JPH09512430A - Dna配列 - Google Patents
Dna配列Info
- Publication number
- JPH09512430A JPH09512430A JP7528082A JP52808295A JPH09512430A JP H09512430 A JPH09512430 A JP H09512430A JP 7528082 A JP7528082 A JP 7528082A JP 52808295 A JP52808295 A JP 52808295A JP H09512430 A JPH09512430 A JP H09512430A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- fix
- factor
- mrna
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
組換ヒト因子IXの低い発現率は形質転換宿主等の異種発現システムにおける異常なスプライシングによるものである。異常なスプライス部位は、(a)1085番目のmRNAのヌクレオチドを含む供与部位;及び(b)1547番目のmRNAのヌクレオチドを含む受容部位として同定された(なお、この際、mRNAのヌクレオチドの番号は図面の図2を使用する)。改善された因子IX発現配列は、異常なスプライシング効果を防止または抑制し収率を向上するように、上記部位の少なくとも1つを操作により除去される。改善されたDNA配列は遺伝子治療においても有用である。
Description
【発明の詳細な説明】
DNA配列
本発明は、ヒトの因子IX(fIX)をコード化するDNA配列に関するもの
である。このような配列は、形質転換動物等の、因子IXに関する発現システム
において有用であり、さらに、遺伝子治療においても可能性を有するものである
。
異種の、特に、形質転換した、システムにおいて因子IXを高度に発現するこ
とは困難である。例えば、ヒツジ等の形質転換動物のミルク中でヒトの因子IX
をβ−ラクトグロブリンにより誘導される形質転換発現(transgenic expression
)する基本的な方法(WO−A−8800239号に開示されているように)は
なされているが、得られる収率が低い。上記に関しては下記の2つの主な理由が
あると考えられる:
発現しない:因子IXのcDNAを使用することは、通常、理に適ったレベ
ルの適当なfIX転写物を得るという点に関して問題を有していた。この問題は
、一部、トランスジーンレスキュー法(transgene rescue approach)によって解
決された(WO−A−9211358号、「インクリーズド エックスプレッシ
ョン バイ ア セカンド トランスファード シークエンス イン トランス
ジェニック オルガニズムズ(Increased Expression by a Second Transferred
Sequence in Transgenic Organisms)」に記載)。上記公知の公報では、β−ラ
クトブロブリン(BLG)をヒトの因子IXをコード化する構築物FIXDとコ
インテグレートすることにより、高レベルのFIXD mRNAを発現するマウ
スの系統を生産した。しかしながら、これらの動物のミルクはほとんどfIXを
含まなかった。
異常なスプライシング:BLG+FIXDマウスにおけるFIXD mRN
A転写物のより精密な調査により、これらの転写物は予想されたものより約45
0bp短いことが示された。これらはmRNAの異常なスプライシングにより内
部で欠失したことが最も可能性が高いと推定された(クラーク(Clark)ら、バイ
オ/テクノロジー(Bio/Technology)、10巻、頁1450〜1454(1992
年))。
肝臓細胞におけるヒトの因子IXのmRNAのスプライシングは、ジェー バ
イオル ケム(J.Biol.Chem.)、270巻、頁5276〜5281(1994年
)(クラチ(Kurachi)ら)において討論されてきた。ここでは、スプライセオソ
ーム複合体は核から輸送される前の任意の分解からmRNA前駆体を保護するよ
うに作用するため、スプライシングのシグナル配列の存在により因子IXの発現
は向上することが示されている。
異常なスプライシングは異種のまたは形質転換した発現システムにおける因子
IXの低収率の原因であることを決定した。さらに、最も重要なことであるが、
因子IXをコード化するヒト遺伝子における潜在性スプライス部位(cryptic spl
ice site)の位置が同定された。この発見により、因子IXをコード化するDN
A配列を観察された異常なスプライシングを防止するように操作することが可能
になる。
本発明の第一の概念によると、ヒトの因子IX活性を有するタンパク質をコー
ド化する配列を有するDNAにおいて、該DNAが少なくとも1つの下記潜在性
スプライス部位(図面の図2のmRNAのヌクレオチドの番号付けを使用する)
の機能を妨げるように修飾されることを特徴とするDNAを提供するものである
:
(a)1086番目のmRNAのヌクレオチドを含む供与部位;および
(b)1547番目のmRNAのヌクレオチドを含む受容部位。
本発明によるDNAは、fIX配列の異常なスプライシングをなおすることに
よって従来記載されているレベルよりかなり高いレベルでfIXを発現させるこ
とが可能である。
核の前mRNA(即ち、スプライシング前に核内に一時的に存在して細胞質に
輸出されるmRNAを生じる遺伝子の一次転写物)における供与部位はヌクレオ
チドGUを含み、これはスプライシング後に切り出されたイントロンの5’末端
のヌクレオチドになる。核の前mRNAにおける受容部位はヌクレオチドAGを
含み、これはスプライシング後に切り出されたイントロンの3’末端のヌクレオ
チドになる。前記段落において記載されたヌクレオチドの番号付けは、それぞれ
、(5’)の供与部位のG残基及び(3’)の受容部位のG残基に関するもので
ある。
本発明による好ましいDNAは野生型のヒトの因子IXをコード化するもので
ある。しかしながら、変異体(特に、共通配列からのアレイック変異体)、保守
的突然変異体(conservative mutation)または他のタンパク質をコード化するD
NAもまた、タンパク質がヒトの因子IXと実質的に相同である際には、本発明
の概念に含まれる。「実質的に相同である」とは、当該分野においては良く理解
されているが、タンパク質レベルでまたは核酸レベルで評価される。例えば、タ
ンパク質レベルでは、候補となるタンパク質が少なくとも40、60、80、9
0、95または99%のレベル(数が大きくなる程好ましい)でヒトの因子IX
に対してアミノ酸相同性を有する際には、実質的な相同性が存在すると言える。
核酸レベルでは、候補となるDNA配列が少なくとも80、90、95または9
9%のレベル(数が大きくなる程好ましい)でヒトの因子IXに対してDNA配
列の相同性を有する際には、実質的な相同性が存在すると言える。
本発明は因子IX(または因子IX活性を有する他のタンパク質)をコード化
する様々なDNA配列に適用されると解される。特に、本発明は、因子IXをコ
ード化するゲノムDNA中に存在するすべてではないが幾つかのイントロンを含
む、cDNA配列、天然のイントロンの完全な補体を有するゲノム配列及び「ミ
ニ遺伝子」に適用できる。
本発明によるDNAを異常なスプライシングを防止するまたは少なくともかな
り抑制するように潜在性供与/受容部位の機能を妨げるように修飾する方法は様
々な方法がある。
第一には、構築物のイントロン/エキソン構造を、追加したイントロンの5’
または3’端を何等かの方法で潜在性スプライス部位と「競合させる」ことを基
礎として、変更させることがある。しかしながら、上記方法は、比較的複雑で、
さらに、異常なスプライシングを一部しか抑制しない。
第二には、潜在性供与部位を操作により除去する(engineer out)ことがある。
mRNAの供与部位のGまたはUを、ストップコドンが変更により生じない範囲
で、他の塩基で置換する、または両方とも置換する。この方法は、上記した競合
的イントロン方法に比べると技術的により簡単であるが、供与部位におけるGU
残基がバリンコドンの初めの2個のヌクレオチドを形成する(すべてのバリンコ
ドンはGUで開始する)ため、因子IXのアミノ酸配列を変更する必要がある。
これは欠点ではなく、実際には、第二のまたはそれ以降の世代の因子IXの変異
体を操作する際には、好ましい。しかしながら、少なくとも供与部位において野
生型の因子IX配列の保持が必須である際には、適当ではない。
第三には、最も好ましい例としては、潜在性受容部位を操作により除去する(e
ngineer out)ことがある。この部位は因子IXのDNAの3’端の非翻訳領域に
存在するため、アミノ酸配列を含まない。mRNAの
受容部位のAまたはGを欠失する若しくは他の塩基で置換する、または両方を欠
失する若しくは他の塩基で置換する。事実、本発明の最も簡単な実施態様によっ
ては、受容部位の欠失は、3’末端が短くされる因子IXのcDNAセグメント
(または、当然、それにより短くなったcDNA以外のDNA)の生産を必要と
する。他の実施態様によると、特定部位の突然変異誘発(site-directed mutagen
esis)技術を特に用いて受容部位(または、当然、供与部位)を変更してもよい
。
本発明によるDNAは、因子IX(または同様のタンパク質)を発現するシス
テムにおいて有用である。
本発明の第二の概念によると、本発明の第一の概念によるDNAが発現コント
ロール配列に操作により連結される(operably linked)ことからなる発現宿主を
提供するものである。上記発現コントロール配列は、一般的にプロモーターを有
しているが、他の調節配列が存在していてもよい。
本発明は、通常、様々な異なる細胞のタイプ及び培養細胞で使用できるが、原
則的に上記技術から高い収率が利用できるため、形質転換動物の発現システムが
本発明において特に適用できる。したがって、発現宿主は好ましい実施態様によ
っては哺乳動物等の動物である。
異種タンパク質を生産するための好ましい形質転換システムは、WO−A−8
800239号、WO−A−9005188号及びWO−A−9211385号
に開示されているように、ミルクタンパク質のプロモーター、特に乳漿タンパク
質のβ−ラクトグロブリンのプロモーターの制御下で(大人の雌の)乳腺中にト
ランスジーン(transgene)を発現する、形質転換した胎盤性の(placental)非ヒト
の哺乳動物、特に、ヒツジや他の酪農動物の使用を伴うものである。
しかしながら、本発明は上記した好ましい形質転換システムの使用に
制限されるものではない。因子IXをコード化する配列は、例えば、レトロウィ
ルスベクターまたは幹細胞への直接的トランスフェクション(direct transfecti
on)技術を用いて、血友病の遺伝子治療法に使用されるであろうと考えられる。
異常にスプライシングしない改良されたfIX配列の利点は自明である。
本発明の各概念の好ましい態様は、必要であれば変更を加えて(mutatis mutan
dis)、他の概念と同様である。
本発明を下記実施例により詳細に説明する。実施例は下記図面を参照する:
図1は、実施例1で引用されるものであり、FIXD構築物の異常なスプライ
シングを確認するために使用されるスキームを示すものである;
図2もまた、実施例1で引用されるものであり、アンソン(Anson)ら、ザ エ
ンボ ジャーナル(The EMBO Journal)、3(5)、頁1053〜1060(19
84年)から応用されたものであり、因子IXのmRNA中の潜在性供与及び受
容部位の位置を示すものである;
図3は、実施例1で引用されるものであり、供与及び受容部位がどのように相
互作用するかをより詳細に示すものである;
上記図面はまた、供与及び受容部位に関する概括された共通配列を示す;
図4は、潜在性スプライス部位の位置を含む、ヒトの因子IX遺伝子の全体の
構造を示すものである;
図5は、実施例2で引用されるものであり、様々な構築物に関して及び様々な
発現システムにおいてスプライシングされないmRNA及び異常にスプライシン
グされたmRNAを区別するためのPCRを基礎としたスキームを示すものであ
る;
図6は、実施例3で引用されるものであり、FIXD−Δ3’スプラ
イスと称する構築物の構築を示すものである;
図7は、実施例4で引用されるものであり、ヒトの因子IXを高収率で発現す
る形質転換マウスのミルクのウェスタンブロッティング分析を示すものである。
FIXDΔ3’−スプライス(31、31.2及び31.3)系統由来の2動物
のミルクサンプルを非還元条件下で電気泳動した。ミルクサンプルを200倍に
希釈し、5μlまたは10μlをのせた。fIX,10ng fIX;CM,コ
ントロールミルク;CM+fIX,コントロールミルク+10ng fIX;お
よび
図8はまた、実施例4で引用されるものであり、FIXD−Δ3’スプライス
マウス由来の代表的なRNAサンプルを因子IXに特異的なプローブを利用して
ハイブリッド形成した(probe)ノーザンブロットを示すものである。高度に及び
中度に発現するBIXマウス(BIX33.1及びBIX34.1)由来の乳腺
RNAをFIXD−Δ3’スプライス形質転換マウス由来の乳腺サンプル(標識
されたBIXΔ3’3.10−>BIXΔ3’44.2)と比較した。ブロット
を、ヒトのfIXcDNA配列を含むプラスミドであるp5G3’CVIIの標
識された挿入物をプローブとして利用してハイブリッド形成した(probe)後、再
度GAPDHをプローブとして利用してハイブリッド形成してローディング用の
コントロールとした。転写物の大きさを示す。FIXD−Δ3’スプライス転写
物は、BIXマウス由来のものより明らかに大きい。実施例1
−構築物FIXDの異常なスプライシング
FIXD mRNAの異常なスプライシングは、マウスの発現系統の一つの乳
腺RNAからのRT−PCRにより上記転写物をクローニングすることによって
確認した。FIXDはWO−A−9005188号の実施例3及びWO−A−9
211385号の比較例6に開示されており、ヒトの因子IX(fIX)cDN
Aがβ−ラクトグロブリン(BLG)
5’及び3’の配列(エキソン6及び7を含む)に融合されてなるものである;
FIXDは天然に生じるイントロンを含まない。fIX cDNAの5’末端及
びBLGの3’末端に特異的なプライマー(セット1:図1)を設計し構築した
。これらのプライマーは下記配列を有するものであった:
これらのプライマーによりBLD+FIXDマウス由来のより短いFIXD転
写物(BIXと称する)を増幅し、これをpRT−FIXとしてプラスミドベク
ター ピーブルースクリプト(pBLUESCRIPT)中にクローニングした後、配列を決
定した。pRT−FIXの配列により、fIX配列中で462ntの内部の欠失
が示された。これにより、BIX転写物は、FIXD mRNAに関して予想さ
れた1813ntの大きさではなく、1351ヌクレオチドであった(図1)。
サンガー(Sanger)のジデオキシ法により決定された、pRT−FIXの配列に
より、BIX mRNA中で観察された欠失部の正確な位置が同定された。fI
X cDNA配列の調査(アンソン(Anson)ら、ザ エンボ ジャーナル(The EM
BO Journal)、3(5)、頁1053〜1060(1984年))およびpRT
−FIXから推定される5’及び3’端の切断点の比較から、欠失はほとんど確
かに異常なスプライシングによるものであることが示された。これより、欠失は
1085〜1547bp(アンソン(Anson)の文献および本明細書図2の番号付
けの通り)からなるものである。ほとんどの5’端の配列は、5’ GUAAG
UGGであり、ほとんどの3’端の配列は、UUUCUCUUUACAG 3’
である(図3)。これらは、イントロンの供与(5’)及び受容
(3’)部位に非常に「良好な」共通配列である。(イントロンの5’及び3’
末端はそれぞれGU及びAGでなければならない:これらはスプライシングの絶
対的な必要条件である;他の塩基もまた供与及び受容部位の共通配列に隣接して
いる。)
供与及び受容部位の存在は遺伝子が上記したようにスプライシングされなけれ
ばならないことを意味するものではない:この配列からスプライシングが起こる
かどうか否かは予想できない。天然の因子IX遺伝子においては、これらの部位
はFIXD中にある同様の配列によって分断される最後のエキソン(エキソン8
)中に存在する(図4)。にもかかわらず、これらの部位は、ヒトの肝臓におい
て正常に発現する因子IXの前mRNAで使用されない。したがって、理由によ
っては、乳腺で産生されるFIX転写物はこれらの潜在性スプライス部位を使用
しており、これにより内部が欠失したBIX mRNAが産生する。この内部が
欠失したmRNAは、これによりfIXの最後の109アミノ酸をコードするセ
グメントが除去されるので、機能的なfIXタンパク質をコードすることはでき
ない。実施例2
−異常なスプライシングが他のfIX構築物で起こる
fIX cDNA配列の異常なスプライシングの同定が、FIXD構築物(B
LGとコインテグレート)を発現するマウスでなされた。fIX cDNA配列
が形質転換されたヒツジを予め作製しておくが、これらのヒツジでは、fIX
cDNA配列を完全なBLG遺伝子の第一のエキソン中に組込み、構築物をFI
XAと称する(WO−A−8800239号の実施例3に記載される通り)。こ
の構築物はまた、むしろあまり挙動しないと考えられ、さらに、ミルク中に低レ
ベルのfIXを産生した。したがって、上記異常なスプライシングが上記fIX
構築物により乳腺中で起こるかどうかを観察することは有益であった。他の比較
的発現の弱い構築物を有するヒツジ由来の乳腺RNAサンプルである、JFIX
A1(WO−A−9005188号の実施例4のセクションEにおけるJ FI
X A1として知られている)をも、WO−A−9005188号で開示される
ようにして調製された形質転換した創始(founder transgenic)由来の形質転換ヒ
ツジから得た。RNAのRT−PCR増幅時にBIX mRNAで観察された異
常にスプライシングされたmRNAをスプライシングしないfIX配列と識別す
るPCRプライマーを1セット(セット2:図5)を設計した。野生型(異常で
はなくスプライシングされたmRNA)では、上記プライマーは689bpの断
片を生じるが、異常にスプライシングされたmRNAでは、227bpの断片が
生じる。これらのプライマーは下記配列を有しており:
fIXを発現する組織から調製された様々なRNAに対して使用された。結果を
表1に示す。
ヒツジの乳腺におけるFIXA及びJFIXA1はBIXと同等の異常なスプ
ライシングを示したため、厳密に構築物依存性ではない。しかしながら、マウス
におけるFIXAはむしろ混同した状況を表わしている。12匹中たった1匹の
マウスが、比較的高レベル(30μg/ml)で、上記構築物を発現した。この
マウスは、明らかに、乳腺中で異常なスプライシングを行わないので、ミルク中
に非常に高レベルのfIXが、認められる。しかしながら、なぜこのようなこと
が1匹のマウス中で起こるのかは不明である。にもかかわらず、異常なスプライ
シングが存在しないことによりミルク中のfIXレベルが向上することが示唆さ
れる。
実施例3−FIX−Δ3’スプライスの構築
本構築の概要を図6に示す。下記PCRプライマー1セット(セット4):
を用いて、5’端のBLG配列からfIXのストップコドンの3’端であるが潜
在性受容スプライス部位の5’端直前の配列までのFIXDのセグメントを増幅
した。これにより、このDNAのセグメントは、fIXのコーディング配列は有
するが、3’端の非翻訳領域中に潜在性受容部位を欠失する。このセグメントを
BLG配列に融合して、潜在性受容部位を含む、FIXD中に存在するfIXの
3’フランキング配列の141bpが欠失している以外はFIXDに非常に近似
した構築物を作製した。実施例4−FIX−Δ3’スプライスの発現
FIX−Δ3’スプライスにより形質転換動物におけるfIXの発現が向上し
たかどうかを試験するために、FIX−Δ3’スプライスをマ
ウスの卵中にBLGと共にコインジェクト(coinject)し(WO−A−92113
85号の通り)、多くの形質転換系統を確立した。FIX−Δ3’スプライスの
トランスジーン(transgene)の発現をRNA及びタンパク質レベルで乳腺中で分
析した。
タンパク質分析:形質転換マウス9系統を分析した。これらすべてはミルク中で
fIXを検出可能なレベルで発現する。これらのうちの1系統(系統31)は非
常に高いレベル(平均60.9μg/ml)を示し、固体によっては100μg
/mlを超えるものもあった(表2):これは、従来ミルク中で得られたレベル
の断然最高値である。
因子IXミルクサンプルのELISA分析
これらのミルクは修飾された因子IXのcDNA(受容スプライス部位が除去
された)を有する形質転換マウスから得られたものである。ELISAはウサキ
のポリクローナルによる捕獲(capture)を基礎とするものであり、検出はビオチ
ン化により修飾される以外は同様のポリクローナルによるものである。発現を下
記に示す:−
さらに、産生したタンパク質は、還元ゲル及び非還元ゲル上でヒトfIX由来
の正常な血漿と非常に近似した移動度を有し(図7)、生物学的に活性を有する
(表3)。上記fIX産生レベルはヒツジにおいて大量(commercial)である。形質転換マウスのミルク由来のヒトfIXの精製および生物学的な活性
fIXをイムノアフィニティ(immunoaffinity)クロマトグラフィーによって系
統31で溜められたマウスミルクから精製した。Ca+結合fIX Glaドメ
インと結合するMabA7は、チャールズ ラッシュ(Charles Lutsch)からの寄
贈である。抗体を臭化シアン活性化セファロ
ースにカップリングさせた。希釈されたミルクを,4℃で50mMトリス、15
0mM NaCl(pH7.5)(TBS)+50mM CaCl2中で抗体と
複合体形成したセファロース(antibody-conjugated Sepharose)と共に一晩イン
キュベートした。結合したタンパク質をTBS、25mM EDTA(pH7.
5)で無勾配溶離し、fIX凝固活性を、Ca+を加えることにより5分後に反
応を開始して、fIX欠失血漿(fIX deficient plasma)(ダイアグノスティック
リージェンツ(Diagnostic Reagents)、オクソン(Oxon)、英国)及びAPTT
試薬(シグマ(Sigma))を添加することによって測定した。凝固を、エスティ4
アナライザー(ST4 Analyser)(ダイアグノスティカ スタゴ(Diagnostica Sta
go))を用いてボールオシレーション(ball oscillation)によって測定した。正
常なヒト血漿(ELISAによる測定で4μg/ml fIX)を標準物質とし
て用いた。結果を下記表3に示す:−
RNA分析:FIX−Δ3’スプライスマウス由来の代表的なRNAサンプルの
ノーザンブロットをfIXに特異的なプローブを利用してハイブリッド形成した
(probe)。予想された大きさの転写物(〜1680nt)を観察し(図8)、さ
らに、安定状態のmRNAレベルはミルク中
で検出されたfIXのレベルと創刊した(例えば、系統31は最高のmRNAレ
ベルを有していた(表2参照))。これらのFIX−Δ3’スプライス RNA
を数個のBIX RNAと一緒に泳動した。ここで、FIX−Δ3’スプライス
RNAは、構築物はより小さいが、BIX mRNA(1351nt)に比べ
ると分子量が高いことに留意する。BIX mRNAを短くする異常なスプライ
シングがキュアされた(cure)。これは、FIX−Δ3’スプライスRNAのRT
−PCR分析により確認され、これにより転写物の3’側のセグメントはそのま
まである(示さず)ことが示された。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG),
AM,AT,AU,BB,BG,BR,BY,CA,C
H,CN,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB
,GE,HU,IS,JP,KE,KG,KP,KR,
KZ,LK,LR,LT,LU,LV,MD,MG,M
N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU
,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TT,
UA,US,UZ,VN
【要約の続き】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.ヒトの因子IX活性を有するタンパク質をコード化する配列を有するDNA において、該DNAが下記潜在性スプライス部位(図面の図2のmRNAのヌク レオチドの番号付けを使用する)の少なくとも1つの機能を妨げるように修飾さ れることを特徴とするDNA: (a)1086番目のmRNAのヌクレオチドを含む供与部位;および (b)1547番目のmRNAのヌクレオチドを含む受容部位。 2.野生型のヒトの因子IXをコード化する、請求の範囲第1項に記載のDNA 。 3.因子IXをコード化するゲノムDNA中に存在するイントロンを少なくとも 1つ含む、請求の範囲第1項または第2項に記載のDNA。 4.潜在性供与部位が操作により除去される、請求の範囲第1項、第2項または 第3項に記載のDNA。 5.潜在性受容部位が操作により除去される、請求の範囲第1〜4項のいずれか に記載のDNA。 6.因子IXをコード化するDNAセグメントであり、該DNAセグメントは受 容部位を除去するためにその3’端で短くされるものである、請求の範囲第5項 に記載のDNA。 7.cDNAである、請求の範囲第6項に記載のDNA。 8.発現コントロール配列に操作により連結された請求の範囲第1〜7項のいず れかに記載のDNAを有する発現宿主。 9.形質転換した非ヒト動物である、請求の範囲第8項に記載の発現宿主。 10.該動物は胎盤性哺乳動物であり、該発現コントロール配列は因子IXが哺 乳動物のミルク中に存在するように乳腺中で発現させるもので ある、請求の範囲第9項に記載の発現宿主。 11.該発現コントロール配列がβ−ラクトグロブリンのプロモーターを有する ものである、請求の範囲第9項に記載の発現宿主。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB9408717A GB9408717D0 (en) | 1994-05-03 | 1994-05-03 | DNA sequences |
GB9408717.8 | 1994-05-03 | ||
PCT/GB1995/000996 WO1995030000A1 (en) | 1994-05-03 | 1995-05-02 | Dna sequences |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09512430A true JPH09512430A (ja) | 1997-12-16 |
Family
ID=10754465
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7528082A Pending JPH09512430A (ja) | 1994-05-03 | 1995-05-02 | Dna配列 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6046380A (ja) |
EP (1) | EP0763108A1 (ja) |
JP (1) | JPH09512430A (ja) |
CN (1) | CN1149317A (ja) |
AU (1) | AU686375B2 (ja) |
CA (1) | CA2189438A1 (ja) |
FI (1) | FI964423A (ja) |
GB (1) | GB9408717D0 (ja) |
NO (1) | NO964628L (ja) |
NZ (1) | NZ284550A (ja) |
WO (1) | WO1995030000A1 (ja) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5744326A (en) * | 1996-03-11 | 1998-04-28 | The Immune Response Corporation | Use of viral CIS-acting post-transcriptional regulatory sequences to increase expression of intronless genes containing near-consensus splice sites |
EP0912748B1 (en) * | 1996-06-27 | 2006-08-16 | Novozymes, Inc. | Modification of cryptic splice sites in heterologous genes expressed in fungi |
DE69841459D1 (en) | 1997-02-14 | 2010-03-11 | American Nat Red Cross | Expression des active human factor ix im brustdrüsengewebe transgener tiere |
US6231863B1 (en) | 1997-06-10 | 2001-05-15 | American Cyanamid Company | DNA sequences, molecules, vectors and vaccines for feline calicivirus disease and methods for producing and using same |
AU735763B2 (en) | 1997-12-05 | 2001-07-12 | Immune Response Corporation, The | Novel vectors and genes exhibiting increased expression |
GB9908788D0 (en) * | 1999-04-16 | 1999-06-09 | Univ London | Gene expression in eukaryotic cells |
US6936467B2 (en) * | 2000-03-27 | 2005-08-30 | University Of Delaware | Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides |
AU2001263271A1 (en) * | 2000-05-17 | 2001-11-26 | University Of Delaware | Plant gene targeting using oligonucleotides |
WO2002077161A2 (en) * | 2001-03-12 | 2002-10-03 | Progenetics Llc | Production of high levels of trangenic factor ix without gene rescue, and its therapeutic uses |
US20040133930A1 (en) | 2002-03-11 | 2004-07-08 | Cooper Julian D. | Production of high levels of transgenic factor ix without gene rescue, and its therapeutic uses |
US8021658B2 (en) * | 2001-05-25 | 2011-09-20 | Thomas Jefferson University | Alternative splice forms of proteins as basis for multiple therapeutic modalities |
US7220718B2 (en) * | 2001-08-03 | 2007-05-22 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Oral treatment of hemophilia |
EP2305312B1 (en) | 2001-10-10 | 2015-03-04 | ratiopharm GmbH | Remodelling and glycoconjugation of follicle-stimulating hormone (FSH) |
ES2561985T3 (es) | 2001-10-10 | 2016-03-01 | Ratiopharm Gmbh | Remodelación y glicoconjugación de anticuerpos |
EP2338333B1 (en) | 2003-04-09 | 2017-09-06 | ratiopharm GmbH | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
EP2975135A1 (en) | 2005-05-25 | 2016-01-20 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
FR2901707B1 (fr) | 2006-05-31 | 2017-09-29 | Lab Francais Du Fractionnement | Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis |
FR2904558B1 (fr) * | 2006-08-01 | 2008-10-17 | Lab Francais Du Fractionnement | "composition de facteur vii recombinant ou transgenique, presentant majoritairement des formes glycanniques biantennees, bisialylees et non fucosylees" |
FR2910786B1 (fr) * | 2006-12-29 | 2017-08-11 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies (Lfb) | "procede d'extraction d'une proteine presente dans du lait" |
FR2912310B1 (fr) | 2007-02-13 | 2009-08-07 | Kasan Sarl | Nouvelles compositions cosmetiques et/ou pharmaceutiques et leurs applications. |
WO2008153366A2 (en) * | 2007-06-15 | 2008-12-18 | Mogam Biotechnology Research Institute | Method for manufacturing active recombinant blood coagulation factor ix |
HRP20230259T1 (hr) | 2008-09-15 | 2023-04-28 | Uniqure Biopharma B.V. | Mutant polipeptida faktora ix, njegove primjene i postupak za njegovu proizvodnju |
US8861162B2 (en) * | 2010-03-09 | 2014-10-14 | Honeywell International Inc. | High power solid state power controller (SSPC) solution for primary power distribution applications |
SG11202103734PA (en) | 2018-10-18 | 2021-05-28 | Intellia Therapeutics Inc | Compositions and methods for expressing factor ix |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9028062D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Agricultural & Food Res | Production of transgenic animals |
-
1994
- 1994-05-03 GB GB9408717A patent/GB9408717D0/en active Pending
-
1995
- 1995-05-02 EP EP95916808A patent/EP0763108A1/en not_active Withdrawn
- 1995-05-02 WO PCT/GB1995/000996 patent/WO1995030000A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-05-02 CN CN95192895.3A patent/CN1149317A/zh active Pending
- 1995-05-02 AU AU23170/95A patent/AU686375B2/en not_active Ceased
- 1995-05-02 JP JP7528082A patent/JPH09512430A/ja active Pending
- 1995-05-02 NZ NZ284550A patent/NZ284550A/en unknown
- 1995-05-02 CA CA002189438A patent/CA2189438A1/en not_active Abandoned
-
1996
- 1996-11-01 US US08/742,877 patent/US6046380A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-01 NO NO964628A patent/NO964628L/no unknown
- 1996-11-04 FI FI964423A patent/FI964423A/fi unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1995030000A1 (en) | 1995-11-09 |
AU2317095A (en) | 1995-11-29 |
CA2189438A1 (en) | 1995-11-09 |
EP0763108A1 (en) | 1997-03-19 |
FI964423A0 (fi) | 1996-11-04 |
AU686375B2 (en) | 1998-02-05 |
GB9408717D0 (en) | 1994-06-22 |
US6046380A (en) | 2000-04-04 |
CN1149317A (zh) | 1997-05-07 |
NO964628D0 (no) | 1996-11-01 |
NO964628L (no) | 1997-01-03 |
FI964423A (fi) | 1996-11-04 |
NZ284550A (en) | 1998-05-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH09512430A (ja) | Dna配列 | |
Hanover et al. | Mitochondrial and nucleocytoplasmic isoforms of O-linked GlcNAc transferase encoded by a single mammalian gene | |
JP4163517B2 (ja) | フォンビルブラント因子(vWF)切断酵素 | |
US20100068802A1 (en) | Novel human androgen receptor alternative splice variants as biomarkers and therapeutic targets | |
US7179620B2 (en) | Gene responsible for stargardt-like dominant macular dystrophy | |
US8084415B2 (en) | Uteroglobin in the treatment of IGA mediated nephropathy | |
JP2004505631A (ja) | リシルオキシダーゼ遺伝子ファミリーの新規メンバー | |
JP4488140B2 (ja) | セリンプロテアーゼであるコリン | |
AU721105B2 (en) | Mammalian regulator of nonsense-mediated RNA decay | |
JP2004529602A (ja) | ミスマッチエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子およびその使用方法 | |
JP2001512676A (ja) | 1−α−ヒドロキシラーゼの材料および方法 | |
US7094591B2 (en) | Human aggrecanase and nucleic acid compositions encoding the same | |
US7211649B1 (en) | Cartilage intermediate layer protein | |
US20050026255A1 (en) | Corin, a serine protease | |
Sun et al. | Characterization of an unusual variant mRNA of human lysosomal α-mannosidase | |
WO1996037104A1 (en) | Compositions and methods for inhibiting fibrogenesis | |
MacLea | Molecular characterization of human deoxyribonuclease IIα: Structural determinants of activity and therapeutic implications | |
WO2006084007A2 (en) | Novel gene underlying atherosclerosis locus i | |
WO2001049707A1 (en) | Gene involved in mineral deposition and uses thereof | |
WO2001079467A2 (en) | Identification of a renal nadph oxidase | |
WO2004074302A2 (en) | Autosomal recessive polycystic kidney disease nucleic acids and peptides | |
JP2001136975A (ja) | 新規遺伝子及びそれにコードされる蛋白質foap−9 | |
WO2002000886A1 (fr) | Nouveau polypeptide, hydroperoxyde reductase 9, et polynucleotide codant ce polypeptide |