JPH09511402A - 標本の生物分解性を測定する処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は，標本の生物分解性を測定する２つの処理方法に関するものである。標本は，培養液の中に存在し，溶液には二酸化炭素が含まれており，溶液から分離された二酸化炭索の量が測定される。生物分解性は分離された二酸化炭索の量に基づいて決定される。この発明によれば，発生した二酸化炭素はアルカリ溶液中に導入され，この溶液の導電率が測定され，この導電率に基づいて溶液中の二酸化炭素の量が算出される。

Description

【発明の詳細な説明】 標本の生物分解性を測定する処理方法 この発明は，標本を培養液に入れ，溶液を曝気し，培養液から分離した二酸化 炭素の量を測定し，分離した二酸化炭素の量に基づいて生物分解性を判定する形 式の標本の生物分解性を測定する処理方法に関する。 プラスチックの利用がますます増大するとともに，その廃棄が重大な問題にな ってきている。生物分解性の速度と分解の程度とが如何に迅速に，又，どの程度 まで物質を試験方法と同じ微生物環境で分解するかを決定している。採用した試 験方法で得られた結果は，例えば，排出液浄化プラントのような好気性の環境下 で，プラスチックが分解される生物分解性の程度と時間とを査定するのに利用さ れている。 一般に，生物分解性を測定する方法では，生物分解により標本から発生する二 酸化炭素の量が時間の関数として算定され，それに基づいて培養液内で分解する 有機炭素の量，および重合体の分解の程度と速度とを最終的に判定することが出 来る。 標準的な処理方法として公知のスツルム試験では，例えは，標本を培養液を入 れたテストジャー中に置き，パイプライン系を通して空気をジャー内に導入する 。培養液を入れたテストジャー内に空気を導入する前に，空気中の二酸化炭素は ，例えば，水酸化ナトリウム溶液に吸収させて除去される。それによって，培養 液中に発生し，この処理方法で測定可能な二酸化炭素は，主として標本の生物分 解により導出される。このシステムでは，培養液を入れた複数個のジャーを並行 して使用することが出来る。それぞれ培養液が入っているジャーから発生したＣ Ｏ₂は，アルカリ溶液中に導入される。標準的な３種類のアルカリ溶液がある。 二酸化炭素が水酸化バリウムと接触すると，下記の反応式（１）に示すように， 炭酸バリウムが発生する。 Ｂａ（ＯＨ）₂＋ＣＯ₂→ＢａＣＯ₃＋Ｈ₂Ｏ （Ｉ） バイオリアクターで発生した炭酸塩の量，ひいては二酸化炭素の量は，時間の 関数として水酸化バリウム溶液から滴定により算出される。 スツルム試験にはいくつかの問題点がある。即ち，数種類の溶液を通して連続 的になされる曝気と長いパイプラインを使用することによる漏れ流が生じること であり，これが測定結果を不正確にしている。さらに，連続的な曝気の結果，シ ステム内が加圧状態となると，曝気の終了時に還流が発生し，培養液がパイプラ イン系やその他のフラスコ内に流入することである。このことによって，試験全 体が中止になる場合がある。スツルム試験に伴う滴定では，多くの時間がかかり ，そのため試験時間が長引く。 この発明の目的は，従来よりも確実であるとともに，労力を要することもなく 迅速に実施することの出来る標本の生物分解性を測定する新規な処理方法に関す るものである。 この発明の目的は，特に，時間のかかる滴定方法を用いることなく試験中に発 生する二酸化炭素の量を迅速に測定することが出来る処理方法を提供することで ある。 この発明のさらに他の目的は，測定結果，即ち，標本の生物分解性を可能なか ぎり迅速に，且つ，再現性をもって自動的に測定することが出来るような処理方 法を提供することである。 この発明の特徴は，クレームに記載されている。 この発明の処理方法は，バイオリアクター内で培養液を連続的に曝気すること を基本としている。注入された空気中の二酸化炭素は除去される。微生物活動で 発生する二酸化炭素は，バイオリアクターからのガスを非沈殿性アルカリ溶液が 入っているジャー内に導入することにより回収される。アルカリ溶液としては， 例えば，ＮａＯＨ，ＫＯＨ等の適当な濃度の非沈殿性アルカリ溶液が使用される 。発生した二酸化炭素は，アルカリ溶液と反応し，反応式（II）に示すように， 炭酸塩と水とを生成する。但し，ＫＯＨはアルカリ溶液である。 ＣＯ₂＋２ＫＯＨ→Ｋ₂ＣＯ₃＋Ｈ₂Ｏ （II） 反応の結果，溶液の導電率は低下する。この導電率の低下は，例えば，ＫＯＨ ジャー内に配置されたセンサーにより測定される。そして，ＫＯＨ溶液内に導入 されたガス中に含まれる二酸化炭素は，時間の関数として測定値から判定される 。必要ならば，ＫＯＨ溶液中に導入された二酸化炭素の量は，下記の反応式（II I）に基づいて，例えば，指示薬としてフェノールフタレンを含むＨＣＬ溶液を 使用して，例えば，滴定により化学的に判定してもよい。 Ｋ₂ＣＯ₃＋ＨＣＬ→ＫＨＣＯ₃＋ＫＣＬ （III） ＫＯＨ溶液中に入った二酸化炭素の量は，化学式（IV）により計算することが 出来る。 ｍ_CO2＝ΔＶ_HCL＊Ｃ_HCL＋（Ｖ_KOH／Ｖ_SAMPLE）＊Ｍ_CO2 （IV） ここで， ΔＶ_HCL ＝初期状態を基準とした時の消費したＨＣＬの容積（ｍｌ） Ｃ_HCL ＝滴定で用いられたＨＣＬのモル濃度（ｍモル／ｍｌ） Ｖ_KOH ＝水酸化カリウム溶液の容積（ｍｌ） Ｖ_SAMPLE＝滴定で用いられるＫＯＨ標本の容積（ｍｌ） Ｍ_CO2 ＝二酸化炭素の分子量，４４ｍｇ／モル この発明が示すように，アルカリ溶液中に結合されている二酸化炭素の量は， 溶液の導電率から算出される。アルカリ溶液としては，例えば，水酸化アルカリ （ＮａＯＨ，ＫＯＨ，ＬｉＯＨ），または水酸化アルミニウムのような任意の非 沈殿性アルカリ溶液を使用することが出来る。導電率の測定は，センサーとして 適当なもの，例えば，好適なプラチナ電極を使用してこの分野では公知の方法で 実施することが出来る。電極を使用することが特に有利である理由としては，測 定を迅速，且つ，正確に行うことが出来るとともに，測定結果が電気的な信号の 形式で得られることである。さらに，電気的な信号の処理は，公知の電子技術に より実施することが出来るとともに，信号は所望の形に変換された後，例えば， マイクリロコンピュータのような計算機に直接伝送され，発生した二酸化炭素の 全発生量，又は発生率が，時間の関数として自動的に算出される。 この発明による新規な方法によれば，滴定を行う必要がなくなるので，生物分 解性の判定がさらに容易になる。 この発明の処理方法によれば，大量の標本を同時に検査することが出来るので ，判定コストを削減することが出来る。 次に，添付図面を参照してこの発明を詳細に説明する。 第１図は，この発明の実施例を示すもので，この発明による処理方法を実施す るための装置が示されている。 第２図は，第１図に示す装置により作成された導電率センサーの校正曲線が示 されている。 第３図は，他の方法とこの発明による方法とでそれぞれ判定された標本の二酸 化炭素の含有量が示されている。 第４図は，発生したＣＯ₂の活性炭による濾過が生物分解性の結果に及ぼす影 響が示されている。 第５図は，β−ヒドロキシブチレート／バレラートの生物分解性試験において ，この発明の処理方法で発生した二酸化炭素の量（ｍｇ）が時間の関数として示 されている。 第６図は，β−ヒドロキシブチレート／バレラートの生物分解性試験において ，この発明の処理方法で発生した二酸化炭素の量が並行試験で得られた平均値で 示されている。 第７図は，β−ヒドロキシブチレート／バレラートの生物分解性試験において ，この発明の処理方法で発生した二酸化炭素の量が，時間の関数として示されて いる。 第８図は，この発明の処理方法により標本から判定した生物分解性が時間の関 数として示されている。 第１図は，この発明の処理方法を実施するための装置の概略図を示している。 空気ポンプ１は，曝気に用いるためのもので，シリカゲルが含まれている容器 ２を介して空気を吸引管３内に吸引するために配置されており，この吸引管によ り曝気された空気中の二酸化炭素が，吸引され除去される。例えば，吸引管３は ，水酸化物，例えば，水酸化ナトリウム粒剤のような任意の二酸化炭素除去物質 でもよい。４つの吸引管を直列および並列に（２個ずつ）配置した後，曝気ガス は，例えば，０．１Ｍの水酸化バリウムを含んでいる連続したジャー４を介して 相当する測定ユニット５に導入さる。それによってＣＯ₂が確実に除去されると ともに，この結果が表示され，曝気用の空気は，加湿される。第１図では，８個 の測定ユニット５の内，２個だけが示されている。 測定ユニット５はバイオリアクター６を備え，その中に試験される標本が配置 されている。バイオリアクター内には培養液が入れられている。バイオリアクタ ーの容量は，例えば，２０００ｍｌであり，培養液の量は，例えば，１０００ｍ ｌである。バイオリアクター内で発生したガスは，０．１ＭのＫＯＨ溶液が入れ られている測定ジャー６内に導入される。この測定ジャー内には，ＫＯＨ溶液の 導電率に基づいて，ＫＯＨ溶液中で結合した二酸化炭素を判定するための電極７ である測定センサーが配置されている。ＣＯ₂を確実に回収するために，ガスは 測定ユニット６からＫＯＨ溶液が充填されている別のジャー９に導入される。そ れぞれジャー６および９には，それぞれ３００ｍｌの０．１Ｍの濃度のＫＯＨ溶 液が入れられており，この溶液量と濃度は，６６０ｍｇの二酸化炭素を結合する のに充分な値である。 測定ジャー６内に配置されている電極は，スイッチ列１０に接続され，さらに 電圧信号を処理し，測定するためのデータロガー１１に接続されている。さらに ，スイッチ列１０とデータロガー１１からのそれぞれ出力信号は，コンピュータ １２へと伝送され，処理計算されて最終的な結果が算出される。 バイオリアクター６には，チェック弁１３が配設されており，培養液が，例え ば，圧力の変動によりまたは，その他の理由によりパイプライン系２０へと逆流 するのをを防止している。 例１：センサーの校正 センサーの校正は，例えば，チャップマンによって開示された方法（１９７ １年）により行われる。この方法によれば，種々の比率でＫＯＨとＫ₂ＣＯ₃の溶 液が混合されて校正液が調整される。調整された溶液の炭酸カリウムに対する飽 和度が０％から１００％の範囲で変化するように，０．１Ｍの濃度のＫＯＨと０ ．０５Ｍの濃度のＫ₂ＣＯ₃との溶液が混合され，その溶液の容積は３００ｌであ った。 センサーは校正溶液中に配置され，溶液の導電率を示す電圧値が測定された。 測定値は，センサーを安定した定常状態にさせるために，２４時間の間１０分間 隔で自動的に測定された。センサーが安定した後，最後の１０個の測定結果に対 してその平均値が計算される。この平均値を校正溶液のそれぞれの飽和度におけ るセンサーの校正値であると見做した。校正溶液はセンサー毎に交換され，各セ ンサーの安定化がはかられ，電圧値が記録された。この手順は，すべてのセンサ ーについてすべての校正溶液に関する校正値が得られるまで反復してなされた。 第２図は，このようにして得られた校正グラフの測定結果を示している。 溶液の導電率は，溶液の温度により左右されることが知られている。温度の影 響を解明するために，２つの異なる校正溶液（飽和度がそれぞれ０％と５０％） の導電率を示す電圧値が温度の関数として測定された。その結果によれば，温度 が１°Ｃ上昇する毎に，電圧値は僅かに０．００４８７Ｖ（０％の飽和度），お よび０．００７１４Ｖ（５０％の飽和度）しか低下しないことが判明した。実験 した時の条件下では，ＫＯＨ溶液の温度は０．１°Ｃ未満しか変動しないことが 判明した。従って，電圧値に及ぼす温度の影響は無視することが出来る。 例２：二酸化炭素の測定 第１図に示す装置を用いて二酸化炭素の回収と導電率を測定するためのセンサ ーの動作試験が行われた。二酸化炭素は炭酸ナトリウムから発生したものである 。１リットルの超純水を含むバイオリアクターのフラスコに，既知の量のＮａ₂ ＣＯ₃が添加された。炭酸塩から二酸化炭素を分離するために，２．０ＭのＨＣ Ｌがフラスコに添加された。分離したＣＯ₂は，曝気用空気とともに０．１Ｍの ＫＯＨを含むフラスコ内に導入された。導電率の変化に基づき，且つ，滴定によ ってフラスコから回収されたＣＯ₂の量が算定された。試験の結果は，導電率， 滴定値，理論値に対する各二酸化炭素量が，第３図にグラフで示されている。 その結果は発生した二酸化炭素の回収が有効であることを示しており，異なる 方法によって得られた結果と極めて近似しており，そのことから導電率の変化に 基づく処理方法が極めて良好であることを示している。 例３：ＣＯ₂ガスの洗浄 炭素源をグルコース，分解有機物を大腸菌とした分解試験では，アルカリ溶液 中に混入した時，二酸化炭素の他に電圧値を上げる別の代謝生成物の発生が認め られた。アルカリ溶液は重量分析計で分析され，約２０種類の異なる有機成分が 検出された。その一部は溶液の導電率に影響すると見られる極性を有していた。 これらの成分を除去するために，バイオリアクターからガスを洗浄する種々の方 法が試みられた。ガスの洗浄は種々の洗浄流体を用いて試行されたが，バイオリ アクターからガス中に混入した導電率に影響を及ぼす揮発性有機成分を除去する ことは効率上適切でないことが判明した。従って，活性炭を通す濾過によるガス の洗浄が試験された。試験装置の基本的な構成は，第１図に示すものが使用され た。測定ジャー４，６および８は，活性炭による濾過機構を備えている。 試験の結果が，第４図に示されている。この図から，測定ジャー４の場合，す べての二酸化炭素が活性炭による濾過機構を通過した。その結果，滴定値と導電 率とはいづれも同じ値であることが判明した。測定ジャー５から８までにおいて は，活性炭による濾過は良好に作用し，導電率は滴定によって得られた結果のレ ベルを下回る結果となった。 揮発性有機成分を除去するために，活性炭を使用してバイオリアクターからの ガスを濾過することは良好に機能する手順であることが判明した。 例４：重合体での生物分解性の実験 実際の重合体による生物分解性試験の例として，この発明の処理方法における ポリ−β−ヒドロキシプチレート／パレラート（ＰＨＢ／Ｖ）の分解を提示する 必要がある。この実験では，１００，２００および３００ｍｇのＰＨＢ／Ｖの生 物分解性が検討された。 第５図から第８図は，導電率の測定の基本的な装置を用いて実施した試験につ いて，段階的に示されている。第５図には，時間の関数として８個のバイオリア クター内で発生した二酸化炭素の量が示されている。左上の図面は，いわゆる零 標本（微生物摂取のみ；重合体標本ではない）である。左下の図面は，標本がリ ットル当り１００ｍｇのＰＢＨ／Ｖの場合，右上の図面は，標本がリットル当り ２００ｍｇのＰＢＨ／Ｖの場合，右下の図面は，標本がリットル当り３００ｍｇ のＰＢＨ／Ｖの場合がそれぞれ示されている。 第６図には，第５図に示す各場合を反復した結果の平均値がそれぞれ示されて いる。これらの平均値は，生物分解性を算出するために用いられる。 次に，零標本ジャーで発生した二酸化炭素が，標本物質を含む測定ジャーで発 生した二酸化炭素の値から減算され，その結果が第７図に示されている。左上の 図面は，標本がリットル当り１００ｍｇのＰＢＨ／Ｖの場合，左下の図面は，標 本がリットル当り２００ｍｇのＰＢＨ／Ｖの場合，右上の図面は，標本がリット ル当り３００ｍｇのＰＢＨ／Ｖの場合がそれぞれ示されている。 標本中の炭素量をコンピュータのプログラムソフトウエアに入力すると，時間 の関数として標本の生物分解性が計算される。生物分解性は，標本中の有機炭素 に基づいて計算された理論上の二酸化炭素の発生量と実際の標本から発生した二 酸化炭素との比率を表している。第８図は，時間の関数に対するこの試験におけ る標本の生物分解性を示しており，左上の図面は，標本がリットル当り１００ｍ ｇのＰＢＨ／Ｖの場合，左下の図面は，標本がリットル当り２００ｍｇのＰＢＨ ／Ｖの場合，右上の図面は，標本がリットル当り３００ｍｇのＰＢＨ／Ｖの場合 がそれぞれ示されている 滴定により得られた結果から，例えば，１００ｍｇのＰＨＢ／Ｖを含む標本に 関する結果を計算することが出来る。 アルカリ測定ジャーから取り出された１ｍｌの標本について，２つの並列に配 置されたフラスコの一方では，試験開始時に純粋なＫＯＨ溶液が消費したよりも ５．２ｍｌより少ない０．００３ＭのＨＣＬが消費され，他方では５．０ｍｌ少 ない０．００３ＭのＨＣＬが消費された。それにより上記の公式からＫＯＨ測定 ジャーに含まれる二酸化炭素が算出される。即ち， ５．２ｍｌ＊０．００３ｍモル（ｍｌ＊（３００ｍｌ／１ｍｌ）） ＊４４ｍｇ／ｍモル＝２０５．９ｍｇ， それぞれ１９８ｍｇ，平均値は２０１．９５ｍｇである。 上記の平均値から，零標本測定ジャー内の二酸化炭素の平均値である４９．４ ｍｇを減算すると，標本から発生した二酸化炭素の量を算出することが出来る。 即ち，１５２．５５ｍｇである。 １００ｍｇのＰＨＢ／Ｖが５７．９ｍｇの炭素を含んでいることがわかれば， 理論上発生する二酸化炭素の量が判明する。即ち，２１２．３ｍｇである。この ようにして生物分解性が次のように判明する。 生物分解性＝（１５２．５５ｍｇ／２１２．３ｍｇ）＊１００％＝７１．８％ 他の標本についても同様にして生物分解性が計算された。滴定の結果，および 導電率の測定装置で得られた結果から計算された全ての標本の生物分解性を以下 に示す。 この実施例は，この発明を説明するために示したもので，この発明を限定する ものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．標本を培養液に入れ，溶液を曝気し，培養液から分離した二酸化炭素の量 を測定し，この分離した二酸化炭素の量に基づいて生物分解性を判定する形式の 標本の生物分解性を測定する処理方法において，発生した二酸化炭素を非沈殿性 のアルカリ溶液中に導入し，前記溶液の導電率を測定し，この導電率に基づいて 溶液中に吸引された二酸化炭素の量を算出すること を特徴とする標本の生物分解性を測定する処理方法。 ２．処理中に分離した二酸化炭素の量を時間の関数として算出すること を特徴とする請求項１に記載の標本の生物分解性を測定する処理方法。 ３．導電率の変化を時間の関数として測定し，この測定結果をコンピュータに 記憶し，標本の生物分解性をＥＰＤプログラムを利用して自動的に算出すること を特徴とする請求項１又は請求項２に記載の標本の生物分解性を測定する処理 方法。 ４．発生した妨害物質を除去するために，培養液中で発生する二酸化炭素を適 宜のフィルターを通して濾過すること を特徴とする請求項１から請求項３のいづれかに記載の標本の生物分解性を測 定する処理方法。 ５．二酸化炭素を活性炭を通して濾過すること を特徴とする請求項１から請求項４のいづれかに記載の標本の生物分解性を測 定する処理方法。 ６．標本を培養液に入れ，溶液を曝気し，培養液から分離した二酸化炭素の量 を測定し，この分離した二酸化炭素の量に基づいて生物分解性を判定する形式の 標本の生物分解性を測定する処理方法において，発生した二酸化炭素を非沈殿性 のアルカリ溶液中に導入し，前記溶液の導電率の変化を自動的に測定し，この測 定結果をコンピュータに記憶させ，標本の生物分解性をＥＰＤプログラムを利用 してコンピュータにより自動的に算出すること を特徴とする標本の生物分解性を測定する処理方法。