JPH10300735A - クロマトグラフィーの試料導入条件決定法 - Google Patents
クロマトグラフィーの試料導入条件決定法Info
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- JPH10300735A JPH10300735A JP9112172A JP11217297A JPH10300735A JP H10300735 A JPH10300735 A JP H10300735A JP 9112172 A JP9112172 A JP 9112172A JP 11217297 A JP11217297 A JP 11217297A JP H10300735 A JPH10300735 A JP H10300735A
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Abstract
料導入間隔を求め、最小のカラム本数を正確に求めるこ
とができる方法を提供すること。 【解決手段】微量の試料をカラムに導入して溶出液の吸
光度を測定することによって溶出曲線を作成し、この溶
出曲線から分離すべき各成分のピーク時間と分散を求
め、これらの数値に基づき試料を複数回導入したときの
ガウス分布による溶出曲線式を作成し、これに基づい
て、試料導入時間および試料導入開始から次の試料導入
開始までの試料導入間隔を変えてシミュレーションを行
なうことによって、分離すべき成分が許容純度を維持で
きる最大試料導入時間および最小試料導入間隔を求める
ことを特徴とする、クロマトグラフィーの試料導入時間
および試料導入間隔を決定する方法。
Description
ーの試料導入時間および試料導入間隔を決定する方法に
関する。また、本発明は並列接続された複数のカラムを
用いたクロマトグラフィー連続分離法に必要なカラムの
数を決定する方法に関する。より詳細には、少量の試料
を用いて1回だけ予備試験を行なうことによって、カラ
ムの数を決定する方法に関する。
分離する方法として、クロマトグラフィーによる分離法
が広く用いられている。クロマトグラフィーによって多
量の試料を処理するために、さまざまな技術が提案され
ている。例えば、カラムの径を大きくして充填剤の量を
増やし、1つのカラムで処理することができる量を多く
する方法がある。しかし、この方法では溶離液がカラム
を素通りしてしまうチャンネリング現象が生じることが
多い。このため、分離される成分の純度が低下し、所期
の目的を達成できないことがある。したがって、分離さ
れる成分の純度を維持するためには、カラムの径を一定
値以下に制限しなければならない。そこで、複数のカラ
ムを並用して分離する方法が開発され、今日でも多用さ
れている。この方法によれば、原理的に多量の成分を精
度良く分離することが可能である。
て試料を連続的に処理することが求められている。この
ような連続処理のためには、複数のカラムを並列に接続
し、試料を一定の導入時間をかけて順番にカラムに導入
して行く方法が有効である。こうして最後のカラムまで
試料を導入し終えたら、最初に導入したカラムから試料
を再度導入し、このサイクルを繰り返すことによって系
を止めずに連続的な処理を行なうことができる。このよ
うな複数のカラムを並列接続した系を用いて成分を分離
するときには、なるべく試料導入時間を長くして1本の
カラムに対して多くの試料を一度に導入するとともに、
次回の導入までの間隔をできるだけ短くするのが好まし
い。分離される成分の純度を許容範囲内に保ちながら、
最適な条件を見出すことができれば、カラムの本数を減
らすことができる。カラムの本数を減らすことができれ
ば、系が簡単になり、分離操作が単純化してコスト削減
にもつながる。従来は、試料を何度もカラムに導入して
溶出曲線を取得する予備試験を繰り返すことによって、
カラムの本数を決定していた。しかしながら、貴重な試
料を用いる場合には、予備試験を複数回行なうことが許
されない場合がある。このような場合には、正確な最適
条件を見出す手段がなく、カラムの最小数を求めること
もできなかった。
のような従来技術の問題点を解消し、1回の予備試験で
最適な試料導入時間、試料導入間隔を求め、最小のカラ
ム本数を正確に求めることができる方法を提供すること
を目的とした。また、複数回予備試験を行なうことが許
されない貴重な成分を分離する場合に、最小限の予備試
験で効率のよい分離条件を見出すことができる方法を提
供することをも目的とした。
ために鋭意検討を進めた結果、本発明者らは、予備試験
で求めた各成分のピーク時間と分散値を基礎としてシミ
ュレーションを行なうことによって、最適な試料導入時
間、試料導入間隔およびカラムの本数を正確に決定する
ことができることを見出して本発明を完成した。すなわ
ち、本発明は、微量の試料をカラムに導入して溶出液の
吸光度を測定することによって溶出曲線を作成し、この
溶出曲線から分離すべき各成分のピーク時間μn'と分散
σn'2を求め、式(1)の溶出曲線に基づいて、試料導
入時間hおよび試料導入開始から次の試料導入開始まで
の試料導入間隔Tを変えてシミュレーションを行なうこ
とによって、分離すべき成分が許容純度を維持できる最
大試料導入時間hmaxおよび最小試料導入間隔Tminを求
めることを特徴とする、クロマトグラフィーの試料導入
時間および試料導入間隔を決定する方法:
aは分離すべき成分数であり、 μn = μn' + h/2 σn 2 = σn '2+ h2/12 である)を提供するも
のである。
ラムに一定の試料導入時間をかけて試料を順次導入し、
最後のカラムに導入後さらに最初のカラムから順番に試
料を導入する操作を繰り返し、各カラムから溶出される
成分を検出器で検出しながら必要な成分を分離するクロ
マトグラフィーによる連続分離法に必要なカラムの本数
を決定する方法であって、上記の方法にしたがって最大
試料導入時間hmaxおよび最小試料導入間隔Tminを求
め、Tmin/hmax(小数点以下繰り上げ)を必要なカラ
ムの本数とする、ことを特徴とする、クロマトグラフィ
ーによる連続分離法に必要なカラムの本数を決定する方
法を提供するものである。
あれば行なうことができる。通常は、1〜10μl程度
の試料があれば十分である。予備試験は導入時間を無視
しうる程度であることが必要とされるため、多量の試料
を導入してはならない。予備試験には、分離を行なう系
に使用されているカラムと同条件のカラムを用いる。す
なわち、充填剤の種類および量、カラムの径などを一致
させておく必要がある。また、試料導入速度、溶離液お
よび成分の検出方法も一致させておく必要がある。成分
の検出方法は、紫外線などを照射して溶出液の吸光度を
測定することによって行なうのが一般的である。予備試
験は、分離を行なう系の中のカラムを用いて行なっても
よい。予備試験によって得られた溶出曲線から、分離す
べき成分のピーク時間μn'と分散σn'2を求める。試料
の導入量を増やして試料導入時間がhになったときの各
試料のピーク時間μnと分散σn 2は、これらの値に基づ
いて以下の式で表される(Kubin, M,"Beitrag zur Theo
rie der Chromatographie", Collect. Czech.Chem.Comm
un.,30,1104-1118(1965))。なお、nは成分の種類を示
す。
f(μ,σ)であることから、溶出曲線は以下の式で表
される。式中、aは分離すべき成分の数である。
を繰り返して導入した場合の溶出曲線は、以下の式で表
される。式中、Tは試料導入開始から次の試料導入開始
までの試料導入間隔である。
の各成分の純度を予測することができる。成分の純度を
許容できる範囲内に維持しながら、可能な限りhを大き
くし、Tを小さくすることによって、hmaxとTminを求
めることができる。このhmaxとTminにより分離操作を
行なうことによって、1本のカラムで効率よく成分を分
離することが可能になる。また、Tmin/hmaxを計算
し、小数点以下を繰り上げることによって最低限必要な
カラムの本数を求めることもできる。このようにして求
めた試料導入時間hmaxで必要最小限のカラムに順次試
料を導入して行けば、並列接続の系で非常に効率のよい
分離を行なうことができる。
に説明する。以下の実施例に示す成分、割合、操作順序
等は、本発明の精神から逸脱しない限り適宜変更するこ
とができる。したがって、本発明の範囲は以下の実施例
に示す具体例に制限されるものではない。 (実施例1)本実施例において、下記構造を有するフマ
ル酸セモチアジル(R体)とその光学異性体(S体)か
らなるラセミ体を、純度98%以上でR体とS体に光学
分割する際の最適な試料導入条件を決定した(R体とS
体の分配係数差1以上)。
た。なお、本明細書でいう純度は、R体とS体の濃度差
を、R体とS体の総濃度で割った値である。予備試験の
系として、単一カラムからなるクロマトグラフを使用し
た。カラムは、内径4.6mm、長さ250mmの Chi
ralpak AS (ダイセル化学(株)製:充填剤粒子径10
μm)を使用した。カラム入口には試料を注入するため
の6ポートバルブを設置し、カラム出口にはフマル酸セ
モチアジルを検出するための検出器を設置した。
1μlを0.6ml/分の速度で導入した。その後、溶
離液である100%エタノールを0.6ml/分の速度
で導入した。カラム出口から出てくる溶出液に300n
mの紫外線を照射して吸光度変化を測定することによっ
て、R体とS体のピーク時間μn'と分散σn'2を求め
た。結果は以下のとおりであった。 μR' = 8.4min σR’2 = 0.068min2 μS' = 17.1min σS’2 = 0.36 min2 式(1)にしたがって、S体の純度を98%に固定し、
試料導入時間を変動させてR体の純度をシミュレーショ
ンした。結果は図1に示すとおりであった。これとまっ
たく同じ条件で実際に試料導入時間を変動させてR体の
純度を測定した結果も図1に併せて示した。シミュレー
ション結果と実験結果は極めてよく符合した。いずれの
場合も、R体純度が98%以上を維持する最大試料導入
時間は2分であることを示している。同様にして、S体
の純度を98%に固定し、試料導入時間を2分にして試
料導入間隔を変動させることによってR体の純度をシュ
ミレーションした。また、これと同じ条件で実際に2回
の試料導入の間隔を変動させてR体の純度を測定した。
結果は図2に示すとおりであった。両者の結果はほぼ符
合し、試料導入間隔が16分以上であればR体の純度は
ほぼ100%であることを示していた。
された複数のカラムで構成される系によるラセミ体溶液
の分割を行なった。本実施例で用いた試料およびカラム
は実施例1と同一である。また、並列接続された複数の
カラムで構成される系として、図3に示す系を用いた。
また、カラムの本数は実施例1の結果を踏まえ、最小試
料導入間隔を最大試料導入時間で割った値である8本に
した。クロマトグラフのカラム入口に設置した各バルブ
の向きは、バルブ(5)のみF方向とし、その他のバル
ブ(6〜12)はE方向とした。また、カラム出口に設
置した各バルブの向きは、バルブ(21)をA方向と
し、バルブ(22〜28)をD方向とした。また、検出
器出口に設置したバルブ(33、34)の向きはH方向
とした。また、洗浄用溶離液の流路に設置されたバルブ
(35、36)は共に閉じておいた。
のラセミ体溶液を第1カラム(13)から順番に0.6
ml/分で導入した。各カラムへの導入時間は2分とし
た。1本のカラムへの導入が終了した時点で、そのカラ
ムの入口バルブをE方向にして溶離液の導入を開始し、
同時に次のカラムの入口バルブをF方向にしてラセミ体
溶液の導入を開始した。このようにして第1カラム(1
3)にラセミ体溶液の導入を開始してから16分後に第
8カラム(20)への導入が完了した。その後も、続け
て第1カラム(13)から同様にラセミ体溶液の導入を
継続し、計1時間導入を行なった。その後、全カラムか
らフマル酸セモチアジルが溶出するまで溶離液をカラム
に導入し続けた。
は、以下のa)およびb)にしたがって制御した。条件
a)およびb)は、第m成分検出器によって第nカラム
の溶出液内に第m成分を検出した場合について一般化し
て記載したものである(第1成分がR体、第2成分がS
体に対応する)。成分を検出した時点でa)にしたがっ
てバルブを操作し、ただちに検出器の洗浄を開始した。
検出器の洗浄が完了した時点で、さらにb)にしたがっ
てバルブを操作した。なお、以下のa)およびb)にお
いて、m+1が2を越える場合はm+1を1とし、n+
1が8を越える場合はn+1を1とする。 a)第m+1成分検出器に他のカラムの溶出液が導入さ
れていない場合は、第nカラム溶出液を第m+1成分検
出器に導き、それ以外の場合は第nカラム溶出液を第m
成分受器に導いた。 b)第n+1カラム溶出液がいずれの検出器にも導かれ
ていない場合は、第n+1カラム溶出液を第m成分検出
器に導いた。
溶離液のポンプ(37)を駆動し、バルブ(35、3
6)を開き、検出器出口のバルブ(33、34)をG方
向にして溶離液を3.6ml/分で30秒間流すことに
よって行なった。洗浄終了時には、ポンプ(37)を止
め、バルブ(35、36)を閉じて、検出器出口のバル
ブ(33、34)をH方向に戻した。この方法にしたが
って、ラセミ体溶液を1時間カラムに導入し続けた後、
溶離液を流すことによってすべてのR体およびS体の溶
出が完了したところで系を止めた。第1成分受器に入っ
ているR体の純度と、第2成分受器に入っているS体の
純度を測定したところ、R体は99.6%であり、S体
は98.7%であった。
験で最適な試料導入時間と試料導入間隔を求めることが
できる。また、これらの値に基づいて、複数のカラムを
並列接続した系で分離を行なう際のもっとも効率が良い
カラムの本数を正確に求めることができる。分離条件を
最適化するために何度も予備試験を行なう必要がないた
め、本発明の方法は貴重な試料を分離する際に極めて有
用である。
概略図である。
Claims (2)
- 【請求項1】微量の試料をカラムに導入して溶出液の吸
光度を測定することによって溶出曲線を作成し、この溶
出曲線から分離すべき各成分のピーク時間μn'と分散σ
n'2を求め、 式(1)の溶出曲線に基づいて、試料導入時間hおよび
試料導入開始から次の試料導入開始までの間隔Tを変え
てシミュレーションを行なうことによって、分離すべき
成分が許容純度を維持できる最大試料導入時間hmaxお
よび最小試料導入間隔Tminを求めることを特徴とす
る、クロマトグラフィーの試料導入時間および試料導入
間隔を決定する方法。 【数1】 (上式において、mは1つのカラムへの試料導入回数、
aは分離すべき成分数であり、 μn = μn' + h/2 σn 2 = σn '2+ h2/12 である) - 【請求項2】並列接続された複数のカラムに一定の試料
導入時間をかけて試料を順次導入し、最後のカラムに導
入後さらに最初のカラムから順番に試料を導入する操作
を繰り返し、各カラムから溶出される成分を検出器で検
出しながら必要な成分を分離するクロマトグラフィーに
よる連続分離法において、必要なカラムの本数を決定す
る方法であって、 請求項1の方法にしたがって最大試料導入時間hmaxお
よび最小試料導入間隔Tminを求め、 Tmin/hmax(小数点以下繰り上げ)を必要なカラムの
本数とする、ことを特徴とする、クロマトグラフィーに
よる連続分離法に必要なカラムの本数を決定する方法。
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
JP11217297A JP3847409B2 (ja) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | クロマトグラフィーの試料導入条件決定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP11217297A JP3847409B2 (ja) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | クロマトグラフィーの試料導入条件決定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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JPH10300735A true JPH10300735A (ja) | 1998-11-13 |
JP3847409B2 JP3847409B2 (ja) | 2006-11-22 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP11217297A Expired - Fee Related JP3847409B2 (ja) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | クロマトグラフィーの試料導入条件決定法 |
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JP (1) | JP3847409B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006343271A (ja) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Shimadzu Corp | オートサンプラ |
-
1997
- 1997-04-30 JP JP11217297A patent/JP3847409B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006343271A (ja) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Shimadzu Corp | オートサンプラ |
JP4720305B2 (ja) * | 2005-06-10 | 2011-07-13 | 株式会社島津製作所 | オートサンプラ |
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---|---|
JP3847409B2 (ja) | 2006-11-22 |
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