JPH10108676A - ミトコンドリア遺伝子、オルガネラ及び植物細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞質雄性不稔トマト植物に存在するミトコ
ンドリア遺伝子の提供。 【解決手段】 配列番号１で表される塩基配列を実質的
に含むミトコンドリア遺伝子、該ミトコンドリア遺伝子
を含む組換えベクター、該ミトコンドリア遺伝子を含む
ミトコンドリア、該ミトコンドリアを含む細胞質、及び
該細胞質を含む細胞。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞質雄性不稔ト
マト植物に存在するミトコンドリア遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】雄性不稔とは、多くの高等植物で見られ
る雄性器官の不稔現象をいう。雄性不稔には、細胞質に
よるもの、核内遺伝子によるもの、及びこの両者が関与
するものが知られており、このうち細胞質雄性不稔は、
核ゲノムと細胞質との不和合により引き起こされると考
えられている。雄性不稔形質、特に細胞質雄性不稔形質
を有する植物は、自殖性植物を用いてヘテローシス育種
を行う場合に雑種種子の生産が容易になる点で優れてい
るため、イネ、トウモロコシなど育種上広く使用されて
いる。

【０００３】細胞質雄性不稔植物を作出するには、一般
には細胞質雄性不稔形質を導入させたい作物と、その作
物と同一の種（亜種を含む）又は交雑可能な属に属する
植物とを交配することにより行われる。例えば、細胞質
雄性不稔イネ植物は、イネの花粉をインド型品種（Chin
surah Boro II)に繰り返し受粉し、交配による核置換を
することにより作出することができ、また、細胞質雄性
不稔のアブラナ科植物体は、例えば「オグラ細胞質」と
呼ばれるダイコン由来の細胞質雄性不稔を引き起こす細
胞質を持つ植物体に、イネの場合と同様に、細胞質雄性
不稔の形質を付加したい植物を交配することにより（核
置換法）、あるいは、オグラ細胞質を持つ細胞と細胞質
雄性不稔を導入したい植物の細胞とを融合することによ
り（非対称細胞法）作出することができる。

【０００４】しかし、トマトにおいては、これまで細胞
質雄性不稔を引き起こす細胞質は、種内及び交雑可能な
属内では見出されていない。また、雄性不稔形質は開花
によって初めてその形質が明確になるものであり、開花
期以前に、ある植物体中にその形質を特定することは困
難である。したがって、上記問題点を解消し、また、開
花期以前に植物体中の形質を容易に特定できるようにす
るためには、雄性不稔に関する分子生物学的解析が必要
とされる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、トマト植物
に細胞質雄性不稔を引き起こす遺伝子に密接に連鎖して
いるＤＮＡを提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、細胞質雄性不稔トマト
植物体及び正常のトマト植物体からミトコンドリアＤＮ
Ａを単離し比較することにより、細胞質雄性不稔の原因
となる遺伝子に密接に連鎖するＤＮＡ領域を見出し、本
発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、配列番
号１で表される塩基配列を実質的に含むミトコンドリア
遺伝子である。ここで、「実質的に」とは、本発明のミ
トコンドリア遺伝子が、トマト植物に細胞質雄性不稔を
引き起こす機能を有する限り、本発明の遺伝子の塩基配
列に欠失、置換、挿入等の変異が生じてもよいことを意
味するものである。

【０００７】さらに、本発明は、前記ミトコンドリア遺
伝子を含む組換えベクターである。さらに、本発明は、
前記ミトコンドリア遺伝子を含むミトコンドリアであ
る。さらに、本発明は、前記ミトコンドリアを含む細胞
質である。さらに、本発明は、前記細胞質を含む細胞で
ある。細胞としては、例えばトマト植物の細胞が挙げら
れる。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】トマト植物体においては、トマト
植物の細胞とジャガイモの近縁野生種の細胞とを非対称
細胞融合することにより雄性不稔を付与することが可能
となった。本発明者は、この非対称細胞融合法を用い
て、トマト栽培品種の母系植物体への細胞質雄性不稔形
質導入を行った。このような不稔形質導入が行われた母
系植物体においては、再分化してくる植物体に雄性稔性
がある個体と無い個体とが混在している。そこで、本発
明者は、これら雄性稔性の有無とミトコンドリアＤＮＡ
との関係を検討した。その結果、雄性不稔植物体に特異
的なミトコンドリアゲノムから本発明のＤＮＡを得るこ
とができた。

【０００９】(1) 細胞質雄性不稔トマト植物の作出 Melchersら（特開平2-138927号公報）の方法に従い、ト
マトの栽培品種の数種と、ジャガイモの野生種とを非対
称細胞融合し、再分化植物体の中から細胞質雄性不稔ト
マト植物体を選抜する。トマトとしては、例えばリコペ
ルシコン・エスキュレントゥム・ミル（Lycopersicon e
sculentum Mill.)（例えば品種「世界一」）、リコペル
シコン・エスキュレントゥム・ヴァラエティ・セラシフ
ォルメ（Lycopersicon esculentum var.cerasiforme)等
が挙げられ、ジャガイモの野生種としては、例えばソラ
ヌム・アカウレ・ホークス（Solanum acaule Hawkes ）
が挙げられる。

【００１０】非対称細胞融合とは、細胞融合の対象とな
る２種類の植物細胞において、一方の細胞については核
を不活化させ、他方の細胞については細胞質（例えばミ
トコンドリア）を不活化させ、両細胞を融合させる手法
をいう。核を不活化させた一方の細胞を細胞質提供細
胞、細胞質を不活化させた他方の細胞を核提供細胞とす
る。

【００１１】細胞質提供細胞は、雄性不稔形質を核提供
細胞に付与する細胞であり、材料となる植物の本葉を切
り取り、γ線又はＸ線照射などを行って核遺伝子を不活
化させた後、公知の手法（Cell Culture and Somatic C
ell Genetics of Plants: vol1, 375, Acad.Press In
c.,1984)により本葉の細胞をプロトプラスト化させて単
離することにより当該細胞を得ることができる（特開平
2-138927号公報）。

【００１２】これに対し、核提供細胞は植物体を構成す
る細胞であり、材料となる植物の種子を無菌的に発芽さ
せ、その幼苗の葉を切り取り、上記と同様の手法により
プロトプラストを単離した後、ヨードアセトアミド等を
用いて細胞質を不活化することにより当該細胞を得るこ
とができる（特開平2-138927号公報）。細胞融合は、公
知のポリエチレングリコール法（Planta,120,215-227,1
974)、電気融合法（Planta,151,26-32,1981)等により行
うことができる。

【００１３】細胞融合後、プロトプラストからの植物体
の再分化を行う。すなわち、融合処理後の培養によって
得られたカルスを再分化培地に移植し、光照射の条件下
で２か月程培養することにより再分化した茎葉が得られ
る。融合細胞から再分化した植物体の中には雄性不稔形
質を有するものと有さないものとが混在する。そこで、
雄性不稔形質を有する植物体のみを選抜する必要があ
る。

【００１４】選抜は、以下の手法により行う。すなわ
ち、再分化してきた幼植物体で形態的に正常なトマト植
物体と同一なものの根端の分裂組織の細胞の染色体を計
測し、正常のトマト植物と同じ２倍体（2n＝24) の植物
体を全て栽培し開花させる。開花した花より葯を採取
し、葯内の花粉の一部を酢酸カーミンにより染色し、顕
微鏡下で形態を観察し、残りの花粉の一部を人工花粉発
芽培地（Ame.J.Botany,50,859-865,1963) に播き、約１
時間後に顕微鏡下で花粉管の発芽伸長を観察する。更
に、採取した葯内の残りの花粉を自殖及び種子発芽より
育成した正常なトマト植物体に受粉する。これらによ
り、酢酸カーミンにより細胞内が鮮やかな赤色に染まる
球形の花粉が観察され、人工花粉発芽培地上での花粉管
の発芽伸長が見られず、且つ自殖他殖による種子が獲得
できなかったトマト植物体を雄性不稔植物体として選抜
する（Ｒ０世代）。更に、この雄性不稔トマト植物体に
正常なトマト植物体の花粉を受粉し、種子を得て、この
後代（Ｒ１世代）を育成し、同様な雄性不稔形質を示し
て初めて、先代（Ｒ０世代）が細胞質雄性不稔であるこ
とが確認される。

【００１５】(2) 細胞質雄性不稔トマト植物体のミトコ
ンドリアＤＮＡライブラリーの構築 前記(1) のようにして選別された細胞質雄性不稔トマト
植物体の緑葉からミトコンドリアＤＮＡを調製する。ミ
トコンドリアＤＮＡの調製は、常法により行うことがで
きる（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,6832-6836,1992) 。
まず、十分に展開した緑葉をミトコンドリア単離用の緩
衝液中でホモジナイズし、ホモジネートを３層のミラク
ロスで濾した後、1400×ｇで遠心する。上清を更に2200
×ｇで10分遠心し、その上清を15000 ×ｇで10分遠心す
る。沈殿にDNaseIを含む緩衝液を加えて懸濁し、０℃で
30分間静置する。さらにDNaseIを追加し、更に０℃で30
分間静置する。EDTAを加えてDNaseIの活性を止め、洗浄
用の緩衝液を加えて遠心し、沈殿を再度緩衝液に懸濁し
て遠心する。これを数回繰り返すことにより、ミトコン
ドリア顆粒を得る。ミトコンドリア顆粒を穏やかに分解
し、ミトコンドリアＤＮＡを常法、例えばフェノール／
クロロフォルム／イソアミルアルコール抽出法で抽出
し、エタノールで沈殿させ、塩化セシウム超遠心法で純
化する。

【００１６】上記の手法により得られたＤＮＡを適当な
制限酵素（例えばSau3AI) で部分分解した後、アルカリ
フォスファターゼ処理を行い、ＤＮＡ断片を脱リン酸化
する。これを制限酵素（例えばBamHI）で切断したベク
ターとライゲーションを行い、ライブラリーを作製す
る。ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るフ
ァージ又はプラスミドが使用される。ファージベクター
としては、例えばEMBL3 、M13 等が挙げられ、プラスミ
ドベクターとしては、例えばpBR322、pUC18 等が挙げら
れる。さらに、大腸菌やバチルス・ブレビスなどの２種
以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほ
か、各種のシャトルベクターを使用することもできる。
このようなベクターについても、前記制限酵素で切断
し、その断片を得ることができる。

【００１７】ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させる
には、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ
断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結さ
せ、組換えベクターを作製する。宿主微生物に組換えベ
クターを導入するには、公知の方法により行うことがで
きる。例えば、宿主微生物が大腸菌の場合はカルシウム
法（Lederberg,E.M. etal.,J.Bacteriol.119,1072(197
4)) 等を採用することができ、宿主微生物がファージＤ
ＮＡの場合はインビトロ・パッケージング法(Horn,B. M
ethods in Enzymology,68,299 (1979)) などを採用する
ことができる。本発明では、インビトロ・パッケージン
グ用キット（GIGAPACK GOLD; STRATAGENE 社製) が用い
られる。

【００１８】(3) 細胞質雄性不稔に強く連鎖するミトコ
ンドリアゲノム領域の特定 前記(1)で選抜した細胞質雄性不稔トマト植物体、及び
生食大玉系トマト品種「世界一」（以下「世界一トマ
ト」という）の緑葉から、それぞれの全ＤＮＡを抽出す
る。ＤＮＡの抽出は、いずれもCTAB法（Lichtenstein a
nd Draper (1985)DNA cloning vol.1 67-119）により行
うことができる。

【００１９】得られる全ＤＮＡを制限酵素（例えばBamH
I)で切断し、その断片をアガロースゲル電気泳動で分画
する。次いで、それぞれの画分を、ナイロンメンブレン
（パール）にトランスファーする。そして、(2) で得ら
れたミトコンドリアＤＮＡ断片を含むクローンをプロー
ブとしてサザンハイブリダイゼーション(Southern (197
5) J.Mol.Bio. 98:503-517）を行う。プローブについて
は、ライブラリー中のそれぞれの断片に［α-³²P］dCTP
を取り込ませて放射標識したものを用い (Feinberg, et
al.(1983) Anal.Biochem. 132:6-13)、オートラジオグ
ラフィーを行ってバンドを検出する。

【００２０】(4) スクリーニング 前記サザンハイブリダイゼーションにより目的の断片が
得られた場合は、その断片を適当な制限酵素（例えばBa
mHI ）で切断し、得られる断片をプラスミドに導入する
ことによってプラスミドクローンを得ることができる。
ここで使用されるプラスミドとしては、pBlueskript SK
+等が挙げられる。

【００２１】(5) 花粉非発芽型雄性不稔トマト植物の作
出 花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマト植物体を細胞質提供
親として、任意のトマト品種又は系統との非対称細胞融
合を行い、任意のトマト品種又は系統の形質を持つ花粉
非発芽型細胞質雄性不稔トマト植物の作出を行う。前記
(1)によって得られた花粉非発芽型雄性不稔トマト植物
に、稔性のあるトマトの花粉を受粉して種子を得る。雄
性稔性のあるトマトの細胞に花粉非発芽型細胞質雄性不
稔トマト植物体のミトコンドリアゲノムの一部を導入す
る目的で、この種子の発芽によって得られた子葉細胞の
細胞質と雄性稔性のあるトマトの子葉細胞とを融合させ
（非対称細胞融合）、植物体を得る。非対称細胞融合法
については前記と同様である。

【００２２】細胞融合後の植物体を再分化させ、花粉非
発芽型雄性不稔形質の個体を選抜する。得られた雄性不
稔個体の葉よりCTAB法（Lichtenstein and Draper (198
5)DNA cloning vol.1 67-119）により全ＤＮＡを抽出
し、制限酵素BamHI で切断し、アガロースゲル電気泳動
で分画後、ナイロンメンブレン（パール）にトランスフ
ァーする。ファージクローンをプローブにしてサザンハ
イブリダイゼーションを行う。

【００２３】(6) 花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマト植
物に特異的に存在するＤＮＡ断片の塩基配列の解析 前記(4) の手法により得られたBamHI断片の塩基配列の
決定は、公知のいずれかの手法により行うことができ
る。その手法としては、例えばジデオキシ法等が挙げら
れる。本発明においては、Sequenase キット(UBC) を用
いて行う。塩基配列が一旦決定されると、その後は、化
学合成によって、又は決定された当該塩基配列から合成
したプライマーを用いたＰＣＲによって、あるいは該塩
基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダ
イズさせることによって、所望の遺伝子を得ることが出
来る。

【００２４】このようにして得られた本発明の遺伝子
は、雄性不稔に直接関与する遺伝子と密接に連鎖する遺
伝子である。従って、本発明の遺伝子は世代を経ても安
定して存在し、さらに複数回細胞融合を行っても、本発
明の遺伝子は、一方のミトコンドリアから他方のミトコ
ンドリアに導入されるものである。

【００２５】(7) ミトコンドリア顆粒、該ミトコンドリ
アを含む細胞質及び該細胞質を含む細胞 本発明のミトコンドリアは、細胞融合により任意に生じ
たミトコンドリアＤＮＡの組換えに起因するＤＮＡ配列
を含むものである。本発明の細胞質は、葉等の組織にＸ
線又はγ線を照射して核の遺伝物質を正常に機能しない
ように破壊した後、プロトプラストを単離することによ
り得られる。また、遠心分離操作により細胞質を分離す
ることも可能である。また、本発明の細胞は本発明のミ
トコンドリアＤＮＡ断片を含むミトコンドリア顆粒を含
有することを特徴としているため、例えば、In situ ハ
イブリダイゼーション等の方法により、本発明のミトコ
ンドリアを含む細胞を特定することができる。

【００２６】

〔実施例１〕

(1) 細胞質雄性不稔トマト植物の作出 世界一トマトの種子を無菌的に発芽させ、その幼苗より
子葉を切取り、Shahinの改変TSE-2 酵素液（Cell Cultu
re and Somatic Cell Genetics of Plants:Vol.1,(Vasi
l ed.)pp375, Acad.Pre.Inc.,1984)を用いてプロトプラ
ストを単離した。この単離には、TSE-2 酵素液において
セルラーゼオノズカR-11を 2.0％に、マセロザイムR-10
を0.2 ％に改変して（改変TSE-2 酵素液) 使用した。

【００２７】プロトプラストを精製し、これを10mMのヨ
ードアセトアミド溶液に懸濁し、４℃で15分間放置して
プロトプラストの細胞質因子の不活性化を行った。一
方、ソラヌム・アカウレ・ホークスを、挿木により無菌
的に増殖させた。その本葉を切取り、γ線又はＸ線を10
0krad 照射して核遺伝子を不活性化した後、前記改変TS
E-2 酵素液を用いてプロトプラストを単離した。ヨード
アセトアミド処理したトマトのプロトプラストと、γ線
又はＸ線照射したソラヌム・アカウレ・ホークスのプロ
トプラストとを等量混合し、Kao らの方法（Planta, 12
0,215-227,1974) に準じて融合処理を行った。

【００２８】すなわち、プロトプラスト懸濁液をプラス
チックペトリ皿に５滴滴下し、12分後に、25％(W/W)の
ポリエチレングリコール1540、塩化カルシウム10.5mM及
びリン酸二水素カリウム0.7mM を含むポリエチレングリ
コール液12滴を滴下して20分放置した。次に、グリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH10.5) 50.0mM、塩化カル
シウム50.0mM及びマンニトール0.2Mを含む高ｐＨ高カル
シウム液20滴を20分間隔で２度加え、混合液を適量除き
ながら塩化カルシウム0.75mM及びマンニトール0.4Mを含
む洗浄液を15分間隔で２度加えた。最後にTM-2（Theor.
Appl.Genet.,69,235-240,1985)を15分間隔で２度加え
た。

【００２９】プロトプラストの培養及び再分化はShahin
の方法（Theor.Appl.Genet.,69,235-240,1985)に準じて
行った。すなわち、融合処理から２週間後に液体培地か
ら得られた小カルスを個体培地に移植し、24℃、500Lx
で６日間培養し、生長したカルスを分化培地に移植し、
24℃、4500〜5000Lxでさらに２ヶ月間培養した。再分化
した茎葉はTM-5（Theor.Appl.Genet.,69,235-240,1985)
に移植し、１ヶ月半培養した。発根した茎葉を挿木によ
り無菌的に増殖させ、融合処理から約４ヶ月後に鉢出
し、温室で栽培した。

【００３０】出発材料の世界一トマトと染色体数（2n＝
24) や茎葉の形態が同一な再分化植物体を開花させ、こ
れらの花より採取した花粉を酢酸カーミンで染色した。
そして、ほぼ100％赤色に染色され、染色の状態も世界
一トマトと同様な再分化植物の花粉について人工花粉発
芽培地(Ame.J.Botany:50,859-865,1963)に播き、花粉の
発芽を観察した。世界一トマトでは、播いた花粉の50〜
80％が発芽して花粉管を伸長させたのに対して、全く発
芽しない花粉を持つ再分化植物について自殖したとこ
ろ、種子は得られなかった。更に、この花粉を世界一ト
マト植物体に受粉したが種子は得られず、唯一、世界一
トマトの花粉を受粉した場合のみ種子が得られた。

【００３１】この世界一トマトを交配して得られた種子
を播種したところ、花粉を含めた形態及び生育について
世界一トマトと差の認められないトマト植物体が得られ
た。しかし、これらの植物体の母植物体、すなわち再分
化当代のトマト植物体と同様に、花粉の発芽は人工花粉
発芽培地上及びトマトの柱頭で見られず、従って種子を
得ることができなかった。以上のようにして、世界一ト
マトとソラヌム・アカウレ・ホークスとの非対称細胞融
合により、花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマト植物体を
作出した。

【００３２】(2) 花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマト植
物体MSA1のミトコンドリアＤＮＡライブラリーの構築 花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマト植物体MSA1の緑葉を
ミトコンドリア単離用の緩衝液（0.44M Sucrose/50mM T
ris-HCl,pH7.59/3mM EDTA/0.1% polyvinylpyrrolidone/
0.2% bovine serum albumin/1mM 2-mercaptoethanol)中
でホモジナイズし、ホモジネートを３層のミラクロスで
濾した後、1400×ｇで遠心した。上清を更に2200×ｇで
10分遠心し、その上清を15000 ×ｇで10分遠心した。沈
殿に200μg/ml DNaseI を含む緩衝液（0.44M Sucrose/5
0mM Tris-HCl,pH7.5/25mM MgCl)を加えて懸濁し、０℃
で30分間静置した。EDTAを最終濃度が50mMになるように
加えてDNaseIの活性を止め、洗浄用の緩衝液(50mM Tris
-HCl,pH7.5/50mM EDTA/0.1% polyvinylpyrrolidone) を
加えて遠心し、沈殿を再度緩衝液に懸濁して遠心した。
これを数回繰り返すことにより、ミトコンドリア顆粒を
得た。

【００３３】次に、得られたミトコンドリア顆粒を緩衝
液中（1% sarkosyl/20mM EDTA/proteinase K(200μg/m
l)/50mM Tris-HCl,pH8.0)、37℃で１時間穏やかに溶解
し、ミトコンドリアＤＮＡを、フェノールと、フェノー
ル／クロロフォルム／イソアミルアルコール（24:24:1)
(vol/vol) の混合物とを用いて抽出し、エタノールで沈
殿させ、塩化セシウム密度勾配超遠心(140,000×g)で純
化した。上記の手法により得られたＤＮＡを制限酵素Sa
u3AIで部分分解した後、アルカリフォスファターゼ処理
を行い、ＤＮＡ断片を脱リン酸化し、これを制限酵素Ba
mHI で切断したベクターEMBL3 とライゲーションを行
い、インビトロパッケージングによりライブラリーを作
製した。

【００３４】(3) 細胞質雄性不稔に強く連鎖するミトコ
ンドリアゲノム領域の特定 前記(1) で選抜した細胞質雄性不稔トマト植物体及び世
界一トマトの緑葉からCATB法(Lichtenstein and Drape
r,(1985) DNA cloning vol.1,67-119) により全ＤＮＡ
を抽出し、制限酵素BamHIで切断し、アガロースゲル電
気泳動で分画後、ナイロンメンブレン（パール）にトラ
ンスファーした。

【００３５】前記(2) で得られた花粉非発芽型細胞質雄
性不稔トマト植物体MSA1のミトコンドリアＤＮＡ断片を
含む含むファージクローンをプローブとしてサザンハイ
ブリダイゼーション(Southern (1975) J.Mol.Bio. 98:5
03-517）を行った。プローブはランダムプライマー法
(Feinberg, et al.(1983) Anal.Biochem. 132:6-13)で
［α-³²P］dCTPを取り込ませて標識し、オートラジオグ
ラフィーにてバンドを検出した。

【００３６】その結果、ファージクローンA641と相同性
を示す6.6kbpのBamHI 断片が、調べた非対称細胞融合に
より作出された全ての花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマ
ト植物体で、核提供細胞として供試したトマト品種、系
統に関係なく見いだされた（図１）。図１において、レ
ーン１は世界一トマト由来のＤＮＡ、レーン２〜９は再
分化トマト植物体由来のＤＮＡ、レーン10はソラヌム・
アカウレ・ホークス由来のＤＮＡ、Ｍは分子量マーカー
である。レーン７、８及び９の植物体において6.6kbpの
バンドが現れ、これらの植物体は花粉非発芽型細胞質雄
性不稔であった。レーン２〜６の再分化植物体は雄性稔
性があった。

【００３７】(4) スクリーニング及び塩基配列の決定 クローンA641をBamHI で切断し、6.6kbp断片をpBlueskr
ipt SK+のBamHI 部位に導入することによってプラスミ
ドクローンA641B6.6を得た。A641B6.6の塩基配列の決定
は、Sequenase キット(UBC) を用いて行った。その結
果、配列番号１で表される塩基配列が得られた。

【００３８】(5) 花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマト植
物体のミトコンドリアゲノムの雄性稔性のあるトマト植
物体細胞への導入 花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマト植物体のミトコンド
リアゲノムの一部を雄性稔性のある植物体に導入し、花
粉非発芽型細胞質雄性不稔に形質転換するかどうかを調
べるため、花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマト植物体の
細胞質を細胞質提供細胞として、雄性稔性のあるトマト
細胞との非対称細胞融合を行った。再分化植物体の葉よ
りCTAB法(Lichtenstein and Draper,(1985) DNA clonin
gvol.1,67-119) により全ＤＮＡを抽出し、制限酵素Bam
HIで切断し、アガロースゲル電気泳動で分画後、ナイロ
ンメンブレン（パール）にトランスファーした。ファー
ジクローンA641をプローブにしてサザンハイブリダイゼ
ーションを行った。

【００３９】その結果、6.6kbpのBamHI 断片が、調べた
全ての花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマト植物体のみに
見いだされ、雄性稔性のあるトマト植物体からは見いだ
されなかった（図２）。図２において、レーン１〜12は
再分化トマト植物体由来のＤＮＡ、レーン13は世界一ト
マト由来のＤＮＡ、レーン14はMSA1トマト由来のＤＮ
Ａ、Ｍは分子量マーカーを表す。レーン１、５、７、８
及び11の植物体において6.6kbpのバンドが現れた。これ
らレーン１、５、７、８及び11の植物体は花粉非発芽型
細胞質雄性不稔であった。

【００４０】以上のことから、本発明のＤＮＡは、トマ
ト植物の花粉非発芽型細胞質雄性不稔の原因となるもの
であることが示された。本発明により、開花以前のトマ
ト植物体において、花粉非発芽型細胞質雄性不稔の形質
を特定する方法が提供される。トマト植物とSolanum ac
aule又は花粉非発芽型細胞質雄性不稔トマト植物体との
非対称細胞融合によるトマト植物体への雄性稔性の形質
転換において、サザンハイブリダイゼーションのプロー
ブとして、開花期以前に花粉非発芽型細胞質雄性不稔植
物体を選抜することが可能となる。

【００４１】

【発明の効果】本発明により、トマト植物に細胞質雄性
不稔を引き起こす遺伝子に密接に連鎖しているＤＮＡが
提供される。本発明のＤＮＡは、花粉非発芽型細胞質雄
性不稔トマト植物体の作出、更にはトマトの品種改良に
利用される。

【００４２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：6623 配列の形：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名： Lycopersicon esculentum Mill. cv. Sekai-
ichi MSA1 細胞の種類：本葉細胞 オルガネラ名：ミトコンドリア 直接の起源 ライブラリー名：MSA1ミトコンドリアDNAライブラリー クローン名：A641B6.6 配列： GATCCGAATC GGACCTAAAT GGGAATGACA TGAAAAGTCT TTTTCAAAAC CTAGCATTAA 60 GGGCGTTACG ACGATATACG AGAGGAATAG AGAAAAACTC GTGATTGGTG TGGAGGGGAA 120 GATCTGTTTA TGATATAGTT CAAGAAAGAG TCGTCTCATT TCCTTACTTC TTTATAATTC 180 ATTCACTTCA AGACTGGTTC TGAACGCCGC GTAAGATCAT CTTCAACCAA CCTCCACCGT 240 ACTTTCGGTG CGACCACTAA AGAATTGCTT ATACACTAAA GAGCTGCTTA TATACGTTTA 300 CTAAAAGACT GACTTTCATT CATTATCATT AGTCCAGCGT GAAACTAAGA AAGAGAGATG 360 TGCCTAAGGC GGCATGTAAG CAAACTGTGC ACGCTAAGAG AAGAGGAGAG ATGTTCGCAA 420 TTACTACCAC AAGAAAGCCG CCCCCTATCT TCTAAAGGGG CCCGTCACTT CGTTCGTACC 480 TTCTTGGCTT AGGCTTCCAA CTGAACAACA TGGCCTTGCC GCCCCGCCAC TAGCAGAAGC 540 TAAGCGCTTG AAAACGCTAA GAAAGGTTGC TTCTGTCGCC CTTCTGTGCA ACAGTCCACC 600 AGTAGCGGAA GAGAGGGTTA CCGTACATAC AAGAGTCTTC CAGTTCTTAC GGAAGCTCTT 660 TCTTACCAGT CAATCAAGTA GTACAAGAAC TGTATCTTAT CTTATAGCCC GGCGCGGCGG 720 GTCGCTTTTA AATTAATTAA GAAGATAGAA GAAAGTATTA AATAGATAAG GAGTAGATGA 780 GTGAGTGAGT CCTCACTGAC CTGAGCGATT TCGATCACCT AGCAGGCCTT TTATTTGGTA 840 GGTAACATCG CCAAAGCGTA TCATCAGATT TGACTACGAA GGAAGGAACT CGAAGTGAAA 900 GGGCACCGTC TTGTGCAAGG CAACGATAGT TGGCCCTCTA TATCTTCTAT CTGGTAGACT 960 TGGTAAAAGG GCCCCGACTT ATTTCAGAAT TTGAGTTCGA CCGCGGCTTC CCCCTTTTTT 1020 TGGGGGGGAT CAAGTTCCTT GCCAACTGCC ACCTATCGAC CCCGATCTCT TTTCATTTGT 1080 TTTGGATATT ACCAAACCTA GCCTAGCCTT CGTAAATCAC ACTAAAGCGG ACACCCAACT 1140 ATGGAAAGCC TCCTTAAGGG TGGGTTAGGT TAGTCAATCC GGCCCGAGAC GGTTCGTTGA 1200 CAAAACCGCC GTAGAATTCC TACTTTTCAA TAGAGCGGAG CAGGACTGAT CAACGAGAAA 1260 GAGGCCCTAC TCACTACAAA CGAATACACC ACAAGATTGA ACTGCACTCA TGCCTCTCCC 1320 GCATCAAGTT GACCGCCCCC CCCTACGTAG TGATTCTATC AATCATGTAC GTAGGTAGGA 1380 CCCTCCATTC TGATTGGTAT ATCATGAAAA AAGAAAGCCA TTTGCACCAG GCGCACTGCG 1440 TTTCCCTTGC CCAGATGTTC GTCTTTCTAA GTCAAGTAAT GGTGACCCAC CGAAGACTGG 1500 AGCTTCGTAA CATGTTGACG AAGGCCCCCG AACTGAGGGT TCGGTCAGTA GAAGGGACGA 1560 CTTTGTCTCC CCGGAAGAAG AATAGCCCCG CTCTCTAGCC GACTGATCCC GTTGACCCTA 1620 TAACTGGGAG GGAACGTGTC ACATTAGAGG TGAACGATCA GAGGTGTCTC TAATCACCAC 1680 GACGAGGCGG GTCCCTCTTT TAGTAGACTC AGCTATGAAT ATTCATTCAG AAATGAATGC 1740 CGGGCTCTTT CTTTCACTGC TAACCCCATT TTATTTTCAA CATGCTGAAA CTTTCTGTTT 1800 CGTCGAGCCC CGAGCTTGTG GTCCTCCTTT GAGTGTGGGT TCAATTGAAT GAATCTGTCA 1860 AGTCAAGGAA ACCGTACGTA GCAGCAAGGA TGGTGCATCG CCTATTTATC GTTCTCGCTC 1920 GGGAGCCAAA ACGAACACGC CTGCTACCTA CTGTACTGGA CCTTCGACCA GGCATTCTAC 1980 CTTTGTCGAA TCGGAACCAA CACCACTGCA TTGCGCTCGA ACAGTTGAGC GGCCGCCGGC 2040 AGCAACTTCC GTGCACAGAT ATAGATTCAT TCCTCGTACC TGGTCCAGCC TCACAACCCT 2100 TCGCGGGTTG GTAAGAAGTC AGTCTTGTTT GGTAAGACGG AATTGGACAA AGAAAAGAGA 2160 GTGCTCGACC GGAACAACGG CCAACAAAGA CCGTAATTAC ATAGATAACT GCTCCTCCCC 2220 TTCTCCTTAA GGCTTTAAGG CGAACCGTAT GGCGGCTGGA AAGAAAGACG CCCTCACCTT 2280 CTCTGGTGTC AGTGAGAGCA ATTTGAGTAT CCCCCGTTGA CCTTCTTTTG TAGATAGAAT 2340 CTTCAATGAG TGGAAACAAG CAACCTTACT AAGAAAGGTG CTTGTTGAGT AAGGCCGGCT 2400 TTCGAGCCCA AGCCCCTTGT ATAGGTTGGG CGCTTGAGCG ATCTTTCACA TATCGATCAA 2460 GGCTTTCCTT GAGTTTGAAA TAAGGGGCAA GAAGCAAGGG CGTCAAGGCT GCGCGAAACG 2520 GCTTGCGCCT TAGCGCATCC CTTTTCTTGC AGGAGTGCTA ACGCGCGACC TTACGTTTTC 2580 TTCCGCTTGC TCTGCAGTAC GAGCCTCATA CAGAGCCGCG CTCCTTTAAT ATGATGAGAA 2640 GAAGGGGGGC CGGCCTCTTT TCCGTACCAA TCCTTATTTA CTACTACATC TTTTTTTGGG 2700 TGTATAGCTC AGTTGGTAGA GCATTGGGCT TTTAACCTAA TGGTCGCAGG TTCAAGTCCT 2760 GCTATACCCA AACCTACCTT ACACTCTACT ATGAATAAGG ATGCATAGTA GCCTTCAAAG 2820 ATGACTCTTT GGCCTTTCGA CTCGCTTCGG CGACTTCGCC TTTAAGTGAC AAGGGGGTGA 2880 GCCGCTCCAA GCAAAGCATA GTGAATCCCG AACTTGCCCA CGCTCATCCA AACCGGCCTC 2940 AAAAAGCGAT CGGAAAGCGA AGCCCTTCCT TCCAATCCAA GCCGGCGAAG CCGCCCCTAT 3000 ATCTAACACC GCTCACCCCG ATCACATATT GGCACGTTCA TGATGCATCA TAATCAAAAG 3060 GCCGTAAAGT AAAGAAGACC TATGCATCAG TGTACTGTCA TGATCACATA TAGCTCGATT 3120 TTATTGACGG CTTGAAGGCG AACCGCTATT TCTTAGGGCA AAGGGCGCTC CATCCTCCTA 3180 ACTCCAACCA CTTCTCCCAG GGACAGGAAC TACGGCTTGA CCTTCGGGGA AGAAGTCCGT 3240 GGGACCCCTC CTTCGAGGCG CCTAGATAGT GAAAGGTTAT CCCTTTGCAA GGCTGGAAGC 3300 TAAGCAAAGT CACGAAGCTG GCTGACTACC CTCGAGCAGA GCCCAGACCC GGAGTGGTGG 3360 CTGAACTCGC CGCAGAGTTC AGGAGCGGAA AAGCCACTTG ACTGTAAGGA AAGGAGCGAG 3420 CAAGACTATC TTGGTGAATG CAATAAGAAC CGGCTGCTCG CCGCAGCAGA GTGCTTTGCC 3480 CATGCTGCTA TCCGCCGCCG AAGCGCTCAA GGGATTCGTG CTTGAATGTC GAGATCAGGG 3540 GACTCTATCC AATCCATGCG GCAAATCTGT TTGTGGTGGA AAAAAGTCAA CAATAAAGAA 3600 AAAAGAAACA AACAGAATAT AGAAAATCAT TGAATTTGTT TGCTCCGATA CAAGAGATCG 3660 GCCCCGAAGC AAGATATGGT GGGTGCCAGC AACTTTCACT TGTTAGGAGT AGGGGCTGAA 3720 AAGAGCTCTT TGTATAGGTT GGGTTTTCTG GGCTTTGATG CTTACCTTCT TATTATTAAA 3780 AGGGGAGGGT TTAATAAAGG AGCTGAAAGC CACTTGACTG TAAGGAGAGG AGGTCAATAA 3840 AAAAAAAAGA GATGTTAATT AATCAAAGGT CCAACTGATC ACCACGCCTG TATTGTAAAT 3900 ATGCAGTTAG GAATAATCCA GCCAAAGTAA TAGGAATTAG GCCTAACACG ATTCCAAATA 3960 GAAAAACTTC AACCATTTTT CTTTGTTTGA AAGGAGAAAA AAAAAGAGGT AATATCTATA 4020 CCTAAATATT ATCCGAATTG ACATGAATCT CAATGACAAT GACCAAGAAT TGACAATTGG 4080 TAACGTAAGT AAATATAGAA TACACGTAAT CCCACAGAAA GATTTCTTTT TTAGAATTGT 4140 TCATTTTGAA TATCAGTTTA AATAAGTCGT ATCTTGCTCA GACCAATAAA TAGAGCTGAG 4200 GTTATAGTTA AAGCCGCTAA TAGAAAACCG AAAGAACTAG TTATAGTAAG CATGAAAGGG 4260 CTAAATTAAA TGAAATATGT TCTTTTTATA CATATGTTTA GAAAGCACTT ACCTAAGTTT 4320 CCATTTTTGC AAAATAGGAG GATAGGCAAA AATCTCAATT TCAATTGAAA GAAGAAGTTG 4380 AATTAAATTT TATTCATCTA TCATTATAGG CAGACAGCAC TAACAAAGAT AAGTGACAGA 4440 CATATAAAAG AAATTGATTC ATCATCTGTA ACATCTATCC ATCCCGCAAT TCCAATCAAC 4500 CGATTCATTG AGTAACTCTT GGGTAAACTA TTAAACTAAT AAGAGCTGTA TCGTCTAACT 4560 TCATTCAAAA ATGAAACTGG AATTTTTATA GAATAAAATT CGAAAATCAT TTCTATTTTG 4620 ATCATTTCTT AGATTCTGTT GAATTGTATC GAATCCATTT TCTATTTTAA AGCGAACACT 4680 TATAAAACTA GAAAACTTTT TCTTTTTACT TTAATTTAAG TTTAACTCAT TAGATTCAGT 4740 AATATATTAA TTCACATAAT ATCTTGAATG ATTGAGAAGA AGAAAAAGTT ATCACACAAT 4800 CGCTTGAAAA AATCTTTTTT TTGGGATCAA TATCAGCAGT TCATCCAACG ATAAACAACA 4860 CCCGAATTAT AGAGCTACGA CACAATCAAA CCCGAACGAA CAAAATGTTG AATTTCATCG 4920 TACCAGTCTC TACTGGGGGT TATTACTCAT TTTTGTACTT GCTTTTTTAT TTTCCAATTA 4980 TTTCTTCAAT TAACAAAACG AAAGAGAATA AATAAGATTC TCTTAGCCTC GTTCGGAAGG 5040 ATCTCATAAT TCAATTATCC AAGGCTGTTT ATGTCTCTAG CATGACCACT TGATGAAATC 5100 TGGAGGGAAG TGGGGTAAAT GGCCGATACT ACTGGAAGGA TTCCTCTTTG GATAATAGGT 5160 ACTGTAACTG GTATTCTTGT AATCGGTTTA ATAGGTATTT TCTTTTATGG TTCATATTCC 5220 GGATTGGGTT CATCCCTGTA GTAATCGAAT GAATTGAGTT GTCAACATGA AAGCGTAAGA 5280 ACTCAACGGG ATTCCCAGCA TCTCGTAGAA AAAGAGTATG TAATGTAGAT TTTTCAGAAG 5340 GGTCTAAATA AGACAAAGGA GTTTTCATAA TTTCATTTTT TTTATCATAA ATAATCGCTA 5400 ACAAGAATTT GGTTCTTTTT ACGAACTTGA TGTCGATAAA TCTGCGAATC TATAAATTCA 5460 TTTCGGCCAA TTGAACCTTC TCGAACTCTT TCTTTTTAAG AACCAAAAAG ATTTGTGCCA 5520 AAATAACAGA TGCCAAGAAG AACAAAAGTC CTTGGACACG TAATGGATCT TGAAGTACTA 5580 TTTCTGCATC TCCTGACCAA ATCCGCCTAC ATTAGGATTA CTCGTTAATC CTTGATCAAA 5640 TTTGATAGAT TCGCCCCCGG AAACAAGAAG TTCTGGTCCG GGAGGGATAA TATCAACCAC 5700 TTGACGCCCA TCCGACGCAT CCGTTATGGT TATCTCATAT CCCCCTTTGT CTTTTCGTAT 5760 GATTTTGCTT ACTATACCTG CTGCTGTACG ATTATAAACT GCATTCTTAC TCTTGCTGCC 5820 GTCGGGATAA ATCTGAACCC TTCCCCTGTT CCCGCCTACG TATATAGGAT ATTTTTCGAA 5880 GTGAACATCC TTCTTAGTAG CAGGGTCCGG GGAAAGAATA GGGAAGGTTA ATTTCACTAT 5940 ATTTTTTACC AGGGACAGGG CCTACCACAA GAATCTTTTT TTTATTGGGG CGATAGCTCT 6000 TAAAAGAAAA ATTGCCAATC TTTTCTTTCA TCTCGGGAGG GATACGATCG GGAGGAGCTA 6060 ATTCAACCCC CTCCGGTAAA ATAAGAACAA GCCCCCACGT TCAACCCCCC TTTTTTACCC 6120 ATTAGCAAGA ACTTGTTTCA GTTGCATATC ATAAGGAATT CGAACAACTG CCTCAAATAC 6180 AGTATCCGGA AGTACCGCTT GTGGAACCTC AATCTCCACG GGCTTATTAG CTAAATGGCA 6240 ATTGGCACAT ACAATACGCC CAGTCGCTTC TCGTGGATTT TCATAACCCT GCTGTGCAAA 6300 AGTGGGATAT GCACTTGCAA TAGATGTCCG AGTGTTGATA TATATCATGA GCGATACGGA 6360 AATAGATCGA GTAACTCTTT CTTTAGCCAA GAAAAAGCAT TTCTAGTTTG CATGGTCCAA 6420 TCATTGATCG CGAAAATTTG ACAATAAATT GGGTAGGCTC ACTAGTATAG TTCCTAGCCA 6480 CGATTCTGCT ATTTGCTGGA ATAATCTAGG ATGAATCTCC CCGATGGTTA GAAATAGAAA 6540 GAGTAAATAC TATTTTCAAT ACTTTGCTTA TGTACAACTA CAAAGTACCA AGCATTCTAA 6600 TTGGATTAGA TTAATATCAA TGG 6623

【図面の簡単な説明】

【図１】サザンハイブリダイゼーションの結果を示す電
気泳動写真である。

【図２】サザンハイブリダイゼーションの結果を示す電
気泳動写真である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表される塩基配列を実質的
   に含むミトコンドリア遺伝子。
2. 【請求項２】 請求項１記載のミトコンドリア遺伝子を
   含む組換えベクター。
3. 【請求項３】 請求項１記載のミトコンドリア遺伝子を
   含むミトコンドリア。
4. 【請求項４】 請求項３記載のミトコンドリアを含む細
   胞質。
5. 【請求項５】 請求項４記載の細胞質を含む細胞。
6. 【請求項６】 細胞がトマト植物のものである請求項５
   記載の細胞。