JPH10286093A - ハイブリッド種子の判定方法及び純度検定方法 - Google Patents
ハイブリッド種子の判定方法及び純度検定方法Info
- Publication number
- JPH10286093A JPH10286093A JP9111820A JP11182097A JPH10286093A JP H10286093 A JPH10286093 A JP H10286093A JP 9111820 A JP9111820 A JP 9111820A JP 11182097 A JP11182097 A JP 11182097A JP H10286093 A JPH10286093 A JP H10286093A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rice
- seed
- dna
- line
- mitochondria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ハイブリッド種子の判定及び純度検定を簡便
かつ確実にできる方法を提供する。 【解決手段】 検査対象となる種子又は該種子由来の実
生から抽出されたＤＮＡに、細胞質雄性不稔系統で特異
的に欠失している組換え型ミトコンドリアＤＮＡが存在
するかを検査し、組換え型ミトコンドリアＤＮＡの有無
或いはその存在率に基づいて、ハイブリッド種子である
か否かを判定し、或いはハイブリッド種子の純度を検定
する。 【効果】 ハイブリッド種子の判定、ハイブリッド種子
の純度検定が飛躍的に効率化される。
かつ確実にできる方法を提供する。 【解決手段】 検査対象となる種子又は該種子由来の実
生から抽出されたＤＮＡに、細胞質雄性不稔系統で特異
的に欠失している組換え型ミトコンドリアＤＮＡが存在
するかを検査し、組換え型ミトコンドリアＤＮＡの有無
或いはその存在率に基づいて、ハイブリッド種子である
か否かを判定し、或いはハイブリッド種子の純度を検定
する。 【効果】 ハイブリッド種子の判定、ハイブリッド種子
の純度検定が飛躍的に効率化される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イネハイブリッド
種子の親系統種子の生産、或いはハイブリッド種子の生
産におけるハイブリッド種子の純度管理に利用される。
本発明はハイブリッド種子の判定方法及び純度検定方法
に関する。
種子の親系統種子の生産、或いはハイブリッド種子の生
産におけるハイブリッド種子の純度管理に利用される。
本発明はハイブリッド種子の判定方法及び純度検定方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】ハイブリッド種子を生産する方法とし
て、植物の細胞質雄性不稔系統と稔性回復系統を同時に
栽培し、細胞質雄性不稔系統に稔性回復系統の花粉を交
配させることによってハイブリッド種子を細胞質雄性不
稔系統に実らせる方法が一般に行われている。細胞質雄
性不稔系統とは、細胞質のミトコンドリアＤＮＡに存在
する不稔因子によって、雄性器官である花粉が正常に発
達できなくなり、その結果自殖によって自身の種子が遺
伝的に形成できない植物の系統をいう。従って、そのよ
うな植物は正常な他の系統の花粉を交配することによっ
て、交配種子を形成することができる。一方、稔性回復
系統とは、雄性不稔因子の働きを抑制もしくは阻害する
働きを持つ稔性回復遺伝子を核ゲノムに持つ系統を言
う。故に稔性回復系統は細胞質雄性不稔系統と交配した
場合、その子供であるハイブリッドで、細胞質雄性不稔
系統由来の不稔因子の働きを抑制もしくは停止させるこ
とによって、花粉を正常に発達させ、自殖種子を形成す
る能力を有する。従って、細胞質雄性不稔系統に稔性回
復系統を交配して得られたハイブリッドは自殖種子を形
成できる。
て、植物の細胞質雄性不稔系統と稔性回復系統を同時に
栽培し、細胞質雄性不稔系統に稔性回復系統の花粉を交
配させることによってハイブリッド種子を細胞質雄性不
稔系統に実らせる方法が一般に行われている。細胞質雄
性不稔系統とは、細胞質のミトコンドリアＤＮＡに存在
する不稔因子によって、雄性器官である花粉が正常に発
達できなくなり、その結果自殖によって自身の種子が遺
伝的に形成できない植物の系統をいう。従って、そのよ
うな植物は正常な他の系統の花粉を交配することによっ
て、交配種子を形成することができる。一方、稔性回復
系統とは、雄性不稔因子の働きを抑制もしくは阻害する
働きを持つ稔性回復遺伝子を核ゲノムに持つ系統を言
う。故に稔性回復系統は細胞質雄性不稔系統と交配した
場合、その子供であるハイブリッドで、細胞質雄性不稔
系統由来の不稔因子の働きを抑制もしくは停止させるこ
とによって、花粉を正常に発達させ、自殖種子を形成す
る能力を有する。従って、細胞質雄性不稔系統に稔性回
復系統を交配して得られたハイブリッドは自殖種子を形
成できる。
【０００３】種子は作物栽培の基本となるもので、世界
各国で種子検査に関する規定が制定され、種子の管理が
実施されている。種子の純度についても規定されていお
り、夾雑種子の割合がその基準とされている。夾雑の程
度については様々な基準があるが、例えば、日本ではイ
ネについては固定種で９９％以上、ハイブリッドイネで
９８％以上の種子純度であることが主要農産物種子法で
求められている。このように、種子生産業においては、
生産したハイブリッド種子がどの程度の純度を持ってい
るかを調べること（純度検定）が必須である。
各国で種子検査に関する規定が制定され、種子の管理が
実施されている。種子の純度についても規定されていお
り、夾雑種子の割合がその基準とされている。夾雑の程
度については様々な基準があるが、例えば、日本ではイ
ネについては固定種で９９％以上、ハイブリッドイネで
９８％以上の種子純度であることが主要農産物種子法で
求められている。このように、種子生産業においては、
生産したハイブリッド種子がどの程度の純度を持ってい
るかを調べること（純度検定）が必須である。
【０００４】従来、生産した種子の純度検定には、単一
ロットの多くの種子のうちの少量の種子を採種し、栽培
試験によって純度検定を行ってきた。この方法は栽培に
多大の労力と広い圃場を必要とする。またこの方法は検
定結果が天候や季節などの自然環境の影響を大きく受け
るため、安定した検定が得られにくい欠点を有してい
た。
ロットの多くの種子のうちの少量の種子を採種し、栽培
試験によって純度検定を行ってきた。この方法は栽培に
多大の労力と広い圃場を必要とする。またこの方法は検
定結果が天候や季節などの自然環境の影響を大きく受け
るため、安定した検定が得られにくい欠点を有してい
た。
【０００５】この様な問題点から、近年、種子純度の検
定には野菜ではアイソザイムを利用する方法がいくつか
用いられるようになってきた。しかし、ハイブリッドの
両親間でアイソザイムに違いが見られないことが多いた
め、この方法は全てのハイブリッド種子の純度検定に適
応できる技術ではない。また、これまでに開発された種
子純度の検定方法は全て、種子１粒１粒を検査したいく
つかのデータを集計して集計結果から純度を決定する方
法であって、多数の種子または該種子由来の実生を直接
同時に、バルクとして種子純度に使用する方法は知られ
ていなかった。
定には野菜ではアイソザイムを利用する方法がいくつか
用いられるようになってきた。しかし、ハイブリッドの
両親間でアイソザイムに違いが見られないことが多いた
め、この方法は全てのハイブリッド種子の純度検定に適
応できる技術ではない。また、これまでに開発された種
子純度の検定方法は全て、種子１粒１粒を検査したいく
つかのデータを集計して集計結果から純度を決定する方
法であって、多数の種子または該種子由来の実生を直接
同時に、バルクとして種子純度に使用する方法は知られ
ていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ハイ
ブリッド種子を安定的に生産するための細胞質雄性不稔
イネを提供することにある。よって、本発明の目的はハ
イブリッド種子の判定方法を提供することにある。ま
た、本発明の他の目的はハイブリッド種子の純度を多数
の種子または該種子由来の実生を同時に、安定的、高精
度かつ簡便に検定する方法を提供することにある。
ブリッド種子を安定的に生産するための細胞質雄性不稔
イネを提供することにある。よって、本発明の目的はハ
イブリッド種子の判定方法を提供することにある。ま
た、本発明の他の目的はハイブリッド種子の純度を多数
の種子または該種子由来の実生を同時に、安定的、高精
度かつ簡便に検定する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは非対称細胞
融合によって細胞質雄性不稔イネを作出する方法を開発
した。この方法によって得られた細胞質雄性不稔イネの
中に、維持系統および稔性回復系統のイネのミトコンド
リアに存在し、細胞質雄性不稔系統のイネのミトコンド
リアでは欠失しているＤＮＡ（以下、組換え型ミトコン
ドリアＤＮＡと呼ぶことがある）を持つイネが存在する
ことを見出した。細胞質雄性不稔現象はミトコンドリア
ＤＮＡの構造と密接に関連することが知られている。本
発明者らは、組換え型ミトコンドリアＤＮＡを持つイネ
に着目し、組換え型ミトコンドリアＤＮＡを利用するこ
とでハイブリッド種子の判定及び純度検定を容易に行え
ないかを鋭意検討した。
融合によって細胞質雄性不稔イネを作出する方法を開発
した。この方法によって得られた細胞質雄性不稔イネの
中に、維持系統および稔性回復系統のイネのミトコンド
リアに存在し、細胞質雄性不稔系統のイネのミトコンド
リアでは欠失しているＤＮＡ（以下、組換え型ミトコン
ドリアＤＮＡと呼ぶことがある）を持つイネが存在する
ことを見出した。細胞質雄性不稔現象はミトコンドリア
ＤＮＡの構造と密接に関連することが知られている。本
発明者らは、組換え型ミトコンドリアＤＮＡを持つイネ
に着目し、組換え型ミトコンドリアＤＮＡを利用するこ
とでハイブリッド種子の判定及び純度検定を容易に行え
ないかを鋭意検討した。
【０００８】多数の種子をバルクで検査し、種子純度を
検定するためには、ハイブリッドでは欠失し、かつ、ハ
イブリッド以外の種子には存在する形質を利用しなけれ
ばならない。すなわち、ハイブリッド以外の種子が混入
した場合にのみハイブリッド以外の種子に特異的な形質
が検出されることが必要である。ハイブリッドは２種類
のイネを交配して得られる。従って、２種類それぞれの
親から一組づつの染色体を受け継ぐため、核ゲノムに関
しては両親の特徴を合わせ持つ。従って、ハイブリッド
の核ゲノムとそれに支配される性質は両親の何れかに存
在する。従来用いられている技術は全て、この特性を利
用してハイブリッドであることを証明する検査技術であ
る。ハイブリッドは両親の特性を合わせ持つが、その細
胞質は雌親系統にのみ由来する。この現象は母性遺伝と
して広く知られる現象である。母性遺伝するものとして
ミトコンドリアに存在するＤＮＡが挙げられる。ハイブ
リッドの雌親は細胞質雄性不稔で特殊なミトコンドリア
ＤＮＡの構造を有している。従って、ハイブリッドも同
じ特殊なミトコンドリアＤＮＡを有することになる。さ
らに、雌親自身は自殖によって自身の種子を形成するこ
とができないことから、雌親自身の種子がハイブリッド
種子に混入する可能性はない。
検定するためには、ハイブリッドでは欠失し、かつ、ハ
イブリッド以外の種子には存在する形質を利用しなけれ
ばならない。すなわち、ハイブリッド以外の種子が混入
した場合にのみハイブリッド以外の種子に特異的な形質
が検出されることが必要である。ハイブリッドは２種類
のイネを交配して得られる。従って、２種類それぞれの
親から一組づつの染色体を受け継ぐため、核ゲノムに関
しては両親の特徴を合わせ持つ。従って、ハイブリッド
の核ゲノムとそれに支配される性質は両親の何れかに存
在する。従来用いられている技術は全て、この特性を利
用してハイブリッドであることを証明する検査技術であ
る。ハイブリッドは両親の特性を合わせ持つが、その細
胞質は雌親系統にのみ由来する。この現象は母性遺伝と
して広く知られる現象である。母性遺伝するものとして
ミトコンドリアに存在するＤＮＡが挙げられる。ハイブ
リッドの雌親は細胞質雄性不稔で特殊なミトコンドリア
ＤＮＡの構造を有している。従って、ハイブリッドも同
じ特殊なミトコンドリアＤＮＡを有することになる。さ
らに、雌親自身は自殖によって自身の種子を形成するこ
とができないことから、雌親自身の種子がハイブリッド
種子に混入する可能性はない。
【０００９】このような考えに基づき、本発明者らは、
ハイブリッドのミトコンドリアＤＮＡに着目し、ハイブ
リッドでのみ特異的に欠失しているミトコンドリアＤＮ
Ａを検索し、細胞質雄性不稔イネで特異的に欠失してい
るミトコンドリアＤＮＡを見出だした。また、細胞融合
によって生み出した組換え型ミトコンドリアＤＮＡを有
する細胞質雄性不稔系統のイネでも、稔性回復系統や維
持系統には存在するミトコンドリアＤＮＡの一部が欠失
していることを見出した。さらに、本発明者らはこのミ
トコンドリアＤＮＡを特異的に検出する技術を開発し
た。この検出技術によってハイブリッドで欠失している
ミトコンドリアＤＮＡの有無を検定することで、ハイブ
リッド種子の判定及び純度を検定できることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。
ハイブリッドのミトコンドリアＤＮＡに着目し、ハイブ
リッドでのみ特異的に欠失しているミトコンドリアＤＮ
Ａを検索し、細胞質雄性不稔イネで特異的に欠失してい
るミトコンドリアＤＮＡを見出だした。また、細胞融合
によって生み出した組換え型ミトコンドリアＤＮＡを有
する細胞質雄性不稔系統のイネでも、稔性回復系統や維
持系統には存在するミトコンドリアＤＮＡの一部が欠失
していることを見出した。さらに、本発明者らはこのミ
トコンドリアＤＮＡを特異的に検出する技術を開発し
た。この検出技術によってハイブリッドで欠失している
ミトコンドリアＤＮＡの有無を検定することで、ハイブ
リッド種子の判定及び純度を検定できることを見いだ
し、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち、本発明は、維持系統および稔性
回復系統のイネのミトコンドリアに存在し、細胞質雄性
不稔系統のイネのミトコンドリアでは欠失しているＤＮ
Ａが、判定すべき１粒のイネ種子または該種子由来の１
株の実生から抽出されたＤＮＡに存在するか否かを検査
することにより、該イネ種子或いは該イネ実生がハイブ
リッドであるか否かを判定することを特徴とする、ハイ
ブリッド種子の判定方法、及び維持系統および稔性回復
系統のイネのミトコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔
系統のイネのミトコンドリアでは欠失しているＤＮＡ
が、検定すべき２〜１０００粒のイネ種子または該種子
由来の２〜１０００株の実生から抽出されたＤＮＡにお
ける存在率を検査することにより、該イネ種子或いは該
イネ実生に占めるハイブリッドの割合を決定することを
特徴とする、ハイブリッド種子の純度検定方法である。
回復系統のイネのミトコンドリアに存在し、細胞質雄性
不稔系統のイネのミトコンドリアでは欠失しているＤＮ
Ａが、判定すべき１粒のイネ種子または該種子由来の１
株の実生から抽出されたＤＮＡに存在するか否かを検査
することにより、該イネ種子或いは該イネ実生がハイブ
リッドであるか否かを判定することを特徴とする、ハイ
ブリッド種子の判定方法、及び維持系統および稔性回復
系統のイネのミトコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔
系統のイネのミトコンドリアでは欠失しているＤＮＡ
が、検定すべき２〜１０００粒のイネ種子または該種子
由来の２〜１０００株の実生から抽出されたＤＮＡにお
ける存在率を検査することにより、該イネ種子或いは該
イネ実生に占めるハイブリッドの割合を決定することを
特徴とする、ハイブリッド種子の純度検定方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明における細胞質雄性不稔系
統とは、細胞質のミトコンドリアＤＮＡに存在する不稔
因子によって、雄性器官である花粉が正常に発達できな
くなり、その結果自殖によって自身の種子が遺伝的に形
成できない植物の系統を言う。この細胞質雄性不稔系統
雌性期間である雌しべは正常なため、正常な他の系統の
花粉を交配することによって、交配種子を形成すること
ができる。本発明における維持系統とは、細胞質雄性不
稔系統と核ゲノムの構成は同じであり、細胞質のミトコ
ンドリアＤＮＡには雄性不稔因子がないことのみが異な
る系統を言う。よって、維持系統の花粉は正常に発達で
きる。本発明における稔性回復系統とは、雄性不稔因子
の働きを抑制もしくは阻害する働きを持つ稔性回復遺伝
子を核ゲノムに持つ系統を言う。故に稔性回復系統は細
胞質雄性不稔系統と交配した場合、その子供であるハイ
ブリッドで、細胞質雄性不稔系統由来の不稔因子の働き
を抑制もしくは停止させることによって、花粉を正常に
発達させ、自殖種子を形成する能力を有する。従って、
細胞質雄性不稔系統に稔性回復系統を交配して得られた
ハイブリッドは自殖種子を形成できる。これら細胞質雄
性不稔系統、維持系統、稔性回復系統のミトコンドリア
ゲノムの構造はそれぞれ異なっている。
統とは、細胞質のミトコンドリアＤＮＡに存在する不稔
因子によって、雄性器官である花粉が正常に発達できな
くなり、その結果自殖によって自身の種子が遺伝的に形
成できない植物の系統を言う。この細胞質雄性不稔系統
雌性期間である雌しべは正常なため、正常な他の系統の
花粉を交配することによって、交配種子を形成すること
ができる。本発明における維持系統とは、細胞質雄性不
稔系統と核ゲノムの構成は同じであり、細胞質のミトコ
ンドリアＤＮＡには雄性不稔因子がないことのみが異な
る系統を言う。よって、維持系統の花粉は正常に発達で
きる。本発明における稔性回復系統とは、雄性不稔因子
の働きを抑制もしくは阻害する働きを持つ稔性回復遺伝
子を核ゲノムに持つ系統を言う。故に稔性回復系統は細
胞質雄性不稔系統と交配した場合、その子供であるハイ
ブリッドで、細胞質雄性不稔系統由来の不稔因子の働き
を抑制もしくは停止させることによって、花粉を正常に
発達させ、自殖種子を形成する能力を有する。従って、
細胞質雄性不稔系統に稔性回復系統を交配して得られた
ハイブリッドは自殖種子を形成できる。これら細胞質雄
性不稔系統、維持系統、稔性回復系統のミトコンドリア
ゲノムの構造はそれぞれ異なっている。
【００１２】本発明において利用される組換え型ミトコ
ンドリアＤＮＡとは、細胞質雄性不稔系統で特異的に欠
失しているＤＮＡ、即ち、維持系統および稔性回復系統
のイネのミトコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔系統
のイネのミトコンドリアでは欠失しているＤＮＡを指
す。よって、細胞質雄性不稔系統のミトコンドリアＤＮ
Ａ内で特異的に欠失していればいかなる欠失ＤＮＡでも
本発明の組換え型ミトコンドリアＤＮＡとして用いるこ
とが可能である。組換え型ミトコンドリアＤＮＡとして
は、イネのミトコンドリアのＦ０−ＡＴＰａｓｅのサブ
ユニット６をコードする遺伝子が例示できる。植物のミ
トコンドリアＤＮＡのサイズは非常に大きいにもかかわ
らず、コードしている遺伝子は多くとも５０個程度であ
り、ＤＮＡの大部分は生存に直接関わってはいない。そ
のため、植物のミトコンドリアＤＮＡは非常に変異が大
きく、植物種はもちろん同一植物内でも系統によってそ
の構造は大きく異なる。さらに、後述するように細胞融
合によって人為的にミトコンドリアＤＮＡの構造変異を
生み出すことが可能となっている。
ンドリアＤＮＡとは、細胞質雄性不稔系統で特異的に欠
失しているＤＮＡ、即ち、維持系統および稔性回復系統
のイネのミトコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔系統
のイネのミトコンドリアでは欠失しているＤＮＡを指
す。よって、細胞質雄性不稔系統のミトコンドリアＤＮ
Ａ内で特異的に欠失していればいかなる欠失ＤＮＡでも
本発明の組換え型ミトコンドリアＤＮＡとして用いるこ
とが可能である。組換え型ミトコンドリアＤＮＡとして
は、イネのミトコンドリアのＦ０−ＡＴＰａｓｅのサブ
ユニット６をコードする遺伝子が例示できる。植物のミ
トコンドリアＤＮＡのサイズは非常に大きいにもかかわ
らず、コードしている遺伝子は多くとも５０個程度であ
り、ＤＮＡの大部分は生存に直接関わってはいない。そ
のため、植物のミトコンドリアＤＮＡは非常に変異が大
きく、植物種はもちろん同一植物内でも系統によってそ
の構造は大きく異なる。さらに、後述するように細胞融
合によって人為的にミトコンドリアＤＮＡの構造変異を
生み出すことが可能となっている。
【００１３】本発明における組換え型ミトコンドリアＤ
ＮＡは組換え型ミトコンドリアＤＮＡを有する細胞質雄
性不稔イネから常法により抽出することができる。本発
明の組換え型ミトコンドリアＤＮＡを有する細胞質雄性
不稔イネの作出方法は以下のとおりである。常法に従
い、イネの栽培品種と細胞質雄性不稔細系統のプロトプ
ラストを非対称細胞融合することによって細胞質雄性不
稔イネを作出する。すなわち、３０ｍＭのヨードアセト
アミドで処理した栽培品種のプロトプラストと１２５ｋ
ｒａｄのＸ線を照射した細胞質雄性不稔細胞質を持つイ
ネのプロトプラストを電気刺激によって融合させる。融
合した細胞を培養し、増殖した雑種カルスから植物体を
再生させる。再生したイネ植物体から細胞質雄性不稔の
イネを選抜する。選抜されたイネのミトコンドリアＤＮ
Ａを抽出、分析し、融合前の両親のミトコンドリアＤＮ
Ａとは異なるミトコンドリアＤＮＡを持つイネをさらに
選抜する。これらに栽培品種のイネの花粉を交配させ交
配種子を得、さらに、交配種子を播種する。それらのイ
ネの細胞質雄性不稔性を調査し、安定した雄性不稔性を
示すイネを選抜する。
ＮＡは組換え型ミトコンドリアＤＮＡを有する細胞質雄
性不稔イネから常法により抽出することができる。本発
明の組換え型ミトコンドリアＤＮＡを有する細胞質雄性
不稔イネの作出方法は以下のとおりである。常法に従
い、イネの栽培品種と細胞質雄性不稔細系統のプロトプ
ラストを非対称細胞融合することによって細胞質雄性不
稔イネを作出する。すなわち、３０ｍＭのヨードアセト
アミドで処理した栽培品種のプロトプラストと１２５ｋ
ｒａｄのＸ線を照射した細胞質雄性不稔細胞質を持つイ
ネのプロトプラストを電気刺激によって融合させる。融
合した細胞を培養し、増殖した雑種カルスから植物体を
再生させる。再生したイネ植物体から細胞質雄性不稔の
イネを選抜する。選抜されたイネのミトコンドリアＤＮ
Ａを抽出、分析し、融合前の両親のミトコンドリアＤＮ
Ａとは異なるミトコンドリアＤＮＡを持つイネをさらに
選抜する。これらに栽培品種のイネの花粉を交配させ交
配種子を得、さらに、交配種子を播種する。それらのイ
ネの細胞質雄性不稔性を調査し、安定した雄性不稔性を
示すイネを選抜する。
【００１４】次に、組換え型ミトコンドリアＤＮＡを利
用したハイブリッド種子の判定方法をイネを例にして以
下に説明する。まず、１粒のイネ種子または該種子由来
の実生からＤＮＡを抽出する。抽出するための組織とし
ては種子該種子に由来する植物体の根、葉、など植物体
のあらゆる部分を利用でき、また精米も用いることがで
きる。ＤＮＡの抽出方法としてはどの様な方法も用いる
ことができる。得られるＤＮＡは高度に精製されている
必要はなく、粗精製のＤＮＡであっても以降の検査に用
いるいることができる。種子等より抽出されたＤＮＡを
用いた組換え型ミトコンドリアＤＮＡの検査は、系統間
の組換え型ミトコンドリアＤＮＡの比較解析によって行
うことができる。その際、ＤＮＡの検査は相補鎖間の相
補性を利用するハイブリダイゼーション法によって行う
ことができる。すなわち、抽出されたＤＮＡを制限酵素
で切断後、電気泳動によって分画し、フィルターに転写
する。転写されたフィルターに組換え型ミトコンドリア
ＤＮＡをプローブとしてサザンハイブリダイゼーション
を行ない、シグナルの有無によって組換え型ミトコンド
リアＤＮＡの有無を判別する。また、組換え型ミトコン
ドリアＤＮＡの欠失が小さな欠失である場合には、シグ
ナルのサイズの違いとして組換え型ミトコンドリアＤＮ
Ａの有無を判別することもできる。
用したハイブリッド種子の判定方法をイネを例にして以
下に説明する。まず、１粒のイネ種子または該種子由来
の実生からＤＮＡを抽出する。抽出するための組織とし
ては種子該種子に由来する植物体の根、葉、など植物体
のあらゆる部分を利用でき、また精米も用いることがで
きる。ＤＮＡの抽出方法としてはどの様な方法も用いる
ことができる。得られるＤＮＡは高度に精製されている
必要はなく、粗精製のＤＮＡであっても以降の検査に用
いるいることができる。種子等より抽出されたＤＮＡを
用いた組換え型ミトコンドリアＤＮＡの検査は、系統間
の組換え型ミトコンドリアＤＮＡの比較解析によって行
うことができる。その際、ＤＮＡの検査は相補鎖間の相
補性を利用するハイブリダイゼーション法によって行う
ことができる。すなわち、抽出されたＤＮＡを制限酵素
で切断後、電気泳動によって分画し、フィルターに転写
する。転写されたフィルターに組換え型ミトコンドリア
ＤＮＡをプローブとしてサザンハイブリダイゼーション
を行ない、シグナルの有無によって組換え型ミトコンド
リアＤＮＡの有無を判別する。また、組換え型ミトコン
ドリアＤＮＡの欠失が小さな欠失である場合には、シグ
ナルのサイズの違いとして組換え型ミトコンドリアＤＮ
Ａの有無を判別することもできる。
【００１５】また、組換え型ミトコンドリアＤＮＡの欠
失部分の塩基配列を利用したＰＣＲ法によっても組換え
型ミトコンドリアＤＮＡの有無を以下のような方法で判
別することができる。まず、抽出されたＤＮＡを鋳型と
して組換え型ミトコンドリアＤＮＡをＰＣＲ法によって
増幅する。組換え型ミトコンドリアＤＮＡの増幅の有無
や増幅の程度は、例えば増幅されたＤＮＡを電気泳動す
ることによって確認することができる。また、蛍光色素
等を利用して確認することもできる。
失部分の塩基配列を利用したＰＣＲ法によっても組換え
型ミトコンドリアＤＮＡの有無を以下のような方法で判
別することができる。まず、抽出されたＤＮＡを鋳型と
して組換え型ミトコンドリアＤＮＡをＰＣＲ法によって
増幅する。組換え型ミトコンドリアＤＮＡの増幅の有無
や増幅の程度は、例えば増幅されたＤＮＡを電気泳動す
ることによって確認することができる。また、蛍光色素
等を利用して確認することもできる。
【００１６】１粒の種子もしくは該種子由来の実生を対
象とした場合のハイブリッド種子であるか否かの判定
は、組換え型ミトコンドリアＤＮＡが検出された場合に
は、ハイブリッド種子ではないと判定し、逆に該ＤＮＡ
が検出されなかった場合には、ハイブリッドであると判
定する。
象とした場合のハイブリッド種子であるか否かの判定
は、組換え型ミトコンドリアＤＮＡが検出された場合に
は、ハイブリッド種子ではないと判定し、逆に該ＤＮＡ
が検出されなかった場合には、ハイブリッドであると判
定する。
【００１７】本発明のハイブリッド種子の純度検定方法
は、組換え型ミトコンドリアＤＮＡを、植物の種子また
は該種子由来の実生から抽出されたＤＮＡにおいて検査
することにおいては上記のハイブリッド種子の判定方法
と同様である。ハイブリッド種子の判定方法では、ＤＮ
Ａを抽出する対象植物が１粒の種子または該種子由来の
実生であるのに対し、ハイブリッド種子の純度検定方法
では、２〜１０００粒の種子または該種子由来の実生を
混ぜてそれらから一度にＤＮＡを抽出する点、及びハイ
ブリッド種子の判定方法では、判定を抽出されたＤＮＡ
中の組換え型ミトコンドリアＤＮＡの有無により判定す
るのに対し、ハイブリッド種子の純度検定方法では、抽
出されたＤＮＡ中の組換え型ミトコンドリアＤＮＡの存
在率により検定する点において相違している。
は、組換え型ミトコンドリアＤＮＡを、植物の種子また
は該種子由来の実生から抽出されたＤＮＡにおいて検査
することにおいては上記のハイブリッド種子の判定方法
と同様である。ハイブリッド種子の判定方法では、ＤＮ
Ａを抽出する対象植物が１粒の種子または該種子由来の
実生であるのに対し、ハイブリッド種子の純度検定方法
では、２〜１０００粒の種子または該種子由来の実生を
混ぜてそれらから一度にＤＮＡを抽出する点、及びハイ
ブリッド種子の判定方法では、判定を抽出されたＤＮＡ
中の組換え型ミトコンドリアＤＮＡの有無により判定す
るのに対し、ハイブリッド種子の純度検定方法では、抽
出されたＤＮＡ中の組換え型ミトコンドリアＤＮＡの存
在率により検定する点において相違している。
【００１８】ハイブリッド種子の純度検定方法は、具体
的には抽出されたＤＮＡ中の組換え型ミトコンドリアＤ
ＮＡの存在率をＤＮＡの電気泳動のシグナルとして検査
し、そのシグナルの強度でハイブリッドでない異物の存
在率即ち純度を決定する。
的には抽出されたＤＮＡ中の組換え型ミトコンドリアＤ
ＮＡの存在率をＤＮＡの電気泳動のシグナルとして検査
し、そのシグナルの強度でハイブリッドでない異物の存
在率即ち純度を決定する。
【００１９】以上述べたようなハイブリッド種子の純度
検定方法並びにハイブリッド種子の判定方法は、ミトコ
ンドリアのＤＮＡの構造差を利用したものであるが故
に、ミトコンドリアＤＮＡを有する如何なる植物種のハ
イブリッドにも適応可能である。
検定方法並びにハイブリッド種子の判定方法は、ミトコ
ンドリアのＤＮＡの構造差を利用したものであるが故
に、ミトコンドリアＤＮＡを有する如何なる植物種のハ
イブリッドにも適応可能である。
【００２０】
【実施例】以下に本発明を実施例に基づき、さらに詳細
に説明する。尚、以下の実施例２〜４で使用される組換
え型ミトコンドリアＤＮＡは、ハイブリッドライスのＭ
Ｈ２００５から容易に抽出することが可能である。本イ
ネ品種は、本発明の設定登録後、第三者に対して請求に
より、少量の種子の形態で分与される。
に説明する。尚、以下の実施例２〜４で使用される組換
え型ミトコンドリアＤＮＡは、ハイブリッドライスのＭ
Ｈ２００５から容易に抽出することが可能である。本イ
ネ品種は、本発明の設定登録後、第三者に対して請求に
より、少量の種子の形態で分与される。
【００２１】［実施例１］ 細胞質雄性不稔イネの作出 イネ維持系統であるＭＨＢ２５とChinsurah Boro IIの
細胞質を有するＭＴＣ−１０Ａの完熟種子を２ｐｐｍの
２，４−Ｄを含むＮ６寒天培地に置床した。２７℃で１
か月間培養し、増殖したカルスを２ｐｐｍの２，４−Ｄ
と０．３％カザミノ酸を含むＲ２液体培地に移植し、移
植後１週間毎に継代培養を行った。次に、非対称細胞融
合による細胞質雄性不稔イネの作出を以下のとおり行っ
た。培養３日目のそれぞれの培養細胞からプロトプラス
トを単離した。栽培品種ＭＨＢ２５のプロトプラストを
３０ｍＭのヨードアセトアミドで処理した。また、ＭＴ
Ｃ−１０Ａ由来のプロトプラストを１２５ｋｒａｄのＸ
線を照射した。これら２種類のプロトプラストを電気刺
激によって融合した。融合細胞を培養し、増殖した雑種
カルスを増殖させ、植物体を再生させた。再生したイネ
の９０％の株が細胞質雄性不稔に転換されていた。これ
ら細胞質雄性不稔系統うち１０個体および栽培品種ＭＴ
Ｂ２５、ＭＴＲ１８およびＭＴＣ−１０Ａの植物体から
ＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ
を数種類の制限酵素で切断し、０．８％アガロースゲル
にて電気泳動した。泳動後、ナイロンメンブレンフィル
ターに転写した。ミトコンドリアの遺伝子であるａｔｐ
α、ａｔｐ６、ａｔｐ９、ｃｏｘＩ、ｃｏｘＩＩ、ｃｏ
ｂ、ｒｒｎ１８をプローブとしてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。ハイブリダイゼーションは Molecu
lar cloning((1989)Sambrook,J.,Fritsch,E.,F.,,Mania
tis,T.,eds.,Cold Spring Harbor Lab.Press)に従って
行った。ハイブリダイゼーションのシグナルのパターン
を比較した結果、ＭＴＢ２５、ＭＴＲ１８およびＭＴＣ
−１０Ａの何れとも異なるシグナルパターンを示す細胞
質雄性不稔イネを４個体得た。これら４個体にＭＨＢ２
５の花粉を交配し、複数の交配種子を得た。交配後代に
さらにＭＨＢ２５の花粉を交配し、得られた交配種子を
系統として圃場にて栽培した。稔性を調査し、不稔性の
安定した３系統を選抜した。これら３系統のうちの１系
統を細胞質雄性不稔系統ＭＨＡ２５とした。
細胞質を有するＭＴＣ−１０Ａの完熟種子を２ｐｐｍの
２，４−Ｄを含むＮ６寒天培地に置床した。２７℃で１
か月間培養し、増殖したカルスを２ｐｐｍの２，４−Ｄ
と０．３％カザミノ酸を含むＲ２液体培地に移植し、移
植後１週間毎に継代培養を行った。次に、非対称細胞融
合による細胞質雄性不稔イネの作出を以下のとおり行っ
た。培養３日目のそれぞれの培養細胞からプロトプラス
トを単離した。栽培品種ＭＨＢ２５のプロトプラストを
３０ｍＭのヨードアセトアミドで処理した。また、ＭＴ
Ｃ−１０Ａ由来のプロトプラストを１２５ｋｒａｄのＸ
線を照射した。これら２種類のプロトプラストを電気刺
激によって融合した。融合細胞を培養し、増殖した雑種
カルスを増殖させ、植物体を再生させた。再生したイネ
の９０％の株が細胞質雄性不稔に転換されていた。これ
ら細胞質雄性不稔系統うち１０個体および栽培品種ＭＴ
Ｂ２５、ＭＴＲ１８およびＭＴＣ−１０Ａの植物体から
ＣＴＡＢ法によってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ
を数種類の制限酵素で切断し、０．８％アガロースゲル
にて電気泳動した。泳動後、ナイロンメンブレンフィル
ターに転写した。ミトコンドリアの遺伝子であるａｔｐ
α、ａｔｐ６、ａｔｐ９、ｃｏｘＩ、ｃｏｘＩＩ、ｃｏ
ｂ、ｒｒｎ１８をプローブとしてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。ハイブリダイゼーションは Molecu
lar cloning((1989)Sambrook,J.,Fritsch,E.,F.,,Mania
tis,T.,eds.,Cold Spring Harbor Lab.Press)に従って
行った。ハイブリダイゼーションのシグナルのパターン
を比較した結果、ＭＴＢ２５、ＭＴＲ１８およびＭＴＣ
−１０Ａの何れとも異なるシグナルパターンを示す細胞
質雄性不稔イネを４個体得た。これら４個体にＭＨＢ２
５の花粉を交配し、複数の交配種子を得た。交配後代に
さらにＭＨＢ２５の花粉を交配し、得られた交配種子を
系統として圃場にて栽培した。稔性を調査し、不稔性の
安定した３系統を選抜した。これら３系統のうちの１系
統を細胞質雄性不稔系統ＭＨＡ２５とした。
【００２２】［実施例２］ ハイブリッド種子の判定
（１） ハイブリッドライスＭＨ２００５およびその親系統であ
るＭＨＲ１８とＭＨＡ２５の１株の実生よりＣＴＡＢ法
によってＤＮＡを抽出した。また、通常の栽培品種であ
るコシヒカリ、日本晴、ササニシキおよびあきたこまち
のそれぞれ１株の実生からも同様にＤＮＡを抽出した。
抽出されたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、０．
８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、ナイロ
ンメンブレンフィルターに転写した。イネミトコンドリ
アａｔｐ６遺伝子（Akagi et al.(1993)Current Geteti
cs,25:52-58）をプローブとしてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。ハイブリダイゼーションは実施例１
と同様に行った。ＭＨＲ１８では、１．６ｋｂのバンド
と２．２ｋｂのバンドが検出され、ＭＨＡ２５では２．
２ｋｂのバンドのみが検出された。これに対して、ＭＨ
２００５では１．６ｋｂのバンドのみが検出された。ま
た、コシヒカリ、日本晴、ササニシキおよびあきたこま
ちでは２．２ｋｂのバンドのみが検出された。すなわ
ち、ＭＨ２００５では２．２ｋｂのバンドが特異的に欠
失していることが明らかとなり、２．２ｋｂのバンドを
有するもののはＭＨ２００５ではないと判定することが
できた。
（１） ハイブリッドライスＭＨ２００５およびその親系統であ
るＭＨＲ１８とＭＨＡ２５の１株の実生よりＣＴＡＢ法
によってＤＮＡを抽出した。また、通常の栽培品種であ
るコシヒカリ、日本晴、ササニシキおよびあきたこまち
のそれぞれ１株の実生からも同様にＤＮＡを抽出した。
抽出されたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、０．
８％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、ナイロ
ンメンブレンフィルターに転写した。イネミトコンドリ
アａｔｐ６遺伝子（Akagi et al.(1993)Current Geteti
cs,25:52-58）をプローブとしてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。ハイブリダイゼーションは実施例１
と同様に行った。ＭＨＲ１８では、１．６ｋｂのバンド
と２．２ｋｂのバンドが検出され、ＭＨＡ２５では２．
２ｋｂのバンドのみが検出された。これに対して、ＭＨ
２００５では１．６ｋｂのバンドのみが検出された。ま
た、コシヒカリ、日本晴、ササニシキおよびあきたこま
ちでは２．２ｋｂのバンドのみが検出された。すなわ
ち、ＭＨ２００５では２．２ｋｂのバンドが特異的に欠
失していることが明らかとなり、２．２ｋｂのバンドを
有するもののはＭＨ２００５ではないと判定することが
できた。
【００２３】［実施例３］ ハイブリッド種子の判定
（２） ハイブリッドライスのＭＨ２００５およびその親系統で
あるＭＨＡ２５とＭＨＢ２５とＭＨＲ１８を用いた。Ｍ
ＨＡ２５は細胞質雄性不稔系統、ＭＨＢ２５は維持系
統、ＭＨＲ１８は稔性回復系統である。また、対照とし
て、コシヒカリ、日本晴、ササニシキおよびあきたこま
ちを供試した。それぞれの、玄米１粒を２ｍｌのエッペ
ンドルフチューブに入れ、金属棒とハンマーで破砕し
た。これに４００μｌのＥｄｗａｒｄｓらの抽出液（Nu
cleic Acid Resarch,Vol.19,p.1349,(1992)）を加え、
１００゜Ｃで１０分間処理した。処理後、遠心によって
上澄を回収し、等量の２−プロパノールを添加して、遠
心によってＤＮＡを沈殿・回収した。抽出されたＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲを行った。細胞質雄性不稔系統で欠
失している組換え型ミトコンドリアＤＮＡを検出するプ
ライマーとして配列番号２と配列番号３のオリゴヌクレ
オチドを用いた。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ９６００シス
テム（ＡＢＩ社）を使用し、２０μｌの反応量で行っ
た。反応液２０μｌ中には１０ｎｇ ＤＮＡ，０．５ｕ
ｎｉｔｓ、ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社），
４ｎｍｏｌｅ ｄＮＴＰ，１０ｐｍｏｌｅ ｐｒｉｍｅ
ｒ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０
ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２が含まれる。ＰＣ
Ｒ条件は、９５℃で１０秒間のディネーチャー、６０℃
で３０秒間のアニール、７２℃で３０秒間の伸長反応を
１サイクルとし、３５サイクル反応で行った。反応後、
１％アガロースゲルによってＤＮＡを分画し、エチジュ
ウムブロマイドでゲルを染色して観察した。ＭＨＲ１８
とＭＨＢ２５および対照としたコシヒカリ、日本晴、サ
サニシキあきたこまちの玄米からは、何れも約２ｋｂの
バンドが増幅されたのに対して、ＭＨ２００５およびそ
の母親系統であるＭＨＡ２５の玄米から抽出したＤＮＡ
を鋳型とした場合には約２ｋｂのバンドの増幅は見られ
なかった（図１）。母親系統自体は種子として混入する
可能性がないので、バンドが増幅されたものはＭＨ２０
０５ではないと判定できた。
（２） ハイブリッドライスのＭＨ２００５およびその親系統で
あるＭＨＡ２５とＭＨＢ２５とＭＨＲ１８を用いた。Ｍ
ＨＡ２５は細胞質雄性不稔系統、ＭＨＢ２５は維持系
統、ＭＨＲ１８は稔性回復系統である。また、対照とし
て、コシヒカリ、日本晴、ササニシキおよびあきたこま
ちを供試した。それぞれの、玄米１粒を２ｍｌのエッペ
ンドルフチューブに入れ、金属棒とハンマーで破砕し
た。これに４００μｌのＥｄｗａｒｄｓらの抽出液（Nu
cleic Acid Resarch,Vol.19,p.1349,(1992)）を加え、
１００゜Ｃで１０分間処理した。処理後、遠心によって
上澄を回収し、等量の２−プロパノールを添加して、遠
心によってＤＮＡを沈殿・回収した。抽出されたＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲを行った。細胞質雄性不稔系統で欠
失している組換え型ミトコンドリアＤＮＡを検出するプ
ライマーとして配列番号２と配列番号３のオリゴヌクレ
オチドを用いた。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ９６００シス
テム（ＡＢＩ社）を使用し、２０μｌの反応量で行っ
た。反応液２０μｌ中には１０ｎｇ ＤＮＡ，０．５ｕ
ｎｉｔｓ、ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社），
４ｎｍｏｌｅ ｄＮＴＰ，１０ｐｍｏｌｅ ｐｒｉｍｅ
ｒ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０
ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２が含まれる。ＰＣ
Ｒ条件は、９５℃で１０秒間のディネーチャー、６０℃
で３０秒間のアニール、７２℃で３０秒間の伸長反応を
１サイクルとし、３５サイクル反応で行った。反応後、
１％アガロースゲルによってＤＮＡを分画し、エチジュ
ウムブロマイドでゲルを染色して観察した。ＭＨＲ１８
とＭＨＢ２５および対照としたコシヒカリ、日本晴、サ
サニシキあきたこまちの玄米からは、何れも約２ｋｂの
バンドが増幅されたのに対して、ＭＨ２００５およびそ
の母親系統であるＭＨＡ２５の玄米から抽出したＤＮＡ
を鋳型とした場合には約２ｋｂのバンドの増幅は見られ
なかった（図１）。母親系統自体は種子として混入する
可能性がないので、バンドが増幅されたものはＭＨ２０
０５ではないと判定できた。
【００２４】［実施例４］ ハイブリッド種子の純度検
定 ハイブリッドライスＭＨ２００５の玄米とその親系統で
あるＭＨＲ１８の玄米を用いた。ＭＨ２００５を５０粒
とＭＨＲ１８を５０粒混合した１００粒の玄米、ＭＨ２
００５を９０粒とＭＨＲ１８を１０粒混合した１００粒
の玄米、ＭＨ２００５を９５粒とＭＨ１８を５粒混合し
た１００粒の玄米、およびＭＨ２００５を９９粒とＭＨ
Ｒ１８を１粒混合した１００粒の玄米から、ＣＴＡＢ法
によってそれぞれＤＮＡを抽出した。対照として１００
粒のＭＨ２００５の玄米および１００粒のＭＨＲ１８の
玄米からも同様にＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡを
鋳型として、配列番号２と配列番号４のＤＮＡをプライ
マーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ９
６００システム（ＡＢＩ社）を使用し、２０μｌの反応
量で行った。反応液２０μｌ中には１０ｎｇ ＤＮＡ，
０．５ｕｎｉｔｓ、ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲ
Ａ社），４ｎｍｏｌｅ ｄＮＴＰ，１０ｐｍｏｌｅ ｐ
ｒｉｍｅｒ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３），５０ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２が含ま
れる。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０秒間のディネーチャ
ー、６０℃で３０秒間のアニール、７２℃で３０秒間の
伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応で行っ
た。反応後、１％アガロースゲルでＤＮＡを分画した。
ＭＨＲ１８単独のみの場合は約２ｋｂのバンドが増幅さ
れ、ＭＨ２００５のみの場合はバンドは増幅されなかっ
た（図２）。ＭＨ２００５にＭＨＲ１８を混ぜた場合、
９９：１でＭＨＲ１８が混入した場合でも増幅産物が検
出された（図２）。増幅の程度はＭＨＲ１８の混入量に
比例して増加した（図２）。すなわち、１／１００の比
率で異種の種子が混入した場合にその混入を検出するこ
とができた。さらに、混入割合は即ちハイブリッド種子
の純度はＤＮＡの増幅量を予め設定されたスタンダード
と比較することで推定できることがわかった。
定 ハイブリッドライスＭＨ２００５の玄米とその親系統で
あるＭＨＲ１８の玄米を用いた。ＭＨ２００５を５０粒
とＭＨＲ１８を５０粒混合した１００粒の玄米、ＭＨ２
００５を９０粒とＭＨＲ１８を１０粒混合した１００粒
の玄米、ＭＨ２００５を９５粒とＭＨ１８を５粒混合し
た１００粒の玄米、およびＭＨ２００５を９９粒とＭＨ
Ｒ１８を１粒混合した１００粒の玄米から、ＣＴＡＢ法
によってそれぞれＤＮＡを抽出した。対照として１００
粒のＭＨ２００５の玄米および１００粒のＭＨＲ１８の
玄米からも同様にＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡを
鋳型として、配列番号２と配列番号４のＤＮＡをプライ
マーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ９
６００システム（ＡＢＩ社）を使用し、２０μｌの反応
量で行った。反応液２０μｌ中には１０ｎｇ ＤＮＡ，
０．５ｕｎｉｔｓ、ＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲ
Ａ社），４ｎｍｏｌｅ ｄＮＴＰ，１０ｐｍｏｌｅ ｐ
ｒｉｍｅｒ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３），５０ｍＭＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２が含ま
れる。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０秒間のディネーチャ
ー、６０℃で３０秒間のアニール、７２℃で３０秒間の
伸長反応を１サイクルとし、３５サイクル反応で行っ
た。反応後、１％アガロースゲルでＤＮＡを分画した。
ＭＨＲ１８単独のみの場合は約２ｋｂのバンドが増幅さ
れ、ＭＨ２００５のみの場合はバンドは増幅されなかっ
た（図２）。ＭＨ２００５にＭＨＲ１８を混ぜた場合、
９９：１でＭＨＲ１８が混入した場合でも増幅産物が検
出された（図２）。増幅の程度はＭＨＲ１８の混入量に
比例して増加した（図２）。すなわち、１／１００の比
率で異種の種子が混入した場合にその混入を検出するこ
とができた。さらに、混入割合は即ちハイブリッド種子
の純度はＤＮＡの増幅量を予め設定されたスタンダード
と比較することで推定できることがわかった。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、ハイブリッド種子の判定
方法及びハイブリッド種子の純度検定方法が提供され
る。本発明の方法は細胞質雄性不稔系統に特異的に欠失
しているミトコンドリアＤＮＡを検査することによっ
て、ハイブリッドであるか否かの判定及びハイブリッド
種子群のハイブリッド種子の純度を簡便に精度高く実施
できる。本発明の方法により、複数の種子を１度にバル
クで検定することが可能となり、純度検定効率が飛躍的
に効率化される。
方法及びハイブリッド種子の純度検定方法が提供され
る。本発明の方法は細胞質雄性不稔系統に特異的に欠失
しているミトコンドリアＤＮＡを検査することによっ
て、ハイブリッドであるか否かの判定及びハイブリッド
種子群のハイブリッド種子の純度を簡便に精度高く実施
できる。本発明の方法により、複数の種子を１度にバル
クで検定することが可能となり、純度検定効率が飛躍的
に効率化される。
【００２６】
配列番号：１ 配列の長さ：2305 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Oryza sativa L. cv 株名：MTB25 オルガネラ名：ミトコンドリア 配列： AGAGTGAGAA TAGTTGTGAA TCAATGAGTT GATCACTAAA AAGAAGAAAA GGGAATAATA 60 TAATGAAGAT AAGAAGAATT GCCGGAATGA GACTAATCTA GTAAAGGGAG AGGAAGGACT 120 GTCCTCTCGG GGAGGATTCT CGGAAGTTAA TAAGGTGGTA GCAGAGAAGA AAAGGCCAAG 180 CTATCATATT AGGCAAGCAA TGTCCCGGGC ATGCGAAACA GTGGTAAGAA AGTTAAGTAG 240 GATATCTTGA CCTTTGGTGA ACAACGTAGC GTGTCTCGTT CTTTCTTTCT TTTGTTGCCG 300 TACTTGGTAG GCTCCTTGTC CCCTTGATTG TGATTCCGTA CTTTGCCTAT TCGGTATTCC 360 GAGAGGCTGG TCGGATTGGG TTACAGCCTT GTCTGTATAG GAGTATCAGA ATGCTTTACT 420 GCCTTAGTGA AATTTGCTGC CTGTCTGGTT TGTCTGGGAC AGGGTGCCTT TTGCCTATAT 480 GATTATCAGG CTTCCTTACT TATACTACTC TTCTAAACCA CGTAGGGCGA GGGTAGGGAA 540 ATTCATCCCA ACCAATAGCA GTGAGTTAGC TATAACTACT AGGCCTAGAG TAAAGTAGTA 600 GGGCTTTCTG AGGAGTAAGC CTAATTCCGT TAATGCAGAA AGATCTTTCC CAGTCCCAGA 660 TAGAAGAGTA CCAACCAAAG AAGCAAAAGC AAGACCTCAC TAGTAAGGAA GGCACTTGCT 720 GCCGGAGTTC AACAGGCAAA TATAAGAAAA GAAGTCCTGT TCACTTCATC ATCTGTGGGT 780 TGTACTGCTT GAAGGTTCTT CTGAGGGGTA GAATTCGAAT TTCTTCTTTG CTTGTGAGAT 840 AACCATTTCC AGAAACTCAT ATATAGAGAG CGGGTATCGG TGAAAATGGA TCTTACCAGG 900 AGTGGCATTG AATAGGCAGG CTCTGGGATG TAATCTCACT CAAGAGGTCA TTTGTTGGCC 960 CCGCCTTCAC TAGACTAGAG TTTTAGGATA GGTTGGGGAA CCTATACGTC AAGCCCCTAC 1020 GAAGATTGAG AAAAATCGAT GCACATAAGC CATCCGAAAC CAGTATTGGA AAGTGTTCAG 1080 TTTCGTTTTC CATTCTGAAA TGTTCATAGT AGTATAGTAT GTTTTCCGTT GGGTCGACGC 1140 CATGTGATCG CTACTAAAGA TAGAGTTTCC TTGGAAAAAC CGAGGCCAGT TGAGATCAGT 1200 CTCCCTTTCT AGGAGCAGAG CTTAAAAAGA TGGGAAATTC CAATGAATTT CGATCACAAT 1260 CATGTGGTAA TAATGGGTTT GAATCAGAGA GACTCGATCT GGAAACTCCT CAATGATTAT 1320 AACGTGAACT CGTTGAAGAG AAGGAGACAA GCAGAAATAG ACGCTTTTTT TGAACCATTT 1380 GAGAGGGCGC AGCGTATCCG TTTCAATAAC TGGCAGAACG GAATAGAGTT GTTAGATGGG 1440 GCTGAATGGA GGAACGGCGA TATAGTTATC CCTGGAGGCG GCGGACCAGT AATTTCAAGC 1500 CCCTTGGATC AATTTTTCAT TGATCCATTA TTTGGTCTTG ATATGGGTAA CTTTTATTTA 1560 TCATTCACAA ATGAATCCTT GTCTATGGCG GTAACTGTCG TTTTGGTGCC ATCTTTATTT 1620 GGAGTTGTTA CGAAAAAGGG CGGGGGAAAG TCAGTGCCAA ATGCATGGCA ATCCTTGGTA 1680 GAGCTTATTT ATGATTTCGT GCTGAACCTG GTAAACGAAC AAATAGGTGG AAATGTTAAA 1740 CAAAAGTTTT TCCCTCGCAT CTCGGTCACT TTTACTTTTT CGTTATTTCG TAATCCCCAG 1800 GGTATGATAC CCTTTTCCAT TTTTATAGGC ATTACGATCG TTGGATTTCA AAGACATGGG 1860 CTTCATTTTT TTAGCTTCTT ATTACCAGCG GGAGTCCCAC TGCCATTAGC ACCTTTTTTA 1920 GTACTCCTTG AGCTAATCTC TCATTGTTTT CGTGCATTAA GCTCAGGAAT ACGTTTATTT 1980 GCTAATATGA TGGCCGGTCA TAGTTCAGTA AAGATTTTAA GTGGGTTCGC TTGGACTATG 2040 CTATTTCTGA ATAATATTTT CTATTTCATA GGAGATCTTG GTCCCTTATT TATAGTTCTA 2100 GCATTAACCG GTCTGGAATT AGGTGTAGCT ATATTACAAG CTCATGTTTC TACGATCTCA 2160 ATTTGTATTT ACTTGAATGA TGCTATAAAT CTCCATCAAA ATGAGTAATT TCATAATTGA 2220 ATAAAAACGA GGAGCCGAAG ATTTTAGGGG GCGGGACAAA CGCGGAAGTG TATTGCGTTA 2280 CAAAAAATGA CAACTAGCAT TTGTT 2305
【００２７】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列： TCCGTACTTT GCCTATTCGG 20
【００２８】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列： AGAGAAGAGT TCAGCCATGG 20
【００２９】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列： ATGGCAAATC TGGTCCGATG 20
【図１】 細胞質雄性不稔系統で特異的に欠失している
ミトコンドリアＤＮＡをＰＣＲによって増幅した結果を
示す電気泳動写真である。各クレーンには鋳型としたＤ
ＮＡを抽出した品種名を示す。
ミトコンドリアＤＮＡをＰＣＲによって増幅した結果を
示す電気泳動写真である。各クレーンには鋳型としたＤ
ＮＡを抽出した品種名を示す。
【図２】 細胞質雄性不稔系統で欠失しているミトコン
ドリアＤＮＡのＰＣＲによる検出感度を調べた結果を示
す電気泳動写真である。
ドリアＤＮＡのＰＣＲによる検出感度を調べた結果を示
す電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 藤村 達人 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内
Claims (12)
- 【請求項１】 維持系統および稔性回復系統のイネのミ
トコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔系統のイネのミ
トコンドリアでは欠失しているＤＮＡが、判定すべき１
粒のイネ種子または該種子由来の１株の実生から抽出さ
れたＤＮＡに存在するか否かを検査することにより、該
イネ種子或いは該イネ実生がハイブリッドであるか否か
を判定することを特徴とする、ハイブリッド種子の判定
方法。 - 【請求項２】 維持系統および稔性回復系統のイネのミ
トコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔系統のイネのミ
トコンドリアでは欠失しているＤＮＡが配列番号１で示
されるイネのミトコンドリアのＦ０−ＡＴＰａｓｅのサ
ブユニット６をコードする遺伝子であることを特徴とす
る請求項１に記載のハイブリッド種子の判定方法。 - 【請求項３】 維持系統および稔性回復系統のイネのミ
トコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔系統のイネのミ
トコンドリアでは欠失しているＤＮＡが、判定すべきイ
ネ種子または該種子由来の実生から抽出されたＤＮＡに
存在するか否かを、相補性を利用するハイブリダイゼー
ション法により検査することを特徴とする請求項１に記
載のハイブリッド種子の判定方法。 - 【請求項４】 判定すべきイネ種子または該種子由来の
実生から抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法でＤＮ
Ａ増幅することを特徴とする請求項１に記載のハイブリ
ッド種子の判定方法。 - 【請求項５】 植物がイネ以外のミトコンドリアＤＮＡ
を有する植物である請求項１〜４の何れか一項に記載の
ハイブリッド種子の判定方法。 - 【請求項６】 維持系統および稔性回復系統のイネのミ
トコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔系統のイネのミ
トコンドリアでは欠失しているＤＮＡが、検定すべき２
〜１０００粒のイネ種子または該種子由来の２〜１００
０株の実生から抽出されたＤＮＡにおける存在率を検査
することにより、該イネ種子或いは該イネ実生に占める
ハイブリッドの割合を決定することを特徴とする、ハイ
ブリッド種子の純度検定方法。 - 【請求項７】 維持系統および稔性回復系統のイネのミ
トコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔系統のイネのミ
トコンドリアでは欠失しているＤＮＡが配列番号１で示
されるイネのミトコンドリアのＦ０−ＡＴＰａｓｅのサ
ブユニット６をコードする遺伝子であることを特徴とす
る請求項６に記載のハイブリッド種子の純度検定方法。 - 【請求項８】 維持系統および稔性回復系統のイネのミ
トコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔系統のイネのミ
トコンドリアでは欠失しているＤＮＡが、検定すべきイ
ネ種子または該種子由来の実生から抽出されたＤＮＡに
おける存在を、相補性を利用するハイブリダイゼーショ
ン法により検査することを特徴とする請求項６に記載の
ハイブリッド種子の純度検定方法。 - 【請求項９】 検定すべきイネ種子または該種子由来の
実生から抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法でＤＮ
Ａ増幅することを特徴とする請求項６に記載のハイブリ
ッド種子の純度検定方法。 - 【請求項１０】 植物がイネ以外のミトコンドリアＤＮ
Ａを有する植物である請求項６〜９の何れか一項に記載
のハイブリッド種子の純度検定方法。 - 【請求項１１】 イネの維持系統および稔性回復系統の
ミトコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔系統のイネの
ミトコンドリアでは欠失しているＤＮＡを有する細胞質
雄性不稔イネ。 - 【請求項１２】 配列番号１で示されるイネのミトコン
ドリアのＦ０−ＡＴＰａｓｅのサブユニット６をコード
する遺伝子が欠落した組換え型ミトコンドリアＤＮＡを
有する請求項１１記載の細胞質雄性不稔イネ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9111820A JPH10286093A (ja) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | ハイブリッド種子の判定方法及び純度検定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9111820A JPH10286093A (ja) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | ハイブリッド種子の判定方法及び純度検定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10286093A true JPH10286093A (ja) | 1998-10-27 |
Family
ID=14570988
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9111820A Pending JPH10286093A (ja) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | ハイブリッド種子の判定方法及び純度検定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10286093A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002024900A1 (fr) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Japan Tobacco Inc. | Procede de detection de graines de riz contaminantes |
| CN111512959A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-11 | 汉中职业技术学院 | 一种可早期鉴定种子纯度的杂交油菜育种方法 |
-
1997
- 1997-04-15 JP JP9111820A patent/JPH10286093A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002024900A1 (fr) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Japan Tobacco Inc. | Procede de detection de graines de riz contaminantes |
| CN111512959A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-11 | 汉中职业技术学院 | 一种可早期鉴定种子纯度的杂交油菜育种方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hasan et al. | Recent advancements in molecular marker-assisted selection and applications in plant breeding programmes | |
| Leblanc et al. | Detection of the apomictic mode of reproduction in maize-Tripsacum hybrids using maize RFLP markers | |
| Barcaccia et al. | Inheritance of parthenogenesis in Poa pratensis L.: auxin test and AFLP linkage analyses support monogenic control | |
| Talukder et al. | Linkage mapping and genome-wide association studies of the Rf gene cluster in sunflower (Helianthus annuus L.) and their distribution in world sunflower collections | |
| Wilkinson et al. | Evidence for somatic translocation during potato dihaploid induction | |
| Usatov et al. | Introgression of the rice blast resistance genes Pi1, Pi2 and Pi33 into Russian rice varieties by marker-assisted selection | |
| López et al. | Self-incompatibility genotypes in almond re-evaluated by PCR, stylar ribonucleases, sequencing analysis and controlled pollinations | |
| WO2002077277A2 (en) | Dna markers for assessing seed purity and a method of using dna sequences for assessing seed purity | |
| Pooler et al. | Aberrant transmission of RAPD markers in haploids, doubled haploids, and F1 hybrids of peach: observations and speculation on causes | |
| Villalta et al. | Comparative microsatellite linkage analysis and genetic structure of two populations of F 6 lines derived from Lycopersicon pimpinellifolium and L. cheesmanii | |
| CN111334597B (zh) | 用于检测西瓜白粉病抗性的snp位点、kasp标记及其应用 | |
| BR112017002448B1 (pt) | Método de identificação de planta de milho com resistência à helmintosporiose do milho e método de introgressão de alelos de qtl em plantas de milho | |
| Shen et al. | Linkage analysis of a fertility restoring mutant generated from CMS rice | |
| US10590491B2 (en) | Molecular markers associated with Mal de Rio Cuarto Virus in maize | |
| 天野淳二 et al. | Early identification of intra-and intergeneric hybrids among Colchicaceous ornamentals, Gloriosa spp., Littonia modesta Hook. and Sandersonia aurantiaca Hook., by flow cytometry and random amplified polymorphic DNA analyses | |
| EP2848701B1 (en) | Genetic loci on maize chromosomes 3 and 4 that are associated with Fusarium ear mold resistance | |
| JPH10286093A (ja) | ハイブリッド種子の判定方法及び純度検定方法 | |
| Liu et al. | Genetic diversity and the population structure at two ploidy levels of Lycoris radiata as revealed by SCoT analysis | |
| Kong et al. | Characterization of T. aestivum-H. californicum chromosome addition lines DA2H and MA5H | |
| Zhang et al. | Use of hybrid rice and the proliferation of weedy rice: A case in Jiangsu, China | |
| CN111961742B (zh) | 重组核苷酸片段RecS5-1和RecS5-2及其检测引物与应用 | |
| CN116287403B (zh) | 一种创造优势杂交粳稻的育种方法 | |
| US20230183732A1 (en) | Stalk rot-resistant maize plants | |
| KR100580266B1 (ko) | 무사마귀병 저항성 유전자에 대한 ｄｎａ 표지 | |
| JP2000512153A (ja) | グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素および細胞質性雄性不稔の核性回復 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060822 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061219 |