JPH10153573A - 酸化還元酵素を用いる測定方法 - Google Patents
酸化還元酵素を用いる測定方法Info
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- JPH10153573A JPH10153573A JP8325922A JP32592296A JPH10153573A JP H10153573 A JPH10153573 A JP H10153573A JP 8325922 A JP8325922 A JP 8325922A JP 32592296 A JP32592296 A JP 32592296A JP H10153573 A JPH10153573 A JP H10153573A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酸化還元酵素-メディエータ混合物層を形成
させた作用極を用いる測定方法において、測定値のバラ
ツキを少なくした方法を提供する。 【解決手段】 酸化還元酵素-メディエータ混合物層を
形成させた作用極およびその対極の表面に被測定溶液を
接触させた後、瞬時に-0.5〜+0.5Vの微小電位を一定時
間印加した後、0.5〜0.7Vの印加電位を加えて一定時間
経過後の電流値を測定する。
させた作用極を用いる測定方法において、測定値のバラ
ツキを少なくした方法を提供する。 【解決手段】 酸化還元酵素-メディエータ混合物層を
形成させた作用極およびその対極の表面に被測定溶液を
接触させた後、瞬時に-0.5〜+0.5Vの微小電位を一定時
間印加した後、0.5〜0.7Vの印加電位を加えて一定時間
経過後の電流値を測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酸化還元酵素を用
いる測定方法に関する。更に詳しくは、酸化還元酵素を
メディエータ(電子伝達体)との混合物として用いる測定
方法に関する。
いる測定方法に関する。更に詳しくは、酸化還元酵素を
メディエータ(電子伝達体)との混合物として用いる測定
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】グルコースオキシダーゼ(GOD)によって
代表される酸化還元酵素を用いるバイオセンサにおいて
は、酸化還元酵素は作用極上に固定化されるが、この場
合GOD等はメディエータとの混合物層を形成させて用い
られることがある。ここで、酸化還元酵素としてはGOD
以外にも、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダー
ゼ、ピルビン酸オキシダーゼ等が用いられ、またメディ
エータとしては、フェリシアン化カリウム、パラベンゾ
キノン等が用いられる。
代表される酸化還元酵素を用いるバイオセンサにおいて
は、酸化還元酵素は作用極上に固定化されるが、この場
合GOD等はメディエータとの混合物層を形成させて用い
られることがある。ここで、酸化還元酵素としてはGOD
以外にも、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダー
ゼ、ピルビン酸オキシダーゼ等が用いられ、またメディ
エータとしては、フェリシアン化カリウム、パラベンゾ
キノン等が用いられる。
【０００３】ここで用いられるGOD-メディエータ混合物
層は、次のように作用する。GODは酸素の共存下でグル
コースを酸化し、その際発生するH2O2を作用極上で更に
酸化し、このとき発生する酸化電流値を測定することに
よって、グルコース濃度を間接的に求めている。 グルコース＋O2 → グルコノラクトン＋H2O2 H2O2 → O2＋2H+＋2e-
層は、次のように作用する。GODは酸素の共存下でグル
コースを酸化し、その際発生するH2O2を作用極上で更に
酸化し、このとき発生する酸化電流値を測定することに
よって、グルコース濃度を間接的に求めている。 グルコース＋O2 → グルコノラクトン＋H2O2 H2O2 → O2＋2H+＋2e-
【０００４】この場合、被測定溶液が希釈されるバッチ
式測定法、FIA(フロー・インジェクション・アナリシ
ス)方式測定法においては、水溶液中の溶存酸素濃度が8
ppm(0.3mM、25℃)程度でも、制限透過膜の付与等の手段
を用いることにより、十分に検量性を確保することがで
きる。
式測定法、FIA(フロー・インジェクション・アナリシ
ス)方式測定法においては、水溶液中の溶存酸素濃度が8
ppm(0.3mM、25℃)程度でも、制限透過膜の付与等の手段
を用いることにより、十分に検量性を確保することがで
きる。
【０００５】しかしながら、被測定溶液の希釈のない原
液サンプルの場合には、酵素反応が溶存酸素濃度に律速
されるため、グルコース濃度として約100mg/dl付近迄し
か直線検量範囲を示さない。そして、例えば使い捨てグ
ルコースバイオセンサなどにあっては、多くの場合原液
サンプルについての測定が行われる。
液サンプルの場合には、酵素反応が溶存酸素濃度に律速
されるため、グルコース濃度として約100mg/dl付近迄し
か直線検量範囲を示さない。そして、例えば使い捨てグ
ルコースバイオセンサなどにあっては、多くの場合原液
サンプルについての測定が行われる。
【０００６】メディエータとして、例えばフェリシアン
化カリウムを用いた場合には、グルコースとの反応で発
生したフェロシアン化イオンが作用極で酸化され、酸化
電流を生ずる。 グルコース＋2Fe(CN)6 ---＋H2O→ グルコン酸＋2H+＋2F
e(CN)6 ---- 2Fe(CN)6 ---- → 2Fe(CN)6 ---＋2e-
化カリウムを用いた場合には、グルコースとの反応で発
生したフェロシアン化イオンが作用極で酸化され、酸化
電流を生ずる。 グルコース＋2Fe(CN)6 ---＋H2O→ グルコン酸＋2H+＋2F
e(CN)6 ---- 2Fe(CN)6 ---- → 2Fe(CN)6 ---＋2e-
【０００７】フェリシアン化カリウムの添加量(濃度約1
0〜1500mM/約0.5〜10μl)は任意に設定することができ
るため、センサの検量範囲は溶存酸素に律速されなくな
る。
0〜1500mM/約0.5〜10μl)は任意に設定することができ
るため、センサの検量範囲は溶存酸素に律速されなくな
る。
【０００８】しかしながら、このようなGOD-メディエー
タ混合物層を作用極上に形成させて用いる測定方法にお
いては、グルコースによって還元された酵素と反応した
メディエータが更に電極と反応する際に、メディエータ
の電極迄の移動が自由拡散によっているため、それの移
動速度が濃度差や粘度差などの影響を受け易く、それが
測定値である出力のバラツキの原因となっている。
タ混合物層を作用極上に形成させて用いる測定方法にお
いては、グルコースによって還元された酵素と反応した
メディエータが更に電極と反応する際に、メディエータ
の電極迄の移動が自由拡散によっているため、それの移
動速度が濃度差や粘度差などの影響を受け易く、それが
測定値である出力のバラツキの原因となっている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、酸化
還元酵素-メディエータ混合物層を形成させた作用極を
用いる測定方法において、測定値のバラツキを少なくし
た方法を提供することにある。
還元酵素-メディエータ混合物層を形成させた作用極を
用いる測定方法において、測定値のバラツキを少なくし
た方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】かかる本発明の目的は、
酸化還元酵素-メディエータ混合物層を形成させた作用
極およびその対極の表面に被測定溶液を接触させた後、
瞬時に-0.5〜+0.5Vの微小電位を一定時間印加した後、
0.5〜0.7Vの印加電位を加えて一定時間経過後の電流値
を測定することによって達成される。
酸化還元酵素-メディエータ混合物層を形成させた作用
極およびその対極の表面に被測定溶液を接触させた後、
瞬時に-0.5〜+0.5Vの微小電位を一定時間印加した後、
0.5〜0.7Vの印加電位を加えて一定時間経過後の電流値
を測定することによって達成される。
【００１１】
【発明の実施の形態】作用極および対極あるいは作用
極、対極および参照極は、セラミックス、ガラス、プラ
スチック、紙、生分解性材料(例えば、微生物生産ポリ
エステル等)などの絶縁性基板上に設けられる。作用
極、対極および参照極リードは、スクリーン印刷法、蒸
着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボ
ン等から形成され、参照極は参照極リード上にスクリー
ン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって一旦
銀電極を形成させた後、定電流電解する方法あるいは塩
化第２鉄水溶液中に浸漬する方法、更にはスクリーン印
刷法によって塩化銀を塗布、積層させる方法などによっ
て形成される。その後、各電極の中央部分が樹脂製絶縁
膜などによって被覆される。なお、参照極を設けない２
電極構造のものとすることもできる。
極、対極および参照極は、セラミックス、ガラス、プラ
スチック、紙、生分解性材料(例えば、微生物生産ポリ
エステル等)などの絶縁性基板上に設けられる。作用
極、対極および参照極リードは、スクリーン印刷法、蒸
着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボ
ン等から形成され、参照極は参照極リード上にスクリー
ン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって一旦
銀電極を形成させた後、定電流電解する方法あるいは塩
化第２鉄水溶液中に浸漬する方法、更にはスクリーン印
刷法によって塩化銀を塗布、積層させる方法などによっ
て形成される。その後、各電極の中央部分が樹脂製絶縁
膜などによって被覆される。なお、参照極を設けない２
電極構造のものとすることもできる。
【００１２】作用極上への混合物層の形成は、水１ml当
りGOD約1〜50mg、好ましくは約1〜20mg(165800単位の場
合)およびフェリシアン化カリウム約1〜100mg、好まし
くは約10〜60mgまたはパラベンゾキノン約1〜200mg、好
ましくは約50〜180mgを溶解させた水溶液約0.5〜10μ
l、好ましくは約0.5〜3μlを滴下法、スピンコート法な
どによって作用極上に滴下することによって行われ、そ
こに約0.05〜10μm、好ましくは約0.1〜2μmの膜厚の混
合物層を室温条件下で形成させる。
りGOD約1〜50mg、好ましくは約1〜20mg(165800単位の場
合)およびフェリシアン化カリウム約1〜100mg、好まし
くは約10〜60mgまたはパラベンゾキノン約1〜200mg、好
ましくは約50〜180mgを溶解させた水溶液約0.5〜10μ
l、好ましくは約0.5〜3μlを滴下法、スピンコート法な
どによって作用極上に滴下することによって行われ、そ
こに約0.05〜10μm、好ましくは約0.1〜2μmの膜厚の混
合物層を室温条件下で形成させる。
【００１３】グルコース濃度の測定は、従来このように
して作製されたグルコースバイオセンサに所定濃度のグ
ルコース水溶液を滴下して約1〜60秒間程度反応させた
後、そこに約0.05〜0.8V、好ましくは約0.5〜0.7Vの電
圧を印加し、例えば印加20秒後の電流値を測定すること
によって行われていたが、本発明においてはメディエー
タが電荷を帯びていることに着目し、電極間に微小電位
をかけることによりメディエータ分子の挙動を制御し、
これによって出力のバラツキを抑え得ることを見出した
ものである。
して作製されたグルコースバイオセンサに所定濃度のグ
ルコース水溶液を滴下して約1〜60秒間程度反応させた
後、そこに約0.05〜0.8V、好ましくは約0.5〜0.7Vの電
圧を印加し、例えば印加20秒後の電流値を測定すること
によって行われていたが、本発明においてはメディエー
タが電荷を帯びていることに着目し、電極間に微小電位
をかけることによりメディエータ分子の挙動を制御し、
これによって出力のバラツキを抑え得ることを見出した
ものである。
【００１４】具体的には、混合物層を形成させた作用極
およびその対極の表面に被測定溶液を接触させた後、瞬
時に-0.5〜+0.5V、好ましくは-0.1〜+0.1Vの微小電位を
一定時間(約10〜100秒間、好ましくは約60〜80秒間)印
加する。ここで微小電位値が0を含まず、±0.5V以下に
設定されるのは、フェリシアンイオンが還元されて形成
されたフェロシアンイオンにその酸化還元電位(約0.6V)
以上の電位が電極間にかかると、酸化されてフェリシア
ンイオンに戻り、その際電子を放出してしまうためであ
る。
およびその対極の表面に被測定溶液を接触させた後、瞬
時に-0.5〜+0.5V、好ましくは-0.1〜+0.1Vの微小電位を
一定時間(約10〜100秒間、好ましくは約60〜80秒間)印
加する。ここで微小電位値が0を含まず、±0.5V以下に
設定されるのは、フェリシアンイオンが還元されて形成
されたフェロシアンイオンにその酸化還元電位(約0.6V)
以上の電位が電極間にかかると、酸化されてフェリシア
ンイオンに戻り、その際電子を放出してしまうためであ
る。
【００１５】その後、0.5〜0.7Vの印加電位を加え、一
定時間(約5〜15秒間)経過後の電流値が測定される点
は、従来法と同じである。グルコースバイオセンサ以外
のバイオセンサについても、同様に微小電位の印加が行
われた後、所定の印加電圧を加えて測定が行われる。
定時間(約5〜15秒間)経過後の電流値が測定される点
は、従来法と同じである。グルコースバイオセンサ以外
のバイオセンサについても、同様に微小電位の印加が行
われた後、所定の印加電圧を加えて測定が行われる。
【００１６】
【発明の効果】作用極上に酸化還元酵素-メディエータ
混合物層を設けたバイオセンサを用いての測定に際し、
所定の印加電位を加える前に微小電位を印加することに
よって、測定される電流値のバラツキを抑えることがで
きる。
混合物層を設けたバイオセンサを用いての測定に際し、
所定の印加電位を加える前に微小電位を印加することに
よって、測定される電流値のバラツキを抑えることがで
きる。
【００１７】
【実施例】次に、実施例について本発明を説明する。
【００１８】実施例 ポリエチレンテレフタレートフィルム(厚さ0.25mm)上
に、スクリーン印刷法によって、いずれもカーボン製の
対極、作用極および参照極リードを作用極を中心とし
て、膜厚5μmで形成させた。次いで、参照極リード上
に、銀ペーストをスクリーン印刷法によって5μmの厚さ
で印刷し、焼成して銀電極とした。これらの各電極の中
央部分を厚さ15μmのポリエステル樹脂製絶縁膜で覆っ
た後、銀電極部分を0.1M塩酸中に浸漬し、0.6mA/cm2の
電流密度で20分間の定電流電解を行い、その表面を塩化
銀化して、銀/塩化銀参照極を形成させた。この定電流
電解には、ポテンショガルバノスタット(北斗電工製HA5
01)が用いられた。
に、スクリーン印刷法によって、いずれもカーボン製の
対極、作用極および参照極リードを作用極を中心とし
て、膜厚5μmで形成させた。次いで、参照極リード上
に、銀ペーストをスクリーン印刷法によって5μmの厚さ
で印刷し、焼成して銀電極とした。これらの各電極の中
央部分を厚さ15μmのポリエステル樹脂製絶縁膜で覆っ
た後、銀電極部分を0.1M塩酸中に浸漬し、0.6mA/cm2の
電流密度で20分間の定電流電解を行い、その表面を塩化
銀化して、銀/塩化銀参照極を形成させた。この定電流
電解には、ポテンショガルバノスタット(北斗電工製HA5
01)が用いられた。
【００１９】このような構成の各電極の内の作用極上
に、水１mlにGOD(165800単位/g)10mgおよびフェリシア
ン化カリウム48mgを溶解させた水溶液を1.5μl滴下して
室温条件下で乾燥させ、グルコースバイオセンサＡを作
製した。また、参照極を有しない２極構造のグルコース
バイオセンサＢを、同様にして作製した。
に、水１mlにGOD(165800単位/g)10mgおよびフェリシア
ン化カリウム48mgを溶解させた水溶液を1.5μl滴下して
室温条件下で乾燥させ、グルコースバイオセンサＡを作
製した。また、参照極を有しない２極構造のグルコース
バイオセンサＢを、同様にして作製した。
【００２０】作製されたグルコースバイオセンサに、濃
度300mg/dlのグルコース水溶液20μl(pH6.0)を滴下し、
そこに瞬時に+0.1Vの微小電位を30秒間印加した後、0.6
Vの電位を印加し、印加10秒後の電流値を測定した。測
定には、ポテンショガルバノスタット(HA501)およびフ
ァンクションジネレータ(北斗電工製HB104)が用いられ
た。各センサは１サンプル毎に使い捨てとし、各センサ
間の再現性(n=10)を示す変動係数(平均値に対する標準
偏差の割合)を求めた。
度300mg/dlのグルコース水溶液20μl(pH6.0)を滴下し、
そこに瞬時に+0.1Vの微小電位を30秒間印加した後、0.6
Vの電位を印加し、印加10秒後の電流値を測定した。測
定には、ポテンショガルバノスタット(HA501)およびフ
ァンクションジネレータ(北斗電工製HB104)が用いられ
た。各センサは１サンプル毎に使い捨てとし、各センサ
間の再現性(n=10)を示す変動係数(平均値に対する標準
偏差の割合)を求めた。
【００２１】その結果、センサＡについては平均22.5μ
A、変動係数2.0%、またセンサＢについては平均24.5μ
A、変動係数2.2%の値が得られた。なお、微小電位を印
加しない場合には、センサＡについては平均22.7μA、
変動係数2.4%、またセンサＢについては平均24.3μA、
変動係数2.5%の値が得られており、微小電位の印加によ
って変動係数が改善されていることが分かる。
A、変動係数2.0%、またセンサＢについては平均24.5μ
A、変動係数2.2%の値が得られた。なお、微小電位を印
加しない場合には、センサＡについては平均22.7μA、
変動係数2.4%、またセンサＢについては平均24.3μA、
変動係数2.5%の値が得られており、微小電位の印加によ
って変動係数が改善されていることが分かる。
【００２２】更に、グルコース水溶液濃度を種々変更し
た場合のセンサＢについての出力を測定し、それから変
動係数(n=10)を算出すると次のような結果となった。
た場合のセンサＢについての出力を測定し、それから変
動係数(n=10)を算出すると次のような結果となった。
【００２３】 グルコース 微小電位印加 微小電位印加せず 濃度(mg/dl) 出力(μA) 変動係数(%) 出力(μA) 変動係数(%) 0 0 0 0 0 50 3 2.6 3 2.8 100 6 2.6 6 3.0 250 14 2.4 14 2.5 500 28 4.7 27 5.0 800 45 7.2 44 7.4 1000 57 7.9 55 8.3
Claims (1)
- 【請求項１】 酸化還元酵素-メディエータ混合物層を
形成させた作用極およびその対極の表面に被測定溶液を
接触させた後、瞬時に-0.5〜+0.5Vの微小電位を一定時
間印加した後、0.5〜0.7Vの印加電位を加えて一定時間
経過後の電流値を測定することを特徴とする酸化還元酵
素を用いる測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8325922A JPH10153573A (ja) | 1996-11-22 | 1996-11-22 | 酸化還元酵素を用いる測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8325922A JPH10153573A (ja) | 1996-11-22 | 1996-11-22 | 酸化還元酵素を用いる測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10153573A true JPH10153573A (ja) | 1998-06-09 |
Family
ID=18182101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8325922A Pending JPH10153573A (ja) | 1996-11-22 | 1996-11-22 | 酸化還元酵素を用いる測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10153573A (ja) |
-
1996
- 1996-11-22 JP JP8325922A patent/JPH10153573A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040831 |