JPH09512169A - 微生物の存在下にカルボン酸を生物変換する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物変換に最適の非解離カルボン酸の濃度を、生物変換の間において終始、ｐＨ値制御することにより調整することを特徴とする、微生物の存在下に、カルボン酸を生物変換する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物の存在下にカルボン酸を生物変換する方法 本発明は、微生物の存在下にカルボン酸を生物変換する方法に関する。ここで 生物変換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と称するのは、特定純度の物 質（前駆物質）を、微生物、動植物培養細胞または分離酵素の触媒的作用により 選択的化学転化させて特定の最終生成物を形成することを意味する。 このカルボン酸の生物変換は、化学的合成によっては、たとえ可能であるにし ても極めて複雑で厄介な、ヒドロキシル化、エポキシド化のような、局部選択的 ないし互変選択的反応を達成するために行なわれる。 西独特願公開３９１００２４号公報は、種々の微生物を使用して、２−フェノ キシプロピオン酸を局部選択的ヒドロキシル化により、２−（４−ヒドロキシフ ェノキシ）−プロピオン酸に転化する方法を記載している。ラセミ化合物および 光学対掌的に純粋な化合物の両者をヒドロキシル化することができる。この方法 の利点は、ヒドロキシル化された副生成物を形成しないことである。 しかしながら、この方法は、経済性に関して改善される必要がある。ことに、 ５０ｇ／ｌ以上の前駆物質濃度であっても転化が完了せず、あるいは発酵時間が 著しく長いことが、この方法の経済性に悪影響をもたらす。 そこで、この分野の技術的課題ないし本発明の目的は、上述した欠点をもたら さない、微生物の存在下にカルボン酸を生物変換する方法を提供することである 。 しかるに、この課題ないし目的は、解離されていないカルボン酸の生物変換に 最適の濃度を生物変換の間において終始、ｐＨ値制御により調整することを特徴 とする、微生物の存在下にカルボン酸を生物変換する方法によって、解決ないし 達成されることが本発明者らにより見出された。 生物変換が行なわれる過程で、ｐＨ値は頻繁に、しかも大きく変化する。これ は生成する中間代謝物、消費される栄養素、前駆物質の生成速度変化などの多く のファクターにより影響を受ける。 ｐＨ値は生物変換において決定的な役割を果たす。これによりカルボン酸の解 離形態と非解離形態の間の割合が固定されるからである。この割合は、カルボン 酸のｐＫａが既知であれば、周知の緩衝等式により簡単に見出され得る。 ｐＨ値の増大は、極めて一般的に、解離カルボン酸の割合の増大をもたらし、 ｐＨ値の低減は、非解離カルボン酸の割合を増大させる。 非解離形態のカルボン酸が、微生物により変換される適当なカルボン酸形態で ある。 従って、ｐＨ値の制御により非解離カルボン酸の割合を最大限にするのが好ま しい。これにより、前駆物質の細胞中への高率の拡散をもたらす、高トランスメ ンブレイン（細胞膜滲透）濃度勾配が設定されるからである。しかしながら、非 解離形態の割合は、適宜の微生物に毒性効果ないし成長抑止効果をもたらす程高 くなされる必要はない。 生物変換の過程は、種々の複数段階から成るが、これらは相互に重畳して、各 段階の間に明確な区別を設けることはできない。 第１段階相は、微生物の成長により劃定される。経済的ないし効率的な方法と するためには、この段階において、前駆物質の存在下に、生産性微生物量をでき るだけ迅速に達成することが望ましい。生物変換の末期における微生物量の２５ −５０％が、この段階相において存在することが、原則的に好ましい。この第１ 段階相は、一般的に全生物変換時間の１０−３０％を占める。 この第１段階相における臨界的ファクターは、媒体の容量オスモル濃度および 前駆物質の濃度ないし量割合であって、このパラメータないし条件のいずれか一 方の、または両者の数値が高いと、微生物の成長が抑止されるか、あるいはこれ に対して毒性的作用がもたらされる。 従って、生物変換の第１段階相におけるこのｐＨ値は、前駆物質の非解離形態 の割合が、成長抑止濃度の１から３０％、ことに３から２０％となるように制御 されるのが好ましい。 この成長抑止濃度は、当該分野の技術者に周知の簡単な事前テストにより、特 定のカルボン酸および所定の微生物に関して、容易に決定され得る。さらに調整 されるべきｐＨ値も、カルボン酸の既知のｐＫａ値および緩衝等式から、容易に 算出され得る。 生物変換の第２段階相においては、前駆物質の大部分は、大きい量生産力で転 化される。高い時空収率を達成するため、非解離形態の前駆物質の量割合は、所 定微生物に対する成長抑止濃度の５から６５％、ことに１５から４０％となるよ うに調整される。 生物変換の第３段階相においては、前駆物質はもはや計量されず、媒体中にお いて前駆物質は目的生成物に転化されていることが望ましい。この段階相におい て、ｐＨ値は原則として低減され、これにより前駆物質濃度が低下しても、非解 離状態の前駆物質の濃度は、できるだけ長く、第２段階相の最適範囲に維持され る。その結果、量生産力を制約する拡散速度は、充分に高いレベルに止まる。こ の段階相は、全生物変換時間の１０から３０％を占める。 この方法により、２−フェノキシプロピオン酸から、２−（４−ヒドロキシフ ェノキシ）−プロピオン酸へのヒドロキシル転化の場合、１００ｇ／ｌ以上の生 成濃度で、１０日以内の生物変換処理の末期において、完全転化（９８％以上） が達成可能である。 本発明方法は、生物変換によるカルボン酸のヒドロキシル化およびエポキシド 化に適する。カルボン酸としては、脂肪族および芳香族、ことに脂環式および芳 香族のカルボン酸が適当である。 芳香族基を有するカルボン酸（芳香族カルボン酸）のヒドロキシル化が、こと に有利に行なわれる。芳香族基の局部選択的ヒドロキシル化が、本発明方法によ りことに有利に行なわれる。本発明方法は、西独特願公開３９１００２４号、４ １３４７７４号、４１３４７７５号、４１４２９４３号、４２２０２４１号、４ ２３２５２２号公報に記載されている化合物に適用され得る。 本発明方法にことに適する微生物は、菌類およびバクテリアであって、この微 生物の例は、上述３９１００２４号公報に記載されており、またこれに記載され ている方法により容易に見出され得る。 ２−フェノキシプロピオン酸から、２−（４−ヒドロキシフェノキシ）−プロ ピオン酸への転化にことに適する微生物は、Ｂｅａｖｅｒｉａ（白キョウ蚕病菌 ）に属する菌類である。 生物変換は、原則的に場合により前駆物質を含有する栄養媒体中において微生 物を培養し、転化後、微生物培養肉汁から生成物をできるだけ完全に単離し、必 要に応じて精製することにより行なわれる。 前駆物質は、生物変換の過程において添加されてもよく、また当初に添加し、 次いで間欠的にまたは継続的に添加することもできる。 この添加は、生物変換の過程で行なうのがことに有利である。当初から前駆物 質の全量を存在させることは不必要であり、またこれにより微生物に大きい滲透 圧ストレスを与える場合があるからである。 さらに、好ましい実施態様においては、生物変換の間に、炭素または窒素、も しくは炭素と窒素のような栄養素の添加が行なわれる。 本発明にことに適する微生物は、生物変換の滲透圧条件（容量オスモル濃度） に特別に適合せしめられた微生物である。 この種の微生物は、放射線または化学剤による古典的な、突然変異の誘発およ び次いで行なわれる大量の前駆物質／生成物の存在下における成長、選定により もたらされ得る。 追加的に転置可能の遺伝素子を突然変異のために使用することもできる。 この種の微生物は、また次第に増大する量の前駆物質／生成物の流動媒体中濃 度の添加により、適合化が低度の個体の集団から、連続的培養により選定される こともできる。 実験例 以下の実験例により本発明をさらに具体的に説明し、対比例に比べてその利点 を明らかにする。 実験例１から４には、本発明によるｐＨ値制御をしない生物変換が、実験例５ および６には、このｐＨ値制御を行なう生物変換が記載される。 実験例１（対比例） ｐＨ値を制御することなく、また各種栄養源を計量添加する、２−（４−ヒド ロキシフェノキシ）−プロピオン酸の製造方法。 本実験例においては、西独特願公開３９１００２４号公報に記載された方法に 対応する発酵による２−（４−ヒドロキシフェノキシ）−プロピオン酸製造用培 養基が示される。 予備培養用の栄養媒体Ａ、Ｂ、Ｃが、主培養用の栄養媒体Ｄが以下のようにし て調製された。 希元素溶液 ２−フェノキシプロピオン酸は、ナトリウム塩の５０％濃度水溶液の形態で使 用された。 主培養に使用された尿素は、濾過により消毒された。セルロースおよびホスフ ァートはそれぞれ別個に、その他は一緒にオートクレーブ高圧滅菌された。各組 成分の合併後、ＮａＯＨによりｐＨ値を６．８に調整した。 Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ（白キョウ蚕病菌の１種）（ＣＭＩ Ｎｏ．１２９４２）を、液体培養において、１００ｇ／ｌの２−フェノキシプロ ピオン酸の存在下、ｐＨ６．８で、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグワニジン（ｓ ｉｃ）による突然変異誘発により得た。Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグワニジン を使用する突然変異体の製造方法については、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ １８（１９６５）７８８を参照され度い。前駆物質の 高濃度の存在下に成長する菌の選択は、浸積培養による５継代で行なわれた。こ のようにして得られた菌株をＬｕ７００と命名し、本実験例および以下の実験例 において使用した。 この菌株を、イノキュウム、すなわち接種物を形成するため、寒天培養基上で 培養した。この寒天培養基は、１８ｇ／ｌの濃度の媒体Ａに寒天を添加して調製 された。新しい培養基への移転は１４日ごとに行ない、１−３週間の古い寒天培 養基は、予備培養に使用された。 予備培養基は、５００ｍｌ容積のエルレンマイヤーフラスコ４本にそれぞれ１ ００ｍｌの無菌媒体Ａを装填して調製された。これらのフラスコに、寒天培養基 から、菌株Ｌｕ７００の菌糸体を少しずつ添加、接種して、２８０℃、２５０ｒ ｐｍで２日間、振とう攪拌した。これを９ｌの無菌媒体Ｂを含有する発酵槽の接 種のために使用し、８００ｒｐｍ、２８℃、１日当たり１ＶＶＭの曝気で１日間 インキュベーションを行なった。この培養０．４５ｌを、９ｌの媒体Ｃを含有す る発酵槽の接種用に使用し、同じく８００ｒｐｍ、２８℃、１日当たり１ＶＶＭ の曝気で１日間インキュベーション処理した。この第３培養を本実験例および以 下の実験例における主培養の接種用に使用した。 すなわち、９ｌの媒体Ｄを含有する発酵槽を、０．９ｌの第３培養で接種し、 同じ処理条件下で５日間インキュベーション処理した。ｐＨ値制御は行なわなか った。発酵の間のｐＨ値変化を記録した。発酵末期に試料を採取し、そのグル コースをベーリンガー、マンハイム、テスト、キット Ｎｏ．７１６２５１を使 用して、酵素活性的に測定し、転化割合を、西独特願公開３９１９０２４号公報 に記載された方法により、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で測定した。このＧ Ｃ分析検線用の標準として、２−フェノキシプロピオン酸および２−（４−ヒド ロキシフェノキシ）−プロピオン酸の真正試料を使用した。 分子転化は、ガスクロマトグラフィーで確認した２−フェノキシプロピオン酸 および２−（４−ヒドロキシフェノキシ）−プロピオン酸の濃度から、妥当な分 子量を使用して見出した。特定時間における各発酵槽ごとの生成物の量を、使用 された前駆物質の量と分子転化割合から測定した。 ５日後に以下の結果が得られた。 実験例２（対比例） 高い前駆物質濃度下における２−（４−ヒドロキシフェノキシ）−プロピオン 酸の製造 実験例１に記載された一連の予備培養を、菌株Ｌｕ７００を使用して行ない、 ９ｌの媒体Ｄを含有する発酵槽を、０．９ｌの第３培養で接種した。ただし、本 実験例では、この媒体Ｄには、１００ｇ／ｌのフェノキシプロピオン酸が添加さ れた。処理条件は、実験例１に詳述した通りになされた。本実験例においてもｐ Ｈ値制御は行なわず、その記録のみを行なった。 処理の５日目および７日目に試料を採取し、実験例１と同様にして分析した。 実験例３（対比例） Ｃ元素源の添加、高い前駆物質濃度下における、２−（４−ヒドロキシフェノ キシ）−プロピオン酸の製造 実験例１に記載された一連の予備培養を、菌株Ｌｕ７００を使用して行ない、 ９ｌの媒体Ｄを含有する発酵槽を、０．９ｌの第３培養で接種した。ただし、媒 体Ｄにおけるグルコース量は６０ｇ／ｌに、２−フェノキシプロピオン酸量は９ ０ｇ／ｌに変更した。また発酵槽の処理は、温度、曝気度および攪拌速度につい て実験例１に記載されたようにして行なった。本実験例においても、実験例２と 同様にｐＨ値の制御は行なわず、その変化を記録するに止めた。ただし、２日目 から３日目に、１日当たり、各発酵槽ごとに、２５０ｇのグルコースを５５％濃 度の溶液形態で添加した。 処理の５日目と７日目に試料を採取し、実験例１と同様にして分析した。その 結果は以下の通りである。 実験例４（実施例） ＣおよびＮ元素源の添加、高い前駆物質濃度下における２−（４−ヒドロキシ フェノキシ）−プロピオン酸の製造 実験例１に記載された一連の予備培養を、菌株Ｌｕ７００を使用して行ない、 ９ｌの媒体Ｄを含有する発酵槽を、０．９ｌの第３培養で接種した。媒体Ｄにお けるグルコース量は６０ｇ／ｌに、２−フェノキシプロピオン酸量は９０ｇ／ｌ に変更した。処理条件は、実験例１と同様にした。発酵の間、以下の溶液を以下 の標準で連続的に計量、給送した。 ｐＨ値は、適当な制御装置を使用して５Ｍ ＮａＯＨで６．５以上に定常的に 維持し、実際のｐＨ値を毎日記録した。 ５日目、７日目、９日目に試料を採取し、実験例１と同様に分析した。結果は 以下の通りであった。 実験例５（実施例） ｐＨ値制御下における２−（４−ヒドロキシフェノキシ）−プロピオン酸の製 造 実験例１に記載された一連の予備培養を、菌株Ｌｕ７００を使用して行ない、 ９ｌの媒体Ｄを含有する発酵槽を、０．９ｌの第３培養で接種した。この媒体Ｄ におけるグルコース濃度は６０ｇ／ｌ、２−フェノキシプロピオン酸濃度は９０ ｇ／ｌとした。発酵槽の処理は、実験例１と同様の条件下に行なわれた。発酵の 間、以下の溶液を以下の標準で連続的に計量給送した。 毎日、ｐＨ値変化を５Ｍ ＮａＯＨで制御し、下表に示されるｐＨ値とした。 ５日目および７日目に試料を採取し、実験例１と同様にして分析した。その結果 は以下に示される通りであった。 実験例６（実施例） ｐＨ制御、前駆物質の計量給送下における２−（４−ヒドロキシフェノキシ） −プロピオン酸の製造 実験例１における一連の予備培養を、菌株Ｌｕ７００を使用して行ない、９ｌ の媒体Ｄを含有する発酵槽を、０．９ｌの第３培養で接種した。ただし、媒体Ｄ 中のグルコース濃度は６０ｇ／ｌ、２−フェノキシプロピオン酸濃度は９０ｇ／ ｌとした。処理条件は、実験例１と同様にした。発酵の間に、下記溶液を下記標 準で連続的に計量、給送した。 ｐＨ値変化を毎日、５Ｍ ＮａＯＨまたは２Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄で制御し、下表に示 される数値に調整した。５日目、７日目、９日目に試料を採取し、実験例１と同 様にして分析した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 生物変換に最適の非解離カルボン酸の濃度を、生物変換の間において終 始、ｐＨ値制御することにより調整することを特徴とする、微生物の存在下に、 カルボン酸を生物変換する方法。 ２． 芳香族カルボン酸を生物変換のために使用することを特徴とする、請求 項１の方法。 ３． 生物変換が、カルボン酸の芳香族核のヒドロキシル化であることを特徴 とする、請求項２の方法。 ４． 生物変換が、２−フェノキシプロピオン酸のパラ−ヒドロキシル化であ ることを特徴とする、請求項３の方法。 ５． 生物変換の間において、栄養素源を計量給送することを特徴とする、請 求項１から４のいずれかの方法。 ６． 生物変換の間において、前駆物質を計量給送することを特徴とする、請 求項１から５のいずれかの方法。 ７． 生物変換の滲透条件に、特に適合せしめられた微生物を、生物変換用微 生物として使用することを特徴とする、請求項１から６のいずれかの方法。 ８． 請求項１から７の生物変換を利用して、２−フェノキシプロピオン酸か ら、２−（４−ヒドロキシフェノキシ）−プロピオン酸を製造する方法。