JPH099953A - New fine algae belonging to genus botryococcus - Google Patents
New fine algae belonging to genus botryococcusInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、新規なボツリオコッカ
ス属に属する微細藻類に関し、詳しくは炭素数30の炭
化水素を多く含有する炭素数30〜33の炭化水素を効
率的に産生する新規なボツリオコッカス・ブラウニー
Bレース株に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a novel microalgae belonging to the genus Botryococcus, more specifically, a novel microalga that efficiently contains a hydrocarbon having 30 carbon atoms and has 30 to 33 carbon atoms. Botulio Coccus brownie
Regarding B race stock.
【0002】[0002]
【従来の技術】近年、CO2による地球温暖化が問題と
なっている中で、光エネルギーによりCO2を固定化し
炭化水素に変換する能力を有する微細藻類の利用に対す
る期待が高まっている。この様に光エネルギーを用いて
CO2を固定化し炭化水素を産生する微細藻類のうちで
も、ボツリオコッカス属に属する微細藻類は特に、炭化
水素を産生する能力に優れ、藻体全量に対する炭化水素
の含有量も乾燥重量の20〜40%と際だって高く、ボ
ツリオコッカス属に属する微細藻類の培養藻体から炭化
水素を取り出してこれを有効利用する様々な研究が既に
行われている。2. Description of the Related Art In recent years, with global warming caused by CO 2 becoming a problem, expectations are increasing for the use of microalgae having the ability to fix CO 2 by light energy and convert it into hydrocarbons. Of the microalgae that fix CO 2 by using light energy to produce hydrocarbons in this manner, the microalgae belonging to the genus Botryococcus are particularly excellent in the ability to produce hydrocarbons and are hydrocarbons based on the total amount of algal cells. The content thereof is remarkably high at 20 to 40% of the dry weight, and various studies have already been conducted to extract hydrocarbons from cultured alga bodies of microalgae belonging to the genus Botryococcus and utilize them effectively.
【0003】上記ボツリオコッカス属に属する微細藻類
のうちでもボツリオコッカス属Bレースに属する微細藻
類の藻体が産生する炭化水素は、総称してボツリオコッ
セン(Botryococcenes)と呼ばれる特徴的な炭化水素で
あり、ボツリオコッカス属Bレースに属する微細藻類の
株の違いにより、産生される炭化水素の種類や、産生さ
れる総炭化水素中の個々の炭化水素の含有量も様々であ
る。Among the above-mentioned microalgae belonging to the genus Botryococcus, the hydrocarbons produced by the algal bodies of the microalgae belonging to the B race of the genus Botryococcus are characteristic hydrocarbons collectively called Botryococcenes. There are various types of hydrocarbons produced and the content of individual hydrocarbons in the total produced hydrocarbons also varies depending on the strain of the microalgae belonging to the B race of the genus Botryococcus.
【0004】ここで、現在知られているボツリオコッカ
ス・ブラウニー Bレースに属する微細藻類では、産生
する炭化水素は炭素数が34以上の炭化水素がその大部
分を占める株が多く、また、炭素数34以上の炭化水素
を産生炭化水素中に含有しない株や含有しても極少量で
ある株も知られているが、これらの株では炭化水素が3
3あるいは32の炭化水素が産生炭化水素中の主成分と
なっている。この様なボツリオコッカス・ブラウニー
Bレースに属する微細藻類が産生する炭化水素は、精製
された後、これをそのまま燃料として用いたり、あるい
は得られた炭化水素を水素添加等の還元反応により飽和
炭化水素として化粧料基剤等に用いたりすることが可能
であるが、上述の様に産生される炭化水素の炭素数が大
きいために精製に必要な蒸留等に多量なエネルギーが必
要であった。Here, in the currently known microalgae belonging to the Botryococcus brownie B race, most of the hydrocarbons produced are strains having carbon atoms of 34 or more, and most of them are carbonaceous strains. Strains containing no more than 34 hydrocarbons in the produced hydrocarbons and strains containing very few hydrocarbons are known, but these strains contain 3 hydrocarbons.
3 or 32 hydrocarbons are the main components in the produced hydrocarbons. Such a Botryococcus brownie
The hydrocarbons produced by the microalgae belonging to B race are purified and then used as fuel as they are, or the obtained hydrocarbons are used as a saturated hydrocarbon by a reduction reaction such as hydrogenation to be used as a cosmetic base. Although it can be used, a large amount of energy is required for distillation and the like required for purification because the hydrocarbon produced as described above has a large number of carbon atoms.
【0005】そこで、炭化水素を産生する能力に優れる
ボツリオコッカス・ブラウニー Bレースに属する微細
藻類において、精製等に要するエネルギーを省力化する
こと等を目的として、産生する炭化水素の炭素数が30
〜33程度の炭化水素からなり、これら炭化水素の内で
も炭素数の小さい炭化水素をより効率的に産生するボツ
リオコッカス属に属する微細藻類の新規な株が望まれて
いた。[0005] Therefore, in the microalgae belonging to the Botryococcus brownie B race excellent in the ability to produce hydrocarbons, the number of carbon atoms of the produced hydrocarbons is 30 for the purpose of saving the energy required for purification and the like.
A novel strain of microalgae belonging to the genus Botryococcus, which is composed of about 33 to about 33 hydrocarbons and more efficiently produces hydrocarbons having a small carbon number among these hydrocarbons, has been desired.
【0006】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、炭素数30〜33程度の炭化水
素からなり、これら炭化水素の内でも炭素数が小さい炭
化水素をより効率的に産生するボツリオコッカス属に属
する微細藻類の新規な株を提供することを課題とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made from the above viewpoint, and is composed of hydrocarbons having about 30 to 33 carbon atoms. Among these hydrocarbons, hydrocarbons having smaller carbon number are more efficient. It is an object of the present invention to provide a novel strain of microalgae belonging to the genus Botryococcus which is produced in Japan.
【0007】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、藻体が産生する
炭化水素が主として炭素数30〜33の炭化水素からな
り、前記炭化水素の総量に対する炭素数30の炭化水素
の割合が5重量%以上であるボツリオコッカス属に属す
る微細藻類の新規株を見出し、本発明を完成させた。As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found that the hydrocarbons produced by algae are mainly hydrocarbons having 30 to 33 carbon atoms. The present invention was completed by discovering a new strain of microalgae belonging to the genus Botuliococcus having a ratio of hydrocarbons having 30 carbon atoms to the total amount of hydrogen of 5% by weight or more.
【0008】すなわち本発明は、藻体が産生する炭化水
素が主として炭素数30、31、32及び33の炭化水
素からなり、前記炭化水素の総量に対する炭素数30の
炭化水素の割合が5重量%以上であるボツリオコッカス
・ブラウニー Bレースの新規株を提供する。That is, according to the present invention, the hydrocarbons produced by the alga are mainly hydrocarbons having 30, 31, 32 and 33 carbon atoms, and the ratio of the hydrocarbon having 30 carbon atoms to the total amount of the hydrocarbons is 5% by weight. We will provide new strains of Botulio Coccus Brownie B races as described above.
【0009】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
の、藻体が産生する炭化水素が主として炭素数30、3
1、32及び33の炭化水素からなり、前記炭化水素の
総量に対する炭素数30の炭化水素の割合が5重量%以
上であるBレースに属するボツリオコッカス・ブラウニ
ー(Botryococcus braunii)の新規株は、湖水等から採
取されたボツリオコッカス属に属する微細藻類(以下、
「ボツリオコッカス属藻類」という)を含有するサンプ
ルから以下の方法を用いて分離することが可能である。Hereinafter, the present invention will be described in detail. The hydrocarbons produced by the algal cells of the present invention are mainly those having 30 or 3 carbon atoms.
A new strain of Botryococcus braunii belonging to B-race consisting of 1, 32 and 33 hydrocarbons, wherein the proportion of hydrocarbons having 30 carbon atoms to the total amount of said hydrocarbons is 5% by weight or more, Microalgae belonging to the genus Botryococcus collected from lake water (hereinafter,
It is possible to separate from a sample containing "Botryococcus algae") using the following method.
【0010】上記ボツリオコッカス属藻類を含有するサ
ンプルは、例えば、淡水湖(池、沼等を含む)、汽水湖
等の湖水表面から、プランクトンネット(網目:10μ
m〜200μm程度)等を用いて採取することができる
が、ボツリオコッカス属藻類を含有するサンプルであれ
ば特に制限されるものではない。The sample containing the algae of the genus Botryococcus is, for example, a plankton net (mesh: 10 μm) from the surface of fresh water (including ponds, swamps, etc.) and brackish water.
m-200 μm) or the like, but the sample is not particularly limited as long as it is a sample containing Botryococcus algae.
【0011】この様にして採取されたサンプルから本発
明のボツリオコッカス・ブラウニーBレースの新規株を
分離するためにはまず、上記サンプルに有効塩素を作用
させ、ボツリオコッカス属藻類以外の微生物を殺菌す
る。この時、処理されるサンプルは、有効塩素処理及び
その後の処理をしやすくするために、予め適当な培地で
培養して藻体量を増やしておいてもよい。培地として
は、CHU培地、JM培地、MDM培地など無機培地が
挙げられるが、ボツリオコッカス属藻類の培養に適した
ものであれば、特に制限されない。また、有効塩素で処
理するのはサンプルまたは培養液そのものでもよく、更
に、サンプルまたは培養液から遠心分離、濾過等により
得た藻体又は濃縮液でもよい。In order to isolate the novel strain of Botryococcus brownie B race of the present invention from the sample thus collected, first, the above-mentioned sample is treated with available chlorine so that microorganisms other than the alga of the genus Botryococcus To sterilize. At this time, the sample to be treated may be previously cultured in an appropriate medium to increase the amount of algal cells in order to facilitate the effective chlorine treatment and the subsequent treatment. Examples of the medium include CHU medium, JM medium, MDM medium and other inorganic media, but are not particularly limited as long as they are suitable for culturing Botryococcus algae. Further, the sample or the culture solution itself may be treated with available chlorine, or the algal cells or the concentrated solution obtained from the sample or the culture solution by centrifugation, filtration or the like.
【0012】上記ボツリオコッカス属藻類を含むサンプ
ルに有効塩素を作用させるには、例えば、次亜塩素酸水
溶液、または次亜塩素酸ナトリウムもしくは次亜塩素酸
カルシウム等の次亜塩素酸塩の水溶液(以下、単に「次
亜塩素酸」という)に前記試料を懸濁させる方法が挙げ
られる。サンプルの処理に用いる次亜塩素酸の濃度は、
通常、有効塩素の濃度として0.01〜1000pp
m、好ましくは0.1〜100ppmであり、また、処
理時間は0.1〜1000分、好ましくは1〜100分
である。この濃度が0.01ppmよりも低いとあるい
は処理時間が0.1分より短いと雑菌が十分に殺菌され
ないことがある。また、濃度が1000ppmを越える
とあるいは処理時間が1000分より長いとボツリオコ
ッカス属藻類自体が死滅することがある。In order to make available chlorine act on a sample containing the above-mentioned Botryococcus alga, for example, an aqueous solution of hypochlorous acid or an aqueous solution of hypochlorite such as sodium hypochlorite or calcium hypochlorite. A method of suspending the sample in (hereinafter, simply referred to as “hypochlorous acid”) can be mentioned. The concentration of hypochlorous acid used to process the sample is
Usually, the effective chlorine concentration is 0.01 to 1000 pp
m, preferably 0.1 to 100 ppm, and the treatment time is 0.1 to 1000 minutes, preferably 1 to 100 minutes. If this concentration is lower than 0.01 ppm or if the treatment time is shorter than 0.1 minutes, various bacteria may not be sterilized sufficiently. Further, if the concentration exceeds 1000 ppm or if the treatment time is longer than 1000 minutes, the Botryococcus alga itself may be killed.
【0013】また、上記サンプルの培養液を次亜塩素酸
で処理する場合には、次亜塩素酸を上記濃度となるよう
に加えればよく、また、藻体を次亜塩素酸で処理する場
合には、上記濃度となるように希釈した次亜塩素酸水溶
液あるいは培養液で希釈した次亜塩素酸に藻体を懸濁さ
せればよい。When the culture solution of the above sample is treated with hypochlorous acid, hypochlorous acid may be added so as to have the above concentration, and when algal cells are treated with hypochlorous acid. For this purpose, the algal cells may be suspended in the hypochlorous acid aqueous solution diluted to the above concentration or in the hypochlorous acid diluted with the culture solution.
【0014】上記のようにしてサンプルを次亜塩素酸で
処理した後に、これをそのまま用いてもよいが、藻体を
濾過又は遠心分離等により分離し、培養液又は緩衝液に
懸濁する操作を繰り返すことなどによって洗浄し、ある
いはチオ硫酸ナトリウム等を加えること等により有効塩
素を除去することが好ましい。加えるチオ硫酸ナトリウ
ムの量は、加えた次亜塩素酸から生じる有効塩素の全量
を除去するのに必要な量であることが好ましい。After treating the sample with hypochlorous acid as described above, the sample may be used as it is, but an operation of separating algal cells by filtration or centrifugation and suspending them in a culture solution or a buffer solution. It is preferable to remove the available chlorine by washing by repeating the above, or by adding sodium thiosulfate or the like. The amount of sodium thiosulfate added is preferably the amount required to remove all of the available chlorine resulting from the added hypochlorous acid.
【0015】続いて、上記次亜塩素酸処理を行ったサン
プルを、ボツリオコッカス属藻類の培養に適した平板培
地、例えば、CHU培地、JM培地、MDM改変培地な
どの無機培地、またはこれら無機培地にグルコース、ク
エン酸、酢酸などの有機炭素源を加えた培地に塗布して
培養を行う。ここで用いる培地には、ボツリオコッカス
属藻類の生育に影響を与えない抗生物質等を添加しても
よい。また、平板培地に塗布する際に、塗布量が多すぎ
ると、平板培地に生じるコロニーが近接し、コロニーを
分離しにくくなるので、数段階で希釈したものを塗布す
るとよい。Subsequently, the hypochlorous acid-treated sample is treated with a plate medium suitable for culturing Botryococcus algae, for example, an inorganic medium such as CHU medium, JM medium, MDM modified medium, or the like. The culture is performed by applying the medium to a medium in which an organic carbon source such as glucose, citric acid, and acetic acid is added. An antibiotic or the like that does not affect the growth of Botryococcus alga may be added to the medium used here. When the amount of application is too large when applying to the plate medium, colonies formed on the plate medium come close to each other and it becomes difficult to separate the colonies. Therefore, it is advisable to apply the diluted solution in several steps.
【0016】培養は、蛍光灯等を用いて光照射下で行う
ことが好ましいが、照射照度が高すぎるとかえって増殖
が阻害される場合があるので、通常0〜300μE/m
2・s、好ましくは5〜100μE/m2・sで照射する
のがよい。また、培養温度としては、通常0〜80℃、
好ましくは15〜35℃がよい。The culture is preferably performed under light irradiation using a fluorescent lamp or the like. However, if the irradiation illuminance is too high, the growth may be hindered. Therefore, the culture is usually 0 to 300 μE / m.
Irradiation is performed at 2 · s, preferably 5 to 100 μE / m 2 · s. The culture temperature is usually 0 to 80 ° C,
It is preferably 15 to 35 ° C.
【0017】培養は、通常1〜60日、好ましくは1〜
30日行う。培養中に生じるコロニーが、残存する雑菌
のコロニーであるか、あるいは単一のボツリオコッカス
属藻類のコロニーであるかを判明するにはある程度の培
養期間が必要であり、培養期間が長すぎると雑菌が繁茂
するので、上記期間内で培養するのが好ましいが、培地
や培養条件、雑菌の残存の程度等によっても異なるの
で、培養中にコロニーを観察し、適宜培養を打ち切れば
よい。The culture is usually carried out for 1 to 60 days, preferably 1 to
Do 30 days. A certain culture period is required to determine whether the colonies generated during the culture are colonies of remaining bacteria or a single colony of Botryococcus algae, and if the culture period is too long Since various bacteria grow, it is preferable to culture within the above period, but since it varies depending on the medium, the culture conditions, the degree of remaining of various bacteria, etc., colonies may be observed during the culture and the culture may be appropriately stopped.
【0018】上記のようにして平板培地上に生じたボツ
リオコッカス属藻類の単一コロニーを採取することによ
り、ボツリオコッカス属藻類の種々の純化株が得られ
る。平板培地からコロニーを分離する際には、顕微鏡、
好ましくは実体顕微鏡観察下で行うと、ボツリオコッカ
ス属藻類のコロニーであることを確認しながら採取でき
る点で好ましい。コロニーの採取の方法は特に問わず、
例えば滅菌した白金線でかき取り、あるいはパスツール
ピペットで吸い上げればよい。この際、空中の雑菌によ
る汚染を防止するために、無菌室またはクリーベンチ内
で操作を行うとよい。By collecting a single colony of Botryococcus algae formed on the plate medium as described above, various purified strains of Botryococcus algae can be obtained. When separating colonies from the plate medium, use a microscope,
It is preferable to carry out the observation under a stereoscopic microscope, since it can be collected while confirming that it is a colony of Botryococcus alga. The method of collecting colonies is not particularly limited,
For example, it may be scraped with a sterilized platinum wire or sucked up with a Pasteur pipette. At this time, in order to prevent contamination by airborne bacteria, it is advisable to carry out the operation in a sterile room or cleave bench.
【0019】上記のようにして分離した株を再び培養
し、雑菌が生育しないことを確認することによって、こ
れらが純化株であることを確認することができる。さら
に、得られた純化株が、ボツリオコッカス属藻類である
ことを顕微鏡観察等により確認しておくとよい。It is possible to confirm that these are purified strains by culturing again the strains isolated as described above and confirming that the germs do not grow. Furthermore, it is advisable to confirm that the obtained purified strain is an alga of the genus Botryococcus by microscopic observation or the like.
【0020】この様にして得られたボツリオコッカス属
藻類の純化株を分離して、それぞれの純化株について、
これらの純化株の藻体が産生する炭化水素の分析を以下
の方法で行い、藻体が産生する炭化水素が主として炭素
数30、31、32及び33の炭化水素からなり、全炭
化水素量に対する炭素数30の炭化水素の割合が5重量
%以上である株をスクリーニングすることにより、本発
明のボツリオコッカス属藻類の新規株が得られる。ここ
で、本発明において「炭化水素が主として炭素数30、
31、32及び33の炭化水素からなり」とは、炭素数
30、31、32及び33の炭化水素の合計量の、藻体
が産生する全炭化水素量に占める割合が概ね90重量%
以上であることを示す。Purified strains of Botryococcus alga obtained in this manner are separated, and each purified strain is
The hydrocarbons produced by the algal bodies of these purified strains are analyzed by the following method, and the hydrocarbons produced by the algal bodies consist mainly of hydrocarbons having 30, 31, 32, and 33 carbon atoms, and A new strain of the genus Alga of the genus Botryococcus of the present invention can be obtained by screening a strain having a hydrocarbon ratio of 30 carbon atoms of 5% by weight or more. Here, in the present invention, "hydrocarbons mainly have 30 carbon atoms,
"Comprising 31, 32, and 33 hydrocarbons" means that the proportion of the total amount of hydrocarbons having 30, 31, 32, and 33 carbon atoms in the total amount of hydrocarbons produced by the alga is approximately 90% by weight.
The above is shown.
【0021】ボツリオコッカス属藻類の藻体が産生する
炭化水素を分析する方法としては、従来から行われてい
る方法を用いればよく、例えば、ボツリオコッカス属藻
類を培養して藻体を増殖させ、得られた培養液から濾過
等で取り出した湿藻体を凍結乾燥または加温して乾燥し
た後、この藻体乾燥物に内部標準として一定量のn−ペ
ンタコサン等を加え、n−ヘキサン、メタノール−クロ
ロホルム(1:1)等の抽出溶媒に浸漬して炭化水素を
抽出させ(Phytochemistry,vol.19,1081-1085,1980)、
その後、藻体、溶出溶媒を除去し、抽出された炭化水素
についてNMR、IR、ガスクロマトグラフィーやGC
−MS等で分析を行う方法をとればよい。As a method for analyzing the hydrocarbons produced by the algal bodies of Botryococcus algae, conventionally used methods may be used. For example, the algae are grown by culturing Botryococcus algae. Then, the wet algal cells taken out from the obtained culture solution by filtration and the like are freeze-dried or heated and dried, and then a fixed amount of n-pentacosane or the like is added as an internal standard to the dried algal cells, and n-hexane is added. , Methanol-chloroform (1: 1) soaks in an extraction solvent to extract hydrocarbons (Phytochemistry, vol.19,1081-1085,1980),
Then, the algal cells and the elution solvent were removed, and the extracted hydrocarbons were analyzed by NMR, IR, gas chromatography and GC.
-A method such as MS may be used for analysis.
【0022】この様にして藻体が産生する炭化水素が主
として炭素数30、31、32及び33の炭化水素から
なり、全炭化水素量に対する炭素数30の炭化水素の割
合が5重量%以上である株をスクリーニングすること
で、本発明のボツリオコッカス属藻類の株が得られる
が、これらの株についてそれぞれ分類学的性質を調べる
ことにより、これらの株の同定が行われる。炭化水素産
生能に関して上記特徴(藻体が産生する炭化水素が主と
して炭素数30、31、32及び33の炭化水素からな
り、全炭化水素量に対する炭素数30の炭化水素の割合
が5重量%以上である)を有する本発明のボツリオコッ
カス属藻類は、この様な分類学的性質の調査によりボツ
リオコッカス・ブラウニー Bレースに属する株である
ことが確認された。また、藻体が産生する炭化水素につ
いての上記特徴は、後述のように、これまでに見出され
た他のボツリオコッカス・ブラウニー Bレースの株に
は見られないものであり、本発明のボツリオコッカス・
ブラウニー Bレース株は新規であると言える。The hydrocarbons produced by the alga in this manner are mainly composed of hydrocarbons having 30, 31, 32 and 33 carbon atoms, and the ratio of the hydrocarbon having 30 carbon atoms to the total amount of hydrocarbons is 5% by weight or more. The strains of the genus Alga of the genus Botryococcus of the present invention can be obtained by screening certain strains. These strains are identified by examining their taxonomic properties. Regarding the hydrocarbon production capacity, the above characteristics (hydrocarbons produced by algae are mainly hydrocarbons having 30, 31, 32 and 33 carbon atoms, and the ratio of hydrocarbons having 30 carbon atoms to the total amount of hydrocarbons is 5% by weight or more. The algae of the genus Botryococcus of the present invention having the following) was confirmed to be a strain belonging to Botryococcus brownie B race by the investigation of such taxonomic properties. Further, the above-mentioned characteristics of the hydrocarbon produced by the alga are not found in other strains of Botryococcus brownie B race found so far, as will be described later. Botulio Coccus
It can be said that the Brownie B race strain is new.
【0023】尚、この様な藻体が産生する炭化水素が主
として炭素数30、31、32及び33の炭化水素から
なり、全炭化水素量に対する炭素数30の炭化水素の割
合が5重量%以上である本発明のボツリオコッカス・ブ
ラウニー Bレース株のうちでも、更に藻体が産生する
全炭化水素量に対する炭素数30の炭化水素の割合が1
0重量%以上であるボツリオコッカス・ブラウニー B
レース株が本発明においてはより好ましい。The hydrocarbons produced by such algal cells are mainly hydrocarbons having 30, 31, 32 and 33 carbon atoms, and the ratio of the hydrocarbons having 30 carbon atoms to the total amount of hydrocarbons is 5% by weight or more. Among the Botryococcus brownie B race strains of the present invention, the ratio of hydrocarbons having 30 carbon atoms to the total amount of hydrocarbons produced by algal cells is 1
Botryococcus brownie B with 0% by weight or more
Race strains are more preferred in the present invention.
【0024】この様な本発明のボツリオコッカス・ブラ
ウニー Bレース株の1例として後述実施例で分離され
たボツリオコッカス・ブラウニー SI−1株が挙げら
れるが、このボツリオコッカス・ブラウニー SI−1
株は、本発明により初めて得られた新規株であり、この
株の藻体が産生する炭化水素においては、炭素数30、
31、32及び33の炭化水素の合計量の、全炭化水素
量に占める割合は概ね95重量%以上であり、全炭化水
素量に対する炭素数30の炭化水素の割合は概ね10〜
30重量%であり、本発明においてより好ましいと言え
る。また、本株の工業技術院生命工学工業技術研究所へ
の寄託は拒否されたが、本発明の成立の確認のために菌
株を分譲することは、ここに保証されるものである。As an example of such a Botryococcus brownie B race strain of the present invention, there can be mentioned the Botryococcus brownie SI-1 strain isolated in the below-mentioned Example. 1
The strain is a novel strain obtained by the present invention for the first time, and the hydrocarbon produced by the alga of this strain has 30 carbon atoms,
The ratio of the total amount of hydrocarbons of 31, 32, and 33 to the total amount of hydrocarbons is generally 95% by weight or more, and the ratio of the hydrocarbon having 30 carbon atoms to the total amount of hydrocarbons is generally 10 to 10.
It is 30% by weight and can be said to be more preferable in the present invention. Although the deposit of this strain to the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, AIST was refused, the distribution of the strain to confirm the establishment of the present invention is guaranteed here.
【0025】[0025]
【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。EXAMPLES Examples of the present invention will be described below.
【0026】[0026]
【実施例1】網目が25μmの北原式プランクトンネッ
ト用いて、一碧湖(静岡県)の湖水表面のプランクトン
類を採集した。得られた試料を顕微鏡で観察したとこ
ろ、ボツリオコッカス属藻類に特徴的な形態をしたコロ
ニー(顕微鏡下、10〜30分経過するとコロニーから
油滴が分泌)が認められた。Example 1 Planktons on the surface of lake water of Lake Ippiki (Shizuoka Prefecture) were collected using a Kitahara type plankton net having a mesh of 25 μm. When the obtained sample was observed under a microscope, colonies having a morphology characteristic of Botryococcus algae (oil droplets were secreted from the colonies after 10 to 30 minutes under the microscope) were observed.
【0027】上記湖水サンプルを4本の試験管に分け、
それぞれに有効塩素濃度が1ppm、5ppm、10p
pm、20ppmになるように次亜塩素酸ナトリウムを
加え、10分間、室温で静置した。静置後、活性塩素を
除去するためにチオ硫酸ナトリウムを活性塩素1mgあ
たり7.16mgとなるように加えた。The lake water sample was divided into four test tubes,
Effective chlorine concentration for each is 1ppm, 5ppm, 10p
Sodium hypochlorite was added to pm of 20 ppm, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After standing, sodium thiosulfate was added to remove active chlorine so that the amount of 7.16 mg was 1 mg of active chlorine.
【0028】上記処理液を、グルコース0.1%、寒天
1.5%を含むJM培地の平板培地に塗布し、蛍光灯を
光源として約15μE/m2・sになるように照射し、
25℃にて1週間培養した。尚、JM培地の組成は以下
のとおりである。 〔JM培地の組成〕下記表1中1〜9のストック溶液1
mLずつを混合し、蒸留水又は脱イオン水を用いて1L
とし、pHを7付近に調整する。The above treatment solution was applied to a plate medium of JM medium containing glucose 0.1% and agar 1.5%, and irradiated with a fluorescent lamp as a light source at about 15 μE / m 2 · s,
The cells were cultured at 25 ° C for one week. The composition of the JM medium is as follows. [Composition of JM medium] Stock solutions 1 to 9 in Table 1 below
Mix each mL and use distilled or deionized water to 1 L
And adjust the pH to around 7.
【0029】[0029]
【表1】 [Table 1]
【0030】培養後、クリーンベンチ内で実体顕微鏡
(倍率20倍)を用いてコロニー形状等のボツリオコッ
カス属藻類特有の性質を観察しながらボツリオコッカス
属藻類の単一コロニーを白金線でかき取り、グルコース
0.1%、寒天1.5%を含むJM平板培地に移植し
た。これを、蛍光灯による約15μE/m2・sの光照
射下で、25℃で4週間培養した。After culturing, a single colony of Botryococcus algae was scratched with a platinum wire while observing the characteristics peculiar to Botryococcus algae such as the colony shape using a stereoscopic microscope (20 times magnification) in a clean bench. It was taken and transferred to a JM plate medium containing glucose 0.1% and agar 1.5%. This was cultured at 25 ° C. for 4 weeks under irradiation with light of about 15 μE / m 2 · s by a fluorescent lamp.
【0031】上記で得られたボツリオコッカス属藻類の
藻体を白金線を用いてかき取り、JM液体培地に移し、
光照射下でさらに2週間培養した。白金耳で培養液の一
部をとり、普通寒天培地(1L中に、肉エキス:5g、
ペプトン:10g、塩化ナトリウム:5g、寒天:15
gを含む;pH7.0)の平板培地に塗布し、25℃で
7日間培養し、雑菌が生育しないことを確認した。ま
た、こうして得られた純化株を顕微鏡観察し、ボツリオ
コッカス・ブラウニーのみであることを、コロニー形状
等の本藻類特有の性質(葉緑体を細胞中に含む西洋梨型
をした細胞が集合し、ほぼ球状のコロニーを形成してい
る。更に、コロニーを顕微鏡下観察を続けると油滴を生
じる。)により確認した。The algae of Botryococcus algae obtained above were scraped using a platinum wire and transferred to a JM liquid medium,
The cells were further cultured under light irradiation for 2 weeks. Take a part of the culture solution with a platinum loop and use a normal agar medium (meat extract: 5 g in 1 L,
Peptone: 10 g, sodium chloride: 5 g, agar: 15
g; pH 7.0), and cultured at 25 ° C. for 7 days to confirm that no bacteria grow. In addition, microscopic observation of the purified strain obtained in this way revealed that only Botryococcus brownies showed the unique properties of the algae, such as colony shape (a pear-shaped cell containing chloroplasts in the cells was collected. An approximately spherical colony was formed, and the colony was further observed under a microscope to produce oil droplets.)
【0032】ここで、この様にして得られた純化株をボ
ツリオコッカス・ブラウニー SI−1株とした。な
お、湖水サンプルをそのまま平板(JM培地及びグルコ
ースを含むJM培地)に塗布し培養したが、ボツリオコ
ッカスのみのコロニーは得られなかった。The purified strain thus obtained was designated as Botulinum coccus brownie SI-1 strain. The lake water sample was directly applied to a plate (JM medium and JM medium containing glucose) and cultured, but no colonies of Botryococcus alone were obtained.
【0033】次に、上記で得られたボツリオコッカス・
ブラウニー SI−1株をグルコースを含むJM培地に
接種し、植え継ぎを繰り返しながら5カ月間培養した。
この固体培養で得られた藻体を、表2に組成を示すCH
U−13×2培地(pH7)を0.3L入れた偏平フラ
スコに接種し、8日間の液体培養(培養条件;照度:2
80μE/s・m2、通気量:0.5vvm(5%C
O2)、温度25℃)を行った。Next, the Botryococcus
The Brownie SI-1 strain was inoculated into a JM medium containing glucose and cultured for 5 months while repeating subculture.
CH 2 whose composition is shown in Table 2 is obtained from the algal cells obtained by this solid culture.
A flat flask containing 0.3 L of U-13 × 2 medium (pH 7) was inoculated, and liquid culture was carried out for 8 days (culture conditions; illuminance: 2
80 μE / s · m 2 , ventilation rate: 0.5 vvm (5% C
O 2 ), temperature 25 ° C.).
【0034】[0034]
【表2】 [Table 2]
【0035】[0035]
【表3】 [Table 3]
【0036】得られた藻体を105℃で乾燥し、50倍
量のn−ヘキサンを用いて炭化水素の抽出を3回行っ
た。n−ヘキサン相を濃縮後、シリカゲルカラムクロマ
トグラフィーで炭化水素を精製した。n−ヘキサン溶出
された炭化水素画分を濃縮し、これをNMR、IR、G
C−MSを用いて分析した。NMR分析では、不飽和プ
ロトン由来のピークが4.4〜6ppmに、飽和プロト
ン由来のピークが0.6〜2.7ppmに観察された。
飽和プロトンと不飽和プロトンの比はほぼ4:1であっ
た。IRでは、3080cm-1、1640cm-1に二重
結合由来の吸収が認められた。その他、CH結合、CC
結合以外の結合が認められないことから炭化水素と確認
された。The obtained algal cells were dried at 105 ° C., and hydrocarbons were extracted 3 times with 50 times the amount of n-hexane. After concentrating the n-hexane phase, the hydrocarbon was purified by silica gel column chromatography. The hydrocarbon fraction eluted with n-hexane was concentrated, and it was collected by NMR, IR, G
It analyzed using C-MS. In the NMR analysis, a peak derived from an unsaturated proton was observed at 4.4 to 6 ppm, and a peak derived from a saturated proton was observed at 0.6 to 2.7 ppm.
The ratio of saturated to unsaturated protons was approximately 4: 1. In IR, absorption derived from the double bond was observed at 3080 cm -1 and 1640 cm -1 . Others, CH bond, CC
Since no bond other than the bond was observed, it was confirmed to be hydrocarbon.
【0037】次にGC−MSより、GCで観察されたピ
ークの親イオンは410、424、434、446であ
ることからそれぞれ炭素数30、31、32、33のボ
ツリオコッカス・ブラウニー Bレースに特徴的な炭化
水素であることが確認され、これよりボツリオコッカス
・ブラウニー SI−1株をボツリオコッカス・ブラウ
ニー Bレースと同定した。また、上記液体培養により
ボツリオコッカス・ブラウニー SI−1株が産生した
炭化水素の組成は、上記GC−MS分析により、炭素数
30、31、32、33の炭化水素がそれぞれ26重量
%、12重量%、44重量%、15重量%であり、この
他に炭素数34の炭化水素が微量ではあるが含まれてい
ることがわかった。Next, according to GC-MS, the parent ions of the peaks observed in GC were 410, 424, 434, and 446. Therefore, it was confirmed that the botulinum Coccus brownie B races having 30, 31, 32, and 33 carbon atoms were obtained. It was confirmed to be a characteristic hydrocarbon, and from this, the Botryococcus brownie SI-1 strain was identified as a botulococcus brownie B race. Further, the composition of the hydrocarbon produced by the Botryococcus brownie SI-1 strain by the liquid culture was 26% by weight of hydrocarbons having 30, 31, 32, and 33 carbon atoms by the GC-MS analysis, respectively. %, 44% by weight, 15% by weight, and it was found that a hydrocarbon having a carbon number of 34 was also contained in a small amount.
【0038】[0038]
【実施例2】上記実施例1と同様にして得られたボツリ
オコッカス・ブラウニー SI−1株をグルコースを含
むJM培地に接種し4週間培養した。この固体培養で得
られた藻体を掻き取り、これを105℃で乾燥した後、
この乾燥藻体をn−ヘキサンで3回抽出した。抽出溶液
よりn−ヘキサンを濃縮除去後、これをガスクロマトグ
ラフィーで分析した。ガスクロマトグラフィーのカラム
には、フェニルメチルシリコン系キャピラリーカラム
(25m)を用いた。この結果、この培養で産生された
炭化水素の組成は、炭素数30、31、32、33の炭
化水素がそれぞれ11重量%、6重量%、61重量%、
22重量%であることがわかった。Example 2 Botryococcus brownie SI-1 strain obtained in the same manner as in Example 1 was inoculated into a JM medium containing glucose and cultured for 4 weeks. After scraping off the algal cells obtained by this solid culture and drying this at 105 ° C.,
The dried algal cells were extracted 3 times with n-hexane. After n-hexane was concentrated and removed from the extracted solution, it was analyzed by gas chromatography. A phenylmethylsilicon-based capillary column (25 m) was used as the gas chromatography column. As a result, the composition of the hydrocarbons produced in this culture was 11% by weight, 6% by weight, 61% by weight of hydrocarbons having 30, 31, 32 and 33 carbon atoms, respectively.
It was found to be 22% by weight.
【0039】[0039]
【実施例3】上記実施例1と同様にして、ボツリオコッ
カス・ブラウニー SI−1株をグルコースを含むJM
培地で固体培養した後、得られた藻体を上記表2に組成
を示すCHU−13×2培地(pH7)で液体培養し
た。得られた藻体をCHU−13×2培地(pH7)3
Lの入った撹拌型培養槽に接種し、更に8日間の液体培
養(培養条件;照度:180μE/s・m2、通気量:
0.5vvm(5%CO2)、温度25℃)を行った。
この培養液の10mLを取り出し、濾紙を用いて藻体を
回収後、105℃で乾燥した。得られた乾燥藻体にn−
ヘキサンを加え3回の抽出処理を行った。抽出液を濃縮
後、ガスクロマトグラフィーで分析した。この結果、こ
の培養で産生された炭化水素の組成は、炭素数30、3
1、32、33の炭化水素がそれぞれ16重量%、15
重量%、52重量%、17重量%であることがわかっ
た。[Example 3] In the same manner as in Example 1 above, the botulinum Coccus brownie SI-1 strain was mixed with JM containing glucose.
After solid-cultured in the medium, the obtained algal cells were liquid-cultured in CHU-13 × 2 medium (pH 7) having the composition shown in Table 2 above. The obtained algal cells were mixed with CHU-13 × 2 medium (pH 7) 3
The mixture was inoculated into a stirred culture tank containing L and further liquid-cultured for 8 days (culture conditions; illuminance: 180 μE / s · m 2 , aeration amount:
0.5 vvm (5% CO 2 ), temperature 25 ° C.).
10 mL of this culture broth was taken out, the algal cells were collected using a filter paper, and then dried at 105 ° C. N- was added to the obtained dried algal cells.
Hexane was added and extraction treatment was performed 3 times. The extract was concentrated and then analyzed by gas chromatography. As a result, the composition of the hydrocarbons produced in this culture has 30 and 3 carbon atoms.
Hydrocarbons of 1, 32 and 33 are 16% by weight and 15% respectively
It was found to be wt%, 52 wt% and 17 wt%.
【0040】上記実施例1〜3の培養で本発明のボツリ
オコッカス・ブラウニー SI−1株により産生された
炭化水素の組成についての分析結果を、他のボツリオコ
ッカス・ブラウニー Bレース株の産生炭化水素分析値
(文献値)と共に表4に示す。The results of analysis on the composition of hydrocarbons produced by the Botryococcus brownie SI-1 strain of the present invention in the culture of Examples 1 to 3 above were analyzed and the results of other Botryococcus brownie B race strains were produced. It is shown in Table 4 together with the hydrocarbon analysis values (reference values).
【0041】[0041]
【表4】 [Table 4]
【0042】これから、本発明により得られた上記ボツ
リオコッカス・ブラウニー SI−1株の藻体により産
生された炭化水素においては、炭素数30、31、32
及び33の炭化水素の合計量の、全炭化水素量に占める
割合は97重量%以上であり、且つ全炭化水素中の炭素
数30の炭化水素の占める割合は11〜26重量%であ
ることがわかった。本発明のボツリオコッカス・ブラウ
ニー SI−1株の産生炭化水素におけるこの様な特徴
は、表からわかるように、これまでに見出された他のボ
ツリオコッカス・ブラウニー Bレースの株には見られ
ないものであり、ボツリオコッカス・ブラウニー SI
−1株は、本発明により初めて得られた新規株であると
言える。From the above, in the hydrocarbon produced by the alga of the above-mentioned Botryococcus brownie SI-1 strain obtained by the present invention, the number of carbon atoms is 30, 31, 32.
And the proportion of the total amount of hydrocarbons 33 and 33 in the total amount of hydrocarbons is 97% by weight or more, and the proportion of the hydrocarbons having 30 carbon atoms in the total amount of hydrocarbons is 11 to 26% by weight. all right. Such a feature in the produced hydrocarbon of the Botryococcus brownie SI-1 strain of the present invention is not found in other strains of the Botryococcus brownie B race found so far, as can be seen from the table. Not possible, Botulio Coccus Brownie SI
It can be said that the -1 strain is a novel strain obtained for the first time by the present invention.
【0043】[0043]
【発明の効果】本発明の新規ボツリオコッカス・ブラウ
ニー Bレース株は、本株の藻体により産生される炭化
水素が主として炭素数30、31、32及び33の炭化
水素からなり、全炭化水素中に占める炭素数30の炭化
水素の割合が5重量%以上という、これまでに知られる
ボツリオコッカス・ブラウニー Bレース株には見られ
ない特徴を持つ。従って、本発明のボツリオコッカス・
ブラウニー Bレース株を用いることで、炭素数30の
炭化水素を多く含有する炭素数30〜33の炭化水素を
効率的に生産することが可能となる。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the novel Botryococcus brownie B race strain of the present invention, the hydrocarbons produced by the alga of this strain are mainly hydrocarbons having 30, 31, 32 and 33 carbon atoms, The ratio of hydrocarbons having 30 carbon atoms is 5% by weight or more, which is a characteristic not found in the hitherto known Botryococcus brownie B race strains. Therefore, the Botryococcus of the present invention
By using the Brownie B race strain, it becomes possible to efficiently produce a hydrocarbon having 30 to 33 carbon atoms, which contains a large amount of hydrocarbon having 30 carbon atoms.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:89) ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Office reference number FI technical display location C12R 1:89)
Claims (2)
数30、31、32及び33の炭化水素からなり、前記
炭化水素の総量に対する炭素数30の炭化水素の割合が
5重量%以上であるボツリオコッカス・ブラウニー B
レース株。1. The hydrocarbon produced by the alga is composed mainly of hydrocarbons having 30, 31, 32 and 33 carbon atoms, and the ratio of the hydrocarbon having 30 carbon atoms to the total amount of said hydrocarbons is 5% by weight or more. Botulio Coccus Brownie B
Race stock.
1株である請求項1記載のボツリオコッカス・ブラウニ
ー Bレース株。2. A Botryococcus brownie SI-
The Botryococcus brownie B race strain according to claim 1, which is one strain.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16354095A JPH099953A (en) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | New fine algae belonging to genus botryococcus |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16354095A JPH099953A (en) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | New fine algae belonging to genus botryococcus |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH099953A true JPH099953A (en) | 1997-01-14 |
Family
ID=15775833
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16354095A Pending JPH099953A (en) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | New fine algae belonging to genus botryococcus |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH099953A (en) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012077801A1 (en) | 2010-12-09 | 2012-06-14 | 国立大学法人筑波大学 | Novel strain classified under botryococcus braunii |
JP2012531917A (en) * | 2009-07-01 | 2012-12-13 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | Extraction method of extracellular terpenoids from microalgal colonies |
JP2013243943A (en) * | 2012-05-23 | 2013-12-09 | Univ Of Tsukuba | New strain of botryococcus braunii |
-
1995
- 1995-06-29 JP JP16354095A patent/JPH099953A/en active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012531917A (en) * | 2009-07-01 | 2012-12-13 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | Extraction method of extracellular terpenoids from microalgal colonies |
WO2012077801A1 (en) | 2010-12-09 | 2012-06-14 | 国立大学法人筑波大学 | Novel strain classified under botryococcus braunii |
JP2013243943A (en) * | 2012-05-23 | 2013-12-09 | Univ Of Tsukuba | New strain of botryococcus braunii |
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