JPH10174591A - 可溶性組換えαｖβ３付着受容体 - Google Patents
可溶性組換えαｖβ３付着受容体Info
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- JPH10174591A JPH10174591A JP9338883A JP33888397A JPH10174591A JP H10174591 A JPH10174591 A JP H10174591A JP 9338883 A JP9338883 A JP 9338883A JP 33888397 A JP33888397 A JP 33888397A JP H10174591 A JPH10174591 A JP H10174591A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70546—Integrin superfamily
- C07K14/70557—Integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 リガンド結合活性が損なわれていない、本質
的に精製された可溶性のαvβ3付着受容体を提供するこ
とにある。 【解決手段】 完全鎖長の、あるいは膜透過ドメインま
たは、膜透過ドメイン及び細胞質ドメインを含む末端部
分を欠失させたαvβ3付着受容体をコードする遺伝子を
バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて発現させ、
完全鎖長のものの場合には細胞膜から界面活性剤を用い
て目的とする組換え遺伝子産物を分離、精製し、末端欠
失型のものについては培養液中から分離、精製する。
的に精製された可溶性のαvβ3付着受容体を提供するこ
とにある。 【解決手段】 完全鎖長の、あるいは膜透過ドメインま
たは、膜透過ドメイン及び細胞質ドメインを含む末端部
分を欠失させたαvβ3付着受容体をコードする遺伝子を
バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて発現させ、
完全鎖長のものの場合には細胞膜から界面活性剤を用い
て目的とする組換え遺伝子産物を分離、精製し、末端欠
失型のものについては培養液中から分離、精製する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リガンド結合活性
が損なわれていない、新規の精製組換えαvβ3付着受容
体（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、およびバ
キュロウイルス−昆虫細胞発現系を使用した組換え技術
により可溶性の非膜結合型付着受容体を、優れた収率で
生産することのできる方法に関する。このように作製さ
れた可溶性受容体は、天然のαvβ3付着受容体を阻害す
ることができる新しい治療薬のスクリーニングにも容易
に適用できるものである。さらに、本発明は宿主細胞の
表面膜に結合している受容体を界面活性剤を使用して溶
解させることにより、完全鎖長の組換えαvβ3付着受容
体を優れた収量で生産できる方法に関する。
が損なわれていない、新規の精製組換えαvβ3付着受容
体（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、およびバ
キュロウイルス−昆虫細胞発現系を使用した組換え技術
により可溶性の非膜結合型付着受容体を、優れた収率で
生産することのできる方法に関する。このように作製さ
れた可溶性受容体は、天然のαvβ3付着受容体を阻害す
ることができる新しい治療薬のスクリーニングにも容易
に適用できるものである。さらに、本発明は宿主細胞の
表面膜に結合している受容体を界面活性剤を使用して溶
解させることにより、完全鎖長の組換えαvβ3付着受容
体を優れた収量で生産できる方法に関する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】インテグリン（ｉｎｔ
ｅｇｒｉｎ）は、付着受容体のスーパファミリーであ
り、これは、細胞外に固体状の環境を有する細胞の、細
胞外マトリックス（ＥＣＭ）への付着、及び他の細胞へ
の付着の両方を制御しているものである。付着あるいは
癒着は、細胞にとって基本的に重要なものであり、固定
と移動のためのきっかけを、あるいは成長と分化のため
のシグナルを与えるものである。インテグリンは、細胞
付着、血餅形成のための移動、炎症、胚形成、癌の増殖
と転移のような多くの正常または病理的事象に直接に関
与しており、根本的な治療手段におけるターゲットとな
るものである。
ｅｇｒｉｎ）は、付着受容体のスーパファミリーであ
り、これは、細胞外に固体状の環境を有する細胞の、細
胞外マトリックス（ＥＣＭ）への付着、及び他の細胞へ
の付着の両方を制御しているものである。付着あるいは
癒着は、細胞にとって基本的に重要なものであり、固定
と移動のためのきっかけを、あるいは成長と分化のため
のシグナルを与えるものである。インテグリンは、細胞
付着、血餅形成のための移動、炎症、胚形成、癌の増殖
と転移のような多くの正常または病理的事象に直接に関
与しており、根本的な治療手段におけるターゲットとな
るものである。
【０００３】インテグリンは、非共有結合のα及びβサ
ブユニットから成り、必須のヘテロ二量体膜通過タンパ
ク質である。インテグリンは、β１、β２、β３、αv
鎖の４つの、部分的に重複したインテグリン・サブファ
ミリーに分類され、ある特定の細胞は各サブファミリー
とは別の種類のインテグリンを発現する。最近の１０年
間において、研究者から、インテグリンは細胞付着に関
与している主要の受容体であり、治療手段における好適
なターゲットとしてなり得ることが示されてきた。イン
テグリンに関する報告としては、例えばE.Ruoulahti(J.
Clin. Invest.1991, 87)やR.O.Hynes(Cell, 1992, 69)
がある。
ブユニットから成り、必須のヘテロ二量体膜通過タンパ
ク質である。インテグリンは、β１、β２、β３、αv
鎖の４つの、部分的に重複したインテグリン・サブファ
ミリーに分類され、ある特定の細胞は各サブファミリー
とは別の種類のインテグリンを発現する。最近の１０年
間において、研究者から、インテグリンは細胞付着に関
与している主要の受容体であり、治療手段における好適
なターゲットとしてなり得ることが示されてきた。イン
テグリンに関する報告としては、例えばE.Ruoulahti(J.
Clin. Invest.1991, 87)やR.O.Hynes(Cell, 1992, 69)
がある。
【０００４】αv系列のインテグリンは主要なサブファ
ミリーであると見られているもので、従来から指摘され
てきた機能と最近に見いだされた新しい機能を有する。
例えば、メラノーマ細胞株では、腫瘍発生と転移とに関
連したαv系インテグリンの発現の増加(Felding-Haberm
ann et al. 1992,J.Clin. Invest. 89, 2018, Marshall
et al. 1991, Int. J. Cancer49, 924)によって、癌細
胞の転移過程にαv系のインテグリンが関与しているこ
とが示唆された。癌細胞の付着、拡大、特に、最も典型
的な上皮悪性腫瘍である結腸直腸癌についてインテグリ
ンの関与が議論されている。
ミリーであると見られているもので、従来から指摘され
てきた機能と最近に見いだされた新しい機能を有する。
例えば、メラノーマ細胞株では、腫瘍発生と転移とに関
連したαv系インテグリンの発現の増加(Felding-Haberm
ann et al. 1992,J.Clin. Invest. 89, 2018, Marshall
et al. 1991, Int. J. Cancer49, 924)によって、癌細
胞の転移過程にαv系のインテグリンが関与しているこ
とが示唆された。癌細胞の付着、拡大、特に、最も典型
的な上皮悪性腫瘍である結腸直腸癌についてインテグリ
ンの関与が議論されている。
【０００５】αv系インテグリンは、ＲＧＤ（ＮＨ2-ア
ルギニンーグリシンーアスパラギン酸−ＣＯＯＨ）トリ
ペプチド配列を有するリガンドを結合部位として特異的
に認識するとされている。αv系受容体インテグリンで
あるαvβ1、αvβ3、αvβ5はビトロネクチン（ｖｉｔ
ｒｏｎｅｃｔｉｎ）の相当部位を特異的に認識し、α v
β1、αvβ3、αvβ5、αvβ6はフィブロネクチン（ｆ
ｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）の相当部位を認識し、αvβ3は
フォンビルブラント因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎ
ｄ ｆａｃｔｏｒ）、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎ
ｏｇｅｎ）及びオステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔ
ｉｎ）の相当部位を認識する(Busk et al.1992, J.Bio
l. Chem. 267, 5790; Smith and Cheresh 1990, J. Bio
l. Chem. 265, 2168)。これらの抗インテグリン抗体、
例えばαvβ3インテグリンに対する抗体をブロックする
機能については知られている（Cheresh and Spiro 198
7, J.Biol. Chem. 262, 17703; Chuntharapai et al. 1
993, Exp. Cell Res. 205, 345; EP95119233)。
ルギニンーグリシンーアスパラギン酸−ＣＯＯＨ）トリ
ペプチド配列を有するリガンドを結合部位として特異的
に認識するとされている。αv系受容体インテグリンで
あるαvβ1、αvβ3、αvβ5はビトロネクチン（ｖｉｔ
ｒｏｎｅｃｔｉｎ）の相当部位を特異的に認識し、α v
β1、αvβ3、αvβ5、αvβ6はフィブロネクチン（ｆ
ｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）の相当部位を認識し、αvβ3は
フォンビルブラント因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎ
ｄ ｆａｃｔｏｒ）、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎ
ｏｇｅｎ）及びオステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔ
ｉｎ）の相当部位を認識する(Busk et al.1992, J.Bio
l. Chem. 267, 5790; Smith and Cheresh 1990, J. Bio
l. Chem. 265, 2168)。これらの抗インテグリン抗体、
例えばαvβ3インテグリンに対する抗体をブロックする
機能については知られている（Cheresh and Spiro 198
7, J.Biol. Chem. 262, 17703; Chuntharapai et al. 1
993, Exp. Cell Res. 205, 345; EP95119233)。
【０００６】種々のペプチドおよび抗体によるリガンド
とインテグリンとの間の相互作用の阻害という点に基づ
いて、癌の増殖・転移、ウイルス感染、骨粗しょう症、
血管形成などの多様なプロセスの中での、ビトロネクチ
ン受容体としてのαvβ3インテグリンの重要な役割が注
目されるに至っている(Felding-Habermann and Cheresh
1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5, 864; Brooks et a
l, 1994, Cell 79, 1157; Brooks et al. 1994, Scienc
e 264, 569)。αvβ3インテグリンの治療手段における
強力なターゲットとしての浮上は、精製αvβ3を必要と
するプロセスであるαvβ3アンタゴニストの検索をリー
ドすることとなった。多くの必須の膜タンパク質に共通
するように、インテグリンも非イオン性界面活性剤の存
在下のみにおいて活性のある可溶性分子として得られる
ものであり、そのため、薬剤のスクリーニングのための
αvβ3のヒト胎盤からの精製は、厄介で、コストがかか
り、健康に対する考えられ得るリスクを有するものとな
っている(Mitjans et al.1995, J. Cell Sci. 108,282
5)。組換え型のインテグリンについては、すでにＣＨＯ
細胞(O'Toole et al., 1990, Cell Regul. 1, 883)や胎
児腎臓２９３細胞(King et al., 1990, J. Bone Mine R
es. 9, 381)のような真核生物系での発現が行われてい
いるが、ＤＮＡ組換え技術によって生化学的に満足でき
る量の生産は未だなされていない。末端欠失型の可溶性
αvβ3インテグリンの生物学的活性に関する報告はない
し、組換え技術による完全鎖長を有するαvβ3受容体の
生化学的に重要な量での生産も行われていない。
とインテグリンとの間の相互作用の阻害という点に基づ
いて、癌の増殖・転移、ウイルス感染、骨粗しょう症、
血管形成などの多様なプロセスの中での、ビトロネクチ
ン受容体としてのαvβ3インテグリンの重要な役割が注
目されるに至っている(Felding-Habermann and Cheresh
1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5, 864; Brooks et a
l, 1994, Cell 79, 1157; Brooks et al. 1994, Scienc
e 264, 569)。αvβ3インテグリンの治療手段における
強力なターゲットとしての浮上は、精製αvβ3を必要と
するプロセスであるαvβ3アンタゴニストの検索をリー
ドすることとなった。多くの必須の膜タンパク質に共通
するように、インテグリンも非イオン性界面活性剤の存
在下のみにおいて活性のある可溶性分子として得られる
ものであり、そのため、薬剤のスクリーニングのための
αvβ3のヒト胎盤からの精製は、厄介で、コストがかか
り、健康に対する考えられ得るリスクを有するものとな
っている(Mitjans et al.1995, J. Cell Sci. 108,282
5)。組換え型のインテグリンについては、すでにＣＨＯ
細胞(O'Toole et al., 1990, Cell Regul. 1, 883)や胎
児腎臓２９３細胞(King et al., 1990, J. Bone Mine R
es. 9, 381)のような真核生物系での発現が行われてい
いるが、ＤＮＡ組換え技術によって生化学的に満足でき
る量の生産は未だなされていない。末端欠失型の可溶性
αvβ3インテグリンの生物学的活性に関する報告はない
し、組換え技術による完全鎖長を有するαvβ3受容体の
生化学的に重要な量での生産も行われていない。
【０００７】従って、比較的容易で安全な方法により、
精製されており、かつ生化学的に使える量での生産が可
能な可溶性組換えαvβ3受容体が提供されることが望ま
れている。更に、そのようなプロセスは、完全鎖長のα
vβ3受容体の生産にも有益であり得る。
精製されており、かつ生化学的に使える量での生産が可
能な可溶性組換えαvβ3受容体が提供されることが望ま
れている。更に、そのようなプロセスは、完全鎖長のα
vβ3受容体の生産にも有益であり得る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、バキュロウイ
ルス−昆虫細胞発現系を使用した、生物学的に十分な機
能を有する可溶性αvβ3の最初の高レベル発現及び精製
について記載するものである。哺乳動物細胞におけるの
と同様に処理された組換えタンパク質（付着受容体）の
高収量を達成するために、バキュロウイルスのポリヘド
リン遺伝子を強力なウイルスプロモータとして使用さ
れ、αvβ3タンパク質の過剰発現が達成された。この可
溶性タンパク分子は、天然の胎盤におけるもの及び完全
長の組換え受容体におけるリガンドとの結合活性及び特
異性を維持しており、そして、界面活性剤を用いずに精
製することができるために、結合性の人工物の混入の可
能性を除去でき、構造解析における高度な解析結果とス
クリーニングにおける高生産性に適した分子を製造する
ことができる。
ルス−昆虫細胞発現系を使用した、生物学的に十分な機
能を有する可溶性αvβ3の最初の高レベル発現及び精製
について記載するものである。哺乳動物細胞におけるの
と同様に処理された組換えタンパク質（付着受容体）の
高収量を達成するために、バキュロウイルスのポリヘド
リン遺伝子を強力なウイルスプロモータとして使用さ
れ、αvβ3タンパク質の過剰発現が達成された。この可
溶性タンパク分子は、天然の胎盤におけるもの及び完全
長の組換え受容体におけるリガンドとの結合活性及び特
異性を維持しており、そして、界面活性剤を用いずに精
製することができるために、結合性の人工物の混入の可
能性を除去でき、構造解析における高度な解析結果とス
クリーニングにおける高生産性に適した分子を製造する
ことができる。
【０００９】本発明の目的は、リガンド結合活性が損な
われていない、本質的に精製された可溶性のαvβ3付着
受容体を提供することにある。ヒト由来の対応する受容
体は本発明における好適な態様の一つである。
われていない、本質的に精製された可溶性のαvβ3付着
受容体を提供することにある。ヒト由来の対応する受容
体は本発明における好適な態様の一つである。
【００１０】本発明の受容体は、αv鎖とβ3鎖を有し、
それぞれの鎖のＣ末端において、膜通過ドメインを含む
部分、または該膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒ
ａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を含む部分と細胞質ドメイン
（ｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｉｃｄｏｍａｉｎ）の全てを
含む部分の分だけ鎖長が短くなっている構造を採り得
る。成熟したヒトのαv及びβ3タンパク質鎖におけるア
ミノ酸配列およびＤＮＡ配列については、膜通過ドメイ
ンおよび細胞質ドメインのものとともにすでに知られて
いる。
それぞれの鎖のＣ末端において、膜通過ドメインを含む
部分、または該膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒ
ａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を含む部分と細胞質ドメイン
（ｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｉｃｄｏｍａｉｎ）の全てを
含む部分の分だけ鎖長が短くなっている構造を採り得
る。成熟したヒトのαv及びβ3タンパク質鎖におけるア
ミノ酸配列およびＤＮＡ配列については、膜通過ドメイ
ンおよび細胞質ドメインのものとともにすでに知られて
いる。
【００１１】本発明において特に好ましい対象は、対応
する成熟タンパク質鎖におけるＮ末端から数えて、約９
５７個のアミノ酸を有する末端欠失型（ｔｒｕｎｃａｔ
ｅｄ：基準となるものの末端部分を削除して短縮化した
もの）αv鎖と、約６９２個の末端欠失型のβ3鎖を有す
る可溶性ヒト組換え受容体を利用できるようにすること
である。この好ましい形の可溶性受容体では、成熟タン
パク質鎖における実質的に全ての膜通過ドメインととも
に細胞質ドメインの全てが除去されている。しかしなが
ら、以下に示すとおり、膜通過ドメインの部分を含む可
溶性受容体も本発明に含まれる。また、本発明は、ヒト
αvβ3付着受容体に限定されない。本発明における方法
によれば、ヒト由来でないαvβ3受容体を問題なく生産
することもできる。更に、ヒトのものに相当する受容体
を、以下に示す本発明の方法によって生産することがで
きる。
する成熟タンパク質鎖におけるＮ末端から数えて、約９
５７個のアミノ酸を有する末端欠失型（ｔｒｕｎｃａｔ
ｅｄ：基準となるものの末端部分を削除して短縮化した
もの）αv鎖と、約６９２個の末端欠失型のβ3鎖を有す
る可溶性ヒト組換え受容体を利用できるようにすること
である。この好ましい形の可溶性受容体では、成熟タン
パク質鎖における実質的に全ての膜通過ドメインととも
に細胞質ドメインの全てが除去されている。しかしなが
ら、以下に示すとおり、膜通過ドメインの部分を含む可
溶性受容体も本発明に含まれる。また、本発明は、ヒト
αvβ3付着受容体に限定されない。本発明における方法
によれば、ヒト由来でないαvβ3受容体を問題なく生産
することもできる。更に、ヒトのものに相当する受容体
を、以下に示す本発明の方法によって生産することがで
きる。
【００１２】本発明にかかる方法によってリガンド結合
活性が損なわれていない、高純度に精製された可溶性組
換えヒトαvβ3付着受容体を収率よく生産することがで
き、この方法は、（ｉ）Ｃ末端から数えて少なくとも５
２個のアミノ酸を含む部分の分だけ鎖長が短くなった前
記受容体のαv鎖をコードする第一のｃＤＮＡと、Ｃ末
端から数えてが少なくとも６１個のアミノ酸からなる部
分の分だけ鎖長が短くなった前記受容体のβ3鎖をコー
ドする第二のｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現系のバ
キュロウイルス転送ベクターに組み込んでサブクローニ
ングを行い、（ｉｉ）上記の第一及び／または第二ＤＮ
Ａを含むベクターを、前記発現系のバキュロウイルスの
ゲノムＤＮＡに移入させて組換えバキュロウイルスを形
成し、（ｉｉｉ）該組換えバキュロウイルスの完全な状
態を昆虫細胞に感染させ、（ｉｖ）感染した昆虫細胞を
培養基で培養して、末端欠失型のヘテロ二量体α vβ3受
容体を該培養基中に発現させ、（ｖ）前記発現した受容
体を、ヒトαvβ3受容体またはその個々の成分鎖に特異
的に結合する抗体を使用した抗体アフィニティクロマト
グラフィにより、培地から分離し、精製することを特徴
とする。
活性が損なわれていない、高純度に精製された可溶性組
換えヒトαvβ3付着受容体を収率よく生産することがで
き、この方法は、（ｉ）Ｃ末端から数えて少なくとも５
２個のアミノ酸を含む部分の分だけ鎖長が短くなった前
記受容体のαv鎖をコードする第一のｃＤＮＡと、Ｃ末
端から数えてが少なくとも６１個のアミノ酸からなる部
分の分だけ鎖長が短くなった前記受容体のβ3鎖をコー
ドする第二のｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現系のバ
キュロウイルス転送ベクターに組み込んでサブクローニ
ングを行い、（ｉｉ）上記の第一及び／または第二ＤＮ
Ａを含むベクターを、前記発現系のバキュロウイルスの
ゲノムＤＮＡに移入させて組換えバキュロウイルスを形
成し、（ｉｉｉ）該組換えバキュロウイルスの完全な状
態を昆虫細胞に感染させ、（ｉｖ）感染した昆虫細胞を
培養基で培養して、末端欠失型のヘテロ二量体α vβ3受
容体を該培養基中に発現させ、（ｖ）前記発現した受容
体を、ヒトαvβ3受容体またはその個々の成分鎖に特異
的に結合する抗体を使用した抗体アフィニティクロマト
グラフィにより、培地から分離し、精製することを特徴
とする。
【００１３】本発明の他の態様として、完全鎖長の組換
えαvβ3受容体、特に、ヒト由来のものの生産のための
類似の方法が開示されている。この方法は以下の工程に
よって特徴付けられる。
えαvβ3受容体、特に、ヒト由来のものの生産のための
類似の方法が開示されている。この方法は以下の工程に
よって特徴付けられる。
【００１４】（ｉ）前記受容体の完全なαv鎖をコード
する第一のｃＤＮＡと、前記受容体の完全なβ3鎖をコ
ードする第二のｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現系の
バキュロウイルスベクターに組み込み、サブクローニン
グをする。
する第一のｃＤＮＡと、前記受容体の完全なβ3鎖をコ
ードする第二のｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現系の
バキュロウイルスベクターに組み込み、サブクローニン
グをする。
【００１５】（ｉｉ）上記第１及び／または第２のＤＮ
Ａを含むベクターを、前記バキュロウイルス発現系のバ
キュロウイルスのゲノムＤＮＡに移入させ、組換えバキ
ュロウイルスを得る。
Ａを含むベクターを、前記バキュロウイルス発現系のバ
キュロウイルスのゲノムＤＮＡに移入させ、組換えバキ
ュロウイルスを得る。
【００１６】（ｉｉｉ）前記の完成された組換えバキュ
ロウイルスを昆虫細胞に感染させる。
ロウイルスを昆虫細胞に感染させる。
【００１７】（ｉｖ）感染した昆虫細胞を培養基で培養
し、発現した細胞膜結合型の受容体を界面活性剤で溶解
させる。
し、発現した細胞膜結合型の受容体を界面活性剤で溶解
させる。
【００１８】（V）上記で溶解した受容体をヒトαvβ3
受容体またはその成分鎖に特異的である抗体を使用した
抗体アフィニティクロマトグラフィにより細胞を除いた
培地から精製する。
受容体またはその成分鎖に特異的である抗体を使用した
抗体アフィニティクロマトグラフィにより細胞を除いた
培地から精製する。
【００１９】本発明のαvβ3受容体は、天然の受容体を
阻害することのできる治療用化合物を発見するために有
用である。従って、本発明は、このような薬剤化合物の
発見のためにこの可溶性受容体を適用する方法をも含
む。前述したように、本発明にかかる受容体を利用して
開発が期待できる薬剤化合物としては、１個以上のＲＧ
Ｄユニットを含む全ての、線状または環状ペプチドまた
はαvβ3付着受容体に対してＲＧＤペプチドと同様な生
物学的活性を示す非ペプチド類似体がある（下記参
照）。
阻害することのできる治療用化合物を発見するために有
用である。従って、本発明は、このような薬剤化合物の
発見のためにこの可溶性受容体を適用する方法をも含
む。前述したように、本発明にかかる受容体を利用して
開発が期待できる薬剤化合物としては、１個以上のＲＧ
Ｄユニットを含む全ての、線状または環状ペプチドまた
はαvβ3付着受容体に対してＲＧＤペプチドと同様な生
物学的活性を示す非ペプチド類似体がある（下記参
照）。
【００２０】本発明には、先に記載した、更に以下に記
載するαvβ3受容体を使用した、治療用化合物、特にα
vβ3受容体を阻害できるＲＧＤペプチドまたはその非ペ
プチド類似体の天然のαvβ3受容体を阻害できる能力に
基づいたスクリーニングの方法も含まれる。
載するαvβ3受容体を使用した、治療用化合物、特にα
vβ3受容体を阻害できるＲＧＤペプチドまたはその非ペ
プチド類似体の天然のαvβ3受容体を阻害できる能力に
基づいたスクリーニングの方法も含まれる。
【００２１】本発明においては、以下の略語が用いられ
ている。
ている。
【００２２】 αvβ3 インテグリン １７Ｅ６ ｍＡｂ（モノクローナル抗体） ＡＰ３ ｍＡｂ ＬＭ６０９ ｍＡｂ Ｐ４Ｃ１９ ｍＡｂ Ｐ１Ｆ６ ｍＡｂ αv（ＦＬ） 完全鎖長のαv鎖 αv（ＳＬ） 短鎖（末端欠失型αv鎖）のαv β3（ＦＬ） 完全鎖長のβ3鎖 β3（ＳＬ） 短鎖（末端欠失型β3鎖）のβ3 ＢａｃＰＡＫ バキュロウイルス発現系 ＳＦ９（Ｓｆ９）、ハイ・ファイヴ（Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖ
ｅ） 昆虫細胞 Ｍ．Ｏ．Ｉ． 感染多重度
ｅ） 昆虫細胞 Ｍ．Ｏ．Ｉ． 感染多重度
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明において用いられる微生
物、細胞株、プラスミド、ファージミド、プロモータ、
耐性マーカ、複製オリジン、その他のベクターフラグメ
ントは、市販されているか、一般的に入手可能なもので
ある。上記のうちで市場から直接入手できないものにつ
いても定法による調製可能であるか、または別の一般的
に入手可能な材料で代用可能である。本発明では、わず
かに改変または変更させた配列を有するＤＮＡ配列およ
びアミノ酸配列、あるいは化学的方法や物理的方法によ
り意図的または無作為に得られた変異体や変種も用いら
れる。一般的にここに記載された特性及び機能を示すこ
れらの全ての変異体や変種が含まれる。
物、細胞株、プラスミド、ファージミド、プロモータ、
耐性マーカ、複製オリジン、その他のベクターフラグメ
ントは、市販されているか、一般的に入手可能なもので
ある。上記のうちで市場から直接入手できないものにつ
いても定法による調製可能であるか、または別の一般的
に入手可能な材料で代用可能である。本発明では、わず
かに改変または変更させた配列を有するＤＮＡ配列およ
びアミノ酸配列、あるいは化学的方法や物理的方法によ
り意図的または無作為に得られた変異体や変種も用いら
れる。一般的にここに記載された特性及び機能を示すこ
れらの全ての変異体や変種が含まれる。
【００２４】本発明による技術と方法に関しての本質的
な内容がこの明細書に詳しく説明されている。詳しく説
明されてないその他の技術は、当業者には知られている
標準の方法であるか、参考文献に詳しく説明されている
か、原特許申請書、標準文献(Sambrook et al., 1989:
「分子クローニング, 実験マニュアル」, Cold Spring
Harbor: Cold Spring Harbar Laboratory Press; Harlo
w and Lane 1988:「抗体ー実験マニュアル」, Cold Spr
ing Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press)
に記載されている。
な内容がこの明細書に詳しく説明されている。詳しく説
明されてないその他の技術は、当業者には知られている
標準の方法であるか、参考文献に詳しく説明されている
か、原特許申請書、標準文献(Sambrook et al., 1989:
「分子クローニング, 実験マニュアル」, Cold Spring
Harbor: Cold Spring Harbar Laboratory Press; Harlo
w and Lane 1988:「抗体ー実験マニュアル」, Cold Spr
ing Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press)
に記載されている。
【００２５】インテグリンαvとインテグリンβ3のｃＤ
ＮＡについても知られており[Fitzgerald et al., 198
7, J. Biol. chem. 262, 3936(β3); Suzuki et al., 1
987,J. Biol. Chem. 262, 14080 (αv)]、入手も可能
で、例えば、ヌクレオチド合成器により作製することも
できる。
ＮＡについても知られており[Fitzgerald et al., 198
7, J. Biol. chem. 262, 3936(β3); Suzuki et al., 1
987,J. Biol. Chem. 262, 14080 (αv)]、入手も可能
で、例えば、ヌクレオチド合成器により作製することも
できる。
【００２６】本発明による成熟完全鎖長のヒトαvタン
パク質鎖は、１０１８個のアミノ酸を有するが、そのう
ち膜通過ドメインには約２９個のアミノ酸が、細胞質ド
メインには約３２個のアミノ酸がある。従って、細胞質
ドメイン及び膜通過ドメインを含む領域は合計約６１個
のアミノ酸から構成される。この領域は、この鎖のＮ末
端に位置する。従って、本発明において好ましい末端欠
失型αv鎖は、およそ９５７個のアミノ酸から構成され
る。
パク質鎖は、１０１８個のアミノ酸を有するが、そのう
ち膜通過ドメインには約２９個のアミノ酸が、細胞質ド
メインには約３２個のアミノ酸がある。従って、細胞質
ドメイン及び膜通過ドメインを含む領域は合計約６１個
のアミノ酸から構成される。この領域は、この鎖のＮ末
端に位置する。従って、本発明において好ましい末端欠
失型αv鎖は、およそ９５７個のアミノ酸から構成され
る。
【００２７】本発明による成熟完全鎖長のヒトβ3タン
パク質鎖は、７６２個のアミノ酸を有するが、そのうち
膜通過ドメインには、αv鎖の場合と同様に、約２９個
のアミノ酸があり、細胞質ドメインには約４１個のアミ
ノ酸がある。従って、細胞質ドメイン及び膜通過ドメイ
ンの領域は合計約７０個のアミノ酸で構成されている。
これら膜通過ドメイン及び細胞質ドメインの領域はＮ末
端側に位置している。従って、本発明において好ましい
末端欠失型β3鎖は、およそ６９２個のアミノ酸から構
成される。
パク質鎖は、７６２個のアミノ酸を有するが、そのうち
膜通過ドメインには、αv鎖の場合と同様に、約２９個
のアミノ酸があり、細胞質ドメインには約４１個のアミ
ノ酸がある。従って、細胞質ドメイン及び膜通過ドメイ
ンの領域は合計約７０個のアミノ酸で構成されている。
これら膜通過ドメイン及び細胞質ドメインの領域はＮ末
端側に位置している。従って、本発明において好ましい
末端欠失型β3鎖は、およそ６９２個のアミノ酸から構
成される。
【００２８】本発明においては、受容体鎖の全鎖長から
細胞質ドメインと膜通過ドメインの全てが除かれている
ことが好ましい。しかし、細胞質ドメイン全部と膜通過
ドメインのアミノ酸鎖の１部分だけを取り除いたもので
もかまわない。αv鎖またはβ3鎖が末端欠失型は、膜通
過ドメイン由来の、１〜１０個のアミノ酸、特に、１〜
５個のアミノ酸が付いていることが好ましい。この末端
欠失型αvβ3受容体はその後の状況においてグリコシル
化される。グリコシル化の程度は、その由来（起源）と
使用した宿主により違ってくる。
細胞質ドメインと膜通過ドメインの全てが除かれている
ことが好ましい。しかし、細胞質ドメイン全部と膜通過
ドメインのアミノ酸鎖の１部分だけを取り除いたもので
もかまわない。αv鎖またはβ3鎖が末端欠失型は、膜通
過ドメイン由来の、１〜１０個のアミノ酸、特に、１〜
５個のアミノ酸が付いていることが好ましい。この末端
欠失型αvβ3受容体はその後の状況においてグリコシル
化される。グリコシル化の程度は、その由来（起源）と
使用した宿主により違ってくる。
【００２９】本発明で使用したバキュロウイルス発現系
は、よく知られたもので一般に入手可能である。好まし
いバキュロウイルス発現系としては、クロンテックラボ
ラトリ社（Clontech Laboraratories, Inc.；ケンブリ
ッジバイオサイエンス、ＵＫから入手可能）のＢａｃＰ
ＡＫ（商品名）であるが、その他のものでも使用可能で
ある。
は、よく知られたもので一般に入手可能である。好まし
いバキュロウイルス発現系としては、クロンテックラボ
ラトリ社（Clontech Laboraratories, Inc.；ケンブリ
ッジバイオサイエンス、ＵＫから入手可能）のＢａｃＰ
ＡＫ（商品名）であるが、その他のものでも使用可能で
ある。
【００３０】本発明によれば、昆虫細胞を組換えバキュ
ロウイルスＤＮＡで感染させる。原理的にはすべての昆
虫細胞システムを使えるが、ウイルスシステムに対する
高感染性と、良好かつ安定した発現を保証するものが好
ましい。昆虫細胞としては、市販されているＳＦ９細
胞、特に、ハイ・ファイヴ（Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ）細胞
が好ましい。本発明によれば、サブクローニングの段階
ではＳＦ９細胞を使用し、最終の発現段階ではＨｉｇｈ
・Ｆｉｖｅ細胞を使用することが好ましい（実施例参
照）。
ロウイルスＤＮＡで感染させる。原理的にはすべての昆
虫細胞システムを使えるが、ウイルスシステムに対する
高感染性と、良好かつ安定した発現を保証するものが好
ましい。昆虫細胞としては、市販されているＳＦ９細
胞、特に、ハイ・ファイヴ（Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ）細胞
が好ましい。本発明によれば、サブクローニングの段階
ではＳＦ９細胞を使用し、最終の発現段階ではＨｉｇｈ
・Ｆｉｖｅ細胞を使用することが好ましい（実施例参
照）。
【００３１】ＳＦ９細胞（例えば、Invitrogen Corpora
tionから販売されている）は昆虫細胞用の品質を有する
１０％胎児ウシ血清(FBS, Life Technologies, Inc.)を
追加したＴＣ１００内で保存し、Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細
胞(例えば、Invitrogen Corporation から販売されてい
るＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）は１６．５ｍＭのＬ−グ
ルタミン(Life Technologies, Inc.)、ペニシリン（５
０ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）で補足したエクスプレスファイブ培地(Express Fiv
e medium、Life Technologies, Inc.)内で保存する。
tionから販売されている）は昆虫細胞用の品質を有する
１０％胎児ウシ血清(FBS, Life Technologies, Inc.)を
追加したＴＣ１００内で保存し、Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細
胞(例えば、Invitrogen Corporation から販売されてい
るＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）は１６．５ｍＭのＬ−グ
ルタミン(Life Technologies, Inc.)、ペニシリン（５
０ＩＵ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）で補足したエクスプレスファイブ培地(Express Fiv
e medium、Life Technologies, Inc.)内で保存する。
【００３２】バキュロウイルス−昆虫細胞発現系を使用
して、ヒト組換えαvβ3受容体の生産を下記の要領で実
施した。バキュロウイルス発現システムは、Kidd and E
mery(1993, Appl. Biochem. Biotechonol. 42, 137; O'
Reilly et al.,1992:「バキュロウイルス発現ベクター
実験マニュアル」、Oxford University Press, Inc.New
York)の提案した方法と同様に使用した。
して、ヒト組換えαvβ3受容体の生産を下記の要領で実
施した。バキュロウイルス発現システムは、Kidd and E
mery(1993, Appl. Biochem. Biotechonol. 42, 137; O'
Reilly et al.,1992:「バキュロウイルス発現ベクター
実験マニュアル」、Oxford University Press, Inc.New
York)の提案した方法と同様に使用した。
【００３３】ＰＣＲにより、膜通過ドメイン及び細胞外
部分との境界（図１）をコードしている部位で末端を切
り取ったαvとβ3鎖ｃＤＮＡを作製した。末端欠失型の
αv鎖とβ3鎖［αv（ＳＬ）とβ3（ＳＬ）］ｃＤＮＡお
よび完全鎖長のαv鎖とβ3鎖［αv（ＦＬ）β3（Ｆ
Ｌ）］ｃＤＮＡを、バキュロウイルス転送ベクターｐＢ
ａｃＰＡＫ９にサブクローニングした。本発明では、各
受容体鎖のｃＤＮＡを、安定性に関する問題を避けるた
めに、別々のベクターにそれぞれクローニングすること
もできる。しかし、各鎖の等モル状態を維持するために
単一のベクターを使用することが好ましい。実験では、
驚いたことに、両方の受容体鎖のＤＮＡ配列を持つベク
ターが大きいものであったにもかかわらず安定であっ
た。
部分との境界（図１）をコードしている部位で末端を切
り取ったαvとβ3鎖ｃＤＮＡを作製した。末端欠失型の
αv鎖とβ3鎖［αv（ＳＬ）とβ3（ＳＬ）］ｃＤＮＡお
よび完全鎖長のαv鎖とβ3鎖［αv（ＦＬ）β3（Ｆ
Ｌ）］ｃＤＮＡを、バキュロウイルス転送ベクターｐＢ
ａｃＰＡＫ９にサブクローニングした。本発明では、各
受容体鎖のｃＤＮＡを、安定性に関する問題を避けるた
めに、別々のベクターにそれぞれクローニングすること
もできる。しかし、各鎖の等モル状態を維持するために
単一のベクターを使用することが好ましい。実験では、
驚いたことに、両方の受容体鎖のＤＮＡ配列を持つベク
ターが大きいものであったにもかかわらず安定であっ
た。
【００３４】削除される末端領域がそれぞれ、９８７個
のαv鎖アミノ酸［９５７個の成熟タンパク質＋３０個
のシグナルペプチド］及び７１８個のβ3鎖アミノ酸
［６９２個の成熟タンパク質＋２６個のシグナルペプチ
ド］をコードする完全な膜通過ドメインと細胞質ドメイ
ンを含む場合には、この末端欠失型αvとβ3鎖のｃＤＮ
Ａには通常シグナル配列が含まれる。完全長の、または
末端欠失型のαvもしくはβ3鎖を発現させるための組換
えバキュロウイルスは、線状化にしたバキュロスウイル
スＢａｃＰＡＫ６をゲノムＤＮＡに同時移入により形成
し、その後、ＳＦ９細胞またはＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞
中でのプラーク精製及び増幅によって濃度を高めた(O'R
eilly et al., 1992: 「バキュロウイルス発現ベクタ
ー：実験マニュアル」, Oxford University, Inc. New
York）。移入したプラスミドが正確に移入されているか
どうかを、組換えウイルスゲノムＤＮＡのＰＣＲまたは
サザンブロット手順により確認した。
のαv鎖アミノ酸［９５７個の成熟タンパク質＋３０個
のシグナルペプチド］及び７１８個のβ3鎖アミノ酸
［６９２個の成熟タンパク質＋２６個のシグナルペプチ
ド］をコードする完全な膜通過ドメインと細胞質ドメイ
ンを含む場合には、この末端欠失型αvとβ3鎖のｃＤＮ
Ａには通常シグナル配列が含まれる。完全長の、または
末端欠失型のαvもしくはβ3鎖を発現させるための組換
えバキュロウイルスは、線状化にしたバキュロスウイル
スＢａｃＰＡＫ６をゲノムＤＮＡに同時移入により形成
し、その後、ＳＦ９細胞またはＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞
中でのプラーク精製及び増幅によって濃度を高めた(O'R
eilly et al., 1992: 「バキュロウイルス発現ベクタ
ー：実験マニュアル」, Oxford University, Inc. New
York）。移入したプラスミドが正確に移入されているか
どうかを、組換えウイルスゲノムＤＮＡのＰＣＲまたは
サザンブロット手順により確認した。
【００３５】完全鎖長のαv鎖を発現するＳＦ９細胞と
Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞を代謝標識して検出した結果か
ら、約１１０ｋＤａと１５０ｋＤａの２通りの組換えタ
ンパク質が存在することが判明した（図２Ａ、３列
目）。同様に、完全鎖長のβ3鎖を発現するＳＦ９細胞
を代謝標識して検出した結果でも、約９０ｋＤａと１２
５ｋＤａの２本のバンドが見られた（図２Ａ、４列
目）。疑似感染させた場合（１列）と、組換えＤＮＡが
組み込まれていないウイルスで感染をさせた場合（列
２）との比較から、ウイルスのライフサイクルの非常に
遅い段階における宿主細胞ゲノムの抑制度が示された。
個々の完全鎖長か、または、末端欠失型のαvもしくは
β3をそれぞれ発現する細胞をツニカマイシンで処理す
ると（図２Ｂ、１、３、５、７列）、移動速度の遅いバ
ンドの発生が阻害されており、これは、１５０／１１０
ｋＤａバンド（図２Ｂ、２、４列）と１２５／９０ｋＤ
ａバンド（図２Ｂ、６、８列）の部位が、組換えタンパ
ク質のグルコシル化された部分とグリコシル化されない
部位とにそれぞれ対応していることを示している。この
結果は、Ｎ−グリコシル化のような翻訳後修飾がなされ
るバキュロウイルス系における組換えタンパク質の割合
が、ウイルスのライフサイクルの遅い段階では減少する
という２、３の報告(Jarvis and Finn 1995, Virology
212, 500)を確認するものである。αvタンパク質とβ3
タンパク質がグリコシル化されている場合とグリコシル
化されていない場合でのサイズにおける比較的大きな差
異は、タンパク質がかなりの量でグリコシル化され、し
かも、αvタンパク質の場合には１３のＮーグルコシル
化部位があること、β3タンパク質には１０のＮーグル
コシル化部位があることに関係がある。
Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞を代謝標識して検出した結果か
ら、約１１０ｋＤａと１５０ｋＤａの２通りの組換えタ
ンパク質が存在することが判明した（図２Ａ、３列
目）。同様に、完全鎖長のβ3鎖を発現するＳＦ９細胞
を代謝標識して検出した結果でも、約９０ｋＤａと１２
５ｋＤａの２本のバンドが見られた（図２Ａ、４列
目）。疑似感染させた場合（１列）と、組換えＤＮＡが
組み込まれていないウイルスで感染をさせた場合（列
２）との比較から、ウイルスのライフサイクルの非常に
遅い段階における宿主細胞ゲノムの抑制度が示された。
個々の完全鎖長か、または、末端欠失型のαvもしくは
β3をそれぞれ発現する細胞をツニカマイシンで処理す
ると（図２Ｂ、１、３、５、７列）、移動速度の遅いバ
ンドの発生が阻害されており、これは、１５０／１１０
ｋＤａバンド（図２Ｂ、２、４列）と１２５／９０ｋＤ
ａバンド（図２Ｂ、６、８列）の部位が、組換えタンパ
ク質のグルコシル化された部分とグリコシル化されない
部位とにそれぞれ対応していることを示している。この
結果は、Ｎ−グリコシル化のような翻訳後修飾がなされ
るバキュロウイルス系における組換えタンパク質の割合
が、ウイルスのライフサイクルの遅い段階では減少する
という２、３の報告(Jarvis and Finn 1995, Virology
212, 500)を確認するものである。αvタンパク質とβ3
タンパク質がグリコシル化されている場合とグリコシル
化されていない場合でのサイズにおける比較的大きな差
異は、タンパク質がかなりの量でグリコシル化され、し
かも、αvタンパク質の場合には１３のＮーグルコシル
化部位があること、β3タンパク質には１０のＮーグル
コシル化部位があることに関係がある。
【００３６】インテグリンは細胞外マトリックスと細胞
骨格との間の構造付着機能により細胞形態を決定し、調
節する(Schwartz et al., 1995, Ann. Rev. Cell Dev.
Biol. 11, 549; Montgomery et al., 1994, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 91, 8856)。バキュロウイルス感染
の後期の段階では、ＳＦ９細胞／Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細
胞細胞は、αvまたはβ3のいずれかだけを発現する組換
えバキュロウイルスを感染させた時も、組換え体を含ま
ないウイルスを感染させた時と同じように、細胞形態は
通常円形になりその結合も緩やかである（図３Ａ）。し
かし、αv（ＦＬ）＋β3（ＦＬ）、または、αv（Ｓ
Ｌ）＋β3（ＦＬ）を共発現するウイルスを感染した昆
虫細胞では、その細胞同士が強固に結合され、さらに大
きく広がった細胞形態が見られる（図３Ｂ及び図３
Ｃ）。αv（ＦＬ）＋β3（ＳＬ）、または、αv（Ｓ
Ｌ）＋β3（ＳＬ）を発現するウイルスを同時感染させ
た細胞では、その形態には変化は見られない。これらの
結果は、α鎖の細胞質ドメインが、β鎖の細胞質ドメイ
ンの細胞骨格への親和性に対しての負の調節に関与して
いるという説(Filardo and Cheresh 1994, J. Biol. Ch
em. 269, 4641;Akiyama et al.,1994, J. Biol. Chem.
269, 15961; LaFlamme et al.,1994, J. Cell Biol. 12
6, 1287)を裏付けるものである。αvβ3受容体は、ペプ
チド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を有する多
数のリガンドと結合する。このことに対応して、ビトロ
ネクチンをコートしたプレート上でのαv及びβ3ウイル
ス感染ＳＦ９細胞の細胞形態の変化は、ＲＧＤペプチド
を作用させる試験において阻害された。（表１）。
骨格との間の構造付着機能により細胞形態を決定し、調
節する(Schwartz et al., 1995, Ann. Rev. Cell Dev.
Biol. 11, 549; Montgomery et al., 1994, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 91, 8856)。バキュロウイルス感染
の後期の段階では、ＳＦ９細胞／Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細
胞細胞は、αvまたはβ3のいずれかだけを発現する組換
えバキュロウイルスを感染させた時も、組換え体を含ま
ないウイルスを感染させた時と同じように、細胞形態は
通常円形になりその結合も緩やかである（図３Ａ）。し
かし、αv（ＦＬ）＋β3（ＦＬ）、または、αv（Ｓ
Ｌ）＋β3（ＦＬ）を共発現するウイルスを感染した昆
虫細胞では、その細胞同士が強固に結合され、さらに大
きく広がった細胞形態が見られる（図３Ｂ及び図３
Ｃ）。αv（ＦＬ）＋β3（ＳＬ）、または、αv（Ｓ
Ｌ）＋β3（ＳＬ）を発現するウイルスを同時感染させ
た細胞では、その形態には変化は見られない。これらの
結果は、α鎖の細胞質ドメインが、β鎖の細胞質ドメイ
ンの細胞骨格への親和性に対しての負の調節に関与して
いるという説(Filardo and Cheresh 1994, J. Biol. Ch
em. 269, 4641;Akiyama et al.,1994, J. Biol. Chem.
269, 15961; LaFlamme et al.,1994, J. Cell Biol. 12
6, 1287)を裏付けるものである。αvβ3受容体は、ペプ
チド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を有する多
数のリガンドと結合する。このことに対応して、ビトロ
ネクチンをコートしたプレート上でのαv及びβ3ウイル
ス感染ＳＦ９細胞の細胞形態の変化は、ＲＧＤペプチド
を作用させる試験において阻害された。（表１）。
【００３７】
【表１】 アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸、またはグリシ
ンの代わりにβ−アラニンで置換した対照ペプチド、す
なわちｃｙｃ（ＲＧＥｆＶ）およびｃｙｃ（ＲβＡＤｆ
Ｖ）を使用した場合にも細胞形態に影響はなかった。
ンの代わりにβ−アラニンで置換した対照ペプチド、す
なわちｃｙｃ（ＲＧＥｆＶ）およびｃｙｃ（ＲβＡＤｆ
Ｖ）を使用した場合にも細胞形態に影響はなかった。
【００３８】ＳＦ９細胞よりもバキュロウイルスの発現
分泌タンパク質を多く産生すると言われている(Davis e
t al., 1993, In Vitro Cell Dev. Bio. Anim. 29A, 38
8)Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞に、完全鎖長のαvとβ3、末
端欠失型のαvとβ3の両方を発現する組換えバキュロウ
イルスを種々に組み合わせたものを感染させた。細胞抽
出物または細胞で調節した培地を用いたｍＡｂ ＬＭ６
０９とαvβ3との複合体の免疫沈降実験（図４）の結果
から、組換えαvβ3ヘテロ二量体が、そのαv鎖とβ3鎖
の一つまたは両方が完全鎖長を有する時には細胞表面に
存在することが分かっている（図４、１〜３列）。さら
に重要なことは、末端欠失型のαvと末端欠失型のβ3の
同時発現の場合には、可溶性のヘテロ二量体が分泌され
ることである（図４、９列）。無血清環境で可溶性のα
vβ3の産生によって、その後の後続する処理が大きく簡
便化され、抗αvβ3化合物を探索するための大規模なス
クリーニング手順の構築にある程度の柔軟性を導入でき
ることが示された。
分泌タンパク質を多く産生すると言われている(Davis e
t al., 1993, In Vitro Cell Dev. Bio. Anim. 29A, 38
8)Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞に、完全鎖長のαvとβ3、末
端欠失型のαvとβ3の両方を発現する組換えバキュロウ
イルスを種々に組み合わせたものを感染させた。細胞抽
出物または細胞で調節した培地を用いたｍＡｂ ＬＭ６
０９とαvβ3との複合体の免疫沈降実験（図４）の結果
から、組換えαvβ3ヘテロ二量体が、そのαv鎖とβ3鎖
の一つまたは両方が完全鎖長を有する時には細胞表面に
存在することが分かっている（図４、１〜３列）。さら
に重要なことは、末端欠失型のαvと末端欠失型のβ3の
同時発現の場合には、可溶性のヘテロ二量体が分泌され
ることである（図４、９列）。無血清環境で可溶性のα
vβ3の産生によって、その後の後続する処理が大きく簡
便化され、抗αvβ3化合物を探索するための大規模なス
クリーニング手順の構築にある程度の柔軟性を導入でき
ることが示された。
【００３９】本発明にかかる、新規な末端欠失型のαv
β3受容体およびその完全鎖長の変異体は、組換え技術
による発現工程の後、抗体アフィニティクロマトグラフ
ィーで精製される。本発明で使用した発現系は、上記の
受容体の高産生に極めて効果的なものであり、異タンパ
ク質の産生が少なく、単一の精製手順で、通常十分に高
度に精製された製品を得ることができる。抗体アフィニ
ティクロマトグラフィーはよく知られた技術である。こ
こでは、ある抗原エピトープに対して特異性を有する抗
体が、適当に活性化された支持体マトリックス、例え
ば、修飾されたアガロースやセファロースに酵素的にあ
るいは化学的に結合している。本発明によれば、使用さ
れる好適な抗体はαvβ3受容体、または単一のαv鎖ま
たはβ3鎖に対して高い特異性を有していることが必要
である。アフィニティクロマトグラフィーに使える抗体
は沢山知られており、それらのいくつかは誰にでも利用
できるパブリックドメインの抗体であるのでその入手に
問題はない。ＡＰ３（抗−β3）、ＬＭ６０９（抗−αv
β3）、Ｐ４Ｃ１０（抗−β1）、Ｐ１Ｆ６（抗−α
vβ5）、１７Ｅ６（抗−αv）については詳細な特性解
析がなされている(Mitjans etal., 1995, J.Cell Sci.
108, 2825)。モノクローナル抗体である１７Ｅ６は、２
７２−１７Ｅ６と呼ばれるハイブリドーマ細胞から産生
される抗体のことである。このハイブリドーマ細胞は、
ドイツ・微生物寄託機関(Braunschweig, FRG)（寄託番
号ＤＭＳ・ＡＣＣ２１６０）に寄託された。このモノク
ローナル抗体１７Ｅ６は、ヨーロッパ特許出願（０７１
９８５９）での特許の対象でもある。抗−β3抗体ＡＰ
３は、寄託機関ＡＴＣＣに寄託されている（寄託番号：
ＨＢ−２４２）。抗体１７Ｅ６と抗体ＡＰ３は、容易に
入手できるので、特に本発明では適している。ＬＭ６０
９(Cheresh and Spiro 1987, J. Biol. Chem. 262, 177
03)は、α鎖とβ鎖の両方に対しての抗体として作用す
るので特に興味があるものである。
β3受容体およびその完全鎖長の変異体は、組換え技術
による発現工程の後、抗体アフィニティクロマトグラフ
ィーで精製される。本発明で使用した発現系は、上記の
受容体の高産生に極めて効果的なものであり、異タンパ
ク質の産生が少なく、単一の精製手順で、通常十分に高
度に精製された製品を得ることができる。抗体アフィニ
ティクロマトグラフィーはよく知られた技術である。こ
こでは、ある抗原エピトープに対して特異性を有する抗
体が、適当に活性化された支持体マトリックス、例え
ば、修飾されたアガロースやセファロースに酵素的にあ
るいは化学的に結合している。本発明によれば、使用さ
れる好適な抗体はαvβ3受容体、または単一のαv鎖ま
たはβ3鎖に対して高い特異性を有していることが必要
である。アフィニティクロマトグラフィーに使える抗体
は沢山知られており、それらのいくつかは誰にでも利用
できるパブリックドメインの抗体であるのでその入手に
問題はない。ＡＰ３（抗−β3）、ＬＭ６０９（抗−αv
β3）、Ｐ４Ｃ１０（抗−β1）、Ｐ１Ｆ６（抗−α
vβ5）、１７Ｅ６（抗−αv）については詳細な特性解
析がなされている(Mitjans etal., 1995, J.Cell Sci.
108, 2825)。モノクローナル抗体である１７Ｅ６は、２
７２−１７Ｅ６と呼ばれるハイブリドーマ細胞から産生
される抗体のことである。このハイブリドーマ細胞は、
ドイツ・微生物寄託機関(Braunschweig, FRG)（寄託番
号ＤＭＳ・ＡＣＣ２１６０）に寄託された。このモノク
ローナル抗体１７Ｅ６は、ヨーロッパ特許出願（０７１
９８５９）での特許の対象でもある。抗−β3抗体ＡＰ
３は、寄託機関ＡＴＣＣに寄託されている（寄託番号：
ＨＢ−２４２）。抗体１７Ｅ６と抗体ＡＰ３は、容易に
入手できるので、特に本発明では適している。ＬＭ６０
９(Cheresh and Spiro 1987, J. Biol. Chem. 262, 177
03)は、α鎖とβ鎖の両方に対しての抗体として作用す
るので特に興味があるものである。
【００４０】上記の抗体を支持体に担持させた後、感染
後溶菌させた昆虫細胞の清浄な無細胞培地（本発明にか
かる末端欠失型、または、溶解された完全鎖長の組換え
受容体を含む）を、上記の支持体の入ったカラムに入
れ、数回このカラム内を循環させて、発現した受容体を
固定抗体に結合させる。その後、精製したαvβ3受容体
をイオン性緩衝液でカラムから洗い出して、そのままリ
ガンド結合やその他の実験にすぐに使用できる。
後溶菌させた昆虫細胞の清浄な無細胞培地（本発明にか
かる末端欠失型、または、溶解された完全鎖長の組換え
受容体を含む）を、上記の支持体の入ったカラムに入
れ、数回このカラム内を循環させて、発現した受容体を
固定抗体に結合させる。その後、精製したαvβ3受容体
をイオン性緩衝液でカラムから洗い出して、そのままリ
ガンド結合やその他の実験にすぐに使用できる。
【００４１】ヒトのビトロネクチン、フィブロネクチ
ン、フィブリノーゲンは、ヒト血漿から精製できる(Yat
ohgo et al., 1988, Cell Struct, Funct. 13, 281; Ru
oslahti et al., 1982, Methods Enzymol 82, Pt A, 80
3; Ruoslahti 1988, Ann. Rev.Biochem. 57, 375; Kaza
l et al., 1963, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 98
9)。組換えヒトαvβ3の精製及び特性の解析は、詳細に
は下記の方法で行うことができる。１７Ｅ６、ＡＰ３ま
たはＬＭ６０９抗体を使用したアフィニティ・クロマト
グラフィーを実施する。ヒト胎盤由来のαvβ3を、例え
ば、スミス＆チェレッシュ(Smith and Cheresh)(1988,
J.Biol. Chem. 263, 18726)の方法を採用して抗体アフ
ィニティ・クロマトグラフィーで精製する。
ン、フィブリノーゲンは、ヒト血漿から精製できる(Yat
ohgo et al., 1988, Cell Struct, Funct. 13, 281; Ru
oslahti et al., 1982, Methods Enzymol 82, Pt A, 80
3; Ruoslahti 1988, Ann. Rev.Biochem. 57, 375; Kaza
l et al., 1963, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 98
9)。組換えヒトαvβ3の精製及び特性の解析は、詳細に
は下記の方法で行うことができる。１７Ｅ６、ＡＰ３ま
たはＬＭ６０９抗体を使用したアフィニティ・クロマト
グラフィーを実施する。ヒト胎盤由来のαvβ3を、例え
ば、スミス＆チェレッシュ(Smith and Cheresh)(1988,
J.Biol. Chem. 263, 18726)の方法を採用して抗体アフ
ィニティ・クロマトグラフィーで精製する。
【００４２】完全鎖長の組換えαvβ3は、αv（ＦＬ）
とβ3（ＦＬ）を同時に感染させたＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ
細胞昆虫細胞の抽出物を非イオン系界面活性剤に溶解さ
せることにより精製できる。可溶性の末端欠失型のαv
β3は、αv（ＳＬ）とβ3（ＳＬ）を同時に感染させた
Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞からは、界面活性剤を使用せず
に精製できる。ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）にお
いては、同じ抗体（ＬＭ６０９、１７Ｅ６、ＡＰ３）に
よって、末端欠失型の可溶性の組換えαvβ3と、完全鎖
長の可溶性組換えαvβ3の両方が認識され、ＥＬＩＳＡ
によるタイター値で判定した場合に、溶解された胎盤由
来のαvβ3と同程度の親和性を示すことが判明した。し
かし、抗−β1（Ｐ４Ｃ１０）抗体または抗−αvβ5特
異（Ｐ１Ｆ６）抗体は、どちらも認識せず、これは、エ
ピトープの保存と、αvβ3に他のインテグリンが低濃度
で混入していることを示す（図５）。
とβ3（ＦＬ）を同時に感染させたＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ
細胞昆虫細胞の抽出物を非イオン系界面活性剤に溶解さ
せることにより精製できる。可溶性の末端欠失型のαv
β3は、αv（ＳＬ）とβ3（ＳＬ）を同時に感染させた
Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞からは、界面活性剤を使用せず
に精製できる。ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）にお
いては、同じ抗体（ＬＭ６０９、１７Ｅ６、ＡＰ３）に
よって、末端欠失型の可溶性の組換えαvβ3と、完全鎖
長の可溶性組換えαvβ3の両方が認識され、ＥＬＩＳＡ
によるタイター値で判定した場合に、溶解された胎盤由
来のαvβ3と同程度の親和性を示すことが判明した。し
かし、抗−β1（Ｐ４Ｃ１０）抗体または抗−αvβ5特
異（Ｐ１Ｆ６）抗体は、どちらも認識せず、これは、エ
ピトープの保存と、αvβ3に他のインテグリンが低濃度
で混入していることを示す（図５）。
【００４３】精製した胎盤由来αvβ3は、非還元条件下
で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動）を行うと、解離をして、１６０ｋＤａのα鎖と
９５ｋＤａのβ鎖の２本のバンドが現れる（図６、２列
目）。精製した完全鎖長の組換えαvβ3では、約１４０
ｋＤａのαv鎖と、９０ｋＤａのβ3鎖に解離したバンド
が現れる（図６、３列目）。組換えαvβ3が低分子量と
なるのには、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞に
より発現された組換えタンパク質の不完全なグリコシル
化または変性したゴリコシル化が原因している可能性が
ある。精製した可溶性の組換えαvβ3では、約１２０ｋ
Ｄａの末端欠失型αv鎖と、８０ｋＤａの末端欠失型β3
鎖への解離を示すバンドが現れる。この分子量の低下
は、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞において発
現した組換えタンパク質の不完全な、あるいは通常と異
るグルコシル化のためであると考えられる。精製された
組換えαvβ3は、約１２０ｋＤａの末端欠失型のαv鎖
と、約８０ｋＤａの末端欠失型のβ3鎖に分離する。
で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動）を行うと、解離をして、１６０ｋＤａのα鎖と
９５ｋＤａのβ鎖の２本のバンドが現れる（図６、２列
目）。精製した完全鎖長の組換えαvβ3では、約１４０
ｋＤａのαv鎖と、９０ｋＤａのβ3鎖に解離したバンド
が現れる（図６、３列目）。組換えαvβ3が低分子量と
なるのには、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞に
より発現された組換えタンパク質の不完全なグリコシル
化または変性したゴリコシル化が原因している可能性が
ある。精製した可溶性の組換えαvβ3では、約１２０ｋ
Ｄａの末端欠失型αv鎖と、８０ｋＤａの末端欠失型β3
鎖への解離を示すバンドが現れる。この分子量の低下
は、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞において発
現した組換えタンパク質の不完全な、あるいは通常と異
るグルコシル化のためであると考えられる。精製された
組換えαvβ3は、約１２０ｋＤａの末端欠失型のαv鎖
と、約８０ｋＤａの末端欠失型のβ3鎖に分離する。
【００４４】αv鎖は、通常、翻訳後開裂が起こり、密
度の重鎖と軽鎖に分かれてからこれらの間にジスルフィ
ド架橋結合が起こる（図１）(Hynes 1992, Cell 69, 1
1)。それ故、還元条件下では、胎盤由来のαvβ3のうち
のα鎖は、さらに解離して１４０ｋＤａの重鎖と２５ｋ
Ｄａの軽鎖となり（図６、６列目）、β鎖は１１０ｋＤ
ａに相当する位置まで移動する。α鎖の軽鎖の中には膜
通過を遮断する部位があり、完全鎖長のα鎖も、末端欠
失型の組換えα鎖も、還元条件下では、１４０ｋＤａの
位置までの移動を起すはずであった。しかし、完全鎖長
αv鎖と、可溶性αv鎖では、還元条件下でも非還元条件
下でも同じ分子量を示し（７、８列目）、これは、αv
鎖には翻訳後に部分的な開裂しか起こらなかったことを
示している。７、８列目の約１２０ｋＤａでの弱いバン
ドは重αv鎖であると考えられる。胎盤由来のαvβ3と
組換えαvβ3との間での相違は、バキュロウイルス感染
の非常に遅い時期における不完全なタンパク質分解プロ
セスに原因がある(O'Reilly et al., 1992, 「バキュロ
ウイルス発現ベクター：実験マニュアル」, Oxford Uni
versity Press. Inc. New York)。表２は、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの分析結果である。
度の重鎖と軽鎖に分かれてからこれらの間にジスルフィ
ド架橋結合が起こる（図１）(Hynes 1992, Cell 69, 1
1)。それ故、還元条件下では、胎盤由来のαvβ3のうち
のα鎖は、さらに解離して１４０ｋＤａの重鎖と２５ｋ
Ｄａの軽鎖となり（図６、６列目）、β鎖は１１０ｋＤ
ａに相当する位置まで移動する。α鎖の軽鎖の中には膜
通過を遮断する部位があり、完全鎖長のα鎖も、末端欠
失型の組換えα鎖も、還元条件下では、１４０ｋＤａの
位置までの移動を起すはずであった。しかし、完全鎖長
αv鎖と、可溶性αv鎖では、還元条件下でも非還元条件
下でも同じ分子量を示し（７、８列目）、これは、αv
鎖には翻訳後に部分的な開裂しか起こらなかったことを
示している。７、８列目の約１２０ｋＤａでの弱いバン
ドは重αv鎖であると考えられる。胎盤由来のαvβ3と
組換えαvβ3との間での相違は、バキュロウイルス感染
の非常に遅い時期における不完全なタンパク質分解プロ
セスに原因がある(O'Reilly et al., 1992, 「バキュロ
ウイルス発現ベクター：実験マニュアル」, Oxford Uni
versity Press. Inc. New York)。表２は、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの分析結果である。
【００４５】
【表２】 ｈｃ：重鎖、ｌｃ：軽鎖 本発明の方法によれば、短鎖の組換えαvβ3受容体と完
全鎖長の組換えαvβ3受容体の両方が作製可能である。
本発明により作製された受容体が、なかでも末端欠失型
が、例えばヒト胎盤から分離して比較例として用いた天
然の受容体のリガンド結合特異性を有することを示すた
めに、結合特異性分析を行った。この分析のために、α
vβ3受容体の拮抗阻害剤として知られるリガンドを使用
した。前述したように、ＲＧＤアミノ酸配列（アルギニ
ン、グリシン、アスパラギン）を含む線状化ペプチドま
たは環状ペプチドが優れた拮抗阻害剤である。この目的
のための適当なペプチドとしては、例えば、次のものが
ある。ＧＲＧＤＳＰＫ、エチスタチン(Echistatin)、環
状−ＲＧＤｆＶ、環状−ＲＧＤｆＮＭｅＶ、環状−Ｒβ
ＡＤｆＶ、ＫＴＡＤＣ（Ｔｒｔ）ＰＲＮＰＨＫＧＰＡ
Ｔ、ＧＲＧＥＳＰＫ、環状−ＫＧＤｆＶ、環状−ＲＧＥ
ｆＶ。これらの他に、ＲＧＤペプチドと類似した作用を
し、αvβ3受容体との結合能のある非ペプチド系化合物
も使用できる。このようなＲＧＤペプチド及び非ペプチ
ド類似体はすでによく知られた物質であり（ヨーロッパ
特許出願番号９６１１３９７２，ヨーロッパ特許公開０
５７８０８３，０６３２０５３，０４７８３６３，０７
１０６５７，０７４１１３３、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１
２１８１）、公知の標準的な方法で合成することも可能
である。これらのリガンドを、従来技術で知られている
方法により、標識分子または原子で修飾して使用する。
ビオチン化リガンドを使用することが好ましい。
全鎖長の組換えαvβ3受容体の両方が作製可能である。
本発明により作製された受容体が、なかでも末端欠失型
が、例えばヒト胎盤から分離して比較例として用いた天
然の受容体のリガンド結合特異性を有することを示すた
めに、結合特異性分析を行った。この分析のために、α
vβ3受容体の拮抗阻害剤として知られるリガンドを使用
した。前述したように、ＲＧＤアミノ酸配列（アルギニ
ン、グリシン、アスパラギン）を含む線状化ペプチドま
たは環状ペプチドが優れた拮抗阻害剤である。この目的
のための適当なペプチドとしては、例えば、次のものが
ある。ＧＲＧＤＳＰＫ、エチスタチン(Echistatin)、環
状−ＲＧＤｆＶ、環状−ＲＧＤｆＮＭｅＶ、環状−Ｒβ
ＡＤｆＶ、ＫＴＡＤＣ（Ｔｒｔ）ＰＲＮＰＨＫＧＰＡ
Ｔ、ＧＲＧＥＳＰＫ、環状−ＫＧＤｆＶ、環状−ＲＧＥ
ｆＶ。これらの他に、ＲＧＤペプチドと類似した作用を
し、αvβ3受容体との結合能のある非ペプチド系化合物
も使用できる。このようなＲＧＤペプチド及び非ペプチ
ド類似体はすでによく知られた物質であり（ヨーロッパ
特許出願番号９６１１３９７２，ヨーロッパ特許公開０
５７８０８３，０６３２０５３，０４７８３６３，０７
１０６５７，０７４１１３３、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１
２１８１）、公知の標準的な方法で合成することも可能
である。これらのリガンドを、従来技術で知られている
方法により、標識分子または原子で修飾して使用する。
ビオチン化リガンドを使用することが好ましい。
【００４６】末端欠失型の組換えαvβ3受容体あるいは
その完全鎖長誘導体を、例えば、マイクロタイタープレ
ート上に吸着させて固定化し、上記の標識リガンドを反
応させる。本発明によるαvβ3受容体は上記のリガンド
と強く結合するが、非ＲＧＤペプチドとは結合せず、ヒ
ト胎盤由来の生体αvβ3受容体と極めて類似した性質を
示す。このことは、本発明にかかる方法により入手でき
る受容体が、特異的なリガンド結合能という点で、本来
の機能を有していることを示している。
その完全鎖長誘導体を、例えば、マイクロタイタープレ
ート上に吸着させて固定化し、上記の標識リガンドを反
応させる。本発明によるαvβ3受容体は上記のリガンド
と強く結合するが、非ＲＧＤペプチドとは結合せず、ヒ
ト胎盤由来の生体αvβ3受容体と極めて類似した性質を
示す。このことは、本発明にかかる方法により入手でき
る受容体が、特異的なリガンド結合能という点で、本来
の機能を有していることを示している。
【００４７】詳細には、末端欠失型の組換えαvβ3受容
体の生物活性の測定は下記の方法で実施され得る。
体の生物活性の測定は下記の方法で実施され得る。
【００４８】組換えαvβ3受容体と胎盤由来のαvβ3受
容体の両方について、末端欠失型のものと完全鎖長のも
のを固定化して、それらに対するビオチン化リガンドの
結合能を測定する。αvβ3受容体に結合することが知ら
れている３種類の、ＲＧＤ配列を有するリガンド（ビト
ロネクチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン）を
使用した。これらのリガンドは、その濃度に応じて、完
全鎖長の受容体と可溶性受容体のそれぞれの調製物と結
合し、結合における重複した濃度依存性と飽和濃度は胎
盤由来のαvβ3受容体の場合と同様である（図７）。組
換えαvβ3受容体との特異的相互反応の試験にビトロネ
クチンを使用する。ビオチン化したビトロネクチンと上
記のペプチドまたは非ペプチド類似体の濃度を増加させ
ながら固定化受容体に同時にインキュベートして反応さ
せた。上記で述べたペプチド化合物は、ビトロネクチン
が胎盤由来のαvβ3受容体、完全鎖長のαvβ3受容体お
よび可溶性組換えαvβ3受容体のいずれにも結合するこ
とを阻害し（図８、９）、β−アラニン−グリシンの対
照ペプチドの約４〜５倍の阻害効果を示す。各受容体の
環状−ＲＧＤｆＶに対するＩＣ50は、ナノモル（１−５
ｎＭ）範囲の低い濃度であった。ここで使用した同じ方
法を使えば、すでに知られているαvβ3受容体に特異的
なリガンドから、αvβ3受容体阻害剤になりうる可能性
のある物質を薬剤化合物をとしてスクリーニングするこ
とが可能となる。
容体の両方について、末端欠失型のものと完全鎖長のも
のを固定化して、それらに対するビオチン化リガンドの
結合能を測定する。αvβ3受容体に結合することが知ら
れている３種類の、ＲＧＤ配列を有するリガンド（ビト
ロネクチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン）を
使用した。これらのリガンドは、その濃度に応じて、完
全鎖長の受容体と可溶性受容体のそれぞれの調製物と結
合し、結合における重複した濃度依存性と飽和濃度は胎
盤由来のαvβ3受容体の場合と同様である（図７）。組
換えαvβ3受容体との特異的相互反応の試験にビトロネ
クチンを使用する。ビオチン化したビトロネクチンと上
記のペプチドまたは非ペプチド類似体の濃度を増加させ
ながら固定化受容体に同時にインキュベートして反応さ
せた。上記で述べたペプチド化合物は、ビトロネクチン
が胎盤由来のαvβ3受容体、完全鎖長のαvβ3受容体お
よび可溶性組換えαvβ3受容体のいずれにも結合するこ
とを阻害し（図８、９）、β−アラニン−グリシンの対
照ペプチドの約４〜５倍の阻害効果を示す。各受容体の
環状−ＲＧＤｆＶに対するＩＣ50は、ナノモル（１−５
ｎＭ）範囲の低い濃度であった。ここで使用した同じ方
法を使えば、すでに知られているαvβ3受容体に特異的
なリガンドから、αvβ3受容体阻害剤になりうる可能性
のある物質を薬剤化合物をとしてスクリーニングするこ
とが可能となる。
【００４９】本発明は、バキュロウイルス昆虫細胞発現
系が、培地中あるいは細胞表面上に分泌される可溶性の
受容体としての完全な機能性を有するヒト組換えαvβ3
インテグリンを多量に発現させるために使用できること
を示している。αvβ3に対する特異的複合抗体（ＬＭ６
０９、１７Ｅ６、ＡＰ３）での沈降及び精製によって示
されるように、この受容体の二重（ＳＬ）末端欠失型が
複合体の形で分泌される。最適の条件下であれば、１リ
ットルの培養基（上清）当たり１〜１０ｍｇ、好ましく
は２〜５ｍｇの収量（可溶性であるとともに完全鎖長の
受容体）を得ることができる。可溶性αvβ3の生化学的
に有用な量での定常的な生産ができることで、αvβ3を
使用した薬剤化合物のスクリーニングにおける高生産性
及びこの重要な受容体の構造解析ができるようになる。
なお、胎盤組織から分離される天然の受容体の収量は組
織１ｋｇ当たり約１〜２ｍｇである。
系が、培地中あるいは細胞表面上に分泌される可溶性の
受容体としての完全な機能性を有するヒト組換えαvβ3
インテグリンを多量に発現させるために使用できること
を示している。αvβ3に対する特異的複合抗体（ＬＭ６
０９、１７Ｅ６、ＡＰ３）での沈降及び精製によって示
されるように、この受容体の二重（ＳＬ）末端欠失型が
複合体の形で分泌される。最適の条件下であれば、１リ
ットルの培養基（上清）当たり１〜１０ｍｇ、好ましく
は２〜５ｍｇの収量（可溶性であるとともに完全鎖長の
受容体）を得ることができる。可溶性αvβ3の生化学的
に有用な量での定常的な生産ができることで、αvβ3を
使用した薬剤化合物のスクリーニングにおける高生産性
及びこの重要な受容体の構造解析ができるようになる。
なお、胎盤組織から分離される天然の受容体の収量は組
織１ｋｇ当たり約１〜２ｍｇである。
【００５０】本発明における方法で得られた組換え完全
長の、及び末端欠失型のαvβ3タンパク質のそれぞれの
純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＥＬＩＳＡによる検定にお
いて、９５〜９９％、好ましくは９７〜９９％である。
可溶性の組換え受容体では、完全鎖長の組換え受容体に
較べて阻害剤に対する感度が約４分の１である。末端欠
失型の可溶性受容体のもうひとつの長所は、界面活性剤
を使用せずに精製できることである。通常必要とされる
非イオン系界面活性剤は極めて高価である（例えば、オ
クチル−β−Ｄグリコーピラノシド１０ｇで５００ド
ル）。胎盤組織から３〜４ｍｇの受容体を溶解させるの
に必要な界面活性剤は約２５ｇである。
長の、及び末端欠失型のαvβ3タンパク質のそれぞれの
純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＥＬＩＳＡによる検定にお
いて、９５〜９９％、好ましくは９７〜９９％である。
可溶性の組換え受容体では、完全鎖長の組換え受容体に
較べて阻害剤に対する感度が約４分の１である。末端欠
失型の可溶性受容体のもうひとつの長所は、界面活性剤
を使用せずに精製できることである。通常必要とされる
非イオン系界面活性剤は極めて高価である（例えば、オ
クチル−β−Ｄグリコーピラノシド１０ｇで５００ド
ル）。胎盤組織から３〜４ｍｇの受容体を溶解させるの
に必要な界面活性剤は約２５ｇである。
【００５１】一方が完全鎖長で他方が末端欠失型のα鎖
とβ鎖［αv（ＦＬ）×β3（ＳＬ）またはαv（ＳＬ）
×β3（ＦＬ）］を有する組換えウイルスを共感染させ
た細胞は、ヘテロ二量体の受容体を細胞表面に発現す
る。しかし、α鎖とβ鎖が両方とも完全長であるか、あ
るいは、β鎖が完全長でα鎖が末端欠失型を含む細胞で
は、それがビトロネクチンに結合する時に形状変化が起
こる。この付着と拡張という細胞形態の変化がαvβ3の
特異的性質を示すことは、ＲＧＤ配列を含むペプチドの
添加がリガンドと天然受容体との相互作用を特異的にブ
ロックする一方で、ＲＧＥ配列またはＲＡＤ配列を含む
ペプチドの両方はこれらの相互作用をブッロクしない点
によって示される。完全鎖長のα鎖と末端欠失型のβ鎖
を有する細胞では拡張は見られない。
とβ鎖［αv（ＦＬ）×β3（ＳＬ）またはαv（ＳＬ）
×β3（ＦＬ）］を有する組換えウイルスを共感染させ
た細胞は、ヘテロ二量体の受容体を細胞表面に発現す
る。しかし、α鎖とβ鎖が両方とも完全長であるか、あ
るいは、β鎖が完全長でα鎖が末端欠失型を含む細胞で
は、それがビトロネクチンに結合する時に形状変化が起
こる。この付着と拡張という細胞形態の変化がαvβ3の
特異的性質を示すことは、ＲＧＤ配列を含むペプチドの
添加がリガンドと天然受容体との相互作用を特異的にブ
ロックする一方で、ＲＧＥ配列またはＲＡＤ配列を含む
ペプチドの両方はこれらの相互作用をブッロクしない点
によって示される。完全鎖長のα鎖と末端欠失型のβ鎖
を有する細胞では拡張は見られない。
【００５２】ＥＬＩＳＡの検定結果によれば、β3に特
異的な抗体ＡＰ３(Newman et al., 1985, Blood 65, 22
7)と、αvに特異的である抗体１７Ｅ６(Mitjans et a
l., 1995, J. Cell Science. 108, 2825)と、複合体に
特異的である抗体ＬＭ６０９(Cheresh and Spiro 1987,
J. Biol. Chem. 262, 1770323)は、完全鎖長の受容体
と末端欠失型の受容体の両方を特異的に認識する。この
ことは、組換えインテグリンが胎盤由来のαvβ3と同じ
エピトープをもっていることを示している。
異的な抗体ＡＰ３(Newman et al., 1985, Blood 65, 22
7)と、αvに特異的である抗体１７Ｅ６(Mitjans et a
l., 1995, J. Cell Science. 108, 2825)と、複合体に
特異的である抗体ＬＭ６０９(Cheresh and Spiro 1987,
J. Biol. Chem. 262, 1770323)は、完全鎖長の受容体
と末端欠失型の受容体の両方を特異的に認識する。この
ことは、組換えインテグリンが胎盤由来のαvβ3と同じ
エピトープをもっていることを示している。
【００５３】非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
において、αv−鎖およびβ3−鎖に典型的なバンドが現
れている。完全鎖長の組換えα鎖の分子量は胎盤由来の
完全鎖長のα鎖に較べて小さい（１６０ｋＤａに対して
約１４０ｋＤａ）が、これは、昆虫細胞におけるグリコ
シル化の度合いの減少か、またはグルコシル化の内容の
違いが起こっているためと考えられる。
において、αv−鎖およびβ3−鎖に典型的なバンドが現
れている。完全鎖長の組換えα鎖の分子量は胎盤由来の
完全鎖長のα鎖に較べて小さい（１６０ｋＤａに対して
約１４０ｋＤａ）が、これは、昆虫細胞におけるグリコ
シル化の度合いの減少か、またはグルコシル化の内容の
違いが起こっているためと考えられる。
【００５４】完全鎖長及び可溶性の組換えαvβ3受容体
は共に、リガンドであるビトロネクチン、フィブリノー
ゲン、フィブロネクチンに特異的に結合し、ビトロネク
チンの結合は、ＲＧＤを有するペプチドにより特異的に
阻害され、その場合の濃度依存性は胎盤由来の受容体と
同じである。
は共に、リガンドであるビトロネクチン、フィブリノー
ゲン、フィブロネクチンに特異的に結合し、ビトロネク
チンの結合は、ＲＧＤを有するペプチドにより特異的に
阻害され、その場合の濃度依存性は胎盤由来の受容体と
同じである。
【００５５】このように、完全鎖長、および、末端欠失
型のヒトαvβ3受容体に対するリガンドの結合特異性や
胎盤由来のものと同定度の飽和濃度が判明したことによ
り、労力を使わずに、ヒトの胎盤を使用することによる
リスクもなしに、バキュロウイルス昆虫細胞発現系を使
用して機能的な組換えαvβ3受容体を大規模生産するこ
とが可能となる。さらに、本発明で使用したバキュロウ
イルス発現系を使用すれば、修飾受容体やキメラ受容体
も発現させることも可能で、これらは、リガンドの結合
とそれに続くシグナル伝達機構の分子レベルでの研究に
有用なものとなる。
型のヒトαvβ3受容体に対するリガンドの結合特異性や
胎盤由来のものと同定度の飽和濃度が判明したことによ
り、労力を使わずに、ヒトの胎盤を使用することによる
リスクもなしに、バキュロウイルス昆虫細胞発現系を使
用して機能的な組換えαvβ3受容体を大規模生産するこ
とが可能となる。さらに、本発明で使用したバキュロウ
イルス発現系を使用すれば、修飾受容体やキメラ受容体
も発現させることも可能で、これらは、リガンドの結合
とそれに続くシグナル伝達機構の分子レベルでの研究に
有用なものとなる。
【００５６】
実施例１：組換え転送ベクターの構築 αvｐｃＤＮＡ-１Ｎｅｏ（Felding-Habermann 1992, J.
Clin. Invest., 89,2018）から、αvｃＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩ断片として切り出し、転送プラスミドｐＢａｃＰＡ
Ｋ８(Clontech社)に組み込んでクローニングを行った。
ここで作製された組換え体をαv（ＦＬ）（ｐＢａｃ
８）と名づけた。β3ｐｃＤＮＡ−１Ｎｅｏからインテ
グリンβ3ｃＤＮＡをＸｂａＩ断片として切り出し、転
送プラスミドｐＢａｃＰＡＫ９(Clontech社)に組み込ん
でクローニングした。膜貫通部分を欠失した末端欠失型
のαvｃＤＮＡとβ3ｃＤＮＡをＰｆｕ熱安定ＤＮＡポリ
メラーゼ(Stratragene社)を使用したポリメラーゼ鎖反
応（ＰＣＲ）により構築した。
Clin. Invest., 89,2018）から、αvｃＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩ断片として切り出し、転送プラスミドｐＢａｃＰＡ
Ｋ８(Clontech社)に組み込んでクローニングを行った。
ここで作製された組換え体をαv（ＦＬ）（ｐＢａｃ
８）と名づけた。β3ｐｃＤＮＡ−１Ｎｅｏからインテ
グリンβ3ｃＤＮＡをＸｂａＩ断片として切り出し、転
送プラスミドｐＢａｃＰＡＫ９(Clontech社)に組み込ん
でクローニングした。膜貫通部分を欠失した末端欠失型
のαvｃＤＮＡとβ3ｃＤＮＡをＰｆｕ熱安定ＤＮＡポリ
メラーゼ(Stratragene社)を使用したポリメラーゼ鎖反
応（ＰＣＲ）により構築した。
【００５７】成熟αv（シグナル配列を含む）の１〜９
８７番のアミノ酸をコードしている末端欠失型αvｃＤ
ＮＡを下記に示すオリゴヌクレチド・プライマーを用い
て作製した。
８７番のアミノ酸をコードしている末端欠失型αvｃＤ
ＮＡを下記に示すオリゴヌクレチド・プライマーを用い
て作製した。
【００５８】５’−ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＡＴ ＴＴＡ
ＣＡＧ ＴＧＡ−３’（前進プライマ、配列番号：１）
と、５’−ＣＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＡＧ ［ＡＣＴ］
ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡＴＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ−
３’［逆方向プライマ（配列番号：２）であり、９８７
番のアミノ酸をコードする配列に続いて翻訳終始コドン
（ＡＣＴ）を含み、この後にＸｂａＩ制限酵素切断部位
（下線部）がある。］。
ＣＡＧ ＴＧＡ−３’（前進プライマ、配列番号：１）
と、５’−ＣＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＡＧ ［ＡＣＴ］
ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡＴＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ−
３’［逆方向プライマ（配列番号：２）であり、９８７
番のアミノ酸をコードする配列に続いて翻訳終始コドン
（ＡＣＴ）を含み、この後にＸｂａＩ制限酵素切断部位
（下線部）がある。］。
【００５９】ＰＣＲ生成物を制限酵素Ｓａ１ＩとＸｂａ
Ｉで消化して、その断片をＳａ１Ｉ／ＸｂａＩで切断さ
れたαvｐｃＤＮＡ−１Ｎｅｏに組み込みクローニング
した。末端欠失型のαvｃＤＮＡをｐＢａｃＰＡＣ９の
ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断部位に組み込んでサブクロー
ニングをして、産生したクローンをαv（ＳＬ）（ｐＢ
ａｃ９）と名づけた。成熟β3（シグナル配列を含む）
の１〜７１８番のアミノ酸をコードしている末端欠失型
β3ｃＤＮＡを下記に示すオリゴヌクレチド・プライマ
ーを用いて作製した。
Ｉで消化して、その断片をＳａ１Ｉ／ＸｂａＩで切断さ
れたαvｐｃＤＮＡ−１Ｎｅｏに組み込みクローニング
した。末端欠失型のαvｃＤＮＡをｐＢａｃＰＡＣ９の
ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断部位に組み込んでサブクロー
ニングをして、産生したクローンをαv（ＳＬ）（ｐＢ
ａｃ９）と名づけた。成熟β3（シグナル配列を含む）
の１〜７１８番のアミノ酸をコードしている末端欠失型
β3ｃＤＮＡを下記に示すオリゴヌクレチド・プライマ
ーを用いて作製した。
【００６０】５’−ＧＣＧ ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＴＴ
ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ［ＡＴＧ］ ＣＧＡ ＧＣＧ
ＣＧＧ ＣＣＧ−３’［前進プライマー（配列番号：
３）であり、翻訳開始コドン（ＡＧＴ）とＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限酵素（下線部）を含む］と、５’−ＧＡＴ ＣＧ
Ａ ＴＣＴ ＡＧＡ ［ＣＴＡ］ ＧＧＴ ＣＡＧ Ｇ
ＧＣ ＣＣＴ ＴＧＧ ＧＡＣ ＡＣＴ−３’［逆方向
プライマ（配列番号：４）であり、７１８番のアミノ酸
をコードする配列に続いて翻訳終始コドン（ＣＴＡ）を
含み、この後にＸｂａＩ制限酵素切断部位（下線部）が
ある。］。
ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ［ＡＴＧ］ ＣＧＡ ＧＣＧ
ＣＧＧ ＣＣＧ−３’［前進プライマー（配列番号：
３）であり、翻訳開始コドン（ＡＧＴ）とＨｉｎｄＩＩ
Ｉ制限酵素（下線部）を含む］と、５’−ＧＡＴ ＣＧ
Ａ ＴＣＴ ＡＧＡ ［ＣＴＡ］ ＧＧＴ ＣＡＧ Ｇ
ＧＣ ＣＣＴ ＴＧＧ ＧＡＣ ＡＣＴ−３’［逆方向
プライマ（配列番号：４）であり、７１８番のアミノ酸
をコードする配列に続いて翻訳終始コドン（ＣＴＡ）を
含み、この後にＸｂａＩ制限酵素切断部位（下線部）が
ある。］。
【００６１】ＰＣＲ生成物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと
ＸｂａＩで切断して、その断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂ
ａＩで切断されたｐＳＫ＋(Stratagene社)に組み込んで
クローニングをした。産生したクローン[（β3（ＳＬ）
（ｐＳＫ＋）]をＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノーフラグメント（ベーリンガーマ
ンハイム社）で補充して末端平滑化を行った。平滑末端
を有する線状化プラスミドをＸｂａＩで消化して、その
断片をｐＢａｃＰＡＫ９のＳｍａＩ／ＸｂａＩ切断部位
に組み込んでサブクローニングをした。産生したクロー
ンをβ3（ＳＬ）（ｐＢａｃ９）と名づけた。αv（Ｓ
Ｌ）（ｐＢａｃ９）とβ3（ＳＬ）（ｐＢａｃ９）の両
方のＰＣＲ増幅部位のＤＮＡ塩基配列を確認して、その
構築物のすべてについて、正確なサイズのタンパク質が
発現されているかについて、ＴＮＴ−結合網状赤血球溶
解液システム（Coupled Reticulocyte Lysate System；
Promega社）を使用して、バクテリオファージＴ７プロ
モータでのin vitro転写と翻訳により試験した。 実施例２：組換えバキュロウイルスの作製 バキュロウイルスゲノムＤＮＡであるＢａｃＰＡＫ６(C
lontech)を高タイターのストックから入手して(Page an
d Murphy 1990: Methods in Molecular Biology, Human
a Press, Clifton, New Jersey, USA)、制限酵素Ｂｓｕ
３６Ｉ(Kitts and Possee 1993, Biotechniques 14, 81
0)で線状化した。完全鎖長及び末端欠失型のαvとβ3イ
ンテグリンを発現する組換えバキュロウイルスクローン
を、クローンテック社(Clontech)のＢａｃＰＡＫ製品プ
ロトコールに従って作製した。負の対照として使用する
ために、ｐＢａｃＰＡＫ９を転送プラスミドとして使用
して、組換えＤＮＡを含まないクローンを調製した。
ＸｂａＩで切断して、その断片をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂ
ａＩで切断されたｐＳＫ＋(Stratagene社)に組み込んで
クローニングをした。産生したクローン[（β3（ＳＬ）
（ｐＳＫ＋）]をＨｉｎｄＩＩＩで切断して、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノーフラグメント（ベーリンガーマ
ンハイム社）で補充して末端平滑化を行った。平滑末端
を有する線状化プラスミドをＸｂａＩで消化して、その
断片をｐＢａｃＰＡＫ９のＳｍａＩ／ＸｂａＩ切断部位
に組み込んでサブクローニングをした。産生したクロー
ンをβ3（ＳＬ）（ｐＢａｃ９）と名づけた。αv（Ｓ
Ｌ）（ｐＢａｃ９）とβ3（ＳＬ）（ｐＢａｃ９）の両
方のＰＣＲ増幅部位のＤＮＡ塩基配列を確認して、その
構築物のすべてについて、正確なサイズのタンパク質が
発現されているかについて、ＴＮＴ−結合網状赤血球溶
解液システム（Coupled Reticulocyte Lysate System；
Promega社）を使用して、バクテリオファージＴ７プロ
モータでのin vitro転写と翻訳により試験した。 実施例２：組換えバキュロウイルスの作製 バキュロウイルスゲノムＤＮＡであるＢａｃＰＡＫ６(C
lontech)を高タイターのストックから入手して(Page an
d Murphy 1990: Methods in Molecular Biology, Human
a Press, Clifton, New Jersey, USA)、制限酵素Ｂｓｕ
３６Ｉ(Kitts and Possee 1993, Biotechniques 14, 81
0)で線状化した。完全鎖長及び末端欠失型のαvとβ3イ
ンテグリンを発現する組換えバキュロウイルスクローン
を、クローンテック社(Clontech)のＢａｃＰＡＫ製品プ
ロトコールに従って作製した。負の対照として使用する
ために、ｐＢａｃＰＡＫ９を転送プラスミドとして使用
して、組換えＤＮＡを含まないクローンを調製した。
【００６２】正確に組換えられたウイルスクローンが産
生されていることをＰＣＲで増幅させて確認し、そのウ
イルスをＳＦ９細胞に感染させた(O'Reilly at al., 19
92,バキュロウイルス発現ベクター；実験マニュアル, O
xford University Press Inc, New York)。 実施例３：ＳＦ９細胞に発現されたタンパク質の代謝パ
ルス標識。
生されていることをＰＣＲで増幅させて確認し、そのウ
イルスをＳＦ９細胞に感染させた(O'Reilly at al., 19
92,バキュロウイルス発現ベクター；実験マニュアル, O
xford University Press Inc, New York)。 実施例３：ＳＦ９細胞に発現されたタンパク質の代謝パ
ルス標識。
【００６３】文献記載の方法で、ＳＦ９細胞の代謝パル
ス標識検出を実施した(Summer andSmith 1987:「バキュ
ロウイルスと昆虫細胞の取扱いマニュアル」、Texas Ag
ricultural Experiment Station Bulletin B-1555)。指
定に応じて、代謝パルス標識を行う前と行っている間の
１６時間にわたって、濃度１０μｇ／ｍｌのツニカマイ
シン（シグマ）を反応させた。細胞は１００μｌの緩衝
液[1% Nonidet(商標) P-40, 1 mM CaCl2, 150 mM NaCl,
0.4 mM Pefabloc(商標)(Boehringer Mannheim社), 10
μg/ml Leupeptin及びE64(sigma), 10 mM Tris/HCl; pH
7.4; NonidetP-40は界面活性剤であり、Pefabloc(商標)
は、プロテアーゼ阻害剤である）] 中で溶菌させた。菌
溶解液をエッペンドルフマイクロヒュージにより１４０
０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、還元条件下
で、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動
で分離した。その後、固定化させ、乾燥してオートラジ
オグラフィを実施した (Sambrook et al., 1989:「分子
クローニング：実験マニュアル」、Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。 実施例４：昆虫細胞でのタンパク質の発現 組換えタンパク質が、Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞により、
単分子層または懸濁液の状態で発現された。αvを発現
する組換えバキュロウイルスと、β3を発現する組換え
バキュロウイルスの両方を、培地を最小の量にして、静
かに撹拌しながら同時感染させた。この時の、それぞれ
の感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）は５〜２０（１個の細胞に
対して５〜２０のウイルスＤＮＡを感染させる）であっ
た。２時間後に、細胞だけを新鮮なＥｘｐｒｅｓｓ・Ｆ
ｉｖｅ培地に移して２７℃で、４８〜６４時間インキュ
ベートした。膜に結合している組換えインテグリンを分
離するために、遠心分離（１０００×ｇ，１０分）を行
い、細胞を収集し細胞ペレットとして使用した。可溶性
組換えインテグリンを分離するために、細胞を除去した
上清を使用した。 実施例５：免疫沈降法 Ａｆｆｉｇｅｌ（商標）ビーズ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）(Mit
jans et al., 1995, J. Cell Sci.108, 2825)に結合し
たαvβ3複合体の細胞外ドメインを認識するモノクロー
ナル抗体ＬＭ６０９を使用して、表面ビオチン化細胞の
抽出液と細胞で調整した培地（cell conditioned mediu
m）での免疫沈降検出法を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
とHybond-PVDF膜(Towbin et al., 1979, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 76, 4350)上でのウエスタンブロット法
を実施した後、メーカよりの指示書に従ってＥＣＬウエ
スタンブロット検出試薬(Amersham社)を用いた強化化学
ルミネセンス法を行ってビトチン化タンパク質の検出を
行った。 実施例６：細胞の形態変化の検討 ＳＦ９細胞（１×１０6菌／ウエル）を６枚のウエル・
プレート上にそのままか、あるいは、精製ヒト血漿ビト
ロネクチン（ＰＢＳ中濃度５μｇ／ｍｌ；２時間）をコ
ーティングしたプレート上に固定し、非特異的部位をブ
ロックした（ＰＢＳ中濃度３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を使
用）。その後、種々の組み合わせでウイルスを感染させ
た。感染をさせた後４８時間、細胞形態に変化がないか
観察した。指定に応じて、培地に１０μＭ環状ペプチド
をαvインテグリン−リガンド相互作用 [環状（ＲＧＤ
ｆＶ）、環状（ＲβＡＤｆＶ）または環状（ＲＧＥｆ
Ｖ）（ここで小文字はＤ−アミノ酸）]の競争的阻害剤
として添加した。 実施例７：組換えインテグリンの精製 完全鎖長のαvβ3を発現するＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞を
収集して、ＰＢＳで洗浄して、氷冷した細胞溶解用緩衝
液（１００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、
１ｍＭＣａＣｌ2、２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ（商
標）、ｐＨ７．４、ＰＢＳ中）を用いて、４℃で１時間
溶解させた。この細胞溶解液を遠心分離（１０、０００
×ｇ、４５分、４℃）して、その上澄みを、細胞溶解用
緩衝液で事前平衡化させてある、１７Ｅ６抗体使用のア
フィニティクロマトグラフィ・カラムの中を４℃で１昼
夜再循環させた。洗浄後（ベッド容量２０ｍｌ、２×１
０ｃｍカラム、５０ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グル
コシド、２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、２ｍＭ ＣａＣｌ
2、ｐＨ７．４、ＰＢＳ溶液）、結合タンパク質を溶出
させ（５０ｍＭ ＯＧ、２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、２
ｍＭ ＣａＣｌ2、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ
３．１）、その溶出液を２８０ｎｍでモニターをして、
分画を直ちに中和した（１：５０容量３Ｍ トリス／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．８）。ピーク分画をプールして透析（１
０ｍＭ ＯＧ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４、ＰＢ
Ｓ溶液）して濃縮し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析
した。その一部（タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌ）を−
８０℃で保存した。ＢＣＡタンパク質分析法（Ｐｉｅｒ
ｃｅ）により、ＢＳＡ標準液に対するタンパク質濃度を
測定した。感染したＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞の培養上清
（無細胞培地）を、１７Ｅ６抗体使用のアフィニティク
ロマトグラフィ・カラムの中を再循環させることによ
り、可溶性末端欠失型組換えαvβ3の精製を行った。洗
浄、溶出、測定については、緩衝液に界面活性剤を含ま
ない点を除いて、完全鎖長のαvβ3で説明した通りであ
る。精製受容体のＥＬＩＳＡ検出には、ヤギ−抗マウス
ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ接合体（ＢＩＯ−ＲＡＤ）と
３， ３’，５，５’−テトラメチルベンジジン−ジヒ
ドロクロリド（シグマ）を基質として使用した。 実施例８：可溶性で膜貫通部分を完全長で有するαvβ3
受容体の精製は、ＬＭ６０９抗体使用のアフィニティク
ロマトグラフィ・カラムを使用して行われた。 実施例９：抗体アフィニティクロマトグラフィ・カラム
の作製 支持マトリックス（Ａｆｆｉｇｅｌ（商標）、ＢＩＯＲ
ＡＤ）を５００ｍｌ冷却ＰＢＳにて洗浄した。精製抗体
を、循環回転状態で、支持マトリックス（５ｍｇ／ｍｌ
ゲル）と一緒に約１２時間インキュベートした。上澄み
を取り除いて、その後、マトリックス上で引き続き活性
を示しているものを０．１Ｍエタノールアミンで遮断し
た。支持マトリックスを０．０１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で交
互に洗浄してから直接使用した。 実施例１０：インテグリンリガンド結合、競争的アッセ
イ；リガンドと抗体のビオチン化 タンパク質のＰＢＳ溶液を５倍濃縮の結合用緩衝液（５
００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ ＮａＨＣＯ3）で１
ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した。 作製したば
かりのＮ−ハイドロキシスクシンイミドビオチン（シグ
マ）[1 mg/ml DMSO溶液]を、０．１ｍｇ／ｍｌのタンパ
ク質溶液に添加して、２０℃で２時間インキュベートし
た。透析（ＰＢＳ、０．０２５％ＮａＮ3）後、タンパ
ク質濃度を測定した。ビオチン化したタンパク質を４℃
で保存した。
ス標識検出を実施した(Summer andSmith 1987:「バキュ
ロウイルスと昆虫細胞の取扱いマニュアル」、Texas Ag
ricultural Experiment Station Bulletin B-1555)。指
定に応じて、代謝パルス標識を行う前と行っている間の
１６時間にわたって、濃度１０μｇ／ｍｌのツニカマイ
シン（シグマ）を反応させた。細胞は１００μｌの緩衝
液[1% Nonidet(商標) P-40, 1 mM CaCl2, 150 mM NaCl,
0.4 mM Pefabloc(商標)(Boehringer Mannheim社), 10
μg/ml Leupeptin及びE64(sigma), 10 mM Tris/HCl; pH
7.4; NonidetP-40は界面活性剤であり、Pefabloc(商標)
は、プロテアーゼ阻害剤である）] 中で溶菌させた。菌
溶解液をエッペンドルフマイクロヒュージにより１４０
０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、還元条件下
で、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動
で分離した。その後、固定化させ、乾燥してオートラジ
オグラフィを実施した (Sambrook et al., 1989:「分子
クローニング：実験マニュアル」、Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。 実施例４：昆虫細胞でのタンパク質の発現 組換えタンパク質が、Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞により、
単分子層または懸濁液の状態で発現された。αvを発現
する組換えバキュロウイルスと、β3を発現する組換え
バキュロウイルスの両方を、培地を最小の量にして、静
かに撹拌しながら同時感染させた。この時の、それぞれ
の感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）は５〜２０（１個の細胞に
対して５〜２０のウイルスＤＮＡを感染させる）であっ
た。２時間後に、細胞だけを新鮮なＥｘｐｒｅｓｓ・Ｆ
ｉｖｅ培地に移して２７℃で、４８〜６４時間インキュ
ベートした。膜に結合している組換えインテグリンを分
離するために、遠心分離（１０００×ｇ，１０分）を行
い、細胞を収集し細胞ペレットとして使用した。可溶性
組換えインテグリンを分離するために、細胞を除去した
上清を使用した。 実施例５：免疫沈降法 Ａｆｆｉｇｅｌ（商標）ビーズ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）(Mit
jans et al., 1995, J. Cell Sci.108, 2825)に結合し
たαvβ3複合体の細胞外ドメインを認識するモノクロー
ナル抗体ＬＭ６０９を使用して、表面ビオチン化細胞の
抽出液と細胞で調整した培地（cell conditioned mediu
m）での免疫沈降検出法を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
とHybond-PVDF膜(Towbin et al., 1979, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 76, 4350)上でのウエスタンブロット法
を実施した後、メーカよりの指示書に従ってＥＣＬウエ
スタンブロット検出試薬(Amersham社)を用いた強化化学
ルミネセンス法を行ってビトチン化タンパク質の検出を
行った。 実施例６：細胞の形態変化の検討 ＳＦ９細胞（１×１０6菌／ウエル）を６枚のウエル・
プレート上にそのままか、あるいは、精製ヒト血漿ビト
ロネクチン（ＰＢＳ中濃度５μｇ／ｍｌ；２時間）をコ
ーティングしたプレート上に固定し、非特異的部位をブ
ロックした（ＰＢＳ中濃度３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を使
用）。その後、種々の組み合わせでウイルスを感染させ
た。感染をさせた後４８時間、細胞形態に変化がないか
観察した。指定に応じて、培地に１０μＭ環状ペプチド
をαvインテグリン−リガンド相互作用 [環状（ＲＧＤ
ｆＶ）、環状（ＲβＡＤｆＶ）または環状（ＲＧＥｆ
Ｖ）（ここで小文字はＤ−アミノ酸）]の競争的阻害剤
として添加した。 実施例７：組換えインテグリンの精製 完全鎖長のαvβ3を発現するＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞を
収集して、ＰＢＳで洗浄して、氷冷した細胞溶解用緩衝
液（１００ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、
１ｍＭＣａＣｌ2、２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ（商
標）、ｐＨ７．４、ＰＢＳ中）を用いて、４℃で１時間
溶解させた。この細胞溶解液を遠心分離（１０、０００
×ｇ、４５分、４℃）して、その上澄みを、細胞溶解用
緩衝液で事前平衡化させてある、１７Ｅ６抗体使用のア
フィニティクロマトグラフィ・カラムの中を４℃で１昼
夜再循環させた。洗浄後（ベッド容量２０ｍｌ、２×１
０ｃｍカラム、５０ｍＭ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グル
コシド、２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、２ｍＭ ＣａＣｌ
2、ｐＨ７．４、ＰＢＳ溶液）、結合タンパク質を溶出
させ（５０ｍＭ ＯＧ、２ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、２
ｍＭ ＣａＣｌ2、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ
３．１）、その溶出液を２８０ｎｍでモニターをして、
分画を直ちに中和した（１：５０容量３Ｍ トリス／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．８）。ピーク分画をプールして透析（１
０ｍＭ ＯＧ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４、ＰＢ
Ｓ溶液）して濃縮し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析
した。その一部（タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌ）を−
８０℃で保存した。ＢＣＡタンパク質分析法（Ｐｉｅｒ
ｃｅ）により、ＢＳＡ標準液に対するタンパク質濃度を
測定した。感染したＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ細胞の培養上清
（無細胞培地）を、１７Ｅ６抗体使用のアフィニティク
ロマトグラフィ・カラムの中を再循環させることによ
り、可溶性末端欠失型組換えαvβ3の精製を行った。洗
浄、溶出、測定については、緩衝液に界面活性剤を含ま
ない点を除いて、完全鎖長のαvβ3で説明した通りであ
る。精製受容体のＥＬＩＳＡ検出には、ヤギ−抗マウス
ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ接合体（ＢＩＯ−ＲＡＤ）と
３， ３’，５，５’−テトラメチルベンジジン−ジヒ
ドロクロリド（シグマ）を基質として使用した。 実施例８：可溶性で膜貫通部分を完全長で有するαvβ3
受容体の精製は、ＬＭ６０９抗体使用のアフィニティク
ロマトグラフィ・カラムを使用して行われた。 実施例９：抗体アフィニティクロマトグラフィ・カラム
の作製 支持マトリックス（Ａｆｆｉｇｅｌ（商標）、ＢＩＯＲ
ＡＤ）を５００ｍｌ冷却ＰＢＳにて洗浄した。精製抗体
を、循環回転状態で、支持マトリックス（５ｍｇ／ｍｌ
ゲル）と一緒に約１２時間インキュベートした。上澄み
を取り除いて、その後、マトリックス上で引き続き活性
を示しているものを０．１Ｍエタノールアミンで遮断し
た。支持マトリックスを０．０１Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で交
互に洗浄してから直接使用した。 実施例１０：インテグリンリガンド結合、競争的アッセ
イ；リガンドと抗体のビオチン化 タンパク質のＰＢＳ溶液を５倍濃縮の結合用緩衝液（５
００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ ＮａＨＣＯ3）で１
ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した。 作製したば
かりのＮ−ハイドロキシスクシンイミドビオチン（シグ
マ）[1 mg/ml DMSO溶液]を、０．１ｍｇ／ｍｌのタンパ
ク質溶液に添加して、２０℃で２時間インキュベートし
た。透析（ＰＢＳ、０．０２５％ＮａＮ3）後、タンパ
ク質濃度を測定した。ビオチン化したタンパク質を４℃
で保存した。
【００６４】リガンド結合分析：インテグリンをコーテ
ィング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０μＭ ＭｎＣｌ2、２０
ｍＭトリス／ＨＣＬ；ｐＨ７．４）で、濃度が１μｇ／
ｍｌになるように希釈して、その１００μｌを９６ウエ
ルマイクロタイタープレートに１昼夜４℃で吸着させ
た。プレートを一度に結合緩衝液（コート用緩衝液に
０．１％(w/v)ＢＳＡを含む）で洗浄して、ブロッキン
グ用緩衝液（３％(w/v)ＢＳＡを含むコート用緩衝液）
で３７℃で２時間ブロックした。結合用緩衝液で洗浄し
た後、連続的に希釈ビオチン化リガンドを添加した。こ
れを、インキュベート（３時間、３７℃）をした後、結
合していないリガンドを結合緩衝液で洗い流し、結合し
たビオチンを抗ビオチン−アルカリフォスファターゼ接
合抗体とインキュベートしてこれを検出して、さらに、
ｐ−ニトロフェニル リン酸（ＢＩＯ−ＲＡＤ）基質を
使用して結合抗体を定量した。 実施例１１：インテグリンリガンド結合、競争的アッセ
イ 競争的アッセイ：インテグリンを前述の方法で固定化し
た。連続的に希釈した環状ペプチドをビオチン化ビトロ
ネクチン（１μｇ／ｍｌ）と並行して添加した。３７℃
で３時間インキュベートした後、上記と同じように、結
合リガンドを検出した。３重アッセイを数回繰り返し
た。
ィング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣ
ｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０μＭ ＭｎＣｌ2、２０
ｍＭトリス／ＨＣＬ；ｐＨ７．４）で、濃度が１μｇ／
ｍｌになるように希釈して、その１００μｌを９６ウエ
ルマイクロタイタープレートに１昼夜４℃で吸着させ
た。プレートを一度に結合緩衝液（コート用緩衝液に
０．１％(w/v)ＢＳＡを含む）で洗浄して、ブロッキン
グ用緩衝液（３％(w/v)ＢＳＡを含むコート用緩衝液）
で３７℃で２時間ブロックした。結合用緩衝液で洗浄し
た後、連続的に希釈ビオチン化リガンドを添加した。こ
れを、インキュベート（３時間、３７℃）をした後、結
合していないリガンドを結合緩衝液で洗い流し、結合し
たビオチンを抗ビオチン−アルカリフォスファターゼ接
合抗体とインキュベートしてこれを検出して、さらに、
ｐ−ニトロフェニル リン酸（ＢＩＯ−ＲＡＤ）基質を
使用して結合抗体を定量した。 実施例１１：インテグリンリガンド結合、競争的アッセ
イ 競争的アッセイ：インテグリンを前述の方法で固定化し
た。連続的に希釈した環状ペプチドをビオチン化ビトロ
ネクチン（１μｇ／ｍｌ）と並行して添加した。３７℃
で３時間インキュベートした後、上記と同じように、結
合リガンドを検出した。３重アッセイを数回繰り返し
た。
【００６５】
配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー 配列 GACCAGCATT TACAGTGA 18 配列番号：２ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー 配列 CACAGGTCTA GACTATGGCT GAATGCCCCA GG 32 配列番号：３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー 配列 GCGCGCAAGC TTGCCGCCAC CATGCGAGCG CGGCCG 36 配列番号：４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＰＣＲ用プライマー 配列 GATCGATCTA GACTAGGTCA GGGCCCTTGG GACACT 36
【図１】二量体のαvβ3受容体を図式化したものであ
り、末端欠失のためのαv鎖の切断部位とβ3鎖の切断部
位が示されている。αv鎖は、通常、翻訳後開裂が起こ
り、重鎖（αvｈｃ）と軽鎖（αvｌｃ）に分かれ、その
後、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）架橋により結合される。Ｅ
Ｃ：細胞外、ＰＭ：細胞膜、ＩＣ：細胞内、ＩＡＣ：イ
ンテグリンと結合している細胞質骨格、Ｌｉｇ：リガン
ド。
り、末端欠失のためのαv鎖の切断部位とβ3鎖の切断部
位が示されている。αv鎖は、通常、翻訳後開裂が起こ
り、重鎖（αvｈｃ）と軽鎖（αvｌｃ）に分かれ、その
後、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）架橋により結合される。Ｅ
Ｃ：細胞外、ＰＭ：細胞膜、ＩＣ：細胞内、ＩＡＣ：イ
ンテグリンと結合している細胞質骨格、Ｌｉｇ：リガン
ド。
【図２】（Ａ）疑似感染させたＳＦ９細胞（１列目）と
組換え体を含まないウイルスを感染させたＳＦ９細胞
（２列目）、αv（ＦＬ）を含むウイルスを感染させた
Ｓｆ９細胞（３列目）またはβ3（ＦＬ）を含むウイル
スを感染させたＳＦ９細胞（４列）を、35Ｓ標識アミノ
酸を使用して２時間の代謝標識を行い、感染後４０時間
で結果を見たものである。細胞抽出物は、還元条件下、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。右側に標準標識タ
ンパク質の分子量をｋＤＡとして表示している。 （Ｂ）αv（ＦＬ）（１、２列目）、αv（ＳＬ）（３、
４列目）、β3（ＦＬ）（５、６列目）、β3（ＳＬ）
（７、８列目）を感染させたＳＦ９細胞を、１０μＭツ
ニカマイシンのＤＭＳＯ溶液で処理するか（１、３、
５、７列）、あるいは、ＤＭＳＯだけで処理した場合
（２、４、６、８列）の結果を示している。感染細胞を
上記と同じように代謝パルス標識した。標準標識タンパ
ク質を右に示している。
組換え体を含まないウイルスを感染させたＳＦ９細胞
（２列目）、αv（ＦＬ）を含むウイルスを感染させた
Ｓｆ９細胞（３列目）またはβ3（ＦＬ）を含むウイル
スを感染させたＳＦ９細胞（４列）を、35Ｓ標識アミノ
酸を使用して２時間の代謝標識を行い、感染後４０時間
で結果を見たものである。細胞抽出物は、還元条件下、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。右側に標準標識タ
ンパク質の分子量をｋＤＡとして表示している。 （Ｂ）αv（ＦＬ）（１、２列目）、αv（ＳＬ）（３、
４列目）、β3（ＦＬ）（５、６列目）、β3（ＳＬ）
（７、８列目）を感染させたＳＦ９細胞を、１０μＭツ
ニカマイシンのＤＭＳＯ溶液で処理するか（１、３、
５、７列）、あるいは、ＤＭＳＯだけで処理した場合
（２、４、６、８列）の結果を示している。感染細胞を
上記と同じように代謝パルス標識した。標準標識タンパ
ク質を右に示している。
【図３】同時感染をさせた後の細胞形態の変化を示した
ものである。組換えタンパク質を含まないウイルス
（Ａ）、αv（ＦＬ）＋β3（ＦＬ）を含むウイルス
（Ｂ）、αv（ＳＬ）＋β3（ＳＬ）を含むウイルス
（Ｃ）をそれぞれ感染させたＳＦ９を感染後４８時間目
に位相差顕微鏡で見たものである。
ものである。組換えタンパク質を含まないウイルス
（Ａ）、αv（ＦＬ）＋β3（ＦＬ）を含むウイルス
（Ｂ）、αv（ＳＬ）＋β3（ＳＬ）を含むウイルス
（Ｃ）をそれぞれ感染させたＳＦ９を感染後４８時間目
に位相差顕微鏡で見たものである。
【図４】細胞表面と可溶性αvβ3との免疫沈降法分析の
結果である。αv(ＦＬ)＋β3(ＦＬ)を含むウイルス
（１、６列）、αv(ＦＬ)＋β3(ＳＬ)を含むウイルス
（２、７列）、αv(ＳＬ)＋β3(ＦＬ)を含むウイルス
（３、８列）、αv(ＳＬ)＋β3(ＳＬ)を含むウイルス
（４、９列）または組換えタンパク質を含まないウイル
ス（５、１０列）を同時感染させたＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ
細胞から調製した細胞抽出物（１〜５列）と細胞で調整
した培地（ｃｅｌｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄ
ｉｕｍ）（６〜１０列）を使用した。αvβ3複合体をモ
ノクローナル抗体ＬＭ６０９を使用して免疫沈降させ、
非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ＰＶＤＦ
膜に移し、ストレプトアジビン−ＨＲＰ接合体で標識検
出した結果である。
結果である。αv(ＦＬ)＋β3(ＦＬ)を含むウイルス
（１、６列）、αv(ＦＬ)＋β3(ＳＬ)を含むウイルス
（２、７列）、αv(ＳＬ)＋β3(ＦＬ)を含むウイルス
（３、８列）、αv(ＳＬ)＋β3(ＳＬ)を含むウイルス
（４、９列）または組換えタンパク質を含まないウイル
ス（５、１０列）を同時感染させたＨｉｇｈ・Ｆｉｖｅ
細胞から調製した細胞抽出物（１〜５列）と細胞で調整
した培地（ｃｅｌｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄ
ｉｕｍ）（６〜１０列）を使用した。αvβ3複合体をモ
ノクローナル抗体ＬＭ６０９を使用して免疫沈降させ、
非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ＰＶＤＦ
膜に移し、ストレプトアジビン−ＨＲＰ接合体で標識検
出した結果である。
【図５】精製受容体の分析結果である。各種のモノクロ
ーナル抗体を使用して、精製完全鎖長の、および末端欠
失型のαvβ3のエピトープと純度が分析された。受容体
濃度を増加させながら固定化させて、抗体ＬＭ６０９
（抗−αvβ3抗体）、１７Ｅ６（抗−αv抗体）、ＡＰ
３（抗−β3抗体）、Ｐ４Ｃ１０（抗−β1抗体）、Ｐ１
Ｆ６（抗−αvβ5抗体）を反応させて分析した。縦軸
は、４５０ｎｍでの吸光度。横軸：コートされた受容体
濃度（μｇ／ｍｌ）。（○）胎盤由来αvβ3、（■）α
v（ＦＬ）＋β3（ＦＬ）、（◆）αv（ＳＬ）＋β3（Ｓ
Ｌ）。
ーナル抗体を使用して、精製完全鎖長の、および末端欠
失型のαvβ3のエピトープと純度が分析された。受容体
濃度を増加させながら固定化させて、抗体ＬＭ６０９
（抗−αvβ3抗体）、１７Ｅ６（抗−αv抗体）、ＡＰ
３（抗−β3抗体）、Ｐ４Ｃ１０（抗−β1抗体）、Ｐ１
Ｆ６（抗−αvβ5抗体）を反応させて分析した。縦軸
は、４５０ｎｍでの吸光度。横軸：コートされた受容体
濃度（μｇ／ｍｌ）。（○）胎盤由来αvβ3、（■）α
v（ＦＬ）＋β3（ＦＬ）、（◆）αv（ＳＬ）＋β3（Ｓ
Ｌ）。
【図６】精製受容体の分析を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よる精製受容体の分析である。１、５列：ＨＭＷ、２、
６列：胎盤由来αvβ3、３、７列：αv(ＦＬ)×β3(Ｆ
Ｌ)、４、８列：αv(ＳＬ)×β3(ＳＬ)。１、３、５、
７列：非還元条件下。２、４、６、８：還元条件下。
よる精製受容体の分析である。１、５列：ＨＭＷ、２、
６列：胎盤由来αvβ3、３、７列：αv(ＦＬ)×β3(Ｆ
Ｌ)、４、８列：αv(ＳＬ)×β3(ＳＬ)。１、３、５、
７列：非還元条件下。２、４、６、８：還元条件下。
【図７】精製組換えαvβ3の活性試験結果である。固定
化受容体へのリガンド結合を示す。ビオチン化ビトロネ
クチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチンを固定化
した受容体に結合させた。結合したリガンドを抗−ビオ
チン抗体で検出した。縦軸：吸光度（４０５ｎｍ）で示
したリガンド結合。横軸：ビトロネクチン、フィブリノ
ーゲン、フィブロネクチンの濃度（μｇ／ｍｌ）。
（○）胎盤由来αvβ3、（■）αv(ＦＬ)＋β3(ＦＬ)、
（◆）αvΔ(ＳＬ)＋β3Δ(ＳＬ)。
化受容体へのリガンド結合を示す。ビオチン化ビトロネ
クチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチンを固定化
した受容体に結合させた。結合したリガンドを抗−ビオ
チン抗体で検出した。縦軸：吸光度（４０５ｎｍ）で示
したリガンド結合。横軸：ビトロネクチン、フィブリノ
ーゲン、フィブロネクチンの濃度（μｇ／ｍｌ）。
（○）胎盤由来αvβ3、（■）αv(ＦＬ)＋β3(ＦＬ)、
（◆）αvΔ(ＳＬ)＋β3Δ(ＳＬ)。
【図８】異なる受容体とビトロネクチンの結合に対する
ＲＧＤペプチドの作用を示すものである。図に示した数
種のペプチドの濃度を上げながら、ビオチン化ビトロネ
クチンをインキュベートした。縦軸：ビトロネクチンの
結合率（％）、横軸：ペプチド濃度。（●）胎盤由来α
vβ3、（■）末端欠失型組換えαvβ3（第１調製）、
（▲）末端欠失型組換えαvβ3（第２調製）。
ＲＧＤペプチドの作用を示すものである。図に示した数
種のペプチドの濃度を上げながら、ビオチン化ビトロネ
クチンをインキュベートした。縦軸：ビトロネクチンの
結合率（％）、横軸：ペプチド濃度。（●）胎盤由来α
vβ3、（■）末端欠失型組換えαvβ3（第１調製）、
（▲）末端欠失型組換えαvβ3（第２調製）。
【図９】異なる受容体とビトロネクチンの結合に対する
ＲＧＤペプチドの作用を示すものである。図に示した数
種のペプチドの濃度を上げながら、ビオチン化ビトロネ
クチンをインキュベートした。縦軸：ビトロネクチンの
結合率（％）、横軸：ペプチド濃度。（●）胎盤由来α
vβ3、（■）末端欠失型組換えαvβ3（第１調製）、
（▲）末端欠失型組換えαvβ3（第２調製）。
ＲＧＤペプチドの作用を示すものである。図に示した数
種のペプチドの濃度を上げながら、ビオチン化ビトロネ
クチンをインキュベートした。縦軸：ビトロネクチンの
結合率（％）、横軸：ペプチド濃度。（●）胎盤由来α
vβ3、（■）末端欠失型組換えαvβ3（第１調製）、
（▲）末端欠失型組換えαvβ3（第２調製）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 591032596 Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． 250, Ｄ−64293 Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄ ｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅ ｒｍａｎｙ (72)発明者 ベェート ディーフェンバッハ ドイツ連邦共和国 デー−64271 ダルム シュタット メルク カーゲーアーアー内 (72)発明者 デテレフ ギュソウ ドイツ連邦共和国 デー−64271 ダルム シュタット メルク カーゲーアーアー内 (72)発明者 ラーヨ メーター ドイツ連邦共和国 デー−64271 ダルム シュタット メルク カーゲーアーアー内 (72)発明者 エイリシュ クーレン ドイツ連邦共和国 デー−64271 ダルム シュタット メルク カーゲーアーアー内 (72)発明者 アレックス ブロウン ドイツ連邦共和国 デー−64271 ダルム シュタット メルク カーゲーアーアー内
Claims (18)
- 【請求項１】 リガンド結合活性が損なわれていない、
実質的に精製された可溶性組換えαvβ3付着受容体。 - 【請求項２】 ヒトαvβ3付着受容体である請求項１に
記載の付着受容体。 - 【請求項３】 αv鎖とβ3鎖とを有し、これらの鎖のそ
れぞれが、そのＣ末端が、膜通過ドメインを含む部分、
またはこの膜通過ドメインを含む部分と全細胞質ドメイ
ンとを含む部分の分だけ短縮されている請求項２に記載
の受容体。 - 【請求項４】 対応する成熟タンパク質鎖のＮ末端から
数えた場合に、約９５７個のアミノ酸を含む末端欠失の
αv鎖と、約６９２個のアミノ酸を含む末端欠失のβ3鎖
とを有する請求項３に記載の受容体。 - 【請求項５】 請求項７に記載の方法により得られるヒ
トαvβ3付着受容体。 - 【請求項６】 非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＡによ
り測定した場合に、末端欠失のαv鎖の分子量が１２０
ｋＤａ（±１２ｋＤａ）であり、末端欠失のβ3鎖の分
子量が約８０ｋＤａ（±８ｋＤａ）である請求項１２に
記載の受容体。 - 【請求項７】 リガンド結合活性が損なわれていない、
高純度に精製された可溶性ヒト組換えαvβ3付着受容体
を高収率で調製する方法であって、 （ｉ）Ｃ末端から少なくとも５２個のアミノ酸を含む部
分の分だけ鎖長が短くなった前記受容体のαv鎖をコー
ドする第１のｃＤＮＡと、Ｃ末端から少なくとも６１個
のアミノ酸を含む部分だけ鎖長が短くなった前記受容体
のβ3鎖をコードする第２のｃＤＮＡを、バキュロウイ
ルス発現系のバキュロウイルス転送用ベクターに組み込
んで、サブクローニングを行い、 （ｉｉ）前記第１及び／または第２のＤＮＡを含むベク
ターを、前記発現系のバキュロウイルスのゲノムＤＮＡ
に移入させ、 （ｉｉｉ）前記完全な組換えバキュロウイルスで昆虫細
胞を感染させ、 （ｉｖ）前記感染昆虫細胞を培地で培養して、ヘテロ二
量体の末端欠失型αvβ3受容体を該培地中に発現させ、 （ｖ）発現した受容体を、ヒトαvβ3付着受容体または
その個別の構成鎖に特異的に結合する抗体を使った抗体
アフィニティクロマトグラフィにより培地から精製する
ことを特徴とする付着受容体の調製方法。 - 【請求項８】 前記第１、第２のｃＤＮＡを同じバキュ
ロウイルスベクターに組み込んでサブクローニングする
請求項７に記載の調製方法。 - 【請求項９】 バキュロウイルス発現系がＢａｃＰＡＫ
システムである請求項７に記載の調製方法。 - 【請求項１０】 感染用の昆虫細胞が、ハイ ファイヴ
（Ｈｉｇｈ・Ｆｉｖｅ）（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）
細胞である請求項７に記載の調整方法。 - 【請求項１１】 抗体アフィニティクロマトグラフィに
使用される特異的抗体が、登録番号が２７２−１７Ｅ６
（ＤＳＭ ＡＣＣ２１６０）であるハイブリドーマ細胞
株で産生されたｍＡｂ １７Ｅ６である請求項７に記載
の調製方法。 - 【請求項１２】 第１のｃＤＮＡが、Ｃ末端から数えて
約６１個のアミノ酸を含む部分の分だけ鎖長が短くなっ
ている前記受容体のαv鎖（成熟なタンパク質であれば
約９５７個のアミノ酸を含む鎖に相当）をコードするた
めに使用され、第２のｃＤＮＡがＣ末端から数えて約７
０個のアミノ酸を含む部分の分だけ鎖長が短くなってい
る前記受容体のβ3鎖（成熟なタンパク質であれば約６
９２個のアミノ酸を含む鎖に相当）をコードするために
使用される請求項７に記載の調製方法。 - 【請求項１３】 末端欠失型αv鎖をコードするｃＤＮ
Ａが、オリゴヌクレチドである、５’−ＧＡＣ ＣＡＧ
ＣＡＴ ＴＴＡ ＣＡＧ ＴＧＡ−３’（配列番号：
１）と、５’−ＣＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＣＴ
ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＴＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ−
３’（配列番号：２）をプライマーとして使用したＰＣ
Ｒにより作成され、末端欠失型β3鎖をコードするｃＤ
ＮＡが、オリゴヌクレチドである、５’−ＧＣＧ ＣＧ
Ｃ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＣＧＡ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ−３’（配列番号：
３）と、５’−ＧＡＴ ＣＧＡ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＴ
Ａ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＧＣ ＣＣＴ ＴＧＧ ＧＡＣ
ＡＣＴ−３’（配列番号：４）をプライマーとして使
用してＰＣＲにより作成されたものである請求項１２に
記載の調製方法。 - 【請求項１４】 前記受容体を阻害する治療薬の発見の
ための、請求項１〜６に記載の可溶性組換えαvβ3受容
体の使用法。 - 【請求項１５】 治療薬化合物がＲＧＤペプチドまたは
非ペプチド性の類似物質である請求項１４に記載の使用
法。 - 【請求項１６】 請求項１〜４に記載の可溶性αvβ3受
容体及び該αvβ3受容体を阻害する可能性のある治療用
化合物を使用して、治療用化合物の天然のα vβ3受容体
を阻害する能力のある治療用化合物をスクリーニングす
る方法。 - 【請求項１７】 治療用化合物としてのＲＧＤペプチド
または非ペプチド性類似体を、検出標識により検出が可
能なように修飾し、固定化された精製可溶性αvβ3受容
体と反応させ、さらに、該受容体に結合したリガンドの
量が測定される請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 高純度に精製された完全鎖長のヒト組
換えαvβ3付着受容体を高収率で調製する方法におい
て、 （ｉ）前記受容体のαv鎖をコードする第１のｃＤＮＡ
と、上記の受容体のβ3鎖をコードする第２のｃＤＮＡ
を、バキュロウイルス発現系のバキュロウイルス転送ベ
クターに組み込んで、サブクローニングを行い、 （ｉｉ）前記の第１及び／または第２のＤＮＡからを含
む前記ベクターを前記発現系のバキュロウイルスのゲノ
ムＤＮＡに移入させ、 （ｉｉｉ）上記の完全な組換えバキュロウイルスで昆虫
細胞を感染させ、 （ｉｖ）上記の感染昆虫細胞を培地で培養して、発現し
た膜結合受容体を界面活性剤で溶解させ、 （ｖ）上記の溶解した受容体を、ヒトαvβ3付着受容体
またはその個別の構成鎖に特異的に結合する抗体を使っ
た抗体アフィニティクロマトグラフィにより無細胞培地
から精製することを特徴とする調製方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96119700/1 | 1996-12-09 | ||
| EP96119700 | 1996-12-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10174591A true JPH10174591A (ja) | 1998-06-30 |
| JP4349662B2 JP4349662B2 (ja) | 2009-10-21 |
Family
ID=8223479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33888397A Expired - Fee Related JP4349662B2 (ja) | 1996-12-09 | 1997-12-09 | 可溶性組換えαｖβ３付着受容体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20020055136A1 (ja) |
| EP (1) | EP0846702B1 (ja) |
| JP (1) | JP4349662B2 (ja) |
| DE (1) | DE69739295D1 (ja) |
| ES (1) | ES2321991T3 (ja) |
Families Citing this family (3)
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| US6268215B1 (en) * | 1998-11-04 | 2001-07-31 | The Research Foundation Of State University Of New York | Recombinant keratinocytes |
| CN1346282A (zh) | 1998-12-23 | 2002-04-24 | G.D.西尔公司 | 在肿瘤的治疗中使用环加氧酶－2－抑制剂与一种或多种抗肿瘤剂作为联合治疗的方法 |
| US20020025510A1 (en) * | 2000-07-26 | 2002-02-28 | Strongin Alex Y. | Screening methods based on superactivated alpha V beta 3 integrin |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5212071A (en) * | 1988-04-01 | 1993-05-18 | The Johns Hopkins University | Nucleic acids encoding a human C3b/C4b receptor (CR1) |
| US4223002A (en) * | 1978-08-28 | 1980-09-16 | Hoffmann-La Roche Inc. | Isolation of alpha1 -fetoprotein |
| US4745051A (en) * | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
| EP0452364B1 (en) * | 1988-12-22 | 2002-05-22 | Genentech, Inc. | Method for preparing water soluble polypeptides |
| US5298418A (en) * | 1991-09-16 | 1994-03-29 | Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. | Cell line isolated from larval midgut tissue of Trichoplusia ni |
| AU680411B2 (en) * | 1992-04-03 | 1997-07-31 | Genentech Inc. | Antibodies to alphavbeta3 integrin |
| US5753230A (en) * | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| DK0719859T3 (da) * | 1994-12-20 | 2003-10-20 | Merck Patent Gmbh | Anti-alfa V-integrin monoklonalt antistof |
| CA2229622A1 (en) * | 1995-08-31 | 1997-03-06 | Le T. Duong | Mouse integrin subunits |
| US5854205A (en) * | 1995-10-23 | 1998-12-29 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic compositions and methods |
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