JPH10323182A - ホスホリパーゼa1活性を有する細菌の培養液、ドコサヘキサエン酸高含有リン脂質の調製法及び2−アシルリゾリン脂質の製造法 - Google Patents
ホスホリパーゼa1活性を有する細菌の培養液、ドコサヘキサエン酸高含有リン脂質の調製法及び2−アシルリゾリン脂質の製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ホスホリパーゼA1の新たな供給源を提供す
ると共に、DHA高含有リン脂質及びリゾリン脂質をよ
り効率良く大量に調製しうる方法を提供する。 【解決手段】 ホスホリパーゼA1活性を有する、ドコ
サヘキサエン酸産生細菌の培養液、この培養液を用いて
ドコサヘキサエン酸含有リン脂質を加水分解することか
らなる、ドコサヘキサエン酸高含有リン脂質の調製法、
およびその培養液を用いてリン脂質を加水分解すること
からなる、2−アシルリゾリン脂質の製造法。 【効果】 リン脂質の改質、脂質生化学研究などに有用
なホスホリパーゼA1活性を有する培養液を提供し、こ
れによりリパーゼよりも効率良くDHA高含有リン脂質
が調製できると共に、2−アシルリゾリン脂質を効率良
く製造することができる。又、DHA合成遺伝子を組み
込んだ他の生物に利用することによってDHA含有脂質
の生産を高めることが期待できる。
ると共に、DHA高含有リン脂質及びリゾリン脂質をよ
り効率良く大量に調製しうる方法を提供する。 【解決手段】 ホスホリパーゼA1活性を有する、ドコ
サヘキサエン酸産生細菌の培養液、この培養液を用いて
ドコサヘキサエン酸含有リン脂質を加水分解することか
らなる、ドコサヘキサエン酸高含有リン脂質の調製法、
およびその培養液を用いてリン脂質を加水分解すること
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れによりリパーゼよりも効率良くDHA高含有リン脂質
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の生産を高めることが期待できる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明はホスホリパーゼA1
活性を有するドコサヘキサエン酸(DHA)産生細菌の
培養液、この培養液を用いるDHA高含有リン脂質の調
製法及び2−アシルリゾリン脂質の製造法に関する。
活性を有するドコサヘキサエン酸(DHA)産生細菌の
培養液、この培養液を用いるDHA高含有リン脂質の調
製法及び2−アシルリゾリン脂質の製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】DHAは、n-3系列の高度不飽和脂肪酸
としてn-6系列のエイコサノイドの生成を競合的に抑制
するほか、同じn-3系列の高度不飽和脂肪酸であるエイ
コサペンタエン酸(以下EPA)やα-リノレン酸には
ない記憶学習能向上作用、抗アレルギー作用、抗腫瘍作
用等を有することが知られている。DHAは魚油からト
リグリセリドとして大量に単離されるため、健康食品と
しての市場が確立されている。しかし、生体内における
DHAの存在形態はリン脂質であること、DHAを経口
投与した場合、リン脂質型の方がトリグリセリド型より
も高い生理活性を有することなどがわかっている。現在
のDHA高含有リン脂質は、海産魚介類のリン脂質から
の抽出、DHA産生細菌による発酵生産、卵黄レシチン
などのドコサヘキサエン酸含有リン脂質のリパーゼによ
る濃縮等により調製されている。しかしながらこれらの
従来技術には、1)魚介類からの抽出は夾雑物が多く大
量に得るには困難を伴う、2)細菌による発酵生産はコ
ストが高くなる、3)リパーゼによる濃縮においては、
基質となる卵黄レシチンを卵黄脂質から精製し、リン脂
質の約2倍量存在するトリグリセリドを除去する必要が
あるなどの欠点があった。
としてn-6系列のエイコサノイドの生成を競合的に抑制
するほか、同じn-3系列の高度不飽和脂肪酸であるエイ
コサペンタエン酸(以下EPA)やα-リノレン酸には
ない記憶学習能向上作用、抗アレルギー作用、抗腫瘍作
用等を有することが知られている。DHAは魚油からト
リグリセリドとして大量に単離されるため、健康食品と
しての市場が確立されている。しかし、生体内における
DHAの存在形態はリン脂質であること、DHAを経口
投与した場合、リン脂質型の方がトリグリセリド型より
も高い生理活性を有することなどがわかっている。現在
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などのドコサヘキサエン酸含有リン脂質のリパーゼによ
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従来技術には、1)魚介類からの抽出は夾雑物が多く大
量に得るには困難を伴う、2)細菌による発酵生産はコ
ストが高くなる、3)リパーゼによる濃縮においては、
基質となる卵黄レシチンを卵黄脂質から精製し、リン脂
質の約2倍量存在するトリグリセリドを除去する必要が
あるなどの欠点があった。
【0003】リゾリン脂質は通常のリン脂質より高い界
面活性を有し、食品への利用に際して極めて効果的な脂
質形態であることが知られている。リゾリン脂質は食品
の乳化安定性、食感、弾力性をリン脂質以上に改善でき
るとともに他の乳化剤の使用量を節約することができ
る。また、食品用途の他に化粧品用乳化剤としても利用
価値がある。リゾリン脂質の調製方法としてホスホリパ
ーゼA2による方法が知られている。現在、工業的に利
用できるホスホリパーゼA2は豚膵臓を起源とする酵素
だけであり、1−アシルリゾリン脂質によるエマルジョ
ンに比べて、2−アシルリゾリン脂質によるエマルジョ
ンは油層分離率が著しく低い点(第35回油化学討論
会、講演番号P10)で問題がある。一方、ホスホリパ
ーゼA1によるリゾリン脂質の工業的生産は行われてい
ない。
面活性を有し、食品への利用に際して極めて効果的な脂
質形態であることが知られている。リゾリン脂質は食品
の乳化安定性、食感、弾力性をリン脂質以上に改善でき
るとともに他の乳化剤の使用量を節約することができ
る。また、食品用途の他に化粧品用乳化剤としても利用
価値がある。リゾリン脂質の調製方法としてホスホリパ
ーゼA2による方法が知られている。現在、工業的に利
用できるホスホリパーゼA2は豚膵臓を起源とする酵素
だけであり、1−アシルリゾリン脂質によるエマルジョ
ンに比べて、2−アシルリゾリン脂質によるエマルジョ
ンは油層分離率が著しく低い点(第35回油化学討論
会、講演番号P10)で問題がある。一方、ホスホリパ
ーゼA1によるリゾリン脂質の工業的生産は行われてい
ない。
【0004】ホスホリパーゼはトリグリセリドを加水分
解しないので、基質中にトリグリセリドが存在していて
も、ジグリセリドやモノグリセリドが生成せず、リン脂
質の加水分解生成物であるリゾリン脂質の精製を阻害し
ない。一般にDHAはリン脂質のsn-2位に結合している
ので、これを濃縮するにはホスホリパーゼA1活性が必
要である。これまでに知られているホスホリパーゼA1
は細胞膜中に存在し、大量生産は容易ではない。最近ア
スペルギルス属の糸状菌からホスホリパーゼA 1 の調製
法が開発されたが(特開平7-222592)、培養に長時間を
要し菌体を含む培地からの酵素の抽出操作は煩雑であ
る。
解しないので、基質中にトリグリセリドが存在していて
も、ジグリセリドやモノグリセリドが生成せず、リン脂
質の加水分解生成物であるリゾリン脂質の精製を阻害し
ない。一般にDHAはリン脂質のsn-2位に結合している
ので、これを濃縮するにはホスホリパーゼA1活性が必
要である。これまでに知られているホスホリパーゼA1
は細胞膜中に存在し、大量生産は容易ではない。最近ア
スペルギルス属の糸状菌からホスホリパーゼA 1 の調製
法が開発されたが(特開平7-222592)、培養に長時間を
要し菌体を含む培地からの酵素の抽出操作は煩雑であ
る。
【0005】ホスホリパーゼA1は動物の膵臓や肝臓、
微生物に存在し、ホスホリパーゼA2と共にリン脂質の
代謝回転に寄与している。また、リン脂質の脂肪酸分子
内分布の解析や脂質生化学研究において有用な酵素であ
るが、現在のところ精製品も含めて市販品はない。
微生物に存在し、ホスホリパーゼA2と共にリン脂質の
代謝回転に寄与している。また、リン脂質の脂肪酸分子
内分布の解析や脂質生化学研究において有用な酵素であ
るが、現在のところ精製品も含めて市販品はない。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、リン
脂質の改質、脂質生化学研究などに有用なホスホリパー
ゼA1の新たな供給源を提供すると共に、DHA高含有
リン脂質及びリゾリン脂質をより効率良く大量に調製し
うる方法を提供することにある。
脂質の改質、脂質生化学研究などに有用なホスホリパー
ゼA1の新たな供給源を提供すると共に、DHA高含有
リン脂質及びリゾリン脂質をより効率良く大量に調製し
うる方法を提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上述の課題
を解決するために鋭意研究した結果、DHAを産生する
細菌の培養液中にホスホリパーゼA1活性を検出した。
また、卵黄リン脂質及びイカの皮から抽出したリン脂質
を基質とした場合、このホスホリパーゼA1活性によっ
て生成したリゾリン脂質中にDHAが濃縮されているこ
と、及び大豆リン脂質を基質とした場合、生成したリゾ
リン脂質の構成脂肪酸がホスホリパーゼA2の加水分解
により生成した脂肪酸と一致することを見いだし、本発
明を完成させるに至った。
を解決するために鋭意研究した結果、DHAを産生する
細菌の培養液中にホスホリパーゼA1活性を検出した。
また、卵黄リン脂質及びイカの皮から抽出したリン脂質
を基質とした場合、このホスホリパーゼA1活性によっ
て生成したリゾリン脂質中にDHAが濃縮されているこ
と、及び大豆リン脂質を基質とした場合、生成したリゾ
リン脂質の構成脂肪酸がホスホリパーゼA2の加水分解
により生成した脂肪酸と一致することを見いだし、本発
明を完成させるに至った。
【0008】すなわち本発明は、ホスホリパーゼA1活
性を有する、ドコサヘキサエン酸産生細菌の培養液、及
びその培養液を用いてドコサヘキサエン酸含有リン脂質
を加水分解することからなる、ドコサヘキサエン酸高含
有リン脂質の調製法及び、その培養液を用いてリン脂質
を加水分解することからなる2−アシルリゾリン脂質の
製造法を提供する。
性を有する、ドコサヘキサエン酸産生細菌の培養液、及
びその培養液を用いてドコサヘキサエン酸含有リン脂質
を加水分解することからなる、ドコサヘキサエン酸高含
有リン脂質の調製法及び、その培養液を用いてリン脂質
を加水分解することからなる2−アシルリゾリン脂質の
製造法を提供する。
【0009】本発明において、培養液とは、DHA産生
細菌を培養して得られる培養産物をすべて包含するもの
であり、菌体を含んでいても、含んでいなくてもよい。
本発明に係わるDHA産生細菌としてはシーワネラ属、
シュードアルテロモナス属、及びビブリオ属などに属す
るものを挙げることができ、例えばシーワネラ・ベンチ
カ類縁のSCRC-21406(FERM P-15693)、シュードアルテ
ロモナス属のSCRC-21416(FERM P-15935)、ビブリオ・
マリナス(ATCC15381)などが含まれるが、DHAを産
生する細菌であれば属、種によらず含まれる。本発明の
培養液は、これらの菌株を、例えば常法に従ってペプト
ンと酵母エキスを含む培地で培養した後、慣用の方法で
単離、精製することにより得られる。本発明の調製法及
び製造法においては、遠心によって菌体を除去した培地
(培養上清)を用いることが好ましい。基質としては大
豆、菜種などの植物、イクラ、イカ、卵黄などの陸産及
び海産動物、バクテリア、酵母などの微生物由来の天然
に存在するリン脂質、及び化学的、酵素的に調製された
リン脂質など、sn-1位エステル結合を有するリン脂質で
あれば用いることができる。ドコサヘキサエン酸高含有
リン脂質の調製にあたっては、これらのリン脂質のう
ち、とくにドコサヘキサエン酸含有率の多いもの、例え
ば、イクラ、イカ、卵黄、バクテリアなどに由来するも
のが好ましい。
細菌を培養して得られる培養産物をすべて包含するもの
であり、菌体を含んでいても、含んでいなくてもよい。
本発明に係わるDHA産生細菌としてはシーワネラ属、
シュードアルテロモナス属、及びビブリオ属などに属す
るものを挙げることができ、例えばシーワネラ・ベンチ
カ類縁のSCRC-21406(FERM P-15693)、シュードアルテ
ロモナス属のSCRC-21416(FERM P-15935)、ビブリオ・
マリナス(ATCC15381)などが含まれるが、DHAを産
生する細菌であれば属、種によらず含まれる。本発明の
培養液は、これらの菌株を、例えば常法に従ってペプト
ンと酵母エキスを含む培地で培養した後、慣用の方法で
単離、精製することにより得られる。本発明の調製法及
び製造法においては、遠心によって菌体を除去した培地
(培養上清)を用いることが好ましい。基質としては大
豆、菜種などの植物、イクラ、イカ、卵黄などの陸産及
び海産動物、バクテリア、酵母などの微生物由来の天然
に存在するリン脂質、及び化学的、酵素的に調製された
リン脂質など、sn-1位エステル結合を有するリン脂質で
あれば用いることができる。ドコサヘキサエン酸高含有
リン脂質の調製にあたっては、これらのリン脂質のう
ち、とくにドコサヘキサエン酸含有率の多いもの、例え
ば、イクラ、イカ、卵黄、バクテリアなどに由来するも
のが好ましい。
【0010】
【実施例】以下、参考例と実施例により本発明を詳細に
説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるもので
はない。
説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるもので
はない。
【0011】実施例1 DHA産生細菌SCRC-21406(FERM P-15693)をP5培地
(ペプトン 5.0%、酵母エキス 0.5%、人工海水 50%)に
植菌して8℃で約48時間振盪培養した。遠心で菌体を除
去して培養上清を得た。基質として1-パルミトイル-2-
オレオイルホスファチジルコリン(16:0/ 18:1(n-9)-P
C)、又は1-オレオイル-2-パルミトイルホスファチジル
コリン(18:1(n-9)/ 16:0-PC) 5mg、培養上清 0.2mlに
蒸留水を加え、全量を 1mlにした。30℃で5時間撹拌し
た後、フォルチ法で脂質を抽出した後、シリカゲルTLC
でリゾホスファチジルコリン(LPC)を分画した。塩酸
メタノール法でLPCの構成脂肪酸を塩酸メタノール法で
メチルエステルとして得た後、ガスクロマトグラフィで
定量分析した。原料とLPCの脂肪酸組成を表1に示す。
両基質ともLPCにはsn-1位とsn-2位の脂肪酸が検出され
たが、sn-2位の脂肪酸が多く残っており、sn-1位のアシ
ル基が選択的に加水分解された。即ち、酵素溶液として
用いた培養上清中には、主要な加水分解活性としてホス
ホリパーゼA1活性が存在することが確認された。
(ペプトン 5.0%、酵母エキス 0.5%、人工海水 50%)に
植菌して8℃で約48時間振盪培養した。遠心で菌体を除
去して培養上清を得た。基質として1-パルミトイル-2-
オレオイルホスファチジルコリン(16:0/ 18:1(n-9)-P
C)、又は1-オレオイル-2-パルミトイルホスファチジル
コリン(18:1(n-9)/ 16:0-PC) 5mg、培養上清 0.2mlに
蒸留水を加え、全量を 1mlにした。30℃で5時間撹拌し
た後、フォルチ法で脂質を抽出した後、シリカゲルTLC
でリゾホスファチジルコリン(LPC)を分画した。塩酸
メタノール法でLPCの構成脂肪酸を塩酸メタノール法で
メチルエステルとして得た後、ガスクロマトグラフィで
定量分析した。原料とLPCの脂肪酸組成を表1に示す。
両基質ともLPCにはsn-1位とsn-2位の脂肪酸が検出され
たが、sn-2位の脂肪酸が多く残っており、sn-1位のアシ
ル基が選択的に加水分解された。即ち、酵素溶液として
用いた培養上清中には、主要な加水分解活性としてホス
ホリパーゼA1活性が存在することが確認された。
【0012】
【表1】 表1 DHA産生細菌SCRC-21406の培養上清を用いたホスファチジル コリンの加水分解反応で生成したLPCの脂肪酸組成(mol%) ─────────────────────────────── 16:0/18:1(n-9)-PC 18:1(n-9)/16:0-PC 16:0 18:1(n-9) 16:0 18:1(n-9) (mol%) (mol%) (mol%) (mol%) ─────────────────────────────── 原料 48.3 51.7 48.1 51.9 LPC 17.4 82.6 92.9 7.1 ───────────────────────────────
【0013】参考例1 シーワネラ・ベンチカに類縁のDHA産生細菌SCRC-214
06(FERM P-15693)をK28培地(ペプトン 0.5%、酵母エ
キス 0.1%、人工海水 50%)に植菌して8℃で約48時間振
盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基
質としてのオリーブ油 1ml或いはトリグリセリド/ジグ
リセリド(2:1, mol/mol)混合物 1mlに培養上清 3mlを
加え、30℃で24時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルTL
Cに展開した結果、遊離酸の生成は検出されず、加水分
解は確認されなかった。従って、この培養上清はリパー
ゼ活性を有しないことが判明した。
06(FERM P-15693)をK28培地(ペプトン 0.5%、酵母エ
キス 0.1%、人工海水 50%)に植菌して8℃で約48時間振
盪培養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。基
質としてのオリーブ油 1ml或いはトリグリセリド/ジグ
リセリド(2:1, mol/mol)混合物 1mlに培養上清 3mlを
加え、30℃で24時間撹拌した。反応溶液をシリカゲルTL
Cに展開した結果、遊離酸の生成は検出されず、加水分
解は確認されなかった。従って、この培養上清はリパー
ゼ活性を有しないことが判明した。
【0014】実施例2 シーワネラ・ベンチカに類縁のDHA産生細菌SCRC-214
06(FERM P-15693)を実施例1と同様に培養して培養上
清を得た。卵黄リン脂質 25mg、培養上清 1mlに蒸留水
を加え、全量を 5mlにした。反応及び反応溶液からの脂
質抽出は実施例1と同様に行った。脂質はシリカゲルTL
Cに展開し、残存した基質(PC=ホスファチジルコリ
ン、PE=ホスファチジルエタノールアミン)、加水分
解で生成したリゾリン脂質(LPC=リゾホスファチジ
ルコリン、LPE=リゾホスファチジルエタノールアミ
ン)及び遊離酸(FA)に分画した。各々の構成脂肪酸
組成分析は実施例1と同様に行った。リン脂質の加水分
解率は 23.8%、リン脂質組成と各々のDHA含量を表2
に示す。
06(FERM P-15693)を実施例1と同様に培養して培養上
清を得た。卵黄リン脂質 25mg、培養上清 1mlに蒸留水
を加え、全量を 5mlにした。反応及び反応溶液からの脂
質抽出は実施例1と同様に行った。脂質はシリカゲルTL
Cに展開し、残存した基質(PC=ホスファチジルコリ
ン、PE=ホスファチジルエタノールアミン)、加水分
解で生成したリゾリン脂質(LPC=リゾホスファチジ
ルコリン、LPE=リゾホスファチジルエタノールアミ
ン)及び遊離酸(FA)に分画した。各々の構成脂肪酸
組成分析は実施例1と同様に行った。リン脂質の加水分
解率は 23.8%、リン脂質組成と各々のDHA含量を表2
に示す。
【0015】参考例2 大腸菌JM109株をLB培地(バクトペプトン 1.0%、酵母エ
キス 0.5%、NaCl 1.0%)に植菌して37℃で約20時間振盪
培養した。培養液の菌体密度は610nmの吸光度(以下OD6
10)で4.50であった。遠心で菌体を除去して培養上清を
得た。実施例2と同じ卵黄リン脂質 25mg、培養上清 1m
lに蒸留水を加え、全量を 5mlにした。反応及び脂質脂
肪酸分析は実施例2と同様に行った。その結果、加水分
解率は 検出限界以下であった。反応後のリン脂質組成
と各々のDHA含量は表2にまとめた。
キス 0.5%、NaCl 1.0%)に植菌して37℃で約20時間振盪
培養した。培養液の菌体密度は610nmの吸光度(以下OD6
10)で4.50であった。遠心で菌体を除去して培養上清を
得た。実施例2と同じ卵黄リン脂質 25mg、培養上清 1m
lに蒸留水を加え、全量を 5mlにした。反応及び脂質脂
肪酸分析は実施例2と同様に行った。その結果、加水分
解率は 検出限界以下であった。反応後のリン脂質組成
と各々のDHA含量は表2にまとめた。
【0016】参考例3 シーワネラ・ピュトリファシエンスに類縁のEPA産生
細菌SCRC-2738をK28培に植菌して14℃で約20時間振盪培
養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。実施例
2と同じ卵黄リン脂質 25mg、培養上清 1mlに蒸留水を
加え、全量を 5mlにした。反応及び脂質脂肪酸分析は実
施例2と同様に行った。リン脂質の加水分解率は 検出
限界以下であった。反応後のリン脂質組成と各々のDH
A含量を表2にまとめた。このようにDHA産生菌培養
上清のホスホリパーゼA1活性によってリゾリン脂質に
DHAが濃縮された。大腸菌やEPA産生細菌にはこの
ような活性は検出されなかった。
細菌SCRC-2738をK28培に植菌して14℃で約20時間振盪培
養した。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。実施例
2と同じ卵黄リン脂質 25mg、培養上清 1mlに蒸留水を
加え、全量を 5mlにした。反応及び脂質脂肪酸分析は実
施例2と同様に行った。リン脂質の加水分解率は 検出
限界以下であった。反応後のリン脂質組成と各々のDH
A含量を表2にまとめた。このようにDHA産生菌培養
上清のホスホリパーゼA1活性によってリゾリン脂質に
DHAが濃縮された。大腸菌やEPA産生細菌にはこの
ような活性は検出されなかった。
【0017】
【表2】 表2 DHA産生細菌SCRC-21416、大腸菌JM109及びEPA産生細菌SCRC-2738の 培養上清を用いた卵黄リン脂質の加水分解反応生成物の脂質組成(mol%)と DHA含有量(mol%) ─────────────────────────────────── 原料 実施例2 参考例2 参考例3 脂質 組成 DHA 組成 DHA 組成 DHA 組成 DHA (mol%)(mol%) (mol%)(mol%) (mol%)(mol%) (mol%)(mol%) ─────────────────────────────────── PC 80.8 17.1 49.6 16.1 71.2 20.7 79.4 16.7 PE 13.3 38.5 10.5 42.5 19.8 32.6 11.2 24.5 LPC 3.5 10.0 20.9 41.1 5.4 7.0 6.5 9.1 LPE 2.4 14.0 13.1 41.1 3.7 5.8 2.9 19.9 ─────────────────────────────────── PL* 98.1 19.6 74.4 23.9 98.8 22.5 98.8 17.4 FA 1.9 17.4 25.7 6.4 1.2 18.2 1.2 18.6 ───────────────────────────────────* PLは総リン脂質でPC、PE、LPC、LPEの合計
【0018】実施例3 実施例1のDHA産生細菌SCRC-21406(FERM P-1569
3)、シュードアルテロモナスに属するDHA産生細菌S
CRC-21416(FERM P-15935)、ビブリオ・マリナス(ATC
C15381)をK28培地に植菌して8℃で約43時間振盪培養し
た。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。実施例2と
同じ卵黄リン脂質 25mg、培養上清 1mlに蒸留水を加
え、全量を 5mlにした。反応及び脂質脂肪酸分析は実施
例2と同様に行った。リン脂質の加水分解率はSCRC-214
06, SCRC-21416, ビブリオ・マリナスが各々26.6, 14.
9, 16.4 %、リン脂質組成と各々のDHA含量を表3に
示す。属の異なるDHA産生細菌の培養上清を用いて
も、DHAがリゾリン脂質中に濃縮された。
3)、シュードアルテロモナスに属するDHA産生細菌S
CRC-21416(FERM P-15935)、ビブリオ・マリナス(ATC
C15381)をK28培地に植菌して8℃で約43時間振盪培養し
た。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。実施例2と
同じ卵黄リン脂質 25mg、培養上清 1mlに蒸留水を加
え、全量を 5mlにした。反応及び脂質脂肪酸分析は実施
例2と同様に行った。リン脂質の加水分解率はSCRC-214
06, SCRC-21416, ビブリオ・マリナスが各々26.6, 14.
9, 16.4 %、リン脂質組成と各々のDHA含量を表3に
示す。属の異なるDHA産生細菌の培養上清を用いて
も、DHAがリゾリン脂質中に濃縮された。
【0019】
【表3】 表3 DHA産生細菌SCRC-21406、SCRC-21416、ビブリオ・マリナスの培養上清 を用いた卵黄リン脂質の加水分解反応生成物の脂質組成(mol%)とDHA含 有量(mol%) ─────────────────────────────────── 原料 SCRC-21406 SCRC-21416 ヒ゛フ゛リオ・マリナス 脂質 組成 DHA 組成 DHA 組成 DHA 組成 DHA (mol%)(mol%) (mol%)(mol%) (mol%)(mol%) (mol%)(mol%) ─────────────────────────────────── PC 82.8 12.1 55.2 11.8 64.9 10.3 57.8 12.7 PE 13.0 33.3 10.0 30.3 11.1 32.4 9.8 35.7 LPC 1.2 7.2 25.8 20.5 18.0 24.4 25.1 24.0 LPE 3.0 13.2 9.0 26.0 6.0 30.5 7.3 29.6 ─────────────────────────────────── PL* 97.1 14.8 70.5 16.2 82.2 15.2 80.7 17.8 FA 2.9 18.6 29.5 3.4 17.8 4.8 19.3 3.4 ───────────────────────────────────* PLは総リン脂質でPC、PE、LPC、LPEの合計
【0020】実施例4 実施例1のDHA産生細菌SCRC-21406(FERM P-1569
3)、シュードアルテロモナスに属するDHA産生細菌S
CRC-21416(FERM P-15935)、ビブリオ・マリナス(ATC
C15381)をK28培地に植菌して8℃で約39時間振盪培養し
た。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。イカの皮か
ら抽出したホスファチジルコリン 10mg、培養上清 0.4m
lに蒸留水を加え、全量を 2mlにした。反応及び脂質脂
肪酸分析は実施例2と同様に行った。リン脂質の加水分
解率はSCRC-21406, SCRC-21416, ビブリオ・マリナスが
各々12.4, 14.2, 17.1 %、リン脂質組成と各々のDHA
含量を表4に示す。イカの皮から抽出したホスファチジ
ルコリンから、DHA産生菌の培養上清を用いてDHA
含量を高めたリゾリン脂質を調製できた。
3)、シュードアルテロモナスに属するDHA産生細菌S
CRC-21416(FERM P-15935)、ビブリオ・マリナス(ATC
C15381)をK28培地に植菌して8℃で約39時間振盪培養し
た。遠心で菌体を除去して培養上清を得た。イカの皮か
ら抽出したホスファチジルコリン 10mg、培養上清 0.4m
lに蒸留水を加え、全量を 2mlにした。反応及び脂質脂
肪酸分析は実施例2と同様に行った。リン脂質の加水分
解率はSCRC-21406, SCRC-21416, ビブリオ・マリナスが
各々12.4, 14.2, 17.1 %、リン脂質組成と各々のDHA
含量を表4に示す。イカの皮から抽出したホスファチジ
ルコリンから、DHA産生菌の培養上清を用いてDHA
含量を高めたリゾリン脂質を調製できた。
【0021】
【表4】 表4 DHA産生細菌SCRC-21406、SCRC-21416、ビブリオ・マリナスの培養上清 を用いたイカリン脂質の加水分解反応生成物の脂質組成(mol%)とDHA含 有量(mol%)) ─────────────────────────────────── 原料 SCRC-21406 SCRC-21416 ヒ゛フ゛リオ・マリナス 脂質 組成 DHA 組成 DHA 組成 DHA 組成 DHA (mol%)(mol%) (mol%)(mol%) (mol%)(mol%) (mol%)(mol%) ─────────────────────────────────── PC 100.0 43.2 70.8 45.8 73.5 48.1 71.7 47.1 LPC 0.0 0.0 29.2 73.1 26.5 74.2 28.3 73.1 ─────────────────────────────────── PL* 100.0 43.2 80.5 50.5 79.1 52.1 78.1 52.1 FA 0.0 0.0 19.5 7.3 20.9 6.7 21.9 5.9 ───────────────────────────────────* PLは総リン脂質でPC、LPCの合計
【0022】実施例5 シュードアルテロモナスに属するDHA産生細菌SCRC-2
1416(FERM P-15935)、をP5培地に植菌して8℃で約40
時間振盪培養した。遠心で菌体を 除去して培養上清を
得た。大豆から抽出したホスファチジルコリン 10mg、
ジエチルエーテル1mLに培養上清 0.4mlを加え、30分間
撹拌した。脂質脂肪酸分析は実施例2と同様に行った。
リン脂質の加水分解率は33.0%、加水分解反応生成物の
脂肪酸組成を表5にまとめた。
1416(FERM P-15935)、をP5培地に植菌して8℃で約40
時間振盪培養した。遠心で菌体を 除去して培養上清を
得た。大豆から抽出したホスファチジルコリン 10mg、
ジエチルエーテル1mLに培養上清 0.4mlを加え、30分間
撹拌した。脂質脂肪酸分析は実施例2と同様に行った。
リン脂質の加水分解率は33.0%、加水分解反応生成物の
脂肪酸組成を表5にまとめた。
【0023】参考例4 実施例5の生成物であるリゾリン脂質が2−アシルリゾ
リン脂質であることを確認するために、以下の実験を行
った。大豆から抽出したホスファチジルコリン 5mg、ジ
エチルエーテル 1mL、ホウ酸緩衝液(pH7.1) 0.2mlに
豚膵臓起源ホスホリパーゼA2を加え、37℃で1時間撹拌
した。生成したリゾリン脂質の脂肪酸分析は実施例2と
同様に行った。なお、リン脂質の加水分解率は12.9%で
あり、結果を表5に示した。
リン脂質であることを確認するために、以下の実験を行
った。大豆から抽出したホスファチジルコリン 5mg、ジ
エチルエーテル 1mL、ホウ酸緩衝液(pH7.1) 0.2mlに
豚膵臓起源ホスホリパーゼA2を加え、37℃で1時間撹拌
した。生成したリゾリン脂質の脂肪酸分析は実施例2と
同様に行った。なお、リン脂質の加水分解率は12.9%で
あり、結果を表5に示した。
【0024】
【表5】 表5 DHA産生細菌SCRC-21416の培養上清及びホスホリパーゼA2を 用いた大豆リン脂質の加水分解反応生成物の脂肪酸組成(mol%) ──────────────────────────────── 脂肪酸 原料 SCRC-21416* ホスホリハ゜ーセ゛A2 * PC LPC FA LPC ──────────────────────────────── C16:0 11.9 1.1 11.7 11.8 C18:0 3.3 0.3 3.4 5.0 C18:1(n-9) 5.5 3.3 2.1 2.3 C18:1(n-7) 1.4 0.0 1.2 1.1 C18:2(n-6) 70.2 41.0 28.5 26.9 C18:3(n-3) 7.7 4.3 3.1 2.9 ────────────────────────────────* LPCとFAは、各々の合計が50%になるように計算した。
【0025】このように、大豆から抽出したホスファチ
ジルコリンから、DHA産生菌の培養上清を用いて得た
遊離脂肪酸の組成と、豚膵臓起源ホスホリパーゼA2か
ら得たリゾリン脂質の脂肪酸組成がよく一致した。すな
わち、DHA産生菌の培養上清を用いることにより、選
択的に2−アシルリゾリン脂質を製造することができ
た。
ジルコリンから、DHA産生菌の培養上清を用いて得た
遊離脂肪酸の組成と、豚膵臓起源ホスホリパーゼA2か
ら得たリゾリン脂質の脂肪酸組成がよく一致した。すな
わち、DHA産生菌の培養上清を用いることにより、選
択的に2−アシルリゾリン脂質を製造することができ
た。
【0026】
【発明の効果】リン脂質の改質、脂質生化学研究などに
有用なホスホリパーゼA1活性を有する培養液を提供す
る。リパーゼよりも効率良くDHA高含有リン脂質が調
製できると共に、2−アシルリゾリン脂質を効率良く製
造することができる。又、DHA合成遺伝子を組み込ん
だ他の生物に利用することによってDHA含有脂質の生
産を高めることが期待できる。
有用なホスホリパーゼA1活性を有する培養液を提供す
る。リパーゼよりも効率良くDHA高含有リン脂質が調
製できると共に、2−アシルリゾリン脂質を効率良く製
造することができる。又、DHA合成遺伝子を組み込ん
だ他の生物に利用することによってDHA含有脂質の生
産を高めることが期待できる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成10年3月12日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0009
【補正方法】変更
【補正内容】
【0009】本発明において、培養液とは、DHA産生
細菌を培養して得られる培養産物をすべて包含するもの
であり、菌体を含んでいても、含んでいなくてもよい。
本発明に係わるDHA産生細菌としてはシーワネラ属、
シュードアルテロモナス属、及びビブリオ属などに属す
るものを挙げることができ、例えばシーワネラ・ベンチ
カ類縁のSCRC−21406(FERM P−156
93)、シュードアルテロモナス属のSCRC−214
16(FERM P−15935)、ビブリオ・マリナ
ス(ATCC15381)などが含まれる。SCRC−
21406は、通商産業省 工業技術院生命工学工業技
術研究所 特許微生物寄託センターにFERM P−1
5693として寄託され、平成9年6月13日付で同生
命工学工業技術研究所 特許微生物寄託センターにおい
てFERM BP−5979としてブタペスト条約に基
く国際寄託に移管された。SCRC−21416は、通
商産業省 工業技術院生命工学工業技術研究所 特許微
生物寄託センターにFERM P−15935として寄
託され、平成9年6月13日付で同生命工学工業技術研
究所 特許微生物寄託センターにおいてFERM BP
−5980としてブタペスト条約に基く国際寄託に移管
された。DHAを産生する細菌であれば属、種によらず
含まれる。本発明の培養液は、これらの菌株を、例えば
常法に従ってペプトンと酵母エキスを含む培地で培養し
た後、慣用の方法で単離、精製することにより得られ
る。本発明の調製法及び製造法においては、遠心によっ
て菌体を除去した培地(培養上清)を用いることが好ま
しい。基質としては大豆、菜種などの植物、イクラ、イ
カ、卵黄などの陸産及び海産動物、バクテリア、酵母な
どの微生物由来の天然に存在するリン脂質、及び化学
的、酵素的に調製されたリン脂質など、sn−1位エス
テル結合を有するリン脂質であれば用いることができ
る。ドコサヘキサエン酸高含有リン脂質の調製にあたっ
ては、これらのリン脂質のうち、とくにドコサヘキサエ
ン酸含有率の多いもの、例えば、イクラ、イカ、卵黄、
バクテリアなどに由来するものが好ましい。
細菌を培養して得られる培養産物をすべて包含するもの
であり、菌体を含んでいても、含んでいなくてもよい。
本発明に係わるDHA産生細菌としてはシーワネラ属、
シュードアルテロモナス属、及びビブリオ属などに属す
るものを挙げることができ、例えばシーワネラ・ベンチ
カ類縁のSCRC−21406(FERM P−156
93)、シュードアルテロモナス属のSCRC−214
16(FERM P−15935)、ビブリオ・マリナ
ス(ATCC15381)などが含まれる。SCRC−
21406は、通商産業省 工業技術院生命工学工業技
術研究所 特許微生物寄託センターにFERM P−1
5693として寄託され、平成9年6月13日付で同生
命工学工業技術研究所 特許微生物寄託センターにおい
てFERM BP−5979としてブタペスト条約に基
く国際寄託に移管された。SCRC−21416は、通
商産業省 工業技術院生命工学工業技術研究所 特許微
生物寄託センターにFERM P−15935として寄
託され、平成9年6月13日付で同生命工学工業技術研
究所 特許微生物寄託センターにおいてFERM BP
−5980としてブタペスト条約に基く国際寄託に移管
された。DHAを産生する細菌であれば属、種によらず
含まれる。本発明の培養液は、これらの菌株を、例えば
常法に従ってペプトンと酵母エキスを含む培地で培養し
た後、慣用の方法で単離、精製することにより得られ
る。本発明の調製法及び製造法においては、遠心によっ
て菌体を除去した培地(培養上清)を用いることが好ま
しい。基質としては大豆、菜種などの植物、イクラ、イ
カ、卵黄などの陸産及び海産動物、バクテリア、酵母な
どの微生物由来の天然に存在するリン脂質、及び化学
的、酵素的に調製されたリン脂質など、sn−1位エス
テル結合を有するリン脂質であれば用いることができ
る。ドコサヘキサエン酸高含有リン脂質の調製にあたっ
ては、これらのリン脂質のうち、とくにドコサヘキサエ
ン酸含有率の多いもの、例えば、イクラ、イカ、卵黄、
バクテリアなどに由来するものが好ましい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI (C12N 1/20 C12R 1:63) (C12P 9/00 C12R 1:01) (C12P 9/00 C12R 1:63) (C12P 7/64 C12R 1:01) (C12P 7/64 C12R 1:63)
Claims (4)
- 【請求項1】 ホスホリパーゼA1活性を有する、ドコ
サヘキサエン酸産生細菌の培養液。 - 【請求項2】 細菌がシーワネラ属、シュードアルテロ
モナス属、ビブリオ属に属するものである、請求項1に
記載のドコサヘキサエン酸産生細菌の培養液。 - 【請求項3】請求項1に記載の培養液を用いてドコサヘ
キサエン酸含有リン脂質を加水分解することからなる、
ドコサヘキサエン酸高含有リン脂質の調製法。 - 【請求項4】請求項1に記載の培養液を用いてリン脂質
を加水分解することからなる、2−アシルリゾリン脂質
の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10021962A JPH10323182A (ja) | 1997-03-27 | 1998-02-03 | ホスホリパーゼa1活性を有する細菌の培養液、ドコサヘキサエン酸高含有リン脂質の調製法及び2−アシルリゾリン脂質の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7512697 | 1997-03-27 | ||
JP9-75126 | 1997-03-27 | ||
JP10021962A JPH10323182A (ja) | 1997-03-27 | 1998-02-03 | ホスホリパーゼa1活性を有する細菌の培養液、ドコサヘキサエン酸高含有リン脂質の調製法及び2−アシルリゾリン脂質の製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10323182A true JPH10323182A (ja) | 1998-12-08 |
Family
ID=26359116
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10021962A Pending JPH10323182A (ja) | 1997-03-27 | 1998-02-03 | ホスホリパーゼa1活性を有する細菌の培養液、ドコサヘキサエン酸高含有リン脂質の調製法及び2−アシルリゾリン脂質の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH10323182A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999058643A1 (fr) * | 1998-05-14 | 1999-11-18 | Sagami Chemical Research Center | Micro-organisme produisant de l'acide docosahexanoique et une phospholipase a1, milieu de culture liquide de ce micro-organisme, procede de preparation d'un phospholipide, et procede de production de 2-acyllysophospholipide |
WO2007097160A1 (ja) | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Tokyo University Of Marine Science And Technology | 新規微生物、脂質改質剤、2-アシルリゾリン脂質の製造方法、ジアシルグリセロールの製造方法、セラミドの製造方法及び油脂の脱ガム法 |
CN102266356A (zh) * | 2011-07-21 | 2011-12-07 | 青岛科技大学 | 一种利用假交替单胞菌制备鳗弧菌杀菌剂的方法 |
-
1998
- 1998-02-03 JP JP10021962A patent/JPH10323182A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999058643A1 (fr) * | 1998-05-14 | 1999-11-18 | Sagami Chemical Research Center | Micro-organisme produisant de l'acide docosahexanoique et une phospholipase a1, milieu de culture liquide de ce micro-organisme, procede de preparation d'un phospholipide, et procede de production de 2-acyllysophospholipide |
WO2007097160A1 (ja) | 2006-02-27 | 2007-08-30 | Tokyo University Of Marine Science And Technology | 新規微生物、脂質改質剤、2-アシルリゾリン脂質の製造方法、ジアシルグリセロールの製造方法、セラミドの製造方法及び油脂の脱ガム法 |
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