JPH10227792A - Measuring method for neutrophil chemotactic factor - Google Patents
Measuring method for neutrophil chemotactic factorInfo
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- JPH10227792A JPH10227792A JP9345018A JP34501897A JPH10227792A JP H10227792 A JPH10227792 A JP H10227792A JP 9345018 A JP9345018 A JP 9345018A JP 34501897 A JP34501897 A JP 34501897A JP H10227792 A JPH10227792 A JP H10227792A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は刺激剤を接種した動
物の腹腔滲出好中球を用いることを特徴とする好中球走
化性因子の測定方法に関する。The present invention relates to a method for measuring a neutrophil chemotactic factor, which comprises using neutrophils exuded from the peritoneal cavity of an animal inoculated with a stimulant.
【0002】[0002]
【従来の技術】白血球の組織への浸潤が生体防御機構に
おいて重要な位置を占めていることはよく知られてい
る。局所感染症に対する生体防御反応においては、外来
性の細菌などを殺菌するため好中球が感染した炎症部位
に集積する。2. Description of the Related Art It is well known that infiltration of leukocytes into tissues plays an important role in the body defense mechanism. In host defense reactions against local infections, neutrophils accumulate at infected inflammatory sites to kill foreign bacteria and the like.
【0003】また、癌細胞やウイルス感染細胞などに対
する生体防御反応においては、白血球が標的局所に動
員、集積する。これらの生体防御反応においては、白血
球(好中球)を炎症部位や標的部位に動員、集積させる
作用、即ち、白血球の遊走性および走化性を誘導する作
用が重要な役割を果たす。[0003] In a biological defense reaction against cancer cells or virus-infected cells, leukocytes are mobilized and accumulated at a target local area. In these biological defense reactions, the action of recruiting and accumulating leukocytes (neutrophils) to inflammation sites and target sites, that is, the action of inducing leukocyte migration and chemotaxis, plays an important role.
【0004】従来より、好中球の走化性因子としては、
補体フラグメントC5a(J.Biol.Chem.,2536955-6964,
1978) ,ロイコトリエンB4(Prostaglandines,20,411
-418,1980),ヒト単球由来好中球走化性因子(Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A,84,9233-9237,1987) 、fMLP(folmyl
Methyonyl Loycyl Phenylalanine),PAF(Platelet activ
ating factor)などが知られているが、最近になり、炎
症のケミカルメディエーターであるIL-1(Interleukin-
1) やTNF(Tumor necrosis factor), LPS(Lipopolysacch
aride)などの刺激を受けて初めて単球、線維芽細胞、内
皮細胞などが生合成して分泌する新しい好中球走化性因
子、IL-8(Interleukin-8) およびそのファミリーが見出
だされた(細胞工学, 9,435-443,1990)。Conventionally, neutrophil chemotaxis factors include:
Complement fragment C5a (J. Biol. Chem., 2536955-6964,
1978), Leukotriene B4 (Prostaglandines, 20, 411)
-418,1980), human monocyte-derived neutrophil chemotactic factor (Proc. Nat
l.Acad.Sci.USA, 84,9233-9237,1987), fMLP (folmyl
Methyonyl Loycyl Phenylalanine), PAF (Platelet activ
ating factor) is known, but recently, IL-1 (Interleukin-
1) and TNF (Tumor necrosis factor), LPS (Lipopolysacch
a new neutrophil chemotactic factor, IL-8 (Interleukin-8) and its family, which are synthesized and secreted by monocytes, fibroblasts, endothelial cells, etc. (Cell Engineering, 9,435-443, 1990).
【0005】IL−8は好中球走化性因子として,また
脱顆粒を引き起こす好中球活性化因子として見出だされ
てきたが、その後の研究によって,好中球以外にTリン
パ球や好塩基球,好酸球,血管内皮細胞に対しても遊走
活性を持ち、好中球の活性化による種々新たな生物活性
が報告されるようになった。たとえば、細胞内酵素の放
出、LTB4 の産生促進、Candida albicansの増殖抑
制、好中球での細胞接着因子(Mac-1,CR-1) の発現増
強、未刺激内皮細胞への好中球付着増強、IL−8刺激
好中球の内皮細胞付着能の低下など、また、皮膚角化細
胞の増殖刺激やメラノーマ細胞の投与局所への集積など
血球系の細胞以外への作用も報告されるようになった。
しかし、これらの生物活性のなかでも、好中球遊走活性
は直接的作用で最も強い活性である。[0005] IL-8 has been found to be a neutrophil chemotactic factor and a neutrophil activator that causes degranulation. It also has chemotactic activity on basophils, eosinophils, and vascular endothelial cells, and various new biological activities due to neutrophil activation have been reported. For example, release of intracellular enzymes, promoting the production of LTB 4, Candida albicans growth inhibition, enhanced expression of cell adhesion factors in neutrophils (Mac-1, CR-1 ), unstimulated endothelial cells to neutrophils Effects on non-hemocyte cells such as enhanced adhesion, decreased adhesion of endothelial cells to IL-8-stimulated neutrophils, and stimulation of skin keratinocyte proliferation and accumulation of melanoma cells at the administration site are also reported. It became so.
However, among these biological activities, neutrophil migration activity is the strongest activity as a direct effect.
【0006】好中球走化性因子の測定法には,近年、急
速に進展した特異的モノクローナル抗体作製技術を用い
て作製された感度の良い酵素標識免疫定量法(ELISA)や
ラジオイムノアッセイ法があるが、これらは生物活性を
反映したものでなく、精度、再現性に優れた簡便な生物
活性測定法の確立が望まれてきた。[0006] In recent years, neutrophil chemotactic factors have been measured using highly sensitive enzyme-labeled immunoassays (ELISA) and radioimmunoassays, which have been produced using a specific monoclonal antibody production technology that has been rapidly developed in recent years. However, these do not reflect biological activity, and it has been desired to establish a simple method for measuring biological activity with excellent accuracy and reproducibility.
【0007】ヒトIL−8に関してこれまでに報告され
てきた生物活性測定法には,好中球遊走活性を測定する
方法,好中球の活性化により遊離されるライソザイム酵
素や活性酸素を測定する方法などがある。現在一般に用
いられている遊走活性測定法には、次に述べるように感
度、精度、再現性,操作における簡便さの点で問題があ
り、ライソザイム酵素の遊離や活性酸素の放出を測定す
る方法は,IL−8の好中球活性化による間接作用であ
ることから感度,特異性,再現性の点で問題があった。[0007] The biological activity measurement methods reported so far for human IL-8 include a method for measuring neutrophil migration activity, a lysozyme enzyme and active oxygen released by neutrophil activation. There are methods. Currently used migration activity measurement methods have problems in sensitivity, accuracy, reproducibility, and simplicity in operation as described below. Methods for measuring the release of lysozyme enzyme and the release of active oxygen are not available. , IL-8, which is an indirect effect of neutrophil activation, and thus has problems in sensitivity, specificity, and reproducibility.
【0008】走化性因子の遊走活性測定はBoyden法(J.
Exp.Med.,115, 453-466, 1962)を基本にした改良法(Im
munology 10,409-416,1966, Am.J.Pathol.64,521-530,
1971,J. Immunol.Methods 46,251-258,1981, J.Clin.P
athol 35,182-185,1982)がそれぞれに検討され用いられ
てきた。しかし、これらの方法は標準化されておらず,
測定値が測定者に左右されやすく客観性を欠き精度に問
題があること、染色した遊走細胞を顕微鏡下でカウント
するため多大の労力を要することなどの欠点があり,こ
の方法で大量のサンプルを処理することは不可能であっ
た。[0008] The migration activity of chemotactic factors is measured by the Boyden method (J.
Exp.Med., 115, 453-466, 1962).
munology 10,409-416,1966, Am.J.Pathol.64,521-530,
1971, J. Immunol.Methods 46, 251-258, 1981, J. Clin. P
athol 35, 182-185, 1982) have been studied and used individually. However, these methods are not standardized,
There are drawbacks such as the fact that the measured value is easily influenced by the measurer, lacks objectivity and has a problem with accuracy, and requires a great deal of labor to count stained migrating cells under a microscope. It was impossible to process.
【0009】最近になり,Gallinら(J.Immunol.,110,2
33-240,1973)やKuriharaら(J.Pharm.Dyn.,7,747-754,19
84) はCr標識した好中球を用いてこれまで問題であった
Boyden法の欠点をカバーできるケモタキシス アッセイ
法を考案したが,この方法でも大量のサンプルをスクリ
ーニングできないこと,特別な研究設備が必要であるこ
と,ラジオアイソトープを使用することによる危険性が
存在すること,アイソトープラベルにより好中球の生存
率とその機能が低下するなどの問題点が残されている。Recently, Gallin et al. (J. Immunol., 110, 2)
33-240, 1973) and Kurihara et al. (J. Pharm. Dyn., 7, 747-754, 19
84) has previously been a problem with Cr-labeled neutrophils
We devised a chemotaxis assay that could cover the shortcomings of the Boyden method, but this method also did not allow for the screening of large numbers of samples, required special research equipment, and the dangers of using radioisotopes. Isotope labeling has problems such as a decrease in neutrophil viability and its function.
【0010】また,Watanabeら(Japan.J.Pharmacol.,3
9,102-104,1985, J.Pharmacol.Methods,22,13-18,198
9) は,マルチウエルタイプのボイデンチェンバーを考
案し,これを用いて多数のサンプルの好中球走化性を測
定できるシステムを開発した。この方法は比較的迅速で
簡便な利点がありスクリーニング アッセイには適して
いるが,上室と下室の細胞浮遊液とサンプル液を隔てる
メンブレンの固定には習熟した技術を必要とし,細胞数
を濁度の吸光度から測定するためコールターカウンター
による測定法より精度の点で問題が残されている。In addition, Watanabe et al. (Japan. J. Pharmacol., 3
9,102-104,1985, J.Pharmacol.Methods, 22,13-18,198
9) devised a multi-well type Boyden chamber and developed a system that can measure neutrophil chemotaxis of many samples using this. Although this method has the advantage of being relatively quick and convenient, it is suitable for screening assays, but requires a skilled technique to fix the membrane that separates the cell suspension from the upper and lower chambers from the sample solution, and requires a high cell count. Since it is measured from the turbidity absorbance, there remains a problem in terms of accuracy compared to the measurement method using a Coulter counter.
【0011】一方,IL−8により活性化された好中球
は脱顆粒を起こし,エラスターゼ,カテプシンG,ミエ
ロパーオキシダーゼ,βグルクロニダーゼ,コラゲナー
ゼ,Type IV ゼラチナーゼなどの酵素を放出したり,活
性酸素を放出することが知られている。遊離したライソ
ザイム酵素を測定する方法は,細胞をTryton X-100など
で破壊しなければ検出できず,再現性が良く精度の高い
測定は期待できない。また,IL−8の好中球活性化作
用は非常に弱く,単独では活性酸素の放出も少ないの
で,活性酸素量で測定するにはTNF やGM-CSFなどの強い
活性化因子との組み合わせが必要となり精度,感度,再
現性に優れた測定系にはなりにくい(Blood,Vol.78,No.
10,2708-2714,1991)。On the other hand, neutrophils activated by IL-8 cause degranulation, releasing enzymes such as elastase, cathepsin G, myeloperoxidase, β-glucuronidase, collagenase, and type IV gelatinase, and release active oxygen. It is known to release. The method of measuring the released lysozyme enzyme cannot be detected unless the cells are destroyed with Tryton X-100 or the like, and high reproducibility and high precision measurement cannot be expected. In addition, since the neutrophil activating effect of IL-8 is very weak and the release of active oxygen alone is small, a combination with a strong activating factor such as TNF or GM-CSF is required to measure the amount of active oxygen. It is necessary to provide a measurement system with excellent accuracy, sensitivity, and reproducibility (Blood, Vol. 78, No.
10,2708-2714,1991).
【0012】好中球の調製方法にはすでに確立されてい
るいくつかの方法がある。通常,多く用いられているの
は,ヒトあるいは動物の血液から比重分離液を用いて分
画精製する方法である。これはヘパリン加注射器を用い
て静脈あるいは心臓から採取した血液をデキストラン生
理食塩水とよく混和し,室温に30分から1 時間静置して
分離された血漿層(多核白血球,リンパ球,単球,血小
板を含む)を適切な比重に調製された比重分離液を用い
て好中球分画し,精製する方法である。このようにして
得られた好中球画分を用いる遊走試験では、幾つかの問
題点が指摘されている。それは入念な精製を繰り返して
も,赤血球などの混入が避けられず,高純度の好中球分
画を得るのには時間と労力を要すること、その結果好中
球収量も少なくなること,採血から精製までの時間と操
作が長いことは,好中球機能の低下を引き起こしやす
く、遊走能測定における再現性に影響を与えること、赤
血球などの混入は遊走試験に影響を与えること,大量調
製が難しくヒトや動物の個体差が大きいなどである。ま
た,ヒト血液を用いる場合には感染の危険性や定常的な
供給の難しさも考えられる。There are several established methods for preparing neutrophils. Usually, a method often used is to fractionate and purify from human or animal blood using a specific gravity separation solution. This is done by mixing blood collected from a vein or heart using a heparinized syringe with dextran saline and leaving it at room temperature for 30 minutes to 1 hour to separate the plasma layers (polynuclear leukocytes, lymphocytes, monocytes, This is a method of purifying neutrophils (including platelets) using a specific gravity separation solution adjusted to an appropriate specific gravity. In the migration test using the neutrophil fraction thus obtained, several problems have been pointed out. Even if elaborate purification is repeated, contamination of erythrocytes and the like is inevitable, and it takes time and effort to obtain a high-purity neutrophil fraction, resulting in lower neutrophil yield, blood sampling The long time and procedure from purification to purification tend to cause a decrease in neutrophil function, affecting the reproducibility of migratory ability measurement. Contamination of erythrocytes etc. affects the migration test. It is difficult and there are large individual differences between humans and animals. In addition, when human blood is used, there is a risk of infection and difficulty in regular supply.
【0013】また,より簡便な好中球の分離法として,
グリコーゲンやカゼインなどを動物の腹腔に接種し,腹
腔に滲出してきた好中球を用いる方法がある。この方法
は,動物種により接種する刺激剤の濃度と時間が異なる
が,適切な条件下では95% 以上の純度の好中球を得るこ
とができ,簡便に大量の好中球を集めることができる利
点がある。しかし,この方法は,刺激剤を用いることに
より正常の好中球に比べ機能が多少異なっている可能性
が考えられる。好中球走化性因子の遊走能活性測定に使
用できれば多くの利点が生ずる。As a simpler method for separating neutrophils,
There is a method in which glycogen or casein is inoculated into the abdominal cavity of an animal and neutrophils exuded into the abdominal cavity are used. In this method, the concentration and time of the stimulant to be inoculated vary depending on the animal species, but neutrophils with a purity of 95% or more can be obtained under appropriate conditions, and large amounts of neutrophils can be easily collected. There are advantages that can be done. However, the function of this method may be slightly different from that of normal neutrophils by using a stimulant. Numerous advantages result if they can be used to measure the migratory activity of neutrophil chemotactic factors.
【0014】さらに,骨髄から好中球を得る方法もあ
る。これは動物の大腿骨からシリンジを用いて骨髄液を
採取し,前述の比重分離液を用いて,血液からの精製と
同様に好中球分画を得る方法である。この方法も血液の
分画と同様操作の長い欠点があり,ルーチン的に用いる
には手間がかかり過ぎる上,実験毎に好中球の収率や機
能に差が生ずることなどが考えられ適切ではない。There is also a method for obtaining neutrophils from bone marrow. This is a method in which bone marrow fluid is collected from the femur of an animal using a syringe, and a neutrophil fraction is obtained using the above-described specific gravity separation solution in the same manner as in purification from blood. This method has the same long drawbacks as the blood fractionation, and is too time-consuming to use routinely. In addition, the yield and function of neutrophils may differ from experiment to experiment, so it is not appropriate. Absent.
【0015】通常,好中球走化性因子の好中球遊走活性
は血液の分画により得られた好中球を用いてケモタキシ
ス メンブレン上の遊走細胞を顕微鏡下でカウントする
方法で測定されている。この方法では,メンブレンの裏
測に遊走した細胞を二重染色法で染色しなければなら
ず,染色の不均一性による誤差が生じやすいことや細胞
がメンブレン上に均一に遊走しないことから,顕微鏡下
で測定する細胞数に客観性が少なくなるなど,精度や再
現性の点で問題が多い。動物の腹腔に刺激剤を接種し、
腹腔に大量の滲出した好中球を用いて遊走試験を行い遊
走細胞数をコールターカウンターなどの機器を用いて測
定できれば,より簡便に客観性のある遊走活性測定を行
うことができる。また刺激剤で活性化された腹腔滲出好
中球の走化性因子に対する反応性が正常な末梢血好中球
に比べ増強されているなら、大量サンプルの測定にも対
応できる優れた遊走活性測定法を構築できる可能性があ
る。Usually, the neutrophil migration activity of a neutrophil chemotactic factor is measured by using a neutrophil obtained by blood fractionation to count the number of migrating cells on a chemotaxis membrane under a microscope. I have. In this method, cells that migrated to the back of the membrane must be stained by the double staining method. Since errors due to uneven staining are likely to occur, and the cells do not migrate uniformly on the membrane, microscopy is required. There are many problems in terms of accuracy and reproducibility, such as less objectivity in the number of cells measured below. Inoculating the animal with the stimulant in the abdominal cavity,
If a migration test can be performed using a large amount of neutrophils exuding into the abdominal cavity and the number of migrated cells can be measured using a device such as a Coulter counter, an objective measurement of migration activity can be performed more easily. Also, if the reactivity of stimulant-activated peritoneal exudate neutrophils to chemotactic factors is enhanced compared to normal peripheral blood neutrophils, excellent migration activity measurement that can support the measurement of large samples A law could be built.
【0016】[0016]
【発明が解決しようとする課題】上記の通りこれまでの
遊走能測定法には問題があり、多数のサンプルを精度良
く評価できる標準化された方法がなく,簡便で感度,精
度,再現性に生物活性測定方法の確立が望まれている。As described above, the conventional methods for measuring migration ability have a problem, and there is no standardized method that can evaluate a large number of samples with high accuracy. It is desired to establish an activity measurement method.
【0017】[0017]
【課題を解決するための手段】上記の課題は,以下の本
発明により達成される。すなわち,上記課題に基づいて
鋭意研究を行った結果、好中球走化性因子の好中球遊走
活性を簡便に精度、再現性良く測定することに成功し、
本発明を完成するに至った。The above-mentioned object is achieved by the present invention described below. In other words, as a result of intensive studies based on the above-mentioned problems, we succeeded in simply measuring the neutrophil migration activity of neutrophil chemotactic factors with good accuracy and reproducibility,
The present invention has been completed.
【0018】即ち、本発明は以下の方法からなる好中球
走化性因子の好中球遊走活性測定方法である。刺激剤を
接種した動物の腹腔滲出好中球を用い、遊走用チェンバ
ーの上室から走化性因子を含む下室へ遊走落下した好中
球をコールターカウンター、血球数測定装置,吸光度測
定装置,テトラゾリウム塩((3−(4,5−ジメチル
チアゾル−2−イル)−2,5−ジフェニル テトラゾ
リウム ブロマイド、以下MTTという)による比色定
量法などにより定量することによる好中球走化性因子の
好中球遊走活性測定方法である。That is, the present invention is a method for measuring neutrophil migration activity of neutrophil chemotactic factor, comprising the following method. Using neutrophils exuded from the peritoneal cavity of the animal inoculated with the stimulant, neutrophils that had migrated and dropped from the upper chamber of the migration chamber to the lower chamber containing the chemotactic factor were analyzed using a Coulter counter, a blood cell counter, an absorbance analyzer, Neutrophil chemotaxis factor determined by colorimetry using a tetrazolium salt ((3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, hereinafter referred to as MTT)) Is a method for measuring neutrophil migration activity.
【0019】[0019]
【発明の実施の形態】本発明に使用される動物として
は、ウサギ、モルモット、ラットあるいはハムスターが
用いられるが、特にこれらに限定されるものではなく、
これらの動物の重量は,ウサギが1-3kg,モルモットが0.
2-1kg 、ラットが150ー250gおよびハムスターが80−150g
のものが好ましく用いられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION As animals used in the present invention, rabbits, guinea pigs, rats or hamsters are used, but are not particularly limited thereto.
These animals weigh 1-3 kg for rabbits and 0,0 for guinea pigs.
2-1kg, rat 150-250g and hamster 80-150g
Is preferably used.
【0020】これらの動物の好中球は以下の方法で調製
することができる。腹腔滲出好中球を採取するには、腹
腔への刺激剤の接種が必要である。刺激剤の濃度や好中
球の浸潤がピークに達する時間は、動物の種により異な
るので、滲出した細胞の90% 以上が好中球である条件下
で採取されなければならない。 刺激剤としてはグリコ
ーゲン、カゼイン、ポリペプトン、チオグリコレート培
地などが用いられる。好ましくはシェルフィシュ グリ
コーゲン(シグマ)あるいはオイスター グリコーゲン
(シグマ)をオートクレーブ滅菌して使用するのが望ま
しい。ウサギの場合にはグリコーゲンの溶解は生理食塩
水を用い、シェルフィシュ グリコーゲンでは最終濃度
0.15%,オイスター グリコーゲンでは0.1%の濃度で調製
し接種する。ウサギ以外の動物の場合には蒸留水に溶解
し、10% 濃度溶液として使用する。Neutrophils of these animals can be prepared by the following method. Collection of peritoneal exudate neutrophils requires inoculation of the peritoneal cavity with a stimulant. The concentration of stimulants and the time at which neutrophil infiltration peaks vary among animal species, and must be harvested under conditions where 90% or more of the exuded cells are neutrophils. Glycogen, casein, polypeptone, thioglycolate medium and the like are used as stimulants. Preferably, shellfish glycogen (Sigma) or Oyster glycogen (Sigma) is used after autoclaving. In rabbits, glycogen is dissolved using physiological saline, and in shellfish glycogen, the final concentration is
Prepare and inoculate at a concentration of 0.15% and 0.1% for oyster glycogen. For animals other than rabbits, dissolve in distilled water and use as a 10% concentration solution.
【0021】刺激剤は、例えば、ウサギには150ml,モル
モットには10ml-20ml 、ラット(200g前後)やマウス
(20-25g前後)ではそれぞれ5ml と2ml を腹腔内に接種
する。多核白血球の腹腔への浸潤のピークは、刺激剤接
種後、モルモット・ウサギで12-16 時間、マウス・ラッ
トで6 時間前後である。刺激後これら時間を経過するに
従い、単球やマクロファージが多くなり、好中球の純度
が低くなるので注意を要する。The stimulant is intraperitoneally inoculated with 150 ml for rabbits, 10 ml-20 ml for guinea pigs, and 5 ml and 2 ml for rats (about 200 g) and mice (about 20-25 g), respectively. The peak of infiltration of polynuclear leukocytes into the peritoneal cavity is around 12-16 hours in guinea pig rabbits and around 6 hours in mice and rats after stimulant inoculation. Care must be taken because as time elapses after stimulation, monocytes and macrophages increase and the purity of neutrophils decreases.
【0022】好中球の滲出の程度および遊走能には、雌
雄において著名な差は認められない。また、週令、系
統、飼育環境の異なる動物から得られた好中球の遊走能
機能にも明らかな差は認められないが、好ましくは5-10
週令のSPF(specific pathogenfree ) あるいはクリーン
飼育の動物が用いられる。There is no significant difference between males and females in the degree of neutrophil exudation and migration ability. In addition, there is no apparent difference in the migratory function of neutrophils obtained from animals of different ages, strains, and breeding environments, but preferably 5-10
Week-old SPF (specific pathogen free) or clean bred animals are used.
【0023】刺激剤接種後の腹腔滲出好中球を用いる利
点は、対照として行った以下に述べる全血あるいは末梢
血から分画精製して得られる好中球を用いる方法と比較
することにより明らかである。The advantage of using neutrophils exuded from the peritoneal cavity after inoculation of the stimulant is evident from the comparison with the following method using neutrophils obtained by fractionating and purifying from whole blood or peripheral blood as a control. It is.
【0024】ヒトや種々の動物の血液から好中球を分離
するには、例えば、免疫実験操作法(南江堂、635
頁、1995年)に記載された次の方法を用いることが
できるが、特に、これに限定されるものではない。ヒト
末梢血は腕静脈から、ウサギ、モルモット、ラット、マ
ウスなどの動物の血液は、心臓からヘパリンで湿したデ
ィスポーザブル注射器を用いて採取される。採取された
血液から多核白血球は、例えば次のように分画される。
ヘパリン加血液をHanks 液で2 倍に希釈し、このヘパリ
ン加希釈血液1容に対して、3%デキストラン生理食塩水
を1/4-1/5 容加えてよく混和した後、室温で30分間静置
すると多核白血球、リンパ球、単球、血小板を含む血漿
層と赤血球層とに分離される。上層の血漿層を分取し、
Ficoll-Hypaque液(ファルマシア)またはFicoll-Conra
y 液(IBL)に静かに重層し、400g,30 分間室温で遠心す
ると、好中球は沈渣として得られるので上清を取り除
く。沈渣中に混入する赤血球は、注射用蒸留水で低張処
理して溶血させ、PBS で等張に戻した後280g,10 分間,4
℃で遠心して好中球を集める。これを2-3 回Hanks 液
で洗浄し好中球分画として遊走試験に用いる。To separate neutrophils from the blood of humans and various animals, for example, an immunological experiment procedure (Nankodo, 635)
Page, 1995), but the method is not particularly limited thereto. Human peripheral blood is collected from the arm vein, and blood from animals such as rabbits, guinea pigs, rats and mice is collected from the heart using a disposable syringe moistened with heparin. Multinuclear leukocytes are fractionated from the collected blood, for example, as follows.
Heparinized blood was diluted 2-fold with Hanks' solution, and 1% of this heparinized blood was mixed with 1 / 4-1 / 5 volume of 3% dextran saline, mixed well, and then mixed at room temperature for 30 minutes. Upon standing, it is separated into a plasma layer containing polynuclear leukocytes, lymphocytes, monocytes, and platelets, and a red blood cell layer. Separate the upper plasma layer,
Ficoll-Hypaque solution (Pharmacia) or Ficoll-Conra
Gently overlay the solution (IBL) and centrifuge at 400 g for 30 minutes at room temperature. Neutrophils are obtained as a sediment, and the supernatant is removed. Erythrocytes mixed into the sediment are subjected to hypotonic treatment with distilled water for injection to lyse hemolysate, returned to isotonic with PBS, and then 280 g for 10 min.
Collect neutrophils by centrifugation at 0 ° C. Wash this 2-3 times with Hanks' solution and use it as a neutrophil fraction for the migration test.
【0025】本発明の好中球遊走試験は、上室と下室を
ポリカーボネートフィルターで仕切られたマルチウエル
タイプのボイデンチェンバーあるいは24穴プレートに
遊走用セル(ケモタキセル、クラボウなど)を乗せるい
ずれの方法でも良いが、遊走細胞の回収率の点から、好
ましくは、個々に分離された遊走用セルを用いる方法が
良い。遊走用メンブレンは、3 から8um のポアサイズの
ものが用いられるが、3um のメンブレンが好ましく用い
られる。In the neutrophil migration test of the present invention, the migration cell (chemotaxel, Kurabo, etc.) is placed on a multiwell type Boyden chamber or a 24-well plate in which the upper and lower chambers are separated by a polycarbonate filter. Although a method may be used, a method using individually separated migration cells is preferred from the viewpoint of the recovery rate of the migration cells. As the migration membrane, one having a pore size of 3 to 8 μm is used, and a 3 μm membrane is preferably used.
【0026】次に、好中球走化性因子の遊走活性測定法
の実際について説明する。遊走用メンブレンで仕切られ
た下室に段階希釈した走化性因子を一希釈につき2 ウエ
ルを用いて乗せ、さらに走化性因子を含まない対照とポ
ジテイブコントロールとして10-7M のfMLPをそれぞれ2
ウエルずつ乗せる。下室に入れるサンプルの液量は、上
室と下室を仕切るメンブレンが浸る量とする。Next, the actual method of measuring the migration activity of neutrophil chemotactic factors will be described. The serially diluted chemotactic factor was placed in the lower chamber partitioned by the migration membrane using 2 wells per dilution, and 10 -7 M fMLP was added to each of the control containing no chemotactic factor and the positive control for 2 times.
Put on each well. The liquid volume of the sample to be put in the lower chamber is an amount that the membrane that separates the upper and lower chambers is immersed.
【0027】好中球遊走試験には、通常の動物細胞の培
養用培地の他にPBS,Hanks 液などの塩類溶液も使用する
ことができる。また、これら培地や塩類溶液には必要に
応じて0.1%(w/v) ウシ血清アルブミン、10-20mMHEPES,
ペニシリンG(0.1mg/ml) などを含有させることもでき
る。ただし、いずれの場合も、培地や塩類溶液には、1-
2mMCaCl2 の添加が必須である。In the neutrophil migration test, a saline solution such as PBS or Hanks solution can be used in addition to a usual culture medium for animal cells. In addition, 0.1% (w / v) bovine serum albumin, 10-20 mM HEPES,
Penicillin G (0.1 mg / ml) and the like can also be contained. However, in each case, 1-
Addition of 2 mM CaCl 2 is essential.
【0028】遊走能測定用に腹腔から採取されたウサギ
やモルモットの好中球は、採取時に混入したゴミや組織
片を除くためにメッシュを通し、3-4 回遊走用培地ある
いは塩類溶液で洗浄してから測定に用いる。上室には2
x 106 個/mlの濃度に調製した細胞浮遊液を入れ、37
℃の炭酸ガスインキュベーター(約5%のCO2 濃度)内で
30分から60分遊走させる。遊走細胞数の最大値は30-40
分でプラトーに達し、それ以上時間が経過しても遊走細
胞数の増加は見られない。遊走時間が終了したら遊走用
メンブレンあるいは遊走用セルを取り除き、下室に遊走
落下した細胞数を計数する。Rabbit and guinea pig neutrophils collected from the abdominal cavity for migratory activity measurement are passed through a mesh to remove dust and tissue fragments mixed at the time of collection, and washed 3-4 times with a migration medium or a salt solution. Then use for measurement. 2 in upper room
Add the cell suspension prepared at a concentration of x10 6 cells / ml, and add
In a carbon dioxide gas incubator (about 5% CO 2 concentration)
Let go for 30 to 60 minutes. Maximum number of migrating cells is 30-40
A plateau is reached in minutes, and no increase in the number of migrating cells is observed even after a longer time. When the migration time is over, the migration membrane or the migration cells are removed, and the number of cells that have migrated and dropped into the lower chamber is counted.
【0029】下室に遊走した好中球を効率良く回収する
には,チェンバーやプレートへの好中球の接着を極力少
なくする必要がある。24穴プレートを用いる場合に
は,ポリスチレン製のものは好中球の接着が強く細胞の
回収に時間がかかるので、できればコラーゲンあるいは
ゼラチンコートしたプレートを使用するのが望ましい。
下室から回収された遊走細胞は,コールターカウンタ
ー,血球数測定装置,吸光度測定,テトラゾリウム塩
(MTT法)による比色定量法(J.Immunol.Method.65,
55-63,1983) などにより測定される。In order to efficiently collect neutrophils that have migrated to the lower chamber, it is necessary to minimize the adhesion of neutrophils to the chamber or plate. When a 24-well plate is used, a plate made of polystyrene is preferably coated with collagen or gelatin, if possible, since neutrophils are strongly adhered to the cells and it takes a long time to recover the cells.
The migrated cells recovered from the lower chamber are analyzed by a Coulter counter, a blood cell counter, an absorbance measurement, and a colorimetric method using a tetrazolium salt (MTT method) (J. Immunol. Method. 65,
55-63, 1983).
【0030】本発明により、例えばヒトIL−8の好中
球遊走活性はモルモット腹腔滲出好中球を用いてヒト好
中球を使用した場合と同等以上の感度(最大遊走活性濃
度6−12ng/ml)で再現性良く簡便に測定することができ
るが,本発明はヒトIL-8以外のすべての好中球走化性因
子の測定に適応することができる。例えばヒトIL-8サブ
ファミリー、ウサギIL-8/NAP-1, ラットGRO/CINC, マウ
スMIP-2,ウシIL-8,補体フラグメントC5a,ロイコトリエ
ンB4,fMLP なども本発明により測定できるが,これらに
限定されるものではない。According to the present invention, for example, the neutrophil migration activity of human IL-8 is equal to or higher than that of human neutrophils using guinea pig peritoneal exudate neutrophils (maximum migration activity concentration: 6-12 ng / m). The present invention can be applied to the measurement of all neutrophil chemotactic factors other than human IL-8. For example, human IL-8 subfamily, rabbit IL-8 / NAP-1, rat GRO / CINC, mouse MIP-2, bovine IL-8, complement fragment C5a, leukotriene B4, fMLP, etc. can be measured according to the present invention. It is not limited to these.
【0031】好中球遊走活性の測定に必要な標準品は,
純度の高い精製標品が用いられる。この標品は,ELISA
法,アミノ酸組成分析,吸光度測定などにより,正確な
IL-8蛋白量を測定し,遊走能の測定毎に毎回使用できる
ように分注し,−80 ℃のフリーザーで保管される。ヒ
トIL−8測定用標準品の単位はWHOの国際標準品
(1000単位/アンプル)の力価に補正し使用する。The standard required for measuring neutrophil migration activity is as follows:
A purified product with high purity is used. This sample is an ELISA
Method, amino acid composition analysis, absorbance measurement, etc.
The amount of IL-8 protein is measured, aliquoted so that it can be used each time the migration ability is measured, and stored in a freezer at -80 ° C. The unit of the human IL-8 measurement standard is corrected to the titer of the WHO international standard (1000 units / ampoule) before use.
【0032】本発明による好中球走化性因子の好中球遊
走活性の解析は次のように行われる。 (a)遊走細胞数として得られた各測定値からネガティ
ブコントロールの値(好中球走化性因子を含まない培地
あるいはバッファーのみの細胞数)を差し引く。 (b)n=2で2倍段階希釈したサンプルの各濃度の中で
最大遊走活性を示す測定値の平均値を100 とし,ネガテ
ィブコントロールの値を0 として各測定値の比率を計算
する。 (c)横軸を対数で走化性因子濃度,縦軸を(b)で求
めた最大遊走活性を示す濃度に対する比率をプロットす
る。 (d)プロットから正の相関が得られる回帰を行い,そ
の回帰式から遊走細胞数の比率が50に相当する濃度を求
め,ED50値とする。 (e)力価はED50値を与える希釈倍数の逆数として求め
られる。 (f)(e)で求められた値をWHOの国際標準品の力
価とすり合されたラボスタンダードの値で補正を行う。The neutrophil migration activity of the neutrophil chemotactic factor according to the present invention is analyzed as follows. (A) Subtract the value of the negative control (the number of cells in the medium or buffer alone containing no neutrophil chemotactic factor) from each measured value obtained as the number of migrated cells. (B) Calculate the ratio of the measured values showing the maximum migratory activity as 100 and the value of the negative control as 0 in each concentration of the sample which is two-fold serially diluted with n = 2. (C) The abscissa plots the concentration of the chemotactic factor in logarithm, and the ordinate plots the ratio to the concentration showing the maximum migration activity obtained in (b). From (d) plots performs regression positive correlation is obtained, the ratio from the regression equation number of migrated cells determine the concentration equivalent to 50, the ED 50 value. (E) titers are determined as the reciprocal of the dilution that gives the ED 50 values. (F) The value obtained in (e) is corrected with the value of the laboratory standard that has been reconciled with the titer of the WHO international standard product.
【0033】[0033]
【実施例】以下に本発明を実施例により更に詳しく説明
する。但し,本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
【0034】実施例1 各種動物の腹腔滲出好中球の調製:刺激剤として用いる
オイスター グリコーゲン(Sigma,G-8751) 溶液は,ウ
サギ用として0.2gを生理食塩水の200ml に溶解し,150m
l を腹腔に接種した。モルモット,ラット,マウス用に
は注射用蒸留水で10% 溶液を調製し,モルモットには10
-12ml,ラットには5ml,マウスには2ml をそれぞれ接種し
た。ウサギは2.0-2.5kg のニュージランド ホワイト種
の雌を固定後,50mlシリンジを用いて刺激剤を50mlずつ
3回に分け腹腔に接種した。モルモットは7 週令のHart
lay 種の雌に10mlの刺激剤を接種し,どちらも16時間後
に腹腔滲出好中球を採取した。ラットおよびマウスは,
刺激剤を接種した6 時間後に腹腔滲出液を採取した。腹
腔滲出液は0.02% ヘパリン(ノボ・ノルディスクA/S,10
00単位/ml)を添加したPBS の中に懸濁し,遠心後さらに
2回洗浄,遠心(1000rpm,5 分)を繰り返してから,組
織片などの固形物を除くために70umのメッシュを通し
た。遠心して集めた細胞を0.1%BSA および1mMCaCl2 を
添加したPBS で2 回洗浄遠心(1000rpm,5 分)して実験
に使用する好中球を調製した。Example 1 Preparation of peritoneal exudate neutrophils of various animals: Oyster glycogen (Sigma, G-8751) solution used as a stimulant was prepared by dissolving 0.2 g of rabbit solution in 200 ml of physiological saline and adding 150 m
l was inoculated intraperitoneally. For guinea pigs, rats and mice, prepare a 10% solution with distilled water for injection.
-12 ml, 5 ml for rats, and 2 ml for mice. Rabbits were fixed with 2.0-2.5 kg of New Zealand White females, and inoculated intraperitoneally with 50 ml of the stimulant in three 50 ml portions using a 50 ml syringe. Guinea pigs are 7 weeks old Hart
Lay females were inoculated with 10 ml of stimulant, and in both cases, peritoneal exudate neutrophils were collected 16 hours later. Rats and mice are
Six hours after inoculation with the stimulant, peritoneal exudate was collected. Peritoneal exudate was 0.02% heparin (Novo Nordisk A / S, 10
(00 units / ml), suspended in PBS, centrifuged, washed twice more, centrifuged (1000 rpm, 5 minutes), and then passed through a 70-um mesh to remove solids such as tissue fragments. . The cells collected by centrifugation were washed twice with PBS supplemented with 0.1% BSA and 1 mM CaCl 2 and centrifuged (1000 rpm, 5 minutes) to prepare neutrophils used in the experiment.
【0035】ウサギもモルモットも,この方法により,
一匹あたり1-5 x 108 個の細胞が得られ,ラット,マウ
スでは1-3 x 107 個を得ることができた。得られた細胞
の種類を明らかにするために,モルモット腹腔より採取
された細胞をサイトスピン(SHANDON,Cytospin 3) に乗
せ,650rpmで5 分遠心後濾紙を乾燥し,メイ・グリュン
ワルド染色液とギムザ染色液で細胞を染色し,細胞の種
類を同定した。その結果からこれら細胞の90% 以上が好
中球であることが確認できた。Both rabbits and guinea pigs can be
1-5 × 10 8 cells were obtained per animal, and 1-3 × 10 7 cells were obtained in rats and mice. To clarify the types of cells obtained, cells collected from the guinea pig peritoneum were placed on cytospin (SHANDON, Cytospin 3), centrifuged at 650 rpm for 5 minutes, and the filter paper was dried. Cells were stained with the staining solution to identify the type of cells. The results confirmed that 90% or more of these cells were neutrophils.
【0036】実施例2 ヒトおよび動物血液からの好中球の分画精製:ヒト血液
は腕静脈よりヘパリンで湿した50mlシリンジで40ml採血
し,50ml遠心管2 本に20mlずつ分注し,各遠心管にPBS
(Hanks 液)20mlと10% デキストラン液を3ml 加え,30
分間室温で静置した。好中球を含む上清を回収し,比重
が1.077に調整されたFicoll-Hypaque液(ファルマシ
ア)をいれた遠心管に等量重層し室温で1700rpm ,30分
間遠心した。好中球は沈渣として得られるので,上清を
除去し,混入している赤血球を溶血させるために蒸留水
を適量加え2 回ピペッティングし,ただちに0.1%BSA お
よび1mMCaCl2 を含むPBS を4-5 倍量加えて,遠心(100
0rpm,5 分)し上清を除去した。沈殿として得られた好
中球を上記PBS に懸濁しトリパンブルーで細胞数をカウ
ントし,遊走試験に用いた。ヒト血液40mlより,3 x 10
7 から1 x 108 個の好中球が得られた。Example 2 Purification of neutrophil fractionation from human and animal blood: Human blood was collected from the arm vein with a 50 ml syringe moistened with heparin (40 ml), and dispensed in 20 ml portions into two 50 ml centrifuge tubes. PBS in centrifuge tube
(Hanks solution) Add 20 ml and 3 ml of 10% dextran solution, and add 30 ml.
Let stand at room temperature for minutes. The supernatant containing neutrophils was collected, layered in equal volumes on a centrifuge tube containing Ficoll-Hypaque solution (Pharmacia) adjusted to a specific gravity of 1.077, and centrifuged at room temperature at 1700 rpm for 30 minutes. Neutrophils are obtained as sediment, so remove the supernatant, add an appropriate amount of distilled water to lyse the contaminating erythrocytes, pipette twice, and immediately add PBS containing 0.1% BSA and 1 mM CaCl 2 to PBS. Add 5 volumes and centrifuge (100
(0 rpm, 5 minutes) and the supernatant was removed. Neutrophils obtained as a precipitate were suspended in the above PBS, and the number of cells was counted using trypan blue, and used for a migration test. 3 x 10 from 40 ml of human blood
7 1 x 10 8 neutrophils were obtained.
【0037】ウサギやモルモットの血液は,心臓から全
採血した。ウサギは2.5kg,ニュージランド ホワイト種
を用い,モルモットは22週令のHartlay 種のいずれも雌
を使用した。好中球の分画は上述したヒト末梢血からの
分画方法と同様に行った。その結果、90% 以上を好中球
が占めているのが観察できた。Rabbit and guinea pig blood was collected entirely from the heart. Rabbits used 2.5 kg, New Zealand white breeds, and guinea pigs used females of all 22-week-old Hartlay breeds. Neutrophil fractionation was performed in the same manner as described above for fractionation from human peripheral blood. As a result, it was observed that neutrophils accounted for more than 90%.
【0038】実施例3 ラット骨髄好中球の分画精製:8週令のウイスター(13
0-150g) およびSD(170-190g) ラットの雌を用いて,
大腿骨から骨髄液を採取し,ここに含まれる好中球を分
画した。大腿骨の腔に2.5%ウシ胎児血清を添加したPBS
を23G の注射針を付けた5ml のシリンジで数回フラッシ
ュし,骨髄液を回収した。この時得られた細胞数は1大
腿骨あたり約2-5 x 107 個であった。これを1.077 の比
重分離液の上に等量重層し,1800rpで25分間室温で遠心
した。遠心管の底に沈殿した好中球画分に混入している
赤血球を実施例2と同じ方法で溶血させ,再度遠心して
好中球を精製した。この方法により約70%の純度の好
中球が得られた。Example 3 Fractionation and Purification of Rat Bone Marrow Neutrophils: 8-week-old Wistar (13
0-150g) and SD (170-190g) rats
Bone marrow fluid was collected from the femur and the neutrophils contained therein were fractionated. PBS with 2.5% fetal bovine serum in the femoral cavity
Was flushed several times with a 5 ml syringe equipped with a 23G injection needle, and bone marrow fluid was collected. The number of cells obtained at this time was about 2-5 × 10 7 per femur. This was overlaid on a 1.077 specific gravity separation solution in an equal volume and centrifuged at 1800 rp for 25 minutes at room temperature. Erythrocytes mixed in the neutrophil fraction precipitated at the bottom of the centrifuge tube were hemolyzed in the same manner as in Example 2, and centrifuged again to purify neutrophils. Neutrophils of about 70% purity were obtained by this method.
【0039】実施例4 遊走試験:遊走試験は24穴コラーゲンコート プレー
トに3um の穴を有したケモタキセル(クラボウ)を乗せ
て行った。サンプルを2倍段階希釈し,これを24穴プレ
ートの各ウエルに500ul ずつ入れ,この上にケモタキセ
ルを乗せた。セルの中に遊走用バッファー( PBS,0.1%BS
A,1mMCaCl2) で2 x 106 /ml に調製した好中球懸濁液を
200ul を接種し,40-60 分間5%炭酸ガスインキュベータ
ー(37 ℃) の中で遊走させた。遊走時間は一実験毎に
全て一定にした。遊走時間終了後24穴プレートの各ウエ
ルからケモタキセルを静かに抜き取り,ウエルに遊走落
下した細胞をコールターカウンターで測定した。Example 4 Migration test: The migration test was carried out by placing chemotaxel (Kurabo) having a hole of 3 μm on a 24-well collagen-coated plate. The sample was serially diluted two-fold, and 500 ul was added to each well of a 24-well plate, on which chemotaxel was placed. Migration buffer (PBS, 0.1% BS) in the cell
A, 1mMCaCl 2 ) with neutrophil suspension adjusted to 2 x 10 6 / ml.
200 ul was inoculated and allowed to migrate in a 5% CO2 incubator (37 ° C) for 40-60 minutes. The migration time was kept constant every experiment. After the migration time, the chemotaxel was gently removed from each well of the 24-well plate, and the cells migrated and dropped into the wells were measured using a Coulter counter.
【0040】実施例5 ヒトIL−8に対する各種動物の腹腔滲出好中球の反応
性の比較:モルモット(ハートレー種,10週令),マウ
ス(C3H,7 週令),ラット(SD,7 週令),ウサ
ギ(ニュージランド ホワイト種,12週令)のいずれも
雌を用いて実施例1に示した方法に従い好中球を調製し
た。これら細胞を用いて実施例4に示した方法に従い遊
走試験を行った。図1に示したように,0.1-100ng/mlの
ヒトIL−8に対し,モルモットおよびウサギ好中球は
遊走反応を示すが,マウスやラットの細胞は,これら濃
度のIL-8に対し遊走しなかった。中でもモルモット腹腔
滲出好中球はヒトIL−8に対し強い反応性が認められ
た。Example 5 Comparison of reactivity of peritoneal exudate neutrophils of various animals to human IL-8: Guinea pig (Hartley, 10 weeks old), mouse (C3H, 7 weeks old), rat (SD, 7 weeks old) ) And rabbits (New Zealand White, 12 weeks old) were used to prepare neutrophils according to the method described in Example 1 using females. Using these cells, a migration test was performed according to the method described in Example 4. As shown in FIG. 1, guinea pigs and rabbit neutrophils show a migration response to 0.1-100 ng / ml of human IL-8, whereas mouse and rat cells migrate to these concentrations of IL-8. Did not. Above all, guinea pig peritoneal exudate neutrophils showed strong reactivity with human IL-8.
【0041】実施例6 ヒトIL−8に対するモルモット心臓血由来好中球と腹
腔滲出好中球の反応性の比較:ハートレー種,22週令の
雌のモルモット4匹のうち,3匹を用い,心臓から全採
血し,実施例2で示した方法に従い,別々に好中球を調
製した。残り1匹には10% オイスターグリコーゲンを接
種し実施例1に示した方法に従い好中球を調製した。こ
れら好中球分画を用いて,実施例4に示した遊走試験を
行い,好中球の遊走能を調べた。図2および3に結果を
示した。これより心臓の血液から分画した好中球はヒト
IL−8を含まないバッファーへの遊走細胞数に対する
IL−8による最大遊走細胞数の倍率(ケモタキシス
インデックス)は,最大で5倍程度であるのに比べ,腹
腔滲出好中球の反応性は50倍以上であることが判る。Example 6 Comparison of reactivity between neutrophils derived from guinea pig heart blood and neutrophils exuding peritoneal cavity to human IL-8: Three out of four female guinea pigs of Hartley type, 22 weeks old, were used. Whole blood was collected from the heart, and neutrophils were separately prepared according to the method described in Example 2. The other one was inoculated with 10% oyster glycogen, and neutrophils were prepared according to the method described in Example 1. Using these neutrophil fractions, the migration test shown in Example 4 was performed to examine the migration ability of neutrophils. 2 and 3 show the results. Neutrophils fractionated from the blood of the heart were obtained by multiplying the maximum number of cells migrated by IL-8 to the number of cells migrated to a buffer containing no human IL-8 (chemotaxis).
It can be seen that the reactivity of neutrophils exuded from the abdominal cavity is 50 times or more, while the index is about 5 times at the maximum.
【0042】実施例7 ヒトIL−8に対するウサギ心臓血由来好中球と腹腔滲
出好中球の反応性の比較:2.5kg のニュージランド ホ
ワイト種の雌のウサギを用いて実施例2で示した方法に
従い,心臓から全採血し,好中球を分画した。一方,別
のウサギを用い,実施例1に示した方法により腹腔滲出
好中球を得た。全採血により一匹から2 x107 個の好中
球が分画され,腹腔滲出好中球は約2 x 108 個が得られ
た。これら好中球を用いて,実施例4に示した遊走試験
を行い,遊走能の比較を行った。図4および5に結果を
示したが,全血から分画して得られた好中球は,ヒトI
L−8に対し全く遊走反応を示さなかった。一方,腹腔
滲出好中球はIL−8を含まないバッファーへの非特異
的な遊走細胞数に対するIL−8による最大遊走細胞数
の比率が約10倍であった。ヒトIL−8に対し腹腔滲
出好中球は高い反応性を示すことがウサギでも確認され
た。Example 7 Comparison of the reactivity of neutrophils derived from rabbit heart blood and neutrophils exuded to the peritoneal cavity to human IL-8: 2.5 kg of New Zealand White female rabbits using the method described in Example 2 According to the above, whole blood was collected from the heart and neutrophils were fractionated. On the other hand, peritoneal exudate neutrophils were obtained by the method shown in Example 1 using another rabbit. From the whole blood, 2 x 10 7 neutrophils were fractionated from one animal, and about 2 x 10 8 neutrophils were exuded from the peritoneal cavity. Using these neutrophils, the migration test shown in Example 4 was performed, and the migration ability was compared. The results are shown in FIGS. 4 and 5, where neutrophils obtained by fractionation from whole blood were
It did not show any migration reaction to L-8. On the other hand, in the peritoneal exudate neutrophils, the ratio of the maximum number of migrated cells by IL-8 to the number of non-specific migrated cells to the buffer containing no IL-8 was about 10 times. It was also confirmed in rabbits that peritoneal exudate neutrophils showed high reactivity to human IL-8.
【0043】実施例8 ヒトIL−8に対するラット骨髄好中球と腹腔滲出好中
球の反応性の比較:ラット骨髄好中球は8 週令のSDお
よびWisterラットの雌各2匹を用い,大腿骨から実施例
3に示した方法に従って調製し,1-1.5 x 107 個の好中
球を得た。腹腔滲出好中球は10% オイスターグリコーゲ
ン5ml を腹腔に接種してから6 時間後に採取した。これ
ら好中球を用いて遊走試験を行い,図6〜9の結果を得
た。図6および7は骨髄好中球に対するヒトIL−8の
遊走活性をラットIL−8(CINC)を対照に調べた
結果であるが、WisterおよびSDラットのいずれもヒト
IL−8による遊走反応の感度は低く,最大遊走活性濃
度は,モルモット腹腔滲出好中球の50倍以上必要である
ことが示された。図8および9はより高濃度のヒトIL
−8を用いて,腹腔滲出好中球の反応性を見た結果であ
るが,WisterおよびSDのいずれのラットも5ug/mlでモ
ルモットと同等の最大遊走反応が認められたが,これは
モルモット好中球に対する最大遊走濃度の500 倍に当た
る。これらの結果から,好中球の由来やラットの種に関
係なく,ヒトIL−8はラット好中球に対し遊走活性は
著しく低いことが判明した。Example 8 Comparison of reactivity between rat bone marrow neutrophils and peritoneal exudate neutrophils to human IL-8: Rat bone marrow neutrophils were used for each of 8 female SD and Wister rats. It was prepared from the femur according to the method described in Example 3 to obtain 1-1.5 × 10 7 neutrophils. Peritoneal exudate neutrophils were collected 6 hours after intraperitoneal inoculation with 5 ml of 10% oyster glycogen. A migration test was performed using these neutrophils, and the results shown in FIGS. FIGS. 6 and 7 show the results of examining the migration activity of human IL-8 on bone marrow neutrophils using rat IL-8 (CINC) as a control. The sensitivity was low, indicating that the maximum concentration of migratory activity was required to be at least 50 times that of guinea pig peritoneal exudate neutrophils. 8 and 9 show higher concentrations of human IL.
The results of examining the reactivity of peritoneal exudate neutrophils using -8 showed that both Wister and SD rats had a maximum migration response equivalent to that of guinea pigs at 5 ug / ml. This is 500 times the maximum migration concentration for neutrophils. These results indicate that human IL-8 has a remarkably low migration activity on rat neutrophils irrespective of the origin of neutrophils and the species of rat.
【0044】実施例9 ヒトIL−8に対するヒト末梢血好中球とモルモット腹
腔滲出好中球の遊走反応の比較: ヒト末梢血好中球は
実施例2に述べた方法に従い分画精製した。この方法に
より40mlの血液から2-4 x 107 個の好中球を得た。モル
モットは9 週令,雌のハートレー種を用い,オイスター
グリコーゲン接種後16時間で腹腔滲出液を採取し,実施
例1に従い好中球を得た。これら好中球の遊走試験を実
施例4に述べたように行い,ヒトIL−8に対する反応
性を比較した。図10の結果は異なったヒトの血液から
分画した好中球の遊走能を調べたものである。図11は
別の人から得た好中球とモルモット腹腔滲出好中球の遊
走能を比較したものである。これらの結果から,ヒトI
L−8に対するヒト末梢血好中球の反応性には個人差が
大きいこと,モルモット腹腔滲出好中球の感度はヒト末
梢血好中球と同等あるいはそれ以上であることが判明し
た。Example 9 Comparison of migration reaction between human peripheral blood neutrophils and guinea pig peritoneal exudate neutrophils against human IL-8: Human peripheral blood neutrophils were fractionated and purified according to the method described in Example 2. In this way, 2-4 × 10 7 neutrophils were obtained from 40 ml of blood. Guinea pigs were 9-week-old female Hartley breeds. Peritoneal exudate was collected 16 hours after inoculation with oyster glycogen, and neutrophils were obtained according to Example 1. The migration test of these neutrophils was performed as described in Example 4, and the reactivity to human IL-8 was compared. The results in FIG. 10 were obtained by examining the migration ability of neutrophils fractionated from different human blood. FIG. 11 compares the migration ability of neutrophils obtained from another person with guinea pig peritoneal exudate neutrophils. From these results, human I
It was found that the reactivity of human peripheral blood neutrophils to L-8 varied greatly between individuals, and that the sensitivity of guinea pig peritoneal exudate neutrophils was equal to or higher than that of human peripheral blood neutrophils.
【0045】実施例10 各種ヒトケモカインに対するモルモット腹腔滲出好中球
の反応性:モルモット腹腔滲出好中球の各種ヒトケモカ
インに対する反応性を調べ図12に示した。これよりモ
ルモット腹腔滲出好中球はIL−8以外に好中球遊走活
性をもつ他のヒトケモカインに対しても濃度依存的に反
応することが明かになった。Example 10 Reactivity of Guinea Pig Peritoneal Exudate Neutrophils to Various Human Chemokines: The reactivity of guinea pig peritoneal exudate neutrophils to various human chemokines was investigated and is shown in FIG. This revealed that guinea pig peritoneal exudate neutrophils also reacted in a concentration-dependent manner with other human chemokines having neutrophil migration activity other than IL-8.
【0046】実施例11 遊走細胞数測定におけるボイデン チェンバー法との比
較:ヒトIL−8に高い感受性を示すモルモット腹腔滲
出好中球を用いて,本発明に用いた遊走細胞の測定法
を,従来のケモタキシス メンブレンに遊走付着した細
胞をカウントする方法と比較した。ボイデン チェンバ
ーは48ウエルのものを使用し,メンブレンは,3um の
穴を有したポリカーボネート フィルター(Neuro Prob
e Inc.,25 x 80mm) を用いた。下室に3 倍段階希釈した
ヒトIL−8とバッファーのみのコントロールを30ulず
つ入れ,上室には2 x 106 /mlに調製したモルモット好
中球液を各ウエルに50ulずつ入れた。このチェンバーを
5%炭酸ガスインキュベーターに入れ,40分間37 ℃で遊
走させた。遊走時間終了後メンブレンフィルターを外
し,上室側の細胞を擦り取り,遊走細胞をアルコール固
定後,ディフクィック染色液(国際試薬)で染色し,風
乾して遊走細胞を顕微鏡下(x400) でカウントした。結
果を図13に示したが,この方法では最大遊走活性濃度
の判定は可能だが,明確な濃度依存性カーブを描くこと
は困難であった。一方,実施例4に示した方法では,図
14〜16に示したように,1ng/ml以下の低濃度のIL
−8に対しても直線性に優れた濃度依存的なカーブを書
くことが可能であることが判明した。Example 11 Comparison with the Boyden Chamber Method in Measuring the Number of Migrating Cells: The method for measuring the number of migrating cells used in the present invention using guinea pig peritoneal exudate neutrophils having high sensitivity to human IL-8 was compared with the conventional method. Was compared with a method of counting the number of cells that had migrated and adhered to the Chemotaxis membrane. The Boyden chamber used was 48 wells, and the membrane was a polycarbonate filter (Neuro Prob) with 3 um holes.
e Inc., 25 x 80 mm). The lower chamber was filled with 30 ul of a three-fold serially diluted human IL-8 and a buffer-only control, and the upper chamber was filled with 50 ul of a guinea pig neutrophil solution adjusted to 2 × 10 6 / ml in each well. This chamber
The cells were placed in a 5% carbon dioxide incubator and allowed to migrate for 40 minutes at 37 ° C. After the migration time, remove the membrane filter, scrape the cells in the upper chamber, fix the migrated cells with alcohol, stain with Diffick stain (International reagent), air-dry, and count the migrated cells under a microscope (x400). did. The results are shown in FIG. 13. Although it was possible to determine the maximum migration activity concentration by this method, it was difficult to draw a clear concentration-dependent curve. On the other hand, in the method shown in Example 4, as shown in FIGS.
It has been found that it is possible to draw a concentration-dependent curve excellent in linearity even for −8.
【0047】実施例12 最大遊走活性を与える遊走時間の検討:モルモット腹腔
滲出好中球を用いて実施例4に示した遊走試験の遊走時
間をそれぞれ30,60,90分に分けて遊走細胞数の変化を調
べた。結果は図17に示した。これより好中球の遊走
は,遊走開始後ほぼ30分でプラトーに達し,90分以上
ではほとんど遊走細胞数に変化が見られないことが明ら
かになった。 実施例13 遊走活性の日差再現性:本発明によるモルモット腹腔滲
出好中球を用いた遊走試験法を用いて,ELISA法,吸光
度測定,アミノ酸組成分析から蛋白量として1ug/mlと測
定されたヒトIL−8の遊走活性を測定日を変えて測定
した結果を表1に示した。活性単位は最大遊走活性を示
す測定値の平均値を100%とし,バッファーのみのネガテ
ィブコントロールの値を0 として,50% の遊走細胞数を
与えるIL−8濃度(ED50) の希釈倍数の逆数を単位数
として示した。図18に示すように横軸に対数でIL−
8濃度をとり,縦軸には最大遊走細胞数(ネガティブコ
ントロールの細胞数を差し引く)を100 として,これに
対し,直線性の良い4−5点のIL−8濃度における遊
走細胞数の比率をプロットして,回帰式を得,ED50値を
算出した。Example 12 Examination of the migration time giving the maximum migration activity: The migration time in the migration test shown in Example 4 using guinea pig peritoneal exudate neutrophils was divided into 30, 60 and 90 minutes, respectively, to determine the number of migrated cells. Was examined for changes. The results are shown in FIG. From this, it was found that neutrophil migration reached a plateau almost 30 minutes after the start of migration, and that the number of migrated cells hardly changed after 90 minutes. Example 13 Daily reproducibility of migratory activity: Using a migration test method using guinea pig peritoneal exudate neutrophils according to the present invention, the protein amount was determined to be 1 ug / ml by ELISA, absorbance measurement, and amino acid composition analysis. Table 1 shows the results of measuring the migration activity of human IL-8 on different measurement dates. The activity unit is the reciprocal of the dilution factor of the IL-8 concentration (ED 50 ) that gives 50% of the number of migrated cells, with the average of the measured values showing the maximum migration activity as 100% and the value of the buffer-only negative control as 0. Is shown as the number of units. As shown in FIG. 18, the abscissa represents the logarithm of IL-
The maximum number of migrating cells (subtracting the number of negative control cells) was taken as 100 on the vertical axis, and the ratio of the number of migrating cells at the IL-8 concentration of 4 to 5 points with good linearity was calculated. After plotting, a regression equation was obtained and the ED 50 value was calculated.
【0048】[0048]
【表1】 実施例14 遊走活性とELISA法との相関:本発明によるモルモ
ット腹腔滲出好中球を用いた37回の遊走試験の結果と
ELISA 法で測定した結果との相関を調べ,図19に示し
た。横軸にはELISA 法で測定したIL-8濃度を対数でと
り,縦軸には遊走試験で得られた活性単位を対数でとり
測定値をプロットした。両者の間には優れた相関がある
ことが理解できる。[Table 1] Example 14 Correlation between migratory activity and ELISA method: Results of 37 migration tests using guinea pig peritoneal exudate neutrophils according to the present invention
The correlation with the result measured by the ELISA method was examined and shown in FIG. The abscissa plots the logarithm of the IL-8 concentration measured by the ELISA method, and the ordinate plots the logarithm of the activity unit obtained in the migration test. It can be seen that there is an excellent correlation between the two.
【0049】実施例15 好中球遊走能に及ぼす好中球文画処理の影響:実施例6
および7で示した腹腔滲出好中球と末梢好中球のIL−
8に対する反応性の違いが、血液から好中球を分画する
操作によるのではないことを明らかにするために、腹腔
滲出好中球を末梢血の分画と同じ処理を行い、遊走能を
調べた。9週令のモルモット4匹を準備し、3匹から実
施例2に従い好中球を調整した。残り1匹は、実施例1
に従い好中球を採取し、その半量(2x108 個)につ
いて実施例2の末梢血分と同じ操作を行った。これらの
好中球を用いてヒトIL−8に対する遊走試験を行い、
その結果を図20に示した。これより腹腔滲出好中球と
末梢血好中球の反応性の違いが好中球調整操作の違いに
夜のでないことが確認された。Example 15 Influence of Neutrophil Drawing Processing on Neutrophil Migration Ability: Example 6
Peritoneal exudate neutrophils and peripheral neutrophils IL-
In order to clarify that the difference in the reactivity to neutrophils was not due to the operation of fractionating neutrophils from blood, peritoneal exudate neutrophils were treated in the same manner as in the fractionation of peripheral blood, and migratory ability was evaluated. Examined. Four 9-week-old guinea pigs were prepared, and neutrophils were prepared from the three guinea pigs according to Example 2. The remaining one is from Example 1.
Neutrophils were collected according to the procedure described above, and the same operation as that of the peripheral blood component of Example 2 was performed for half of the neutrophils (2 × 10 8 ). Using these neutrophils, a migration test on human IL-8 was performed,
The result is shown in FIG. From this, it was confirmed that the difference in reactivity between neutrophils exuding abdominal cavity and neutrophils in the peripheral blood was not due to the difference in neutrophil adjustment operation at night.
【0050】[0050]
【発明の効果】本発明により、好中球走化性因子の遊走
活性を簡便に精度、再現性良く測定することができた。Industrial Applicability According to the present invention, the migration activity of neutrophil chemotactic factor can be easily measured with high accuracy and reproducibility.
【図1】ヒトIL−8に対する各種動物の腹腔滲出好中
球の遊走反応を調べた結果を示す。FIG. 1 shows the results of examining the migration response of peritoneal exudate neutrophils of various animals to human IL-8.
【図2】ヒトIL−8に対するモルモット腹腔滲出好中
球の遊走反応の結果を示す。FIG. 2 shows the results of the migration reaction of guinea pig peritoneal exudate neutrophils to human IL-8.
【図3】ヒトIL−8に対するモルモット心臓血好中球
の遊走反応の結果を示す。FIG. 3 shows the results of chemotactic response of guinea pig cardiac neutrophils to human IL-8.
【図4】ヒトIL−8に対するウサギ腹腔滲出好中球の
遊走反応の結果を示す。FIG. 4 shows the results of a migration reaction of rabbit peritoneal exudate neutrophils to human IL-8.
【図5】ヒトIL−8に対するウサギ心臓血好中球の遊
走反応の結果を示す。FIG. 5 shows the results of a migration reaction of rabbit heart blood neutrophils to human IL-8.
【図6】ヒトIL−8に対するWisterラット骨髄好中球
の遊走反応の結果を示す。FIG. 6 shows the results of a migration reaction of Wister rat bone marrow neutrophils to human IL-8.
【図7】ヒトIL−8に対するSDラット骨髄好中球の
遊走反応の結果を示す。FIG. 7 shows the results of a migration reaction of SD rat bone marrow neutrophils to human IL-8.
【図8】ヒトIL−8に対するWisterラット腹腔滲出好
中球の遊走反応の結果を示す。FIG. 8 shows the results of the migration reaction of Wister rat peritoneal exudate neutrophils to human IL-8.
【図9】ヒトIL−8に対するSDラット腹腔滲出好中
球の遊走反応の結果を示す。FIG. 9 shows the results of a migration reaction of SD rat peritoneal exudate neutrophils to human IL-8.
【図10】ヒトIL−8に対するヒト末梢血好中球の遊
走反応の結果を示す。FIG. 10 shows the results of a migration reaction of human peripheral blood neutrophils to human IL-8.
【図11】ヒトIL−8に対するモルモット腹腔滲出好
中球とヒト末梢血好中球の遊走反応の比較を行った結果
を示す。FIG. 11 shows the results of a comparison of the migration reaction between guinea pig peritoneal exudate neutrophils and human peripheral blood neutrophils against human IL-8.
【図12】各種ヒトケモカインに対するモルモット腹腔
滲出好中球の反応性を調べた結果を示す。FIG. 12 shows the results of examining the reactivity of guinea pig peritoneal exudate neutrophils to various human chemokines.
【図13】ボイデン チェンバーを用いた従来法におけ
るヒトIL−8に対するモルモット腹腔滲出好中球の遊
走反応の結果を示す。FIG. 13 shows the results of a migration reaction of guinea pig peritoneal exudate neutrophils to human IL-8 in a conventional method using a Boyden chamber.
【図14】ヒトIL−8のモルモット腹腔滲出好中球の
遊走活性に対する濃度依存性を示す(0.01-50ng/mlの対
数プロット)。FIG. 14 shows the concentration dependence of human IL-8 on migratory activity of guinea pig peritoneal exudate neutrophils (log plot of 0.01-50 ng / ml).
【図15】ヒトIL−8のモルモット腹腔滲出好中球の
遊走活性に対する濃度依存性を示す(0-0.8ng/ml) 。FIG. 15 shows the concentration dependency of human IL-8 on the migration activity of guinea pig peritoneal exudate neutrophils (0-0.8 ng / ml).
【図16】ヒトIL−8のモルモット腹腔滲出好中球の
遊走活性に対する濃度依存性を示す(0-12.5ng/ml)。FIG. 16 shows the concentration dependency of human IL-8 on the migration activity of guinea pig peritoneal exudate neutrophils (0 to 12.5 ng / ml).
【図17】最大遊走活性を与える遊走時間の検討結果を
示す。FIG. 17 shows the results of examining the migration time that gives the maximum migration activity.
【図18】モルモット腹腔滲出好中球を用いたヒトIL
−8の遊走活性測定値とヒトIL−8濃度との相関を示
す。FIG. 18. Human IL using guinea pig peritoneal exudate neutrophils
The correlation between the measured value of the migration activity of -8 and the concentration of human IL-8 is shown.
【図19】モルモット腹腔滲出好中球を用いたヒトIL
−8の遊走活性測定値とELISA 法による測定値との相関
を示す。FIG. 19: Human IL using guinea pig peritoneal exudate neutrophils
The correlation between the measured value of the migration activity of -8 and the value measured by the ELISA method is shown.
【図20】モルモット腹腔滲出好中球の遊走機能が末梢
血分画好中球より高いのは、分画処理の影響によるので
ないことを示す。FIG. 20 shows that the migratory function of guinea pig peritoneal exudate neutrophils is higher than that of peripheral blood fractionated neutrophils, not due to the effect of fractionation treatment.
Claims (8)
用いることを特徴とする好中球走化性因子の測定方法。1. A method for measuring a neutrophil chemotactic factor, comprising using neutrophils exuded from the peritoneal cavity of an animal inoculated with a stimulant.
プトン,チオグリコレート培地である請求項1記載の好
中球走化性因子の遊走活性測定方法。2. The method according to claim 1, wherein the stimulant is a glycogen, casein, polypeptone or thioglycolate medium.
はハムスターである請求項1記載の好中球走化性因子の
測定方法。3. The method for measuring a neutrophil chemotactic factor according to claim 1, wherein the animal is a guinea pig, rabbit, rat or hamster.
1記載の好中球走化性因子の測定方法。4. The method for measuring a neutrophil chemotactic factor according to claim 1, wherein the neutrophil chemotactic factor is derived from a human.
ブファミリー(CXCケモカイン)およびMCAFサブ
ファミリー(CCケモカイン)である請求項1記載の好
中球走化性因子の遊走活性測定方法。5. The method according to claim 1, wherein the neutrophil chemotactic factors are the interleukin 8 subfamily (CXC chemokine) and the MCAF subfamily (CC chemokine).
fMLP、ロイコトリエンB4、活性化補体第5成分
(C5a)およびTNF−αでる請求項1記載の好中球
走化性因子の測定方法。6. The neutrophil chemotactic factor is interleukin 8,
The method for measuring a neutrophil chemotactic factor according to claim 1, which is fMLP, leukotriene B4, activated complement fifth component (C5a) and TNF-α.
子を含む下室へ遊走落下した好中球をカウントすること
を特徴とする請求項1記載の好中球走化性因子の遊走活
性測定方法。7. The neutrophil chemotactic factor according to claim 1, wherein neutrophils that have migrated and fallen from the upper chamber of the migration chamber to the lower chamber containing the neutrophil chemotactic factor are counted. Migration activity measurement method.
測定装置,吸光度測定装置,テトラゾリウム塩による比
色定量法で計数することを特徴とする請求項1記載の好
中球走化性因子の測定方法。8. The neutrophil chemotactic factor according to claim 1, wherein the neutrophil count is counted by a colorimetric method using a Coulter counter, a blood cell count measuring device, an absorbance measuring device, and a tetrazolium salt. Measuring method.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9345018A JPH10227792A (en) | 1996-12-13 | 1997-12-15 | Measuring method for neutrophil chemotactic factor |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8-334119 | 1996-12-13 | ||
JP33411996 | 1996-12-13 | ||
JP9345018A JPH10227792A (en) | 1996-12-13 | 1997-12-15 | Measuring method for neutrophil chemotactic factor |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10227792A true JPH10227792A (en) | 1998-08-25 |
Family
ID=26574736
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9345018A Pending JPH10227792A (en) | 1996-12-13 | 1997-12-15 | Measuring method for neutrophil chemotactic factor |
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JP (1) | JPH10227792A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20230228735A1 (en) * | 2020-09-23 | 2023-07-20 | Suzhou Municipal Hospital | Method for detecting chemotaxis of neutrophil |
-
1997
- 1997-12-15 JP JP9345018A patent/JPH10227792A/en active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20230228735A1 (en) * | 2020-09-23 | 2023-07-20 | Suzhou Municipal Hospital | Method for detecting chemotaxis of neutrophil |
US11774440B2 (en) * | 2020-09-23 | 2023-10-03 | Suzhou Municipal Hospital | Method for detecting chemotaxis of neutrophil |
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