JPH09511906A

JPH09511906A - Methods and products for modulating cell responsiveness to external signals

Info

Publication number: JPH09511906A
Application number: JP7526939A
Authority: JP
Inventors: ゲイリー・エルジヨンソン，
Original assignee: National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine
Current assignee: National Jewish Health
Priority date: 1994-04-15
Filing date: 1994-10-14
Publication date: 1997-12-02
Anticipated expiration: 2022-09-26
Also published as: CA2186526C; CA2186526A1; JP3980609B2; DE69434650T2; AU8017794A; AU703070B2; ATE319821T1; JP2006051026A; JP3980635B2; DE69434650D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、単離されたＭＥＫＫタンパク質、かかるタンパク質をコードする配列を有する核酸分子、およびかかるタンパク質に対して生成する抗体に関する。本発明はまた、かかるタンパク質を使用して、細胞中のシグナル伝達を調節する方法を包含する。本発明はまた、かかるタンパク質またはかかるタンパク質をコードする核酸分子を含んでなる治療組成物、並びに癌、炎症、神経障害、自己免疫疾患、アレルギー反応およびホルモン関連疾患を含む内科的疾病を有する動物を治療ためのそれらの使用を包含する。ＭＥＫＫが発現すると、それはＭＥＫ−１、ＭＥＫ−２およびＪＥＫを含むＭＥＫ類をリン酸化して、活性化する。 (57) [Summary] The present invention relates to isolated MEKK proteins, nucleic acid molecules having sequences encoding such proteins, and antibodies raised against such proteins. The invention also includes methods of using such proteins to regulate signal transduction in cells. The invention also relates to therapeutic compositions comprising such proteins or nucleic acid molecules encoding such proteins, as well as animals having medical disorders including cancer, inflammation, neuropathy, autoimmune diseases, allergic reactions and hormone related diseases. Includes their use for treatment. When MEKK is expressed, it phosphorylates and activates MEKs, including MEK-1, MEK-2 and JEK.

Description

【発明の詳細な説明】外部シグナルに対する細胞応答性を調節するための方法および生成物発明の技術分野本発明は、ＭＥＫＫタンパク質をコードしている単離された核酸分子、実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質、および細胞中のシグナル伝達を調節する生成物および方法に関する。発明の要旨本発明は、哺乳類のＭＥＫタンパク質をリン酸化することができる実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質に関し、該ＭＥＫＫタンパク質は触媒ドメインを含む。本発明は、細胞の表面上の増殖因子受容体から出発するシグナルを、ＭＡＰＫタンパク質の活性を調節することによって、調節することができる実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質を包含し、調節する能力はＲａｆタンパク質シグナル調節と異なる。特に、実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質は、配列番号４：、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０を含むアミノ酸配列をコードしている核酸分子と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる核酸によって、コードされたアミノ酸配列の少なくとも一部を含んでなる。実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質はＭＡＰＫタンパク質の活性を調節することができ、前記タンパク質はＲａｆタンパク質と異なるアミノ酸配列を有する。本発明はまた、配列番号：２、配列番号４：、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０を含むアミノ酸配列をコードしている核酸分子と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる核酸配列によってコードされたアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１種の単離たれたタンパク質を含んでなる製剤を包含する。本発明の一つの態様は、Ｒａｆタンパク質から独立性の哺乳類ＭＥＫをリン酸化することができ、そしてＭＡＰＫタンパク質の活性を調節することができるタンパク質をコードしている配列を有する単離された核酸分子を包含する。特に、本発明は、配列番号１：、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９からなる群から選ばれた核酸配列と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる単離された核酸分子を包含する。本発明の他の態様は、配列番号：、１配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９を含む核酸配列と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる核酸分子を含んでなり、核酸が発現ベクターに操作可能に結合している、組換え分子を包含する。本発明のさらに他の態様は、発現ベクターに操作可能に結合している核酸分子を含んでなる、組換え分子で形質転換された組換え細胞であり、該核酸分子は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９（即ち、表１、表２、表３、表４および表５に示された核酸配列）からなる群から選ばれた核酸配列と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる核酸配列を含んでなる。本発明はまた、細胞中のＲａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節することを含む細胞の恒常性を調節する方法を包含する。特に、この方法は、細胞のアポト−シスを調節することを含んでなる。かかる方法は内科的疾病を治療するのに有用である。特に、この方法は腫瘍形成および自己免疫を抑制するのに有用である。本発明のよれば、疾患を治療する方法は、Ｒａｆ依存性経路の活性を低下させることができる分子、ＭＥＫＫ依存性経路の活性を増加させることができる分子およびそれらの組合せを含む、少なくとも１種の調節分子を含んでなる治療化合物の有効量を、患者に投与することを含んでなり、該有効量は、疾患に関与する有害細胞を除去するに至る量を含んでなる。また、本発明には、（ａ）細胞を推定上の調節分子と接触させること；（ｂ）推定上の調節化合物が細胞中のＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節する能力を、前記ＭＥＫＫ依存性経路の少なくとも１つの構成員の活性化を測定することによって、決定すること；を含んでなる方法によって同定された、細胞中のＭＥＫＫ依存性の活性を調節することができる治療用化合物が包含される。本発明の１つの態様は、実質的に純粋なタンパク質を包含し、該タンパク質は、哺乳類ＭＥＫタンパク質をリン酸化することができ、そしてＲａｆタンパク質から独立性のＭＡＰＫタンパク質の活性を調節することができるＭＥＫタンパク質に選択的に結合することができる抗体を使用して単離され、該抗体は、（ａ）動物に、本発明の実質的に純粋なＭＥＫＫタンパク質の有効量を投与すること；（ｂ）ＭＥＫＫタンパク質に選択的に結合することができる抗体を回収すること；を含んでなる方法によって製造することができる。本発明の他の実施例は、ＭＥＫＫタンパク質に選択的に結合することができる単離された抗体を包含し、該抗体は、動物に、本発明の実質的に純粋なタンパク質の有効量を投与し、そしてＭＥＫＫタンパク質に選択的に結合することができる抗体を回収することを含んでなる方法によって製造することができる。発明の背景マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）（細胞外シグナル調節キナーゼまたはＥＲＫｓとも呼称される）は、チロシンキナーゼ（上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体のような）である増殖因子受容体およびトロンビン受容体のような異種三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）に結合している受容体の両方によって結合しているリガンドに応答して、急速に活性化される。ＭＡＰＫは、種々の第二メッセンジャーによって伝達された多重細胞内シグナルを統合するようである。ＭＡＰＫはリン酸化して、酵素および、ＥＧＦ受容体、Ｒｓｋ９０、ホスホリパーゼＡ₂、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−ＪｕｎおよびＥｌｋ −１／ＴＣＦを含む転写因子の活性を調節する。チロシンキナーゼである受容体によるＭＡＰＫｓの急速な活性化はＲａｓに依存性であるが、ＭＡＰＫのＧタンパク質媒介活性化はＲａｓ依存性および独立性(非依存性)である経路を経て起こるようである。酵母中のフェロモン誘発シグナル経路の相補性分析によって、ＭＡＰＫのＳｐｋ１とＦｕｓ３−Ｋｓｓ１、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）同族体の活性を調節するプロテインキナーゼ系が規定された(例えば、Ｂ．Ｒ．Ｃａｉｒｎｓ等，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖ．，６，１３０５（１９９２）；Ｂ．Ｊ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖ．，６，１２９３（１９９２）；Ｓ．Ａ．Ｎａｄｉｎ−Ｄａｖｉｓ等，ＥＭＢＯＪ．，７，９８５（１９８８）；Ｙ．Ｗａｎｇ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，３５５４（１９９１）参照)。Ｓ．セレビシエでは、プロテインキナーゼＳｔｅ７はＦｕｓ３−Ｋｓｓ１活性の上流調節体であり、プロテインキナーゼＳｔｅ１１はＳｔｅ７を調節する。Ｓ．ポンベ遺伝子産物Ｂｙｒ１とＢｙｒ２は夫々Ｓｔｅ７とＳｔｅ１１と相同である。ＭＥＫ（ＭＡＰＫキナーゼもしくはＥＲＫキナーゼ）またはＭＫＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）酵素は配列がＳｔｅ７Ｂとｙｒ１に類似である。ＭＥＫｓはＭＡＰＫｓをチロシンとスレオニン残基の両方の上でリン酸化し、これによってＭＡＰＫが活性化される。哺乳類のセリン−スレオニンプロテインキナーゼＲａｆはリン酸化して、ＭＥＫを活性化して、ＭＡＰＫが活性化される。Ｒａｆは、増殖因子受容体のチロシンキナーゼ活性に応答して活性化され、それ故Ｒａｆは、膜関連チロシンキナーゼの刺激に応答して、ＭＡＰＫを活性化することができる。Ｒａｆは配列がＳｔｅ１１とＢｙｒ２に関連性でない。従って、Ｒａｆは、哺乳類細胞中で、酵母中で規定されたフェロモン応答性プロテインキナーゼ系からの拡散を示すことができる。ＭＡＰＫの調節において細胞および受容体に特異的な相違があることから、哺乳類ＭＥＫの他のＲａｆ独立性調節体が存在することが示唆される。増殖および分化のようなある種の生物学的機能は、細胞内のシグナル伝達経路によってしっかりと調節されている。シグナル伝達経路は、細胞の平衡定常状態機能を維持している。疾患状態は、細胞中のシグナル伝達が壊れ、細胞機能に通常存在するしっかりした制御が除去される場合に起こることができる。例えば、腫瘍は、細胞増殖の調節が崩壊し、細胞のクローンが無限に膨脹する場合に発生する。シグナル伝達ネットワークは、細胞の種類に依存する多数の細胞機能を調節するから、多種類の疾病がかかるネットワーク中の異常に由来することができる。癌のような荒廃性疾患、自己免疫疾患、アレルギー反応、炎症、神経障害、およびホルモン関連疾患は異常なシグナル伝達に由来することができる。種々の疾患状態に関与する細胞を調節する方法を理解し発見する必要性は長年感じられてきたが、シグナル伝達経路の複雑さによって、細胞中のシグナル導入経路を操作することによって細胞機能を調節する生成物と方法の開発が阻まれてきた。このように、細胞中のシグナル伝達の予想できる制御の実行を可能にし、従って異常な細胞機能によって生起する種々の疾患の治療を可能にする生成物と方法の必要性は残されている。図面の簡単な説明図１は脊椎動物と酵母のシグナル経路の略図である。図２はＲａｓタンパク質経路と異なるＭＥＫＫとＲａｆの二相経路の略図である。図３Ａは数種の細胞株とマウス組織中の一本鎖の７．８ｋｂＭＥＫＫｍＲＮＡのノーザン（ＲＮＡ）ブロットを示す。図３ＢはＭＥＫＫ遺伝子のサザン（ＤＮＡ）ブロットを示す。図３Ｃは齧歯類の細胞株中の７８ｋｄと５０ｋｄのＭＥＫＫの発現を示すイムノブロットを示す。図４はＭＥＫＫ抗血清を使用するＭＥＫＫタンパク質の免疫沈降物を示す。図５は免疫沈降物と細胞溶解物中のＭＥＫＫタンパク質のイムノブロットを示す。図６ＡはＭＥＫＫでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中のＭＡＰＫの活性化を示す。図６ＢはＥＧＦで処理されたか、または処理されなかった細胞中のＭＥＫＫの発現を示すイムノブロットである。図７はＭＥＫＫでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中のＭＥＫの活性化とリン酸化を示す。図８ＡはＭＥＫＫによるＭＥＫ−１のリン酸化を示す。図８ＢはＣＯＳ細胞中で発現したＭＥＫＫによるＭＥＫ−１のリン酸化の経時変化を示す。図８ＣはＣＯＳ細胞中で過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）したＭＥＫＫのイムノブロットである。図９Ａは活性化ＭＥＫ−１によるＭＡＰＫのリン酸化を示す。図９Ｂは免疫沈降したＭＥＫＫによるＭＥＫ−１のリン酸化を示す。図１０Ａは活性化ＲａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化を示す。図１０Ｂは、ＭＥＫＫを過発現していて、そしてＥＧＦで処理されたＣＯＳ細胞から単離されたＲａｆのリン酸化状態を示す。図１１は、免疫沈降したＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂが、キナーゼ不活性なＭＥＫ− １をリン酸化する相対的能力を示す。図１２はＥＧＦ刺激されたＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂ活性の経時変化を示す。図１３は、ＭＥＫＫ免疫沈降物からのＲａｆ−Ｂの免疫低下がＭＥＫＫ活性に影響しないことを示す。図１４は、ＭＥＫＫ免疫沈降物からのＲａｆ−Ｂの免疫低下がＲａｆ−Ｂ活性を低下させることを示す。図１５はＰＣ１２細胞溶解物のＦＰＬＣモノＱイオン交換カラムフラクション中のＭＥＫＫ活性を示す。図１６は優性の陰性Ｎ¹⁷ＲＡＳ発現によるＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂ活性の阻害を示す。図１７は９８ｋＤＭＥＫＫによるＭＥＫタンパク質の活性化を示す。図１８はフォルスコリンによるＭＥＫＫのＥＧＦ活性化の阻害を示す。図１９は切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）トランケートＭＥＫＫ分子による改良されたＭＥＫＫ活性を示す。図２０はＭＥＫＫタンパク質によるＪＮＫ活性化を示す。図２１は、ＭＥＫＫタンパク質による、ｃ−Ｍｙｃ制御転写およびＣＲＥＢ制御転写の調節を示す。図２２はｃ−Ｍｙｃ制御転写のＭＥＫＫ調節の略図である。図２３はＭＥＫＫ３によるｐ３８ＭＡＰＫリン酸化の誘発を示す。図２４はビュ−ベリシン（ｂｅａｕｖｅｒｉｃｉｎ）によるＳｗｉｓｓ３Ｔ３とＲＥＦ５２細胞中のアポト−シスの誘発を示す。図２５はＭＥＫＫによるＲＥＦ５２細胞中のアポト−シスの誘発を示す。図２６はＭＥＫＫによるＳｗｉｓｓ３Ｔ３とＲＥＦ５２細胞中のアポト−シスの誘発を示す。図２７はＭＥＫＫタンパク質を発現しているアポト−シス的なＲＥＦ５２細胞の３枚の代表的な顕微鏡図を示す。図２８はＭＥＫＫタンパク質を発現しているアポト−シス的なＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の３枚の代表的な顕微鏡図を示す。図２９はＭＥＫＫタンパク質とＲａｆタンパク質によるＭＡＰＫ活性の類似な刺激を示す。発明の詳細な記述本発明は、細胞中のシグナル伝達を調節することができる新規なマイトジェンＥＲＫキナーゼキナーゼタンパク質（ＭＥＫＫ）に関する。本発明は、疾患を、かかる疾患に関与する細胞の活性を調節することによって治療する新規な方法を包含する。本発明は、本発明の新規な生成物および方法が、アポト−シスをもたらすことができるシグナル伝達を調節することができる点で、特に有利である。本発明の１つの態様は単離されたＭＥＫＫタンパク質である。本発明によれば、単離されたタンパク質はその天然環境から取出されたタンパク質である。例えば、単離されたＭＥＫＫタンパク質はその天然源から得られるか、または組換えＤＮＡ技術を使用して製造されるか、または化学的に合成されることができる。本明細書で使用されるように、単離されたＭＥＫＫタンパク質は、アミノ酸が欠失（例えば、ペプチドのような、タンパク質の短縮された変形物）、挿入、逆転、置換および／または誘導体化（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パリミトイル化、アミド化および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの添加によって）されたＭＥＫＫタンパク質のような、全長のＭＥＫＫタンパク質またはかかるタンパク質のいずれかの相同体とすることができ、該改変タンパク質はマイトジェンＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）および／またはＪｕｎＥＲＫキナーゼ(ＪＥＫ)をリン酸化することができる。ＭＥＫＫタンパク質の相同体は、この相同体をコードしている核酸配列が、天然ＭＥＫＫタンパク質のアミノ酸配列をコードしている核酸配列に(即ち、と共に)、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる程度に、天然ＭＥＫＫタンパク質のアミノ酸配列に類似しているアミノ酸配列を有するタンパク質である。本明細書で使用されているように、緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）ハイブリッド形成条件とは、オリゴヌクレオチドを含む核酸分子が類似の核酸分子を同定するのに使用される、標準ハイブリッド形成条件を言う。かかる標準条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，分子クローニング：実験操作法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｓＰｒｅｓｓ，１９８９年に開示されている。ＭＥＫＫタンパク質の相同体はまた、その相同体が、天然に存在するＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一つのエピトープに対する免疫反応を誘発する能力を有する程度に、交差反応性であるアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。本発明のタンパク質相同体の最小の大きさは、対応する天然タンパク質をコードしている核酸分子の相補的配列と安定なハイブリッドを形成することができる核酸分子によってコードされる程度の大きさである。このように、かかるタンパク質相同体をコードしている核酸分子の大きさは、核酸組成、核酸分子と相補的配列との間のパーセント相同性並びにハイブリッド形成条件それ自体（例えば、温度、塩濃度およびホルムアミド濃度）に依存性である。かかる核酸分子の最小の大きさは通常、核酸分子がＧＣに富む場合、少なくとも約１２〜約１５個のヌクレオチドの長さであり、そしてＡＴに富む場合、少なくとも約１５〜約１７個の塩基の長さである。このように、本発明のＭＥＫＫタンパク質相同体をコードするために使用された核酸分子の最小の大きさは、約１２〜約１８個のヌクレオチドの長さである。かかる核酸分子の最大の大きさについては、核酸分子が遺伝子の一部、全遺伝子、もしくは同義遺伝子、またはそれらの一部を含むことができるという実際的な制限以外に、全く制限はない。同様に、本発明のＭＥＫＫタンパク質相同体の最小の大きさは、約４〜約６個のアミノ酸の長さであり、好適な大きさは、全長で多価性のタンパク質（即ち、一つ以上のドメインを有し、各ドメインが機能を有する融合タンパク質）が望まれているか、またはかかるタンパク質の機能部分が望まれるかに依存している。ＭＥＫＫタンパク質相同体は、ＭＥＫＫタンパク質をコードしている天然遺伝子の対立遺伝子変異の結果であることができる。天然遺伝子とは、天然中に最もしばしば見出される遺伝子の形態を言う。ＭＥＫＫタンパク質相同体は、これに限定されないが、タンパク質をコードしている遺伝子を、例えば、無作為または標的突然変異誘発を行う古典的または組換えＤＮＡ技術を使用して、直接改変することを含む、当業界で既知の技術を使用して製造することができる。ＭＥＫＫタンパク質相同体がＭＥＫＫおよび／またはＪＥＫタンパク質をリン酸化する能力は、当業者に既知の技術を使用して試験することができる。かかる技術として、実施例で詳細に記載されるリン酸化測定法が挙げられる。１つの態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質はＭＥＫＫ依存性経路を調節することができる。本発明によれば、ＭＥＫＫ依存性経路とは一般的に、ＭＥＫＫタンパク質が、Ｒａｆから実質的に独立している経路を調節する経路、およびＭＥＫＫタンパク質の調節が、Ｒａｆタンパク質特にＭＥＫタンパク質を含む経路の共通の構成員に集中する経路を指す（図２を参照）。適切なＭＥＫＫ依存性経路として、ＭＥＫＫタンパク質とＪＥＫタンパク質を含むが、Ｒａｆタンパク質を含まない経路が挙げられる。当業者は、ＭＥＫＫタンパク質による経路の調節がＲａｆタンパク質から実質的に独立していることを、ＭＥＫＫタンパク質とＲａｆタンパク質がかかる経路の下流の構成員のリン酸化を調節する能力を、例えば、実施例１６に記載の一般的方法を使用して比較することによって、決定することができる。ＭＥＫＫタンパク質がＭＥＫＫより下流の経路の構成員（例えば、ＪＥＫ、ＪＮＫ、Ｊｕｎおよび／またはＡＴＦ−２を含むタンパク質）のリン酸化を、Ｒａｆタンパク質が利用される場合より有意的に大きい量だけ誘発する場合、ＭＥＫＫタンパク質はＲａｆタンパク質から実質的に独立している経路を調節する。例えば、ＪＮＫのリン酸化のＭＥＫＫ誘発は、Ｒａｆタンパク質を使用する場合に誘発されるリン酸化より、好適には少なくとも約１０倍、さらに好適には少なくとも約２０倍、さらにもっと好適には少なくとも約３０倍大きいＪＮＫタンパク質のリン酸化である。リン酸化のＭＥＫＫ誘発がリン酸化のＲａｆタンパク質誘発と同様である場合、当業者は、ＭＥＫＫタンパク質による経路の調節が、Ｒａｆタンパク質も含むことができたシグナル伝達経路の構成員を含むと結論することができる。例えば、ＭＡＰＫのリン酸化のＭＥＫＫ誘発は、Ｒａｆタンパク質によるリン酸化の誘発と同程度の大きさである。「Ｒａｆ依存性経路」とは、Ｒａｆタンパク質がＭＥＫＫタンパク質から実施的に独立しているシグナル伝達経路を調節するシグナル伝達経路、およびＲａｆタンパク質調節がＭＥＫＫタンパク質を含む経路の共通の構成員に集中する経路を言うことができる。Ｒａｆタンパク質による経路の調節の、ＭＥＫＫタンパク質による経路の調節からの独立性は、ＭＥＫＫの独立性を決定するのに使用された方法と同様の方法を使用して決定することができる。他の態様では、ＭＥＫＫタンパク質は、これに限定されないが、マイトジェンＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、転写制御因子（ＴＣＦ）、Ｅｔｓ様−１転写因子（Ｅｌｋ−１）、ＪｕｎＥＲＫキナーゼ（ＪＥＫ）、Ｊｕｎキナーゼ（ＪＵＫ）、ストレス活性化ＭＡＰＫタンパク質、Ｊｕｎ、活性化転写因子−２（ＡＴＦ−２）および／またはＭｙｃタンパク質を含む、シグナル伝達タンパク質の活性を調節することができる。本明細書で使用されるように、タンパク質の「活性」は、タンパク質のリン酸化状態および／またはタンパク質が特定の機能を行う能力（例えば、他のタンパク質をリン酸化するまたは転写を調節する）に直接に関連することができる。本発明のＭＥＫＫタンパク質によって調節された好適なＭＥＫタンパク質として、ＭＥＫ−１および／またはＭＥＫ−２が挙げられる。本発明のＭＥＫＫタンパク質によって調節された好適なＭＡＰＫタンパク質として、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ４２ＭＡＰＫおよび／またはｐ４４ＭＡＰＫが挙げられる。ｐ３８ＭＡＰＫタンパク質をリン酸化することができる好適なＭＥＫＫタンパク質として、配列番号：５によって表される核酸配列によってコードされたタンパク質が挙げられ、配列番号：７によって表されるアミノ酸配列を有するタンパク質はさらに好適である。本発明のＭＥＫＫタンパク質によって調節された好適なストレス活性化ＭＡＰＫタンパク質として、Ｊｕｎキナーゼ（ＪＮｋ）、ストレス活性化ＭＡＰＫ−αおよび／またはストレス活性化ＭＡＰＫ−βが挙げられる。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫタンパク質の活性をＭＥＫの基礎水準（即ち、刺激されないで天然で見出される水準）以上に増加させることができる。例えば、ＭＥＫＫタンパク質は好適には、実施例９に記載の条件下で測定した場合、基礎水準の少なくとも約２倍、さらに好適には少なくとも約３倍、さらにもっと好適には少なくとも約４倍まで、ＭＥＫタンパク質のリン酸化を増加させることができる。本発明の好適なＭＥＫＫタンパク質はまた、ＭＡＰＫタンパク質の活性をＭＡＰＫの基礎水準（即ち、刺激されないで天然で見出される水準）以上に増加させることができる。例えば、本発明のＭＥＫＫタンパク質は好適には、実施例３に記載の条件下で測定した場合、基礎水準の活性の少なくとも約２倍、さらに好適には少なくとも約３倍、さらにもっと好適には少なくとも約４倍まで、ＭＡＰＫ活性を増加させることができる。さらに、本発明のＭＥＫＫタンパク質はＪＮＫタンパク質の活性を増加させることができる。ＪＮＫは、Ｔ細胞、ニュートラル細胞または繊維芽細胞のような種々の細胞の種類の増殖および分化を調節することに関与している、転写因子ＪＵＮの活性を調節する。ＪＮＫはＭＡＰＫと構造的および調節的相同性を示す。例えば、本発明のＭＥＫＫタンパク質は好適には、実施例１６に記載の条件下で測定した場合、Ｒａｆより少なくとも約３０倍、さらに好適にはＲａｆより少なくとも約４０倍、さらにもっと好適にはＲａｆより少なくとも約５０倍まで、ＪＮＫタンパク質のリン酸化を誘発することができる。本発明の好適なＭＥＫＫタンパク質は追加的に、ｃ−Ｍｙｃのリン酸化転写トランスアクチベーションドメインが遺伝子転写を調節することができるような方法で、ｃ−Ｍｙｃ転写トランスアクチベーションドメインタンパク質のリン酸化を誘発することができる。ＭＥＫタンパク質がｃ−Ｍｙｃ転写トランスアクチベーションドメインタンパク質のリン酸化を調節する能力は、Ｒａｆタンパク質または環状ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼがｃ−Ｍｙｃタンパク質を調節する能力を超える。例えば、本発明のＭＥＫＫタンパク質は好適には、実施例１７に記載の条件下で測定した場合、Ｒａｆより少なくとも約２５倍、さらに好適には少なくとも約３５倍、さらにもっと好適には少なくとも約４５倍まで、リン酸化ｃ−Ｍｙｃ転写トランスアクチベーションドメインタンパク質によるルシフェラーゼ遺伝子転写を誘発することができる。本発明の他の態様は、ＭＥＫＫ活性が、これらに限定されないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｃ５Ａ、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、単球走化性プロテイン１（ＭＩＰ１α）、単球化学誘引プロテイン１（ＭＣＰ−１）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ）、ロイコトリエンＢ₄（ＬＴＢ₄Ｒ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ＩｇＥ、主要組織適合性タンパク質（ＭＨＣ）、ペプチド、超抗原、抗原、バソプレシン、トロンビン、ブラジキニンおよびアセチルコリンを含む増殖因子によって刺激される能力に関する。さらに、本発明のＭＥＫＫタンパク質の活性は、ＴＰＡのようなホルボールエステルを含む化合物によって刺激されることができる。好適なＭＥＫＫタンパク質はまたＥＧＦ、ＮＧＦおよびＴＮＦ（特に、ＴＮＦα）によって刺激されることができる。好適には、本発明のＭＥＫＫタンパク質の活性は、ＭＥＫＫタンパク質を産生する細胞が実施例３に記載の条件下でＥＧＦと接触する場合、基礎水準（即ち、刺激されないで天然で見出される水準）の少なくとも２倍、さらに好適には基礎水準の少なくとも約４倍、さらにもっと好適には基礎水準の少なくとも約６倍まで、刺激されることができる。同様に、本発明のＭＥＫＫタンパク質の活性は、ＭＥＫＫタンパク質を産生する細胞が実施例９に記載の条件下でＮＧＦと接触する場合、基礎水準の少なくとも１倍、さらに好適には基礎水準の少なくとも約２倍、さらにもっと好適には基礎水準の少なくとも約３倍まで、ＮＧＦ刺激によって刺激されることができる。好適には、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫタンパク質を産生する細胞が実施例９に記載の条件下でＴＰＡと接触する場合、基礎水準の少なくとも０．５倍、さらに好適には基礎水準の少なくとも約１倍、さらにもっと好適には基礎水準の少なくとも約２倍まで、ＴＰＡ刺激によって刺激されることができる。ＴＰＦは、種々の細胞の種類において細胞死および他の機能を調節することができる。本発明は、ＴＮＦによるＭＥＫＫ刺激がＲａｆから独立してることを発見したものである。同様に、本発明は、ＭＥＫＫタンパク質が細胞の紫外線（ＵＶ）損傷によって直接に刺激されることができ、一方Ｒａｆ依存性経路は刺激されることができないことを認識した最初のものである。それ故、ＴＮＦとＵＶの両方は、Ｒａｆを実質的に活性化することなく、ＭＥＫＫ活性を刺激する。さらに、ＭＥＫＫのＵＶとＴＮＦ活性はＲａｓ依存性である。本発明の他の態様は、本発明のＭＥＫＫタンパク質が細胞のアポト−シスを調節することができ、この能力はＲａｆタンパク質によって共有されないという認識である。本明細書で使用されるように、アポト−シスとは、細胞質小器官の完全性を保存しながらの細胞容量の進行性退縮；光学または電子顕微鏡によって観察される染色質の凝縮；および遠心沈降分析法によって決定されるＤＮＡ切断を含んでなる細胞死の形態を言う。細胞の膜完全性が失われそして細胞溶解が起こる場合、細胞死が起こる。アポト−シスは、細胞が膨脹しついに破裂する点において、壊死と異なる。本発明の好適なＭＥＫＫタンパク質は、細胞が、図２４、２５、２６、２７および２８に示される細胞質退縮および／または核凝縮に実質的に類似する特徴を有するように、細胞のアポト−シスを誘発することができる。図２４〜図２８のアポト−シスは、ＭＥＫＫタンパク質をコードしている発現プラスミドを細胞に微量注入して得たものである。注入された細胞は、抗−β−Ｇａｌ抗体を使用して同定され、そして細胞のＤＮＡはヨウ化プロピジウムで染色された。細胞質組織は抗−チューブリン抗体を使用して監視した。次いで、示差蛍光画像顕微鏡検査法によって、当業界の技術標準を使用して、細胞を映像した。細胞は、細胞質退縮と核凝縮を有する形態を示すことによって、アポト−シスを示した。ＭＥＫＫ依存性である細胞増殖調節シグナル伝達経路の略図を図２に示す。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＪＥＫタンパク質、ＪＮＫタンパク質、Ｊｕｎタンパク質および／またはＡＴＦ−２タンパク質およびＭｙｃタンパク質の活性を調節することができ、かかる調節はＲａｆタンパク質から実質的に（完全でなくとも）独立している。かかるＲａｆ独立性調節は、細胞のアポト−シスを含む、細胞の増殖特性を調節することができる。さらに、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫタンパク質の活性を調節することができ、それはまたＲａｆタンパク質によって調節されることができる。このように、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＡＰＫタンパク質、およびＴＣＦタンパク質（Ｅｌｋ−１タンパク質とも呼称される）のような転写因子のＥｔｓファミリーの構成員の活性を調節することができる。図２を参照すると、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、Ｒａｓタンパク質を活性化することができる多種類の増殖因子によって活性化されることができる。さらに、ＭＥＫＫタンパク質は、ＪＮＫタンパク質を活性化することができ、それはまたＲａｓタンパク質によって活性化されるが、Ｒａｆタンパク質によっては活性化されない。このように、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、種々の細胞表面受容体によって始られるシグナル伝達経路中の分岐点のプロテインキナーゼを含んでなる。ＭＥＫＫタンパク質はまた、Ｒａｆから独立性のＴＮＦタンパク質によって調節されることができ、このことは、ＭＥＫＫタンパク質がＲａｓタンパク質とＲａｆタンパク質から独立している新規なシグナル伝達経路に連合していることを示している。このようにして、ＭＥＫＫタンパク質は、一つまたはそれ以上のシグナル伝達経路中で、Ｒａｆタンパク質から独立性かまたはバイパス性の多数の独特の機能を実行することができる。ＭＥＫＫタンパク質はＭＥＫ活性および／またはＪＥＫ活性を調節することができる。このように、ＭＥＫＫタンパク質は、Ｒａｆ活性を実質的に含まないシグナル伝達経路の構成員の活性を調節することができる。かかる構成員として、これらに限定されないが、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＡＴＦおよびＭｙｃタンパク質を挙げられる。さらに、ＭＥＫＫタンパク質は、Ｒａｆを含むシグナル伝達経路の構成員を調節することができ、かかる構成員として、これらに限定されないが、ＭＥＫ、ＭＡＰＫおよびＴＣＦが挙げられる。従って、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、Ｒａｆタンパク質による顕著な関与から独立している細胞のアポト−シスを調節することができる。ＭＥＫＫタンパク質の多数の機能的特徴の外に、本発明のＭＥＫＫタンパク質は多数の独特な構造的特徴を含んでなる。例えば、一つの態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、特定の機能的特徴を有する２つの異なった構造ドメインの少なくとも１つを含む。かかる構造ドメインには、ＭＥＫタンパク質および／またはＪＥＫをリン酸化することができるＣＯＯＨ−末端プロテインキナーゼ触媒ドメインを含む第二構造ドメインを調節するように働く、ＮＨ₂末端調節ドメインが含まれる。本発明によれば、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、全長のＭＥＫＫタンパク質、並びに上記の機能の少なくとも１つを実行することができるＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部が含む。句「ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部」とは、本発明の全長のＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる核酸分子によってコードされたＭＥＫＫタンパク質の一部を言う。ＭＥＫＫタンパク質の好適な部分は細胞中のアポト−シスを調節するのに有用である。追加の好適な部分は、ＭＥＫＫキナーゼ活性を調節するのに有用な活性を有する。本発明のＭＥＫＫタンパク質の一部に適した大きさは、本発明のＭＥＫＫタンパク質相同体について記載した通りである。他の態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、好適には８％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して決定しそして当業界の標準技術を使用して分解して、約７０ｋＤ〜約２５０ｋＤの範囲内の分子量を有するＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部を含む。好適なＭＥＫＫタンパク質は、約７５ｋＤ〜約２２５ｋＤ、さらに好適には約８０ｋＤ〜約２００ｋＤの範囲内の分子量を有する。さらに他の態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、約３．５ｋＤ〜約１２．０ｋＤの範囲内、さらに好適には約４．０ｋＤ〜約１１．０ｋＤの範囲内、もっとさらに好適には約４．５ｋＤ〜約１０．０ｋＤの範囲内のｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）によってコードされたＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部を含んでなる。特に好適なＭＥＫＫタンパク質は、約４．５ｋＤ〜約５．０ｋＤの範囲内の大きさ、約６．０ｋＤ〜約６．５ｋＤの範囲内の大きさ、約７．０ｋの大きさ、または約８．０ｋＤ〜約１０．０ｋＤの範囲内の大きさを有するｍＲＮＡによってコードされたＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部を含んでなる。他の態様では、本発明のＮＨ₂末端調節ドメインは、少なくとも約１０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約４００個のアミノ酸、さらに好適には少なくとも約１５％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約４００個のアミノ酸、もっとさらに好適には少なくとも約２０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約４００個のアミノ酸を含んでなるＮＨ₂末端を含む。本発明の好適なＮＨ₂末端調節ドメインは、少なくとも約１０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３６０個のアミノ酸、さらに好適には少なくとも約１５％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３６０個のアミノ酸、もっとさらに好適には少なくとも約２０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３６０個のアミノ酸を含んでなるＮＨ₂末端を含む。本発明の他の好適なＮＨ₂末端調節ドメインは、少なくとも約１０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３７０個のアミノ酸、さらに好適には少なくとも約１５％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３７０個のアミノ酸、もっとさらに好適には少なくとも約２０％セリンおよび／またはスレオニン残基を有する約３７０個のアミノ酸を含んでなるＮＨ₂末端を含む。一つの態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質はＳＨ２とＳＨ３ドメインが欠けている。他の態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、天然に存在するＭＥＫＫタンパク質のキナーゼ触媒ドメインと、好適には少なくとも約５０％、さらに好適には少なくとも約７５％、さらにもっと好適には少なくとも約８５％のアミノ酸相同性（比較できる領域内での同一性）を有するＭＥＫＫタンパク質相同体の少なくとも一部を含む。本発明の他のＭＥＫＫタンパク質はまた、天然に存在するＭＥＫＫタンパク質のＮＨ₂末端調節ドメインと、少なくとも約１０％、さらに好適には少なくとも約２０％、さらにもっと好適には少なくとも約３０％のアミノ酸相同性を有する本発明のＭＥＫＫ相同体の少なくとも一部を含む。ＭＥＫＫタンパク質の触媒ドメインを含む配列はホスホトランスフェラーゼ活性に関与し、それ故、比較的に保存されたアミノ酸配列を示す。しかし、ＭＥＫＫタンパク質のＮＨ₂末端調節ドメインは実質的に拡散的であることができる。ＭＥＫＫタンパク質のＮＨ₂末端調節ドメイン間に顕著な相同性が欠けることは、かかるドメインの各々が種々の上流の調節タンパク質によって調節されることと関連している。例えば、ＭＥＫＫタンパク質はタンパク質Ｒａｓによって調節されることができ、一方他のものはＲａｓから独立して調節されることができる。さらに、幾つかのＭＥＫＫタンパク質は増殖因子ＴＮＦαによって調節されることができ、一方他のものはできない。このように、ＭＥＫＫタンパク質のＮＨ₂末端調節ドメインは上流のシグナル伝達調節に選択性を与え、一方触媒ドメインはＭＥＫＫ基質選択性機能を与える。好適なＭＥＫＫ相同体は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列を有するＭＥＫＫタンパク質のキナーゼ触媒ドメインと、少なくとも約５０％、さらに好適には少なくとも約７５％、さらにもっと好適には少なくとも約８５％のアミノ酸相同性を有する。他の好適なＭＥＫＫ相同体は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列を有するＭＥＫＫタンパク質のＮＨ₂末端調節ドメインと、少なくとも約１０％、さらに好適には少なくとも約２０％、さらにもっと好適には少なくとも約３０％のアミノ酸相同性を有する。好適な態様では、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫタンパク質のキナーゼ触媒ドメインをコードしている核酸分子と、少なくとも約５０％、さらに好適には少なくとも約７５％、さらにもっと好適には少なくとも約８５％の相同性を有する核酸分子によってコードされる、本発明のＭＥＫＫタンパク質相同体の少なくとも一部を含む。他の好適なＭＥＫＫタンパク質相同体は、ＭＥＫＫタンパク質のＮＨ₂末端調節ドメインをコードしている核酸分子と、少なくとも約１０％、さらに好適には少なくとも約２０％、さらにもっと好適には少なくとも約３０％の相同性有する核酸分子によってコードされる。さらに他の好適なＭＥＫＫ相同体は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９によって表される核酸配列によってコードされたＭＥＫＫタンパク質のキナーゼ触媒ドメインと、少なくとも約５０％、さらに好適には少なくとも約７５％、さらにもっと好適には少なくとも約８５％の相同性有する核酸分子によってコードされる。ＭＥＫＫ相同体はまた、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：９によって表される核酸配列によってコードされたＭＥＫＫタンパク質のＮＨ₂ 末端調節ドメインと、少なくとも約１０％、さらに好適には少なくとも約２０％、さらにもっと好適には少なくとも約３０％の相同性有する核酸分子によってコードされたものを含む。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ１と呼称し、表１に示されそして配列番号：１と配列番号：２で夫々表された核酸および／またはアミノ酸配列の少なくとも一部を有する（即ち、含む）ＭＥＫＫタンパク質を包含する。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ２と呼称し、表２に示されそして配列番号：３と配列番号：４で夫々表された核酸および／またはアミノ酸配列の少なくとも一部を有するＭＥＫＫタンパク質を包含する。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ３と呼称し、表３に示されそして配列番号：５と配列番号：６で夫々表された核酸および／またはアミノ酸配列の少なくとも一部を有するＭＥＫＫタンパク質を包含する。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、表４に示されそして配列番号：７と配列番号：８で夫々表された核酸および／またはアミノ酸配列の少なくとも一部を有するＭＥＫＫタンパク質を包含することができ、ＭＥＫＫ４と呼称される。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ５と呼称し、表５に示されそして配列番号：９と配列番号：１０で夫々表された核酸および／またはアミノ酸配列の少なくとも一部を有するＭＥＫＫタンパク質を包含する。ＭＥＫＫ５はＭＥＫＫ４のスプライス変異体を表す。表５に示された配列の下線の部分はスプライス挿入を示す。ＭＥＫＫ１のアミノ酸配列と比較して、ＭＥＫＫ２とＭＥＫＫ３のアミノ酸配列が表６に示される。ボールドのアミノ末端−調節ドメイン下線の配列−調節ヒンジ配列ボールドのイタリック体−触媒ドメイン表７は、ＭＥＫＫ１、ＭＥＫＫ２およびＭＥＫＫ３のキナーゼドメインと比較して、ＭＥＫＫ４のキナーゼドメインのアミノ酸配列を示す。上記の配列番号は、実施例に記載の方法に従って推論された配列を表す。核酸およびアミノ酸の配列決定技術は完全には誤り発生なしではないから、上記の配列番号はせいぜい本発明のＭＥＫＫタンパク質の見掛けの核酸配列およびのアミノ酸配列を表すことを注目すべきである。本発明によれば、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、転写後修飾を受けたＭＥＫＫタンパク質を含むことができる。かかる修飾として、例えば、グリコシル化（例えば、Ｎ−結合および／またはＯ−結合オリゴ糖の付加）または転写後立体配座変化もしくは転写後欠失を挙げることができる。本発明の他の態様は、本発明のＭＥＫＫタンパク質をコードしているＭＥＫＫタンパク質遺伝子と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる単離された核酸分子である。本発明によれば、単離された核酸分子は、天然環境から取出された（即ち、人間の操作を受けた）核酸分子である。このように、「単離された」は、核酸分子が精製された程度を反映しない。単離たれた核酸分子として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの誘導体を挙げることができる。本発明の単離された核酸分子は、その天然源から、全（即ち、完全）遺伝子またはその遺伝子と安定なハイブリッドを形成することができるそれらの一部として得ることができる。本明細書で使用されるように、句、実体「の少なくとも一部」とは、実体の機能側面を有するのに少なくとも十分である実体の量を言う。例えば、核酸配列の少なくとも一部は、本明細書で使用されるように、特定の所望遺伝子（例えば、ＭＥＫＫ遺伝子）と、緊縮ハイブリッド形成条件下で安定なハイブリッドを形成することができる核酸配列の量である。本発明の単離された核酸分子はまた、組換えＤＮＡ技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成法を使用して製造することができる。単離されたＭＥＫＫタンパク質核酸分子は、これらに限定されないが、天然の対立遺伝子変異体、およびかかる修飾が本発明のＭＥＫＫタンパク質をコードするかまたはＭＥＫＫの天然核酸分子単離体と緊縮条件下で安定なハイブリッドを形成する核酸の能力を妨害しないような方式で、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、および／または転位された修飾核酸分子を含む、天然の核酸分子とそれらの相同体を含む。本発明のＭＥＫＫタンパク質核酸分子に対する好適な改変として、例えば、調節ドメインをコードしているＭＥＫＫタンパク質核酸分子の少なくとも一部を削除して（表６に示された例）構成的に活性なＭＥＫＫタンパク質を作成すること；触媒ドメインをコードしているＭＥＫＫタンパク質核酸分子の少なくとも一部を削除して（表６に示された例）不活性なＭＥＫＫタンパク質を作成すること；によって、全長のＭＥＫＫタンパク質核酸分子を切断すること、およびＭＥＫＫタンパク質を修飾してタンパク質の所望の不活性化および／または刺激を達成すること、例えば、触媒ドメイン（即ち、ホスホトランスフェラーゼドメイン）中のリジン残基をコードしているコドンをメチオニン残基で置換して触媒ドメインを不活性化することが挙げられる。切断された好適なＭＥＫＫ核酸分子は、触媒ドメインを含有するが、調節ドメインを欠ている、ＭＥＫＫタンパク質の形態をコードする。好適な触媒ドメイン切断ＭＥＫＫ核酸分子は、ＭＥＫＫ１の約３５２〜約６７２、ＭＥＫＫ２の約３５２〜約６１９、ＭＥＫＫ３の約３５８〜約６２６、ＭＥＫＫ４の約８１１〜約１１９５、またはＭＥＫＫ５の約８６３〜約１２４７の残基をコードする。他の切断された好適なＭＥＫＫ核酸分子は、ＮＨ₂末端調節ドメインを含むが、触媒ドメインを欠ているＭＥＫＫタンパク質の形態をコードする。好適な調節ドメイン切断ＭＥＫＫ核酸分子は、ＭＥＫＫ１の約１〜約３６９、ＭＥＫＫ２の約１〜約３３５、ＭＥＫＫ３の約１〜約３６０、ＭＥＫＫ４の約１〜約８２５、またはＭＥＫＫ５の約１〜約８７５の残基をコードして、調節ドメインを除去して、切断されたＭＥＫＫ分子を形成する。本発明の単離された核酸分子は、本発明の少なくとも１種のＭＥＫＫタンパク質をコードする核酸配列を含み、かかるタンパク質の例は本明細書で開示されている。句「核酸分子」とは主として、物理的な核酸分子を表し、そして句「核酸配列」とは主として、核酸分子を含んでなるヌクレオチドの配列を表し、２つの句は互換可能に使用することができる。上記に開示されたように、本発明のＭＥＫＫタンパク質として、これらに限定されないが、全長のＭＥＫＫタンパク質コード領域を有するタンパク質、それらの一部、および他のＭＥＫＫタンパク質相同体が挙げられる。本明細書に使用されるように、ＭＥＫＫタンパク質遺伝子は、その遺伝子（これらに限定されないが、転写、翻訳または転写後制御領域を含む）並びにコード領域それ自体によってコードされたＭＥＫＫタンパク質の産生を制御する調節領域のような天然ＭＥＫＫタンパク質遺伝子に関連するすべての核酸配列を含む。本発明の核酸分子は、単離された天然ＭＥＫＫタンパク質核酸分子またはそれらの相同体であることができる。本発明の核酸分子は、一つまたはそれ以上の調節領域、全長もしくは部分コード領域、またはそれらの組合せを含むことができる。本発明のＭＥＫＫタンパク質核酸分子の最小の大きさは、対応する天然の遺伝子と緊縮ハイブリッド形成条件下で安定なハイブリッドを形成することができる最小の大きさである。ＭＥＫＫタンパク質核酸分子相同体は、当業者に既知の多数の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上掲）を使用して製造することができる。例えば、核酸分子は、これらに限定されないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸配列の選択された領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および／または突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成と核酸分子の混合物を「構築」するための混合物群の連結、およびそれらの組合せのような、古典的な突然変異誘発技術と組換えＤＮＡ技術を含む多種類の技術を使用して改変することができる。核酸分子相同体は、改変核酸の混合物から、核酸によってコードされたタンパク質の機能（相同体がＭＥＫタンパク質またはＪＥＫタンパク質をリン酸化する能力）についてスクリーニングすることによって、および／または単離されたＭＥＫＫタンパク質核酸と緊縮条件下でハイブリッド形成させることによって、選択することができる。本発明の一つの態様は、本明細書に記載のように、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードすることができるＭＥＫＫタンパク質核酸分子、またはその相同体である。本発明の好適な核酸分子は、これらに限定されないが、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の少なくとも一部を有するタンパク質をコードする核酸分子、またはその相同体を含む。本発明の好適な核酸分子は、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸、またはその相同体と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる。ＭＥＫＫタンパク質の触媒ドメインをコードしている核酸配列の対応領域と、少なくとも約５０％、好適には少なくとも約７５％、さらに好適には少なくとも約８５％の相同性を有する核酸配列含むＭＥＫＫタンパク質核酸分子、またはその相同体も好適である。ＭＥＫＫタンパク質のＮＨ₂末端調節ドメインをコードしている核酸配列の対応領域と、少なくとも約２０％、好適には少なくとも約３０％、さらに好適には少なくとも約４０％の相同性を有する核酸配列含むＭＥＫＫタンパク質核酸分子、またはそれらの相同体をも好適である。特に好適な核酸配列は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の触媒ドメインをコードしている核酸配列と、少なくとも約５０％、好適には少なくとも約７５％、さらに好適には少なくとも約８５％の相同性を有する核酸配列である。他の特に好適な核酸配列は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列のＮＨ₂末端調節ドメインをコードしている核酸配列と、少なくとも約２０％、好適には少なくとも約３０％、さらに好適には少なくとも約４０％の相同性を有する核酸配列である。かかる核酸分子は、全長のタンパク質、ハイブリッドタンパク質、融合タンパク質、多価性タンパク質または切断フラグメントをコードしている全長の遺伝子および／または核酸分子であることができる。本発明のさらに好適な核酸分子は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９によって表される核酸配列を有する単離された核酸分子を含んでなる。本発明のＭＥＫＫタンパク質の核酸分子を知ることによって、当業者は、その核酸分子のコピーを作成すること、並びにＭＥＫＫタンパク質コード遺伝子（例えば、翻訳出発部位および／または転写および／もしくは翻訳制御領域を含む核酸分子）および／またはＭＥＫＫタンパク質核酸分子相同体を得ることが可能になる。本発明のＭＥＫＫタンパク質のアミノ酸配列の一部を知ることによって、当業者は、かかるＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸配列をクローニングすることが可能になる。本発明はまた、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードする、本発明の他の（好適には長い）核酸分子の相捕的領域と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチドである核酸分子、またはそれらの相同体を包含する。好適なオリゴヌクレオチドは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の少なくとも一部をコードすることができる核酸分子、またはそれらの相同体と、緊縮条件下でハイブリッド形成することができる。さらに好適なオリゴヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９によって表される核酸配列を有する核酸分子、またはそれらの相補体とハイブリッド形成することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそのいずれかの誘導体であることができる。かかるオリゴヌクレオチドの最小の大きさは、ある種のオリゴヌクレオチドと、本発明の他の核酸分子上の相補的配列との間に安定なハイブリッドを形成するのに必要な大きさである。最小の大きさの特性は、本明細書に開示されている。オリゴヌクレオチドの大きさはまた、本発明に従ってオリゴヌクレオチドを使用するのに十分なものでなければならない。本発明のオリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、追加の核酸分子を同定するプローブとして、核酸分子を増幅または伸張させるプライマーとして、または例えば、細胞によるＭＥＫＫタンパク質の発現を阻害する治療的応用において、を含む多種類の応用で使用することができる。かかる治療的応用として、例えば、アンチセンス−、トリプレックス形成−、リボザイム−および／またはＲＮＡ薬物−に基づく技術で、かかるオリゴヌクレオチドを使用することを含む。それ故、本発明は、かかるオリゴヌクレオチドの使用およびＭＥＫＫタンパク質の産生を妨害する方法を含む。一つの態様では、本発明の単離されたＭＥＫＫタンパク質は、このタンパク質を製造するのに有効な条件下でこのタンパク質を培養し、そのタンパク質を回収することによって、製造することができる。培養するのに好適な細胞は、ＭＥＫＫタンパク質を発現することができる組換え細胞であり、その組換え細胞は、本発明の一つまたはそれ以上の核酸分子で宿主細胞を形質転換することによって製造することができる。核酸分子の細胞中への形質転換は核酸分子を細胞中に挿入することができる方法によって行うことができる。形質転換技術として、これらに限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入法、リポフェクション、吸着法、およびプロトプラスト融合法が挙げられる。組換え細胞は、単細胞にとどまるかまたは組織、器官もしくは多細胞生物に増殖することができる。本発明の形質転換された核酸分子は染色体外にとどまるか、または形質転換された（即ち、組換え）細胞の染色体内の一つまたはそれ以上の部位中に、発現する能力が保持される方法で、統合することができる。本発明は、宿主細胞中に核酸分子を送達することができるベクター中に挿入された、本発明の少なくとも１種のＭＥＫＫタンパク質核酸分子を含む組換えベクターを包含する。かかるベクターは、異種核酸配列、例えば、天然では本発明のＭＥＫＫタンパク質核酸分子に隣接して見出されない核酸配列を含有する。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、および原核または真核のいずれかであり、そして通常はウイルスまたはプラスミドである。組換えベクターは、クローニング、配列決定、および／またはその他本発明のＭＥＫＫタンパク質核酸分子の操作に使用することができる。組換えベクターの１つの型（本明細書では組換え分子と呼称し、そして以下に詳細に説明する）は本発明の核酸分子の発現に使用される。好適な組換えベクターは形質転換細胞中で複製することができる。組換えベクター中に挿入される好適な核酸分子には、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸分子、またはそれらの相同体が含まれる。組換えベクター中に挿入されるさらに好適な核酸分子には、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および／または配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の少なくとも一部をコードしている核酸分子、またはそれらの相同体が含まれる。組換えベクター中に挿入されるさらにもっと好適な核酸分子には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および／または配列番号：９によって表される核酸分子、またはそれらの相補体が含まれる。細胞を形質転換するのに適した宿主細胞は、本発明の少なくとも１種の核酸分子で形質転換された後、本発明のＭＥＫＫ分子を産生することができるものであればいずれの細胞も含むことができる。宿主細胞は、未形質転換細胞、またはすでに少なくとも１種の核酸分子で形質転換されている細胞であることができる。本発明の適切な宿主細胞として、細菌、真菌（酵母を含む）、昆虫、動物および植物細胞を挙げることができる。好適な宿主細胞として、細菌、酵母、昆虫および哺乳類細胞が挙げられ、哺乳類細胞が特に好適である。組換え細胞は好適には、宿主細胞を、その各々が一つまたはそれ以上の転写制御配列を含有する発現ベクターに作用結合している本発明の一つまたはそれ以上の核酸分子を含んでなる、一つまたはそれ以上の組換え分子で形質転換することによって製造される。句、作用結合したとは、ベクターが宿主細胞中に形質転換された場合に核酸分子が発現することができるような方式で、核酸分子を発現ベクター中に挿入することを言う。本明細書で使用されているように、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、そして特定の核酸分子の発現を行うことができるＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。好適には、発現ベクターはまた、宿主細胞中で複製することができる。発現ベクターは、原核または真核のいずれかであり、そして通常はウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターには、細菌、真菌、昆虫、動物および／または植物細胞中を含む、本発明の組換え細胞中で作用する（即ち、直接遺伝子発現）ものであればいずれのベクターも含まれる。このように、本発明の核酸分子は、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、停止配列、複製の起点、および組換え細胞と適合性でありそして本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列ような調節配列を含有する発現ベクターに作用結合することができる。本明細書で使用されるように、転写制御配列には、転写の開始、伸張および停止を制御することができる配列が含まれる。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列のような転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列には、本発明の少なくとも一つの組換え細胞中で作用することができるものであればいずれの転写制御配列も含まれる。多種類のかかる転写制御配列は当業者に知られている。好適な転写制御配列として、これらに限定されないが、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージランダ（λ）（λ_PLとλ_PRかおよびかるプロモーターを含む融合物）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、アルファ交配因子、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０、レトロウイルスアクチン、レトロウイルス長末端反復、ラウスウイルス、熱ショック、ホスフェートおよびニトレート転写制御配列、並びに原核または真核細胞中の遺伝子発現を制御することができる他の配列のような、細菌、酵母、および哺乳類細胞中で作用するものが挙げられる。追加の適切な転写制御配列として、組織特異性プロモーターとエンハンサー並びにリンホカイン誘発プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘発されるプロモーター）が挙げられる。本発明の転写制御配列はまた、ＭＥＫＫタンパク質をコードしているＤＮＡ配列と天然で会合している天然に存在する転写制御配列を包含することができる。発現ベクター中への挿入のために好適な核酸分子には、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸分子、またはそれらの相同体が含まれる。発現ベクター中への挿入のためにさらに好適な核酸分子には、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および／または配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の少なくとも一部をコードしている核酸分子、またはそれらの相同体が含まれる。発現ベクター中への挿入のためにさらにもっと好適な核酸分子には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および／または配列番号：９によって表される核酸分子、またはそれらの相捕体が含まれる。本発明の発現ベクターはまた、本発明の挿入された核酸分子が融合タンパク質として発現する融合配列を含有する。本発明のＭＥＫＫ核酸分子の一部として融合配列が含まれると、核酸分子によってコードされたタンパク質の産生、貯蔵および／または使用の間の安定性が向上する。さらに、融合セグメントは、得られた融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができるように、ＭＥＫＫタンパク質の精製を単純化する道具として作用することができる。適切な融合セグメントは、所望の機能（例えば、向上した安定性および／または精製道具）を有するいずれの大きさのドメインであることができる。一つまたはそれ以上の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内である。融合セグメントは、ＭＥＫＫタンパク質のアミノおよび／またはカルボキシル末端に結合することができる。融合セグメントとＭＥＫＫタンパク質との間の結合は、ＭＥＫＫタンパク質の直送的（ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ）回収を可能にする切断に感受性をもつように、構築することができる。融合タンパク質は好適には、ＭＥＫＫタンパク質のカルボキシルおよび／またはアミノ末端に結合した融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換された組換え細胞を培養することによって製造することができる。本発明の組換え細胞には、本発明のいずれか少なくとも一種の核酸分子で形質転換されたいずれの細胞も含まれる。好適な組換え細胞は、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部をコードする少なくとも一種の核酸分子、またはそれらの相同体で形質転換された細胞である。さらに好適な組換え細胞は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および／または配列番号：１０によって表されるアミノ酸配列の少なくとも一部をコードすることができる核酸分子、またはそれらの相同体で形質転換される。さらにもっと好適な組換え細胞は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および／または配列番号：９によって表される少なくとも一種の核酸分子、またはその相補体で形質転換される。特に好適な組換え細胞には、下記の核酸分子の少なくとも一種で形質転換された、疾病に関与する哺乳類細胞が含まれる。組換えＤＮＡ技術を使用すると、形質転換された核酸分子の発現を、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、これらの核酸分子が転写される効率、得られた転写物を翻訳される効率、および転写後修飾の効率を操作することによって、改善することがきることは、当業者によって認識されることができる。本発明の核酸分子の発現を増加させるのに有用な組換え技術として、これらに限定されないが、高コピー数プラスミドに作用結合した核酸分子、一つまたはそれ以上の宿主細胞染色体中への核酸分子の統合、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナルの置換または修飾（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）、転写制御シグナルの置換または修飾（例えば、リボソーム結合部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）、宿主細胞のコドン使用法に対応する本発明の核酸分子の修飾、転写を不安定にする配列の削除、および発酵の間に組換えタンパク質産生から組換え細胞増殖を一時的に分離する制御シグナルの使用が挙げられる。本発明の発現した組換えタンパク質の活性は、得られたタンパク質を断片化すること、修飾すること、または誘導体化することによって改善することができる。本明細書で使用されるように、細胞中の核酸配列のコピー数を増幅することは、細胞のゲノム中の核酸配列のコピー数を増加させることによってか、または形質転換によって核酸配列の追加のコピーを細胞中に導入することによって、達成することができる。コピー数の増幅は、さらに多量の酵素を産生させて、基質の生成物への変換を向上させるような方法で行われる。例えば、本発明の核酸を含有する組換え分子は、細胞中に形質転換されて、酵素合成を向上させることができる。形質転換は、核酸配列が細胞中に挿入されるいずれの方法を使用しても、達成することができる。形質転換前に、組換え分子上の核酸配列は、より高い特異的活性を有する酵素をコードするように操作することができる。本発明によれば、組換え細胞は、かかるタンパク質を製造するのに有効な条件下でかかる細胞を培養し、そしてタンパク質を回収することによって、本発明のＭＥＫＫタンパク質を製造するのに使用することができる。タンパク質を製造するのに有効な条件として、これらに限定されないが、タンパク質製造を可能にする適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられる。適切または有効な培地とは、本発明の細胞を培養した場合、ＭＥＫＫタンパク質を産生することができるいずれの培地をも言う。かかる培地は通常、同化性の炭水化物、窒素とリン源、並びに適切な塩、ミネラル、金属およびビタミンのような他の栄養素を含んでなる水性培地である。培地は、複合栄養素を含んでなることができるか、または規定の最小培地であることができる。本発明の細胞は、これらに限定されないが、バッチ、フィード・バッチ、細胞リサイクル、および連続発酵槽を含む慣用の発酵バイオリアクター中で培養することができる。培養はまた、振盪フラスコ、試験管、ミクロタイター皿、およびペトリ皿中で行うことができる。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含量で行われる。かかる培養条件は当業者の専門的技術の範囲内にある。製造に使用されたベクターおよび宿主系に依存して、得られたＭＥＫＫタンパク質は、組換え細胞内に残存するか、または発酵培地中に分泌される。句「タンパク質を回収すること」とは、単にタンパク質を含有する全発酵培地を収集することを指し、そして分離または精製の追加の工程を含める必要はない。本発明のＭＥＫＫタンパク質は、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、濾過法、電気泳動法、疎水性相互反応クロマトグラフィー法、ゲルクロマトグラフィー法、逆相クロマトグラフィー法、等電点クロマトグラフィー法および示差可溶化法のような多種類の標準タンパク質精製技術を使用して精製することができる。さらに、本発明のＭＥＫＫタンパク質は、動物から回収されたＭＥＫＫタンパク質を発現する細胞からＭＥＫＫタンパク質を単離することによって製造することができる。例えば、Ｔ細胞のような細胞型は、動物の胸腺から単離することができる。次いで、ＭＥＫＫタンパク質が、単離されたＴ細胞から本明細書に記載の標準技術を使用して単離することができる。本発明はまた、細胞の表面上の受容体から始まるシグナルを調節することができる化合物を同定する方法を包含し、かかるシグナル調節はいくつかの点でＭＥＫＫタンパク質に関係する。かかる方法は、（ａ）ＭＥＫＫタンパク質を含有する細胞を推定される調節化合物と接触させること；（ｂ）細胞を細胞の表面上の受容体に結合することができるリガンドと接触させること；（ｃ）推定される調節化合物が細胞シグナルを調節することができる能力を、本発明のＭＥＫＫ依存性経路の構成員の活性化を決定することによって評価すること；の諸工程を含んでなる。工程（ｃ）を行う好適な方法は、ＭＥＫＫ依存性経路の構成員のリン酸化を測定することを含んでなる。かかる測定は、ホスホチロシン、ホスホセリンおよび／またはホスホスレオニンに特異的な抗体を有する免疫測定法を使用して行うことができる。工程（ｃ）を行う他の好適な方法は、ＭＥＫＫタンパク質がＭＥＫタンパク質および／またはＪＥＫタンパク質をリン酸化する能力を本明細書で記載の方法を使用して測定することを含んでなる。他の態様では、細胞中のシグナル伝達を調節することができる化合物を同定する方法は、（ａ）推定される阻害化合物を、ＭＥＫＫタンパク質と接触させて反応混合物を生成すること；（ｂ）反応混合物をＭＥＫタンパク質と接触させること；（ｃ）推定される阻害化合物がＭＥＫタンパク質のリン酸化を阻害する能力を、ＭＥＫＫタンパク質によって評価すること；の諸工程を含んでなる。工程（ｃ）から得られる結果を、推定される阻害化合物が、ＭＥＫタンパク質をリン酸化するＲａｆタンパク質の能力を、阻害する能力と比較して、その化合物が、Ｒａｆタンパク質から独立性のＭＥＫＫタンパク質を含むシグナル伝達を選択的に調節することができるかどうかを決定することができる。上記の方法で使用されるＭＥＫＫ、ＭＥＫおよびＲａｆタンパク質は組換えタンパク質または天然で誘導されたタンパク質であることができる。さらに、特定のシグナル伝達経路中の阻害作用の部位がＲａｆとＭＥＫＫタンパク質の両方を含むかどうかを、上記の実験（即ち、ＭＥＫＫ依存性経路についての記載を参照）を行うことによって決定することができる。本発明の他の態様は、細胞の表面上の受容体から始まるシグナルを調節することができる化合物を同定するキットを包含し、シグナルはいくつかの点でＭＥＫＫタンパク質と関係する。かかるキットは、（ａ）ＭＥＫＫタンパク質を含有する少なくとも１種の細胞；（ｂ）その細胞の表面上の受容体に結合することができるリガンド；および（ｃ）推定される調節化合物がＭＥＫＫタンパク質のリン酸化を変える能力を評価する手段；を含んでなる。リン酸化を検出するかかる手段は、当業者に知られている方法および試薬を包含し、例えば、リン酸化は、チロシン、セリンおよびスレオニンのようなリン酸化アミノ酸残基に特異的な抗体を使用して検出することができる。かかるキットを使用して、特定の経路構成体のシグナル伝達経路中の位置、並びに調節部位またはその近辺の、かかる経路中に含まれる構成体の同一性を、かなり良好な特異性をもって決定することができる。他の態様では、本発明のキットは、（ａ）ＭＥＫＫタンパク質；（ｂ）ＭＥＫタンパク質；および（ｃ）推定される阻害化合物がＭＥＫタンパク質のリン酸化を阻害する能力をＭＥＫＫタンパク質によって評価する手段；を包含する。本発明のキットはさらに、Ｒａｆタンパク質および推定される阻害化合物が、ＭＥＫタンパク質をリン酸化するＲａｆタンパク質の能力を阻害する能力を検出する手段を含んでなることができる。本発明の他の態様は、疾患に関与する細胞中のシグナル伝達経路を操作することによって、調節または治療をうける内科的疾病を有する動物の治療に関する。かかる内科的疾病には、異常な細胞増殖および分泌される細胞生成物の異常な産生に由来する疾患が含まれる。特に、かかる内科的疾病として、これらに限定されないが、自己免疫疾患、炎症反応、アレルギー反応およびパーキンソン病とアルツハイマー病のような神経疾患が挙げられる。本発明の方法を使用する治療を受ける好適な癌として、これらに限定されないが、小細胞癌、過発現ＥＧＦ受容体をもつ非小細胞肺癌、過発現ＥＧＦまたはＮｅｕ受容体をもつ乳癌、樹立オートクリンループの過発現増殖因子受容体を有する腫瘍、および樹立パラクリンループの過発現増殖因子受容体を有する腫瘍が挙げられる。本発明によれば、用語、治療とは、内科的疾患の進行の調節または内科的疾患の完全な除去（例えば、治療）を言うことができる。内科的疾患の治療は、内科的疾患に関与する細胞が細胞外刺激（例えば、サイトカイニンの増殖因子）にもはや反応しないような方式で、細胞のシグナル伝達活性を調節すること、または内科的疾患に関与する細胞のアポト−シスによる死滅を含んでなることができる。本発明の１つの態様は、本発明のＭＥＫＫタンパク質が、細胞増殖、細胞死および細胞機能（細胞生成物の分泌）のような細胞活性を調節することによって、細胞の恒常性を調節することができるという認識を含む。かかる調節は、多くの場合、Ｒａｆから独立しているが、しかし、上記のように（図２に示されるように）ＭＥＫＫタンパク質によって調節することができる幾つかの経路は、Ｒａｆタンパク質による上流の調節を受けることができる。それ故、Ｒａｆタンパク質および／またはＭＥＫＫタンパク質の活性を刺激または阻害して、所望の結果を得ることは、本発明の範囲内にある。理論にとらわれないならば、Ｒａｓタンパク質（図２を参照）からの分岐点でのＲａｆタンパク質およびＭＥＫＫタンパク質活性の調節は、「２−ヒット」機構によって制御することができと考えられる。例えば、第一「ヒット」は、例えば、細胞を、Ｒａｓタンパク質が活性化されるような方式で、細胞表面受容体に結合することができる増殖因子と接触させることを含む、Ｒａｓタンパク質を刺激してＲａｓ依存性経路を刺激するいずれの手段をも含んでなることができる。Ｒａｓタンパク質の活性化に続いて、ＭＡＰＫ活性と比較して、ＪＮＫの活性を増加させ、またはその逆でもある、第二「ヒット」を導出することができる。第二「ヒット」として、これらに限定されないが、ＪＮＫまたはＭＡＰＫを、ＭＥＫＫ、ＪＥＫ、Ｒａｆおよび／またはＭＥＫの活性を刺激または阻害することができる化合物によって、調節することが挙げられる。例えば、プロテインキナーゼＣまたはホスホリパーゼＣキナーゼのような化合物は、ＪＮＫが優先的にＭＡＰＫ以上に活性化されるような方式で、拡散的Ｒａｓ依存性経路をＭＥＫＫ依存性経路の方に駆動するのに要する、第二「ヒット」を提供することができる。本発明の１つの態様は、細胞中のＲａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節することを含んでなる細胞の恒常性を調節する方法を包含する。本明細書で使用されるように、用語「恒常性」とは、シグナル伝達経路のような細胞内システムを使用して、細胞が正常な状態を維持する傾向を言う。ＭＥＫＫ依存性経路の活性の調節には、ＭＥＫＫ依存性経路の構成員、Ｒａｆ依存性経路の構成員、それらの組合せの活性を調節して、所定の経路中のリン酸化の所望の調節を達成するすることによって、Ｒａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を増加させることが含まれる。調節するＭＥＫＫ依存性経路またはＲａｆ依存性経路の好適な調節された構成員として、これらに限定されないが、ＭＥＫＫ、Ｒａｆ、ＪＥＫ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、ＴＣＦ、ＡＴＦ−２、ＪｕｎおよびＭｙｃ、並びにそれらの組合せが挙げられる。一つの態様では、ＭＥＫＫ依存性経路の構成員、Ｒａｆ依存性経路の構成員、およびそれらの組合せの活性は、細胞中のかかる構成員の濃度を変えることによって調節される。一つの好適な調節スキームは、ＭＥＫＫ、Ｒａｆ、ＪＥＫ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、ＴＣＦ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、およびＭｙｃ、並びにそれらの組合せの濃度を変えることを含む。さらに好適な調節スキームは、ＭＥＫＫ、ＪＥＫ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、およびＭｙｃ、並びにそれらの組合せを含むタンパク質の濃度を増加させることを含む。他のさらに好適な調節スキームは、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、および、ＴＣＦ、並びにそれらの組合せを含むタンパク質の濃度を減少させることを含む。２つまたはそれ以上の上記の調節スキーム中のタンパク質濃度の調節を組合せて、細胞中の最適のアポト−シス効果を達成することができることも本発明の範囲内にある。本発明の調節スキーム中でタンパク質の濃度を増加させる好適な方法として、これらに限定されないが、細胞内のかかるタンパク質をコードしている核酸配列のコピー数を増加させること、かかるタンパク質をコードしているかかる核酸配列が細胞内で転写される効率を改善すること、転写物がかかるタンパク質に翻訳される効率を改善すること、かかるタンパク質の転写後修飾の効率を改善すること、かかるタンパク質を産生することができる細胞をアンチ−センス核酸配列と接触させること、およびそれらの組合せが挙げられる。本発明の好適な態様では、細胞の恒常性は、細胞のアポト−シスを調節することによって制御される。細胞のアポト−シスを調節する適切な方法は、ＭＥＫＫタンパク質がＲａｆから実質的に独立している経路を調節するＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節することである。細胞のアポト−シスを調節する特に好適な方法は、細胞を、未調節キナーゼ活性を有するＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸分子と接触させることによって、ＭＥＫＫタンパク質の濃度を増加させることを含んでなる。細胞を接触させる好適な核酸分子として、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０、によって表されるＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸分子、およびそれらの組合せが挙げられる。細胞を接触させるさらに好適な核酸分子として、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および／または配列番号：１０によって表されるＭＥＫＫタンパク質のキナーゼ触媒ドメイン（即ち、調節ドメインでない）のみをゆうする切断されたＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸分子が挙げられる。細胞を接触させるさらにもっと好適な核酸分子として、ＭＥＫＫ１_352-672、ＭＥＫＫ２_352-619、ＭＥＫＫ３_358-626、ＭＥＫＫ４₈₁₁ _-1195 、ＭＥＫＫ５_863-1247を含む核酸分子、およびそれらの組合せが挙げられる。再び、本明細書に記載のＭＥＫＫタンパク質の適切な変形は、緊縮条件下で上記の配列のいずれかとハイブリッド形成することができる核酸分子によってコードされたタンパク質を含んでなる。上記の方法が、細胞を、ＭＥＫＫ活性を阻害することができる化合物と接触させることによって、細胞中のＭＥＫＫタンパク質の活性を低下させる工程をさらに含んでなることは、本発明の範囲内にある。かかる化合物としては、ＭＥＫタンパク質によるＭＡＰＫのリン酸化が阻害されるような方式で、ＭＥＫＫのキナーゼドメインに結合することができるペプチド；および／またはＭＡＰＫタンパク質のリン酸化が阻害されるような方式で、ＭＡＰＫタンパク質の一部に結合することができるペプチドを挙げることができる。他の態様では、ＭＥＫＫ依存性経路の構成員、Ｒａｆ依存性経路の構成員、およびそれらの組合せの活性は、細胞中のかかる構成員の活性を直接に変えることによって調節することができる。ＭＥＫＫ依存性経路の構成員の活性を変える好適な方法としては、これらの限定されないが、細胞を、タンパク質が活性化されるような方式で、ＭＥＫＫ、ＪＥＫ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、およびＭｙｃを含むタンパク質、およびそれらの組合せと直接に相互作用することができる化合物と接触させること；および／または細胞を、タンパク質の活性が阻害されるような方式で、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、ＴＣＦタンパク質を含むタンパク質、およびそれらの組合せと直接に相互作用することができる化合物と接触させることが挙げられる。ＭＥＫＫ依存性経路の構成員を調節することができる、細胞を接触させるのに好適な化合物として、ペプチドが、かかるタンパク質のキナーゼドメインの活性を調節する調節ドメインの能力を阻害する、ＭＥＫＫ、ＪＥＫ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、およびＭｙｃを含むタンパク質の調節ドメインに結合することができるペプチドが挙げられる。細胞を接触させるのに好適な他の化合物として、ＴＮＦα、チロシンキナーゼを調節する増殖因子、Ｇタンパク質結合受容体を調節するホルモンおよびＦＡＳリガンドが挙げられる。Ｒａｆ依存性経路の構成員を調節することができる、細胞を接触させるのに好適な化合物として、ペプチドが、タンパク質がリン酸化されるかまたは基質をリン酸化する能力を阻害する、Ｒａｆ、ＭＥＫ−１、ＭＥＫ−２、ＭＡＰＫ、およびＴＣＦからなる群から選ばれたタンパク質のキナーゼ触媒ドメインに結合することができるペプチドが挙げられる。本発明の１つの態様は、ＭＥＫＫタンパク質がＭＡＰＫを活性化することができるという認識に関する。ＭＡＰＫは、哺乳類系中の種々の細胞経路に関与していることは知られている。ＭＡＰＫは、細胞分裂誘発、ＤＮＡ合成、細胞分裂および分化に関与していることは知られている。ＭＡＰＫはまた、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｍｙｃのような癌遺伝子の活性化に関与していると認められる。理論にとらわれないならば、本発明者は、ＭＡＰＫはまた遺伝子源を有する種々の異常症に密接に関与していると考える。ＭＡＰＫは核膜を横断することが知られていて、種々の遺伝子の発現を調節することの少なくとも部分的に原因であると考えられる。このように、ＭＡＰＫは、癌、神経疾患、自己免疫疾患、アレルギー反応、創傷治癒および炎症反応の刺激と進行に顕著な役割を果たすと考えられる。本発明者は、ＭＥＫＫをコードしている核酸配列を最初に同定することによって、ＭＥＫＫの発現を調節し、そのようにしてＭＡＰＫの活性化を調節することが可能になることを認めた。本発明はまた、被験者の身体の区域に、有効量の裸のプラスミドＤＮＡ化合物を注入することを含んでなる、細胞の恒常性を調節する方法を包含する。裸のプラスミドＤＮＡ化合物は、本発明のＭＥＫＫタンパク質をコードしていて、身体の区域中に位置する受容細胞中に取込まれそして発現することができる裸のプラスミドＤＮＡベクターに操作可能に結合している核酸分子を含んでなる。本発明の好適な裸のプラスミドＤＮＡ化合物は、脱調節されたキナーゼ活性を有する切断されたＭＥＫＫタンパク質をコードしている核酸分子を含んでなる。本発明の好適な裸のプラスミドＤＮＡベクターは当業界で知られているものを包含する。本発明の裸のプラスミドＤＮＡ化合物は、被験者に投与された場合、被験者内の細胞を形質転換し、細胞のアポト−シスを調節することができるＭＥＫＫタンパク質またはＲＮＡ核酸分子の少なくとも一部の産生を指示する。本発明の裸のプラスミドＤＮＡ化合物は、癌、自己免疫疾患、炎症反応、アレルギー反応およびＰａｒｋｉｎｓｏｎ病とＡｌｚｈｅｉｍｅｒ病のような神経障害を含む内科的疾病に罹っている被験者を治療することができる。例えば、裸のプラスミドＤＮＡ化合物は、抗腫瘍療法として、プラスミドが腫瘍細胞によって取込まれ、発現して、腫瘍細胞を死滅させるように、プラスミドの有効量を直接に腫瘍中に注射することによって、投与することができる。本明細書で使用されるように、被験者に投与する裸のプラスミドＤＮＡの有効量は、裸のプラスミドＤＮＡが治療することが意図されている内科的疾病を調節または治療するのに要する量を含んでなり、かかる投与の方法、投与の回数および投与の頻度は、不適当な実験に頼ることのない当業者によって決定されることができる。本発明の治療方法で使用される治療用化合物は、適切な賦形剤をさらに含んでなる。本発明の治療方法で使用される治療用化合物は、治療される被験者が許容できる賦形剤中に製剤することができる。かかる賦形剤として、水、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、ハンクス液、および他の生理学的に平衡された塩水溶液が挙げられる。固定（ｆｉｘｅｄ）油、ごま油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような非水媒体を使用することができる。他の有用な賦形剤として、ナトリウムカルボキシメチルセルローズ、ソルビトール、またはデキストランのような粘度増強剤を含有する懸濁剤が挙げられる。賦形剤はまた、等張性および化学的安定性を向上する物質のような、少量の添加剤を含有することができる。緩衝液として、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液およびトリス緩衝液が挙げられ、一方保存剤の例として、チメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。標準製剤は注射用液剤または注射用懸濁剤もしくは液剤として適切な液体中に取込まれることができる固形剤であることができる。従って、非液状製剤では、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、投与前に無菌水または食塩水に添加することができる保存剤等を含んでなることができる。他の態様では、本発明の治療方法で使用される治療用化合物はまた、担体を含んでなることができる。担体は通常、治療される動物中で治療用化合物の半減期を増加させる化合物である。適切な担体として、これらに限定されないが、リポゾーム、ミセル、細胞、高分子制御放出製剤、生物分解性移植片、細菌、ウイルス、油、エステルおよびグルコールが挙げられる。好適な担体はリポソームとミセルを含む。本発明の治療方法で使用される治療用化合物は、本明細書に記載の内科的疾病を有するいずれの被験者にも投与することができる。本発明の治療用化合物を有効な方法で投与する許容されるプロトコールは、１回の服用量、服用の回数、服用投与の頻度および投与の方法によって変えることができる。かかるプロトコールの決定は、不適当な実験に頼ることのない当業者によって行われることができる。有効な服用量とは、本明細書に記載の内科的疾病について被験者を治療することができる服用量を言う。有効な服用量は、例えば、使用された治療用化合物、治療される内科的疾病、および受容動物の大きさと種類に依存して変わることができる。被験者を治療する有効服用量は、内科的疾病に関与する細胞の活性（増殖を含めて）を調節することができる、経時的に投与される服用量を含む。例えば、本発明の裸のプラスミドＤＮＡ化合物の第一回の服用量は、腫瘍を有する被験者に投与された場合、腫瘍の大きさを７日間で約１０％減少させる量を含んでなる。第二回の服用量は、第一回の服用と少なくとも同一の治療用化合物を含んでなる。本発明の他の態様は、本明細書に記載の内科的疾病を有する被験者のための治療法を処方する方法を包含する。治療法を処方する好適な方法は、（ａ）内科的疾病に関与する細胞中のＭＥＫＫタンパク質活性を測定して、細胞が本発明の方法を使用する治療法に感受性があるかどうかを決定すること；および（ｂ）細胞中のＲａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節して、細胞のアポト−シスを誘発することを含む治療法を処方すること；を含んでなる。ＭＥＫＫタンパク質活性を測定する工程は、（１）被験者から細胞の試料を取出すこと；（２）細胞をＴＮＦαで刺激すること；および（３）ホスホスレオニンおよび／またはホスホセリンに特異的である抗体を使用する免疫測定法を使用して、ＪＥＫタンパク質のリン酸化の状態を検出すること；を含んでなることができる。本発明はまた、本発明のＭＥＫＫタンパク質に選択的に結合することができる抗体を包含する。かかる抗体は本明細書では抗ＭＥＫＫ抗体と呼称される。抗ＭＥＫＫ抗体の多クローン性集団はＭＥＫＫ抗血清中に含有されることができる。ＭＥＫＫ抗血清とは、アフィニティー精製された多クローン性抗体、硫酸アンモニウムカット抗血清または全血清を言うことができる。本明細書で使用されるように、用語「に選択的に結合した」とは、かかる抗体がＭＥＫＫタンパク質に優先的に結合する能力を言う。結合は、免疫ブロット測定法、免疫沈降測定法、酵素免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）、放射標識免疫測定法、免疫蛍光抗体測定法および免疫電子顕微鏡法、［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、分子クローニング実験手引き書（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｓＰｒｅｓｓ、１９８９年を参照］を含む、当業者に既知の多種類の方法を使用して測定することができる。本発明の抗体は多クローン性または単クローン性抗体であることができ、そして当業界で標準の技術を使用して製造することができる。本発明の抗体は、抗体を得るために使用されたタンパク質のエピトープの少なくとも１つに選択的に結合することができる、一本鎖抗体を含む、抗体断片および遺伝子工学の抗体のような機能的均等物を包含する。好適には、抗体は、ＭＥＫＫ核酸分子によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質に応答して、生成する。さらに好適には、抗体は、ＭＥＫＫタンパク質の少なくとも一部に応答して生成し、さらに好適には、抗体は、ＭＥＫＫタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に応答して生成する。好適には、本発明の抗体は、本発明のＭＥＫＫタンパク質に対して、約１０³Ｍ^-1〜約１０¹²Ｍ^-1の単一部位結合親和力を有する。本発明の抗体を製造する好適な法は、動物に、ＭＥＫＫタンパク質の有効量を投与して抗体を産生させ、そして抗体を回収することを包含する。本発明の抗体は、本発明の範囲内にある多種類の潜在的な使用を有する。例えば、かかる抗体は、独特のＭＥＫＫタンパク質を同定し、そしてＭＥＫＫタンパク質を回収するのに使用することができる。本発明の他の態様は、（ａ）細胞を推定される調節分子と接触させること；および（ｂ）推定される調節化合物が細胞中のＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節する能力を、前記ＭＥＫＫ依存性経路の少なくとも１つの構成員の活性化を測定することによって、決定すること；によって同定された、細胞中のＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節することができる治療用化合物を含んでなる。ＭＥＫＫ依存性経路の構成員の活性化を測定する好適な方法は、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の転写調節活性を測定すること、ＭＥＫＫ、ＪＥＫ、ＪＮＫ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、Ｍｙｃからなる群から選ばれたタンパク質のリン酸化を測定すること、およびそれらの組合せを包含する。以下の実施例は、本発明の説明のために提供されるものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実施例実施例１本実施例はＭＥＫＫ１タンパク質の構造的特性決定について記載する。Ａ．ＭＥＫＫ１ヌクレオチド配列ＭＥＫＫ１タンパク質を以下の方法によってクローン化した。独自の変性イノシンオリゴデオキシヌクレオチドを、酵母Ｓｔｅ１１とＢｙｒ２遺伝子の間の配列同一性の領域に対応するように設計した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞からのポリアデニル化ＲＮＡから誘導されたプライマーとｃＤＮＡ鋳型を用いて、３２０塩基対（ｂｐ）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅生成物を単離した。この３２０ｂｐｃＤＮＡをプローブとして使用して、マウス脳ｃＤＮＡライブラリーから、当業界の標準方法を使用して、３２６０ｂｐのＭＥＫＫ１ｃＤＮＡを同定した。ＭＥＫＫ１ヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡのジデオキシヌクレオチド配列決定法によって、当業界の標準方法を使用して決定した。表６を参照すると、開始コドンのためのＫｏｚａｋ共通配列に基づいて、出発メチオンはヌクレオチド４８４に存在すると予想することができる。このメチオニンを出発点として、ｃＤＮＡは、７３ｋＤの分子サイズに相当する、６７２個のアミノ酸のタンパク質をコードする。位置４４１に、Ｋｏｚａｋ規則に従わないが、６８７個のアミノ酸残基のタンパク質（７４．６ｋＤ）を与える、他のインフレーム・メチオニンがある。また表６を参照すると、ＮＨ₂末端の４００個のアミノ酸の２０％はセリンとスレオニンであり、チロシンは２個だけある。プロテインキナーゼＣによるリン酸化の数個の潜在的部位は、ＮＨ₂末端領域中にある。キナーゼ触媒ドメインはＭＥＫＫ１のＣＯＯＨ末端半分の中に位置する。Ｂ．ＭＥＫＫ１転写のサザンブロット分析同量（２０μｇ）の全ＲＮＡを、臭化エチジウム染色によって示されるように、ゲル中に入れた。ブロットを、ＭＥＫＫキナーゼドメインの一部をコードしている３２０−ｂｐのｃＤＮＡ断片またはＭＥＫＫのＮＨ₂末端領域の一部をコードしている８５８−ｂｐの断片のいずれかで、当業界の標準方法を使用してプローブした。図３Ａを参照すると、７．８ｋＤのｍＲＮＡが、数種の細胞株とマウス組織中でＭＥＫＫｃＤＮＡの５′末端と３′末端から誘導されたプローブで同定された。ＭＥＫＫｍＤＮＡは、マウスの心臓と脾臓中で高度に発現し、肝臓中では発現は低い量であった。Ｃ．サザンブロット分析マウスのゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を、当業界の標準方法を使用して、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩのいずれかで消化し、ゲルに塗布した。ブロットを、ＭＥＫＫ遺伝子の３２０−ｂｐの断片でプローブした。図３Ｂには、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ消化物中に１つのバンドの出現を示し、それはＭＥＫＫが１つの遺伝子によってコードされていることを示す。ＥｃｏＲＩ消化物中に２つのバンドが出現することは、プローブによってスパンされたイントロン配列内にＥｃｏＲＩ部位が存在するらしいことを示す。Ｄ．抗ＭＥＫＫ抗体を使用するイムノブロット３種の異なった抗原を使用して、３種の多クローン性抗血清を製造した。第一の多クローン性抗血清は、ＭＥＫＫのＣＯＯＨ末端から誘導された１５個のアミノ酸のペプチドＤＲＰＰＳＲＥＬＬＫＨＰＶＥＲを含む抗原を使用して製造した。ＮＺＷウサギをペプチドで免疫処置して、当業界の標準方法を使用して抗血清を回収した。この第一の多クローン性抗血清を本明細書ではＤＲＰＰ抗血清と呼称する。第二の多クローン性抗血清は、ＥｃｏＲ１とＰｓｔＩで消化されたＭＥＫＫｃＤＮＡを含むＤＮＡクローンを使用し、ＭＥＫＫのアミノ末端をコードする１２７０ｂｐの断片を生成させて、製造した。この断片をｐＲＳＥＴＣ中でクローン化して、ＭＥＫＫ１のアミノ酸残基１〜３６９を含む組換え分子ｐＭＥＫＫ_1- ₃₆₉ を生成させた。ｐＭＥＫＫ_1-369組換え分子をＥ．コリ中で発現させて、組換え分子によってコードされたタンパク質を回収し、当業界の標準方法を使用して精製した。ＮＺＷウサギを精製組換えＭＥＫＫ_1-369分子で免疫処置し、当業界の標準方法を使用して回収した。この第二の多クローン性抗血清を本明細書ではＭＥＫＫ_1-369抗血清と呼称する。第三の多クローン性抗血清は、ＰｓｔＩとＫｐｎ１で消化されたＭＥＫＫｃＤＮＡを含むＤＮＡクローンを使用し、ＭＥＫＫの触媒ドメインをコードする１６７０ｂｐの断片を生成させて、製造した。この断片をｐＲＳＥＴＣ中でクローン化して、ＭＥＫＫ１のアミノ酸残基３７０−７３８を含む組換え分子ｐＭＥＫＫ_370-738（塩基対１５９２−３２６０によってコードされた）を生成させた。ｐＭＥＫＫ１_370-738組換え分子を、Ｅ．コリ中で発現させて、組換え分子によってコードされたタンパク質を回収し、当業界の標準方法を使用して精製した。ＮＺＷウサギを精製組換えＭＥＫＫ_370-738タンパク質で免疫処置し、当業界の標準方法を使用して回収した。この第三の多クローン性抗血清を本明細書ではＭＥＫＫ１_370-738抗血清と呼称する。ＤＲＰＰ抗血清を使用して、数種の噛歯動物の細胞株から誘導された可溶性細胞タンパク質のウエスタンブロットをプローブした。可溶性細胞タンパク質（１００μｇ）または組換えＭＥＫＫＣＯＯＨ末端融合タンパク質（３０ｎｇ）を、１０％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中に入れ、タンパク質を当業界の標準方法を使用してナイロンフィルターに移した。ナイロンフィルターをアフィニティー精製ＤＲＰＰ抗血清でイムノブロットした（１：３００希釈）。図３Ｃを参照すると、７８ｋＤの免疫活性タンパク質が、フェノクロモサイトーマ（ＰＣ１２）、Ｒａｔ１ａおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞からのタンパク質を含む試料中に同定された。顕著な５０ｋＤの免疫活性バンドも通常存在するが、強度が標本によって変わり、このことはバンドがタンパク質分解断片であることを示す。イムノブロット上の７８ｋＤと５０ｋＤの免疫活性バンドの両方の視覚化は、１５個のアミノ酸ペプチド抗原のアフィニティー精製ＤＲＰＰ抗血清との予備インキュベーションによって抑制された。イムノブロットによって検出されたＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫｃＤＮＡの転写解読枠から推定された分子サイズと類似である。第二のイムノブロット実験では、ＥＧＦで刺激されたまたは刺激されなかったＰＣ１２細胞を溶解し、上記のように、１０％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分別した。細胞溶解物中に含有されたＭＥＫＫタンパク質は、アフィニティー精製ＭＥＫＫ_1-369抗血清（１：３００）を使用するイムノブロットによって、当業界の標準方法を使用して、同定された。図４を参照すると、ＭＥＫＫ１、およびＭＥＫＫ活性、ＭＥＫＫαとＭＥＫＫ βを有する２種の高分子量タンパク質は、アフィニティー精製ＭＥＫＫ_1-369抗血清を使用して、同定された。ＭＥＫＫ１は、アフィニティー精製ＭＥＫＫ_1-36 ₉ 抗血清を使用して同定され、ＭＥＫＫαとＭＥＫＫβは同定されなかった。上記と同一の方法を使用して、ＰＣ１２、Ｒａｔｌａ、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＳｗｉｓｓ細胞溶解物中に存在する、約９８ｋＤと８２ｋＤの２種のＭＥＫＫ免疫活性種が、図５に示されるように、アフィニティー精製ＭＥＫＫ_1-369抗血清によって認められた。本明細書に記載の９８ｋＤのＭＥＫＫタンパク質は元来、関連ＰＣＴ出願（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／０４１７８）の９５ｋＤのＭＥＫＫタンパク質と同定されたことを注目すべきである。その後のトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析によって、分子量の改変が決定された。これらのタンパク質の両方の視覚化は、アフィニティー精製ＭＥＫＫ_1-369抗血清を、精製組換えＭＥＫＫ_1-369融合タンパク質抗原とインキュベートすることによって抑制された。一本鎖の９８ｋＤのＭＥＫＫタンパク質は、ＭＥＫＫ免疫沈降物中に存在するが、プレイムノ血清を使用する免疫沈降物中には存在しなかった。９８ｋＤのＭＥＫＫは、繊維芽細胞株に比してＰＣ１２細胞中で多く発現した。Ｒａｆ−１またはＲａｆ−Ｂを特異的に認識する抗体を用いるイムノブロットによって、これらの酵素のいずれもが、ＭＥＫＫ免疫沈降物の混入物として存在したものでないことが示された。ＭＥＫＫ免疫沈降物中の９８ｋＤのＭＥＫＫは、ＰＣ１２細胞溶解物中のＲａｆ−１またはＲａｆ−Ｂとコミグレート（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ）せず、そしてＭＥＫＫとＲａｆ抗体との間の交差反応性は観察されなかった。実施例２この実施例はＭＥＫＫ２、ＭＥＫＫ３およびＭＥＫＫ４タンパク質をコードしている核酸配列の単離について記載する。ＰＣＲプライマーは、ＭＥＫＫ１のヌクレオチド配列に基づいて設計した。ＰＣ１２とＨＬ６０細胞から単離されたＲＮＡのリバーストランスクリプターゼ反応から単離されたＤＮＡからの断片のＰＣＲ増幅は、標準技術を使用して行った。得られたＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＸクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）中で、標準方法を使用してクローン化し、標準技術を使用するＤＮＡ配列分析に供した。実施例３この実施例は、ＣＯＳ−１細胞中でＭＥＫＫ１タンパク質を発現させて、ＭＡＰＫを含むシグナリング系を調節する機能を規定することについて記載する。１００ｍｍ培養皿中のＣＯＳ細胞を、ｐＣＶＭＶ５発現ベクター単独（１μｇ：対照）またはｐＣＶＭＶ５ＭＥＫＫ構築物（１μｇ：ＭＥＫＫ）のいずれかで、トランスフェクトした。４８時間後、細胞を、ウシ血清アルブミン（０．１％）を含有する無血清培地中に１６〜１８時間入れて、休止を誘導した。次いで、細胞を、ヒトＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）（＋ＥＧＦ）または緩衝液（対照）で１０分間処理し、冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そして５０ｍＭ β−グリセロホスフェート（ｐＨ７．２）、１００ｍＭバナジン酸ナトリウム、２ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＥＧＴＡＴｒｉｔｏｎＸ−１００(０．５％)、ロイペプチン（２μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２μｇ／ｍｌ）、および１ｍＭジチオスレイトール（６００μｌ）を含有する細胞溶解緩衝液中で溶解させた。マイクロフュージ中で最高速度で１０分間遠心分離した後、０．５〜１ｍｇの可溶性タンパク質を含有するＣＯＳ細胞溶解物を、ＭＯＮＯＱカラム上のＦＰＬＣで処理して、溶出フラクションを、Ｈｅａｓｌｅｙ等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｃｅｌｌ，第３巻，第５４５頁，１９９２年に記載の方法にしたがって、ＭＡＰＫ活性について測定した。図６Ａを参照すると、ＭＥＫＫ１がＣＯＳ１細胞中で過発現した場合、ＭＡＰＫ活性は、ＭＥＫＫ１ｃＤＮＡ挿入物を欠くプラスミドでトランスフェクトされた対照細胞中よりも４〜５倍大きかった。ＭＡＰＫの活性化は、血清から遮断されたＣＯＳ細胞中、および添加された増殖因子の不在下で、起こる。ＭＡＰＫの活性は、対照細胞のＥＧＦによる刺激の後に、観察された活性と同様であった。ＭＥＫＫを一時的に過発現するＣＯＳ細胞をＥＧＦで刺激すると、ＭＡＰＫ活性が、ＭＥＫＫ発現単独の場合に観察された活性と比較して、少しだけ増加した。ＭＥＫＫタンパク質が、ＭＡＰＫ活性について試験した試料中に存在することを確認するために、トランスフェクトされたＣＯＳ１細胞の細胞溶解物からのタンパク質を、ＭＥＫＫ特異性抗血清とイムノブロットした。ＣＯＳ細胞からの可溶性タンパク質溶解物の同量（１００μｇ）を、実施例１に記載の方法を使用するイムノブロットのためのゲル上に置いた。フィルターを、アフィニティー精製ＤＲＰＰ抗血清（１：３００）とアフィニティー精製ＭＥＫＫ_1-369抗血清（１：３００）を使用してイムノブロットした。図６Ｂを参照すると、結果は、ＥＧＦで処理されたまたはＥＧＦ無しで処理されたＭＥＫＫをコードしているベクターでトランスフェクトされた細胞中でＭＥＫＫが発現することを示す。５０ｋＤのＭＥＫＫ免疫活性断片のみが、対照ＣＯＳ細胞からの溶解物中に、ＤＲＰＰ抗血清を使用して検出された。ＣＯＳ細胞中でのＭＥＫＫの一過性の発現は、ＰＣ１２、Ｒａｔ１ａ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞中で観察されたものより少し大きい顕著な８２ｋＤのバンドを与えた。イムノブロット中に、１５個のアミノ酸ＤＲＰＰペプチド抗原を抗血清に添加すると、免疫反応性バンドのすべての検出が防止された。これらのバンドは対照ＣＯＳ細胞の抽出物中に検出されなかた。このことは、それらが発現ＭＥＫＫタンパク質から誘導されたことを示している。実施例４この実施例は、ＣＯＳ細胞中でＭＥＫＫ１を発現させて、ＭＥＫタンパク質を活性化するＭＥＫＫタンパク質の能力を試験することについて記載する。組換えＭＡＰＫを使用して、ＭＯＮＯＳカラム上の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって分画されたＣＯＳ細胞溶解物中のＭＥＫ活性を測定した。クセノプス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）からのｐ４２ＭＡＰＫをコードしているｃＤＮＡを、ｐＲＳＥＴＢ発現ベクター中でクローン化した。この構築物を、ＮＨ２末端にポリヒスチジンを含有するｐ４２ＭＡＰＫ融合タンパク質の、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）のＬｙｓＳ株中での発現のために使用した。発現プラスミドを含有する培養物を、６００ｎＭで０．７〜０．９の光学濃度まで、３７ ℃で増殖させた。融合タンパク質合成を誘導するために、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（０．５ｍＭ）を添加し、培養物を３時間インキュベートした。次いで、細胞を収集し、凍結、解凍、および音波処理によって溶解した。溶解物を、１０，０００ｇで４℃で１５分間遠心分離した。次いで、上澄液をＮｉ²⁺充填セファロース樹脂に通し、可溶性組換えＭＡＰＫをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中に溶出させた。精製組換えＭＡＰＫは８０％以上の純度であった。精製組換えＭＡＰＫは、ＭＥＫのための基質として働き、ＥＧＦ受容体の残基６６２〜６８１からなるペプチド（ＥＧＦＲ^662-681）のリン酸化を触媒した。一時的にＭＥＫＫでトランスフェクトされた、ｍｏｃｋトランスフェクトされた（対照）、またはｍｏｃｋトランスフェクトされそしてＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）（＋ＥＧＦ）で処理された、ＣＯＳ細胞からの可溶性細胞溶解物を、ＭｏｎｏＳカラム上のＦＰＬＣによって分画し、内因性ＭＥＫ活性を測定した。内因性ＭＡＰＫはフラクション２〜４中に溶出し、一方ＭＥＫはフラクション９〜１３中に含有された。内因性ＭＥＫ活性を測定するために、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、５０ｍＭ β−グルセロホスフェート、１０ｍＭ２−Ｎ−モルホリンエタン−スルホン酸（ｐＨ６．０）、１００μＭバナジン酸ナトリウム、２ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＥＧＴＡ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．５％）、ロイペプチン（５μ ｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２μｇ／ｍｌ）、および１ｍＭジチオスレイトールを含有する６５０μｌの溶液中で溶解した。マイクロフュージ中で最高速度で１０分間遠心分離した後、可溶性細胞溶解物（１〜２ｍｇのタンパク質）を、溶出緩衝液（５０ｍＭ β−グイセロホスフェート、１０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ６．０）、１００μＭバナジン酸ナトリウム、２ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＥＧＴＡ、および１ｍＭジチオスレイトール）中で平衡化されたＭｏｎｏＳカラムに導入した。カラムを緩衝液（２ｍｌ）で洗浄し、結合したタンパク質を、溶出緩衝液中の線状勾配０−３５０ｍＭのＮａＣｌの３０ｍｌで溶出させた。各フラクションの一部（３０μｌ）を、４０μｌの最終容量中で、の緩衝液（２５ｍＭ β −グルセロホスフェート、４０ｍＭＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン −Ｎ′−（２−エタノールスクホン酸）（ｐＨ７．２）、５０ｍＭバナジン酸ナトリウム、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１００μＭ γ−³²Ｐ−ＡＴＰ（３０００〜４０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、阻害剤、プロテイン−２０（ＩＰ−２０；ＴＴＹＡＤＦＩＡＳＧＲＴＧＲＲＮＡＩＨＤ；２５μｇ／ｍｌ）、０．５ｍＭＥＧＴＡ、組換えＭＡＰキナーゼ（７．５μｇ／ｍｌ）、および２００μＭＥＧＦＲ^662-681）と混合して、ＭＥＫ活性について測定した。３０℃で２０分間インキュベートした後、γ−³²Ｐ−ＡＴＰのＥＧＦＲ^662-681中への取込みを測定した。この測定では、添加された組換えＭＡＰＫを活性化する各カラムフラクションの能力を、ＭＡＰＫ基質、ＥＧＦ受容体から誘導されたペプチド（ＥＧＦＲ）、中へのγ−³² Ｐ−ＡＴＰの取込みによって測定した。図７を参照すると、溶出した活性の第一のピークは内因性活性化ＭＡＰＫを表し、それはＥＧＦＲペプチド基質を直接にリン酸化する。活性の第二のピークはＣＯＳ細胞中の内因性ＭＥＫを表す。内因性ＭＥＫの活性は、ＭｏｎｏＳＦＰＬＣの分画によって特性決定した。ＣＯＳ細胞溶解物をＭｏｎｏＱカラム上のＦＰＬＣによって分画し、発現ＭＥＫＫを部分的に精製した。次いで、精製組換えＭＥＫ−１を、ＭＥＫＫのための基質として、γ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下で使用して、ＭＥＫＫがＭＥＫ−１を直接にリン酸化するかどうかを決定した。ＭＥＫ−１をコードしているｃＤＮＡは、マウスＢ細胞のｃＤＮＡ鋳型から、ポリメラーゼ連鎖反応およびＭＥＫ−１の５′コード領域と３′非翻訳領域の部分に対応するオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを用いて、得た。触媒的不活性なＭＥＫ−１は、Ｌｙｓ³⁴³からＭｅｔの部位特異的突然変異誘発によって生成させた。野生型ＭＥＫ−１と触媒的不活性なＭＥＫ−１タンパク質は、それらのＮＨ２末端でポリヒスチジン配列を含有する組換え融合タンパク質として、ｐＲＳＥＴＡ中で発現させた。ＭＥＫＫでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞またはｍｏｃｋトランスフェクトされたＣＯＳ細胞（対照）からの溶解物は、上記のＭｏｎｏＱカラム上のＦＰＬＣの処理を行った。ＭＥＫＫを含有するフラクションの一部（２０μｌ）を、４０μｌの反応容量中に、５０ｍＭ β−グルセロホスフェート（ｐＨ７．２）、１００μＭバナジン酸ナトリウム、２ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＥＧＴＡ、５０μＭＡＴＰ、ＩＰ−２０（５０ μｇ／ｍｌ）、および１０μｌ γ−³²Ｐ−ＡＴＰを含有する緩衝液と混合し、組換え触媒的不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）（キナーゼ−ＭＥＫ−１）の存在下（＋）または不在下（−）で、４０分間インキュベートした。反応は、５× ＳＤＳ試料緩衝液（１０μｌ）を添加して停止させた。１×ＳＤＳ緩衝液は２％ＳＤＳ、５％グリセロール、６２．５ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％ βーメルカプトエタノール、および０．００１％ブロモフェノールブルーを含有する。試料を３分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィー処理を行った。図８Ａを参照すると、自己リン酸化された組換え野生型ＭＥＫ−１（ＷＴＭＥＫ−１）は、リン酸化された触媒的不活性なＭＥＫ−１とコミグレートした。従って、ＭＥＫＫはＭＥＫ−１をリン酸化することができる。しかし、対照細胞からの溶解物の対応フラクションはＭＥＫ−１をリン酸化することができなかった。実施例５この実施例は、実施例４のリン酸化測定法で使用されたＭＥＫＫ−１の改変形態が、野生型ＭＥＫ−１のようには、自己リン酸化しなかったことを示す研究について記載する。触媒的不活性なＭＥＫ−１のＭＥＫＫによるリン酸化は時間依存性であった（図８Ｂ）；ＭＥＫＫもリン酸化された。ＭｏｎｏＱカラム上のＦＰＬＣからのフラクション２２（２０μｌ）を、組換え触媒的不活性なＭＥＫ−１（０．１５ μｇ）とまたは無しで、記載の時間の間インキュベートした。図８Ｂを参照すると、キナーゼＭＥＫ−１およびＭＥＫＫのリン酸化は、５分後に可視的になり、２０分後に最高になった。ＭＥＫＫリン酸化の時間依存的増加は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のＭＥＫＫタンパク質の高い易動度と相互に関連していた。図８Ｃを参照すると、イムノブロットは、ＭＥＫＫタンパク質が、ＭＥＫをリン酸化する活性のピーク（フラクション２２）と（ｍｏｎｏＱカラム上のＦＰＬＣの後に）共溶出することを示した。ＭＥＫＫのゆっくりと移動する種も、イムノブロットによって検出された。従って、ＭＥＫＫの発煙は、ＭＥＫを活性化して、ＭＡＰＫを活性化するようである。実施例６この実施例は、過発現したＭＥＫＫによってＭＥＫをリン酸化すると、ＭＥＫ、組換え野生型ＭＥＫ−１、および触媒的不活性であるＭＡＰＫの改変形態が活性化されることを記載する。ＣＯＳ細胞溶解物をＭｏｎｏＱ−ＦＰＬＣによって分別して、ＭＥＫＫを含有するフラクションを、それが触媒的不活性な組換えＭＡＰＫをγ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下でリン酸化するように、添加された野生型ＭＥＫ−１を活性化するそれらの能力について測定した。ＭＥＫＫでトランスフェクトされたまたはｍｏｃｋトランスフェクトされたＣＯＳ細胞（対照）からの溶解物を、ＭｏｎｏＱカラム上のＦＰＬＣによって分画して、ＭＥＫＫを含有するフラクションの一部（２０μｌ）を緩衝液と混合した。各フラクションを、精製組換え野生型ＭＥＫ− １（１５０ｎｇ）の存在下（＋）または不在下（−）で、ならびに精製組換え触媒的不活性な（キナーゼ）ＭＡＰＫ（３００ｎｇ）の存在下で、インキュベートした。図９Ａを参照すると、ＭＥＫＫでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の溶解物からのフラクション２０−２４はＭＥＫ−１を活性化した。従って、ＭＥＫＫがＭＥＫ−１をリン酸化し、活性化して、ＭＡＰＫがリン酸化された。実施例７この実施例は、ＭＥＫＫが直接にＭＥＫを活性化し、カラムフラクション中に含有された一つまたはそれ以上の他のキナーゼの活性化によってではないことを示す研究について記載する。過発現されたＭＥＫＫを、ＣＯＳ細胞溶解物から、アフィニティー精製ＭＥＫＫ_1-369抗血清によって免疫沈降させた。免疫沈降したＭＥＫＫを、１５μｌのＰＡＮ（１０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、およびアプロチニン（２０μｇ／ｍｌ））中に再懸濁させ、そして２０μｌの最終容量中で、２０ｍＭｐｉｐｅｓ（ｐＨ７．０）中の触媒的不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）と２５μＣｉのγ−³²Ｐ−ＡＴＰ、１０ｍＭＭｎＣｌ₂、およびアプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）と共に（＋）、または無しで（−）、３０℃で１５分間インキュベートした。反応を、５×ＳＤＳ緩衝液（５μｌ）の添加して停止させた。試料を３分間煮沸して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー処理を行った。図９Ｂを参照すると、ＭＥＫＫは触媒的不活性ＭＥＫ−１をリン酸化し、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で野生型ＭＥＫ−１とコミグレートした。免疫沈降物中に、過発現ＭＥＫＫの数個のリン酸化されたバンドが検出された。これらのバンドは多分、ＭＥＫＫの自己リン酸化に由来し、そしてＭＥＫＫでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの溶解物のイムノブロットによって同定されたＭＥＫＫの形態に対応した。プレイムノ血清で得た免疫沈降物はＭＥＫＫを含有せず、またＭＥＫ−１をリン酸化しなかった。従って、ＭＥＫＫはＭＥＫを直接的にリン酸化するようである。一緒にして考えると、実施例４〜実施例７からの結果は、ＭＥＫＫはＭＥＫをリン酸化し活性化して、それが順にＭＡＰＫをリン酸化し活性化することを示している。実施例８この実施例は、ＲａｆもＭＥＫをリン酸化し活性化することができることを示す。血清から遮断されたＣＯＳ細胞をＥＧＦで刺激し、そしてＲａｆを、Ｒａｆ− １のＣＯＯＨ末端に対する抗体で免疫沈降させた。ＣＯＳ細胞を、ベクター単独（対照）またはＰＣＶ／Ｍ５−ＭＥＫＫ構築物（ＭＥＫＫ）で一時的にトランスフェクトした。休止性の対照細胞を、ヒトＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で、または無しで、１０分間処理して、Ｒａｆを、細胞溶解物から、ＲａｆからのＣＯＯＨ末端ペプチドに対する抗体で、免疫沈降させた。免疫沈降したＲａｆを、触媒的不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）と２５μｌのγ−³²Ｐ−ＡＴＰとインキュベートした。免疫沈降したＲａｆは、γ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下で、ＭＥＫ−１をリン酸化した（図１０Ａ）。ＭＥＫＫを過発現するＣＯＳ細胞からのＲａｆの免疫沈降物中では、ＲａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化は少ししかまたは全く観察されなかった。ＭＥＫＫを過発現するＣＯＳ細胞をＥＧＦで処理すると、免疫沈降したＲａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化が同程度に起こった（図１０Ｂ）。ＭＥＫＫでトランスフェクトされそして血清から遮断された細胞を、ＥＧＦで処理し、そしてＲａｆを免疫沈降させて、触媒的不活性なＭＥＫ−１とインキュベートした。Ｒａｆに対する抗体とのイムノブロットによって示されたように、同量のＲａｆが各試料中に免疫沈降した。最も緩慢に移動するバンドは、ＲａｆまたはＭＥＫ−１に無関連である免疫沈降したリンタンパク質を表す。対照細胞およびＭＥＫＫでトランスフェクトされた細胞からの免疫沈降物中のＲａｆの量は、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲａｆに対する抗体とのイムノブロットによって示されるように、同様であった。従って、ＭＥＫＫとＲａｆは独立してＭＥＫを活性化することができる。実施例９この実施例は、ＭＥＫＫタンパク質を含有する細胞の増殖因子による刺激に応答して、ＰＣ１２細胞から単離された９８ｋＤのＭＥＫＫタンパク質が活性化することについて記載する。ＰＣ１２細胞を、飢餓培地（ＤＭＥＭ、０．１％ＢＳＡ）中で１８〜２０時間インキュウベートすることによって、血清から遮断し、そしてＭＥＫＫを、未処理の対照またはＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）もしくはＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理された細胞の同量を含有する溶解物から、ＭＥＫＫのＮＨ₄末端部分に特異的な上記の抗ＭＥＫＫ抗体で免疫沈降させた。免疫沈降したＭＥＫＫを８μｌのＰＡＮ（１０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、およびアプロチニン（２０μｇ／ｍｌ））中に再懸濁させ、触媒的不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）と４０μＣｉの（γ−³²Ｐ）ＡＴＰと、万能キナーゼ緩衝液（２０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１００ｍＭＭｎＣｌ₂、およびアピロチニン（２０ μｇ／ｍｌ））中で、２０μｌ最終容量中で、３０℃で２５分間インキュベートした。２ＸＳＤＳ試料緩衝液（２０μｌ）を添加して、反応を停止した。試料を３分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＥとオートラジオグラフィー処理を行った。Ｒａｆ−Ｂを、Ｒａｆ−ＢのＣＯＯＨ末端ペプチドに対する抗血清（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で、上記のように、同一の未処理および処理されたＰＣ１２細胞溶解物から免疫沈降させ、同様に測定した。Ｒａｆ−１を、Ｒａｆ−１のＣＯＯＨ末端アミノ酸に対する抗血清（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で免疫沈降させた。血清飢餓にされたＰＣ１２細胞を表皮増殖因子（ＥＧＦ）処理すると、ＭＥＫＫ活性が増加した。図１１を参照すると、結果は、ＭＥＫＫの免疫沈降物によって精製ＭＥＫ−１（キナーゼ不活性型）のリン酸化を、試験管内キナーゼ測定で、測定することによって得たものである。ＮＧＦは、未処理細胞からの対照免疫沈降物と比較して、ＭＥＫＫ活性のわずかな増加を刺激した。Ｒａｆ−Ｂは高い基礎活性を示したが、ＮＧＦとＥＧＦによるＭＥＫＫ活性の刺激は、これらの試薬によるＲａｆ− Ｂ活性化と同様であった。ＮＧＦとＥＧＦによるｃ−Ｒａｆ−１の活性化は、ＭＥＫＫまたはＲａｆ−Ｂのそれと比較して殆ど無視してよい程度であった。ＥＧＦによるＭＥＫＫ刺激の経時変化は、０、１、３、５、１０、または２０分間ＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＰＣ１２細胞の溶解物からのＭＥＫＫまたはＲａｆ−Ｂタンパク質を免疫沈降させ、そのタンパク質を、上記のように、触媒的不活性なＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）と（γ−³²Ｐ）ＡＴＰとインキュベートすることによって行った。データは、典型的実験からの、放射性ゲルのホスホルイメージャー分析によって定量された、各時点での応答の相対的大きさを表す。ＥＧＦ処理の経時変化は、ＭＥＫＫ活性化が５分後に最高水準に達し、少なくとも３０分間持続することを示した（図１２）。Ｒａｆ−Ｂは同様の経時変化を示した；ピークの活性はＥＧＦ処理後３−５分以内に生じ、２０分までの間持続した。ＥＧＦ刺激されたＭＥＫＫ活性をＲａｆ−Ｂのそれからさらに分離するために、ＭＥＫＫ免疫沈降の前に、Ｒａｆ−Ｂを細胞溶解物から免疫清掃した。Ｒａｆ −Ｂを、ＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理されたまたは処理されなかった血清飢餓ＰＣ１２細胞の溶解物から予備清掃した。Ｒａｆ−Ｂを、Ｒａｆ−Ｂに対する抗血清を使用して、または対照として免疫前ＩｇＧ抗血清を使用して、２回予備清掃した。次いで、予備清掃された上澄液を、ＭＥＫＫまたはＲａｆ−Ｂ抗血清で免疫沈降させ、詳細に上記したように、触媒的不活性なＭＥＫ−１と（ γ−³²Ｐ）ＡＴＰとインキュベートした。ＥＧＦ刺激された、および刺激されなかったＰＣ１２細胞溶解物を、ＩｇＧまたはＲａｆ−Ｂ抗血清で予備清掃し、次いでＭＥＫＫ抗血清またはＲａｆ−Ｂ抗体で免疫沈降処理を行った。図１３に示された結果は、試験管内キナーゼ測定中に、Ｒａｆ−Ｂのホスホルイメージャー分析によって測定して、Ｒａｆ−Ｂ活性が６０％低下したことを示した。ＥＧＦ刺激されたＭＥＫＫ活性はＲａｆ−Ｂ除去によって影響されなかったが、これはＲａｆ−ＢがＭＥＫＫ免疫沈降物の成分ではないことを示唆する。Ｒａｆ−Ｂ活性の少なくとも４０％は、Ｒａｆ−Ｂ抗体による予備清掃に対して抵抗性である。ＣＯＳ細胞中で過発現した組換え野生型ＭＥＫＫは、セリンとスレオニン残基上で容易に自己リン酸化し、ＭＥＫＫのアミノ末端は非常にセリンとスレオニンに富む。ＰＣ１２細胞の免疫沈降物中に含有されたＭＥＫＫを、精製組換えＭＥＫＫアミノ末端融合タンパク質の選択的リン酸化について、試験管内キナーゼ測定法で試験した。血清飢餓のＰＣ１２細胞を、ＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理し、同一の細胞溶解物からの同量のタンパク質を、ＭＥＫＫ、Ｒａｆ−Ｂ、または対照として免疫前抗血清で免疫沈降させた。免疫沈降物を、精製組換えＭＥＫＫＮＨ₂ 末端融合タンパク質（４００ｎｇ）および（γ−³²Ｐ）ＡＴＰと、上記のようにインキュベートした。図１４に示された結果は、ＥＧＦ刺激されたおよびＥＧＦ刺激されなかったＰＣ１２細胞の溶解物から免疫沈降したＭＥＫＫは不活性な５０ｋＤのＭＥＫＫＮＨ₂融合タンパク質を強くリン酸化し、一方Ｒａｆ−Ｂ、またはＥＧＦ刺激されたまたはＥＧＦ刺激されなかったＰＣ１２細胞からの免疫前免疫沈降物は、基質としてＭＥＫＫＮＨ₂融合タンパク質を使用しなかったことを示している。従って、ＭＥＫＫ免疫沈降物中に含有されたＥＧＦ刺激されたＭＥＫＫ活性は、混入Ｒａｆキナーゼによるものではない。実施例１０この実施例は、ＰＣ１２細胞溶解物のＦＰＬＣＭｏｎｏＱイオン交換カラムフラクション中のＭＥＫＫ活性について記載する。細胞溶解物は、ＥＧＦ刺激されたＰＣ１２細胞から製造した。１ｍｌのカラムフラクション（１−５２５ｍＭＮａＣｌ勾配）の一部（９００μｌ）をトリクロロ酢酸による沈殿によって濃縮し、上記のようにゲル上に置いた。ゲルをブロットし、次いでＭＥＫＫ特異性抗体でイムノブロットした。図１５Ａに示された結果は、９８ｋＤのＭＥＫＫの免疫反応性がフラクション１０−１２に溶出したことを示している。Ｒａｆ−Ｂ免疫反応性のピークはフラクション１４中に溶出し、一方Ｒａｆ−１はカラムからの溶出液中に検出されなかった。未刺激の対照細胞またはＥＧＦ処理された細胞のＰＣ１２溶解物からの各フラクションの一部（３０μｌ）を、基質として精製組換えＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）を含有する緩衝液中で、上記のように測定した。図１５Ｂに示された結果は、ＥＧＦ刺激されたＰＣ１２細胞からのフラクション１０−１２中に溶出したＭＥＫＫ活性のピークはＭＥＫをリン酸化し、一方未刺激の細胞からのフラクション中にはＭＥＫリン酸化があまり起らなかったことを示している。実施例１１この実施例は、ＭＥＫ−１とＭＥＫＫＮＨ₂末端融合タンパク質のリン酸化は９８ｋＤのＰＣ１２細胞ＭＥＫＫの活性によるものであることを示す研究について記載する。ＥＧＦ刺激されたおよび未刺激の細胞から製造された細胞溶解物を、Ｍｏｎｏ −Ｑカラム上のＦＰＬＣによって分画して、内因性ＭＥＫＫを部分的に精製した。未刺激対照ＰＣ１２細胞またはＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理された細胞からの溶解物を、０−５２５ｍＭＮａＣｌの線状勾配を使用するＭｏｎｏＱカラム上のＦＰＬＣによって分画した。各偶数番号のフラクションの一部（３０μｌ）を、４０μｌの最終容量中に基質として精製組換えＭＥＫ−１（１５０ｎｇ）を含有する緩衝液（２０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス−２−エタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）（ｐＨ７．０）、１０ｍＭＭｎＣｌ₂、アプロチニン（２０μｇ／ｍｌ）、５０ｍＭ β−スルセロホスフェート（ｐＨ７．２）、１ｍＭＥＧＴＡ、ＩＰ−２０（５０μｇ／ｍｌ）、５０ｍＭＮａＦ、および３０μＣｉ（γ−³²Ｐ）ＡＴＰ）と混合し、３０℃で２５分間インキュベートした。反応を、２×ＳＤＳ試料緩衝液（４０μｌ）を添加して停止させ、煮沸して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィー処理を行った。ＭＥＫＫ活性のピークはフラクション１０−１２に溶出した。ＥＧＦ処理されたＰＣ１２細胞の溶解物からの各偶数番号のフラクションの一部（３０μｌ）を、ＭＥＫ−１の代わりに基質として精製組換えＭＥＫＫＮＨ₂末端融合タンパク質（４００ｎｇ）を含有すること以外は上記の通りの緩衝液と混合した。次いで、精製組換えキナーゼ不活性なＭＥＫ−１またはＭＥＫＫＮＨ₂末端融合タンパク質を、（γ−³² Ｐ）ＡＴＰ）の存在下で、基質として使用し、９８ｋＤのＭＥＫＫがいずれかの基質を直接にリン酸化するかどうかを決定した。ＥＧＦで処理されたＰＣ１２細胞からの溶解物のフラクション１０−１４がＭＥＫ−１をリン酸化し、一方未処理の対照のフラクション中ではＭＥＫ−１リン酸化は僅かしか起らなかった。活性のピークが少し幅広であったが（フラクション８−１６）、ＭＥＫＫＮＨ₂ 末端融合タンパク質も、ＭＥＫ−１と同一のフラクション中でリン酸化された。図１６を参照すると、カラムフラクションのイムノブロットから、９８ｋＤのＭＥＫＫタンパク質が、外因的に添加されたキナーゼ不活性なＭＥＫ−１または５０ｋＤのＭＥＫＫＮＨ₂末端融合タンパク質をリン酸化した活性のピークと共に共溶出したことを示した。偶数番号のカラムフラクションの一部（９００μ ｌ）をトリクロロ酢酸による沈殿によって濃縮し、ＭＥＫＫ抗体でイムノブロットした。免疫反応性のピークはフラクション１０−１２に溶出した。実施例１２この実施例は、９８ｋＤのＭＥＫＫによるＭＥＫの活性化について記載する。９８ｋＤのＭＥＫＫを、未処理（−）またはＥＧＦ処理（＋）ＰＣ１２細胞溶解物からの、実施例１に記載のＭＥＫＫ_1-369抗血清を使用して免疫沈降させた。免疫沈降物を、精製組換え野生型ＭＥＫ（１５０ｎｇ）の存在下で（＋）または不在下で（−）、および精製組換え触媒不活性なＭＡＰＫ（３００ｎｇ）および（γ−³²Ｐ）ＡＴＰ）の存在下でインキュウベートした。図１７Ａに示された結果は、ＥＧＦ刺激された細胞から免疫沈降されたＭＥＫＫが、ＭＥＫをリン酸化し活性化して、ＭＡＰＫをリン酸化したことを示している。添加された組換えＭＥＫの不在下では、ＭＡＰＫのリン酸化は起らなかった。イムノブロットからは、ＥＧＦ刺激されたＰＣ１２細胞からのＭＥＫＫ免疫沈降物中には、混入ＭＡＰＫ（図１７Ｂ）または混入ＭＥＫ（図１７Ｃ）は全く無いことが示された。従って、ＭＥＫのリン酸化と活性化は、免疫沈降物中に測定されたＭＥＫＫ活性のＥＧＦ刺激によるものである。実施例１３この実施例は、９８ｋＤのＰＣ１２細胞ＭＥＫＫとＲａｆが、増殖因子媒介シグナリングのための機能的Ｒａｓタンパク質を必要とするかどうかについて記載する。優性の負のＨａ−ｒａｓ（Ａｓｎ−１７）（Ｎ¹⁷Ｒａｓ）をＰＣ１２細胞中で発現させ、そしてＥＧＦ刺激されたＭＥＫＫまたはＲａｆ−Ｂ活性化を、免疫沈降物中で、基質としてキナーゼ不活性なＭＥＫ−１を使用して測定した。デキサメタソン誘発Ｎ¹⁷Ｒａｓを安定して発現するＰＣ１２細胞を、１μＭデキサメタソンを持つまたは持たない０．１％ＢＳＡを含有する培地中で、１８−２０時間、血清飢餓にさせ、次いで未処理またはＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）で５分間処理した。細胞溶解物からの可溶性タンパク質の同量を、ＭＥＫＫ抗血清またはＲａｆ−Ｂ抗血清で免疫沈降して、上記のように、精製組換え触媒的不活性ＭＥＫ−１および（γ−³²Ｐ）ＡＴＰとインキュウベートした。Ｎ¹⁷Ｒａｓの発現が、Ｎ¹⁷Ｒａｓ遺伝子で安定的にトランスフェクトされたＰＣ１２クローン中で、飢餓培地にデキサメタソンを添加することによって、誘発された。Ｎ¹⁷Ｒａｓの発現は、キナーゼ不活性なＭＥＫをリン酸化するその能力によって測定して、ＥＧＦによるＭＥＫＫの活性化を抑制した。Ｒａｆ−ＢのＥＧＦ媒介活性化はまた、Ｎ¹⁷Ｒａｓ発現するＰＣ１２細胞中で、非誘発のＮ¹⁷ Ｒａｓトランスフェクタントに比較して、大きく低下した。野生型ＰＣ１２細胞へのデキサメタソンの添加は、ＥＧＦによって誘導されたＭＥＫＫ活性化またはＲａｆ−Ｂ活性化の大きさに効果を有しなかった。Ｎ¹⁷Ｒａｓ遺伝子で安定的にトランスフェクトされたＰＣ１２細胞クローンは、野生型ＰＣ１２細胞よりも、ＭＥＫＫ活性のＥＧＦ媒介活性化に対する応答性が低い。これらの結果から、機能性Ｒａｓが、ＰＣ１２細胞中のＲａｆ−ＢとＭＥＫＫの増殖因子刺激された活性化に必要であることが示され、このことはＲａｓが、ＲａｆとＭＥＫＫ系統群からの多重プロテインキナーゼエフェクターの活性化によって、細胞増殖と分化に対するその効果を媒介することを示唆する。従って、ＥＧＦは、５分間以内に活性のピークを刺激し、それは処理後少なくとも３０分間持続し、Ｒａｆ−Ｂ活性化の経時変化と同様であった。神経増殖因子（ＮＧＦ）とホルボールエステルＴＰＡも、ＥＧＦより低い程度であるが、ＭＥＫＫを活性化した。免疫沈降物またはカラムフラクション中のＭＥＫＫ活性は、ＥＧＦ刺激されたｃ−Ｒａｆ−１とＲａｆ− Ｂ活性から分離され得る。ホスコリン前処理は、ＥＧＦ、ＮＧＦ、およびＴＰＡによるＭＥＫＫおよびＲａｆ−Ｂ活性化を廃止した（図１８）。ＥＧＦに対応するＭＥＫＫおよびＲａｆ−Ｂ活性化は、優性の負のＮ¹⁷Ｒａｓの安定な発現によって抑制された。これらの知見は、増殖因子によるＲａｓ依存性ＭＥＫＫ調節の第一の証明を表し、そしてＲａｓが、ＲａｆとＭＥＫＫ系統群の構成員との間を交互に結合することができる、複合細胞内キナーゼネットワークの出現を示唆する。９８ｋＤのＰＣ１２細胞ＭＥＫＫの増殖因子媒介活性化がＰＫＡによって抑制されるかどうかを決定するために、ホルスコリンを使用して、細胞内ｃＡＭＰを上昇させ、ＰＫＡを活性化した。血清飢餓されたＰＣ１２細胞を、ホルスコリン（５０μＭ）で３分間前処理するかまたはホルコリン無しで前処理して、プロテインキナーゼＡを活性化し、次いでＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはＴＰＡ（２００ｎＭ）で５分間処理して、ＭＥＫＫを、細胞溶解物からの可溶性タンパク質の同量から免疫沈降させ、上記のように、精製組換え触媒的不活性なＭＥＫ−１および（γ−³²Ｐ）ＡＴＰとインキュウベートした。同一細胞溶解物から、Ｒａｆ−Ｂ活性を、その調節がＭＥＫＫのそれと異なるかどうかを試験するために、測定した。Ｒａｆ−Ｂを、上記の同一の細胞溶解物から免疫沈降させ、上記のように、ＭＥＫ−１をリン酸化するその能力について測定した。ホルスコリン前処理は、キナーゼ不活性なＭＥＫ−１をリン酸化するそれらの能力によって測定して、ＥＧＦ、ＮＧＦ、およびＴＰＡによるＭＥＫＫとＲａｆ−Ｂの活性化を廃止した（図１８）。ホルスカリン処理単独では、いずれのキナーゼにも顕著な効果を有しなかった。これらの結果は、Ｒａｆ−１とＲａｆ−Ｂの外に、ＰＫＡ活性化が、９８ｋＤのＰＣ１２細胞ＭＥＫＫの増殖因子刺激を抑制することを示し、このことは、Ｒａｓの間または下流およびこれらの３つのキナーゼの各々の上流または水準に在るＰＫＡ作用のための共通の調節制御点の存在を示唆する。実施例１４この実施例は、類似のＭＥＫ活性または相違するＭＥＫ活性が、Ｇ_iタンパク質結合された受容体によるＭＡＰＫの活性化に関与するかどうかを、トロンビン刺激されたＲａｔ１ａ細胞からの細胞溶解物中のＭＥＫＫ活性を測定することによって、決定することについて記載する。トロンビン刺激された細胞は、ＥＧＦ刺激された細胞中に検出された主要ＭＥＫピークと共に共分画されたＭＥＫ活性を示した。トロンビン攻撃誘発された（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄｅ）細胞からのＭＥＫ活性の大きさは一般的に、ＥＧＦ刺激の場合に観察されたものより２〜３倍低く、それは、本発明者がトロンビン攻撃誘発された細胞中に観察したより小さいＭＡＰＫ応答と関連している。ｇｉｐ２、ｖ−ｓｒｃ、ｖ−ｒａｓ、またはｖ−ｒａｆを発現するＲａｔ１ａとＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＭＥＫの微分調節によって、本発明者は、ＭＥＫ− １の推定される調節体であるプロテインキナーゼを研究するようになった。最近、Ｒａｆ−１がＭＥＫをリン酸化し活性化することができることが示された。Ｒａｆ活性化は以下の方法で測定した。細胞を血清飢餓にして、上記のように、適切な増殖因子の存在または不在下で攻撃誘発させた。血清飢餓のＲａｔ１ａ細胞を緩衝液単独でまたはＥＧＦで攻撃誘発させ、Ｒａｆを、ＲａｆのＣ末端を認識する抗体を使用して免疫沈降させた。細胞を、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．２、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭグルセロリン酸ナトリウム、２ｍＭバナジン酸ナトリウム、２．１μｇ／ｍｌアプロチニン）中で擦過することによって溶解し、１０分間マイクロフュージして、核を除去した。上澄液をタンパク質含量について正常化し、プロテインＡセファロースで４ ℃で２−３時間予備清澄化した後、Ｒａｆ−１のＣ末端に対するウサギ抗血清とプロテインＡセファロースで免疫沈降させた。ビーズを氷冷ＲＩＰＡで２回、ＰＡＮ（１０ｍＭＰｉｐｅｓ、ｐＨ７．０、１００ｍＭＮａＣｌ、２１μｇ／ｍｌアプロチニン）で２回洗浄した。免疫沈降物の一部をＳＤＳ試料緩衝液で希釈し、イムノブロット分析に使用した。残部をキナーゼ緩衝液（２０ｍＭＰｉｐｅｓｐＨ７．０、１０ｍＭＭｎＣｌ₂、１５０ｎｇキナーゼ不活性な、ＭＥＫ−１、３０μＣｉ γ−³²Ｐ−ＡＴＰおよび２０μｇ／ｍｌアプロチニン）中に、５０μｌの最終容量中、３０℃で３０分間再懸濁させた。野生型組換えＭＥＫ−１をマーカーとして平行して自己リン酸化させた。反応を１２．５μｌのＳＤＳ試料緩衝液の添加によって停止させ、５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィー処理を行った。免疫沈降したＲａｆは、γ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下で、ＭＥＫ−１をリン酸化することができた。この測定で使用された組換えＭＥＫ−１は、野生型ＭＥＫ−１で観察されるように、それが自己リン酸化しなかったことを確認する程キナーゼ不活性であった。対照細胞からの免疫沈降物中には、ＲａｆによるＭＥＫ−１のリン酸化は少しかまたは全く観察されなかった。ＥＧＦの攻撃誘発は明らかに、ＭＥＫ−１のＲａｆ触媒されたリン酸化を刺激した；反対に、Ｒａｔ１ａ細胞のトロンビン攻撃誘発は、内因性ＭＥＫが明らかに活性化された場合でも、測定できる程にはＲａｆを活性化しなかった。ＥＧＦは、組換えＭＥＫ−１のＲａｆリン酸化を、基礎の約２．６倍に刺激した。Ｇｉｐ２またはｖ−ｓｒｃ発現するＲａｔ１ａ細胞からのＲａｆ免疫沈降物中には、ＲａｆによるＭＥＫのリン酸化が少ししか観察さなかった。ＥＧＦ刺激は、これらの細胞株中でＭＥＫ−１のＲａｆ触媒されたリン酸化を、夫々１．８倍と１．４倍に活性化することができた。Ｇｉｐ２とｖ−ｓｒｃ発現する細胞中のＥＦＧ応答のブランティングは、ＭＡＰＫの構成性活性化に対するＥＦＧ受容体の脱感受性の結果のようである。免疫沈降物中のＲａｆ量は、その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲａｆ抗体を使用するイムノブロットによって、同様であることが示された。ＭＥＫのトロンビン刺激が基礎の２〜３倍であるから、Ｒａｆがこの増殖因子によるＭＥＫ活性化に顕著に貢献した場合、ＭＥＫリン酸化の少なくとも１．５倍の刺激が期待される。活性化のこの水準は、ＥＧＦ刺激されたＧｉｐ２とｖ−ｓｒｃ発現する細胞株中に検出可能であった。従って、Ｒａｆのトロンビン活性化を検出できなかたことは、多分測定法の感度によるものである。ＭＡＰＫのトロンビン刺激は３分で最高になる。トロンビンで１分または５分間Ｒａｔ１ａ細胞を刺激しても、Ｒａｆ活性は増加しなかった。ＮＩＨ３Ｔ３細胞では、Ｒａｔ１ａ細胞中のように、ＥＧＦはＲａｆを約２．７倍に活性化し、他方トロンビンは活性化しない。Ｖ−Ｒａｆ発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞はＭＥＫ−１リン酸化の増加を示さなかった。この結果は、ＭＥＫがｖ−Ｒａｆ発現するＮＩＨ２Ｔ３細胞中で明らかに活性化されたから、意外であった。ｃ−Ｒａｆ−１の外に、ｐ９０とｐ７５ｇａｇ−ｒａｆ融合タンパク質の両方は、ｖ−ＲａｆＮＩＨ３Ｔ３細胞から、抗血清によって免疫沈降した。ｐ７５ｇａｇ−ｒａｆはプロテインキナーゼ活性を示すことが示されたが、ＮＨ₂ 末端ｇａｇ融合タンパク質は、試験管内測定系中で、組換えＭＥＫ−１のＲａｆリン酸化を立体化学的に妨害することが可能である。ｖ−Ｒａｆキナーゼ活性を測定する研究がさらに行われることが必要である。結果は、ＭＥＫの活性化が専らＲａｆの活性化によっては説明できないことを示している。トロンビン刺激された、Ｇ_iタンパク質結合経路中およびｇｉｐ２とｖ−ｓｒｃトランスフェクトされた細胞中のＭＥＫ活性化に貢献する、ＭＥＫのための追加の調節キナーゼが存在しなければならない。実施例１５この実施例は、全長のＭＥＫＫタンパク質および負の制御タンパク質と比較して、ＭＥＫＫタンパク質のｐｐｐｓｓ−ｔｒｕｎｃおよびＮｃｏｌ−ｔｒｕｎｃがＭＡＰ活性を活性化する能力を示す。図１９に示された結果は、切断されたＭＥＫＫ分子が全長のＭＥＫＫより活性であったことを示している。事実、切断されたＭＥＫＫ分子は、全長のＭＥＫＫタンパク質より少なくとも約１．５倍活性であった。従って、ＭＥＫＫの調節ドメインが除去されると、触媒ドメインの活性が脱調節され、酵素活性が改善する。実施例１６この実施例は、Ｒａｆに比較して、ＭＥＫによるＪＮＫの優先的活性化について記載する。ヒーラー細胞を、切断されたＭＥＫＫ_370-738で、誘発性乳房腫瘍ウイルスプロモーターの制御下で、エピトープ標識されたＪＮＫ１と一緒に、一時的にトランスフェクトした（Ｄｅｒｉｊａｒｄ等，Ｃｅｌｌ，第７６巻，第１０２８頁，１９９４年に詳細に記載）。他のヒーラー細胞も、切断されたＢＸＢ−Ｒａｆで、誘発性乳房腫瘍ウイルスプロモーターの制御下で、エピトープ標識されたＪＮＫ１と一緒に、一時的にトランスフェクトした（Ｄｅｒｉｊａｒｄ等、上掲）。次の日、ＭＥＫＫ_370-738発現およびＢＸＢ−Ｒａｆ発現が、デキサメトソン（１０μＭ）の投与によって、１７時間誘発された。次いで、細胞抽出物を製造し、免疫複合キナーゼ測定法を使用してＪＮＫ活性について測定した（Ｄｅｒｉｊａｒｄ等，上掲、に詳細に記載）。図２０に示された結果は、ＭＥＫＫは、未不刺激の細胞（基礎）の約３０倍〜約５０倍にＪＮＫ活性を刺激し、Ｒａｆ刺激された細胞の約１５倍〜約２５倍にＪＮＫ活性を刺激したことを示している。実施例１７この実施例は、ＭＥＫＫ発現に応答する、ｃ−Ｍｙｃトランスアクチベーションドメインのリン酸化がＭＹＣ−ＧＡＬ４転写活性を活性化することを記載する。２つの別々の発現プラスミドを以下のように構築した。発現プラスミドｐＬＮＣＸを、ＧＡＬ４（１−１４７）に連結されたｃ−ｍｙｃ（１−１０３）を含むｃＤＮＡクローンに連結して（Ｓｅｔｈ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２６６巻，第２３５２１−２３５２４頁，１９９３年）、組換え分子ｐＭＹＣ−ＧＡＬ４を生成させた。発現プラスミドＵＡＳ_G−ＴＫルシフェラーゼ（Ｓａｄｏｗｓｋｉ等，Ｎａｔｕｒｅ，第３３５巻，第５６３−５６４頁，１９８８年）を、ｐＭＹＣ−ＧＡＬ４またはｐＬＵ−ＧＡＬで、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞中に、当業界の標準方法を使用してトランスフェクトし、組換え細胞（本明細書ではＬＵ／ＧＡＬ細胞と呼称する）を生成させた。組換え対照細胞も、ＧＡＬ４（１−１４７）単独を含有するｐＧＡＬ４−対照プラスミド中で、ｃ−ｍｙｃ（１−１０３）の不在下で、トランスフェクトすることによって製造した。ＬＵ／Ｇａｌ細胞を、ＰＭＥＫＫ_370-738、ｐＭＥＫＫ（全長のＭＥＫＫ_1-738 をコードしている）、ＢＸＢ−Ｒａｆ、ｐＭｙｃ−Ｇａｌ４、ｐＣＲＥＢ−Ｇａｌ４（Ｇａｌ４_1-147に融合されたＣＲＥＢ_1-261をコードしている；Ｈｏｅｆｆｌｅｒ等，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，第３巻，第８６８−８８０頁，１９８９年）、ｐＧａｌ４またはＣＲＥＢ融合タンパク質（ＧＡＬ４と呼称）のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を一夜インキュベートし、次いで当業界の標準方法を使用して溶解した。各細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。図２１に示された結果は、ＭＥＫＫが、ｃ−Ｍｙｃトランスアクチベーションドメインのリン酸化を、ｃ−Ｍｙｃドメインが活性化されそしてトランスフェクトされたルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘発するような方式で、選択的に刺激することができることを示している。さらに、結果は、ＭＥＫＫがＣＲＥＢ活性化を刺激しないことを示している。また、活性化されたＲａｆはＭｙｃ活性化を刺激することができない。ＭＥＫＫによるｃ−Ｍｙｃタンパク質の活性化機構の略図を図２３に示す。実施例１８この実施例は、ＭＥＫＫ３タンパク質によってｐ３８ＭＡＰＫタンパク質をリン酸化することおよびＭＥＫＫ１タンパク質ではリン酸化しないことについて記載する。ＣＯＳ細胞を、ＭＥＫＫ１もしくはＭＥＫＫ３タンパク質をコードしているｃＤＮＡクローンに連結された発現プラスミドｐＣＶＭ５、またはＭＥＫＫｃＤＮＡ挿入物を欠いている対照ｐＣＶＭ５プラスミドで、トランスフェクトした。トランスフェクトの４８時間後、ＣＯＳ細胞は溶解し、溶解物をＭｏｎｏＱＦＰＬＣカラム上で実施例４に記載の条件を使用して分画した。フラクションを、ＭＡＰキナーゼ様酵素のチロシンリン酸化について、実施例４に記載のキナーゼ測定法を使用して、分析した。図２３を参照すると、ＭＥＫＫ３の発現は、ｐ３８ＭＡＰＫおよびｐ４２とｐ４４型のＭＡＰＫのチロシンリン酸化を誘発する。しかし、ＭＥＫＫはｐ３８ＭＡＰＫの弱いリン酸化を誘発するのみであるが、ｐ４２とＰ４４ＭＡＰＫのリン酸化を誘発する。実施例１９この実施例はＭＥＫＫ誘発性アポト−シスについて記載する。アポト−シスの研究のために、細胞を以下のように製造した。Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞とＲＥＦ５２細胞を、注入された細胞の検出のために、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）をコードしている発現プラスミドでトランスフェクトした。次いで、β−Ｇａｌトランスフェクトされた細胞の１セットに、ＭＥＫＫ_370-738タンパク質をコードしている発現ベクターを微量注入した。次いで、β−Ｇａｌトランスフェクトされた細胞の他のセットに、切断されたＢＸＢ−Ｒａｆタンパク質をコードしている発現ベクターを微量注入した。Ａ．ビューベリシン誘発性アポト−シストランスフェクトされたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞とＲＥＦ５２細胞の第一群を、５０μＭビューベリシンで、３７℃で６時間処理した。ビューベリシンは哺乳類細胞中でアポト−シスを誘発することが知られている化合物である。細胞の第二群を、ビューベリシンを欠く対照緩衝液で処理した。次いで、処理された細胞をパラホルムアルデヒド中に固定し、当業界の標準プロトコールを使用してサポニンで浸透性化した。次いで浸透性化された細胞を、細胞を、細胞質収縮を検出するためには、フルオレセイン標識された抗チューブリン抗体（１：５００；ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手）と、またはＤＮＡを染色して核凝結を検出するするためには、１０μＭヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏから入手）とインキュベートすることによって標識した。次いで、標識された細胞を、ＮｉｋｏｎＤｉａｐｈｏｔ蛍光顕微鏡を使用して、微分蛍光画像化法によって観察した。図２４は、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞とＲＥＦ５２細胞の２つの視野を示し、第一の視野は対照緩衝液で処理された細胞を表し、第二の視野はビューベリジンで処理された細胞を表す。ビューベリジンで処理された細胞は、アポト−シスに特徴的である細胞収縮（抗チューブリン抗体によって監視された）と核凝結（ヨウ化プロピジウムによって監視された）を示した。Ｂ．ＭＥＫＫ誘発性アポト−シス β−ガラクトシダーゼ発現プラスミド、およびＭＥＫＫコードプラスミドもしくはＢＸＢ−Ｒａｆコードプラスミドを微量注入されたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞とＲＥＦ５２細胞を、上記のＡ節に記載の方法を使用して、処理し、観察した。抗β−Ｇａｌ抗体（１：５００；ＧＩＢＣＯ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手）を使用して、注入された細胞を検出した。図２５を参照すると、ＲＥＦ５２細胞の顕微鏡分析は、ＭＥＫＫタンパク質を発現する細胞は細胞質収縮と核凝結を受け、アポト−シス的細胞死したことを示した。反対に、ＢＸＢ−Ｒａｆタンパク質を発現する細胞は正常な形態を示し、アポト−シスを受けなかった。同様に、図２６を参照すると、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の顕微鏡分析は、ＭＥＫＫタンパク質を発現する細胞は細胞質収縮と核凝結を受け、アポト−シス的細胞死することを示した。反対に、ＢＸＢ−Ｒａｆタンパク質を発現する細胞は正常な形態を示し、アポト−シスを受けなかった。図２７は、実質的な細胞質収縮と核凝結を受けた、ＭＥＫＫタンパク質を発現するＲＦＥ５２細胞の３つの代表的な視野を、ＭＥＫＫを発現しない対照細胞と比較して示す。同様に、図２８は、実質的な細胞質収縮と核凝結を受けた、ＭＥＫＫタンパク質を発現するＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の３つの代表的な視野を、ＭＥＫＫを発現しない対照細胞と比較して示す。このように、ＭＥＫＫタンパク質はアポト−シス的プログラム細胞死を誘発することができ、Ｒａｆタンパク質はできない。実施例２０この実施例は、ＭＥＫＫとＲａｆタンパク質によるＭＡＰＫ活性の調節について記載する。ＣＯＳ細胞を、実施例３に記載の方法を使用して製造した。さらに、ＣＯＳ細胞を、ｐＣＶＭＶ５Ｒａｆ構築物（１μｇ：Ｒａｆ）でトランスフェクトした。ＦＰＬＣＭｏｎｏＱイオン交換カラムフラクションを実施例３に記載の通り製造し、ＭＡＰＫ活性についてＨｅａｓｌｅｙ等，上掲に記載の方法に従って測定した。図２９を参照すると、ＣＯＳ１細胞中でＭＥＫＫとＲａｆが過発現すると、ＭＡＰＫ活性が基礎水準以上の同様な水準まで刺激された。本発明の上記の記載は、説明と記載の目的のために提供されたものである。さらに、本記載は本発明を、本明細書中で開示された形態に限定することを意図していない。従って、変化と改変は上記の教示と同一であり、関連技術の熟練と知識は本発明の範囲内にある。さらに、上記の明細書に記載の好適な態様は、本発明を実施する最良の方法を説明し、そして他の当業者が本発明を、種々の態様でまた本発明の特定の応用または使用に要する種々の改変を用いて、利用できることを意図している。添付の請求の範囲は、従来技術によって許される程度に、代理態様を包含すると解釈されることが意図されている。Detailed Description of the Invention Methods and products for modulating cell responsiveness to external signals TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding a MEKK protein, which is substantially Pure MEKK protein and products that regulate signal transduction in cells. And method. Summary of the invention The present invention is substantially pure, capable of phosphorylating mammalian MEK proteins. For a trendy MEKK protein, the MEKK protein comprises a catalytic domain. The present invention provides a signal originating from the growth factor receptor on the surface of cells, that Substantially pure that can be regulated by regulating the activity of the protein The ability to include and regulate MEKK proteins is associated with Raf protein signal regulation different. In particular, the substantially pure MEKK protein has SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 4, : 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 are encoded. By a nucleic acid capable of hybridizing with a nucleic acid molecule under stringent conditions, Comprising at least part of the encoded amino acid sequence. Substantially pure MEK K protein can regulate the activity of MAPK protein, The quality has an amino acid sequence that differs from the Raf protein. The present invention also includes SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8. And a nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 10, and stringent conditions By a nucleic acid sequence that can hybridize under At least one isolated having at least part of the amino acid sequence encoded by Formulations comprising the identified proteins. One aspect of the invention is to phosphorylate mammalian MEKs independent of Raf proteins. And can regulate the activity of the MAPK protein. Included is an isolated nucleic acid molecule having a sequence encoding a protein. Especially, The present invention includes SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and sequences. Hybridization with a nucleic acid sequence selected from the group consisting of column number: 9 under stringent conditions It includes isolated nucleic acid molecules that can be. Another aspect of the invention is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: : 7 and SEQ ID NO: 9, and hybridizes under stringent conditions A nucleic acid molecule capable of binding to an expression vector operably linked to the expression vector. Include recombinant molecules. Yet another aspect of the invention is a nucleic acid molecule operably linked to an expression vector. A recombinant cell transformed with the recombinant molecule, the nucleic acid molecule comprising Column number: 1, sequence number: 3, sequence number: 5, sequence number: 7 and sequence number: 9 ( That is, from the group consisting of the nucleic acid sequences shown in Table 1, Table 2, Table 3, Table 4 and Table 5) A nucleic acid sequence capable of hybridizing to the selected nucleic acid sequence under stringent conditions Comprising. The present invention also provides a MEKK-dependent pathway relative to the activity of the Raf-dependent pathway in cells. Methods of modulating cellular homeostasis, including modulating the activity of In particular, The method comprises regulating the apoptosis of cells. Such a method is internal medicine It is useful for treating specific diseases. In particular, this method is effective for tumorigenesis and autoimmunity. Useful for suppressing. According to the present invention, a method of treating a disease reduces the activity of a Raf-dependent pathway. Capable of increasing the activity of MEKK-dependent pathway And a therapeutic compound comprising at least one regulatory molecule, including combinations thereof. Comprising administering to the patient an effective amount of a compound, the effective amount being implicated in the disease It comprises an amount to remove harmful cells. The present invention also includes (a) contacting the cell with a putative regulatory molecule; (b) The ability of putative regulatory compounds to regulate the activity of MEKK-dependent pathways in cells is pre-determined. By measuring activation of at least one member of the MEKK-dependent pathway MEKK in a cell identified by a method comprising: Included are therapeutic compounds capable of modulating extant activity. One aspect of the invention includes a substantially pure protein, wherein the protein is Is capable of phosphorylating mammalian MEK proteins, and Raf proteins MEK protein capable of regulating the activity of MAPK protein independent of Is isolated using an antibody capable of selectively binding to a protein, the antibody being (a) Administering to the animal an effective amount of a substantially pure MEKK protein of the invention; (B) recovering an antibody capable of selectively binding to MEKK protein Can be produced by a method comprising: Other embodiments of the invention are capable of selectively binding MEKK proteins. Included is an isolated antibody, which is used in an animal to produce a substantially pure protein of the invention. Capable of administering an effective amount of quality and selectively binding MEKK protein By recovering the antibody Can be manufactured. BACKGROUND OF THE INVENTION Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) (extracellular signal regulation Kinases or ERKs are tyrosine kinases (epidermal growth factors). (Such as the EGF receptor) and growth factor receptors and thrombin receptors Binds to such a heterotrimeric guanine nucleotide-binding protein (G protein) Activated rapidly in response to a ligand bound by both It is. MAPK is a multicellular intracellular system transmitted by various second messengers. Seems to integrate the Gunnar. MAPK is phosphorylated to receive enzyme and EGF Dosage form, Rsk90, phospholipase A₂, C-Myc, c-Jun and Elk It regulates the activity of transcription factors, including -1 / TCF. Receptors that are tyrosine kinases Rapid activation of MAPKs by Ras is dependent on Ras Protein-mediated activation occurs via pathways that are Ras-dependent and independent (independent). Seems to be. By complementation analysis of the pheromone-induced signaling pathway in yeast, Sp k1 and Fus3-Kss1, Schizosac pombe charomyces pombe) and Saccharomyces cerevisiae (Sa cchromyces cerevisiae) Protease that regulates the activity of homologues The inkinase system has been defined (eg, BR Cairns et al., Genes. and Dev. , 6, 1305 (1992); J. Stevenson, etc. , Genes and Dev. , 6, 1293 (1992); A. Nad in-Davis et al., EMBO J .; , 7, 985 (1988); Wang Et al., Mol. Cell. Biol. , 11, 3554 (1991)). S. In S. cerevisiae, the protein kinase Ste7 is upstream of Fus3-Kss1 activity. A regulator, the protein kinase Ste11 regulates Ste7. S. Pong The gene products Byr1 and Byr2 are homologous to Ste7 and Ste11, respectively. M EK (MAPK kinase or ERK kinase) or MKK (MAP kiner The zekinase) enzyme is similar in sequence to Ste7B and yr1. MEKs are MAP Phosphorylates Ks on both tyrosine and threonine residues, which results in MAP K is activated. Mammalian serine-threonine protein kinase Raf is Oxidation activates MEK and activates MAPK. Raf is a growth factor Raf is activated in response to the tyrosine kinase activity of the child receptor and therefore Raf MAPK can be activated in response to stimulation of continuous tyrosine kinases. R The sequence of af is not related to Ste11 and Byr2. Therefore, Raf is a mammal In cells, expansion from the pheromone-responsive protein kinase system defined in yeast You can show a dispersion. Cell- and receptor-specific phases in the regulation of MAPK The differences indicate the existence of other Raf-independent regulators of mammalian MEK. Be inspired. Certain biological functions such as proliferation and differentiation are intracellular signal transduction pathways. Is tightly adjusted by. Signal transduction pathway is the equilibrium steady state of cells It keeps functioning. Disease states disrupt cell signaling and impair cell function. This can happen if the tight controls that are always present are removed. For example, Tumors occur when the regulation of cell growth is disrupted and the clones of cells expand indefinitely. I do. Signal transduction networks regulate many cell functions that depend on the cell type. Because it saves A class of diseases can result from abnormalities in such networks. Rough like cancer Decomposing diseases, autoimmune diseases, allergic reactions, inflammation, neuropathy, and hormonal functions Renal disorders can result from aberrant signaling. There is a long-standing need to understand and discover how to regulate cells involved in various disease states As has been felt, the complexity of signal transduction pathways leads to signal transduction in cells. Preventing the development of products and methods that regulate cell function by manipulating pathways Came. Thus allowing the execution of predictable control of signal transduction in cells, Therefore, products that enable the treatment of various diseases caused by abnormal cellular function The need for methods remains. Brief description of the drawings FIG. 1 is a schematic diagram of vertebrate and yeast signal pathways. Figure 2 is a schematic representation of the MEKK and Raf biphasic pathways that differ from the Ras protein pathway. You. FIG. 3A shows single-stranded 7.8 kb MEKK mR in several cell lines and mouse tissues. A Northern (RNA) blot of NA is shown. FIG. 3B shows a Southern (DNA) blot of the MEKK gene. FIG. 3C shows the expression of 78 and 50 kd MEKKs in a rodent cell line. The noblot is shown. Figure 4 shows MEKK protein immunoprecipitates using MEKK antiserum. Figure 5 shows immunoblot of MEKK protein in immunoprecipitates and cell lysates. You. FIG. 6A shows MAPK in COS cells transfected with MEKK. Shows activation of. FIG. 6B shows MEKK in cells treated with or without EGF. It is an immunoblot showing expression. FIG. 7 shows activation and reactivation of MEK in COS cells transfected with MEKK. Inhibit oxidation. FIG. 8A shows phosphorylation of MEK-1 by MEKK. FIG. 8B shows the time course of phosphorylation of MEK-1 by MEKK expressed in COS cells. Indicates a change. FIG. 8C shows MEKK overexpressed in COS cells. Is an immunoblot of. FIG. 9A shows phosphorylation of MAPK by activated MEK-1. FIG. 9B shows phosphorylation of MEK-1 by immunoprecipitated MEKK. FIG. 10A shows phosphorylation of MEK-1 by activated Raf. FIG. 10B shows COS cells overexpressing MEKK and treated with EGF. The phosphorylation state of Raf isolated from the vesicle is shown. In FIG. 11, immunoprecipitated MEKK and Raf-B were kinase-inactive MEK-. The relative ability to phosphorylate 1 is shown. FIG. 12 shows the time course of EGF-stimulated MEKK and Raf-B activity. FIG. 13 shows that immunosuppression of Raf-B from MEKK immunoprecipitates resulted in MEKK activity. Indicates that there is no effect. FIG. 14 shows that immunosuppression of Raf-B from MEKK immunoprecipitates shows Raf-B activity. Is shown to decrease. FIG. 15 is an FPLC mono Q ion exchange column fraction of PC12 cell lysate The MEKK activity in the fraction is shown. FIG. 16 shows dominant negative N¹⁷Inhibition of MEKK and Raf-B activity by RAS expression Show. FIG. 17 shows activation of MEK protein by 98 kD MEKK. FIG. 18 shows the inhibition of EGF activation of MEKK by forskolin. FIG. 19 shows a truncated MEKK molecule that has been truncated. Shows improved MEKK activity. FIG. 20 shows JNK activation by MEKK protein. FIG. 21. c-Myc regulated transcription and CREB regulation by MEKK protein. It shows the regulation of transcription. FIG. 22 is a schematic of MEKK regulation of c-Myc regulated transcription. FIG. 23 shows induction of p38MAPK phosphorylation by MEKK3. FIG. 24 shows Swiss3T3 by beauvericin. And induction of apoptosis in REF52 cells. FIG. 25 shows the induction of apoptosis by MEKK in REF52 cells. FIG. 26 shows MEKK-mediated apoptosis in Swiss3T3 and REF52 cells. Shows the induction of. FIG. 27 shows apoptotic REF52 cells expressing MEKK protein. Figure 3 shows three representative micrographs. FIG. 28. Apoptotic Swiss3T expressing MEKK protein. Shown are three representative micrographs of 3 cells. FIG. 29 shows similar MAPK activity by MEKK and Raf proteins. Indicates irritation. Detailed description of the invention The present invention is a novel mitogen capable of regulating signal transduction in cells. ERK kinase kinase protein (MEKK). The present invention relates to A novel method of treating by modulating the activity of cells involved in such diseases Include. The present invention provides that the novel products and methods of the present invention possess apoptosis. It is particularly advantageous in that it can regulate the signaling that can occur. One aspect of the invention is an isolated MEKK protein. According to the present invention , The isolated protein is a protein removed from its natural environment. example For example, the isolated MEKK protein can be obtained from its natural source or can be recombinant It can be manufactured using DNA technology or chemically synthesized. As used herein, an isolated MEKK protein lacks amino acids. Loss (eg, truncated variants of proteins, such as peptides), insertions, reversals , Substitution and / or derivatization (eg glycosylation, phosphorylation, acetylation , Myristoylated, prenylated, parimitoylated, amidated and / or glycated MEKK protein made by addition of cosylphosphatidylinositol) A full-length MEKK protein or a homology of either such protein, such as And the modified protein is a mitogen ERK kinase (MEK ) And / or Jun ERK kinase (JEK) can be phosphorylated . A homologue of the MEKK protein is a nucleic acid sequence encoding this homologue However, the nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of the MEKK protein (ie, And) to the extent that they can hybridize under stringent conditions. Quality A protein having an amino acid sequence similar to the amino acid sequence. This specification Stringent hybridization conditions, as used in Nucleic acid molecules containing oligonucleotides are used to identify similar nucleic acid molecules. Standard hybridization conditions. Such standard conditions are, for example, Samb Brook et al., Molecular Cloning: Experimental Procedures (Molecular Cloni ng: A Laboratory Manual), Cold Spring It is disclosed in Harbor Labs Press, 1989. MEKK A homologue of a protein is also a MEKK protein in which the homologue is a naturally occurring MEKK protein. To the extent that it has the ability to elicit an immune response against at least one epitope of , Proteins having amino acid sequences that are cross-reactive. The minimum size of the protein homologues of the present invention is that which encodes the corresponding native protein. Can form stable hybrids with the complementary sequences of the nucleic acid molecule It is large enough to be encoded by a nucleic acid molecule. In this way, such a tamper The size of the nucleic acid molecule encoding the protein homologue is The percent homology with the sequence as well as the hybridization conditions themselves (eg, Temperature, salt concentration and formamide concentration). Minimum of such nucleic acid molecule Is typically at least about 12 to about 15 nucleotides when the nucleic acid molecule is GC-rich. At least about 15 to about 17 cleotides long and AT-rich Is the length of the base. Thus encoding a MEKK protein homologue of the invention The minimum size of the nucleic acid molecule used to generate is about 12 to about 18 nucleosides. It is the length of chid. The maximum size of such a nucleic acid molecule For example, a nucleic acid molecule is a part of a gene, a whole gene, or a synonymous gene, or There are no restrictions other than the practical restriction that some of them may be included. same Thus, the minimum size of the MEKK protein homologues of the invention is about 4 to about 6 nucleotides. The length of the mino acid, the preferred size is the full-length, multivalent protein (ie A fusion protein having the above domains and each domain having a function) is desired. Or a functional part of such a protein is desired. The MEKK protein homologue is a naturally occurring gene encoding the MEKK protein. It can be the result of an allelic variation in the offspring. Natural genes are the most natural Refers to the form of a gene often found. The MEKK protein homologue Genes encoding proteins include, but are not limited to, randomized or Direct modification using classical or recombinant DNA technology with targeted mutagenesis Can be manufactured using techniques known in the art, including: MEKK Ability of protein homologs to phosphorylate MEKK and / or JEK proteins Force can be tested using techniques known to those skilled in the art. As such technology The phosphorylation measurement method described in detail in Examples is included. In one aspect, the MEKK proteins of the invention regulate MEKK-dependent pathways. Can be According to the present invention, MEKK-dependent pathways are generally MEKK A pathway in which the protein regulates a pathway substantially independent of Raf, and M Pathway in which EKK protein regulation involves Raf proteins, especially MEK proteins Refers to routes that focus on common members of the (see Figure 2). Appropriate MEKK dependence Pathways include MEKK and JEK proteins, but Raf proteins Routes that do not include No. Those skilled in the art will appreciate that regulation of the pathway by the MEKK protein is Raf protein. The fact that MEKK and Raf proteins are substantially independent of quality The ability to regulate phosphorylation of members downstream of such pathways has been demonstrated in, eg, Example 16. It can be determined by comparison using the general method described. M A member of the pathway in which the EKK protein is downstream of MEKK (eg, JEK, JNK , Jun and / or ATF-2). If the protein induces a significantly greater amount than the Proteins regulate pathways that are substantially independent of Raf proteins. For example , Induction of MEKK phosphorylation of JNK is induced when Raf protein is used Preferably at least about 10 times, more preferably at least about 10 times About 20-fold, and even more preferably at least about 30-fold larger JNK protein It is phosphorylation. Induction of phosphorylation by MEKK leads to induction of phosphorylation by Raf protein If similar, one of skill in the art would appreciate that regulation of the pathway by the MEKK protein would result in Raf tag It can be concluded that it includes members of the signaling pathway that could also include proteins it can. For example, MEKK induction of phosphorylation of MAPK is due to Raf protein. The size of the phosphorylation is about the same as the induction of phosphorylation. "Raf-dependent pathway" means that Raf protein is carried out from MEKK protein. Signaling pathway that regulates a signaling pathway that is physically independent, and Raf A pathway in which protein regulation concentrates on a common member of the pathway involving MEKK proteins Can be said. MEKK protein of regulation of pathway by Raf protein Independence from regulation of pathways by quality is used to determine MEKK independence. Using a method similar to Can be determined. In other aspects, the MEKK protein includes, but is not limited to, mitogens. ERK kinase (MEK), mitogen-activated protein kinase (MAPK ), Transcription factor (TCF), Ets-like-1 transcription factor (Elk-1), Jun ERK Kinase (JEK), Jun Kinase (JUK), Stress Activated MAP K protein, Jun, activating transcription factor-2 (ATF-2) and / or My The activity of signaling proteins, including the c protein, can be regulated. As used herein, the "activity" of a protein is the phosphorylation of the protein. A condition and / or the ability of a protein to perform a particular function (eg, another protein Phosphorylation of quality or regulation of transcription). Departure As a preferred MEK protein regulated by the bright MEKK protein, M EK-1 and / or MEK-2. MEKK protein of the present invention Suitable MAPK proteins regulated by p38MAPK, p42 MAPK and / or p44 MAPK. p38MAPK protein As a suitable MEKK protein capable of phosphorylating protein, SEQ ID NO: 5 The protein encoded by the nucleic acid sequence represented by A protein having an amino acid sequence represented by No. 7 is more preferable. Suitable stress activated MAPKs regulated by the MEKK protein of the present invention As proteins, Jun kinase (JNk), stress-activated MAPK-α and And / or stress activated MAPK-β. MEKK tongue of the present invention The protein activates the activity of the MEK protein at the basal level of MEK (ie, without stimulation). Increase above the level found in nature) Can be done. For example, the MEKK protein is preferably described in Example 9. When measured under the conditions of, at least about twice the basal level, and more preferably less Both about 3 times, and even more preferably at least about 4 times the MEK protein Phosphorylation can be increased. The preferred MEKK proteins of the present invention also show the activity of MAPK proteins in MA Increase above the basal level of PK (ie the level found in nature unstimulated) Can be For example, the MEKK protein of the present invention is preferably used in Example 3. At least about twice the basal level of activity when measured under the conditions described, more preferred At least about 3 times, and even more preferably at least about 4 times, MAPK The activity can be increased. Furthermore, the MEKK protein of the present invention increases the activity of JNK protein be able to. JNK is like T cells, neutral cells or fibroblasts Transcription factor J, which is involved in regulating the proliferation and differentiation of various cell types Regulates the activity of UN. JNK shows structural and regulatory homology with MAPK. For example, the MEKK proteins of the invention are preferably prepared under the conditions described in Example 16. When measured, it is at least about 30 times, more preferably less than Raf. At least about 40 times, and even more preferably at least about 50 times J than Raf, J It can induce phosphorylation of NK proteins. A preferred MEKK protein of the invention is additionally a phosphorylated transcriptional transcript of c-Myc. Those whose lance activation domain can regulate gene transcription Of c-Myc transcriptional transactivation domain proteins by Can be triggered. MEK protein Regulate phosphorylation of the c-Myc transcriptional transactivation domain protein. Raf protein or cyclic AMP-dependent protein kinase Beyond the ability to regulate the c-Myc protein. For example, the MEKK tank of the present invention Protein quality is preferably less than Raf when measured under the conditions described in Example 17. At least about 25 times, more preferably at least about 35 times, and even more preferably less. Phosphorylated c-Myc transcription transactivation domain It is possible to induce luciferase gene transcription by an in protein. Another aspect of the invention is that MEKK activity is not limited to, but is not limited to Offspring (EGF), nerve growth factor (NGF), tumor necrosis factor (TNF), C5A, a Interleukin-8 (IL-8), monocyte chemotactic protein 1 (MIP1α), monocyte Sphere chemoattractant protein 1 (MCP-1), platelet activating factor (PAF), N-ho Rumil-methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP), leukotrier B_Four(LTB_FourR), gastrin-releasing peptide (GRP), IgE, suitable for major tissues Compatible protein (MHC), peptide, superantigen, antigen, vasopressin, thrombi Ability to be stimulated by growth factors, including insulin, bradykinin and acetylcholine About. Furthermore, the activity of the MEKK protein of the present invention has a TPA-like activity. It can be stimulated by compounds containing ball esters. Suitable MEKK Proteins are also stimulated by EGF, NGF and TNF (particularly TNFα) Can be done. Suitably, the activity of the MEKK protein of the present invention is such that it produces a MEKK protein. When the cells to be contacted with EGF under the conditions described in Example 3, basal levels (ie, At least of the levels found in nature without being stimulated) 2 times, more preferably at least about 4 times the base level, even more preferably the base It can be stimulated to at least about 6 times the level. Similarly, the activity of a MEKK protein of the invention produces a MEKK protein. When the cells to be contacted with NGF under the conditions described in Example 9, a basal level of 1 times, more preferably at least about 2 times the base level, and even more preferably the base level. It can be stimulated by NGF stimulation to at least about 3 times the core level. Suitably, the MEKK protein of the invention is a protein producing MEKK protein. When the cells are contacted with TPA under the conditions described in Example 9, a basal level of at least 0 . 5 times, more preferably at least about 1 times the base level, and even more preferably the base level. It can be stimulated by TPA stimulation to at least about twice the core level. TPFs can regulate cell death and other functions in various cell types. it can. The present invention proposes that MEKK stimulation by TNF is independent of Raf. I saw it. Similarly, the present invention provides that the MEKK proteins are V) can be directly stimulated by injury, while the Raf-dependent pathway is stimulated It is the first to recognize that it cannot be done. Therefore, of TNF and UV Both stimulate MEKK activity without substantially activating Raf. Further Moreover, the UV and TNF activities of MEKK are Ras-dependent. Another aspect of the invention is that the MEKK protein of the invention regulates cell apoptosis. That this ability is not shared by the Raf protein. Knowledge. As used herein, apoptosis refers to the completion of cytoplasmic organelles. Progressive regression of cell volume while preserving integrity Condensation of chromatin observed by light or electron microscopy; and centrifugal sedimentation analysis Refers to a form of cell death comprising DNA breaks as determined by the method. Complete cell membrane Cell death occurs when integrity is lost and cell lysis occurs. Apoptosis is It differs from necrosis in that cells swell and eventually burst. Suitable MEKK proteins of the present invention are shown in cells of Figures 24, 25, 26, 27. And 28 with features substantially similar to cytoplasmic regression and / or nuclear condensation. As has, it is possible to induce apoptosis of cells. 24-28 Apoptosis was carried out by introducing an expression plasmid encoding MEKK protein into cells. It was obtained by microinjection. The injected cells used anti-β-Gal antibody And the cellular DNA was stained with propidium iodide. Cytoplasmic group Weaves were monitored using anti-tubulin antibody. Then, differential fluorescence image microscopy By inspection, cells were imaged using industry standard techniques. Cell is cytoplasm Apoptosis was indicated by showing a morphology with retraction and nuclear condensation. A schematic of the cell growth regulatory signaling pathway that is MEKK-dependent is shown in FIG. Book MEKK protein of the invention includes JEK protein, JNK protein, and Jun protein. Protein and / or ATF-2 and Myc protein activity Can be regulated, and such regulation is substantially (not completely) from the Raf protein. Independent). Such Raf-independent regulation involves cellular apoptosis. The growth characteristics of cells can be regulated. Furthermore, the MEKK protein of the present invention Can regulate the activity of MEK protein, which is also Raf protein Can be adjusted by quality. Thus, the MEKK protein of the present invention Is a MAPK protein and a TCF protein (also referred to as Elk-1 protein). Regulate the activity of members of the Ets family of transcription factors, such as Can be. Referring to FIG. 2, the MEKK protein of the present invention activates Ras protein. It can be activated by many types of growth factors that can be activated. Further In addition, the MEKK protein can activate the JNK protein, which is It is also activated by Ras protein but not by Raf protein. Not sexualized. As described above, the MEKK protein of the present invention receives various cell surface receptors. Contains a protein kinase at a branch point in the signaling pathway initiated by the body It consists of The MEKK protein is also a TNF protein that is independent of Raf. The MEKK protein can be regulated by the Ras protein. Associated with a novel signaling pathway that is independent of quality and Raf protein It is shown that. In this way, one or more MEKK proteins are Raf protein independent or bypassed in the above signaling pathway It is capable of performing numerous unique functions. MEKK protein has MEK activity and And / or JEK activity can be regulated. In this way, MEKK Tampa Regulates the activity of members of the signaling pathway that are substantially free of Raf activity can do. Such members include, but are not limited to, JNK, J Un, ATF and Myc proteins. In addition, MEKK protein Quality can regulate members of signaling pathways, including Raf, and Members include, but are not limited to, MEK, MAPK and TCF. It is. Therefore, the MEKK protein of the present invention is Raf Regulates cellular apoptosis independent of prominent protein involvement Can be. In addition to the numerous functional characteristics of MEKK proteins, the MEKK proteins of the invention Comprises a number of unique structural features. For example, in one aspect, the M of the present invention The EKK protein is composed of two distinct structural domains with specific functional characteristics. At least one is included. Such structural domains include MEK proteins and / or COOH-terminal protein kinase catalyst capable of phosphorylating JEK or JEK NH, which acts to regulate secondary structural domains, including domains₂End control Included. According to the invention, the MEKK protein of the invention is a full-length MEKK protein. And a MEKK protein capable of performing at least one of the above functions At least part of the quality involved. The phrase "at least part of a MEKK protein" means The nucleic acid encoding the full-length MEKK protein of the present invention is MEKK protein encoded by a nucleic acid molecule capable of bridging Say some of the quality. A suitable portion of the MEKK protein regulates apoptosis in cells. Useful to save. Additional suitable moieties regulate MEKK kinase activity It has a useful activity in The suitable size for a part of the MEKK protein of the present invention is , As described for the MEKK protein homologues of the present invention. In another aspect, the MEKK protein of the invention is tris-glycine SDS-P. By AGE, preferably 8% polyacrylamide SDS gel (SDS-PAG Approximately 70 kD, determined using E) and resolved using standard techniques in the art. To at least a portion of a MEKK protein having a molecular weight in the range of about 250 kD including. Suitable MEKK protein Is in the range of about 75 kD to about 225 kD, more preferably about 80 kD to about 200 kD. It has a molecular weight within the range. In yet another aspect, the MEKK proteins of the present invention have from about 3.5 kD to about 12 kD. . In the range of 0 kD, more preferably in the range of about 4.0 kD to about 11.0 kD, More preferably, mRNA (message within the range of about 4.5 kD to about 10.0 kD) At least part of the MEKK protein encoded by Comprising. A particularly preferred MEKK protein is about 4.5 kD to about 5.0 kD In the range of about 6.0 kD to about 6.5 kD, in the range of about 7.0 kD Or a mR having a size within the range of about 8.0 kD to about 10.0 kD It comprises at least part of the MEKK protein encoded by NA. In another aspect, the NH of the present invention₂The terminal regulatory domain is at least about 10% serine. About 400 amino acids having amino acid and / or threonine residues, more preferably Is about 400 with at least about 15% serine and / or threonine residues Amino acids, even more preferably at least about 20% serine and / or su NH comprising about 400 amino acids with leonine residues₂Including the end. Preferred NH of the present invention₂The terminal regulatory domain is at least about 10% serine and About 360 amino acids having // threonine residues, more preferably less About 360 amino with about 15% serine and / or threonine residues Acid, even more preferably at least about 20% serine and / or threonine NH comprising about 360 amino acids with residues₂Including the end. Other suitable NH of the present invention₂Terminal regulatory domain is at least about 10% Approximately 370 amino acids with serine and / or threonine residues, more preferred Suitably about 37 with at least about 15% serine and / or threonine residues 0 amino acids, even more preferably at least about 20% serine and / or Is an NH comprising about 370 amino acids with threonine residues₂Including the end . In one aspect, the MEKK proteins of the invention lack SH2 and SH3 domains. I am. In another aspect, the MEKK protein of the invention is a naturally occurring MEKK protein. A protein kinase catalytic domain, preferably at least about 50%, more preferably Is at least about 75%, and even more preferably at least about 85% amino acid phase Fewer MEKK protein homologs with homology (identity within comparable regions) At least some. Other MEKK proteins of the invention are also naturally occurring M NH of EKK protein₂A terminal regulatory domain, and at least about 10%, more preferably Suitably at least about 20%, and even more preferably at least about 30% amino. It comprises at least a portion of the MEKK homologues of the present invention having acid homology. The sequence containing the catalytic domain of the MEKK protein has a phosphotransferase activity. It is implicated in sex and therefore exhibits a relatively conserved amino acid sequence. But MEK NH of K protein₂The terminal regulatory domain can be substantially diffusive. MEKK protein NH₂Lack of significant homology between terminal regulatory domains , That each of these domains is regulated by various upstream regulatory proteins Is related to For example, the MEKK protein is regulated by the protein Ras Others can be regulated independently of Ras . further, Some MEKK proteins can be regulated by the growth factor TNFα , While others can't. Thus, NH of MEKK protein₂End regulation The domain confers selectivity to upstream signaling regulation, while the catalytic domain is MEK. Provides the K substrate selectivity function. Suitable MEKK homologues are SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, sequence MEKK having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 At least about 50%, more preferably less than the kinase catalytic domain of a protein. At least about 75%, and even more preferably at least about 85% amino acid homology Having. Other suitable MEKK homologs are SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: No .: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 MEKK protein NH₂A terminal regulatory domain, at least about 10% More preferably at least about 20%, and even more preferably at least about 30%. Has amino acid homology. In a preferred embodiment, the MEKK protein of the present invention is a quinacyl of MEKK protein. A nucleic acid molecule encoding the enzyme catalytic domain and at least about 50%, more preferably Suitably at least about 75%, and even more preferred at least about 85% homology. Of a MEKK protein homologue of the invention encoded by a nucleic acid molecule having Including at least a part. Other suitable MEKK protein homologs are MEKK proteins. Quality NH₂A nucleic acid molecule encoding a terminal regulatory domain and at least about 1 0%, more preferably at least about 20%, even more preferably at least about It is encoded by a nucleic acid molecule with 30% homology. Still other suitable MEKK homologs are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, Depending on the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9. A kinase catalytic domain of a MEKK protein encoded by 50%, more preferably at least about 75%, and even more preferably at least It is encoded by a nucleic acid molecule having about 85% homology. The MEKK homolog is also , SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: NH of the MEKK protein encoded by the nucleic acid sequence represented by 9₂ A terminal regulatory domain, at least about 10%, more preferably at least about 20% , Even more preferably by a nucleic acid molecule having at least about 30% homology. Including those that have been read. The MEKK protein of the invention, designated MEKK1, is shown in Table 1 and The small nucleic acid and / or amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. Includes MEKK proteins having (ie, containing) at least a portion. The MEKK protein of the invention, designated MEKK2, is shown in Table 2 and The small nucleic acid and / or amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively. MEKK proteins having at least a portion are included. The MEKK protein of the invention, designated MEKK3, is shown in Table 3 and The small nucleic acid and / or amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively. MEKK proteins having at least a portion are included. MEKK proteins of the invention are shown in Table 4 and are SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: : At least a part of the nucleic acid and / or amino acid sequence represented by 8 respectively It may include the MEKK protein and is referred to as MEKK4. The MEKK protein of the invention, designated MEKK5, is shown in Table 5 and Of the nucleic acid and / or amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, respectively. Includes MEKK proteins having at least a portion. MEKK5 represents a splice variant of MEKK4. Underlined sequences shown in Table 5 Indicates the splice insertion. Compared to the amino acid sequence of MEKK1, the amino acid sequence of MEKK2 and MEKK3 The columns are shown in Table 6. Bold amino-terminal-regulatory domainUnderlined sequence-Regulatory hinge sequence Bold italics-catalytic domain Table 7 compares the kinase domains of MEKK1, MEKK2 and MEKK3 The amino acid sequence of the kinase domain of MEKK4 is shown. The above SEQ ID NOs represent the sequences deduced according to the methods described in the examples. Nucleic acid And because amino acid sequencing techniques are not completely error-free, The column numbers are at best the apparent nucleic acid sequence and the amino acid sequence of the MEKK protein of the invention. It should be noted that it represents the no acid sequence. According to the present invention, the MEKK protein of the present invention is a MEK that has undergone post-transcriptional modification. A K protein can be included. Such modifications include, for example, glycosylation ( For example, addition of N-linked and / or O-linked oligosaccharides) or post-transcriptional conformation A locus change or a post-transcriptional deletion can be mentioned. Another aspect of the invention is a MEKK encoding a MEKK protein of the invention. Isolated that can hybridize to the protein gene under stringent conditions Nucleic acid molecule. According to the present invention, an isolated nucleic acid molecule is removed from its natural environment. A nucleic acid molecule that has been modified (ie, has undergone human manipulation). Thus, "isolated "Does not reflect the degree to which the nucleic acid molecule was purified. As an isolated nucleic acid molecule, Mention may be made of DNA, RNA or derivatives of DNA or RNA. An isolated nucleic acid molecule of the present invention can be derived from its natural source, including whole (ie, complete) genes. Or part of them that can form stable hybrids with the gene. Can be obtained. As used herein, The phrase "at least a part of" an entity means at least 10 to have a functional aspect of the entity. Says the amount of an entity that is minutes. For example, at least a portion of a nucleic acid sequence is used herein. And a specific desired gene (eg, MEKK gene), as used. The amount of nucleic acid sequence capable of forming a stable hybrid under lid forming conditions is there. The isolated nucleic acid molecule of the present invention also includes recombinant DNA technology (polymerase sequence). Chain reaction (PCR) amplification, cloning) or chemical synthesis Can be. Isolated MEKK protein nucleic acid molecules are not limited to these However, naturally occurring allelic variants, and such modifications are MEKK proteins of the invention. Or a stable nucleic acid molecule that is stable under stringent conditions with the natural nucleic acid molecule isolate of MEKK. Insertion of nucleotides in a manner that does not interfere with the ability of the nucleic acid to form the brid Nucleic acid molecules, including modified, deleted, substituted, and / or transposed modified nucleic acid molecules And their homologues. Suitable modifications to the MEKK protein nucleic acid molecule of the present invention include, for example: At least a portion of the MEKK protein nucleic acid molecule encoding the node domain is deleted. To produce a constitutively active MEKK protein (example shown in Table 6) At least a portion of a MEKK protein nucleic acid molecule encoding a catalytic domain To create an inactive MEKK protein (examples shown in Table 6); Cleaving a full-length MEKK protein nucleic acid molecule, and MEKK Modify proteins to achieve desired inactivation and / or stimulation of proteins In a catalytic domain (ie, a phosphotransferase domain) The methionine residue replaces the codon encoding the lysine residue of Is inactivated. A preferred cleaved MEKK nucleic acid molecule contains a catalytic domain, but contains regulatory domains. It encodes a form of the MEKK protein that lacks the inn. Preferred catalytic domain The cleaved MEKK nucleic acid molecule is from about 352 to about 672 of MEKK 1, from MEKK 2. About 352 to about 619, about 358 to about 626 of MEKK 3, about 8 of MEKK 4. 11 to about 1195, or about residues 863 to 1247 of MEKK 5 are encoded. I do. Other cleaved suitable MEKK nucleic acid molecules are NH₂Including the terminal regulatory domain , Encodes a form of MEKK protein lacking the catalytic domain. Suitable adjustment The domain cleaved MEKK nucleic acid molecule is from about 1 to about 369 of MEKK 1, MEKK. 2 from about 1 to about 335, MEKK 3 from about 1 to about 360, MEKK 4 from about 1 to about 825, or residues from about 1 to about 875 of MEKK 5, which encode a regulatory domain. Is removed to form a truncated MEKK molecule. The isolated nucleic acid molecule of the invention comprises at least one MEKK protein of the invention. Examples of such proteins, including nucleic acid sequences that encode quality, are disclosed herein. I have. The phrase "nucleic acid molecule" primarily refers to physical nucleic acid molecules, and the phrase "nucleic acid molecule" A "sequence" primarily refers to a sequence of nucleotides that comprises a nucleic acid molecule Phrases can be used interchangeably. As disclosed above, the ME of the present invention KK proteins include, but are not limited to, full-length MEKK protein co-proteins. Having a coding region, parts thereof, and other MEKK protein phases The same body is mentioned. As used herein, the MEKK protein gene is the gene Including, but not limited to, transcriptional, translational or post-transcriptional control regions. And the production of MEKK protein encoded by the coding region itself. All those associated with the native MEKK protein gene, such as the regulatory regions that regulate Contains nucleic acid sequences. The nucleic acid molecule of the present invention is an isolated natural MEKK protein nucleic acid. It can be a molecule or a homologue thereof. The nucleic acid molecule of the present invention is May have additional regulatory regions, full length or partial coding regions, or combinations thereof. Can be included. The minimum size of the MEKK protein nucleic acid molecule of the present invention is Forms stable hybrids under stringent hybridization conditions with the corresponding native gene It is the smallest size that can be done. MEKK protein nucleic acid molecule homologues can be derived from numerous methods known to those of skill in the art (eg, Sambrook et al., Supra). For example, nucleic acid Offspring include, but are not limited to, site-directed mutagenesis, mutagenesis Chemical treatment of nucleic acid molecules for restriction enzyme digestion of nucleic acid fragments, selection of nucleic acid sequences Region polymerase chain reaction (PCR) amplification and / or mutagenesis, orientation Mixtures for "synthesizing" mixtures of gonucleotide mixtures and mixtures of nucleic acid molecules Mutagenesis techniques and recombinant D, such as ligation of DNA and combinations thereof. Modifications can be made using a wide variety of techniques, including NA techniques. Nucleic acid molecule homolog Refers to the function (homology) of the protein encoded by the nucleic acid from the mixture of modified nucleic acids. The ability of the body to phosphorylate MEK or JEK proteins) MEKK protein isolated by cleaning and / or isolated Can be selected by hybridizing with nucleic acid under stringent conditions You. One aspect of the invention is the use of the MEKK protein as described herein. A MEKK protein nucleic acid molecule capable of encoding at least part of the quality, or Or its homologue. Suitable nucleic acid molecules of the present invention include, but are not limited to, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 1 Encodes a protein having at least part of the amino acid sequence represented by 0 Nucleic acid molecule, or a homologue thereof. Preferred nucleic acid molecules of the invention encode at least a portion of a MEKK protein. Nucleic acid, or a homologue thereof, which is capable of hybridizing under stringent conditions. . A corresponding region of the nucleic acid sequence encoding the catalytic domain of the MEKK protein, At least about 50%, preferably at least about 75%, more preferably at least A MEKK protein nucleic acid molecule comprising a nucleic acid sequence having about 85% homology, or Homologs of are also suitable. MEKK protein NH₂Code for the terminal regulatory domain The corresponding region of the nucleic acid sequence being at least about 20%, preferably at least about 3%. MEK comprising nucleic acid sequences having 0%, more preferably at least about 40% homology K protein nucleic acid molecules, or homologues thereof, are also suitable. Particularly preferred nucleic acids The sequences are: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and the sequence Nucleic acid encoding the catalytic domain of the amino acid sequence represented by No. 10 Sequences and at least about 50%, preferably at least about 75%, and more preferably less. It is a nucleic acid sequence having at least about 85% homology. Other particularly preferred nucleic acid sequences are , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: NH of the amino acid sequence represented by 10₂Encodes the terminal regulatory domain Nucleic acid sequences and at least about 20%, preferably at least about 30%, more preferably Is a nucleic acid sequence having at least about 40% homology. Such nucleic acid molecules can be full length proteins, hybrid proteins, fusion proteins. Full-length gene encoding a protein, a multivalent protein or a truncated fragment And / or it can be a nucleic acid molecule. Further preferred nucleic acid molecules of the present invention are , SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: Comprising an isolated nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence represented by 9. By knowing the nucleic acid molecule of the MEKK protein of the present invention, one skilled in the art Making copies of nucleic acid molecules, as well as MEKK protein-encoding genes (eg, For example, a nucleus containing a translation start site and / or a transcriptional and / or translational control region. Acid molecule) and / or MEKK protein nucleic acid molecule homologue Become. By knowing a part of the amino acid sequence of the MEKK protein of the present invention, Those skilled in the art will be able to clone nucleic acid sequences encoding such MEKK proteins. It becomes possible to do. The present invention also encodes at least a portion of a MEKK protein of the present invention. Hybridizes under stringent conditions with the complementary regions of other (preferably long) nucleic acid molecules A nucleic acid molecule that is an oligonucleotide capable of Include. Suitable oligonucleotides are SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: No .: 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 Nucleic acid molecules, which can encode a portion if not at all, or homologs thereof, It can hybridize under reduced conditions. More suitable oligonucleoti Denotes SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: issue: A nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence represented by 9 or their complements and hives The lid can be formed. The oligonucleotide of the present invention is RNA, DNA or a derivative thereof. Can be The minimum size of such an oligonucleotide is certain A stable high-strength sequence between the lygonucleotide and complementary sequences on other nucleic acid molecules of the invention. It is the size necessary to form the brid. The smallest size property is described in this specification. Is disclosed in. The size of the oligonucleotide also depends on the size of the oligonucleotide according to the invention. It must be sufficient to use the nucleotides. Oligonu of the present invention Cleotide can be, but is not limited to, a probe that identifies additional nucleic acid molecules. As a primer for amplifying or extending a nucleic acid molecule, or for example in a cell In therapeutic applications that inhibit the expression of MEKK protein by Can be used in applications. Such therapeutic applications include, for example, antisense S-, triplex-forming, ribozyme- and / or RNA drug-based Technology, including the use of such oligonucleotides. Therefore, the present invention Interfere with the use of such oligonucleotides and the production of MEKK proteins Including methods. In one aspect, the isolated MEKK protein of the invention is Cultivate this protein under conditions effective to produce and recover the protein By doing so, it can be manufactured. Suitable cells to culture are MEK A recombinant cell capable of expressing a K protein, the recombinant cell comprising: Produced by transforming a host cell with one or more nucleic acid molecules of the invention. Can be built. Transformation of a nucleic acid molecule into a cell inserts the nucleic acid molecule into the cell can do Can be done by any method. Transformation techniques include, but are not limited to: , Transfection, electroporation, microinjection, lipofexi And adsorption method, and protoplast fusion method. Recombinant cells are single cells It can remain in the cell or grow into a tissue, organ or multicellular organism. The transformed nucleic acid molecule of the present invention either remains extrachromosomal or is transformed. Expressed in one or more sites within the chromosome of the (ie, recombinant) cell It can be integrated in a way that capacity is retained. The present invention inserts into a vector capable of delivering a nucleic acid molecule into a host cell. A recombinant vector comprising at least one MEKK protein nucleic acid molecule of the present invention Including tar. Such a vector may be a heterologous nucleic acid sequence, eg, of the invention in nature. Contains a nucleic acid sequence that is not found adjacent to the MEKK protein nucleic acid molecule. Vek Is either RNA or DNA, and either prokaryotic or eukaryotic. And is usually a virus or plasmid. Recombinant vector , Sequencing, and / or other MEKK protein nucleic acid molecules of the invention Can be used to operate. One type of recombinant vector (recombinant herein) ), And described in detail below), are used to express the nucleic acid molecules of the invention. Used. Suitable recombinant vectors are capable of replicating in transformed cells. Suitable nucleic acid molecules to be inserted into the recombinant vector include a small amount of MEKK protein. Nucleic acid molecules encoding at least a portion, or homologues thereof are included. Recombinant Further suitable nucleic acid molecules to be inserted into the vector include SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and / or Or encodes at least part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10. Nucleic acid molecules, or homologues thereof. Inserted into the recombinant vector Even more preferred nucleic acid molecules are: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: : 5, SEQ ID NO: 7 and / or SEQ ID NO: 9, or Or their complements. Suitable host cells for transforming cells are at least one nucleic acid component of the invention. Capable of producing the MEKK molecule of the present invention after being transformed with the offspring. Any cell can be included. The host cell can be an untransformed cell, or a It can be a cell that has been transformed with at least one nucleic acid molecule. Suitable host cells of the invention include bacteria, fungi (including yeast), insects, animals and Mention may be made of plant cells. Suitable host cells include bacteria, yeast, insects and And mammalian cells, with mammalian cells being particularly preferred. Recombinant cells are preferably host cells, each containing one or more transcriptional regulators. One or more of the invention operatively linked to an expression vector containing a control sequence. Transforming with one or more recombinant molecules comprising a nucleic acid molecule of Manufactured by The phrase operatively linked means that the vector is transformed into a host cell. The nucleic acid molecule in such a way that the nucleic acid molecule can be expressed when Saying to insert into the actor. As used herein, an expression vector Can transform host cells and direct the expression of specific nucleic acid molecules Is a DNA or RNA vector. Suitably, the expression vector It can also replicate in host cells. Expression vectors are either prokaryotic or eukaryotic. No, and usually it is a virus or plasmid. Book The expression vector of the invention can be used in bacterial, fungal, insect, animal and / or plant cells. Including those that act in the recombinant cells of the invention (ie, direct gene expression) Both vectors are included. Thus, the nucleic acid molecule of the present invention is a promoter , Operators, repressors, enhancers, stop sequences, origins of replication, and Other regulatory elements that are compatible with the recombinant cells and control the expression of the nucleic acid molecules of the invention. It can be operably linked to an expression vector containing regulatory sequences such as sequences. This specification As used in the book, transcriptional control sequences control the initiation, extension, and termination of transcription. The sequences that can be included are included. Particularly important transcription control sequences are promoters, Controls transcription initiation, such as enhancer, operator and repressor sequences Things. Suitable transcription control sequences include at least one recombinant cell of the invention. Included are any transcription control sequences that are capable of acting within. Various Such transcription control sequences are known to those of skill in the art. As a suitable transcription control sequence, Although not limited to these, tac, lac, trp, trc, oxy-pro, omp / lpp, rrnB, bacteriophage lander (λ) (λ_PLAnd λ_PRKao A fusion containing a luciferase promoter, bacteriophage T7, T7lac, Bacteriophage T3, Bacteriophage SP6, Bacteriophage SP 01, metallothionein, alpha mating factor, baculovirus, vaccinia Illus, herpesvirus, poxvirus, adenovirus, simianui Ruth 40, retrovirus actin, retrovirus long terminal repeat, rouxwill , Heat shock, phosphate and nitrate transcription control sequences, and prokaryotic or Is a bacterial, yeast, and other sequence that can regulate gene expression in eukaryotic cells. In mother and mammalian cells Those that work in Additional suitable transcription control sequences include tissue-specific Promoters and enhancers as well as lymphokine-inducible promoters (eg, Terferon or interleukin-inducible promoters) Can be The transcription control sequence of the present invention also encodes D encoding the MEKK protein. It can include naturally occurring transcription control sequences that are naturally associated with NA sequences. Wear. Suitable nucleic acid molecules for insertion into an expression vector include MEKK protein Included are nucleic acid molecules that encode at least a portion, or homologs thereof. Manifestation Further suitable nucleic acid molecules for insertion into the vector are SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2. No .: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and / or SEQ ID NO: 10 Nucleic Acid Molecules Encoding at least Part of the Amino Acid Sequences Described or Includes homologs of. Even more preferred nucleic acids for insertion into expression vectors The molecules include: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and / Or a nucleic acid molecule represented by SEQ ID NO: 9, or a phase trap thereof. You. The expression vector of the present invention is also a fusion protein of the inserted nucleic acid molecule of the present invention. Containing the fusion sequence expressed as. As part of the MEKK nucleic acid molecule of the present invention, The inclusion of the combined sequence results in the production and storage of the protein encoded by the nucleic acid molecule. And / or stability during use is improved. In addition, the fusion segment is obtained The purified fusion protein using affinity chromatography To act as a tool to simplify the purification of MEKK proteins. Can be. Appropriate fusion segments provide the desired functionality (e.g., increased stability and And / or Or a purification tool). One It is within the scope of the present invention to use fusion segments of greater length. Fusion Segment is attached to the amino and / or carboxyl termini of the MEKK protein. Can be combined. The bond between the fusion segment and the MEKK protein is M Enables straightforward recovery of EKK protein It can be constructed so that it is susceptible to cleavage. Fusion proteins are preferred Bound to the carboxyl and / or amino terminus of the MEKK protein A set transformed with a fusion nucleic acid sequence encoding a protein containing a fusion segment It can be produced by culturing the replaced cells. Recombinant cells of the invention are transfected with at least one nucleic acid molecule of the invention. Included are any transformed cells. Suitable recombinant cells are MEKK proteins At least one nucleic acid molecule encoding at least part of, or homologues thereof A cell transformed in the body. A further preferred recombinant cell is SEQ ID NO: 2. By SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and / or SEQ ID NO: 10 A nucleic acid molecule capable of encoding at least part of the amino acid sequence represented by Alternatively, they are transformed with their homologues. Even more preferred recombinant cells are Sequence number: 1, sequence number: 3, sequence number: 5, sequence number: 7 and / or sequence number No.:9, or at least one nucleic acid molecule represented by Will be replaced. Particularly preferred recombinant cells are characterized by at least one of the nucleic acid molecules described below. Included are transformed, disease-associated mammalian cells. Using recombinant DNA technology, the expression of transformed nucleic acid molecules can be achieved, for example, by The copy number of nucleic acid molecules in the host cell, the transcription of these nucleic acid molecules The efficiency of translation, the efficiency of translating the resulting transcript, and the efficiency of post-transcriptional modification. It can be recognized by those skilled in the art that it can. As a recombinant technique useful for increasing the expression of the nucleic acid molecule of the present invention, A nucleic acid molecule, such as, but not limited to, one operatively linked to a high copy number plasmid, Or more, integration of nucleic acid molecules into host cell chromosomes, vectors into plasmids Addition of stability sequences, substitution or modification of transcription control signals (eg promoters , Operators, enhancers), substitutions or modifications of transcriptional control signals (eg , Ribosome binding site, Shine-Dalgarno sequence), host cell code Modification of the nucleic acid molecule of the present invention corresponding to the usage, deletion of sequences that destabilize transcription, And temporarily separate recombinant cell growth from recombinant protein production during fermentation The use of control signals is mentioned. The activity of the expressed recombinant protein of the present invention is , Fragmenting, modifying or derivatizing the resulting protein Can be improved by As used herein, amplifying the copy number of a nucleic acid sequence in a cell is , By increasing the copy number of nucleic acid sequences in the genome of the cell, or by Achieved by introducing an additional copy of the nucleic acid sequence into the cell by quality conversion can do. Amplification of copy number produces more enzyme, It is done in such a way as to improve the conversion to the product. For example, the nucleic acid of the present invention is included. The recombinant molecule possesses can be transformed into cells to enhance enzymatic synthesis. Wear. Transformation may be accomplished using any method by which the nucleic acid sequences are inserted into the cell. Can be achieved. Prior to transformation, the nucleic acid sequence on the recombinant molecule is It can be engineered to encode an enzyme with a heterologous activity. Recombinant cells, according to the present invention, have effective conditions for producing such proteins. By culturing such cells below and recovering the protein, It can be used to produce MEKK proteins. Manufacture protein Effective conditions for, but not limited to, enable protein production. Suitable media, bioreactor, temperature, pH and oxygen conditions are included. Suitable When the cells of the present invention are cultivated, the cut or effective medium means MEKK protein It refers to any medium that can be produced. Such medium is usually assimilable charcoal water. Such as chlorides, nitrogen and phosphorus sources, and suitable salts, minerals, metals and vitamins It is an aqueous medium containing other nutrients. The medium comprises complex nutrients Or a defined minimum medium. Cells of the invention include, but are not limited to, batch, feed batch, cell Recycle and cultivate in conventional fermentation bioreactors, including continuous fermentors be able to. The culture also includes shake flasks, test tubes, microtiter dishes, and It can be done in a Petri dish. Culturing is carried out at the appropriate temperature, pH and pH for the recombinant cells. It is carried out with oxygen content. Such culture conditions are within the expertise of one of ordinary skill in the art. The resulting MEKK protein, depending on the vector and host system used for production The quality remains in the recombinant cells or is secreted into the fermentation medium. The phrase "Tampa "Collecting protein" means simply collecting the entire fermentation medium containing protein. And need not include additional steps of separation or purification. M of the present invention EKK proteins include, but are not limited to, affinity chromatographs. Method, ion exchange chromatography method, filtration method, electrophoresis method, hydrophobic mutual reaction Chromatography Method, gel chromatography method, reverse phase chromatography method, isoelectric focusing chromatography A variety of standard protein purification techniques are used, such as chromatography and differential solubilization. Can be used for purification. Furthermore, the MEKK protein of the present invention is used as a MEKK tamper recovered from an animal. Produced by isolating the MEKK protein from cells expressing the protein. Can be. For example, cell types such as T cells may be isolated from the thymus of an animal. it can. The MEKK protein is then described herein from isolated T cells. Can be isolated using standard techniques. The present invention is also able to regulate signals originating from receptors on the surface of cells. Include methods for identifying potential compounds, wherein such signal regulation is Related to KK protein. Such a method comprises (a) a MEKK protein Contacting the cell with a putative regulatory compound; (b) placing the cell on the surface of the cell Contacting with a ligand capable of binding to the receptor; (c) putative modulation The ability of node compounds to regulate cell signaling is determined by the MEKK-dependent of the present invention. Assessing by determining activation of members of the sexual pathway; It consists of A preferred method of performing step (c) is the phosphate of a member of the MEKK-dependent pathway. Comprising measuring oxidization. Such measurements include phosphotyrosine and phosphoserine. And / or using an immunoassay having antibodies specific for phosphothreonine It can be carried out. Another suitable method for carrying out step (c) is that the MEKK protein is The ability to phosphorylate MEK and / or JEK proteins is described herein Comprising using the method described in the book. In another aspect, compounds that can modulate signal transduction in the cell are identified. In the method, (a) putative inhibitory compound is contacted with MEKK protein to react. Forming a reaction mixture; (b) contacting the reaction mixture with MEK protein. And (c) the ability of the putative inhibitory compound to inhibit phosphorylation of the MEK protein Is evaluated by the MEKK protein; Process ( From the results obtained in c), the putative inhibitory compound phosphorylates MEK protein. The ability of the Raf protein to oxidize is compared to its ability to inhibit Selective signaling involving MEKK proteins independent of af proteins You can decide if you can adjust. Used in the above method MEKK, MEK and Raf proteins are recombinant proteins or naturally derived It can be a derived protein. In addition, the sites of inhibitory action in specific signaling pathways are Raf and MEKK Whether or not both of the proteins are included in the above experiment (ie, MEKK-dependent pathway See the above description). Another aspect of the invention is the ability to regulate signals originating from receptors on the surface of cells. Including a kit for identifying compounds capable of Related to K protein. Such a kit contains (a) a MEKK protein (B) capable of binding to a receptor on the surface of the cell. Ligand; and (c) the putative regulatory compound is a phosphorus of the MEKK protein. Means for assessing the ability to alter oxidation. Such a hand to detect phosphorylation The steps include methods and reagents known to those of skill in the art, for example phosphorylation Rosin, Using antibodies specific for phosphorylated amino acid residues like serine and threonine Can be detected. Such kits can be used to Included in such pathways at or near regulatory sites. The identity of the construct can be determined with reasonably good specificity. In another aspect, the kit of the invention comprises (a) MEKK protein; (b) MEK. Protein; and (c) the putative inhibitory compound phosphorylates the MEK protein Means for assessing the ability to inhibit E. coli by the MEKK protein; Departure The kit of Ming further comprises the Raf protein and the putative inhibitory compound MEK A hand to detect the ability to inhibit the ability of Raf proteins to phosphorylate proteins It can comprise steps. Another aspect of the invention is the ability to manipulate signaling pathways in cells involved in disease. The present invention relates to the treatment of animals with medical disorders that are regulated or treated by Such medical disorders include abnormal cell growth and abnormal production of secreted cell products. Diseases of life origin are included. In particular, such medical diseases are not limited to these. However, autoimmune diseases, inflammatory reactions, allergic reactions and Parkinson's Neurological disorders such as Luzheimer's disease may be mentioned. Treatment using the method of the invention Suitable cancers to receive include, but are not limited to, small cell carcinoma, overexpressed EGF receptor Non-small cell lung cancer with body, breast cancer with overexpressed EGF or Neu receptor, established o Tumor with overexpressed growth factor receptor for tocrine loop, and established paracrine Tumors with overexpressed growth factor receptors. According to the invention, the term , Treatment is the regulation of the progression of medical disorders or the complete elimination of medical disorders (eg, Treatment). Treatment of medical disorders Indicates that cells involved in medical diseases are extracellularly stimulated (eg, cytokinin growth factor). The cell's signaling activity in such a way that it no longer responds to Or killing cells involved in medical disorders by apoptosis. Can be. One aspect of the present invention is that the MEKK protein of the present invention inhibits cell proliferation and cell death. And by regulating cellular activities such as cell function (secretion of cellular products), Includes the recognition that cell homeostasis can be regulated. Many such adjustments Independent of Raf, but as described above (as shown in Figure 2 Some pathways that can be regulated by the MEKK protein are Raf It can be subject to upstream regulation by proteins. Therefore, Raf protein And / or stimulates or inhibits the activity of the MEKK protein to produce the desired result. Obtaining is within the scope of the invention. If you're not bound by theory, Ras Tampa Raf and MEKK proteins at branch points from the cytoplasm (see Figure 2) Modulation of cytoplasmic activity could be controlled by a "2-hit" mechanism . For example, the first "hit" is, for example, when cells are activated with Ras protein. Contact with a growth factor capable of binding to cell surface receptors in a manner such that Any of which stimulates Ras proteins to stimulate Ras-dependent pathways, including Means may also be included. Following activation of Ras protein, MAP A second "hi", which increases the activity of JNK relative to K activity, and vice versa. Can be derived. Not limited to these as the second "hit" , JNK or MAPK, MEKK, JEK, Raf and / or MEK Regulated by compounds capable of stimulating or inhibiting the activity of Can be mentioned. For example, protein kinase C or phospholipase C Compounds such as Nase are such that JNK is preferentially activated above MAPK Required to drive a diffuse Ras-dependent pathway towards a MEKK-dependent pathway A second "hit" can be provided. One aspect of the invention is the MEKK-dependent relative to the activity of Raf-dependent pathways in cells. A method of modulating cellular homeostasis comprising modulating the activity of a extrinsic pathway I do. As used herein, the term "homeostasis" refers to the signaling pathway Such an intracellular system is used to describe the tendency of cells to maintain a normal state. M Regulation of EKK-dependent pathway activity involves Raf-dependent, a member of the MEKK-dependent pathway It regulates the activity of members of the sexual pathways, their combinations, to regulate phosphorylation in a given pathway. By achieving the desired regulation, the ME is compared to the activity of the Raf-dependent pathway. Increasing the activity of KK-dependent pathways is included. MEKK-dependent pathways that regulate As a preferred regulated member of the tract or Raf-dependent pathway, No, but MEKK, Raf, JEK, MEK, MAPK, JNK, TCF, AT F-2, Jun and Myc, and combinations thereof. In one aspect, members of the MEKK-dependent pathway, members of the Raf-dependent pathway, The activity of, and combinations thereof, is by altering the concentration of such members in cells. Is adjusted. One suitable regulation scheme is MEKK, Raf, JEK, M EK, MAPK, JNK, TCF, Jun, ATF-2, and Myc, and Including varying the concentration of those combinations. A further preferred regulation scheme is ME KK, JEK, JNK, Jun, ATF-2, and Myc, and combinations thereof Tampa including match Increasing the concentration of the minerals. Another more preferred regulation scheme is Raf , MEK, MAPK, and TCF, and proteins including combinations thereof Reducing the concentration of. In two or more of the above regulation schemes Combining regulation of protein concentration to achieve optimal apoptotic effect in cells It is also within the scope of the present invention that it is possible. As a preferred method of increasing the concentration of protein in the regulation scheme of the invention, Nucleic acid sequences encoding such proteins in cells, including but not limited to Increasing the copy number of the nucleic acid encoding such a protein. Improving the efficiency with which the sequence is transcribed intracellularly, transcribing the transcript into such a protein The efficiency of post-transcriptional modification of such proteins. And a cell capable of producing such a protein as an anti-sense nucleic acid sequence. Contacting, and combinations thereof. In a preferred aspect of the invention, cellular homeostasis regulates cellular apoptosis. Controlled by and. A suitable method for regulating cellular apoptosis is MEKK. A MEKK-dependent pathway that regulates a pathway in which proteins are substantially independent of Raf To regulate the activity of the tract. A particularly preferred method of regulating cellular apoptosis Encodes a cell for a MEKK protein with unregulated kinase activity Increasing the concentration of MEKK protein by contacting it with nucleic acid molecules Comprises and. As a suitable nucleic acid molecule with which cells are contacted, SEQ ID NO: 2, sequence SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10, Nucleic acid molecules encoding MEKK proteins, and combinations thereof Is mentioned. As a more preferable nucleic acid molecule with which a cell is contacted, SEQ ID NO: 2, According to SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and / or SEQ ID NO: 10 The kinase catalytic domain of the MEKK protein (ie, regulatory domain Nucleic acid encoding a truncated MEKK protein There are children. As an even more preferable nucleic acid molecule for contacting cells, MEK K 1_352-672, MEKK 2_352-619, MEKK 3_358-626, MEKK 4₈₁₁ _-1195 , MEKK 5_863-1247Nucleic acid molecules, and combinations thereof. It is. Again, suitable variants of the MEKK proteins described herein are suitable under stringent conditions. By a nucleic acid molecule capable of hybridizing to any of the above sequences at It comprises the encoded protein. The above method comprises contacting the cells with a compound capable of inhibiting MEKK activity. By further increasing the activity of the MEKK protein in the cell It is within the scope of the invention to include Such compounds include MEK In a manner that inhibits phosphorylation of MAPK by proteins, And / or a MAPK tamper Binds to a portion of the MAPK protein in a manner that inhibits phosphorylation of proteins The peptides that can be mentioned are: In another aspect, members of the MEKK-dependent pathway, members of the Raf-dependent pathway, And the activity of their combination directly alters the activity of such members in cells. Can be adjusted by. The ability to alter the activity of members of the MEKK-dependent pathway Suitable methods include, but are not limited to, these: MEKK, JEK, JNK, cells in a manner such that proteins are activated Proteins including Jun, ATF-2, and Myc, and combinations thereof Contacting with a compound capable of interacting directly; and / or a cell Raf, MEK, MAPK, in a manner such that the activity of the protein is inhibited Interacts directly with proteins, including TCF proteins, and combinations thereof Can be mentioned. Structure of MEKK-dependent pathway Suitable compounds for contacting cells, which are able to regulate members, include pep Of the regulatory domain that regulates the activity of the kinase domain of such proteins. MEKK, JEK, JNK, Jun, ATF-2, and My that inhibit capacity include peptides that can bind to the regulatory domain of proteins including c You. Other compounds suitable for contacting cells include TNFα, tyrosine quiner Growth Factors, G Protein-Coupled Receptor Hormones and FAs S ligands may be mentioned. Suitable for contacting cells, which can regulate members of the Raf-dependent pathway. Suitable compounds are peptides, which either phosphorylate proteins or release substrates. Raf, MEK-1, MEK-2, MAPK, and Binds to the kinase catalytic domain of a protein selected from the group consisting of Peptides that can be used. One aspect of the present invention is that the MEKK protein can activate MAPK. Regarding recognition that it can be done. MAPK is involved in various cellular pathways in mammalian systems Is known to exist. MAPK induces cell division, DNA synthesis, cell division and And are involved in differentiation. MAPK also includes c-jun and And activity of oncogenes such as c-myc It is recognized that it is involved in Without being bound by theory, the inventor PK is also thought to be closely involved in various genetic disorders with genetic sources. MA PK is known to cross the nuclear membrane and regulates the expression of various genes Is believed to be at least partially due to. Thus, MAPK is a cancer, Stimulation and promotion of neurological diseases, autoimmune diseases, allergic reactions, wound healing and inflammatory reactions It is thought to play a prominent role in the line. The inventor codes MEKK By first identifying the nucleic acid sequence, the expression of MEKK is regulated, so It was found that it becomes possible to regulate the activation of MAPK. The invention also provides an effective amount of naked plasmid DNA compound in an area of the subject's body. And a method of regulating cellular homeostasis comprising injecting. Naked The rasmid DNA compound encodes the MEKK protein of the present invention, Naked plaques that can be taken up and expressed in recipient cells located in the area of It comprises a nucleic acid molecule operably linked to a Smid DNA vector. The present invention Of the preferred naked plasmid DNA compound of Escherichia coli has a deregulated kinase activity. It comprises a nucleic acid molecule encoding a truncated MEKK protein. Of the present invention Suitable naked plasmid DNA vectors include those known in the art. The naked plasmid DNA compounds of the present invention, when administered to a subject, MEKK tamper capable of transforming cells and regulating cell apoptosis The production of at least a portion of the protein or RNA nucleic acid molecule. The naked plasmid DNA compound of the present invention is useful for cancer, autoimmune diseases, inflammatory reactions, alleles. Ruggy reaction and Parkinson's disease and Alzheimer Can treat subjects suffering from medical illnesses, including neurological disorders such as You. For example, a naked plasmid DNA compound is a The plasmid may be taken up and expressed by the tumor cells to kill them. It can be administered by injecting an effective amount of the drug directly into the tumor. Book As used herein, the effective amount of naked plasmid DNA administered to a subject is , Regulates medical illnesses where naked plasmid DNA is intended to treat or Comprises the amount required to be treated, the mode of administration, the frequency of administration and the dose. The frequency of giving can be determined by those skilled in the art without resorting to inadequate experimentation. Wear. The therapeutic compound used in the therapeutic methods of the present invention further comprises suitable excipients. Become. Therapeutic compounds used in the therapeutic methods of the invention are acceptable to the subject being treated. It can be formulated in different excipients. Such excipients include water, saline, Ringer's solution, glucose solution, Hank's solution, and other physiologically balanced salt solutions Is mentioned. Fixed oil, sesame oil, ethyl oleate or trig A non-aqueous medium such as lyseride can be used. As other useful excipients, Sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, or dextran Suspending agents containing such viscosity enhancing agents are included. Excipients can also be isotonic and Minor amounts of additives can be included, such as substances that improve chemical stability. Buffers include phosphate buffer, bicarbonate buffer and Tris buffer. Examples of preservatives include thimerosal, m- or o-cresol, formalin, and formalin. And benzyl alcohol. Standard formulations are injection solutions or suspensions In a liquid suitable as an agent or liquid Can be a solid agent that can be incorporated into Therefore, in non-liquid formulations , Excipient is dextrose, human serum albumin, sterile water or saline before administration It can comprise preservatives and the like that can be added to the water. In another aspect, the therapeutic compounds used in the therapeutic methods of the invention also include a carrier. It can be. The carrier usually determines the half-life of the therapeutic compound in the animal being treated. Is a compound that increases. Suitable carriers include, but are not limited to, liposomes. Zome, micelle, cell, polymer controlled release formulation, biodegradable implant, bacterium, virus Include soot, oils, esters and glycols. Suitable carriers are liposomes and mi Contains cells. Therapeutic compounds used in the therapeutic methods of the invention include the medical disorders described herein. Can be administered to any subject having Having a therapeutic compound of the invention Acceptable protocols to be administered in an effective manner are: single dose, number of doses, dose It can be varied depending on the administration frequency and administration method. Such protocol The determination of the rules can be made by those skilled in the art without resorting to inadequate experimentation. You. An effective dose is one that treats a subject for the medical illnesses described herein. Say the dose you can. An effective dose is, for example, the therapeutic compound used. , Depending on the medical illness being treated, and the size and type of recipient animal Can be. An effective dose for treating a subject is the activity of cells involved in medical illness ( Dosages administered over time that can regulate growth (including proliferation). An example Thus, a first dose of the naked plasmid DNA compound of the present invention will have tumors Includes an amount that, when administered to a subject, reduces tumor size by about 10% in 7 days It consists of The second dose is the first At least the same therapeutic compound as Another aspect of the invention is a treatment for a subject having a medical condition as described herein. Includes methods of prescribing therapy. The preferred method of prescribing the treatment is (a) medically MEKK protein activity in cells involved in disease is measured to determine whether the cells are of the present invention. Determining whether or not it is sensitive to a therapy using the method; and (b) a cell. The activity of the MEKK-dependent pathway relative to that of the Raf-dependent pathway in Prescribing a therapeutic method comprising inducing vesicle apoptosis. The step of measuring MEKK protein activity includes (1) taking a sample of cells from a subject. (2) stimulating cells with TNFα; and (3) phosphothreonine And / or using an immunoassay using an antibody that is specific for phosphoserine Detecting the phosphorylation status of the JEK protein; Wear. The present invention can also selectively bind to the MEKK proteins of the present invention Antibodies. Such antibodies are referred to herein as anti-MEKK antibodies. Anti-M A polyclonal population of EKK antibodies can be contained in the MEKK antiserum. MEKK antiserum is an affinity-purified polyclonal antibody, ammonium sulfate. It can refer to nium-cut antiserum or whole serum. Used here As such, the term "selectively bound to" means that such an antibody favors the MEKK protein. Says the ability to combine proactively. Binding is by immunoblot assay, immunoprecipitation assay, fermentation Prime immunoassay (eg, ELISA), radiolabeled immunoassay, immunofluorescent antibody assay And immunoelectron microscopy, [eg Sambrook et al., Molecular cloning Experimental Guide (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbo r Labs Press, 1989], known to those of skill in the art. It can be measured using the method of. The antibody of the present invention may be a polyclonal or monoclonal antibody, and Can be manufactured using standard techniques in the industry. The antibody of the present invention is an antibody Selectively bind to at least one of the epitopes of the protein used to obtain Antibody fragments and genetically engineered antibodies, including single chain antibodies, which are capable of combining Such functional equivalents are included. Suitably the antibody is conjugated to a MEKK nucleic acid molecule. Produces in response to an at least partially encoded protein. More suitable Antibody produced in response to at least a portion of the MEKK protein, Suitably, the antibody reacts with the amino or carboxyl terminus of the MEKK protein. Answer and generate. Suitably, the antibody of the invention is directed against the MEKK protein of the invention. And about 10^ThreeM^-1~ About 10¹²M^-1It has a single-site binding affinity of A preferred method of producing the antibodies of the invention is to provide an animal with an effective amount of the MEKK protein. Administering to produce antibody and recovering antibody. Antibodies of the invention Has many potential uses within the scope of the invention. For example, such an antibody Identifies a unique MEKK protein and recovers the MEKK protein Can be used for Another aspect of the invention is: (a) contacting the cell with a putative regulatory molecule; And (b) a putative regulatory compound regulates the activity of a MEKK-dependent pathway in the cell Ability to measure activation of at least one member of the MEKK-dependent pathway Same as Therapeutic application capable of modulating the activity of defined MEKK-dependent pathways in cells Comprising compound. A preferred method for measuring activation of members of the MEKK-dependent pathway Measuring the transcriptional regulatory activity of c-Myc protein, MEKK, JEK, Phosphorus, a protein selected from the group consisting of JNK, Jun, ATF-2, and Myc Includes measuring oxidation, and combinations thereof. The following examples are provided to illustrate the present invention and to illustrate the scope of the present invention. It is not intended to limit the enclosure. ExampleExample 1 This example describes the structural characterization of the MEKK1 protein. A.MEKK1 nucleotide sequence The MEKK1 protein was cloned by the following method. Original modified ino The syn-oligodeoxynucleotide was placed between the yeast Ste11 and Byr2 genes. Designed to correspond to the region of column identity. Polyadenii from NIH3T3 cells Of 320 base pairs ( A bp) polymerase chain reaction (PCR) amplification product was isolated. This 320b From the mouse brain cDNA library using pcDNA as a probe, A 3260 bp MEKK1 cDNA was identified using standard methods in the art. The MEKK1 nucleotide sequence is a double-stranded DNA dideoxynucleotide sequencing. Routinely determined using standard methods in the industry. Referring to Table 6, based on the Kozak consensus sequence for the start codon Thus, the starting methione can be expected to be at nucleotide 484. This Starting from methionine of, the cDNA corresponds to a molecular size of 73 kD, It encodes a protein of 672 amino acids. Kozak rule at position 441 But gives a protein of 687 amino acid residues (74.6 kD) , There are other in-frame methionines. Also, referring to Table 6, NH₂Terminal 20% of 400 amino acids are serine and threonine, only 2 tyrosine is there. Several potential sites of phosphorylation by protein kinase C are NH₂End It is in the area. The kinase catalytic domain is located in the COOH-terminal half of MEKK1. Place. B.Southern blot analysis of MEKK1 transcription An equal amount (20 μg) of total RNA was added as indicated by ethidium bromide staining. , Put in gel. Blots encoding part of the MEKK kinase domain 320-bp cDNA fragment or MEKK NH₂Coding a part of the end area With any of the 858-bp fragments that have been cloned using standard methods in the art. Moved. Referring to FIG. 3A, a 7.8 kD mRNA was detected in several cell lines and mouse. Probe derived from the 5'and 3'ends of the MEKK cDNA in tissue Identified. MEKK mRNA is highly expressed in mouse heart and spleen and Expression was low in the gut. C.Southern blot analysis Mouse genomic DNA (10 μg) was transferred to Bam using standard methods in the art. Digested with either HI, Hind III or Eco RI and applied to gel did. The blot was analyzed for the 320-bp fragment of the MEKK gene. Probed with a piece. In FIG. 3B, 1 in Bam HI and Hind III digests Shows the appearance of two bands, where MEKK is encoded by one gene Indicates that The appearance of two bands in the Eco RI digest indicates that the The presence of an Eco RI site within the intron sequence spanned by the probe Indicate that D.Immunoblot using anti-MEKK antibody Three different antigens were used to produce three polyclonal antisera. first Polyclonal antiserum of Escherichia coli was derived from 15 amino acids derived from the COOH terminus of MEKK. Prepared using an antigen containing the no acid peptide DRPPSRELLKHPVER . Immunize NZW rabbits with the peptide and antiserum using standard methods in the art. Was recovered. This first polyclonal antiserum is referred to herein as the DRPP antiserum. To call. The second polyclonal antiserum was MEKK digested with EcoR1 and PstI. A DNA clone containing cDNA is used to encode the amino terminus of MEKK 1 A 270 bp fragment was generated and produced. Clone this fragment into pRSETC Recombinant molecule pMEKK containing amino acid residues 1-369 of MEKK1_1- ₃₆₉ Was generated. pMEKK_1-369The recombinant molecule was transformed into E. Expression in E. coli and recombination Recover the protein encoded by the molecule and use standard methods in the industry. Purified. NZW Rabbit purified recombinant MEKK_1-369Immunize with molecules, industry Recovered using standard methods of. This second polyclonal antiserum is referred to herein as MEKK_1-369It is called antiserum. The third polyclonal antiserum is MEKK digested with Pst I and Kpn 1. Using a DNA clone containing cDNA, MEKK catalyzed A 1670 bp fragment encoding the main was generated and produced. P this fragment Clone in RSETC to include amino acid residues 370-738 of MEKK1. Mu recombinant molecule pMEKK_370-738(Coded by base pair 1592-3260 Was generated). pMEKK1_370-738The recombinant molecule is transformed into E. Expressed in E. coli And recover the protein encoded by the recombinant molecule by standard methods in the art. Purified using NZW Rabbit purified recombinant MEKK_370-738With protein Immunized and harvested using standard methods in the art. This third polyclonal anti- Serum is referred to herein as MEKK1_370-738It is called antiserum. Soluble cells derived from several rodent cell lines using DRPP antiserum were used. Western blot of vesicle proteins was probed. Soluble cell protein (1 00 μg) or recombinant MEKK COOH-terminal fusion protein (30 ng) The protein was loaded in a 10% Trisglycine SDS-PAGE gel and loaded with Transferred to a nylon filter using standard methods. Nylon filter Immunoblotted with Nity purified DRPP antiserum (1: 300 dilution). Figure 3C Referring to, the 78 kD immunoreactive protein is associated with phenochromocytoma (P C12), samples containing proteins from Rat 1a and NIH 3T3 cells Was identified in. A prominent 50 kD immunoreactive band is also usually present, but the intensity is It varies from book to book, indicating that the band is a proteolytic fragment. Visualization of both the 78 kD and 50 kD immunoreactive bands on the immunoblot was 1 Preliminary Incorporation of Five Amino Acid Peptide Antigen with Affinity Purified DRPP Antiserum Suppressed by cubation. The MEKK protein detected by immunoblot is the MEKK cDNA It is similar to the molecular size estimated from the open reading frame. In a second immunoblot experiment, EGF stimulated or unstimulated PC12 cells were lysed and 10% Trisglycine SDS-PAGE as described above. Sorted on gel. MEKK protein contained in cell lysate Tea refined MEKK_1-369By immunoblot using antiserum (1: 300) Thus, it was identified using standard methods in the industry. Referring to FIG. 4, MEKK1 and MEKK activity, MEKKα and MEKK Two high molecular weight proteins with β are affinity purified MEKK_1-369Anti It was identified using serum. MEKK1 is affinity-purified MEKK_1-36 ₉ It was identified using antiserum and MEKKα and MEKKβ were not identified. Using the same method as above, PC12, Ratla, NIH3T3, and Approximately 98 kD and 82 kD of two MEKKs that are present in Swiss cell lysates The epidemiologically active species is affinity purified MEKK, as shown in FIG._1-369Antiserum Admitted by. The 98 kD MEKK protein described herein was originally Related PCT application (International application number PCT / US94 / 04178) M of 95 kD It should be noted that it was identified as an EKK protein. Then Tris Glicy The modification of the molecular weight was determined by SDS-PAGE gel analysis. These ta Visualization of both proteins is affinity-purified MEKK_1-369Purify antiserum Recombinant MEKK_1-369Suppression by incubating with the fusion protein antigen Was controlled. The single-stranded 98 kD MEKK protein is Present in MEKK immunoprecipitate but in immunoprecipitate using pleimu serum Did not exist. MEKK of 98kD is PC12 cell compared with fibroblast cell line A lot expressed in. Using an antibody that specifically recognizes Raf-1 or Raf-B Immunoblots showed that both of these enzymes It was shown that it was not present as a contaminant. 98 in MEKK immunoprecipitates The MED of kD is commingled with Raf-1 or Raf-B in PC12 cell lysates. Not migrating, and the interaction between MEKK and Raf antibody No differential reactivity was observed.Example 2 This example encodes the MEKK2, MEKK3 and MEKK4 proteins. The isolation of the nucleic acid sequence is described. PCR primers were designed based on the nucleotide sequence of MEKK1. P Reverse transcriptase reaction of RNA isolated from C12 and HL60 cells PCR amplification of a fragment from DNA isolated from the reaction was performed using standard techniques. . The obtained PCR product was used as a pGEX cloning vector (Promega, Wisconsin) and cloned using standard methods and using standard techniques Was subjected to DNA sequence analysis.Example 3 This example expresses the MEKK1 protein in COS-1 cells to induce MA It is described to define the function of regulating the signaling system including PK. COS cells in 100 mm culture dish were treated with pCVMV5 expression vector alone (1 μg: control) or pCVMV5 MEKK construct (1 μg: MEKK) Either was transfected. After 48 hours, the cells were treated with bovine serum albumin. Rest was induced by placing in serum-free medium containing (0.1%) for 16-18 hours. . The cells were then treated with human EGF (30 ng / ml) (+ EGF) or buffer ( Control) for 10 minutes, washed twice with cold phosphate buffered saline (PBS), and 50 mM β-glycerophosphate (pH 7.2), 100 mM vanadic acid Sodium, 2mM MgCl₂1 mM EGTA Triton X-10 0 (0.5%), leupeptin (2 μg / ml), aprotinin (2 μg / ml) , And in a cell lysis buffer containing 1 mM dithiothreitol (600 μl) Dissolved in. Centrifuge at maximum speed for 10 minutes in a microfuge and then COS cell lysates containing 5-1 mg of soluble protein were added to MONO Q Treated with FPLC on ram and eluate fractions from Heasley et al., Mol. . Bio. Cell, Volume 3, page 545, 1992. Were measured for MAPK activity. Referring to FIG. 6A, when MEKK1 was overexpressed in COS1 cells, MAP K activity was transfected with a plasmid lacking the MEKK 1 cDNA insert. 4 to 5 times larger than in the control cells that were used. MAPK activation blocked from serum In COS cells and in the absence of added growth factors. MAPK Activity was similar to that observed after stimulation of control cells with EGF. . When COS cells transiently overexpressing MEKK were stimulated with EGF, MAPK activity was increased. Sex was slightly increased compared to the activity observed with MEKK expression alone. . MEKK protein is present in the sample tested for MAPK activity To confirm the identity of cells from cell lysates of transfected COS1 cells. Proteins were immunoblotted with MEKK-specific antisera. Possible from COS cells The same amount of soluble protein lysate (100 μg) was used using the method described in Example 1. Was placed on a gel for immunoblotting. Affinity purification of filters DRPP antiserum (1: 300) and affinity purified MEKK_1-369Antiserum (1 : 300). Referring to FIG. 6B, the result is EG Vector encoding MEKK processed with F or without EGF Shows that MEKK is expressed in cells transfected with-. 50kD Of the MEKK immunoreactive fragments of DRPP in the lysate from control COS cells. Detected using serum. MEKK transient expression in COS cells 12, a little greater than that observed in Rat 1a, or NIH 3T3 cells It gave a striking 82 kD band. 15 amino acids in the immunoblot Addition of DRPP peptide antigen to antiserum detects all immunoreactive bands Was prevented. These bands were not detected in the extract of control COS cells. This indicates that they were derived from the expressed MEKK protein. .Example 4 This example expresses MEKK1 in COS cells to drive MEK protein Testing the ability of MEKK proteins to activate is described. Fast protein on MONOS column using recombinant MAPK In COS cell lysate fractionated by liquid chromatography (FPLC) MEK activity was measured. Xenopus laevis CDNA encoding p42 MAPK from Cloned in This construct contains polyhistidine at the NH2 terminus Of the p42 MAPK fusion protein of Escherichia coli li) Used for expression of BL21 (DE3) in the LysS strain. Expression plastic Cultures containing Smid were incubated at 600 nM to an optical density of 0.7-0.9, 37 Grow at ° C. To induce fusion protein synthesis, isopropyl-β-ti Add ogalactopyranoside (0.5 mM) and incubate the culture for 3 hours did. The cells were then harvested, lysed by freezing, thawing, and sonicating. The lysate was centrifuged at 10,000 g for 15 minutes at 4 ° C. Then, the supernatant is i²⁺Soluble recombinant MAPK was passed through a packed Sepharose resin and sodium phosphate Elution was carried out in a buffer solution (pH 4.5). Purified recombinant MAPK is more than 80% pure there were. Purified recombinant MAPK acts as a substrate for MEK and acts as an EGF receptor Peptide consisting of residues 662 to 681 (EGFR^662-681) Phosphorylation of did. Transiently transfected with MEKK, mock transfected (Control) or mock transfected and EGF (30 ng / m l) (+ EGF) treated soluble cell lysates from COS cells Endogenous MEK activity was measured by fractionation by FPLC on an OS column. Intrinsic cause Sex MAPK elutes in fractions 2-4, while MEK fractions 9-1. Contained in 3. To measure the endogenous MEK activity, cells were washed twice with cold PBS. Washed, 50 mM β-Glucerophosphate, 10 mM 2-N-morpholineethane-sulfone Acid (pH 6.0), 100 μM sodium vanadate, 2 mM MgCl 2₂1 mM EGTA, Triton X-100 (0.5%), leupeptin (5μ g / ml), aprotinin (2 μg / ml), and 1 mM dithiothreitol Was dissolved in 650 μl of a solution containing 1 at maximum speed in microfuge Elute soluble cell lysate (1-2 mg protein) after centrifugation for 0 min. Buffer solution (50 mM β-glycerophosphate, 10 mM MES (pH 6.0) ), 100 μM sodium vanadate, 2 mM MgCl 2₂1 mM EGTA , And 1 mM dithiothreitol) on a Mono S column equilibrated in I entered. The column is washed with buffer (2 ml) and bound protein is eluted with elution buffer. A linear gradient in the solution was eluted with 30 ml of 0-350 mM NaCl. Each flux Aliquot (30 μl) of the buffer solution (25 mM β) in a final volume of 40 μl. -Glucerophosphate, 40 mM N- (2-hydroxyethyl) piperazine -N '-(2-ethanolsuccinic acid) (pH 7.2), 50 mM sodium vanadate Thorium, 10 mM MgCl₂, 100 μM γ-³²P-ATP (3000- 4000 cpm / pmol), inhibitor, protein-20 (IP-20; TT) YADFIASGRTGRRNAIHD; 25 μg / ml), 0.5 mM EG TA, recombinant MAP kinase (7.5 μg / ml), and 200 μM EGF R^662-681) And measured for MEK activity. 20 minutes at 30 ℃ After cubating, γ-³²EGFR of P-ATP^662-681To measure the uptake Was. In this measurement, each column fraction that activates the added recombinant MAPK is used. Ability of Γ-into MAPK substrate, peptide derived from EGF receptor (EGFR)³² It was measured by the incorporation of P-ATP. Referring to FIG. 7, the first peak of eluted activity represents endogenous activated MAPK. Which directly phosphorylates the EGFR peptide substrate. The second peak of activity is Represents endogenous MEK in COS cells. Endogenous MEK activity was characterized by fractionation of Mono S FPLC . COS cell lysates were fractionated by FPLC on a Mono Q column and expressed M The EKK was partially purified. The purified recombinant MEK-1 is then used for MEKK As a substrate for γ-³²MEKK used MEK-1 in the presence of P-ATP It was decided whether to phosphorylate directly. The cDNA encoding MEK-1 was derived from a mouse B cell cDNA template. Polymerase chain reaction and part of 5'coding region and 3'untranslated region of MEK-1 Min. Using the corresponding oligodeoxynucleotide primer. No catalytic Active MEK-1 is Lys³⁴³To Met by site-directed mutagenesis Generated. The wild-type MEK-1 and the catalytically inactive MEK-1 protein are As a recombinant fusion protein containing a polyhistidine sequence at the NH2 terminus, Expressed in pRSETA. MEKK-transfected COS cells or mock transfection The lysate from the loaded COS cells (control) was F. PLC processing was performed. A portion of the fraction containing MEKK (20 μl) , 50 mM β-Glucerophosphate (pH 7.2) in a reaction volume of 40 μl. ), 100 μM sodium vanadate, 2 mM MgCl₂1 mM EGTA, 50 μM ATP, IP-20 (50 μg / ml), and 10 μl γ-³²Mixing with a buffer containing P-ATP, Existence of recombinant catalytically inactive MEK-1 (150 ng) (kinase-MEK-1) Incubation (+) or absence (-) for 40 minutes. Reaction is 5x SDS sample buffer (10 μl) was added to stop. 1% SDS buffer is 2% SDS, 5% glycerol, 62.5 mM tris-HCl (pH 6.8), 5% β-mercaptoethanol and 0.001% bromophenol blue Contains. Samples boiled for 3 minutes, SDS-PAGE and autoradiography Processed. Referring to FIG. 8A, autophosphorylated recombinant wild-type MEK-1 (WT M). EK-1) comigrated with phosphorylated, catalytically inactive MEK-1. Therefore, MEKK can phosphorylate MEK-1. But control cells Corresponding fraction of lysate from E. coli could not phosphorylate MEK-1 Was.Example 5 This example is a modified form of MEKK-1 used in the phosphorylation assay of Example 4. Studies showed that the condition did not autophosphorylate like wild-type MEK-1. This is described. Phosphorylation of catalytically inactive MEK-1 by MEKK was time-dependent ( FIG. 8B); MEKK was also phosphorylated. From FPLC on Mono Q column Fraction 22 (20 μl) was added to recombinant catalytically inactive MEK-1 (0.15 μg) and with or without μg) for the indicated times. Refer to FIG. 8B. And the kinases MEK-1 and ME Phosphorylation of KK was visible after 5 minutes and peaked after 20 minutes. MEKK The time-dependent increase in phosphorylation is high in MEKK protein in SDS-PAGE It was interrelated with mobility. Referring to FIG. 8C, the immunoblot was MEK. The K protein phosphorylates MEK at the peak of activity (fraction 22) and ( co-elute) (after FPLC on mono Q column). MEKK's Slowly moving species were also detected by immunoblot. Therefore, MEK Fuming of K appears to activate MEK and thus MAPK.Example 6 This example shows that phosphorylation of MEK by overexpressed MEKK results in MEK , Recombinant wild-type MEK-1, and modified forms of MAPK that are catalytically inactive. Described to be sexualized. COS cell lysates were fractionated by Mono Q-FPLC containing MEKK. Containing the fraction with γ-recombinant MAPK which is catalytically inactive.³²P-AT It activates the added wild-type MEK-1 so that it is phosphorylated in the presence of P. Their ability was measured. MEKK transfected or moc Lysates from k-transfected COS cells (control) were treated with Mono Q cells. Fractionated by FPLC on ram, fraction of fraction containing MEKK ( 20 μl) was mixed with buffer. Purified recombinant wild type MEK- 1 (150 ng) in the presence (+) or absence (-) as well as purified recombinant catalyst. Incubation in the presence of mediatingly inactive (kinase) MAPK (300 ng) did. Referring to FIG. 9A, lysis of COS cells transfected with MEKK. Fractions 20-24 from the debris are MEK-1 Activated. Therefore, MEKK phosphorylates and activates MEK-1, resulting in MAP K was phosphorylated.Example 7 This example shows that MEKK directly activates MEK and Not by activation of one or more other kinases contained Describe the studies shown. Overexpressed MEKKs were affinity purified MEKs from COS cell lysates. K_1-369Immunoprecipitated with antiserum. 15 μl of immunoprecipitated MEKK PAN (10 mM piperazine-N, N'-bis-2-ethanesulfonic acid (Pip es) (pH 7.0), 100 mM NaCl, and aprotinin (20 μg / Ml)) and 20 mM pipe in a final volume of 20 μl. 25 μCi with catalytically inactive MEK-1 (150 ng) in es (pH 7.0) Γ-³²P-ATP, 10 mM MnCl₂, And aprotinin (20 μg / ml) with (+) or without (-) incubation at 30 ° C for 15 minutes Was. The reaction was stopped by adding 5 × SDS buffer (5 μl). Sample for 3 minutes After boiling, SDS-PAGE and autoradiography treatment were performed. Referring to FIG. 9B, MEKK phosphorylates catalytically inactive MEK-1, which Hybridized with wild-type MEK-1 on SDS-PAGE. In the immunoprecipitate , Several phosphorylated bands of overexpressed MEKK were detected. These bands Is probably derived from MEKK autophosphorylation and is transfected with MEKK Of MEKK identified by immunoblot of lysates from isolated COS cells It corresponds to the form. Play Muno Immunoprecipitates obtained with serum did not contain MEKK and did not phosphorylate MEK-1. Was. Therefore, MEKK appears to directly phosphorylate MEK. Considered together, the results from Examples 4 to 7 show that MEKK is MEK. Phosphorylates and activates, showing that it phosphorylates and activates MAPK in turn ing.Example 8 This example demonstrates that Raf can also phosphorylate and activate MEK. You. Serum-blocked COS cells were stimulated with EGF and Raf was added to Raf- Immunoprecipitation with an antibody against the COOH terminus of 1. COS cells, vector alone Transfect with (control) or PCV / M5-MEKK construct (MEKK) transiently. It was perfect. Resting control cells were treated with human EGF (30 ng / ml), or Raf from cell lysate, COOH from Raf, treated for 10 min without Immunoprecipitation was performed with an antibody against the terminal peptide. Immunoprecipitated Raf was catalytically Inactive MEK-1 (150 ng) and 25 μl γ-³²P-ATP and Incube I started. Immunoprecipitated Raf was γ-³²MEK-1 in the presence of P-ATP It was phosphorylated (Fig. 10A). Raf exclusion from COS cells overexpressing MEKK Little or no phosphorylation of MEK-1 by Raf is observed in epidemiological sediment Was not done. Treatment of COS cells overexpressing MEKK with EGF resulted in immunoprecipitation. The phosphorylation of MEK-1 by Raf that occurred was similar (Fig. 10B). M Treatment of EKK-transfected and serum-blocked cells with EGF And then exempt Raf It was spun down and incubated with catalytically inactive MEK-1. For Raf Same amount of Raf in each sample, as shown by immunoblot with antibody Immunoprecipitated. The slowest migrating band is unrelated to Raf or MEK-1 Is an immunoprecipitated phosphoprotein. Control cells and trans in MEKK The amount of Raf in the immunoprecipitates from the transfected cells was determined by subsequent SDS-PA. The same as shown by immunoblot with antibodies to GE and Raf. It was like. Therefore, MEKK and Raf can activate MEK independently. Wear.Example 9 This example demonstrates that cells containing MEKK proteins are stimulated by growth factors. In response, the 98 kD MEKK protein isolated from PC12 cells was activated. Describe the facts. PC12 cells in starvation medium (DMEM, 0.1% BSA) for 18-20 hours By incubating, the serum was blocked and MEKK was not treated. Physical control or EGF (30 ng / ml) or NGF (100 ng / ml) MEKK NH3 from lysates containing equal amounts of cells treated for 5 min._FourEnd Immunoprecipitation with the above-mentioned anti-MEKK antibody specific for minutes. Immunoprecipitated MEKK 8 μl of PAN (10 mM piperazine-N, N′-bis-2-ethanesulfonic acid (Pipes) (pH 7.0), 100 mM NaCl, and aprotinin ( 20 μg / ml)) and catalytically inactive MEK-1 (150 ng). And 40 μCi (γ-³²P) ATP and universal kinase buffer (20 mM piperazine N-N, N'-bis-2-ethanesulfonic acid (Pipes) (pH 7.0), 1 00 mM MnCl₂, And apyrotinin (20 μg / ml)) in a final volume of 20 μl, incubated at 30 ° C. for 25 minutes did. The reaction was stopped by adding 2X SDS sample buffer (20 μl). sample Was boiled for 3 minutes and subjected to SDS-PAE and autoradiography. Ra f-B was an antiserum against the COOH-terminal peptide of Raf-B (Santa C ruz Biotechnology, Inc. ), As above, with the same Immunoprecipitated from treated and treated PC12 cell lysates and similarly measured. Raf-1 was treated with antiserum (Santa) against the COOH-terminal amino acid of Raf-1. Cruz Biotechnology, Inc. ) For immunoprecipitation. serum MEKK activity when starved PC12 cells were treated with epidermal growth factor (EGF) increased. Referring to FIG. 11, the results show that MEK-1 purified by immunoprecipitation of MEKK. To measure phosphorylation of (kinase inactive type) by in vitro kinase assay Therefore, it was obtained. NGF compared to control immunoprecipitates from untreated cells , Stimulated a slight increase in MEKK activity. Raf-B showed high basal activity However, stimulation of MEKK activity by NGF and EGF was observed by Raf- Similar to B activation. Activation of c-Raf-1 by NGF and EGF is It was almost negligible compared to that of EKK or Raf-B. The time course of MEKK stimulation by EGF was 0, 1, 3, 5, 10, or 20. MEK from lysates of PC12 cells treated with EGF (30 ng / ml) for min K or Raf-B protein was immunoprecipitated and the protein was labeled as described above. In addition, catalytically inactive MEK-1 (150 ng) and (γ-³²P) ATP and incu I went by beating. De Data were determined by phosphorimager analysis of radioactive gels from a typical experiment. Represents the relative magnitude of the response, quantified, at each time point. The time course of EGF treatment is M Shows that EKK activation reaches a maximal level after 5 minutes and persists for at least 30 minutes. (Fig. 12). Raf-B showed similar time course; peak activity was EGF It occurred within 3-5 minutes after treatment and lasted up to 20 minutes. To further separate EGF-stimulated MEKK activity from that of Raf-B Raf-B was immunocleared from cell lysates prior to MEKK immunoprecipitation. Raf -B was treated with EGF (30 ng / ml) for 5 minutes or not Precleared from lysates of serum starved PC12 cells. Raf-B to Raf-B Using anti-serum against, or using pre-immune IgG anti-serum as a control, 2 Preliminarily cleaned once. The pre-cleaned supernatant is then resuspended in MEKK or Raf-B. Immunoprecipitation with antiserum and catalytically inactive MEK-1 (( γ-³²P) Incubated with ATP. EGF stimulated and unstimulated Pre-cleaned PC12 cell lysates with IgG or Raf-B antiserum, Then, immunoprecipitation treatment was performed with MEKK antiserum or Raf-B antibody. Shown in Figure 13 The results shown were Raf-B phosphor imager during in vitro kinase assay. Raf-B activity was shown to be reduced by 60% as measured by analysis. EGF Stimulated MEKK activity was not affected by Raf-B withdrawal, which was It is suggested that Raf-B is not a component of MEKK immunoprecipitates. Raf-B live At least 40% of the sexes are resistant to Raf-B antibody precleaning . Recombinant wild-type MEKK overexpressed in COS cells showed serine and threonine residues. It easily autophosphorylates on the base and the amino terminus of MEKK is highly serine and threonic. Rich. MEKK contained in the immunoprecipitate of PC12 cells was purified with recombinant M In vitro kinase for selective phosphorylation of EKK amino-terminal fusion proteins Tested by measuring method. Serum-starved PC12 cells were treated with EGF (30 ng / ml) for 5 minutes Equal amount of protein from cell lysate of MEKK, Raf-B, or control And immunoprecipitated with preimmune antiserum. The immunoprecipitate was purified with recombinant MEKK NH.₂ Terminal fusion proteins (400 ng) and (γ-³²P) ATP and as above Incubated. The results shown in FIG. 14 show that EGF stimulated and EG MEKK immunoprecipitated from lysates of PC12 cells that were not F stimulated is inactive MEKKNH of 50kD₂Strongly phosphorylates the fusion protein, while Raf-B, Immunization from PC12 cells with or without EGF stimulation The pre-immunoprecipitate used MEKK NH as a substrate.₂Did not use fusion protein It is shown that. Therefore, it was stimulated by EGF contained in MEKK immunoprecipitates. MEKK activity was not due to contaminating Raf kinase.Example 10 This example is based on FPLC Mono Q ion exchange color of PC12 cell lysate. The MEKK activity in the mu fraction is described. Cell lysates were prepared from EGF stimulated PC12 cells. 1 ml column A portion (900 μl) of the fraction (1-525 mM NaCl gradient) was collected by It was concentrated by precipitation with loroacetic acid and placed on the gel as above. Gel gel And then immunoassay with MEKK-specific antibody. Blotted. The results shown in FIG. 15A indicate that the immunoreactivity of 98 kD MEKK It shows that it was eluted in fractions 10-12. Raf-B immunoreactive The peak elutes in fraction 14, while Raf-1 is in the eluate from the column. Was not detected by. PC12 of unstimulated control cells or cells treated with EGF A portion (30 μl) of each fraction from the lysate was used as a substrate for purified recombinant ME. It was measured as described above in a buffer containing K-1 (150 ng). FIG. 15B The results shown in Fig. 10 are fractions 10-1 from EGF-stimulated PC12 cells. The peak of MEKK activity eluted in 2 phosphorylates MEK, while unstimulated cells Shows that less MEK phosphorylation occurred in the fraction from You.Example 11 In this example, MEK-1 and MEKK NH₂Phosphorylation of terminal fusion proteins Is due to the activity of 98 kD PC12 cell MEKK. And describe it. Cell lysates made from EGF stimulated and unstimulated cells were loaded with Mono Endogenous MEKK was partially purified by fractionation by FPLC on a -Q column . Untreated control PC12 cells or treated with EGF (30 ng / ml) for 5 minutes Lysates from cells were loaded with Mono using a linear gradient of 0-525 mM NaCl. Fractionated by FPLC on Q column. Part of each even numbered fraction ( 30 μl) of purified recombinant MEK-1 (15) as substrate in a final volume of 40 μl. 0 ng) containing buffer (20 mM piperazine-N, N'-bis-2-ethane Sulfonic acid (Pipes) (pH 7.0), 10 mM MnCl₂, Aprocini (20 μg / ml), 50 mM β-sulcerophosphate (pH 7.2), 1 mM EGTA, IP-20 (50 μg / ml), 50 mM NaF, and 30 μCi (γ-³²P) ATP) and incubate at 30 ° C for 25 minutes Was. The reaction was stopped by adding 2 × SDS sample buffer (40 μl) and boiling , SDS-PAGE autoradiography treatment was performed. MEKK activity peak The elution was in fractions 10-12. Lysis of PC12 cells treated with EGF Aliquots of each even-numbered fraction (30 μl) from the Recombinant MEKK NH as substrate for₂End fusion protein (400ng) It was mixed with the buffer solution as described above except that it was contained. Then, purified recombinant quiner Inactive MEK-1 or MEKK NH₂The terminal fusion protein was (γ-³² P) ATP) in the presence of a 98 kD MEKK It was determined whether to directly phosphorylate the substrate. PC12 thin treated with EGF Lysate fraction 10-14 phosphorylates MEK-1 while untreated Little MEK-1 phosphorylation occurred in the physical control fractions. Live The sex peak was a little broad (fractions 8-16), but MEKK NH₂ The terminal fusion protein was also phosphorylated in the same fraction as MEK-1. Referring to FIG. 16, an immunoblot of column fractions revealed a 98 kD MEKK protein is exogenously added kinase inactive MEK-1 or MEKK NH of 50kD₂With the peak activity of phosphorylation of the terminal fusion protein It was shown that both co-eluted. Part of the even-numbered column fraction (900 μ l) was concentrated by precipitation with trichloroacetic acid and immunoblotted with MEKK antibody. I did it. Immunoreactive pea The elution was in fractions 10-12.Example 12 This example describes activation of MEK by a 98 kD MEKK. MEKK of 98 kD was treated with untreated (-) or EGF-treated (+) PC12 cells. MEKK from Example 1 as described in Example 1_1-369Immunoprecipitated using antiserum . The immunoprecipitates were (+) or (+) in the presence of purified recombinant wild type MEK (150 ng) In the absence (−), and purified recombinant catalytically inactive MAPK (300 ng) and (Γ-³²P) Incubated in the presence of ATP). Shown in FIG. 17A The results show that MEKK immunoprecipitated from EGF-stimulated cells phosphorylates MEK. It is shown that MAPK was phosphorylated upon activation by activation. Recombinant added In the absence of MEK, MAPK phosphorylation did not occur. From immunoblot In the MEKK immunoprecipitates from EGF-stimulated PC12 cells, It was shown that there was no PK (Figure 17B) or contaminated MEK (Figure 17C). Obedience Thus, phosphorylation and activation of MEK is dependent on MEKK activity measured in immunoprecipitates. This is due to EGF stimulation.Example 13 This example shows that 98 kD PC12 cells MEKK and Raf are growth factor mediated. Describes whether a functional Ras protein is required for gnunning I do. Dominant negative Ha-ras (Asn-17) (N¹⁷Ras) in PC12 cells Immunoprecipitation of expressed and EGF-stimulated MEKK or Raf-B activation. MEK-1, which is a kinase inactive substance as a substrate in precipitation Was measured using. Dexamethasone-induced N¹⁷PC1 stably expressing Ras 2 cells containing 0.1% BSA with or without 1 μM dexamethasone Serum-starved for 18-20 hours in culture medium followed by untreated or EGF (3 0 ng / ml) for 5 minutes. Equal amount of soluble protein from cell lysate Immunoprecipitated with MEKK antiserum or Raf-B antiserum and purified as described above. Recombinant catalytically inactive MEK-1 and (γ-³²P) Incubate with ATP Was. N¹⁷Ras expression is N¹⁷Stably transfected with Ras gene Induction was performed in PC12 clones by adding dexamethasone to the starvation medium. Was issued. N¹⁷Ras expression is dependent on its ability to phosphorylate kinase-inactive MEK The activation of MEKK by EGF was suppressed as measured by force. Raf-B EGF-mediated activation is also N¹⁷Uninduced N in PC12 cells expressing Ras¹⁷ Significantly reduced compared to Ras transfectants. Wild type PC12 cells Addition of dexamethasone to EGF-induced MEKK activation or It had no effect on the magnitude of Raf-B activation. N¹⁷Stable with Ras gene The transfected PC12 cell clone was Poor responsiveness to EGF-mediated activation of MEKK activity. From these results, Active Ras is a growth factor-stimulated activity of Raf-B and MEKK in PC12 cells. It was shown to be required for sexualization, which means Ras, Raf and MEKK strains Proliferation and differentiation by activation of multiple protein kinase effectors from Escherichia coli To mediate its effect on. Therefore, within 5 minutes, EGF It stimulated a peak of activity, which persisted for at least 30 minutes after treatment and showed Raf-B activity. Aging It was similar to the change. Nerve growth factor (NGF) and phorbol ester TPA It activated MEKK to a lesser extent than EGF. Immunoprecipitate or column MEKK activity in the fraction was determined by EGF-stimulated c-Raf-1 and Raf-. It can be separated from B activity. Foscholine pretreatment is EGF, NGF, and TPA Abolishes MEKK and Raf-B activation by (Fig. 18). Compatible with EGF MEKK and Raf-B activation is associated with a dominant negative N¹⁷Stable expression of Ras Was suppressed. These findings indicate that Ras-dependent MEKK regulation by growth factors Represents the first proof, and Ras between Raf and members of the MEKK family Suggests the emergence of complex intracellular kinase networks that can associate with each other You. Growth factor-mediated activation of 98kD PC12 cell MEKK is suppressed by PKA Intracellular cAMP using forskolin to determine if Elevated and activated PKA. Serum-starved PC12 cells were treated with forskolin. Pretreatment with (50 μM) for 3 minutes or without forcorin, Activates inkinase A, then EGF (30 ng / ml), NGF (100 ng / ml) or TPA (200 nM) for 5 minutes to reduce MEKK. Immunoprecipitated from an equal amount of soluble protein from cell lysate and purified as described above. Recombinant catalytically inactive MEK-1 and (γ-³²P) ATP and incubate did. Raf-B activity from the same cell lysate was regulated differently from that of MEKK. It was measured in order to test whether or not. Raf-B was lysed to the same cytolysis as above. Immunoprecipitation from the lysate and its ability to phosphorylate MEK-1 as described above. I measured it. Forskolin pretreatment is EGF as measured by their ability to phosphorylate inactive MEK-1 Activation of MEKK and Raf-B by NGF, NGF, and TPA was abolished (Fig. 1). 8). Forskalin treatment alone has no significant effect on either kinase Was. These results indicate that PKA activation is 98% in addition to Raf-1 and Raf-B. It was shown to suppress growth factor stimulation of the kD PC12 cell MEKK, which , Ras between or downstream and upstream or level of each of these three kinases Suggests the existence of a common regulatory control point for the action of PKA.Example 14 This example shows that similar or different MEK activity is_iProtein Whether thrombin is involved in the activation of MAPK by the cytoplasmic bound receptor. Measuring MEKK activity in cell lysates from stimulated Rat 1a cells The decision to make is described below. Thrombin-stimulated cells are the major MEs detected in EGF-stimulated cells. MEK activity was shown co-fractionated with the K peak. Thrombin attack triggered ( The magnitude of MEK activity from cells is generally measured by EGF stimulation. It is 2-3 times lower than that observed in severe cases, which is due to the inventor's attack on thrombin. It is associated with the smaller MAPK response observed in bombardment-induced cells. Rat 1 expressing gip2, v-src, v-ras, or v-raf By differential regulation of MEK in a and NIH 3T3 cells, the inventors have determined that MEK- I have come to study protein kinases, one putative regulator. Recently , Raf-1 was shown to be able to phosphorylate and activate MEK. R The af activation was measured by the following method. Cells are serum starved and challenged in the presence or absence of appropriate growth factors as described above. Triggered an attack. Serum-starved Rat 1a cells challenged with buffer alone or with EGF Raf and Raf were immunoprecipitated using an antibody that recognizes the C-terminus of Raf . Cells were placed in ice-cold RIPA buffer (50 mM Tris, pH 7.2, 150 mM N 2 aCl, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 1.0% Tr iton X100, 10 mM sodium pyrophosphate, 25 mM gluceroline Sodium acidate, 2 mM sodium vanadate, 2.1 μg / ml aprotinin) Dissolve by rubbing in and microfuge for 10 minutes to remove nuclei Was. The supernatant was normalized for protein content and 4 times with Protein A Sepharose. After preclearing for 2-3 hours at 0 ° C., a rabbit antiserum against the C-terminus of Raf-1 was used. Immunoprecipitated with Protein A Sepharose. Beads with ice-cold RIPA twice, P AN (10 mM Pipes, pH 7.0, 100 mM NaCl, 21 μg / m 1 aprotinin) and washed twice. Dilute a portion of the immunoprecipitate with SDS sample buffer And used for immunoblot analysis. The rest is the kinase buffer (20 mM Pip es pH 7.0, 10 mM MnCl₂, 150 ng kinase inactive, ME K-1, 30 μCi γ-³²P-ATP and 20 μg / ml aprotinin) Were resuspended in a final volume of 50 μl for 30 minutes at 30 ° C. Wild-type recombinant ME K-1 was used as a marker for autophosphorylation in parallel. Reaction is 12.5 μl S Stop by the addition of DS sample buffer and boil for 5 minutes, then mix with SDS-PAGE. Radiography. Immunoprecipitated Raf was γ-³²Phosphorylation of MEK-1 in the presence of P-ATP We were able to. Recombinant MEK-1 used in this assay That it did not autophosphorylate as observed with wild-type MEK-1 Was confirmed to be inactive. In immunoprecipitates from control cells, Ra Little or no phosphorylation of MEK-1 by f was observed. Of EGF Challenge was apparently stimulated Raf-catalyzed phosphorylation of MEK-1; opposition Intrinsically, Thrombin Challenge of Rat 1a Cells Apparently Activates Endogenous MEK Even when it did, it did not measurably activate Raf. EGF is recombinant RaK phosphorylation of MEK-1 was stimulated approximately 2.6 times basal. Gip2 again Was detected in Raf immunoprecipitates from Rat la cells expressing v-src. Only a small amount of MEK phosphorylation by C. was observed. EGF stimulation is Raf-Catalyzed Phosphorylation of MEK-1 in Cell Strains 1.8- and 1.4-fold, respectively It was able to be activated. Of EFG response in cells expressing Gip2 and v-src Blunting desensitizes EFG receptors to constitutive activation of MAPK. Seems to be the result. The amount of Raf in the immunoprecipitate was determined by the subsequent SDS-PAGE and And immunoblot using Raf antibody showed similar. Raf plays a role in this growth factor because the thrombin stimulation of MEK is 2-3 times higher than the basal level. At least 1.5 times that of MEK phosphorylation if it significantly contributes to MEK activation by Is expected to stimulate. This level of activation is associated with EGF-stimulated Gip2 and vs It was detectable in cell lines expressing rc. Therefore, Raf thrombin activation What could not be detected is probably due to the sensitivity of the assay. MAPK Toro Stimulation is highest in 3 minutes. 1 minute or 5 minutes with thrombin Rat 1a Raf activity was not increased upon stimulation of the vesicles. In NIH3T3 cells, EGF increases Raf by about 2 as in Rat 1a cells. . It is activated 7-fold, whereas thrombin is not. NIH expressing V-Raf 3T3 cells showed no increase in MEK-1 phosphorylation. The result is that MEK Surprisingly, it was clearly activated in NIH2T3 cells expressing v-Raf. Was. In addition to c-Raf-1, p90 and p75gag-raf fusion proteins Both were immunoprecipitated by antisera from v-Raf NIH3T3 cells. p Although 75gag-raf was shown to show protein kinase activity, NH₂ The terminal gag fusion protein was isolated from Raf of recombinant MEK-1 in an in vitro assay system. It is possible to hinder phosphorylation stereochemically. v-Raf kinase activity More research to measure needs to be done. The result is that MEK activation is Have shown that activation by Raf cannot explain this. Thrombin stimulated G_iV-src transfection in the protein binding pathway and in gip2 Additional regulatory kinases for MEK that contribute to MEK activation in isolated cells Must exist.Example 15 This example compares full-length MEKK protein and negative regulatory protein MEKK proteins pppss-trunc and Ncol-trunc Shows the ability to activate MAP activity. The results shown in FIG. 19 indicate that the cleaved MEKK molecule is more active than the full length MEKK. It was shown that it was. In fact, the truncated MEKK molecule is a full-length MEKK It was at least about 1.5 times more active than the protein. Therefore, the adjustment of MEKK Removal of the main deregulates the activity of the catalytic domain and improves enzyme activity .Example 16 This example demonstrates the preferential activation of JNK by MEK as compared to Raf. To describe. Healer cells, cut MEKK_370-738Induced breast tumor virus Under the control of the lomomotor, it is possible to transiently transfect with the epitope-tagged JNK1. (Derijard et al., Cell, Vol. 76, page 1028, Detailed description in 1994). Other Healer cells were also cut with BXB-Raf , An epitope-tagged JN under the control of an inducible mammary tumor virus promoter Transiently transfected with K1 (Derigard et al., Supra). Next day, MEKK_370-738Expression and BXB-Raf expression were determined by 10 μM) was induced for 17 hours. Then produce the cell extract , Immunocomplex kinase assay for JNK activity (Derij). Ard et al., supra, for details). The result shown in FIG. 20 shows that MEKK has not Stimulates JNK activity about 30 to about 50 times that of stimulated cells (basal), and stimulates Raf. It is shown that the JNK activity was stimulated about 15 to 25 times as much as that of the cultured cells.Example 17 This example demonstrates that c-Myc transactivation in response to MEKK expression. We describe that phosphorylation of the ectodomain activates MYC-GAL4 transcriptional activity. . Two separate expression plasmids were constructed as follows. Expression plasmid pLN CX contains c-myc (1-103) linked to GAL4 (1-147) ligated to a cDNA clone (Seth et al., J. Bi ol. Chem. , 266, pp. 23521-23524, 1993), The recombinant molecule pMYC-GAL4 was generated. Expression plasmid UAS_G-TK Le Luciferase (Sadowski et al., Nature, 335, 563-5) 64, 1988) with pMYC-GAL4 or pLU-GAL, Swi. Transfection into ss 3T3 cells using standard methods in the art and recombination Cells (referred to herein as LU / GAL cells) were generated. Recombination control Cells are also in pGAL4-control plasmid containing GAL4 (1-147) alone By transfection in the absence of c-myc (1-103) Manufactured. LU / Gal cells to PMEKK_370-738, PMEKK (full-length MEKK_1-738 , BXB-Raf, pMyc-Gal4, pCREB-Ga. l4 (Gal4_1-147CREB fused to_1-261Is coded; Hoeff Ler et al., Mol. Endocrinol. , Vol. 3, pp. 868-880, 1 989), pGal4 or CREB fusion protein (designated GAL4). Transfected with a gap. Incubate the transfected cells overnight, then standard in the industry Dissolved using the method. Use a luminometer to determine the luciferase activity of each cell lysate. It was measured. The results shown in FIG. 21 indicate that MEKK is c-Myc transactivator. Phosphorylation of the translocation domain, which activates the c-Myc domain and Selective in a manner that induces transcription of the defective luciferase gene Shows that it can be stimulated. Furthermore, the result is that MEKK is CRE Stimulates B activation It is not shown. In addition, activated Raf can stimulate Myc activation. I can't. A schematic diagram of the activation mechanism of c-Myc protein by MEKK is shown in FIG. 3 is shown.Example 18 This example demonstrates that the MEKK3 protein is used to restore the p38MAPK protein. Note that it is not phosphorylated by MEKK1 protein List. COS cells encoding MEKK1 or MEKK3 protein c Expression plasmid pCVM5 or MEKK cD linked to a DNA clone Transfection with control pCVM5 plasmid lacking NA insert. 48 hours post-transfection, COS cells were lysed and lysates were loaded with Mono Q Fractionation on the FPLC column using the conditions described in Example 4. Fraction , Kinase described in Example 4 for tyrosine phosphorylation of MAP kinase-like enzyme Analysis was performed using the Zee measurement method. Referring to FIG. 23, the expression of MEKK3 is p Induces tyrosine phosphorylation of 38 MAPK and p42 and p44 MAPK You. However, MEKK only induces weak phosphorylation of p38 MAPK. Induces phosphorylation of p42 and P44 MAPK.Example 19 This example describes MEKK-induced apoptosis. For apoptosis studies, cells were prepared as follows. Swiss 3 T3 cells and REF52 cells were treated with β-galactosyl for detection of injected cells. Transfected with an expression plasmid encoding a dase (β-Gal) . Then β-Gal transfected MEKK for one set of cells_370-738Expression vector encoding a protein Was microinjected. Then another set of β-Gal transfected cells And a small amount of an expression vector encoding the cleaved BXB-Raf protein. Injected. A.Beauvericin-induced apoptosis The first group of transfected Swiss 3T3 cells and REF52 cells , 50 μM Beauvericin at 37 ° C. for 6 hours. Beauverisin is feeding It is a compound known to induce apoptosis in celloid cells. Cell number Two groups were treated with control buffer lacking Beauvericin. Then the treated cells Immobilize in paraformaldehyde and support using standard protocols in the industry. Permeabilized with nin. Then permeabilized cells, detect cells, cytoplasmic contraction In order to achieve this, anti-tubulin antibody labeled with fluorescein (1: 500; G (Obtained from IBCO, Gaithersburg, MD) or stained with DNA To detect nuclear condensation using 10 μM propidium iodide (Sigma) , St. (Obtained from Louis, Mo.) Was. The labeled cells were then used with a Nikon Diaphot fluorescence microscope. And observed by differential fluorescence imaging. FIG. 24 shows Swiss 3T3 cells. And two fields of REF52 cells are shown, the first field is a field treated with control buffer. Vesicles and the second field represents cells treated with buverizine. Beauverage Cells treated with phospholipids are associated with cell contraction (anti-tubulin) that is characteristic of apoptosis. Antibody monitored) and nuclear condensation (monitored by propidium iodide) showed that. B.MEKK-induced apoptosis β-galactosidase expression plasmid, and MEKK encoding plasmid Swiss 3T3 cells microinjected with BXB-Raf encoding plasmid And REF52 cells were treated and observed using the method described in Section A above. Anti-β-Gal antibody (1: 500; GIBCO, Gaithersburg, MD Injected cells) were used to detect injected cells. Referring to FIG. 25, RE Microscopic analysis of F52 cells showed that cells expressing MEKK protein showed cytoplasmic contraction. It was shown to undergo nuclear condensation and to undergo apoptotic cell death. On the contrary, BXB-Ra Cells expressing the f protein showed normal morphology and did not undergo apoptosis . Similarly, referring to FIG. 26, microscopic analysis of Swiss 3T3 cells showed that ME Cells expressing the KK protein undergo cytoplasmic contraction and nuclear condensation and undergo apoptotic cell death. It was shown to die. Conversely, cells expressing the BXB-Raf protein are positive. It showed a normal morphology and did not undergo apoptosis. FIG. 27 shows MEKK protein undergoing substantial cytoplasmic contraction and nuclear condensation. 3 representative fields of the RFE52 cells that perform the control and the control cells that do not express MEKK. Shown in comparison. Similarly, FIG. 28 shows that ME undergoes substantial cytoplasmic contraction and nuclear condensation. Three representative fields of Swiss 3T3 cells expressing KK protein are shown in M Shown compared to control cells that do not express EKK. Thus, the MEKK protein Can induce apoptotic programmed cell death, and the Raf protein Can not.Example 20 This example demonstrates the regulation of MAPK activity by MEKK and Raf proteins. To describe. COS cells were produced using the method described in Example 3. In addition, COS Vesicles were transfected with the pCVMV5 Raf construct (1 μg: Raf). . The FPLC Mono Q ion exchange column fraction was run as described in Example 3. According to the method described in Heasley et al., Supra for MAPK activity. It was measured. Referring to FIG. 29, when MEKK and Raf were overexpressed in COS1 cells, M APK activity was stimulated to similar levels above basal levels. The above description of the invention has been provided for purposes of illustration and description. Sa Furthermore, the description is not intended to limit the invention to the form disclosed herein. Not. Therefore, the changes and modifications are the same as the above teachings, and the skill and knowledge of the related art are required. Knowledge is within the scope of the invention. Furthermore, the preferred embodiments described in the above specification are The best way to carry out the invention is described and those skilled in the art can use the invention in various ways. It may also be utilized with various modifications required for the particular application or use of the invention. Is intended. The scope of the appended claims should be limited to the extent permitted by prior art. It is intended to be construed to include the physical aspects.

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年５月２２日【補正内容】請求の範囲１．配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０からなる群から選ばれたアミノ酸配列をコードしている核酸分子と、緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下で、ハイブリッド形成することができる核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含んでなる単離されたおよび／または組換えタンパク質。２．配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０からなる群から選ばれたアミノ酸配列をコードしている核酸分子と、緊縮条件下で、ハイブリッド形成することができる核酸配列によってコードされたアミノ酸配列の少なくとも一部を有する少なくとも１種の単離されたおよび／または組換えタンパク質を含んでなる製剤。３．配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９からなる群から選ばれた核酸配列と、緊縮条件下で、ハイブリッド形成することができる単離された核酸分子。４．配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９からなる群から選ばれた核酸配列と、緊縮条件下で、ハイブリッド形成することができる核酸分子を含んでなり、前記核酸分子が発現ベクターに作用結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙｌｉｎｋｅｄ）している組換え分子。５．発現ベクターに作用結合した核酸分子を含んでなり、前記核酸分子が配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９からなる群から選ばれた核酸配列と、緊縮条件下で、ハイブリッド形成することができる核酸配列を含んでなる組換え分子で形質転換された組換え細胞。６．細胞の恒常性を調節する方法であって、細胞を、前記細胞中のＲａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を改変することができる薬剤の量と接触させることを含んでなる調節方法。７．疾病を有する患者に、細胞中のＲａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を改変することができる薬剤の量を投与することを含んでなる内科的疾病を治療する方法。８．腫瘍形成と自己免疫からなる群から選ばれた内科的疾病を抑制する方法であって、疾病を有する患者に、細胞中のＲａｆ依存性経路の活性に比してＭＥＫＫ依存性経路の活性を改変して、前記細胞の増殖を阻害するすることができる薬剤の量を投与することを含んでなる内科的疾病の抑制方法。９．ａ）細胞を推定された調節分子と接触させること；およびｂ）前記の推定された調節化合物が前記細胞中のＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節する能力を、前記ＭＥＫＫ依存性経路の少なくとも１つの構成員の活性化を測定することによって、決定すること；を含んでなる方法によって同定された、細胞中のＭＥＫＫ依存性経路の活性を調節することができる治療化合物。１０．Ｒａｆ依存性経路の活性を低下させることができる分子、ＭＥＫＫ依存性経路の活性を増加させることができる分子およびそれらの組合せからなる群から選ばれた少なくとも１種の調節分子を含んでなる治療化合物の有効量を患者に投与することを含んでなる疾患を治療する方法であって、前記有効量が、前記疾患に関与する有害細胞の消耗をもたらす量を含んでなる疾患の治療方法。１１．ＭＥＫＫ核酸配列を特異的に検出することができることを特徴とする、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９からなる群から選ばれたＭＥＫＫ核酸配列と、緊縮条件下で、選択的にハイブリッド形成する単離された核酸、またはそれらの相補的配列。１２．マップキナーゼキナーゼの活性をモジュレートすることを特徴とする、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０からなる群から選ばれた核酸配列と、緊縮条件下で、ハイブリッド形成することができる核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含んでなる単離されたおよび／または組換えタンパク質。１３．マップキナーゼの活性をモジュレートする、請求の範囲１に記載のタンパク質。１４．キナーゼドメインを含む、請求の範囲１３に記載のタンパク質。１５．マップキナーゼキナーゼをリン酸化する、請求の範囲１４に記載のタンパク質。１６．ＭＥＫＫと異なるアミノ酸配列を有する第二ポリペプチド配列をさらに含んでなる融合タンパク質である、請求の範囲１に記載のタンパク質。１７．哺乳類由来であるマップキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＥＫＫ）をコードしている単離された核酸であって、該ＭＥＫＫが、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０からなる群から選ばれたアミノ酸配列と相同でありそしてＭＥＫＫ１と異なるるアミノ酸配列を有することを特徴とする単離された核酸。１８．細胞の恒常性がＭＥＫＫ依存性経路に依存性であることを特徴とする、細胞を、前記細胞中のＭＥＫＫタンパク質のサブセットの活性を選択的に改変する薬剤の量と接触させることを含んでなる、細胞の恒常性を調節する方法。１９．薬剤がＭＥＫＫ１に比して他のＭＥＫＫタンパク質の活性を選択的に調節する、請求の範囲１８に記載の方法。２０．薬剤が、ＭＥＫＫ１に比して、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８および配列番号：１０からなる群から選ばれたＭＥＫＫの活性を選択的に調節する、請求の範囲１８に記載の方法。２１．細胞を、細胞が存在する動物中に薬剤を投与することによって、生体内で接触させる、請求の範囲１８に記載の方法。２２．配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９からなる群から選ばれたＭＥＫＫコード配列で表わされたヌクレオチド配列を有する、請求の範囲３に記載の核酸。２３．コード配列が、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７および配列番号：９からなる群から選ばれたコード配列に、緊縮条件下で、ハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、組換えタンパク質のためのコード配列を含んでなる核酸ベクター。[Procedure of Amendment] Article 184-8 of the Patent Act [Submission date] May 22, 1996 [Correction contents] The scope of the claims 1. SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 A nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of: gent) conditions, a nucleic acid sequence that can hybridize Isolated and / or recombinant protein comprising the encoded amino acid sequence . 2. SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 A nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence selected from the group Of the amino acid sequence encoded by the nucleic acid sequence capable of hybrid formation. At least one isolated and / or recombinant tan having at least a portion A formulation comprising protein. 3. Consists of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 Can hybridize with a nucleic acid sequence selected from the group under stringent conditions An isolated nucleic acid molecule. 4. Consists of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 Can hybridize with a nucleic acid sequence selected from the group under stringent conditions A nucleic acid molecule, said nucleic acid molecule operably linked to the expression vector. A recombinant molecule that has been ive linked. 5. A nucleic acid molecule operatively linked to an expression vector, said nucleic acid molecule being a sequence No .: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 Nucleic acid sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the nucleic acid sequence A recombinant transformed with a recombinant molecule comprising Eh cells. 6. A method of regulating homeostasis of a cell, the method comprising: Of agents capable of modifying the activity of the MEKK-dependent pathway relative to that of the sexual pathway A method of adjustment comprising contacting with an amount. 7. MEKK in patients with disease compared to the activity of Raf-dependent pathway in cells Comprising administering an amount of an agent capable of altering the activity of a dependent pathway A method of treating a medical condition. 8. A method of controlling medical diseases selected from the group consisting of tumor formation and autoimmunity Thus, in patients with disease, MEK compared to the activity of Raf-dependent pathway in cells Drug capable of inhibiting the proliferation of said cell by modifying the activity of K-dependent pathway A method for suppressing a medical disease, which comprises administering an amount of a drug. 9. a) contacting the cell with a putative regulatory molecule; and b) The putative regulatory compound modulates the activity of a MEKK-dependent pathway in the cell. Capacity to measure activation of at least one member of the MEKK-dependent pathway. By determining, by determining; Modulating the activity of a MEKK-dependent pathway in a cell identified by a method comprising A therapeutic compound that can be ascribed. 10. MEKK-dependent molecule capable of reducing the activity of Raf-dependent pathways A group consisting of molecules and combinations thereof that can increase the activity of the sexual pathway To the patient an effective amount of a therapeutic compound comprising at least one regulatory molecule selected from A method of treating a disease comprising administering the effective amount of the A method for treating a disease comprising an amount that causes depletion of harmful cells involved in the disease. 11. Characterized in that it can specifically detect the MEKK nucleic acid sequence, From the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 A single nucleic acid sequence that selectively hybridizes with a selected MEKK nucleic acid sequence under stringent conditions. Separated nucleic acids, or their complementary sequences. 12. Characterized by modulating the activity of map kinase kinase, Is the group consisting of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10? A nucleic acid capable of hybridizing with a selected nucleic acid sequence under stringent conditions An isolated and / or comprising an amino acid sequence encoded by the sequence Recombinant protein. 13. The protein according to claim 1, which modulates the activity of map kinase. Park quality. 14． The protein according to claim 13, comprising a kinase domain. 15. The protein according to claim 14, which phosphorylates map kinase kinase. Park quality. 16. A second polypeptide sequence having an amino acid sequence different from MEKK is further added. The protein of claim 1 which is a fusion protein comprising. 17． Map kinase kinase kinase (MEKK) derived from mammals Isolated nucleic acid, wherein the MEKK is SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 Characterized by having an amino acid sequence which is homologous and differs from MEKK1 Isolated nucleic acid. 18. Cell homeostasis is dependent on a MEKK-dependent pathway, A cell for the activity of a subset of MEKK proteins in said cell To regulate cellular homeostasis, which comprises contacting with an amount of a drug that selectively modifies How to save. 19. The drug selectively modulates the activity of other MEKK proteins relative to MEKK1. 19. The method of claim 18, wherein the method comprises: 20. The drug has SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: compared to MEKK1. : 8 and SEQ ID NO: 10, the activity of MEKK selected from the group consisting of: 19. The method of claim 18, wherein the method comprises: 21. Cells in vivo by administering the drug into an animal in which the cells are present. 19. The method according to claim 18, wherein the contact is performed with. 22. SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 Having a nucleotide sequence represented by a MEKK coding sequence selected from the group: The nucleic acid according to claim 3. 23. The coding sequences are SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and the sequence No .: 9 to the coding sequence selected from the group consisting of hybrid forms under stringent conditions A recombinant protein, characterized in that it contains a nucleotide sequence A nucleic acid vector comprising a coding sequence.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵＣ１２Ｎ 9/12 ＡＢＥ // Ａ６１Ｋ 35/76 ＡＢＡ 48/00 ＡＥＤＡＢＦ (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI C07H 21/04 9051-4C A61K 37/02 ADU C12N 9/12 ABE // A61K 35/76 ABA 48/00 AED ABF (C12N 9/12 C12R 1:19) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, JP, KE, KG, KP, KR, K , LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, TJ, TT, UA, US, UZ, VN

Claims

[Claims] 1. SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 A nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of: gent) conditions, a nucleic acid sequence that can hybridize An isolated protein comprising at least a portion of the encoded amino acid sequence. 2. Sequence number: 2, sequence number: 4, sequence number: 6, sequence number: 8 and sequence number No. 10 and a nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of Encoded by a nucleic acid sequence capable of hybridizing under reduced conditions At least one isolated protein having at least a portion of an amino acid sequence A formulation comprising: 3. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO No .: 9 and hybridizes with a nucleic acid sequence selected from the group consisting of 9 under stringent conditions. Isolated nucleic acid molecule. 4. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO No .: 9 and hybridizes with a nucleic acid sequence selected from the group consisting of 9 under stringent conditions. A nucleic acid molecule capable of binding to an expression vector. A recombinant molecule that is (operably linked). 5. A nucleic acid molecule operatively linked to an expression vector, said nucleic acid molecule being a sequence From SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9 It can hybridize with a nucleic acid sequence selected from the group under stringent conditions. A recombinant molecule comprising a nucleic acid sequence Transformed recombinant cells. 6. A method of regulating cellular homeostasis, the method comprising: A method of regulation comprising modulating the activity of a MEKK-dependent pathway relative to the activity. 7. Modulates MEKK-dependent pathway activity relative to Raf-dependent pathway activity in cells A method of treating a medical condition, comprising the step of knotting. 8. A method of controlling medical diseases selected from the group consisting of tumor formation and autoimmunity Therefore, the activity of the MEKK-dependent pathway is higher than that of the Raf-dependent pathway in cells. A method for suppressing a medical disease, which comprises regulating the growth of the cells. 9. a) contacting the cell with a putative regulatory molecule; and b) The putative regulatory compound modulates the activity of a MEKK-dependent pathway in the cell. Capacity to measure activation of at least one member of the MEKK-dependent pathway. By determining, by determining; Modulating the activity of a MEKK-dependent pathway in a cell identified by a method comprising A therapeutic compound that can be ascribed. 10. MEKK-dependent molecule capable of reducing the activity of Raf-dependent pathways A group consisting of molecules and combinations thereof that can increase the activity of the sexual pathway To the patient an effective amount of a therapeutic compound comprising at least one regulatory molecule selected from A method of treating a disease comprising administering: A method for treating a disease, comprising an amount that causes depletion of harmful cells involved in the disease.