JPH10276764A - 低栄養性微生物の検索方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 栄養塩類を添加することなしに、低栄養条件
である自然環境の浄化、あるいは製油所や化学工場など
の低栄養排水の処理に有用な微生物の検索方法の提供。 【解決手段】 ５ｐｐｍ以下のリンおよび５０ｐｐｍ以
下の窒素を配合した培地を用いて行うことを特徴とする
低栄養性微生物の検索方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明はリン、窒素等の栄養塩濃度のみが
低い低栄養条件で生育し、環境汚染物質を分解すること
のできる微生物の検索方法に関するものである。

【０００２】

【従来技術】自然環境は一般的に低栄養条件であると考
えられており、また製油所や化学工場などの排水は、リ
ンや窒素に乏しい低栄養排水であるので、通常知られて
いる微生物は生育できない。従来の環境浄化技術では、
汚染環境に（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ＮＨ₄Ｃｌ、Ｎａ₃ＰＯ₄、
Ｎａ₂ＨＰＯ₄等の栄養塩類を添加し、微生物の活性を高
める方法が行われている[（Ｄ．Ａ．Ｇｒａｖｅｓら、
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８，Ｐ８１３
（１９９１）:原山 重明、「地球をまもる小さな生き
物たち」、技報堂出版、Ｐ１０９（１９９５）:西村
実、土と微生物、Ｎｏ４６、Ｐ１９（１９９５）：Ｃ．
Ｈ．Ｎｅｌｓｏｎら、「Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ Ｂｉ
ｏｒｅｍｗｄｉａｔｉｏｎ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｐ
１２５（１９９４））]。また排水処理においても、微
生物の生育と活性を保つために炭素：リン：窒素の割合
を制御することが必要であると考えられている。炭素：
リン：窒素の割合を制御するためには、排水に栄養塩を
添加する方法が一般的である〔「廃水処理技術指導
書」、石油連盟、Ｐ１２９（１９７５）：「公害防止の
技術と法規」、財団法人産業公害防止協会、Ｐ２１５
（１９９２）〕。さらに特開平６−５００４９５では汚
染環境に栄養塩を効率よく持続的に与えるための方法が
記されており、また特開平７−５０７２０８ではリン酸
エステルを添加することにより、栄養物質の供給と同時
に汚染物質を乳化させる方法が記されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】前記のように自然、環
境浄化や低栄養排水の処理には栄養塩類を添加して微生
物の活性を高めることが必要である。しかし汚染環境や
排水に添加する栄養塩類は、環境浄化や排水処理にかか
るコストの１つである。特に浄化しようとする汚染場所
が広い範囲であったり、あるいは処理をしようとする排
水量が多い場合には添加する栄養塩類にかかる費用は莫
大なものとなる。さらに過剰に添加した栄養塩類は、地
下水の硝酸汚染や環境の富栄養化等の二次汚染の原因と
なるので、添加方法や添加量の制御は重要である。

【０００４】すなわち、窒素源は、土壌微生物の作用に
より酸化されて硝酸体となる。したがって窒素源を過剰
に与えると土壌や地下水中の硝酸イオン濃度が高くな
る。硝酸イオンは、発ガン性が指摘されており、飲料水
への混入が問題となっている（鶴巻 道二、「地下水汚
染・土壌汚染の現状と浄化対策」、工業技術会、Ｐ９８
（１９９３））。また、過剰に添加した栄養塩類、特に
リンおよび窒素源が雨水や地下水によって河川や湖沼に
流入すると環境の富栄養化を引き起こす。環境の富栄養
化はアオコの異常発生や飲料水のカビ臭の原因となるた
め、生活排水中のリンや窒素を除去する方法が数多く提
案されている〔中村 和憲、「微生物の生態１７」、学
会出版センター、Ｐ３１（１９９１）：深瀬 哲朗、
「地球をまもる小さな生き物たち」、技報堂出版、Ｐ１
３３（１９９５）〕。Ｐ．Ｍｏｒｇａｎらは土壌環境に
栄養塩類を添加することが土着微生物の有機物質の分解
活性を阻害することを指摘している〔Ｗａｔ．Ｓｃｉ．
Ｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．６，Ｐ６３（１９９０）〕。添加
した栄養塩類による二次汚染を回避するには、栄養塩類
をコントロールしながら添加することが必要である。し
かしこの様な制御装置を排水処理設備に設置すること
は、設備をより高価なものとし、排水の処理コストを増
大させる。さらに汚染土壌や地下水等の汚染環境は解放
系であるため、栄養塩類をコントロールしながら効率よ
く添加するには、何らかの方法で汚染環境を閉鎖する必
要がある。しかし汚染環境を土木的方法によって閉鎖す
るには、多額な資金が必要であり、特に汚染環境が広い
場合には技術的に困難である。したがって汚染環境にお
いて、添加した栄養塩類による二次汚染を防ぐことは事
実上不可能と言わざるを得ない。

【０００５】低栄養性微生物の存在は古くから知られて
おり、多くの研究がなされている。これまで低栄養性微
生物は生育条件の中の有機炭素量でのみ論じられてお
り、有機炭素濃度が１〜１５ｐｐｍ以下で生育可能な微
生物が低栄養性微生物と称されて研究されている[（畝
本 力、「特殊環境に生きる細菌の巧みなライフスタイ
ル」、共立出版、Ｐ７（１９９３）：江口 充、「海洋
微生物とバイオテクノロジー」、技報堂出版、Ｐ６８
（１９９１）：諏訪 裕一ら、「微生物の分離法」、Ｒ
＆Ｄプランニング、Ｐ５４５（１９９０）]。しかしな
がら自然汚染環境あるいは製油所や化学工場の排水は、
汚染物質である有機炭素の濃度が高く、その他のリン、
窒素等の栄養塩濃度のみが低い状態にある。この様な有
機炭素の濃度が高く、その他のリン、窒素等の栄養塩濃
度のみが低い条件で生育し汚染物質を分解する微生物
は、従来の低栄養性微生物の概念に当てはまらないもの
であり、これまでに報告がない。

【０００６】本発明の目的は、栄養塩類を添加すること
なしに、低栄養条件である自然環境の浄化、あるいは製
油所や化学工場などの低栄養排水の処理に有用な微生物
の検索方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、栄養塩類
を添加することなしに、低栄養条件である自然環境の浄
化あるいは製油所や化学工場などの低栄養排水の処理技
術を提供することを目的として多くの実験を行った。普
通の自然環境は低栄養状態と考えられているが、本発明
者らは、微生物の生育に特に重要なリンと窒素に注目
し、自然環境中のリンと窒素の濃度を測定した結果、土
壌や地下水では次表１に示すように窒素濃度が約６０ｐ
ｐｍ以下、リン濃度が約３ｐｐｍ以下である。海洋では
更に栄養成分濃度は低く、窒素濃度が約１．０ｐｐｍ以
下、リン濃度が約０．１ｐｐｍ以下である。前記自然環
境中のリンと窒素の濃度の測定値に基づき、目的とする
有機炭素の濃度が高く、その他のリンと窒素の栄養塩濃
度のみが低い条件で生育し、汚染物質を分解することの
できる微生物を得るための培地は、リン濃度が約５ｐｐ
ｍ以下で、かつ窒素濃度が約５０ｐｐｍ以下のものであ
ることを見出し、本発明の完成に至った。したがって、
本発明の特徴は、５ｐｐｍ以下のリンおよび５０ｐｐｍ
以下の窒素を配合した培地を用いて行うことを特徴とす
る低栄養性微生物の検索方法に関する。

【０００８】

【表１】 １ 発明者の測定による ２ 微生物の生態１２、Ｐ１０、学会出版センター（１９８９）より ３ 西村実、土と微生物、Ｎｏ．４６、Ｐ１９（１９９５）より ４ 微生物の生態３、Ｐ４、学会出版センター（１９８７）より また、製油所や化学工場の排水等は、汚染物質である有
機炭素の濃度が高く、その他のリン、窒素等の栄養塩濃
度のみが低い状態にある。これに対して微生物の研究で
通常用いられている培地成分は、下表２に示すように高
栄養条件である。従ってこれまでの研究の培地で得られ
た微生物を環境浄化や排水処理に用いる場合には、これ
ら環境汚染物質を分解することができないので、微生物
の生育のために栄養源、特にリン源や窒素源を与える必
要がある。

【０００９】

【表２】 １ 発明者の測定による ４ 微生物の生態３、Ｐ４、学会出版センター（１９８７）より ＊ 極東製薬工業製 ＊＊ 日本製薬工業製

【００１０】有機炭素の濃度が高く、その他のリン、窒
素等の栄養塩濃度のみが低い条件で生育し汚染物質を分
解する微生物は、リン濃度５ｐｐｍ以下でかつ窒素濃度
５０ｐｐｍ以下の培地を用いて、例えばフェノール１０
０〜１０００ｐｐｍを炭素源とした条件で検索すること
によって得られる。炭素源は分解しようとする有機物で
あれば何でも良く、フェノール、ベンゼン、トルエン、
キシレン、クレゾール等の芳香族化合物、トリクロロエ
チレンの様な有機塩素化合物、多環芳香族化合物等をあ
げることができる。リン源は実質的に微生物がリン源と
して利用可能な物質であればなんでも良く、リン酸一ア
ンモニウム、リン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、
リン酸水素アンモニウムカリウム、リン酸水素二ナトリ
ウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素アンモニウ
ム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム等
の無機のリン酸塩およびこれらの塩の水和物、酵母エキ
ス、肉汁エキス等のリンを含む天然物やリン酸エステル
等の有機リン化合物等をあげることができる。同様に窒
素源も実質的に微生物が窒素源として利用可能な物質で
あればなんでも良く、硫酸アンモニウム、リン酸一アン
モニウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム
カリウム、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩および
これらの塩の水和物、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、硝酸カリウム等の硝酸塩、亜硝酸ナトリウム等の亜
硝酸塩、尿素、アミノ酸、酵母エキス、肉汁エキス、ペ
プトン等の窒素を含む天然物やアミド化合物等の有機含
窒素化合物等をあげることができる。

【００１１】本発明の微生物は、リン５ｐｐｍ以下でか
つ窒素５０ｐｐｍ以下と言う低栄養条件下で生育するこ
とができるので、栄養塩類を添加しない環境調和型の環
境浄化や排水処理に応用することが可能である。ただ
し、本発明の微生物がリン５ｐｐｍ以下でかつ窒素５０
ｐｐｍ以下と言う低栄養条件下で生育することができる
と言う性質を有することは、該微生物がリン５ｐｐｍ以
上あるいは窒素５０ｐｐｍ以上の条件で生育できないこ
とを意味するのではなく、本発明の微生物には、低栄養
性条件下でしか生育できない偏性低栄養性微生物と低栄
養性条件下でも高栄養性条件下でも生育できる通性低栄
養性微生物が含まれる。本発明の微生物は、真性細菌
（プロトバクテリア）、古細菌（アーキア）を含む原核
微生物および酵母やカビを含む真核微生物が含まれ、該
微生物は１種類の微生物を単独で用いても、あるいは数
種類を混合して用いても良い。本発明の微生物の使用形
態は、浮遊状態で用いても良いが、菌体濃度を高めるた
めに適当な担体に固定化して用いることもできる。固定
化する場合の担体としては、活性炭やガラスビーズ等の
無機物、ポリスチレンやポリプロピレン等の樹脂担体、
アルギン酸ゲルやポリビニルアルコールゲル等の有機物
を挙げることができる。

【００１２】

【実施例】

実施例１ 低リン濃度、低窒素濃度条件（自然環境）で生育するフ
ェノール資化性菌の検索 （検索用培地の作成）検索用培地として、下表３に示し
た培地（以下、Ｅ−培地）を１／１０に希釈したもの
（１／１０Ｅ−培地：リン約５ｐｐｍ、窒素約５０ｐｐ
ｍ）、および１／１００に希釈したもの（１／１００Ｅ
−培地：リン約０．５ｐｐｍ、窒素約５ｐｐｍ）の２種
類を用いた。これに、炭素源としてフェノール１，００
０ｐｐｍを加えた。また、各培地のｐＨは７．０とし
た。

【００１３】

【表３】

【００１４】（分解菌の取得方法Ａ）分離源としては、
つくば市周辺の土壌約４８０種類を用い、以下の方法で
微生物のみを抽出して培地に添加した。３００ｍｌ容の
三角フラスコに滅菌水３０ｍｌを入れ、ここに土壌サン
プル５ｇを加えた。これを１日回転振とうして、菌の抽
出を行なった。抽出後、遠心（２，０００ｒｐｍ，５ｍ
ｉｎ）して土壌を沈澱させ、上清を濾紙、およびグラス
フィルターにてろ過して、土壌微粒子を除いた。得られ
た菌液をニトロセルロースフィルター（０．２μｍ）で
ろ過して微生物を捕集した。このフィルターを適宜切断
して培地に加え、検索を行なった。検索は以下の方法で
行なった。３００ｍｌ容の三角フラスコに１／１０Ｅ−
培地または１／１００Ｅ−培地３０ｍｌを入れ、ここに
上述のニトロセルロースフィルターを加え３０℃にて５
日間振とう培養を行なった。生育の見られたものについ
ては、１／１０Ｅ−培地または１／１００Ｅ−培地８ｍ
ｌを入れた内径２４ｍｍの大型試験管に１００μｌ植え
継ぎ５日間培養した。これを２回繰り返し、菌の単離を
行なった。菌の単離には、前述の１／１０Ｅ−培地また
は１／１００Ｅ−培地に１．２％のアガロース[ａｇａ
ｒｏｓｅ（電気泳動用ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅ ｇｒａｄ
ｅ）]を加えて作成した平板を用いた。これに、前述の
培養液を適宜希釈して塗布し、３０℃にて５日間培養し
て、生育してきたコロニーを単離した。

【００１５】１／１０Ｅ−培地、１／１００Ｅ−培地共
に多数のサンプルに菌の生育が見られたので、菌の単離
を試みた。その結果４種類の形状の異なるコロニーが認
められたので、それぞれについて２〜３コロニーを取得
した。取得した候補株１４株の内、保存中に分離能力を
失わなかった５株（１／１０Ｅ−培地より取得した４
株、１／１００Ｅ−培地より取得した１株）をその後の
検討に用いることとした。これら全ての株は１／１０培
地およびブイヨン培地[ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ
（ＮＢ）]に生育可能であった。１／１０Ｅ−培地で検
索を行なった場合、全ての土壌（抽出菌体）サンプルか
ら菌の生育が見られたことから、この程度の栄養条件
（リン約５ｐｐｍ、窒素約５０ｐｐｍ）で生育する菌は
かなり多いと思われる。また、１／１０Ｅ−培地で取得
した菌と１／１００Ｅ−培地で取得した菌とは、コロニ
ーの形態を観察した限りでは菌種に違いはなかった。ま
た１／１００Ｅ−培地で取得した菌は１／１０Ｅ−培地
でも生育可能であることから、これらは同じ菌か、少な
くとも分類学的に近縁であると思われる。

【００１６】（分解菌の取得方法Ｂ）分離源としては、
厚木市周辺の土壌約２０種類を用い、分解菌の取得方法
Ａとは異なり、前記土壌サンプルをフィルタ−を用いて
濾過することなく、直接前記１／１０Ｅ−培地に加えて
行った。すなわち、前記土壌サンプル約１ｇを５０ｍｌ
の前記１／１０Ｅ−培地を加えた５００ｍｌ容の三角フ
ラスコに加え、３０℃で約１週間培養し、生育のあった
ものは、さらに５０ｍｌの１／１０Ｅ−培地を加えた５
００ｍｌ容の三角フラスコで約１週間培養してから、平
板を用いてコロニ−を単離した。

【００１７】実施例２ （取得した分解菌の同定） 前記分解菌の取得方法Ａで得られたフェノール資化
性菌は全てグラム陰性で、運動性を持ち、オキシダー
ゼ、カタラーゼ共に陽性であった。また、Ｏ−Ｆテスト
は酸化を示した。その他の各種生理試験の結果から、取
得した５株は全てＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａ
ｃｉａであると同定された。しかし、硝酸還元能、グル
コースからの酸の生成、エスカリンの分解試験等の結果
が異なることから、同じＢ．ｃｅｐａｃｉａでも以下の
４つのグループに分けられる。

【００１８】 前記分解菌の取得方法Ｂで得られたフ
ェノール資化性菌は、取得した株の１種類は、グラム陰
性で運動性を持ち、オキシダーゼ、カタラーゼが陽性で
あり、またＯ−Ｆテストは酸化を示し、キングのＢ培地
で蛍光性の色素を生成する、という試験結果から、Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ９−１Ａ１（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５５７１）であると同定された。また、他方
の種類は、形態がロッドでコリネフォルムを示し、グラ
ム陽性で運動性がなく、細胞壁ジアミノ酸としてメソ−
ジアミノピメリン酸を有し、細胞壁に直鎖飽和型及び１
０位にメチル基を有する分枝型の脂肪酸を有する、とい
う試験結果から、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．１０
−１Ａ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５７２）であると固定さ
れた。下表に、前記フェノール資化性菌の特性を示す。

【００１９】

【表４】

【００２０】フェノール資化性菌１Ａの特性（２）

【表５】

【００２１】

【表６】

【００２２】フェノール資化性菌１Ｃの特性（２）

【表７】

【００２３】

【表８】

【００２４】

【表９】

【００２５】

【表１０】

【００２６】

【表１１】

【００２７】

【表１２】

【００２８】

【表１３】

【００２９】

【表１４】

【００３０】

【表１５】

【００３１】

【表１６】

【００３２】実施例３ 低リン濃度、低窒素濃度条件（自然環境）で生育するフ
ェノール資化性菌の検索 （検索用培地の作成）下表１７に示す実際の製油所の排
水の分析結果についての情報が得られたので、これをも
とにして、本実施例では新たに検索用培地として表１８
に示した培地（以下、Ｆ−培地）を１／１００に希釈し
たもの（１／１００Ｆ−培地：リン約１ｐｐｍ、窒素約
２０ｐｐｍ）を用いた。これに炭素源としてフェノール
１００ｐｐｍを加えた。また、培地のｐＨは７．０とし
た。なお、表１８中の微量金属（ｔｒａｃｅ ｍｅｔａ
ｌ）の組成は下表１９の通りである。

【００３３】

【表１７】

【００３４】

【表１８】

【００３５】

【表１９】

【００３６】（分解菌の取得方法Ｃ）分離源としては、
つくば市周辺の土壌約４８０種類を用い、以下の方法で
微生物のみを抽出して培地に添加した。３００ｍｌ容の
三角フラスコに滅菌水３０ｍｌを入れ、ここに土壌サン
プル５ｇを加えた。これを１日回転振とうして、菌の抽
出を行なった。抽出後、遠心（２，０００ｒｐｍ，５ｍ
ｉｎ）して土壌を沈澱させ、上清を濾紙、およびグラス
フィルターにてろ過して、土壌微粒子を除いた。得られ
た菌液をニトロセルロースフィルター（０．２μｍ）で
ろ過して微生物を捕集した。このフィルターを適宜切断
して培地に加え、検索を行なった。検索は以下の方法で
行なった。３００ｍｌ容の三角フラスコに１／１００Ｅ
−培地３０ｍｌを入れ、ここに上述のニトロセルロース
フィルターを加え３０℃にて５日間振とう培養を行なっ
た。生育の見られたものについては、１／１００Ｅ−培
地８ｍｌを入れた内径２４ｍｍの大型試験管に１００μ
ｌ植え継ぎ５日間培養した。これを２回繰り返し、菌の
単離を行なった。菌の単離には、前述の１／１００Ｆ−
培地に１．２％のアガロース[ａｇａｒｏｓｅ（電気泳
動用ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅ ｇｒａｄｅ）]を加えて作
成した平板を用いた。これに、前述の培養液を適宜希釈
して塗布し、３０℃にて５日間培養して、生育してきた
コロニーを単離した。１／１００Ｆ−培地の多数のサン
プルに菌の生育が見られたので、菌の単離を試みた。そ
の結果形状の異なるコロニーが認められたので、コロニ
ーを取得した。これら全ての株は１／１０Ｆ−培地およ
びブイヨン培地[ｎｕｔｒｉｅｎｔｂｒｏｔｈ（ＮＢ）]
に生育可能であった。

【００３７】実施例４ （実施例３で取得した分解菌の同定）取得したフェノー
ル資化性菌の１種類は、グラム陽性の細菌、１種類は酵
母、また３種類はグラム陰性の細菌であった。 Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｔｒｏｃｙａｎｅｕｓ
３Ａ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０１６） Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ ３Ｈ菌株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０１５） Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ
ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ｋ２菌株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０１２） Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ
ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ｋ３菌株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０１３） Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ
ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ｋ１９菌
株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０１４） 下表２０〜２８に前記フェノール資化性菌の特性を示
す。

【００３８】

【表２０】

【００３９】

【表２１】

【００４０】

【表２２】

【００４１】

【表２３】

【００４２】

【表２４】

【００４３】

【表２５】

【００４４】

【表２６】

【００４５】

【表２７】

【００４６】

【表２８】

【００４７】実施例５ 低リン濃度、低窒素濃度条件（自然環境）で生育する芳
香族化合物の資化性菌の検索 （検索用培地の作成）前表１８に示したＦ−培地を１／
１００に希釈したもの（１／１００Ｆ−培地：リン約１
ｐｐｍ、窒素約２０ｐｐｍ）を用いた。これに炭素源と
してベンゼン、トルエンおよびキシレンをそれぞれ１０
０ｐｐｍを加えた。また、培地のｐＨは７．０とした。

【００４８】（分解菌の取得方法Ｄ）分離源としては、
つくば市周辺の土壌約１５０種類を用い、以下の方法で
微生物のみを抽出して培地に添加した。３００ｍｌ容の
三角フラスコに滅菌水３０ｍｌを入れ、ここに土壌サン
プル５ｇを加えた。これを１日回転振とうして、菌の抽
出を行なった。抽出後、遠心（２，０００ｒｐｍ，５ｍ
ｉｎ）して土壌を沈澱させ、上清を濾紙、およびグラス
フィルターにてろ過して、土壌微粒子を除いた。得られ
た菌液をニトロセルロースフィルター（０．２μｍ）で
ろ過して微生物を捕集した。このフィルターを適宜切断
して培地に加え、検索を行なった。検索は以下の方法で
行なった。３００ｍｌ容の三角フラスコに１／１００Ｆ
−培地３０ｍｌを入れ、ここに上述のニトロセルロース
フィルターを加え３０℃にて５日間振とう培養を行なっ
た。生育の見られたものについては、１／１００Ｆ−培
地８ｍｌを入れた内径２４ｍｍの大型試験管に１００μ
ｌ植え継ぎ５日間培養した。これを２回繰り返し、菌の
単離を行なった。菌の単離には、１／１００Ｆ−培地に
１．２％のアガロース[ａｇａｒｏｓｅ（電気泳動用ｕ
ｌｔｒａ−ｐｕｒｅ ｇｒａｄｅ）]を加えて作成した
平板を用いた。これに、前述の培養液を適宜希釈して塗
布し、３０℃にて５日間培養して、生育してきたコロニ
ーを単離した。１／１００Ｆ−培地の多数のサンプルに
菌の生育が見られたので、菌の単離を試みた。その結果
形状の異なるコロニーが認められたので、コロニーを取
得した。これら全ての株は、ブイヨン培地［ｎｕｔｒｉ
ｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）］に生育可能であった。

【００４９】実施例６ （実施例５で取得した分解菌の同定）取得した芳香族化
合物の資化性菌の２種類は、全てグラム陰性の細菌であ
った。 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ Ｋ１
１菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６２０７） Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ Ｋ３
７菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６２０８） 下表２９〜３０に前記芳香族化合物資化性菌の特性を示
す。

【００５０】

【表２９】

【表３０】

【００５１】実施例７ 実施例１で得られた分解菌による低リン濃度、低窒素濃
度条件下のフェノールの分解 （分解方法）供試菌株を１／１０Ｅ−平板培地（フェノ
ール１，０００ｐｐｍ）に植菌し、３０℃にて培養し
た。生育した菌体を１／１０Ｅ−培地２ｍｌを入れたプ
ラスチックチューブ（フェノールがチューブに吸着しな
いことは確認済み）に植菌し、振とう培養機（ＭＢＳＳ
−１０、丸菱）にて培養して、培養後のフェノールの分
解量を、ガスクロマトグラフィーを用いて定量した。初
発フェノール濃度は１００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍと
し、それぞれ３、６日後にサンプリングを行った。ガス
クロマトグラフィーの条件を以下に示す。 カラム（Ｃｏｌｕｍｎ） ：ＵｎｉｓｏｌｅＦ−２００ 注入温度（Ｉｎｊ．ｔｅｍｐ） ：１８０℃ カラム温度（Ｃｏｌ．ｔｅｍｐ）：１５０℃ 検出器 （Ｄｅｔｅｃｔｏｒ） ：ＦＩＤ 注入量 （ｉｎｊ．ｓｉｚｅ） ：２μｌ 内部標準物質（ＩＳ） ：ジエチレングリコール 分解試験の結果を下表３１に示す。実験に供した４株
は、いずれもフェノール分解能を有していた。

【００５２】

【表３１】

【００５３】（実施例１で得られた菌株と既存の菌株の
フェノール分解能の比較実験） 実施例８ 供試菌株としては実施例１で得た分離株１Ａ、１Ｃ、１
Ｅ、１Ｈ及び２Ｄの５株を用いた。また、比較のため
に、これまでにフェノール分解菌として報告されている
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）保存菌株
も用いた。このＡＴＣＣ保存のフェノール分解菌は、下
記の４株である。 ・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＡＴＣＣ １１１７２ ・Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ １４３４７ ・Ｖｉｂｒｉｏ ｃｙｃｌｏｓｉｅｓ ＡＴＣＣ １４６３５ ・Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｐｆｉｉ ＡＴＣＣ ５１３４９ 前記供試菌株を１／１００Ｆ−培地、または１／１００
Ｆ−培地のリン、窒素濃度をそれぞれ約５００ｐｐｍに
高めた培地２ｍｌを入れたプラスチックチューブに植菌
し、振とう培養機（ＭＢＳＳ−１０、丸菱）にて３０
℃、４日間培養した。培養後のフェノールの分解量を、
ガスクロマトグラフィーを用いて定量した。

【００５４】（結果と考察）分解試験の結果を下表３２
〜３３に示した。取得した分解菌は５株とも１／１００
Ｆ−培地に良好に生育し、添加した１００ｐｐｍのフェ
ノールはほとんどが４日以内に完全に分解されていた。
また、培地中のリン、窒素濃度を高めても、生育、フェ
ノール分解共に阻害は全く見られなかった。一方、ＡＴ
ＣＣ保存株の方は、全ての菌株が基本培地には全く生育
が見られなかった。表中でフェノールのわずかな減少が
見られるのは、植菌した菌体への吸着であると思われ
る。なお、培地中のリン、窒素濃度をそれぞれ５００ｐ
ｐｍに高めた培地を用いた場合には、表３３に示すよう
にＡＴＣＣ１４６３５株以外の３株に生育が見られ、フ
ェノールの分解が観察された。この結果から、前記５株
のフェノール分解菌は、これまでに知られているフェノ
ール分解菌が全く生育できないような低リン低窒素条件
下で生育し、良好なフェノール分解能を有する新規な菌
であると考えられる。

【００５５】

【表３２】

【００５６】

【表３３】

【００５７】実施例９ 低リン濃度、低窒素濃度条件で生育するフェノール資化
性菌を用いた各種芳香族化合物の分解 供試菌株としては実施例１で得た分離株１Ａ（Ｂｒｕｋ
ｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ １Ａ）を用いてフ
ェノール、ベンゼン、トルエン、キシレン（異性体混合
物）の資化性を確認した。基質である各種芳香族化合物
の量は１００ｐｐｍとし、培地は１／１００Ｆ−培地を
用い、３０℃で４日間培養行った。その結果を下表３４
に示す。

【００５８】

【表３４】 前表の結果より、何れの基質（炭素源）も炭素源が無い
場合より、微生物の生育が高いことが確認できた。

【００５９】実施例１０ 実施例３で得られた分解菌による低リン濃度、低窒素濃
度条件下のフェノールの分解 （分解方法）供試菌株としては実施例３で得た分離株３
Ａ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｔｒｏｃｙａｎｅｕ
ｓ３Ａ）およびＫ２（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎ
ｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ｓｕｂｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉ
ｃａｎｓＫ２）を用いてフェノールの資化性を確認し
た。基質であるフェノールの量は１００ｐｐｍとし、前
記１／１０Ｅ−培地のリンおよび窒素を５ｐｐｍにした
ものを基本培地とし、リンあるいは窒素濃度を変化させ
た培地を使用しフェノールの資化性を確認した。すなわ
ち、前記供試菌株３ＡおよびＫ２を前記培地に植菌し、
培養は６００ｒｐｍの回転振とう下で３日間３０℃で行
った。菌体の生育度は５８０ｎｍの吸光度（Ａ５８０）
で、フェノール濃度はＨＰＬＣにより測定した。

【００６０】実施例１１ 実施例４取得した分解菌の低リン濃度、低窒素濃度条件
下の各種芳香族化合物に対する分解特性 （分解方法）１／１００ＮＢ平板に生育させた前記Ｋ１
１およびＫ１７株を１／１００Ｆ培地に懸濁し、その１
００μｌを１５５ｍｌ容バイアルビン（培地３０ｍｌ）
に接種。その後基質である各種芳香族化合物（ベンゼ
ン、トルエン、キシレン）をそれぞれ１００ｐｐｍづつ
添加した（合計３００ｐｐｍ）。ただし、キシレンにつ
いては、あらかじめｏ−、ｍ−、ｐ−を１：２：１で混
合しておいたものを使用した。バイアルビンをテフロン
コートブチルゴム栓、およびアルミシールで密封し、３
０゜Ｃで振とう培養をした。実験は２連にて行った。一
定期間ごとにガスタイトシリンジにて気相を５０μｌ引
き抜きＧＣにて定量。また、滅菌した１ｍｌシリンジで
培養液を０．５ｍｌ抜き取り、生育量を測定した。

【００６１】（結果と考察）前記分解試験の結果を図１
〜４に示した。図１および図２に示す結果より、３Ａ株
は１００ｐｐｍのフェノールを分解するのに、培地中の
窒素濃度は５ｐｐｍ程度、リン濃度は５ｐｐｍ程度あれ
ば十分であることが解る。また、図３および図４に示す
結果より、Ｋ２株は１００ｐｐｍのフェノールを分解す
るのに、培地中の窒素濃度は０．５ｐｐｍ程度、リン濃
度は１ｐｐｍ程度あれば十分であることが解る。また、
図５および図６に示す結果より、菌の生育が観察され、
これに伴ってベンゼン、トルエン、キシレンが分解され
ているので、Ｋ１１株およびＫ３７株はベンゼン、トル
エン、キシレンを分解資化して生育していることが解
る。

【００６２】以下、本発明の実施態様を示す。 １．５ｐｐｍ以下のリンおよび５０ｐｐｍ以下の窒素を
配合した培地を用いて行うことを特徴とする低栄養性微
生物の検索方法。 ２．培地が、炭素源栄養分として芳香族化合物を含有す
るものである前記１の低栄養性微生物の検索方法。 ３．培地が、炭素源栄養分としてフェノールを含有する
ものである前記１〜２の低栄養性微生物の検索方法。 ４．培地が、炭素源栄養分としてベンゼン、トルエンお
よびキシレンよりなる群から選ばれた少なくとも一種以
上を含有するものである前記１〜２の低栄養性微生物の
検索方法。

【００６３】５．検索された微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ属に属する微生物である前記１〜４の低栄養性微
生物の検索方法。 ６．微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに
属するものである前記５の低栄養性微生物の検索方法。 ７．微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ９
−１Ａ１菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５７１）である前記
６の低栄養性微生物の検索方法。

【００６４】８．検索された微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄ
ｅｒｉａ属に属する微生物である前記１〜４の低栄養性
微生物の検索方法。 ９．微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉ
ａに属するものである前記８の低栄養性微生物の検索方
法。 １０．微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃ
ｉａ １Ａ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５６６）である前
記９の低栄養性微生物の検索方法。 １１．微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃ
ｉａ １Ｃ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５６７）である前
記９の低栄養性微生物の検索方法。 １２．微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃ
ｉａ １Ｅ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５６８）である前
記９の低栄養性微生物の検索方法。 １３微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉ
ａ １Ｈ菌株（ＦＥＲＭＰ−１５５６９）である前記９
の低栄養性微生物の検索方法。 １４．微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃ
ｉａ ２Ｄ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５５７０）である前
記９の低栄養性微生物の検索方法。 １５．微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｉｃｋｅ
ｔｔｉｉに属するものである前記８の微生物。 １６．微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｉｃｋｅ
ｔｔｉｉ Ｋ１１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６２０７）に属
するものである前記１５の微生物。 １７．微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｉｃｋｅ
ｔｔｔｔｉｉ Ｋ３７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６２０８）
に属するものである前記１５記載の微生物。 １８．検索された微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に
属する微生物である前記１〜４の低栄養性微生物の検索
方法。 １９．微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．１０−
１Ａ１菌株（ＦＥＲＭＰ−１５５７２）である前記１８
の低栄養性微生物の検索方法。

【００６５】２０．検索された微生物がＡｒｔｈｒｏｂ
ａｃｔｅｒ属に属するものである前記１〜４の低栄養性
微生物の検索方法。 ２１．微生物がＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｔｒｏｃ
ｙａｎｅｕｓに属するものである前記２０の低栄養性微
生物の検索方法。 ２２．微生物がＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｔｒｏｃ
ｙａｎｅｕｓ３Ａ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０１６）で
ある前記２１の低栄養性微生物の検索方法。

【００６６】２３．検索された微生物がＣｒｙｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ属に属するものである前記１〜４の低栄養性
微生物の検索方法。 ２４．微生物がＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄ
ｕｓに属するものである前記２３の低栄養性微生物の検
索方法。 ２５．微生物がＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄ
ｕｓ３Ｈ菌株（ＦＥＲＭＰ−１６０１５）である前記２
４の低栄養性微生物の検索方法。

【００６７】２６．検索された微生物がＡｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ属に属するものである前記１〜４の低栄養性微
生物の検索方法。 ２７．微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒ
ｉｆｉｃａｎｓに属するものである前記２６の低栄養性
微生物の検索方法。 ２８．微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒ
ｉｆｉｃａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａ
ｎｓに属するものである前記２７の低栄養性微生物の検
索方法。 ２９．微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒ
ｉｆｉｃａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａ
ｎｓＫ２菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０１２）である前記
２８の低栄養性微生物の検索方法。 ３０．微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒ
ｉｆｉｃａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａ
ｎｓＫ３菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０１３）である前記
２８の低栄養性微生物の検索方法。 ３１．微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒ
ｉｆｉｃａｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａ
ｎｓＫ１９菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０１４）である前
記２８の低栄養性微生物の検索方法。

【００６８】３２．微生物が芳香族化合物を分解するこ
とが可能なものである前記１〜３１の低栄養性微生物の
検索方法。 ３３．芳香族化合物がフェノールである前記３２の低栄
養性微生物の検索方法。 ３４．芳香族化合物がベンゼン、トルエンおよびキシレ
ンよりなる群から選ばれた少なくとも一種以上を含有す
るものである前記３２または３３の微生物の検索方法。

【００６９】

【効果】自然汚染環境や製油所や化学工場などからの低
栄養排水にリン源や窒素源等の栄養塩類を添加すること
なく、低コストで二次汚染の心配のない環境浄化あるい
は排水処理することのできる微生物、および該微生物を
用いた環境浄化あるいは排水処理方法が提供された。

【図面の簡単な説明】

【図１】フェノール資化性菌３Ａの培地中の窒素濃度を
変化させた場合のフェノール分解結果を示す図である。

【図２】フェノール資化性菌３Ａの培地中のリン濃度を
変化させた場合のフェノール分解結果を示す図である。

【図３】フェノール資化性菌Ｋ２の培地中の窒素濃度を
変化させた場合のフェノール分解結果を示す図である。

【図４】フェノール資化性菌Ｋ２の培地中のリン濃度を
変化させた場合のフェノール分解結果を示す図である。

【図５】芳香族炭化水素資化性菌Ｋ１１のベンゼン、ト
ルエン、キシレンを分解資化する時の経時変化を示す図
である。

【図６】芳香族炭化水素資化性菌Ｋ３７のベンゼン、ト
ルエン、キシレンを分解資化する時の経時変化を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:05）

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ５ｐｐｍ以下のリンおよび５０ｐｐｍ以
   下の窒素を配合した培地を用いて行うことを特徴とする
   低栄養性微生物の検索方法。
2. 【請求項２】 培地が、炭素源栄養分として芳香族化合
   物を含有するものである請求項１記載の低栄養性微生物
   の検索方法。
3. 【請求項３】 培地が、炭素源栄養分としてフェノール
   を含有するものである請求項１または２記載の低栄養性
   微生物の検索方法。
4. 【請求項４】 培地が、炭素源栄養分としてベンゼン、
   トルエンおよびキシレンよりなる群から選ばれた少なく
   とも一種以上を含有するものである請求項１または２記
   載の低栄養性微生物の検索方法。
5. 【請求項５】 検索された微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
   ａｓ属に属する微生物である請求項１、２、３または４
   記載の低栄養性微生物の検索方法。
6. 【請求項６】 微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
   ｔｉｄａに属するものである請求項５記載の低栄養性微
   生物の検索方法。
7. 【請求項７】 検索された微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅ
   ｒｉａ属に属する微生物である請求項１、２、３または
   ４記載の低栄養性微生物の検索方法。
8. 【請求項８】 微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃ
   ｅｐａｃｉａに属するものである請求項７記載の低栄養
   性微生物の検索方法。
9. 【請求項９】 微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐ
   ｉｃｋｅｔｔｉｉに属するものである請求項７記載の微
   生物。
10. 【請求項１０】 検索された微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃ
    ｃｕｓ属に属する微生物である請求項１、２、３または
    ４記載の低栄養性微生物の検索方法。
11. 【請求項１１】 微生物がＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属
    に属する微生物である請求項１、２、３または４記載の
    低栄養性微生物の検索方法。
12. 【請求項１２】 微生物がＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
    ａｔｒｏｃｙａｎｅｕｓに属する微生物である請求項１
    １記載の低栄養性微生物の検索方法。
13. 【請求項１３】 微生物がＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属
    に属する微生物である請求項１、２、３または４記載の
    低栄養性微生物の検索方法。
14. 【請求項１４】 微生物がＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
    ａｌｂｉｄｕｓに属するものである請求項１３記載の低
    栄養性微生物の検索方法。
15. 【請求項１５】 微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属に
    属する微生物である請求項１、２、３または４記載の低
    栄養性微生物の検索方法。
16. 【請求項１６】 微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄ
    ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓに属するものである請求項１
    ５記載の低栄養性微生物の検索方法。
17. 【請求項１７】 微生物が芳香族化合物を分解すること
    が可能なものである請求項１、２、３、４、５、６、
    ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５また
    は１６記載の低栄養性微生物の検索方法。
18. 【請求項１８】 芳香族化合物がフェノールである請求
    項１７記載の低栄養性微生物の検索方法。
19. 【請求項１９】 芳香族化合物がベンゼン、トルエンお
    よびキシレンよりなる群から選ばれた少なくとも一種以
    上を含有するものである請求項１７または１８記載の微
    生物の検索方法。