JPH10248567A - フォーミーウイルスエンベロープタンパク質の発現 - Google Patents
フォーミーウイルスエンベロープタンパク質の発現Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 少なくとも１種の修飾フォーミーウイルスエ
ンベロープタンパク質を含むタンパク質を安定して発現
する構築物の提供。 【解決手段】 本発明は、少なくとも１種の修飾フォー
ミーウイルス（ＦＶ）エンベロープタンパク質を含むタ
ンパク質の発現用構築物、それによって得られるタンパ
ク質、及び偽型ウイルス粒子を産生することが可能な補
完細胞系に関する。前記粒子を含有する医薬組成物及び
疾病の治療方法にも関する。
ンベロープタンパク質を含むタンパク質を安定して発現
する構築物の提供。 【解決手段】 本発明は、少なくとも１種の修飾フォー
ミーウイルス（ＦＶ）エンベロープタンパク質を含むタ
ンパク質の発現用構築物、それによって得られるタンパ
ク質、及び偽型ウイルス粒子を産生することが可能な補
完細胞系に関する。前記粒子を含有する医薬組成物及び
疾病の治療方法にも関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、少なくとも１種の
修飾フォーミーウイルス（ＦＶ）エンベロープタンパク
質を含むタンパク質の発現用構築物、それによって得ら
れるタンパク質、及び偽型ウイルス粒子を産生すること
が可能な補完細胞系に関する。前記粒子を含有する医薬
組成物及び疾病の治療方法にも関する。
修飾フォーミーウイルス（ＦＶ）エンベロープタンパク
質を含むタンパク質の発現用構築物、それによって得ら
れるタンパク質、及び偽型ウイルス粒子を産生すること
が可能な補完細胞系に関する。前記粒子を含有する医薬
組成物及び疾病の治療方法にも関する。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】レトロウ
イルス科のサブグループであるフォーミーウイルス（Ｆ
Ｖ）はそのユニークな複製法と遺伝子移入ベクターとし
ての潜在的用途により科学的関心を集めている（３
５）。ＦＶは、例えばヒト集団にＦＶ抗体が存在せず、
自然ＦＶ感染が良性経路を辿り、宿主細胞範囲が非常に
広く、ＦＶゲノムの寸法によりパッケージング限度が拡
がるなどのこのウイルス群の固有の性質により、遺伝子
送達システムの開発に理想的なツールであり得ると記載
されている（４，３０，３２）。しかし、このウイルス
群の分子生物学情報は限られているため、特にマウスレ
トロウイルスに由来するもののように安全なパッケージ
ング細胞系及びベクターは開発されていない（２７）。
他えば、ＦＶゲノムは複雑な構造をもつ２本鎖ＤＮＡで
ある。ＬＴＲ（長い末端反復配列）、パッケージング領
域並びにｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子に加え、ｅｎ
ｖと３’ＬＴＲの間に位置するｂｅｌ１、ｂｅｌ２、ｂ
ｅｌ３、ｂｅｔ、ｂｅｏ及びｂｅｓ等の数個の遺伝子も
含む。ｅｎｖ遺伝子は１３０ｋＤａグリコシル化前駆物
質をコードし、この前駆物質を切断すると、表面（Ｓ
Ｕ）及び膜貫通（ＴＭ）タンパク質を生じる（図１参
照）。更に、ＦＶはスプライスしたｍＲＮＡからＧａｇ
タンパク質とは別にそのＰｏｌタンパク質を発現し、Ｆ
Ｖゲノムパッケージング及び粒子アセンブリのメカニズ
ムや、細胞外粒子に多量の逆転写ＤＮＡが存在する意味
は殆ど分かっていない（１０，１８，３９）。他のユニ
ークな特徴としては、Ｇａｇ前駆物質タンパク質の核局
在（３１，４０）や、恐らくＥＲにＥｎｖ前駆物質タン
パク質が保持される結果として主に細胞質内小胞に出芽
すること（１３）などが挙げられる。
イルス科のサブグループであるフォーミーウイルス（Ｆ
Ｖ）はそのユニークな複製法と遺伝子移入ベクターとし
ての潜在的用途により科学的関心を集めている（３
５）。ＦＶは、例えばヒト集団にＦＶ抗体が存在せず、
自然ＦＶ感染が良性経路を辿り、宿主細胞範囲が非常に
広く、ＦＶゲノムの寸法によりパッケージング限度が拡
がるなどのこのウイルス群の固有の性質により、遺伝子
送達システムの開発に理想的なツールであり得ると記載
されている（４，３０，３２）。しかし、このウイルス
群の分子生物学情報は限られているため、特にマウスレ
トロウイルスに由来するもののように安全なパッケージ
ング細胞系及びベクターは開発されていない（２７）。
他えば、ＦＶゲノムは複雑な構造をもつ２本鎖ＤＮＡで
ある。ＬＴＲ（長い末端反復配列）、パッケージング領
域並びにｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子に加え、ｅｎ
ｖと３’ＬＴＲの間に位置するｂｅｌ１、ｂｅｌ２、ｂ
ｅｌ３、ｂｅｔ、ｂｅｏ及びｂｅｓ等の数個の遺伝子も
含む。ｅｎｖ遺伝子は１３０ｋＤａグリコシル化前駆物
質をコードし、この前駆物質を切断すると、表面（Ｓ
Ｕ）及び膜貫通（ＴＭ）タンパク質を生じる（図１参
照）。更に、ＦＶはスプライスしたｍＲＮＡからＧａｇ
タンパク質とは別にそのＰｏｌタンパク質を発現し、Ｆ
Ｖゲノムパッケージング及び粒子アセンブリのメカニズ
ムや、細胞外粒子に多量の逆転写ＤＮＡが存在する意味
は殆ど分かっていない（１０，１８，３９）。他のユニ
ークな特徴としては、Ｇａｇ前駆物質タンパク質の核局
在（３１，４０）や、恐らくＥＲにＥｎｖ前駆物質タン
パク質が保持される結果として主に細胞質内小胞に出芽
すること（１３）などが挙げられる。
【０００３】モロニーのレトロウイルス系遺伝子移入ベ
クターは現在主要なビークルであり、多種多様な細胞型
に高い効率で安定に遺伝子を移入することができる（２
０）。このベクター系の最大の欠点は、宿主細胞範囲が
限られており、ヒト細胞に感染できない場合もある点で
ある（（１）で報告）。最近、水疱性口炎ウイルス糖タ
ンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（６，３８）又はテナガザル白
血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質
（２，３４）等の外来エンベロープタンパク質による偽
型化を用いた数種の方法でこれらの欠点を克服できるこ
とが判明した。
クターは現在主要なビークルであり、多種多様な細胞型
に高い効率で安定に遺伝子を移入することができる（２
０）。このベクター系の最大の欠点は、宿主細胞範囲が
限られており、ヒト細胞に感染できない場合もある点で
ある（（１）で報告）。最近、水疱性口炎ウイルス糖タ
ンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（６，３８）又はテナガザル白
血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質
（２，３４）等の外来エンベロープタンパク質による偽
型化を用いた数種の方法でこれらの欠点を克服できるこ
とが判明した。
【０００４】しかし、例えばＶＳＶ−Ｇの発現は産生細
胞に高毒性であり、安定なＶＳＶ−Ｇパッケージング細
胞系を作製することはできなかった（８，２２，３
７）。
胞に高毒性であり、安定なＶＳＶ−Ｇパッケージング細
胞系を作製することはできなかった（８，２２，３
７）。
【０００５】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本
発明は少なくとも１種の修飾ＦＶエンベロープタンパク
質を含むタンパク質の発現用構築物に関する。
発明は少なくとも１種の修飾ＦＶエンベロープタンパク
質を含むタンパク質の発現用構築物に関する。
【０００６】本発明による好適ＦＶはヒトフォーミーウ
イルス（ＨＦＶ）であるが、他のウイルス（例えばサル
ＦＶ）も使用できる。
イルス（ＨＦＶ）であるが、他のウイルス（例えばサル
ＦＶ）も使用できる。
【０００７】修飾は、上記修飾ＦＶエンベロープ（ｅｎ
ｖ）タンパク質の１もしくは数個のアミノ酸（ａａ）の
突然変異、欠失、置換及び／又は付加の少なくとも１種
又はその組み合わせから構成され得る。このような修飾
は細胞質尾部（cytoplasmictail）に導入するのが好ま
しい。有利には、修飾ＦＶエンベロープタンパク質はａ
ａ９７５又はより好ましくは９８１で切断されている。
切断（truncation）は終止コドンまで延びていてもよい
し、あるいは場合により原ＦＶ ｅｎｖタンパク質の１
又は数個の残基を終止コドンの前に含んでいてもよい。
更に、本発明の構築物は、成熟修飾ＦＶエンベロープタ
ンパク質又はその前駆物質又は種々の起源の配列の融合
により得られるキメラタンパク質を発現することができ
る。
ｖ）タンパク質の１もしくは数個のアミノ酸（ａａ）の
突然変異、欠失、置換及び／又は付加の少なくとも１種
又はその組み合わせから構成され得る。このような修飾
は細胞質尾部（cytoplasmictail）に導入するのが好ま
しい。有利には、修飾ＦＶエンベロープタンパク質はａ
ａ９７５又はより好ましくは９８１で切断されている。
切断（truncation）は終止コドンまで延びていてもよい
し、あるいは場合により原ＦＶ ｅｎｖタンパク質の１
又は数個の残基を終止コドンの前に含んでいてもよい。
更に、本発明の構築物は、成熟修飾ＦＶエンベロープタ
ンパク質又はその前駆物質又は種々の起源の配列の融合
により得られるキメラタンパク質を発現することができ
る。
【０００８】特に好適な態様では、本発明で使用される
修飾ＦＶ ｅｎｖタンパク質は非ＦＶレトロウイルスエ
ンベロープタンパク質の全部又は好ましくは一部を更に
含む融合タンパク質である。適切な非ＦＶレトロウイル
スの例としては、ニワトリレトロウイルス、ウシレトロ
ウイルス、ネコレトロウイルス、マウスレトロウイルス
（例えばマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、特にモロ
ニーＭｕＬＶ（ＭｏＭｕＬＶ）、フレンドマウス白血病
ウイルス（ＦｒＭｕＬＶ）、特にＦＢ２９株、マウス肉
腫ウイルス（ＭＳＶ））、霊長類レトロウイルス（例え
ばＧａＬＶ、ＶＳＶ、又は例えばＨＩＶ（ヒト免疫不全
ウイルス）もしくはＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）等
のレンチウイルス）が挙げられる。
修飾ＦＶ ｅｎｖタンパク質は非ＦＶレトロウイルスエ
ンベロープタンパク質の全部又は好ましくは一部を更に
含む融合タンパク質である。適切な非ＦＶレトロウイル
スの例としては、ニワトリレトロウイルス、ウシレトロ
ウイルス、ネコレトロウイルス、マウスレトロウイルス
（例えばマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、特にモロ
ニーＭｕＬＶ（ＭｏＭｕＬＶ）、フレンドマウス白血病
ウイルス（ＦｒＭｕＬＶ）、特にＦＢ２９株、マウス肉
腫ウイルス（ＭＳＶ））、霊長類レトロウイルス（例え
ばＧａＬＶ、ＶＳＶ、又は例えばＨＩＶ（ヒト免疫不全
ウイルス）もしくはＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）等
のレンチウイルス）が挙げられる。
【０００９】特に好適な態様では、本発明によるタンパ
ク質は、細胞質ドメインの全部又は一部が非ＦＶレトロ
ウイルスエンベロープタンパク質、特にＭｕＬＶエンベ
ロープタンパク質の細胞質ドメインの全部又は一部で置
換されたＨＦＶタンパク質エンベロープから構成され
る。有利には、融合タンパク質はＭｕＬＶ細胞質ドメイ
ンを修飾ＨＦＶエンベロープタンパク質と融合すること
により構成される。本発明で使用されるＭｕＬＶ細胞質
ドメインはプロセシングされていてもよいし、プロセシ
ングされていなくてもよい。「プロセシングされてい
る」とは、対応するレトロウイルスプロテアーゼにより
通常認識される開裂部位を含むことを意味し、「プロセ
シングされていない」とはこのような部位を含まないか
又は機能的でない（突然変異、欠失又は截断）ことを意
味する。
ク質は、細胞質ドメインの全部又は一部が非ＦＶレトロ
ウイルスエンベロープタンパク質、特にＭｕＬＶエンベ
ロープタンパク質の細胞質ドメインの全部又は一部で置
換されたＨＦＶタンパク質エンベロープから構成され
る。有利には、融合タンパク質はＭｕＬＶ細胞質ドメイ
ンを修飾ＨＦＶエンベロープタンパク質と融合すること
により構成される。本発明で使用されるＭｕＬＶ細胞質
ドメインはプロセシングされていてもよいし、プロセシ
ングされていなくてもよい。「プロセシングされてい
る」とは、対応するレトロウイルスプロテアーゼにより
通常認識される開裂部位を含むことを意味し、「プロセ
シングされていない」とはこのような部位を含まないか
又は機能的でない（突然変異、欠失又は截断）ことを意
味する。
【００１０】本発明の好適構築物は、以下の文中でＨＦ
Ｖ Δ２ＭｕＬＶと呼ぶ融合タンパク質を発現させるこ
とが可能な構築物である。
Ｖ Δ２ＭｕＬＶと呼ぶ融合タンパク質を発現させるこ
とが可能な構築物である。
【００１１】本発明の構築物は、ＦＶ ｅｎｖタンパク
質をコードする配列中に天然に存在するドナー及び／又
はアクセプタースプライシング部位を突然変異させたも
のでもよい。
質をコードする配列中に天然に存在するドナー及び／又
はアクセプタースプライシング部位を突然変異させたも
のでもよい。
【００１２】本発明の構築物は、修飾ＦＶ ｅｎｖタン
パク質をコードする配列を転写及び翻訳できるように調
節エレメントを含み得る。特に、ＦＶ ｅｎｖをコード
する配列の上流に慣用組換え技術により適切なプロモー
ターを作動的に連結することができる。このようなプロ
モーターは原核、真核又はウイルスのいずれの起源でも
よく、構成性でも調節性でもよい。このような調節エレ
メントは当業者に周知である。
パク質をコードする配列を転写及び翻訳できるように調
節エレメントを含み得る。特に、ＦＶ ｅｎｖをコード
する配列の上流に慣用組換え技術により適切なプロモー
ターを作動的に連結することができる。このようなプロ
モーターは原核、真核又はウイルスのいずれの起源でも
よく、構成性でも調節性でもよい。このような調節エレ
メントは当業者に周知である。
【００１３】本発明の構築物は修飾ＦＶ ｅｎｖタンパ
ク質を発現する細胞の検出及び単離を可能にする選択遺
伝子を更に含んでもよく、このような態様も本発明の範
囲内である。本発明の関連では、選択遺伝子は修飾ＦＶ
ｅｎｖタンパク質の発現を誘導して２シストロン転写
物を生じるプロモーターの転写制御下に置いてもよい
し、付加的プロモーター領域の制御下に置いてもよい。
考えられる選択遺伝子は多数あり、例えば抗生物質Ｇ４
１８に対する耐性を与えるｎｅｏ遺伝子、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ（ｄｈＦｒ）遺伝子、ピューロマイシンア
セチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子又はキサン
チンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝
子が挙げられる。
ク質を発現する細胞の検出及び単離を可能にする選択遺
伝子を更に含んでもよく、このような態様も本発明の範
囲内である。本発明の関連では、選択遺伝子は修飾ＦＶ
ｅｎｖタンパク質の発現を誘導して２シストロン転写
物を生じるプロモーターの転写制御下に置いてもよい
し、付加的プロモーター領域の制御下に置いてもよい。
考えられる選択遺伝子は多数あり、例えば抗生物質Ｇ４
１８に対する耐性を与えるｎｅｏ遺伝子、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ（ｄｈＦｒ）遺伝子、ピューロマイシンア
セチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子又はキサン
チンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝
子が挙げられる。
【００１４】本発明の構築物は任意の適当なベクター、
ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター）又
はプラスミドに挿入することができる。適当なベクター
の選択肢は広く、当業者の能力の範囲内である。このよ
うなベクターは組込み型でもよいし、そうでなくてもよ
い。複製適合性（competent ）ウイルス粒子を生じる可
能性を減らすためには、構築物がレトロウイルスＬＴＲ
とパッケージング領域を欠損していると有利である。
ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター）又
はプラスミドに挿入することができる。適当なベクター
の選択肢は広く、当業者の能力の範囲内である。このよ
うなベクターは組込み型でもよいし、そうでなくてもよ
い。複製適合性（competent ）ウイルス粒子を生じる可
能性を減らすためには、構築物がレトロウイルスＬＴＲ
とパッケージング領域を欠損していると有利である。
【００１５】本発明は上記発現構築物により発現される
融合タンパク質及びＦＶ ｅｎｖタンパク質を含む偽型
（pseudotyped ）ウイルス粒子にも関する。ＦＶ ｅｎ
ｖタンパク質は天然ＦＶ ｅｎｖタンパク質、その一部
又はその修飾物から誘導することができる。好適態様で
は、偽型ウイルス粒子は本発明による構築物により発現
される修飾ＦＶ ｅｎｖタンパク質をその表面に含む。
本発明の偽型ウイルス粒子は、組換えレトロウイルスベ
クターを補完（complementation ）細胞系にトランスフ
ェクトすることにより作製することができる。このよう
な技術は公知であり、多数の従来技術文献に記載されて
いる。本発明で使用されるレトロウイルスベクターは、
上記のような任意のレトロウイルスに由来する少なくと
も５’ＬＴＲ、パッケージング領域及び３’ＬＴＲと、
更に目的ポリペプチドを産生するためにリボザイム、ア
ンチセンスＲＮＡ分子又はｍＲＮＡを発現することが可
能な遺伝子を含む。非限定的な例としてサイトカイン
（ＩＬ−２、ＩＦＮα、β又はγ）、１型単純ヘルペス
ウイルス（ＨＳＶ−１）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、
嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（Ｄ
ＦＴＲ）、ジストロフィン、凝固因子（ＦＶＩＩＩ、Ｆ
ＩＸ等）、腫瘍関連抗原（ＭＵＣ−１、ＨＰＶ抗原）、
抗体、イムノトキシン及び抗ＨＩＶ薬剤等の治療用ポリ
ペプチドが特に有用である。
融合タンパク質及びＦＶ ｅｎｖタンパク質を含む偽型
（pseudotyped ）ウイルス粒子にも関する。ＦＶ ｅｎ
ｖタンパク質は天然ＦＶ ｅｎｖタンパク質、その一部
又はその修飾物から誘導することができる。好適態様で
は、偽型ウイルス粒子は本発明による構築物により発現
される修飾ＦＶ ｅｎｖタンパク質をその表面に含む。
本発明の偽型ウイルス粒子は、組換えレトロウイルスベ
クターを補完（complementation ）細胞系にトランスフ
ェクトすることにより作製することができる。このよう
な技術は公知であり、多数の従来技術文献に記載されて
いる。本発明で使用されるレトロウイルスベクターは、
上記のような任意のレトロウイルスに由来する少なくと
も５’ＬＴＲ、パッケージング領域及び３’ＬＴＲと、
更に目的ポリペプチドを産生するためにリボザイム、ア
ンチセンスＲＮＡ分子又はｍＲＮＡを発現することが可
能な遺伝子を含む。非限定的な例としてサイトカイン
（ＩＬ−２、ＩＦＮα、β又はγ）、１型単純ヘルペス
ウイルス（ＨＳＶ−１）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、
嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（Ｄ
ＦＴＲ）、ジストロフィン、凝固因子（ＦＶＩＩＩ、Ｆ
ＩＸ等）、腫瘍関連抗原（ＭＵＣ−１、ＨＰＶ抗原）、
抗体、イムノトキシン及び抗ＨＩＶ薬剤等の治療用ポリ
ペプチドが特に有用である。
【００１６】本発明の別の目的は、偽型ウイルス粒子を
産生することが可能な補完細胞系及び前記ウイルス粒子
の製造方法を提供することである。
産生することが可能な補完細胞系及び前記ウイルス粒子
の製造方法を提供することである。
【００１７】本発明の補完細胞系は任意の細胞、特に真
核細胞に由来し得る。例えばマウス細胞系、医薬的に許
容可能な細胞系（Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ等）又はヒト細胞系
（例えば２９３）が考えられる。このような細胞系は本
発明による構築物を第１の選択遺伝子とともにトランス
フェクトすることにより作製することができる。その
後、ＦＶ ｅｎｖに対する抗体を用いる免疫検出、ウェ
スタンブロット、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）
又は他の任意の方法により、ｅｎｖ産生能の最も高い細
胞が高レベルのＦＶ ｅｎｖタンパク質の発現に対して
スクリーニングされる。あるいは、本発明の補完細胞系
は、第１の選択遺伝子とは異なる第２の選択遺伝子と共
に、より好ましくはＭｕＬＶ、ＦＢ２９又はＨＦＶのレ
トロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する構築物を
更に含んでいてもよい。好ましくは、ｅｎｖ及びｇａｇ
／ｐｏｌ遺伝子はＬＴＲ及びパッケージング領域をもた
ない別個の発現ベクターに担持される。選択及びスクリ
ーニング段階を繰り返し、ｇａｇ／ｐｏｌ発現産物をも
発現するｅｎｖ産生クローンを選択する。
核細胞に由来し得る。例えばマウス細胞系、医薬的に許
容可能な細胞系（Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ等）又はヒト細胞系
（例えば２９３）が考えられる。このような細胞系は本
発明による構築物を第１の選択遺伝子とともにトランス
フェクトすることにより作製することができる。その
後、ＦＶ ｅｎｖに対する抗体を用いる免疫検出、ウェ
スタンブロット、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）
又は他の任意の方法により、ｅｎｖ産生能の最も高い細
胞が高レベルのＦＶ ｅｎｖタンパク質の発現に対して
スクリーニングされる。あるいは、本発明の補完細胞系
は、第１の選択遺伝子とは異なる第２の選択遺伝子と共
に、より好ましくはＭｕＬＶ、ＦＢ２９又はＨＦＶのレ
トロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を発現する構築物を
更に含んでいてもよい。好ましくは、ｅｎｖ及びｇａｇ
／ｐｏｌ遺伝子はＬＴＲ及びパッケージング領域をもた
ない別個の発現ベクターに担持される。選択及びスクリ
ーニング段階を繰り返し、ｇａｇ／ｐｏｌ発現産物をも
発現するｅｎｖ産生クローンを選択する。
【００１８】本発明の補完細胞系は組換えレトロウイル
スベクターをパッケージングするために使用することが
できる。第１及び第２の選択遺伝子とは異なる第３の選
択遺伝子又は潜在（musked）遺伝子（例えばＬａｃＺ）
を発現する慣用レトロウイルスベクターを使用して力価
を試験することができる。その結果、高力価の偽型ウイ
ルス粒子を産生する細胞を選択し、安定な補完細胞系を
提供するように培養することができる。細胞は通常実施
されているように後記方法で一過性試験してもよい。
スベクターをパッケージングするために使用することが
できる。第１及び第２の選択遺伝子とは異なる第３の選
択遺伝子又は潜在（musked）遺伝子（例えばＬａｃＺ）
を発現する慣用レトロウイルスベクターを使用して力価
を試験することができる。その結果、高力価の偽型ウイ
ルス粒子を産生する細胞を選択し、安定な補完細胞系を
提供するように培養することができる。細胞は通常実施
されているように後記方法で一過性試験してもよい。
【００１９】本発明の別の態様によると、本発明の偽型
ウイルス粒子の製造方法が提供される。このような方法
は、（１）本発明の補完細胞系に組換えレトロウイルス
ベクターを導入する段階と、（２）前記偽型ウイルス粒
子の産生を可能にする適切な条件下で前記補完細胞系を
培養する段階と、（３）細胞培養物から偽型ウイルス粒
子を回収する段階を含む。
ウイルス粒子の製造方法が提供される。このような方法
は、（１）本発明の補完細胞系に組換えレトロウイルス
ベクターを導入する段階と、（２）前記偽型ウイルス粒
子の産生を可能にする適切な条件下で前記補完細胞系を
培養する段階と、（３）細胞培養物から偽型ウイルス粒
子を回収する段階を含む。
【００２０】好ましくは、偽型ウイルス粒子は細胞培養
物上清から回収されるが、細胞溶解工程も考えられる。
慣用技術（例えばスクロース又はＣｌＣｓ勾配での超遠
心分離）により偽型ウイルス粒子を更に精製してもよ
い。有利には、こうして製造した偽型ウイルス粒子は
（好ましくはポリブレンの不在下で）多種多様の細胞に
感染することができ、場合によってはヒト血清による失
活を阻止することができる。
物上清から回収されるが、細胞溶解工程も考えられる。
慣用技術（例えばスクロース又はＣｌＣｓ勾配での超遠
心分離）により偽型ウイルス粒子を更に精製してもよ
い。有利には、こうして製造した偽型ウイルス粒子は
（好ましくはポリブレンの不在下で）多種多様の細胞に
感染することができ、場合によってはヒト血清による失
活を阻止することができる。
【００２１】本発明の別の態様によると、本発明の偽型
ウイルス粒子に感染した哺乳動物宿主細胞も提供され
る。このような宿主細胞の非限定的な例としてはヒト上
皮細胞、肺細胞、筋細胞、肝細胞、造血細胞、繊維芽細
胞及びリンパ球が挙げられる。
ウイルス粒子に感染した哺乳動物宿主細胞も提供され
る。このような宿主細胞の非限定的な例としてはヒト上
皮細胞、肺細胞、筋細胞、肝細胞、造血細胞、繊維芽細
胞及びリンパ球が挙げられる。
【００２２】本発明の感染性偽型粒子及び哺乳動物細胞
はワクチン又は治療薬として種々の疾病の予防又は治療
に利用できる。
はワクチン又は治療薬として種々の疾病の予防又は治療
に利用できる。
【００２３】本発明の別の目的は、治療又は予防に有効
な量の本発明の偽型ウイルス粒子及び哺乳動物細胞を治
療薬として含有する医薬組成物を提供することである。
このような医薬組成物は慣用方法で製造することができ
る。特に、本発明の粒子又は哺乳動物細胞をキャリヤ
ー、希釈剤、アジュバント又は賦形剤等の当該技術分野
で周知の適当な物質と組み合わせることができる。医薬
組成物の特定組成は例えば発現させようとする目的ポリ
ペプチド、所望の作用部位、投与方法及び治療対象等の
種々のパラメーターによって異なる。このような組成は
当業者が通常の知識によって決定できる。
な量の本発明の偽型ウイルス粒子及び哺乳動物細胞を治
療薬として含有する医薬組成物を提供することである。
このような医薬組成物は慣用方法で製造することができ
る。特に、本発明の粒子又は哺乳動物細胞をキャリヤ
ー、希釈剤、アジュバント又は賦形剤等の当該技術分野
で周知の適当な物質と組み合わせることができる。医薬
組成物の特定組成は例えば発現させようとする目的ポリ
ペプチド、所望の作用部位、投与方法及び治療対象等の
種々のパラメーターによって異なる。このような組成は
当業者が通常の知識によって決定できる。
【００２４】本発明の最後の態様によると、遺伝病又は
任意の病原遺伝子により誘発される疾病（例えば癌又は
ウイルス誘発病）の治療方法も提供され、該方法は治療
を必要とする対象に治療に有効な量の本発明の偽型ウイ
ルス粒子及び哺乳動物細胞を投与することを特徴とす
る。
任意の病原遺伝子により誘発される疾病（例えば癌又は
ウイルス誘発病）の治療方法も提供され、該方法は治療
を必要とする対象に治療に有効な量の本発明の偽型ウイ
ルス粒子及び哺乳動物細胞を投与することを特徴とす
る。
【００２５】本発明の上記及び他の目的は以下の実施例
及び添付図面から容易に理解されよう。但し、これらの
態様は本発明の全範囲を網羅するものではない。
及び添付図面から容易に理解されよう。但し、これらの
態様は本発明の全範囲を網羅するものではない。
【００２６】特に、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）
粒子へのヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）エンベロー
プタンパク質の取込みは、一過性トランスフェクション
パッケージングセルシステムで試験した。ここで、効率
は低いが、野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質でＭｕ
ＬＶ粒子を偽型化できることを報告しておく。ＨＦＶ細
胞質尾部を完全又は部分的に除去すると、ＨＦＶに仲介
される感染性が失われるか又は低下し、ＭｕＬＶ粒子の
偽型化におけるＨＦＶエンベロープ細胞質尾部の役割が
予想された。ＨＦＶエンベロープ細胞質尾部に存在する
ＥＲ保持シグナルを突然変異させても偽型レトロウイル
スベクターの相対感染性は増加しなかった。他方、プロ
セシングされていないＭｕＬＶエンベロープ細胞質ドメ
インを截断ＨＦＶエンベロープタンパク質に融合したキ
メラエンベロープタンパク質は、ＭｕＬＶ粒子へのキメ
ラエンベロープタンパク質の取込みの増加の結果として
高いＨＦＶ特異的感染性を示した。
粒子へのヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）エンベロー
プタンパク質の取込みは、一過性トランスフェクション
パッケージングセルシステムで試験した。ここで、効率
は低いが、野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質でＭｕ
ＬＶ粒子を偽型化できることを報告しておく。ＨＦＶ細
胞質尾部を完全又は部分的に除去すると、ＨＦＶに仲介
される感染性が失われるか又は低下し、ＭｕＬＶ粒子の
偽型化におけるＨＦＶエンベロープ細胞質尾部の役割が
予想された。ＨＦＶエンベロープ細胞質尾部に存在する
ＥＲ保持シグナルを突然変異させても偽型レトロウイル
スベクターの相対感染性は増加しなかった。他方、プロ
セシングされていないＭｕＬＶエンベロープ細胞質ドメ
インを截断ＨＦＶエンベロープタンパク質に融合したキ
メラエンベロープタンパク質は、ＭｕＬＶ粒子へのキメ
ラエンベロープタンパク質の取込みの増加の結果として
高いＨＦＶ特異的感染性を示した。
【００２７】以下、非限定的な実施例により本発明を更
に説明する。
に説明する。
【００２８】
【実施例】全構築は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，ＮＹ １９８２に記載されているような標準組
換えＤＮＡ技術を使用することにより実施する。細胞系
はＡＴＣＣ等の菌寄託機関から入手でき、標準条件で培
養する（ＮＩＨ３Ｔ３：ＣＲＬ１６５８、Ｍｖ．１．Ｌ
ｕ：ＣＣＬ６４、ＨＴ１０８０：ＣＣＬ１２１、ＢＨＫ
２１：ＣＣＬ１０、ＱＴ２６：ＣＲＬ１７０８及び２９
３：ＣＲＬ１５７３）。ＨＦＶ ｅｎｖタンパク質の配
列は既に公知である。
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，ＮＹ １９８２に記載されているような標準組
換えＤＮＡ技術を使用することにより実施する。細胞系
はＡＴＣＣ等の菌寄託機関から入手でき、標準条件で培
養する（ＮＩＨ３Ｔ３：ＣＲＬ１６５８、Ｍｖ．１．Ｌ
ｕ：ＣＣＬ６４、ＨＴ１０８０：ＣＣＬ１２１、ＢＨＫ
２１：ＣＣＬ１０、ＱＴ２６：ＣＲＬ１７０８及び２９
３：ＣＲＬ１５７３）。ＨＦＶ ｅｎｖタンパク質の配
列は既に公知である。
【００２９】１．ＦＶ ｅｎｖ発現構築物の作製 完全長ｅｎｖオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
を含むＨＦＶプロウイルスクローンｐＨＳＲＶ１（２
８）の３０７６ｂｐ ＡｆｌＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメ
ントをｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクター
に挿入することにより、ヒトＦＶ単離体（ＨＦＶ）のエ
ンベロープ遺伝子の真核発現構築物を作製した。この構
築物をｐＣＨＦＶ ｗｔと名づけ、図１に示す突然変異
及びキメラＨＦＶエンベロープタンパク質を作製するた
めに使用した。要約すると、鋳型としてＨＦＶ及び／又
はＭｕＬＶ ｅｎｖ遺伝子と、所望の突然変異を含むオ
リゴヌクレオチドでポリメラーゼ連鎖反応を使用するこ
とにより截断又はキメラｅｎｖ構築物を作製した。突然
変異体を上記基本ベクターに挿入し、配列決定して部位
外の突然変異を排除した。３種の突然変異ＨＦＶエンベ
ロープ構築物を作製した。ｐＣＨＦＶ Δ１とｐＣＨＦ
Ｖ Δ２はそれぞれａａ９７５又は９８１で截断された
ＨＦＶエンベロープタンパク質をコードする。ｐＣＨＦ
Ｖ Δ２には、元のＨＦＶ ｅｎｖ配列に存在しないＣ
末端アルギニンを付加した。Ｆｌｕｇｅｌら（１１）に
より提案されているＨＦＶエンベロープドメイン構造に
従い、截断の結果、細胞質ドメインは完全（ｐＣＨＦＶ
Δ１）又は部分的（ｐＣＨＦＶΔ２）に除去された。
最後に、ｐＣＨＦＶ ＳＳＳ構築物はセリン残基により
置換された膜貫通（ＴＭ）タンパク質の細胞質尾部のＣ
末端に三重リシンモチーフ（ａａ９８４〜９８６）をも
つＨＦＶエンベロープタンパク質を産生する。この配列
モチーフはＨＦＶエンベロープのＥＲ保持に関与するこ
とが示されている（１３，１４）。
を含むＨＦＶプロウイルスクローンｐＨＳＲＶ１（２
８）の３０７６ｂｐ ＡｆｌＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメ
ントをｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクター
に挿入することにより、ヒトＦＶ単離体（ＨＦＶ）のエ
ンベロープ遺伝子の真核発現構築物を作製した。この構
築物をｐＣＨＦＶ ｗｔと名づけ、図１に示す突然変異
及びキメラＨＦＶエンベロープタンパク質を作製するた
めに使用した。要約すると、鋳型としてＨＦＶ及び／又
はＭｕＬＶ ｅｎｖ遺伝子と、所望の突然変異を含むオ
リゴヌクレオチドでポリメラーゼ連鎖反応を使用するこ
とにより截断又はキメラｅｎｖ構築物を作製した。突然
変異体を上記基本ベクターに挿入し、配列決定して部位
外の突然変異を排除した。３種の突然変異ＨＦＶエンベ
ロープ構築物を作製した。ｐＣＨＦＶ Δ１とｐＣＨＦ
Ｖ Δ２はそれぞれａａ９７５又は９８１で截断された
ＨＦＶエンベロープタンパク質をコードする。ｐＣＨＦ
Ｖ Δ２には、元のＨＦＶ ｅｎｖ配列に存在しないＣ
末端アルギニンを付加した。Ｆｌｕｇｅｌら（１１）に
より提案されているＨＦＶエンベロープドメイン構造に
従い、截断の結果、細胞質ドメインは完全（ｐＣＨＦＶ
Δ１）又は部分的（ｐＣＨＦＶΔ２）に除去された。
最後に、ｐＣＨＦＶ ＳＳＳ構築物はセリン残基により
置換された膜貫通（ＴＭ）タンパク質の細胞質尾部のＣ
末端に三重リシンモチーフ（ａａ９８４〜９８６）をも
つＨＦＶエンベロープタンパク質を産生する。この配列
モチーフはＨＦＶエンベロープのＥＲ保持に関与するこ
とが示されている（１３，１４）。
【００３０】ＭｕＬＶエンベロープタンパク質のプロセ
シングされているか又はプロセシングされていない細胞
質ドメインをコードする配列のＣ末端融合により合計６
個のキメラエンベロープタンパク質を構築した（１６，
１７）。ｐＣＨＦＶ Δ１ＭｕＬＶＲ−、ｐＣＨＦＶ
Δ２ＭｕＬＶＲ−及びｐＣＨＦＶ ＳＳＳＭｕＬＶＲ−
は上記３種の突然変異とプロセシングされているＭｕＬ
Ｖエンベロープ細胞質ドメイン（ａａ６３４〜６４９）
から構成される融合タンパク質をコードし、ｐＣＨＦＶ
Δ１ＭｕＬＶ、ｐＣＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶ及びｐＣＨ
ＦＶ ＳＳＳＭｕＬＶはＣ末端にプロセシングされてい
ないＭｕＬＶエンベロープ細胞質ドメイン（ａａ６３４
〜６６５）を含むそれぞれの融合タンパク質をコードす
る。
シングされているか又はプロセシングされていない細胞
質ドメインをコードする配列のＣ末端融合により合計６
個のキメラエンベロープタンパク質を構築した（１６，
１７）。ｐＣＨＦＶ Δ１ＭｕＬＶＲ−、ｐＣＨＦＶ
Δ２ＭｕＬＶＲ−及びｐＣＨＦＶ ＳＳＳＭｕＬＶＲ−
は上記３種の突然変異とプロセシングされているＭｕＬ
Ｖエンベロープ細胞質ドメイン（ａａ６３４〜６４９）
から構成される融合タンパク質をコードし、ｐＣＨＦＶ
Δ１ＭｕＬＶ、ｐＣＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶ及びｐＣＨ
ＦＶ ＳＳＳＭｕＬＶはＣ末端にプロセシングされてい
ないＭｕＬＶエンベロープ細胞質ドメイン（ａａ６３４
〜６６５）を含むそれぞれの融合タンパク質をコードす
る。
【００３１】ＭｕＬＶ ｇａｇ／ｐｏｌ（ｐＨＩＴ６
０）、エコトロピック（ｐＨＩＴ１２３）及びアンホト
ロピック（ｐＨＩＴ４５６）ＭｕＬＶエンベロープの発
現構築物はＡ．Ｋｉｎｇｓｍａｎ（３３）から提供され
た。レトロウイルスベクターＳＦＧ ＧＦＰＳ６５Ｔ
は、ＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターＳＦＧ（５，２
２）のクローニング部位に挿入された緑色蛍光タンパク
質のヒト化ＯＲＦ（７）（Ｍ．Ｖｏｇｅｌの寄贈品）を
含み、ＭＦＧ．Ｓ ＮＬＳ−ＬａｃＺ（２２）はＳＶ４
０核局在シグナル（ＮＬＳ）に融合したβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（Ｒ．Ｍｕｌｌｉｇａｎの寄贈品）を含
む。ＶＳＶ−Ｇ ＯＲＦを含むプラスミドｐＳＶＧＬ−
１（２９）（Ｊ．Ｒｏｓｅの寄贈品）からの１．６ｋｂ
ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＨＩＴベクターに挿入す
ることにより、ＶＳＶ−Ｇ発現構築物を作製した。
０）、エコトロピック（ｐＨＩＴ１２３）及びアンホト
ロピック（ｐＨＩＴ４５６）ＭｕＬＶエンベロープの発
現構築物はＡ．Ｋｉｎｇｓｍａｎ（３３）から提供され
た。レトロウイルスベクターＳＦＧ ＧＦＰＳ６５Ｔ
は、ＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターＳＦＧ（５，２
２）のクローニング部位に挿入された緑色蛍光タンパク
質のヒト化ＯＲＦ（７）（Ｍ．Ｖｏｇｅｌの寄贈品）を
含み、ＭＦＧ．Ｓ ＮＬＳ−ＬａｃＺ（２２）はＳＶ４
０核局在シグナル（ＮＬＳ）に融合したβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（Ｒ．Ｍｕｌｌｉｇａｎの寄贈品）を含
む。ＶＳＶ−Ｇ ＯＲＦを含むプラスミドｐＳＶＧＬ−
１（２９）（Ｊ．Ｒｏｓｅの寄贈品）からの１．６ｋｂ
ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＨＩＴベクターに挿入す
ることにより、ＶＳＶ−Ｇ発現構築物を作製した。
【００３２】２．種々のＨＦＶ ｅｎｖタンパク質で偽
型化したＭｕＬＶ粒子の感染性 ほぼ従来技術（３３）に記載されているようなｐＨＩＴ
パッケージングシステムを使用して組換えレトロウイル
ス粒子を作製した。要約すると、ＭｕＬＶ ｇａｇ／ｐ
ｏｌ（ｐＨＩＴ６０）の発現構築物、ＭｕＬＶ系レトロ
ウイルスベクターＳＦＧ ＧＦＰＳ６５Ｔ及び上記種々
のエンベロープ発現構築物を２９３Ｔ細胞（９）に一過
性同時トランスフェクトした。トランスフェクションか
ら４８〜７２時間後にウイルス上清を回収した。同一プ
ラスミドをトランスフェクトした各トランスフェクショ
ン産物からの上清をプールし、濾過（０．４５μｍ細孔
寸法）し、最終濃度８μｇ／ｍｌまでポリブレンを加
え、上清を直接使用するか又は使用まで−８０℃で保存
した。レトロウイルス形質導入後にＧＦＰタンパク質を
発現する標的細胞をＦＡＣＳｃａｎでＦＡＣＳ分析によ
り同定し、ＬｙｓｉｓＩＩ ａｎｄ ＣｅｌｌＱｕｅｓ
ｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して陽性細胞の数を定量した。
型化したＭｕＬＶ粒子の感染性 ほぼ従来技術（３３）に記載されているようなｐＨＩＴ
パッケージングシステムを使用して組換えレトロウイル
ス粒子を作製した。要約すると、ＭｕＬＶ ｇａｇ／ｐ
ｏｌ（ｐＨＩＴ６０）の発現構築物、ＭｕＬＶ系レトロ
ウイルスベクターＳＦＧ ＧＦＰＳ６５Ｔ及び上記種々
のエンベロープ発現構築物を２９３Ｔ細胞（９）に一過
性同時トランスフェクトした。トランスフェクションか
ら４８〜７２時間後にウイルス上清を回収した。同一プ
ラスミドをトランスフェクトした各トランスフェクショ
ン産物からの上清をプールし、濾過（０．４５μｍ細孔
寸法）し、最終濃度８μｇ／ｍｌまでポリブレンを加
え、上清を直接使用するか又は使用まで−８０℃で保存
した。レトロウイルス形質導入後にＧＦＰタンパク質を
発現する標的細胞をＦＡＣＳｃａｎでＦＡＣＳ分析によ
り同定し、ＬｙｓｉｓＩＩ ａｎｄ ＣｅｌｌＱｕｅｓ
ｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して陽性細胞の数を定量した。
【００３３】ｐＣＨＦＶ ｗｔ発現構築物を使用した初
期実験によると、効率は低いが、ＨＦＶ ｗｔエンベロ
ープタンパク質でＭｕＬＶ粒子を偽型化することがで
き、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質導入できることが判明した
（図２）。ＨＦＶエンベロープタンパク質は、発現細胞
のＥＲへの保持を誘導するシグナル配列をその細胞質ド
メインに含む（１３，１４）。従って、細胞質的に截断
又は突然変異を含むＨＦＶエンベロープタンパク質をコ
ードする３種の構築物ｐＣＨＦＶ Δ１、ｐＣＨＦＶ
Δ２及びｐＣＨＦＶ ＳＳＳを試験し、ＨＦＶエンベロ
ープの細胞質ドメインとそのＥＲ保持が偽型効率に及ぼ
す影響を調べた。野生型タンパク質に既に観察されてい
る低い偽型活性は、ＨＦＶエンベロープの細胞質ドメイ
ンを完全（ｐＣＨＦＶ Δ１）又は部分的（ｐＣＨＦＶ
Δ２）に除去すると失われるか又は低下する（図
２）。細胞質ＥＲ保持シグナルの突然変異（ｐＣＨＦＶ
ＳＳＳ）はＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞表面
発現を増加することが従来示されている（１３）。しか
し、このような突然変異タンパク質でウイルス粒子を偽
型化しても、これらのウイルスの感染性は増加しなかっ
た（図２）。
期実験によると、効率は低いが、ＨＦＶ ｗｔエンベロ
ープタンパク質でＭｕＬＶ粒子を偽型化することがで
き、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質導入できることが判明した
（図２）。ＨＦＶエンベロープタンパク質は、発現細胞
のＥＲへの保持を誘導するシグナル配列をその細胞質ド
メインに含む（１３，１４）。従って、細胞質的に截断
又は突然変異を含むＨＦＶエンベロープタンパク質をコ
ードする３種の構築物ｐＣＨＦＶ Δ１、ｐＣＨＦＶ
Δ２及びｐＣＨＦＶ ＳＳＳを試験し、ＨＦＶエンベロ
ープの細胞質ドメインとそのＥＲ保持が偽型効率に及ぼ
す影響を調べた。野生型タンパク質に既に観察されてい
る低い偽型活性は、ＨＦＶエンベロープの細胞質ドメイ
ンを完全（ｐＣＨＦＶ Δ１）又は部分的（ｐＣＨＦＶ
Δ２）に除去すると失われるか又は低下する（図
２）。細胞質ＥＲ保持シグナルの突然変異（ｐＣＨＦＶ
ＳＳＳ）はＨＦＶエンベロープタンパク質の細胞表面
発現を増加することが従来示されている（１３）。しか
し、このような突然変異タンパク質でウイルス粒子を偽
型化しても、これらのウイルスの感染性は増加しなかっ
た（図２）。
【００３４】ＨＦＶ細胞質ドメインを除去又は修飾して
も偽型ウイルスの感染効率を増加することはできなかっ
たので、次に第２のアプローチを使用し、ＨＦＶ細胞質
ドメインをＭｕＬＶ細胞質ドメインで置換するか又はＭ
ｕＬＶ細胞質ドメインを修飾完全長ＨＦＶエンベロープ
と融合して所望の効果が得られるか否かを試験した。Ｍ
ｕＬＶエンベロープの細胞質ドメインはウイルス粒子内
でＭｕＬＶプロテアーゼによりプロセシングされること
が示された（１６，１７）。既にプロセシングされてい
る形態のＭｕＬＶエンベロープタンパク質を細胞で発現
させると、大きい多核シンシチウムが形成され、ウイル
ス感染性が低下した（２４，２６）。従って、上記３種
の突然変異体とＭｕＬＶエンベロープタンパク質のプロ
セシングされているか（ＭｕＬＶＲ−）又はプロセシン
グされていない（ＭｕＬＶ）細胞質ドメインのＣ末端融
合タンパク質を作製し、これらのキメラエンベロープタ
ンパク質で偽型化した粒子の感染性をＮＩＨ３Ｔ３細胞
で試験した。興味深いことに、１種の突然変異体である
ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶタンパク質で偽型化したウイルス
は野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化した粒
子よりも１０〜２０倍高い活性を示した（図２）。ＨＦ
Ｖ Δ２ＭｕＬＶタンパク質による感染性のこの増加は
ＮＩＨ３Ｔ３即ちマウス細胞に特異的ではなく、ＭｕＬ
Ｖエンベロープタンパク質で被覆したウイルス粒子を感
染させることができないウズラ繊維芽細胞系ＱＴ−６で
も同様の結果が得られた（図２）。これらの細胞におい
て、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープタンパク質で偽
型化した粒子の感染性はＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化
した粒子よりも一貫して高かった。分析した他の全タン
パク質は、どちらの細胞系でも野生型ＨＦＶエンベロー
プよりも低いか又は同等の相対感染性をもつ偽型ウイル
スを生じた（図２）。更に、プロセシングされているＭ
ｕＬＶ細胞質ドメインを含むキメラＨＦＶエンベロープ
タンパク質をＬ９２９細胞でレトロウイルスベクターに
より発現させると、プロセシングされていないＭｕＬＶ
細胞質ドメインをもつ対応するタンパク質よりも高い融
合活性を示した（データは示さず）。この結果は、Ｍｕ
ＬＶエンベロープの細胞質ドメインがキメラエンベロー
プタンパク質として発現されるときにサル免疫不全ウイ
ルス（ＳＩＶ）等の外来エンベロープタンパク質の融合
活性を制御できることを示すデータ（３６）に一致す
る。更に、種々のエンベロープタンパク質で偽型化した
核局在β−ガラクトシダーゼタンパク質をコードするレ
トロウイルスベクターを含む上清を種々の種の細胞系で
力価測定した（表１）。より詳細に説明すると、トラン
スフェクトした２９３Ｔ細胞の上清の系列希釈液で感染
させる２４時間前に標的細胞（１×１０4 細胞／ウェ
ル）をプレーティングした。感染から４８時間後に青い
フォーカスの数を２回数え、力価を計算した。２回測定
の値は３倍の範囲であった。表に示す結果は、指定細胞
系で全て同一トランスフェクションからの無細胞上清を
用いて独立して２回実施した力価測定の代表値であり、
２回の実験で再現性のある相対力価が得られた。偽型粒
子を含む上清をＮＩＨ３Ｔ３細胞中で６回まで力価測定
し、再現性のある結果を得た。ＨＦＶ ｗｔエンベロー
プタンパク質又はＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶキメラタンパク
質で偽型化したレトロウイルス粒子は、マウス細胞以外
にヒト、ミンク及びハムスター由来の細胞にも感染させ
ることができた（表１）。ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベ
ロープタンパク質で偽型化したレトロウイルスベクター
の力価は、使用した標的細胞に依存して野生型ＨＦＶエ
ンベロープタンパク質で偽型化した場合の力価よりも８
〜３５倍高かった。
も偽型ウイルスの感染効率を増加することはできなかっ
たので、次に第２のアプローチを使用し、ＨＦＶ細胞質
ドメインをＭｕＬＶ細胞質ドメインで置換するか又はＭ
ｕＬＶ細胞質ドメインを修飾完全長ＨＦＶエンベロープ
と融合して所望の効果が得られるか否かを試験した。Ｍ
ｕＬＶエンベロープの細胞質ドメインはウイルス粒子内
でＭｕＬＶプロテアーゼによりプロセシングされること
が示された（１６，１７）。既にプロセシングされてい
る形態のＭｕＬＶエンベロープタンパク質を細胞で発現
させると、大きい多核シンシチウムが形成され、ウイル
ス感染性が低下した（２４，２６）。従って、上記３種
の突然変異体とＭｕＬＶエンベロープタンパク質のプロ
セシングされているか（ＭｕＬＶＲ−）又はプロセシン
グされていない（ＭｕＬＶ）細胞質ドメインのＣ末端融
合タンパク質を作製し、これらのキメラエンベロープタ
ンパク質で偽型化した粒子の感染性をＮＩＨ３Ｔ３細胞
で試験した。興味深いことに、１種の突然変異体である
ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶタンパク質で偽型化したウイルス
は野生型ＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化した粒
子よりも１０〜２０倍高い活性を示した（図２）。ＨＦ
Ｖ Δ２ＭｕＬＶタンパク質による感染性のこの増加は
ＮＩＨ３Ｔ３即ちマウス細胞に特異的ではなく、ＭｕＬ
Ｖエンベロープタンパク質で被覆したウイルス粒子を感
染させることができないウズラ繊維芽細胞系ＱＴ−６で
も同様の結果が得られた（図２）。これらの細胞におい
て、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープタンパク質で偽
型化した粒子の感染性はＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化
した粒子よりも一貫して高かった。分析した他の全タン
パク質は、どちらの細胞系でも野生型ＨＦＶエンベロー
プよりも低いか又は同等の相対感染性をもつ偽型ウイル
スを生じた（図２）。更に、プロセシングされているＭ
ｕＬＶ細胞質ドメインを含むキメラＨＦＶエンベロープ
タンパク質をＬ９２９細胞でレトロウイルスベクターに
より発現させると、プロセシングされていないＭｕＬＶ
細胞質ドメインをもつ対応するタンパク質よりも高い融
合活性を示した（データは示さず）。この結果は、Ｍｕ
ＬＶエンベロープの細胞質ドメインがキメラエンベロー
プタンパク質として発現されるときにサル免疫不全ウイ
ルス（ＳＩＶ）等の外来エンベロープタンパク質の融合
活性を制御できることを示すデータ（３６）に一致す
る。更に、種々のエンベロープタンパク質で偽型化した
核局在β−ガラクトシダーゼタンパク質をコードするレ
トロウイルスベクターを含む上清を種々の種の細胞系で
力価測定した（表１）。より詳細に説明すると、トラン
スフェクトした２９３Ｔ細胞の上清の系列希釈液で感染
させる２４時間前に標的細胞（１×１０4 細胞／ウェ
ル）をプレーティングした。感染から４８時間後に青い
フォーカスの数を２回数え、力価を計算した。２回測定
の値は３倍の範囲であった。表に示す結果は、指定細胞
系で全て同一トランスフェクションからの無細胞上清を
用いて独立して２回実施した力価測定の代表値であり、
２回の実験で再現性のある相対力価が得られた。偽型粒
子を含む上清をＮＩＨ３Ｔ３細胞中で６回まで力価測定
し、再現性のある結果を得た。ＨＦＶ ｗｔエンベロー
プタンパク質又はＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶキメラタンパク
質で偽型化したレトロウイルス粒子は、マウス細胞以外
にヒト、ミンク及びハムスター由来の細胞にも感染させ
ることができた（表１）。ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベ
ロープタンパク質で偽型化したレトロウイルスベクター
の力価は、使用した標的細胞に依存して野生型ＨＦＶエ
ンベロープタンパク質で偽型化した場合の力価よりも８
〜３５倍高かった。
【００３５】
【表１】
【００３６】３．ＨＦＶ特異的抗血清によるＨＦＶ ｅ
ｎｖ偽型粒子の感染性の中和 種々のＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化したＭｕ
ＬＶ粒子の感染性がＨＦＶエンベロープに特異的である
ことを確認するために、偽型粒子を標的細胞に加える前
に抗ＨＦＶ特異的チンパンジー血清と共にプレインキュ
ベートした（３）。アンホトロピックＭｕＬＶエンベロ
ープ又はＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化したウイルス粒
子をＨＦＶ特異的抗血清と共にプレインキュベートした
場合の感染性は、これらのウイルスを標準熱不活化ヒト
血清（図３）又はモックインキュベートしたウイルス粒
子（データは示さず）と共にプレインキュベートした場
合に比較して低下しなかった。他方、野生型ＨＦＶエン
ベロープタンパク質又はＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶキメラで
偽型化した粒子の感染性は、ＨＦＶ特異的抗血清と共に
プレインキュベートすると完全に失われたが、ヒト対照
血清と共にプレインキュベートした場合には失われなか
った（図３）。ＨＦＶエンベロープ特異的感染性のこの
中和は、ＮＩＨ３Ｔ３（図３Ａ）及びＱＴ−６（図３
Ｂ）細胞で観察された。ＨＦＶエンベロープタンパク質
のバキュロウイルス発現ＳＵドメインに対するウサギ血
清を使用した実験でも、ＨＦＶエンベロープタンパク質
で偽型化したウイルス粒子の同様の特異的中和が得られ
た（データは示さず）。
ｎｖ偽型粒子の感染性の中和 種々のＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化したＭｕ
ＬＶ粒子の感染性がＨＦＶエンベロープに特異的である
ことを確認するために、偽型粒子を標的細胞に加える前
に抗ＨＦＶ特異的チンパンジー血清と共にプレインキュ
ベートした（３）。アンホトロピックＭｕＬＶエンベロ
ープ又はＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化したウイルス粒
子をＨＦＶ特異的抗血清と共にプレインキュベートした
場合の感染性は、これらのウイルスを標準熱不活化ヒト
血清（図３）又はモックインキュベートしたウイルス粒
子（データは示さず）と共にプレインキュベートした場
合に比較して低下しなかった。他方、野生型ＨＦＶエン
ベロープタンパク質又はＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶキメラで
偽型化した粒子の感染性は、ＨＦＶ特異的抗血清と共に
プレインキュベートすると完全に失われたが、ヒト対照
血清と共にプレインキュベートした場合には失われなか
った（図３）。ＨＦＶエンベロープ特異的感染性のこの
中和は、ＮＩＨ３Ｔ３（図３Ａ）及びＱＴ−６（図３
Ｂ）細胞で観察された。ＨＦＶエンベロープタンパク質
のバキュロウイルス発現ＳＵドメインに対するウサギ血
清を使用した実験でも、ＨＦＶエンベロープタンパク質
で偽型化したウイルス粒子の同様の特異的中和が得られ
た（データは示さず）。
【００３７】４．ＨＦＶ ｅｎｖタンパク質の発現及び
粒子取込み 一過性トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の放射性免疫
沈降分析（ＲＩＰＡ）により、種々のＨＦＶエンベロー
プタンパク質の発現及びＭｕＬＶ粒子への取込みを測定
した。ＤＮＡ（ｐＨＩＴ６０、ＳＦＧ ＧＦＰＳ６５Ｔ
及び種々のｅｎｖ構築物）の添加から４８時間後に細胞
を［35Ｓ］メチオニンで約２０時間代謝標識した。上清
中に存在するウイルス粒子を溶解バッファーで可溶化す
る前に２０％スクロースクッションで２５０００ｒｐｍ
で遠心分離してペレット化した。次に、試料を免疫沈降
させた。ウイルス粒子とその対応する細胞溶解物をＨＦ
Ｖ特異的チンパンジー血清又は抗ＭｕＬＶ ｇａｇハイ
ブリドーマ上清で免疫沈降させ、沈降物をＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析し
た。ペレット化ウイルス又は細胞溶解物からの免疫沈降
物中のＨＦＶ特異的バンドはＨＦＶ ｅｎｖ発現構築物
をトランスフェクトした試料でしか観察されず、ＭｕＬ
Ｖアンホトロピックエンベロープタンパク質を発現する
試料又はモックトランスフェクト培養物では観察されな
かった。ＨＦＶ ｅｎｖをトランスフェクトした細胞の
細胞溶解物の免疫沈降物には１３０及び１１０ＫＤの２
つの主要なＨＦＶエンベロープ前駆物質バンドが観察さ
れた（１２，２１）。更に、より長時間暴露後にはプロ
セシングされている〜９０ＫＤ ＳＵ及び〜４５〜５０
ＫＤ ＴＭタンパク質に対応する２つのバンドを観察す
ることができた。種々のＨＦＶ突然変異体をトランスフ
ェクトした細胞試料におけるＴＭタンパク質の見掛寸法
は種々異なり、個々のタンパク質のＴＭ部分が修飾され
たことを示した。ＨＦＶ ＳＳＳＭｕＬＶＲ−及びＨＦ
Ｖ ＳＳＳＭｕＬＶは細胞発現の明白な低下を示した
が、それ以外は、トランスフェクトした細胞における種
々のエンベロープタンパク質の定常状態レベルには並の
差異しか観察されなかった。ペレット化ウイルス粒子の
免疫沈降物には両者エンベロープ前駆物質タンパク質と
プロセシングされているＳＵ及びＴＭタンパク質も検出
された。他方、一般に前駆物質タンパク質に対するプロ
セシングされているタンパク質の相対比はウイルス粒子
免疫沈降物のほうが細胞溶解物よりも高かった。
粒子取込み 一過性トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の放射性免疫
沈降分析（ＲＩＰＡ）により、種々のＨＦＶエンベロー
プタンパク質の発現及びＭｕＬＶ粒子への取込みを測定
した。ＤＮＡ（ｐＨＩＴ６０、ＳＦＧ ＧＦＰＳ６５Ｔ
及び種々のｅｎｖ構築物）の添加から４８時間後に細胞
を［35Ｓ］メチオニンで約２０時間代謝標識した。上清
中に存在するウイルス粒子を溶解バッファーで可溶化す
る前に２０％スクロースクッションで２５０００ｒｐｍ
で遠心分離してペレット化した。次に、試料を免疫沈降
させた。ウイルス粒子とその対応する細胞溶解物をＨＦ
Ｖ特異的チンパンジー血清又は抗ＭｕＬＶ ｇａｇハイ
ブリドーマ上清で免疫沈降させ、沈降物をＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析し
た。ペレット化ウイルス又は細胞溶解物からの免疫沈降
物中のＨＦＶ特異的バンドはＨＦＶ ｅｎｖ発現構築物
をトランスフェクトした試料でしか観察されず、ＭｕＬ
Ｖアンホトロピックエンベロープタンパク質を発現する
試料又はモックトランスフェクト培養物では観察されな
かった。ＨＦＶ ｅｎｖをトランスフェクトした細胞の
細胞溶解物の免疫沈降物には１３０及び１１０ＫＤの２
つの主要なＨＦＶエンベロープ前駆物質バンドが観察さ
れた（１２，２１）。更に、より長時間暴露後にはプロ
セシングされている〜９０ＫＤ ＳＵ及び〜４５〜５０
ＫＤ ＴＭタンパク質に対応する２つのバンドを観察す
ることができた。種々のＨＦＶ突然変異体をトランスフ
ェクトした細胞試料におけるＴＭタンパク質の見掛寸法
は種々異なり、個々のタンパク質のＴＭ部分が修飾され
たことを示した。ＨＦＶ ＳＳＳＭｕＬＶＲ−及びＨＦ
Ｖ ＳＳＳＭｕＬＶは細胞発現の明白な低下を示した
が、それ以外は、トランスフェクトした細胞における種
々のエンベロープタンパク質の定常状態レベルには並の
差異しか観察されなかった。ペレット化ウイルス粒子の
免疫沈降物には両者エンベロープ前駆物質タンパク質と
プロセシングされているＳＵ及びＴＭタンパク質も検出
された。他方、一般に前駆物質タンパク質に対するプロ
セシングされているタンパク質の相対比はウイルス粒子
免疫沈降物のほうが細胞溶解物よりも高かった。
【００３８】興味深いことに、ウイルス粒子の個々の免
疫沈降物におけるプロセシングされているＳＵ及びＴＭ
タンパク質の量と、対応する偽型粒子の相対感染性（図
２）の間に良好な相関を観察することができた。最高の
相対感染性をもつ偽型粒子を生じたＨＦＶ Δ２ＭｕＬ
ＶキメラエンベロープはＲＩＰＡでも最強のＳＵ及びＴ
Ｍバンドを示した。粗ウイルスペレット又は抗ｇａｇハ
イブリドーマ上清で免疫沈降させた沈降物で個々のウイ
ルス粒子調製物中のＭｕＬＶ ｇａｇ／ｐｏｌタンパク
質の量を測定した処、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロー
プトランスフェクションを除く全試料で同様であった。
この試料は粒子会合ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質の有意低
下を示し、この調製物には他のウイルスペレットよりも
少数のＭｕＬＶ粒子しか存在しないことを示した。従っ
て、各ウイルス粒子当たりのプロセシングされているＨ
ＦＶ ＳＵ及びＴＭタンパク質の相対量は、ウイルス粒
子調製物をＨＦＶ特異抗体で免疫沈降させた沈降物から
予想されるよりも更に高いと思われる。この現象の一因
として、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶで偽型化した粒子の感染
性が他のＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化した粒
子よりも高い結果、これらの粒子がＨＦＶ ｅｎｖタン
パク質を発現しないトランスフェクト細胞により多量に
吸収されるためであると考えられる。この結果、ＨＦＶ
Δ２ＭｕＬＶで偽型化した粒子は上清から除去され得
る。更に、アンホトロピックＭｕＬＶエンベロープ又は
ＶＳＶ−Ｇで偽型化したＭｕＬＶ粒子とは対照的に、Ｈ
ＦＶで偽型化したウイルスはポリブレン等のポリカチオ
ンの不在下で感染性の低下を全く示さなかった（３
０）。従って、一過性トランスフェクションによりＨＦ
Ｖエンベロープで偽型化したレトロウイルスベクターの
相対力価は、アンホトロピックＭｕＬＶエンベロープ又
はＶＳＶ−Ｇで偽型化した場合よりも過小評価されると
思われる。但し、これらの現象を更に詳細に解明するに
は、ＨＦＶエンベロープで偽型化したウイルスによる感
染に耐性のＨＦＶエンベロープを安定的に発現する細胞
系を使用して更に進んだ実験を行う必要がある。
疫沈降物におけるプロセシングされているＳＵ及びＴＭ
タンパク質の量と、対応する偽型粒子の相対感染性（図
２）の間に良好な相関を観察することができた。最高の
相対感染性をもつ偽型粒子を生じたＨＦＶ Δ２ＭｕＬ
ＶキメラエンベロープはＲＩＰＡでも最強のＳＵ及びＴ
Ｍバンドを示した。粗ウイルスペレット又は抗ｇａｇハ
イブリドーマ上清で免疫沈降させた沈降物で個々のウイ
ルス粒子調製物中のＭｕＬＶ ｇａｇ／ｐｏｌタンパク
質の量を測定した処、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロー
プトランスフェクションを除く全試料で同様であった。
この試料は粒子会合ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質の有意低
下を示し、この調製物には他のウイルスペレットよりも
少数のＭｕＬＶ粒子しか存在しないことを示した。従っ
て、各ウイルス粒子当たりのプロセシングされているＨ
ＦＶ ＳＵ及びＴＭタンパク質の相対量は、ウイルス粒
子調製物をＨＦＶ特異抗体で免疫沈降させた沈降物から
予想されるよりも更に高いと思われる。この現象の一因
として、ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶで偽型化した粒子の感染
性が他のＨＦＶエンベロープタンパク質で偽型化した粒
子よりも高い結果、これらの粒子がＨＦＶ ｅｎｖタン
パク質を発現しないトランスフェクト細胞により多量に
吸収されるためであると考えられる。この結果、ＨＦＶ
Δ２ＭｕＬＶで偽型化した粒子は上清から除去され得
る。更に、アンホトロピックＭｕＬＶエンベロープ又は
ＶＳＶ−Ｇで偽型化したＭｕＬＶ粒子とは対照的に、Ｈ
ＦＶで偽型化したウイルスはポリブレン等のポリカチオ
ンの不在下で感染性の低下を全く示さなかった（３
０）。従って、一過性トランスフェクションによりＨＦ
Ｖエンベロープで偽型化したレトロウイルスベクターの
相対力価は、アンホトロピックＭｕＬＶエンベロープ又
はＶＳＶ−Ｇで偽型化した場合よりも過小評価されると
思われる。但し、これらの現象を更に詳細に解明するに
は、ＨＦＶエンベロープで偽型化したウイルスによる感
染に耐性のＨＦＶエンベロープを安定的に発現する細胞
系を使用して更に進んだ実験を行う必要がある。
【００３９】５．ＦＶ ｅｎｖ遺伝子に配置したスプラ
イスドナー及びアクセプター部位の失活 更に、ＨＦＶエンベロープＯＲＦ（６３１０〜９２７６
位）内に位置する内部ＨＦＶプロモーター（５’ＬＴＲ
の転写始点に対して８４１９位）から誘導されるＢｅｌ
−１及びＢｅｔ転写産物は、ｅｎｖタンパク質のＴＭサ
ブユニットのコーディング領域内のスプライスドナー
（ＳＤ、９１１９位）及びスプライスアクセプター（Ｓ
Ａ、９２３７位）部位を有効に利用する。あるいは、こ
れらのＳＤ及びＳＡ部位を利用してＨＦＶ ｅｎｖタン
パク質をコードするｍＲＮＡをスプライスすると、潜在
的エンベロープ／ｂｅｌ融合タンパク質が得られる。〜
１７０ＫＤは免疫沈降によりＨＦＶ感染細胞で検出する
ことができ、ｍＲＮＡはＨＦＶに感染したヒト繊維芽細
胞からの全ｍＲＮＡのＲＴ（逆転写酵素）ＰＣＲにより
検出することができる。ＳＤ（９１１９位）をＧＴ→Ｇ
Ｇ突然変異により失活させると、１７０ＫＤエンベロー
プ融合タンパク質は消失するが、１３０ＫＤエンベロー
プ前駆物質タンパク質の発現は変わらない。ｅｎｖ／ｂ
ｅｌ融合タンパク質の生物学的機能とウイルス力価に及
ぼす偽型ＭｕＬＶ粒子の影響については現在のところ不
明である。上述のＧＦＰ発現ＭｕＬＶレトロウイルスベ
クターを用いた予備実験は、相対感染性に及ぼす影響を
何ら示さない。
イスドナー及びアクセプター部位の失活 更に、ＨＦＶエンベロープＯＲＦ（６３１０〜９２７６
位）内に位置する内部ＨＦＶプロモーター（５’ＬＴＲ
の転写始点に対して８４１９位）から誘導されるＢｅｌ
−１及びＢｅｔ転写産物は、ｅｎｖタンパク質のＴＭサ
ブユニットのコーディング領域内のスプライスドナー
（ＳＤ、９１１９位）及びスプライスアクセプター（Ｓ
Ａ、９２３７位）部位を有効に利用する。あるいは、こ
れらのＳＤ及びＳＡ部位を利用してＨＦＶ ｅｎｖタン
パク質をコードするｍＲＮＡをスプライスすると、潜在
的エンベロープ／ｂｅｌ融合タンパク質が得られる。〜
１７０ＫＤは免疫沈降によりＨＦＶ感染細胞で検出する
ことができ、ｍＲＮＡはＨＦＶに感染したヒト繊維芽細
胞からの全ｍＲＮＡのＲＴ（逆転写酵素）ＰＣＲにより
検出することができる。ＳＤ（９１１９位）をＧＴ→Ｇ
Ｇ突然変異により失活させると、１７０ＫＤエンベロー
プ融合タンパク質は消失するが、１３０ＫＤエンベロー
プ前駆物質タンパク質の発現は変わらない。ｅｎｖ／ｂ
ｅｌ融合タンパク質の生物学的機能とウイルス力価に及
ぼす偽型ＭｕＬＶ粒子の影響については現在のところ不
明である。上述のＧＦＰ発現ＭｕＬＶレトロウイルスベ
クターを用いた予備実験は、相対感染性に及ぼす影響を
何ら示さない。
【００４０】要約すると、ＨＦＶエンベロープタンパク
質で偽型化したＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターを製
造するためのシステムを作製した。ＨＦＶエンベロープ
タンパク質の細胞質ドメインを前進的に欠失させると、
遺伝子移入とウイルス粒子へのＨＦＶ ｅｎｖ ＳＵ及
びＴＭサブユニットの取込みが低下するので、ＨＦＶエ
ンベロープタンパク質の細胞質ドメインはＭｕＬＶ粒子
の偽型化に少なくとも部分的に関与していた。１種の欠
失突然変異体であるＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープ
にプロセシングされていないＭｕＬＶエンベロープ細胞
質ドメインを付加すると、ＨＦＶ野生型エンベロープタ
ンパク質に比較して感染性が１０〜２０倍増加し、偽型
粒子へのキメラエンベロープタンパク質の取込みが増加
した。レトロウイルス力価は、野生型ＨＦＶエンベロー
プタンパク質で偽型化することにより達せられる力価の
８〜３５倍であった。標的細胞型によっては、遺伝子移
入効率がＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化したレトロウイ
ルスベクターと同等以上のものもあった。野生型ＭｕＬ
Ｖエンベロープタンパク質の場合には、ウイルス粒子へ
のエンベロープの特異的取込みにおける細胞質ドメイン
の役割は不明である。細胞質尾部欠失突然変異体にうち
には粒子会合エンベロープタンパク質が減少するものも
あり（１５）、また、突然変異エンベロープタンパク質
によっては粒子会合の低下を殆ど〜全く示さないものも
あった（２５，２６）。本発明の結果は、エンベロープ
タンパク質の粒子会合、少なくともＭｕＬＶ粒子へのキ
メラエンベロープタンパク質の取込みの増加におけるＭ
ｕＬＶ ｅｎｖ細胞質ドメインの役割を裏付けるもので
ある。
質で偽型化したＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターを製
造するためのシステムを作製した。ＨＦＶエンベロープ
タンパク質の細胞質ドメインを前進的に欠失させると、
遺伝子移入とウイルス粒子へのＨＦＶ ｅｎｖ ＳＵ及
びＴＭサブユニットの取込みが低下するので、ＨＦＶエ
ンベロープタンパク質の細胞質ドメインはＭｕＬＶ粒子
の偽型化に少なくとも部分的に関与していた。１種の欠
失突然変異体であるＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープ
にプロセシングされていないＭｕＬＶエンベロープ細胞
質ドメインを付加すると、ＨＦＶ野生型エンベロープタ
ンパク質に比較して感染性が１０〜２０倍増加し、偽型
粒子へのキメラエンベロープタンパク質の取込みが増加
した。レトロウイルス力価は、野生型ＨＦＶエンベロー
プタンパク質で偽型化することにより達せられる力価の
８〜３５倍であった。標的細胞型によっては、遺伝子移
入効率がＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化したレトロウイ
ルスベクターと同等以上のものもあった。野生型ＭｕＬ
Ｖエンベロープタンパク質の場合には、ウイルス粒子へ
のエンベロープの特異的取込みにおける細胞質ドメイン
の役割は不明である。細胞質尾部欠失突然変異体にうち
には粒子会合エンベロープタンパク質が減少するものも
あり（１５）、また、突然変異エンベロープタンパク質
によっては粒子会合の低下を殆ど〜全く示さないものも
あった（２５，２６）。本発明の結果は、エンベロープ
タンパク質の粒子会合、少なくともＭｕＬＶ粒子へのキ
メラエンベロープタンパク質の取込みの増加におけるＭ
ｕＬＶ ｅｎｖ細胞質ドメインの役割を裏付けるもので
ある。
【００４１】最近、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇ（６，３８）
又はＧＡＬＶエンベロープ（２，３４）等の外来エンベ
ロープタンパク質でＭｕＬＶ系レトロウイルスベクター
を偽型化した結果、ウイルス安定性が増加し、宿主細胞
範囲が広がり、所定の細胞型の形質導入効率が増加し
た。ＦＶの宿主範囲が広く、ヒト血清による失活を阻止
し（３０）、ポリカチオンの不在下で種々の起源の細胞
に有効に感染できる（未公開資料及び（３０））ため、
ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶキメラエンベロープタンパク質で
偽型化したＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターは種々の
細胞型に遺伝子を有効に導入するための有用な新規ツー
ルになるであろう。ＶＳＶ−Ｇは産生細胞に高毒性であ
り、最近まで安定なＶＳＶ−Ｇパッケージング細胞系を
作製することはできなかった（８，２２，３７）が、Ｈ
ＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープの一過性発現の結果、
２９３Ｔ細胞で明白な毒性は生じなかった（データは示
さず、（１９））。
又はＧＡＬＶエンベロープ（２，３４）等の外来エンベ
ロープタンパク質でＭｕＬＶ系レトロウイルスベクター
を偽型化した結果、ウイルス安定性が増加し、宿主細胞
範囲が広がり、所定の細胞型の形質導入効率が増加し
た。ＦＶの宿主範囲が広く、ヒト血清による失活を阻止
し（３０）、ポリカチオンの不在下で種々の起源の細胞
に有効に感染できる（未公開資料及び（３０））ため、
ＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶキメラエンベロープタンパク質で
偽型化したＭｕＬＶ系レトロウイルスベクターは種々の
細胞型に遺伝子を有効に導入するための有用な新規ツー
ルになるであろう。ＶＳＶ−Ｇは産生細胞に高毒性であ
り、最近まで安定なＶＳＶ−Ｇパッケージング細胞系を
作製することはできなかった（８，２２，３７）が、Ｈ
ＦＶ Δ２ＭｕＬＶエンベロープの一過性発現の結果、
２９３Ｔ細胞で明白な毒性は生じなかった（データは示
さず、（１９））。
【００４２】参考資料
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
【表４】
【００４６】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＦＶエンベロープ発現構築物の模式図であ
る。ＨＦＶ（白部分）及びＭｕＬＶ（影部分）エンベロ
ープのＴＭ成分の細胞外、膜間及び細胞質ドメインを
（１１，２４）に従って示す。模式図の下に野生型ＨＦ
Ｖ及びＭｕＬＶタンパク質のアミノ酸配列も示す。ＨＦ
Ｖエンベロープ構築物のアミノ酸位置を目盛りに示す。
ＨＦＶエンベロープの細胞質ドメインでＥＲ保持（１
３）関与する配列モチーフの位置を黒部分として示し、
突然変異配列を斜線部分として示す。ＭｕＬＶエンベロ
ープタンパク質の完全長細胞質ドメインにおけるＭｕＬ
Ｖプロテアーゼの切断部位は２本の逆向き矢印により示
す。
る。ＨＦＶ（白部分）及びＭｕＬＶ（影部分）エンベロ
ープのＴＭ成分の細胞外、膜間及び細胞質ドメインを
（１１，２４）に従って示す。模式図の下に野生型ＨＦ
Ｖ及びＭｕＬＶタンパク質のアミノ酸配列も示す。ＨＦ
Ｖエンベロープ構築物のアミノ酸位置を目盛りに示す。
ＨＦＶエンベロープの細胞質ドメインでＥＲ保持（１
３）関与する配列モチーフの位置を黒部分として示し、
突然変異配列を斜線部分として示す。ＭｕＬＶエンベロ
ープタンパク質の完全長細胞質ドメインにおけるＭｕＬ
Ｖプロテアーゼの切断部位は２本の逆向き矢印により示
す。
【図２】種々のエンベロープタンパク質で偽型化したＭ
ｕＬＶ粒子の感染性を示す。２９３Ｔ細胞の一過性トラ
ンスフェクションにより作製した種々の偽型ＭｕＬＶ粒
子をＮＩＨ３Ｔ３（グレーの棒）又はＱＴ−６（黒の
棒）細胞に感染させた。形質導入から４８時間後にＧＦ
Ｐ発現細胞の百分率をＦＡＣＳ分析により定量した。Ｇ
ＦＰ発現細胞の平均蛍光はモック感染細胞の１００〜３
００倍であった。偽型化に使用した各エンベロープ構築
物をグラフのｙ軸に示す。各構築物のＧＦＰ発現細胞の
平均百分率を対応する標準偏差と共にｘ軸に示す。各構
築物を２〜６回試験した。
ｕＬＶ粒子の感染性を示す。２９３Ｔ細胞の一過性トラ
ンスフェクションにより作製した種々の偽型ＭｕＬＶ粒
子をＮＩＨ３Ｔ３（グレーの棒）又はＱＴ−６（黒の
棒）細胞に感染させた。形質導入から４８時間後にＧＦ
Ｐ発現細胞の百分率をＦＡＣＳ分析により定量した。Ｇ
ＦＰ発現細胞の平均蛍光はモック感染細胞の１００〜３
００倍であった。偽型化に使用した各エンベロープ構築
物をグラフのｙ軸に示す。各構築物のＧＦＰ発現細胞の
平均百分率を対応する標準偏差と共にｘ軸に示す。各構
築物を２〜６回試験した。
【図３】ＨＦＶエンベロープ特異的感染性の中和を示
す。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより
ｙ軸に示すような種々のエンベロープタンパク質で偽型
化合たＭｕＬＶ粒子を作製した。ＮＩＨ３Ｔ３（Ａ）又
はＱＴ−６（Ｂ）細胞に加える前に、上清（１ｍｌ）を
抗ＨＦＶ特異的チンパンジー血清（１：６０）（黒の
棒）又は健康な個体からのヒト血清（１：６０）（グレ
ーの棒）と共に３７℃で１時間インキュベートした。４
時間後に上清を吸引し、新鮮な成長培地に交換した。形
質導入から４８時間後に図２の説明に記載したようにＧ
ＦＰ発現細胞の百分率を測定した。実験は中和性サル血
清及びこれに抗ＨＦＶ表面ウサギ血清（データは示さ
ず）を加えて２回実施し、その結果、ＨＦＶエンベロー
プ偽型レトロウイルスベクターの感染性に同様の相対阻
害が生じた。
す。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより
ｙ軸に示すような種々のエンベロープタンパク質で偽型
化合たＭｕＬＶ粒子を作製した。ＮＩＨ３Ｔ３（Ａ）又
はＱＴ−６（Ｂ）細胞に加える前に、上清（１ｍｌ）を
抗ＨＦＶ特異的チンパンジー血清（１：６０）（黒の
棒）又は健康な個体からのヒト血清（１：６０）（グレ
ーの棒）と共に３７℃で１時間インキュベートした。４
時間後に上清を吸引し、新鮮な成長培地に交換した。形
質導入から４８時間後に図２の説明に記載したようにＧ
ＦＰ発現細胞の百分率を測定した。実験は中和性サル血
清及びこれに抗ＨＦＶ表面ウサギ血清（データは示さ
ず）を加えて２回実施し、その結果、ＨＦＶエンベロー
プ偽型レトロウイルスベクターの感染性に同様の相対阻
害が生じた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/15 Ｃ０７Ｋ 14/15 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (23)
- 【請求項１】 タンパク質が少なくとも１種の修飾フォ
ーミーウイルス（ＦＶ）エンベロープタンパク質を含む
ことを特徴とする、タンパク質の発現用構築物。 - 【請求項２】 フォーミーウイルスがヒトフォーミーウ
イルス（ＨＦＶ）であることを特徴とする請求項１に記
載の構築物。 - 【請求項３】 修飾が少なくとも１種の突然変異及び／
又は少なくとも１種の截断であることを特徴とする請求
項１又は２に記載の構築物。 - 【請求項４】 修飾が前記タンパク質の残基９７５又は
９８１における少なくとも１種の截断であることを特徴
とする請求項３に記載の構築物。 - 【請求項５】 前記タンパク質が非ＦＶレトロウイルス
エンベロープタンパク質の全部又は一部を更に含む融合
タンパク質であることを特徴とする請求項１から４のい
ずれか一項に記載の構築物。 - 【請求項６】 非ＦＶレトロウイルスエンベロープタン
パク質がＭｕＬＶ、ＭｏＭｕＬＶ、ＦＢ２９、ＨＩＶ及
びＳＩＶを含む群から選択されるレトロウイルスに由来
することを特徴とする請求項５に記載の構築物。 - 【請求項７】 タンパク質が細胞質ドメインの全部又は
一部を非ＦＶレトロウイルスエンベロープタンパク質、
好ましくはＭｕＬＶレトロウイルスエンベロープタンパ
ク質の全部又は一部で置換したＨＦＶエンベロープタン
パク質から構成されることを特徴とする請求項１から６
のいずれか一項に記載の構築物。 - 【請求項８】 タンパク質がＭｕＬＶ細胞質ドメインの
全部又は一部と修飾ＨＦＶエンベロープタンパク質との
融合物から構成されることを特徴とする請求項１から７
のいずれか一項に記載の構築物。 - 【請求項９】 ＭｕＬＶ細胞質ドメインがプロセシング
されているか又はプロセシングされていないことを特徴
とする請求項７又は８に記載の構築物。 - 【請求項１０】 タンパク質がＨＦＶ Δ２ＭｕＬＶで
あることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に
記載の構築物。 - 【請求項１１】 構築物がＦＶエンベロープタンパク質
をコードする配列中に天然に存在するドナー及び／又は
アクセプタースプライシング部位の突然変異を含むこと
を特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の
構築物。 - 【請求項１２】 請求項１から１１のいずれか一項に記
載の構築物により発現されるタンパク質。 - 【請求項１３】 ＦＶエンベロープタンパク質を含む偽
型ウイルス粒子。 - 【請求項１４】 請求項１２に記載のタンパク質を含む
偽型ウイルス粒子。 - 【請求項１５】 請求項１から１１のいずれか一項に記
載の構築物を含む補完細胞系。 - 【請求項１６】 請求項１０に記載の構築物を含む請求
項１５に記載の補完細胞系。 - 【請求項１７】 レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子
を発現する構築物を更に含む請求項１５又は１６に記載
の補完細胞系。 - 【請求項１８】 レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子
がＭｕＬＶ又はＦＢ２９に由来することを特徴とする請
求項１７に記載の補完細胞系。 - 【請求項１９】 細胞系が２９３株系に由来することを
特徴とする請求項１５から１８のいずれか一項に記載の
補完細胞系。 - 【請求項２０】 請求項１３又は１４に記載の偽型ウイ
ルス粒子の製造方法であって、（ｉ）請求項１５から１
９のいずれか一項に記載の補完細胞に組換えレトロウイ
ルスベクターを導入する段階と、（ｉｉ）前記偽型ウイ
ルス粒子を産生させるのに適した条件下で前記補完細胞
系を培養する段階と、（ｉｉｉ）細胞培養物から前記偽
型ウイルス粒子を回収する段階を含む前記方法。 - 【請求項２１】 請求項１３もしくは１４に記載の偽型
ウイルス粒子又は請求項２０に記載の方法により得られ
る偽型ウイルス粒子に感染した哺乳動物細胞。 - 【請求項２２】 治療又は予防に有効な量の請求項１３
もしくは１４に記載の偽型ウイルス粒子又は請求項２０
に記載の方法により得られる偽型ウイルス粒子又は請求
項２１に記載の哺乳動物細胞を含む医薬組成物。 - 【請求項２３】 治療を必要とする対象に、治療又は予
防に有効な量の請求項１３もしくは１４に記載の偽型ウ
イルス粒子又は請求項２０に記載の方法により得られる
偽型ウイルス粒子又は請求項２１に記載の哺乳動物細胞
を投与することを含む疾病の治療方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10234997A JP3954151B2 (ja) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | フォーミーウイルスエンベロープタンパク質の発現 |
| AU16291/97A AU1629197A (en) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | Expression of a foamy virus envelope protein |
| US08/816,439 US5929222A (en) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | Expression of a foamy virus envelope protein |
| EP97400573A EP0864652A1 (en) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | Expression of a foamy virus envelope protein |
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| JP10234997A JP3954151B2 (ja) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | フォーミーウイルスエンベロープタンパク質の発現 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10248567A true JPH10248567A (ja) | 1998-09-22 |
| JP3954151B2 JP3954151B2 (ja) | 2007-08-08 |
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|---|---|---|---|
| JP10234997A Expired - Fee Related JP3954151B2 (ja) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | フォーミーウイルスエンベロープタンパク質の発現 |
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| EP (1) | EP0864652A1 (ja) |
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| AU (1) | AU1629197A (ja) |
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| EP1005561A4 (en) * | 1997-03-21 | 2004-03-31 | Enzo Therapeutics Inc A Fully | VECTOR, VIRAL VECTORS AND PACKAGING CELL LINES TO THEIR REPRODUCTION |
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| US7560117B2 (en) * | 2001-05-22 | 2009-07-14 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Foamy virus mutant reverse transcriptase |
| US7247297B2 (en) * | 2001-09-14 | 2007-07-24 | The University Of Chicago | Use of DF3/MUC1 regulated expression in gene therapy |
| US20070037284A1 (en) * | 2003-06-04 | 2007-02-15 | Enzo Therapeutics, Inc. | Vectors for expressing exogenous gene or exogenous nucleic acid sequences |
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| EP2138584B1 (en) | 2008-06-27 | 2013-08-14 | Vectoria Forschungsförderungs Verein e.V. | Foamy viral envelope genes |
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| WO2012170765A2 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
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|---|---|---|---|---|
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-
1997
- 1997-03-14 US US08/816,439 patent/US5929222A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-14 JP JP10234997A patent/JP3954151B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-14 EP EP97400573A patent/EP0864652A1/en not_active Withdrawn
- 1997-03-14 AU AU16291/97A patent/AU1629197A/en not_active Abandoned
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