JPH09512430A

JPH09512430A - Ｄｎａ配列

Info

Publication number: JPH09512430A
Application number: JP7528082A
Authority: JP
Inventors: クラーク，アンソニー，ジョン
Original assignee: ピーピーエルテラピューティクス（スコットランド）リミテッド
Priority date: 1994-05-03
Filing date: 1995-05-02
Publication date: 1997-12-16
Also published as: WO1995030000A1; AU2317095A; CA2189438A1; EP0763108A1; FI964423A0; AU686375B2; GB9408717D0; US6046380A; CN1149317A; NO964628D0; NO964628L; FI964423A; NZ284550A

Abstract

(57)【要約】組換ヒト因子ＩＸの低い発現率は形質転換宿主等の異種発現システムにおける異常なスプライシングによるものである。異常なスプライス部位は、（ａ）１０８５番目のｍＲＮＡのヌクレオチドを含む供与部位；及び（ｂ）１５４７番目のｍＲＮＡのヌクレオチドを含む受容部位として同定された（なお、この際、ｍＲＮＡのヌクレオチドの番号は図面の図２を使用する）。改善された因子ＩＸ発現配列は、異常なスプライシング効果を防止または抑制し収率を向上するように、上記部位の少なくとも１つを操作により除去される。改善されたＤＮＡ配列は遺伝子治療においても有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ配列本発明は、ヒトの因子ＩＸ（ｆＩＸ）をコード化するＤＮＡ配列に関するものである。このような配列は、形質転換動物等の、因子ＩＸに関する発現システムにおいて有用であり、さらに、遺伝子治療においても可能性を有するものである。異種の、特に、形質転換した、システムにおいて因子ＩＸを高度に発現することは困難である。例えば、ヒツジ等の形質転換動物のミルク中でヒトの因子ＩＸをβ−ラクトグロブリンにより誘導される形質転換発現(transgenic expression )する基本的な方法（ＷＯ−Ａ−８８００２３９号に開示されているように）はなされているが、得られる収率が低い。上記に関しては下記の２つの主な理由があると考えられる：発現しない：因子ＩＸのｃＤＮＡを使用することは、通常、理に適ったレベルの適当なｆＩＸ転写物を得るという点に関して問題を有していた。この問題は、一部、トランスジーンレスキュー法(transgene rescue approach)によって解決された（ＷＯ−Ａ−９２１１３５８号、「インクリーズドエックスプレッションバイアセカンドトランスファードシークエンスイントランスジェニックオルガニズムズ(Increased Expression by a Second Transferred Sequence in Transgenic Organisms)」に記載）。上記公知の公報では、β−ラクトブロブリン（ＢＬＧ）をヒトの因子ＩＸをコード化する構築物ＦＩＸＤとコインテグレートすることにより、高レベルのＦＩＸＤｍＲＮＡを発現するマウスの系統を生産した。しかしながら、これらの動物のミルクはほとんどｆＩＸを含まなかった。異常なスプライシング：ＢＬＧ＋ＦＩＸＤマウスにおけるＦＩＸＤｍＲＮＡ転写物のより精密な調査により、これらの転写物は予想されたものより約４５０ｂｐ短いことが示された。これらはｍＲＮＡの異常なスプライシングにより内部で欠失したことが最も可能性が高いと推定された（クラーク(Clark)ら、バイオ／テクノロジー(Bio/Technology)、１０巻、頁１４５０〜１４５４（１９９２年））。肝臓細胞におけるヒトの因子ＩＸのｍＲＮＡのスプライシングは、ジェーバイオルケム(J．Biol．Chem.)、２７０巻、頁５２７６〜５２８１（１９９４年）（クラチ(Kurachi)ら）において討論されてきた。ここでは、スプライセオソーム複合体は核から輸送される前の任意の分解からｍＲＮＡ前駆体を保護するように作用するため、スプライシングのシグナル配列の存在により因子ＩＸの発現は向上することが示されている。異常なスプライシングは異種のまたは形質転換した発現システムにおける因子ＩＸの低収率の原因であることを決定した。さらに、最も重要なことであるが、因子ＩＸをコード化するヒト遺伝子における潜在性スプライス部位(cryptic spl ice site)の位置が同定された。この発見により、因子ＩＸをコード化するＤＮＡ配列を観察された異常なスプライシングを防止するように操作することが可能になる。本発明の第一の概念によると、ヒトの因子ＩＸ活性を有するタンパク質をコード化する配列を有するＤＮＡにおいて、該ＤＮＡが少なくとも１つの下記潜在性スプライス部位（図面の図２のｍＲＮＡのヌクレオチドの番号付けを使用する）の機能を妨げるように修飾されることを特徴とするＤＮＡを提供するものである：（ａ）１０８６番目のｍＲＮＡのヌクレオチドを含む供与部位；および（ｂ）１５４７番目のｍＲＮＡのヌクレオチドを含む受容部位。本発明によるＤＮＡは、ｆＩＸ配列の異常なスプライシングをなおすることによって従来記載されているレベルよりかなり高いレベルでｆＩＸを発現させることが可能である。核の前ｍＲＮＡ（即ち、スプライシング前に核内に一時的に存在して細胞質に輸出されるｍＲＮＡを生じる遺伝子の一次転写物）における供与部位はヌクレオチドＧＵを含み、これはスプライシング後に切り出されたイントロンの５’末端のヌクレオチドになる。核の前ｍＲＮＡにおける受容部位はヌクレオチドＡＧを含み、これはスプライシング後に切り出されたイントロンの３’末端のヌクレオチドになる。前記段落において記載されたヌクレオチドの番号付けは、それぞれ、（５’）の供与部位のＧ残基及び（３’）の受容部位のＧ残基に関するものである。本発明による好ましいＤＮＡは野生型のヒトの因子ＩＸをコード化するものである。しかしながら、変異体（特に、共通配列からのアレイック変異体）、保守的突然変異体(conservative mutation)または他のタンパク質をコード化するＤＮＡもまた、タンパク質がヒトの因子ＩＸと実質的に相同である際には、本発明の概念に含まれる。「実質的に相同である」とは、当該分野においては良く理解されているが、タンパク質レベルでまたは核酸レベルで評価される。例えば、タンパク質レベルでは、候補となるタンパク質が少なくとも４０、６０、８０、９０、９５または９９％のレベル（数が大きくなる程好ましい）でヒトの因子ＩＸに対してアミノ酸相同性を有する際には、実質的な相同性が存在すると言える。核酸レベルでは、候補となるＤＮＡ配列が少なくとも８０、９０、９５または９９％のレベル（数が大きくなる程好ましい）でヒトの因子ＩＸに対してＤＮＡ配列の相同性を有する際には、実質的な相同性が存在すると言える。本発明は因子ＩＸ（または因子ＩＸ活性を有する他のタンパク質）をコード化する様々なＤＮＡ配列に適用されると解される。特に、本発明は、因子ＩＸをコード化するゲノムＤＮＡ中に存在するすべてではないが幾つかのイントロンを含む、ｃＤＮＡ配列、天然のイントロンの完全な補体を有するゲノム配列及び「ミニ遺伝子」に適用できる。本発明によるＤＮＡを異常なスプライシングを防止するまたは少なくともかなり抑制するように潜在性供与／受容部位の機能を妨げるように修飾する方法は様々な方法がある。第一には、構築物のイントロン／エキソン構造を、追加したイントロンの５’ または３’端を何等かの方法で潜在性スプライス部位と「競合させる」ことを基礎として、変更させることがある。しかしながら、上記方法は、比較的複雑で、さらに、異常なスプライシングを一部しか抑制しない。第二には、潜在性供与部位を操作により除去する(engineer out)ことがある。ｍＲＮＡの供与部位のＧまたはＵを、ストップコドンが変更により生じない範囲で、他の塩基で置換する、または両方とも置換する。この方法は、上記した競合的イントロン方法に比べると技術的により簡単であるが、供与部位におけるＧＵ残基がバリンコドンの初めの２個のヌクレオチドを形成する（すべてのバリンコドンはＧＵで開始する）ため、因子ＩＸのアミノ酸配列を変更する必要がある。これは欠点ではなく、実際には、第二のまたはそれ以降の世代の因子ＩＸの変異体を操作する際には、好ましい。しかしながら、少なくとも供与部位において野生型の因子ＩＸ配列の保持が必須である際には、適当ではない。第三には、最も好ましい例としては、潜在性受容部位を操作により除去する(e ngineer out)ことがある。この部位は因子ＩＸのＤＮＡの３’端の非翻訳領域に存在するため、アミノ酸配列を含まない。ｍＲＮＡの受容部位のＡまたはＧを欠失する若しくは他の塩基で置換する、または両方を欠失する若しくは他の塩基で置換する。事実、本発明の最も簡単な実施態様によっては、受容部位の欠失は、３’末端が短くされる因子ＩＸのｃＤＮＡセグメント（または、当然、それにより短くなったｃＤＮＡ以外のＤＮＡ）の生産を必要とする。他の実施態様によると、特定部位の突然変異誘発(site-directed mutagen esis)技術を特に用いて受容部位（または、当然、供与部位）を変更してもよい。本発明によるＤＮＡは、因子ＩＸ（または同様のタンパク質）を発現するシステムにおいて有用である。本発明の第二の概念によると、本発明の第一の概念によるＤＮＡが発現コントロール配列に操作により連結される(operably linked)ことからなる発現宿主を提供するものである。上記発現コントロール配列は、一般的にプロモーターを有しているが、他の調節配列が存在していてもよい。本発明は、通常、様々な異なる細胞のタイプ及び培養細胞で使用できるが、原則的に上記技術から高い収率が利用できるため、形質転換動物の発現システムが本発明において特に適用できる。したがって、発現宿主は好ましい実施態様によっては哺乳動物等の動物である。異種タンパク質を生産するための好ましい形質転換システムは、ＷＯ−Ａ−８８００２３９号、ＷＯ−Ａ−９００５１８８号及びＷＯ−Ａ−９２１１３８５号に開示されているように、ミルクタンパク質のプロモーター、特に乳漿タンパク質のβ−ラクトグロブリンのプロモーターの制御下で（大人の雌の）乳腺中にトランスジーン(transgene)を発現する、形質転換した胎盤性の(placental)非ヒトの哺乳動物、特に、ヒツジや他の酪農動物の使用を伴うものである。しかしながら、本発明は上記した好ましい形質転換システムの使用に制限されるものではない。因子ＩＸをコード化する配列は、例えば、レトロウィルスベクターまたは幹細胞への直接的トランスフェクション(direct transfecti on)技術を用いて、血友病の遺伝子治療法に使用されるであろうと考えられる。異常にスプライシングしない改良されたｆＩＸ配列の利点は自明である。本発明の各概念の好ましい態様は、必要であれば変更を加えて(mutatis mutan dis)、他の概念と同様である。本発明を下記実施例により詳細に説明する。実施例は下記図面を参照する：図１は、実施例１で引用されるものであり、ＦＩＸＤ構築物の異常なスプライシングを確認するために使用されるスキームを示すものである；図２もまた、実施例１で引用されるものであり、アンソン(Anson)ら、ザエンボジャーナル(The EMBO Journal)、３（５）、頁１０５３〜１０６０（１９８４年）から応用されたものであり、因子ＩＸのｍＲＮＡ中の潜在性供与及び受容部位の位置を示すものである；図３は、実施例１で引用されるものであり、供与及び受容部位がどのように相互作用するかをより詳細に示すものである；上記図面はまた、供与及び受容部位に関する概括された共通配列を示す；図４は、潜在性スプライス部位の位置を含む、ヒトの因子ＩＸ遺伝子の全体の構造を示すものである；図５は、実施例２で引用されるものであり、様々な構築物に関して及び様々な発現システムにおいてスプライシングされないｍＲＮＡ及び異常にスプライシングされたｍＲＮＡを区別するためのＰＣＲを基礎としたスキームを示すものである；図６は、実施例３で引用されるものであり、ＦＩＸＤ−Δ３’スプライスと称する構築物の構築を示すものである；図７は、実施例４で引用されるものであり、ヒトの因子ＩＸを高収率で発現する形質転換マウスのミルクのウェスタンブロッティング分析を示すものである。ＦＩＸＤΔ３’−スプライス（３１、３１．２及び３１．３）系統由来の２動物のミルクサンプルを非還元条件下で電気泳動した。ミルクサンプルを２００倍に希釈し、５μｌまたは１０μｌをのせた。ｆＩＸ，１０ｎｇｆＩＸ；ＣＭ，コントロールミルク；ＣＭ＋ｆＩＸ，コントロールミルク＋１０ｎｇｆＩＸ；および図８はまた、実施例４で引用されるものであり、ＦＩＸＤ−Δ３’スプライスマウス由来の代表的なＲＮＡサンプルを因子ＩＸに特異的なプローブを利用してハイブリッド形成した(probe)ノーザンブロットを示すものである。高度に及び中度に発現するＢＩＸマウス（ＢＩＸ３３．１及びＢＩＸ３４．１）由来の乳腺ＲＮＡをＦＩＸＤ−Δ３’スプライス形質転換マウス由来の乳腺サンプル（標識されたＢＩＸΔ３’３．１０−＞ＢＩＸΔ３’４４．２）と比較した。ブロットを、ヒトのｆＩＸｃＤＮＡ配列を含むプラスミドであるｐ５Ｇ３’ＣＶＩＩの標識された挿入物をプローブとして利用してハイブリッド形成した(probe)後、再度ＧＡＰＤＨをプローブとして利用してハイブリッド形成してローディング用のコントロールとした。転写物の大きさを示す。ＦＩＸＤ−Δ３’スプライス転写物は、ＢＩＸマウス由来のものより明らかに大きい。実施例１ −構築物ＦＩＸＤの異常なスプライシングＦＩＸＤｍＲＮＡの異常なスプライシングは、マウスの発現系統の一つの乳腺ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲにより上記転写物をクローニングすることによって確認した。ＦＩＸＤはＷＯ−Ａ−９００５１８８号の実施例３及びＷＯ−Ａ−９２１１３８５号の比較例６に開示されており、ヒトの因子ＩＸ（ｆＩＸ）ｃＤＮＡがβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）５’及び３’の配列（エキソン６及び７を含む）に融合されてなるものである；ＦＩＸＤは天然に生じるイントロンを含まない。ｆＩＸｃＤＮＡの５’末端及びＢＬＧの３’末端に特異的なプライマー（セット１：図１）を設計し構築した。これらのプライマーは下記配列を有するものであった：これらのプライマーによりＢＬＤ＋ＦＩＸＤマウス由来のより短いＦＩＸＤ転写物（ＢＩＸと称する）を増幅し、これをｐＲＴ−ＦＩＸとしてプラスミドベクターピーブルースクリプト(pBLUESCRIPT)中にクローニングした後、配列を決定した。ｐＲＴ−ＦＩＸの配列により、ｆＩＸ配列中で４６２ｎｔの内部の欠失が示された。これにより、ＢＩＸ転写物は、ＦＩＸＤｍＲＮＡに関して予想された１８１３ｎｔの大きさではなく、１３５１ヌクレオチドであった（図１）。サンガー(Sanger)のジデオキシ法により決定された、ｐＲＴ−ＦＩＸの配列により、ＢＩＸｍＲＮＡ中で観察された欠失部の正確な位置が同定された。ｆＩＸｃＤＮＡ配列の調査（アンソン(Anson)ら、ザエンボジャーナル(The EM BO Journal)、３（５）、頁１０５３〜１０６０（１９８４年））およびｐＲＴ −ＦＩＸから推定される５’及び３’端の切断点の比較から、欠失はほとんど確かに異常なスプライシングによるものであることが示された。これより、欠失は１０８５〜１５４７ｂｐ（アンソン(Anson)の文献および本明細書図２の番号付けの通り）からなるものである。ほとんどの５’端の配列は、５’ ＧＵＡＡＧＵＧＧであり、ほとんどの３’端の配列は、ＵＵＵＣＵＣＵＵＵＡＣＡＧ３’ である（図３）。これらは、イントロンの供与（５’）及び受容（３’）部位に非常に「良好な」共通配列である。（イントロンの５’及び３’ 末端はそれぞれＧＵ及びＡＧでなければならない：これらはスプライシングの絶対的な必要条件である；他の塩基もまた供与及び受容部位の共通配列に隣接している。）供与及び受容部位の存在は遺伝子が上記したようにスプライシングされなければならないことを意味するものではない：この配列からスプライシングが起こるかどうか否かは予想できない。天然の因子ＩＸ遺伝子においては、これらの部位はＦＩＸＤ中にある同様の配列によって分断される最後のエキソン（エキソン８）中に存在する（図４）。にもかかわらず、これらの部位は、ヒトの肝臓において正常に発現する因子ＩＸの前ｍＲＮＡで使用されない。したがって、理由によっては、乳腺で産生されるＦＩＸ転写物はこれらの潜在性スプライス部位を使用しており、これにより内部が欠失したＢＩＸｍＲＮＡが産生する。この内部が欠失したｍＲＮＡは、これによりｆＩＸの最後の１０９アミノ酸をコードするセグメントが除去されるので、機能的なｆＩＸタンパク質をコードすることはできない。実施例２ −異常なスプライシングが他のｆＩＸ構築物で起こるｆＩＸｃＤＮＡ配列の異常なスプライシングの同定が、ＦＩＸＤ構築物（ＢＬＧとコインテグレート）を発現するマウスでなされた。ｆＩＸｃＤＮＡ配列が形質転換されたヒツジを予め作製しておくが、これらのヒツジでは、ｆＩＸｃＤＮＡ配列を完全なＢＬＧ遺伝子の第一のエキソン中に組込み、構築物をＦＩＸＡと称する（ＷＯ−Ａ−８８００２３９号の実施例３に記載される通り）。この構築物はまた、むしろあまり挙動しないと考えられ、さらに、ミルク中に低レベルのｆＩＸを産生した。したがって、上記異常なスプライシングが上記ｆＩＸ構築物により乳腺中で起こるかどうかを観察することは有益であった。他の比較的発現の弱い構築物を有するヒツジ由来の乳腺ＲＮＡサンプルである、ＪＦＩＸＡ１（ＷＯ−Ａ−９００５１８８号の実施例４のセクションＥにおけるＪＦＩＸＡ１として知られている）をも、ＷＯ−Ａ−９００５１８８号で開示されるようにして調製された形質転換した創始(founder transgenic)由来の形質転換ヒツジから得た。ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅時にＢＩＸｍＲＮＡで観察された異常にスプライシングされたｍＲＮＡをスプライシングしないｆＩＸ配列と識別するＰＣＲプライマーを１セット（セット２：図５）を設計した。野生型（異常ではなくスプライシングされたｍＲＮＡ）では、上記プライマーは６８９ｂｐの断片を生じるが、異常にスプライシングされたｍＲＮＡでは、２２７ｂｐの断片が生じる。これらのプライマーは下記配列を有しており：ｆＩＸを発現する組織から調製された様々なＲＮＡに対して使用された。結果を表１に示す。ヒツジの乳腺におけるＦＩＸＡ及びＪＦＩＸＡ１はＢＩＸと同等の異常なスプライシングを示したため、厳密に構築物依存性ではない。しかしながら、マウスにおけるＦＩＸＡはむしろ混同した状況を表わしている。１２匹中たった１匹のマウスが、比較的高レベル（３０μｇ／ｍｌ）で、上記構築物を発現した。このマウスは、明らかに、乳腺中で異常なスプライシングを行わないので、ミルク中に非常に高レベルのｆＩＸが、認められる。しかしながら、なぜこのようなことが１匹のマウス中で起こるのかは不明である。にもかかわらず、異常なスプライシングが存在しないことによりミルク中のｆＩＸレベルが向上することが示唆される。実施例３−ＦＩＸ−Δ３’スプライスの構築本構築の概要を図６に示す。下記ＰＣＲプライマー１セット（セット４）：を用いて、５’端のＢＬＧ配列からｆＩＸのストップコドンの３’端であるが潜在性受容スプライス部位の５’端直前の配列までのＦＩＸＤのセグメントを増幅した。これにより、このＤＮＡのセグメントは、ｆＩＸのコーディング配列は有するが、３’端の非翻訳領域中に潜在性受容部位を欠失する。このセグメントをＢＬＧ配列に融合して、潜在性受容部位を含む、ＦＩＸＤ中に存在するｆＩＸの３’フランキング配列の１４１ｂｐが欠失している以外はＦＩＸＤに非常に近似した構築物を作製した。実施例４−ＦＩＸ−Δ３’スプライスの発現ＦＩＸ−Δ３’スプライスにより形質転換動物におけるｆＩＸの発現が向上したかどうかを試験するために、ＦＩＸ−Δ３’スプライスをマウスの卵中にＢＬＧと共にコインジェクト(coinject)し（ＷＯ−Ａ−９２１１３８５号の通り）、多くの形質転換系統を確立した。ＦＩＸ−Δ３’スプライスのトランスジーン(transgene)の発現をＲＮＡ及びタンパク質レベルで乳腺中で分析した。タンパク質分析：形質転換マウス９系統を分析した。これらすべてはミルク中でｆＩＸを検出可能なレベルで発現する。これらのうちの１系統（系統３１）は非常に高いレベル（平均６０．９μｇ／ｍｌ）を示し、固体によっては１００μｇ／ｍｌを超えるものもあった（表２）：これは、従来ミルク中で得られたレベルの断然最高値である。因子ＩＸミルクサンプルのＥＬＩＳＡ分析これらのミルクは修飾された因子ＩＸのｃＤＮＡ（受容スプライス部位が除去された）を有する形質転換マウスから得られたものである。ＥＬＩＳＡはウサキのポリクローナルによる捕獲(capture)を基礎とするものであり、検出はビオチン化により修飾される以外は同様のポリクローナルによるものである。発現を下記に示す：− さらに、産生したタンパク質は、還元ゲル及び非還元ゲル上でヒトｆＩＸ由来の正常な血漿と非常に近似した移動度を有し（図７）、生物学的に活性を有する（表３）。上記ｆＩＸ産生レベルはヒツジにおいて大量(commercial)である。形質転換マウスのミルク由来のヒトｆＩＸの精製および生物学的な活性ｆＩＸをイムノアフィニティ(immunoaffinity)クロマトグラフィーによって系統３１で溜められたマウスミルクから精製した。Ｃａ＋結合ｆＩＸＧｌａドメインと結合するＭａｂＡ７は、チャールズラッシュ(Charles Lutsch)からの寄贈である。抗体を臭化シアン活性化セファロースにカップリングさせた。希釈されたミルクを，４℃で５０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．５）（ＴＢＳ）＋５０ｍＭＣａＣｌ₂中で抗体と複合体形成したセファロース(antibody-conjugated Sepharose)と共に一晩インキュベートした。結合したタンパク質をＴＢＳ、２５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）で無勾配溶離し、ｆＩＸ凝固活性を、Ｃａ＋を加えることにより５分後に反応を開始して、ｆＩＸ欠失血漿(fIX deficient plasma)（ダイアグノスティックリージェンツ(Diagnostic Reagents)、オクソン(Oxon)、英国）及びＡＰＴＴ試薬（シグマ(Sigma)）を添加することによって測定した。凝固を、エスティ４アナライザー(ST4 Analyser)（ダイアグノスティカスタゴ(Diagnostica Sta go)）を用いてボールオシレーション(ball oscillation)によって測定した。正常なヒト血漿（ＥＬＩＳＡによる測定で４μｇ／ｍｌｆＩＸ）を標準物質として用いた。結果を下記表３に示す：− ＲＮＡ分析：ＦＩＸ−Δ３’スプライスマウス由来の代表的なＲＮＡサンプルのノーザンブロットをｆＩＸに特異的なプローブを利用してハイブリッド形成した (probe)。予想された大きさの転写物（〜１６８０ｎｔ）を観察し（図８）、さらに、安定状態のｍＲＮＡレベルはミルク中で検出されたｆＩＸのレベルと創刊した（例えば、系統３１は最高のｍＲＮＡレベルを有していた（表２参照））。これらのＦＩＸ−Δ３’スプライスＲＮＡを数個のＢＩＸＲＮＡと一緒に泳動した。ここで、ＦＩＸ−Δ３’スプライスＲＮＡは、構築物はより小さいが、ＢＩＸｍＲＮＡ（１３５１ｎｔ）に比べると分子量が高いことに留意する。ＢＩＸｍＲＮＡを短くする異常なスプライシングがキュアされた(cure)。これは、ＦＩＸ−Δ３’スプライスＲＮＡのＲＴ −ＰＣＲ分析により確認され、これにより転写物の３’側のセグメントはそのままである（示さず）ことが示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトの因子ＩＸ活性を有するタンパク質をコード化する配列を有するＤＮＡにおいて、該ＤＮＡが下記潜在性スプライス部位（図面の図２のｍＲＮＡのヌクレオチドの番号付けを使用する）の少なくとも１つの機能を妨げるように修飾されることを特徴とするＤＮＡ：（ａ）１０８６番目のｍＲＮＡのヌクレオチドを含む供与部位;および（ｂ）１５４７番目のｍＲＮＡのヌクレオチドを含む受容部位。２．野生型のヒトの因子ＩＸをコード化する、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。３．因子ＩＸをコード化するゲノムＤＮＡ中に存在するイントロンを少なくとも１つ含む、請求の範囲第１項または第２項に記載のＤＮＡ。４．潜在性供与部位が操作により除去される、請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載のＤＮＡ。５．潜在性受容部位が操作により除去される、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のＤＮＡ。６．因子ＩＸをコード化するＤＮＡセグメントであり、該ＤＮＡセグメントは受容部位を除去するためにその３’端で短くされるものである、請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ。７．ｃＤＮＡである、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ。８．発現コントロール配列に操作により連結された請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＤＮＡを有する発現宿主。９．形質転換した非ヒト動物である、請求の範囲第８項に記載の発現宿主。１０．該動物は胎盤性哺乳動物であり、該発現コントロール配列は因子ＩＸが哺乳動物のミルク中に存在するように乳腺中で発現させるものである、請求の範囲第９項に記載の発現宿主。１１．該発現コントロール配列がβ−ラクトグロブリンのプロモーターを有するものである、請求の範囲第９項に記載の発現宿主。