JPH09509572A

JPH09509572A - 抗原をベースとしたヘテロポリマー類及びそれを使用する自己免疫疾患治療法

Info

Publication number: JPH09509572A
Application number: JP7522419A
Authority: JP
Inventors: テイラー，ロナルド，ピー．; ファーグソン，ポリー，ジェー．; マーティン，エドワード，エヌ．; サザーランド，ウィリアム，エス．; レイスト，クライ，ジェー．; グリーン，キルストン; ジョンソン，シド
Original assignee: University of Virginia Patent Foundation
Current assignee: University of Virginia Patent Foundation
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 1997-09-30
Also published as: EP0743856B1; EP0743856A4; ES2207646T3; US5879679A; WO1995022977A1; EP0743856A1; PT743856E; ATE245030T1; DE69531290T2; US20020103343A1; DE69531290D1; AU1967795A; AU696964B2; DK0743856T3; CA2183535A1

Abstract

(57)【要約】抗原をベースとしたヘテロポリマー類（ＡＨＰ）からなる構成物を提供する。この抗原をベースとしたヘテロポリマー類は、ヒトまたは非ヒト霊長類赤血球上の補体レセプター（ＣＲ１）部位に特異的に結合する少なくとも１種のモノクローナル抗体を包含し、且つこの抗−ＣＲ１モノクローナル抗体は標的病原性自己抗体に特異的な抗原に架橋結合されている。さらにこのＡＨＰを使用して、ヒトまたは非ヒト霊長類の自己免疫疾患を治療する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】抗原をベースとしたヘテロポリマー類及びそれを使用する自己免疫疾患治療法技術分野本発明は、霊長類の赤血球上の特定のレセプター部位と標的病原性自己抗体の両方に対して特異性を有する、抗原をベースとしたヘテロポリマー類に関する。本発明はさらに、これらの抗原をベースとしたヘテロポリマー類を使用して自己免疫疾患を治療する方法にも関する。背景技術循環自己抗体は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性心筋炎、免疫複合体媒介の腎臓疾患、リウマチ性関節炎、重症筋無力症、自己免疫性貧血、シェーグレン症候群、特発性血小板減少紫斑病、種々の形態の脈管炎、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を伴う少なくともある種の細胞毒性などを始めとする数多くの自己免疫疾患の病因に大きく関与している。自己抗体媒介疾患の治療のための努力は、部分的な成功にとどまっている。過去に開発された治療法の多くは、抗体の産生を完全に排除するように企図された薬剤または治療用モノクローナル抗体による一般的な免疫抑制手段の使用に基づいたものである。しかしながら今日に至るまで、特定の自己抗体を標的とする有効な治療法は創出されていない。全ての循環抗体を除去するように企図されたプラズマフェレーシス（血漿交換）が行われているが、部分的に成功しているだけである。近年、種々の体外免疫吸収手法が試みられている。これらの手法はより特異性の高いもので、病原性自己抗体のみを取り除くための試みである。これらの手法は、自己抗体の天然標的である自己抗原を含む血液または血漿を、体外マトリックス上に流出させて行うものである。これらの方法は、速度が遅く、身体への器具挿入を必要とし、かつ高価であり、またそれらの定量的効率が低いがゆえにそれらの手順を反復する必要があるなど、いくつかの技術的問題を抱えている。マトリックス上での補体の活性化という合併症の問題もある。全般的にみれば、治療法としての成功度はそれほど高いものではない。もう１つの一般的な、非特異性の取り組みは、コルチコステロイド類、および細胞毒性的な非ステロイド系抗炎症薬を使用する攻撃的な免疫抑制治療法である。この方法は多くのケースで臨床的改善は見られるものの、これらの治療法によってもなお自己免疫疾患による罹患率および死亡率は相当高いものにとどまっている。従って、自己免疫治療法におけるこうした進展はあるものの、なお標的病原性自己抗体に特異的で、迅速且つ定量的な体内治療法の発展の余地が残されている。発明の開示従って本発明の目的は、標的病原性自己抗体に高度に特異的で、迅速且つ定量的な結果を出すことができる自己免疫治療法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、そのような自己免疫治療法を使用して、ヒトおよび非ヒト霊長類の自己免疫疾患の治療法を提供することである。上記の目的は本発明の抗原ベース・ヘテロポリマーによって達成される。これらのヘテロポリマー類は霊長類赤血球上の補体レセプター部位（ＣＲ１）および標的とする病原性自己抗体の両方に特異的なものである。さらに具体的には、上記の目的は霊長類の赤血球上のＣＲ１部位に特異的に結合するモノクローナル抗体（ただしこのモノクローナル抗体は標的病原性自己抗体に特異的な抗原に架橋結合されている）を含む少なくとも１種の抗原ベース・ヘテロポリマーを包含する複合体を提供する本発明によって達成することができる。さらに、これらの目的は霊長類の赤血球上のＣＲ１部位に特異的に結合するモノクローナル抗体、ただしこのモノクローナル抗体は標的病原性自己抗体に特異的な抗原に架橋結合されている、を含む少なくとも１種の抗原ベース・ヘテロポリマーの有効量を、ヒトまたは非ヒト霊長類に投与することにより、自己免疫疾患を治療する方法をも提供する本発明によって達成することができる。図面の簡単な説明図１は霊長類赤血球上のＣＲ１レセプター部位に結合したモノクローナル抗体で構成された抗原ベース・ヘテロポリマー複合体の概略図である。このモノクローナル抗体はまた自己抗原（ｄｓＤＮＡ）に架橋結合されており、これがさらに標的病原性自己抗体（抗−ｄｓＤＮＡ抗体）に結合される。図２は抗原ベース・ヘテロポリマー媒介によるＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体のヒト赤血球細胞に対する結合の動態を示すグラフである。結合される数は、ヒトＩｇＧの結合数に比例したものとなる（下記参照）。Ｍａ、ＭｏおよびＨａは血漿またはＩｇＧ分画を採取したＳＬＥ患者の姓の頭文字である。黒ベタの記号は、赤血球細胞と抗原ベース・ヘテロポリマーおよび上記それぞれの抗体とインキュベーションしたものを示す。白ヌキの記号は、抗原ベース・ヘテロポリマーは使用せずに、赤血球細胞と抗体とインキュベーションしたものを示す。図３は、図２のように調製およびインキュベートした赤血球細胞の、ヒトＩｇＧおよびヒトＩｇＭの両方を、¹²⁵Ｉ−標識モノクローナル抗体でプローブした検査結果を示すグラフである。血漿Ｍａは重症腎炎の患者からのサンプルで、非常に高力価で殆どＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体だけを含む。血漿ＶａはＩｇＧおよびＩｇＭ抗-ｄｓＤＮＡ抗体の両方を含む。図４は結合の特異性を示すための対照試験の結果を示すグラフである。ヒト赤血球細胞を、血漿Ｍａの４倍希釈、または血漿ＭａからのＩｇＧ分画で検査した。Ｐ１＝血漿；Ｎ１＝正常；ＳＲＢＣＳ＝ヒツジ赤血球細胞；ＡＨＰ＝抗原ベース・ヘテロポリマー；Ｍａ＝重症腎炎の患者。図５は対照試験の結果を示すグラフであり、正常なヒト血清中では結合が可能であることを示しており、赤血球細胞の溶解もないことが立証されている。血漿Ｍａの２倍希釈液（ウシ血清アルブミンに希釈）を、新鮮な正常ヒト血清に同様に希釈した血漿Ｍａと比較した。ＰＬ＝血漿；ＮＨＳＣ＝正常ヒト血清補体；ＡＨＰ＝抗原ベース・ヘテロポリマー；ＩＲＲ＝無関係のモノクローナル抗体。図６は用量依存性試験の結果を示すグラフであり、ＳＬＥＩｇＧサンプル１５０μｌ中の赤血球細胞（ヘマトクリット値５０％）へのヒトＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体の結合を最大化するための、抗原ベース・ヘテロポリマー最適注入量を示したものである。ＡＨＰ３は実施例１と同様にして調製したもの（下記参照）。ＡＨＰ２＝ＡＨＰ３の１／２量のｄｓＤＮＡを含んだもの；ＡＨＰ１＝ＡＨＰ３の１／４量のｄｓＤＮＡを含んだもの。図７は結合をＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体の濃度の関数として示したグラフである。ヒト赤血球細胞の５０％分散液を、ウシ血清アルブミンおよびＩｇＧＭｏの混合物中で検査した。データ（計算線）は最小二乗法解析による単純な直線式に合致した。図８は非常に高力価の抗−ｄｓＤＮＡ血漿（Ｍａ）を使用した場合の、ＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体の濃度の関数としての結合を示すグラフである。図９は血漿Ｍａを使用した場合の、ＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体の濃度の関数としての結合を示すグラフである（７Ｇ９ＡＨＰおよび１Ｂ４ＡＨＰ単体のものを、７Ｇ９および１Ｂ４両方を含むカクテル（混合体）と比較した）。発明を実施するための最良の形態本発明は霊長類の赤血球補体レセプター（ＣＲ１）のユニークな構造的および生物物理学的な特性に基づくものである。本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー複合体は、霊長類の赤血球上のＣＲ１部位並びに標的とする病原性自己抗体の両方に特異的なものである。本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー類（ＡＨＰ）は、霊長類赤血球上のＣＲ１レセプター部位に特異的なモノクローナル抗体から調製される。このモノクローナル抗体はまた、標的とする病原性自己抗体に対して特異的な自己抗原に架橋結合する能力のあるものでなければならない。本発明に使用されるそのようなモノクローナル抗体の例としては、１Ｂ４、ＨＢ８５９２、および７Ｇ９などがある。ＨＢ８５９２および１Ｂ４は、テイラー [Taylor]ら、“ヒト赤血球上のＣ３ｂレセプターに抗原を付着させるためのヘテロポリマー系モノクローナル抗体の使用：能性のある治療的処置[Use of hetero polymeric monoclonal antibodies to attach antigens to the C3b receptor o f human erythrocytes: A potential therapeutic treatment]”、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８３３０５〜３３０９（１９９１年４月）；リースト[Reist]ら、“架橋結合された二重特異性モノクローナル抗体ヘテロポリマー類によって霊長類赤血球上の補体レセプターに事前結合された抗原は循環系から速やかに一掃される[Antigens pre-bound to the p rimate eruthrocytecomplement receptor via cross-linked bispecific monocl onal antibody heteropolymers are rapidly cleared from the circulation]” 、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３０２１〜３０２７（１９９３）に開示されている。７Ｇ９は本発明者らの研究所で最近開発されたｍＡｂであり、これは公知の手法により調製することができる。ＣＲ１に対するｍＡｂとしてその他入手可能かつ有用なものは、３Ｄ９およびＥ−１１［（本発明者らが以前、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１巻（１９９２年７月）で使用したもの）］、並びに５７ＦおよびＹＺ１（それぞれヌッセンツヴァイグ[Nussenzwe ig]およびフィアロン[Fearon]により調製および報告されたもの）がある。ＣＲ１に対するｍＡｂはいかなるものも、本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー系で有効に機能するものと考えられる。このモノクローナル抗体は、標的病原性自己抗体に対して特異的な抗原に架橋結合される。この架橋結合は有効な架橋結合方法であればいずれの方法によっても実施することができる。例えば、精製したモノクローナル抗体を先ずビオチン化する。典型的には、各モノクローナル抗体は５種のビオチンを含むことになる。次にこのビオチン化された精製モノクローナル抗体を、ストレプトアビジンを使用して、すでにビオチン化した抗原または自己抗原に架橋結合する。もし抗原が遊離のアミノ基を有する場合は、モノクローナル抗体を抗原に架橋結合させるのに、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用するといった他の公知の方法も使用することができる。非抗原ベース・ヘテロポリマー類の調製の詳細は、テイラー[Taylor]ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、前掲；リースト[Reist]ら、前掲；およびテイラー[ Taylor]ら、“二重特異性ヘテロポリマー媒介の結合による霊長類赤血球補体レセプターへの循環抗原のインビトロ結合とクリアランス［In Vitro binding and clearance of circulating antigen by bispecific heteropolymer-mediated b inding to primate erythrocyte complement receptor］”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（８）：２４６２〜２４６８（１９９２年４月）に記述されている。本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー類を使用することによって、理論的には多くの異なった種類の自己抗原を霊長類の循環系から一掃することができる。特に、血友病を患っている特定のヒトは第VIII因子に欠陥があることが判明している。この血友病はリコンビナント第VIII因子で置換することにより治療される。しかしながら、患者の中にはやがて第VIII因子に対する抗体を発現し、その結果治療に障害をきたすことがある。第VIII因子とともに調製した本発明の抗原ベース・ヘテロポリマーは、この問題に対する治療解決策を提供することになる。具体的には、ＣＲ１に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に架橋結合された第VIII因子を包含する抗原ベース・ヘテロポリマーは、循環している抗−第VIII 因子自己抗体を赤血球ＣＲ１に結合させ、当該自己抗体の一掃を容易にする。第 VIII因子は循環し続け、血液凝固を容易にする。本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー複合体により一掃されるその他の自己抗体としては、下記の抗原に対する自己抗体が挙げられるがこれらに限定されない：筋肉アセチルコリンレセプター（この抗体は重症筋無力症に関与する）；カルジオリピン（ループス疾患に関与する）；血小板に関係する蛋白質（特発性血小板減少紫斑病に関与する）；シェーグレン症候群に関係する複数の抗原類；組織移植自己免疫反応のケースに関与すると思われる抗原類；心筋に見られる抗原類（自己免疫心筋炎に関与する）；免疫複合体媒介の腎臓疾患に関与する抗原類；ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡ抗原類（ループス腎炎に関与する）；デスモグレインおよびデスモプラキン（天疱瘡と類疱瘡に関与する）；その他、特性が判明しており、抗-ＣＲ１ｍＡｂに架橋結合され得るもので、疾患の原因となりうるあらゆる抗原。上記の抗原ベース・ヘテロポリマー複合体がヒトまたは非ヒト霊長類の循環系に注入された場合、この抗原ベース・ヘテロポリマーはモノクローナル抗体を通して赤血球細胞に、高率かつ赤血球細胞上のＣＲ１部位の数に応じて容易に結合する。次にこの抗原ベース・ヘテロポリマーは、ほぼ同じ割合で、抗原を介してモノクローナル抗体に架橋結合された自己抗体に結合する。結合された抗原ベース・ヘテロポリマー自己抗体複合体を含む赤血球細胞は次に、結合された病原性自己抗体の中和と循環系からの一掃とを容易にすることによって治療的に働く。本発明においては、抗原ベース・ヘテロポリマー類が赤血球細胞への結合を容易にし、その結果ヒトおよび非ヒト霊長類の循環系から赤血球細胞そのものは排除することなしに自己抗体を一掃するのである。本発明者らは初めて、抗−ＣＲ１モノクローナル抗体を自己抗原に架橋結合させ、それにより本発明の抗原ベース・ヘテロポリマーを作り出すことによって、特定の自己免疫疾患の患者の血漿中に発見される（ある種の抗原に対して特異性の）自己抗体の大半（約８０〜９５％、表１および図９）を赤血球細胞に特異的に結合させることが可能になることを発見した。具体的には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の血漿中に発見されるｄｓＤＮＡ抗原に対する自己抗体の大半を赤血球細胞に特異的に結合させることができることを実施例が示している。本発明は霊長類赤血球細胞のＣＲ１のユニークな特性、つまり補体によりオプソニン化された免疫複合体を結合させ、そして循環系から排除することができる特性を利用している。この系から排除される免疫複合体は肝臓および脾臓に取り込まれる（コルナコフ[Cornacoff]、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９８３））。ＡＨＰ複合体の自己抗体への結合、または抗体および赤血球細胞ＣＲ１−抗原ベース・ヘテロポリマー複合体の結合の特異性は明白なものである。それは、ａ）抗原ベース・ヘテロポリマーが除外された場合；ｂ）ＣＲ１部位が欠如しているヒツジ赤血球細胞をヒト赤血球細胞に置換した場合，ｃ）抗原ベース・ヘテロポリマーの調製において、ビオチン化された自己抗原を除外した場合；並びにｄ）正常な血清または正常なＩｇＧをＳＬＥ血漿に置換した場合に、結合は全く観察されないからである（図４）。特異性のさらなる証拠は、もし、ｅ）抗原ベース・ヘテロポリマーがモノクローナル抗体なしに調製された場合；ｆ）抗原ベース・ヘテロポリマーが“無関係”のモノクローナル抗体を使用して調製された場合；並びにｇ）抗原ベース・ヘテロポリマー複合体を抑制するために過剰の単一モノクローナル抗体抗-ＣＲ１が使用された場合に、結合が全く観察されないことによっても明らかである（図５）。新鮮な血清の存在（補体源として、２５容量％）は、特異的結合を抑制したり、赤血球細胞を溶解させたりすることがないことも確認されている（図５）。抗原ベース・ヘテロポリマーの注入量範囲は、赤血球細胞の濃度と、抗−ＣＲ１モノクローナル抗体によって認識される１赤血球細胞当りのＣＲ１エピトープ部位の数に基づいて決定される。もし抗原ベース・ヘテロポリマー複合体が過剰に添加された場合、抗原ベース・ヘテロポリマーの１部は赤血球細胞に結合しないが、その代わり赤血球細胞による自己抗体の取り込みを抑制する。その理由は、遊離の抗原ベース・ヘテロポリマーが溶液中にある場合、それが赤血球細胞に結合する抗原ベース・ヘテロポリマーと自己抗体の取り込みで単純に競合するからである。従って、抗原ベース・ヘテロポリマーの媒介による自己抗体のヒト赤血球細胞への結合は、注入された抗原ベース・ヘテロポリマー濃度の関数として調べると、ベル型（中凸状）曲線を呈することになる（図６）。本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー類の、自己抗体の赤血球細胞への結合を容易にするという点での定量的有効性は、ファーの検定［Farr Assay］の結果に示されている。ファーの検定結果は、自己抗体が紛れもなく特異的に赤血球細胞に特異的に吸収されており、本発明の抗原ベース・ヘテロポリマーが存在する場合にはそれが高率（表１において＞９０％）になることを示している。さらに自己抗体の注入量と、抗原ベース・ヘテロポリマー媒介の結合によって赤血球細胞上に存在する自己抗体のレベルの間に、直線関係があることも示されている（図７）。いくつかの事例では、この系は飽和状態を示すことがあるが、これは血漿中の自己抗体の濃度が非常に高い場合は、抗原ベース・ヘテロポリマーの注入量が適当な場合であっても、標準条件下ではすべての自己抗体が赤血球細胞に結合できないことがあるからである（図８）。このことはファーの検定においても示されている。例えば、非常に力価が高い血清の場合、その濃度が高いために自己抗体の結合能力の１部は赤血球細胞への結合に働かないのである（表１）。こうしたケースは例外的であり、ループス腎炎患者からのサンプルの大半（これらは抗−ｄｓＤＮＡ抗体が病原性レベルにある）では、本発明の方法は＞９０％の抗−ｄｓＤＮＡ抗体を除去する。しかしながらこの飽和問題は、ＣＲ１の異なった部位に結合するモノクローナル抗体を含む抗原ベース・ヘテロポリマーの組み合わせを使用することによって解決することができる。モノクローナル抗体７Ｇ９および１Ｂ４は、赤血球細胞ＣＲ１の別々且つ非競合部位に結合する。従って、別個のモノクローナル抗体で作られた２種の抗原ベース・ヘテロポリマーの混合物を含む“カクテル”は、赤血球細胞に対する自己抗体の結合を高めることになる。血漿Ｍａは検討した中で最も高い力価のＳＬＥＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ血漿の１つである。抗−ＣＲ１モノクローナル抗体７Ｇ９並びに１Ｂ４のいずれか単体で調製された単一の抗原ベース・ヘテロポリマーは、無希釈血漿中の赤血球細胞にすべての抗−ｄｓＤＮＡ抗体を吸収させることはできない。しかしながら“カクテル”が使用される場合、血漿Ｍａ中のＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡの９０％以上が赤血球細胞に吸収される（図９）。また、血漿上澄みのファーの検定結果（表１）は、抗原ベース・ヘテロポリマーカクテルと赤血球細胞で処理した場合、血漿Ｍａ中の抗−ｄｓＤＮＡ抗体の結合活性の９０％以上が除去されることを示している。本発明はさらに、本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー複合体の有効量を霊長類に投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法も含んでいる。投与経路はヒトまたは非ヒト霊長類の血液中に静脈注射によって行われることになろう。本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー複合体の有効量は、１回の投与につき１〜１０ｍｇ、好ましくは５ｍｇである。この投与量は霊長類の循環系から最大量２μｇ／ｍｌの自己抗体を浄化することになる。治療環境的には、病原性自己抗原が完全に浄化されるまで治療を繰り返すべきである。本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー類は、静脈注入に使用される液体類と組み合わせて使用することができる。ここに開示したプロトタイプ研究はマウスのモノクローナル抗体を使用して実施したが、現在利用可能な技術によって、これらマウスモノクローナル抗体の“ ヒトへの適用”が可能とされるはずである。これによって、繰り返し投与により抗原ベース・ヘテロポリマーに対する有効性が無くなるという免疫応答の可能性を減じることになろう。取り除かれた、または単離された赤血球もまた、治療薬として使用することができる。抗原ベース・ヘテロポリマーで一旦無害化されると、これらの赤血球は患者に再導入することができ、そしてそこでは血流中の遊離自己抗体は赤血球に結合および固定化され、次いで体内の赤血球浄化機構に基づいて浄化されることになろう。前記のように、別の実施態様においては、赤血球は少なくとも２種類の抗原ベース・ヘテロポリマーの“カクテル”で無害化されるが、これらのヘテロポリマーカクテルは標的自己抗体に結合するのに加えて、霊長類赤血球上のＣＲ１のいくつかの別の重複しない部位にも結合する。下記の実験のいくつかが示すように、霊長類赤血球上のＣＲ１に結合する少なくとも２種類の非重複モノクローナル抗体を使用することにより、結合するヘテロポリマーの数が高率となり、結合可能な部位の数とよく一致するようになる。これはひいては、より多くの自己抗体を本発明のヘテロポリマー複合体に結合させることができることになる。これによって、比較的少数の赤血球が比較的大量の自己抗体と結合するという能力が高められ、さらに正常な霊長類の免疫浄化システムを通して自己抗体の排除をより容易にさせることになる。本発明のＡＨＰはさらに、外から投与されて病原性となる抗体の浄化といったケースでも使用することができる。実施例実施例１モノクローナル抗体と架橋結合ＡＨＰ抗−ＣＲ１／ｄＳＤＮＡ複合体霊長類ＣＲ１に特異的な３種のモノクローナル抗体、即ち１Ｂ４、ＨＢ８５９２、および７Ｇ９を、リースト[Reist]ら（前掲）に記述されている公知の方法により精製した。次いで精製されたモノクローナル抗体を公知の方法によりビオチン化した。典型的には、それぞれのモノクローナル抗体は５種のビオチンを含むことになる。ビオチン化した２４μｇの７Ｇ９と、４８μｌのホウ酸塩生理食塩水（ＢＳ緩衝液）に入れた３０μｇのストレプトアビジン（ＳＡ）を、３０分間室温でインキュベートした。次いで、得られたサンプルを７Ｇ９をビオチン化ｄｓＤＮＡに架橋結合させるために、コロラド大学医療センターのＷ．エムレン博士[Dr．W．Emlen]から購入した３３μｇのビオチン化ｄｓＤＮＡとともにインキュベートした（ＢＳ緩衝液１ｍｌ中、３０塩基対当り１ビオチン）。このプロセスを、１Ｂ４またはＨＢ８５９２を使用して反復した。形成された抗−ＣＲ１／ｄｓＤＮＡ複合体はそれ以上精製を加えずに使用した。実施例２結合検定３人の異なる患者からのＳＬＥ血漿またはＩｇＧ分画（それぞれの患者の姓の頭文字（即ち、Ｍａ、Ｍｏ、およびＨａ）で表す）を一般的な方法［テイラーら、“抗体／ＤＮＡ免疫複合体と補体との相互作用”［The Interaction of Antib ody/DNA Immune Complexes with Complement］、Arthritis and Rheumatism、３０（２）：１７６〜１８５（１９８７年２月）］により、赤血球細胞とＡＨＰを加えたもの（５０％赤血球細胞１５０μｌ当り１０μｌのＡＨＰ３）（図２の黒ベタ記号）ならびにＡＨＰを加えないもの（図２の白ヌキ記号）とともに、下記のように３７℃で所定時間インキュベートした：Ｏ型赤血球細胞を洗浄後、上記いずれかの血漿中で５０％ヘマトクリット値となるように再構築した。ＡＨＰを、赤血球細胞１個当り５００〜１０００個のＣＲ１レセプターとなるように、血液１ｍｌ当り約０．６〜１．２μｇの抗−ＣＲｌｍＡｂ“相当量”を添加した。短時間のインキュベーションの後サンプルを遠心分離し、抗−ｄｓＤＮＡ抗体の独立検定（ファー検定）を行うために上清を分離し、保管した。赤血球ペレットを３回洗浄し、次いでヒトＩｇＧ（ＨＢ４３）に対する¹²⁵Ｉ-標識モノクローナル抗体をこの赤血球細胞に加え、ヒトＩｇＧの取り込み量を測定した（テイラーら、８８：３３０５〜３３０９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、前掲）。図２の下の矢印は、１５分の完全なインキュベーション後の赤血球に対するバックグラウンド結合が、３つのサンプルともすべて低いレベルにあることを特に示している。図の左下の破線はＡＨＰとのインキュベーションの０分への外挿値である。図２はＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体のヒト赤血球細胞に対するＡＨＰ媒介結合の動態の結果を示すものである。これらの結果は本発明の複合体類が赤血球細胞に結合することを示している。これらの結果はさらに、ＡＨＰ複合体が、組み込まれたｄｓＤＮＡの特性によって、ＳＬＥ血漿中に見られる高い結合活性の１ｇＧおよび/ またはＩｇＭ/ 抗−ｄｓＤＮＡ抗体に対する特異的且つ迅速な結合（図２に示されているように３７℃において約５分間で約８０％完了する）を容易にすることを示している。抗−ｄｓＤＮＡ抗体並びに抗−ＣＲ１/ ｄｓＤＮＡＡＨＰ複合体の結合の特異性は、ＡＨＰが除外された場合にすべての結合が排除されるという事実によって明らかである（図２の白ヌキ記号）。実施例３２つのＳＬＥサンプルを上記実施例２と同様にして調製した。ただし、これらのサンプルはＡＨＰとともに３７℃で１５分間インキュベートした。血漿Ｍａは、図３に示されている通り、重症腎炎の患者からのサンプルを代表するものであり、すでに報告されているように、これは非常に高力価でほぼＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体だけを含んだものである（テイラーら、Arthritis and Rheu matism、（１９８７年）］。テイラーらには、血漿ＶａはＩｇＧおよびＩｇＭ抗 −ｄｓＤＮＡ抗体の両方を含むことが示されている。これらの赤血球細胞は、ヒトＩｇＧ（ＨＢ４３）およびヒトＩｇＭ（ＨＢ５７）の両方を、¹²⁵Ｉ-標識モノクローナル抗体でプローブした。実施例４結合特異性を示すための対照実験血漿Ｍａ、または血漿ＭａからのＩｇＧ分画を、前述と同様にして調製した。血漿Ｍａ、および血漿ＭａからのＩｇＧ分画を４倍希釈した。この実験には上記のようにヒト赤血球細胞を使用した。下記のように５種の異なるサンプルを調製した：ａ）ＡＨＰを除外したもの；ｂ）ヒト赤血球細胞の代わりにＣＲＩ部位が欠如しているヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣＳ）を用いたもの；ｃ）ＡＨＰ調製においてビオチン化ｄｓＤＮＡを除外したもの；そしてｄ）正常血漿または正常ＩｇＧをＳＬＥ血漿の代わりに用いたもの（図４）。図４に示されている結果は、ＡＨＰとヒト赤血球細胞が存在する場合（図４の左側の最初の２グループ）のみ、結合が明らかであることを示している。もしＡＨＰが除外されるが、またはＡＨＰからｄｓＤＮＡ抗原が除外されると、結合は全く見られない。さらに、ヒツジ赤血球細胞がＭａとともに使用された場合、または正常ヒトＩｇＧがＭａの代わりに使用された場合、結合はやはりバックグラウンドレベルまで減少する。実施例５この実験では、血漿Ｍａの２倍希釈液（ウシ血清アルブミンに希釈）を、同じ血漿Ｍａを新鮮な正常ヒト血清に希釈したものと比較した。以下の４種のサンプルを調製した：ａ）モノクローナル抗体を使用せずにＡＨＰを調製；ｂ）ＡＨＰをジニトロフェノール基に対するモノクローナル抗体（２３Ｄ１、無関係（ＩＲＲ）抗体）を用いて調製；ｃ）７Ｇ９／ｄｓＤＮＡＡＨＰを抑制するために、過剰の単一７Ｇ９抗−ＣＲ１を使用；そしてｄ）ＡＨＰを使用して調製した血清。特異性の証拠は図５に示されているが、もしモノクローナル抗体を使用せずにＡＨＰを調製した場合、ＡＨＰを無関係のモノクローナル抗体を用いて調製した場合、または７Ｇ９／ｄｓＤＮＡＡＨＰを抑制するために過剰の単一７Ｇ９抗− ＣＲ１を使用した場合には、結合が全く観察されないことが示されている。ビオチン化モノクローナル抗体７Ｇ９を含むＡＨＰの特異性が示されているが、これは過剰のモノクローナル抗体７Ｇ９がＣＲ１の部位に競合することができ、すべてが結合するのを排除するからである。新鮮な血清が存在する場合（補体源として２５容量％）については、特異的な結合を抑制したり、または赤血球細胞を溶解させないことも確認されている（図５）。実施例６抗原ベース・ヘテロポリマー類の定量的有効性を示すファーの検定標的自己抗体の赤血球細胞への結合を容易にする本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー類の定量的有効性を表Ｉにファーの検定の結果として示す。このファーの検定は、テイラーら、Arthritis and Rheumatism、前掲、の記載に従って実施した。これらの検定は抗−ｄｓＤＮＡ抗体に特異的なものである。上清サンプルは血漿蛋白質および大半のＩｇＧを含むが、これらはｄｓＤＮＡに特異的ではなく、赤血球細胞には結合しなかった。これらの検定では、上清中の抗−ｄｓＤＮＡ結合活性は、殆どのＳＬＥ血漿およびＩｇＧ分画に対して著しく減少（表１では９０％以上）していることを示している。これは即ち、ＡＨＰ複合体の存在下でＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体は紛れもなく赤血球細胞に特異的に吸収されたということである。上記の結果は、本発明の抗原ベース・ヘテロポリマー複合体の存在下で、自己抗体が紛れもなく高い効率（＞９０％）で赤血球細胞に特異的に吸収されたことを示している。実施例７用量応答試験ＡＨＰ１、ＡＨＰ２およびＡＨＰ３を以下のように調製した。ＡＨＰ３は実施例１に記述した手順に基づいて、５０％赤血球細胞１５０μｌ当り１０μｌのＡＨＰ３を使用して調製した。ＡＨＰ１およびＡＨＰ２については、ＡＨＰ２はＡＨＰ３のｄｓＤＮＡの１／２を含み、またＡＨＰ１はＡＨＰ３の１／４のｄｓＤＮＡを含む以外は、同様にして調製した。ＳＬＥＩｇＧサンプル１５０μｌ中の赤血球細胞（ヘマトクリット値５０％）へのヒトＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体の結合を最大化するための、ＡＨＰ最適注入量を求めるために用量応答試験を実施した。ＡＨＰ媒介によるヒト赤血球細胞への自己抗体の結合は、注入されたＡＨＰ濃度の関数として調べた場合、ベル型（中凸状）曲線を呈することになる（図６）。ＡＨＰ３はＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡの赤血球細胞への最高レベルの結合を容易にすることからＡＨＰを代表するものとして選んだ。このデータは、ＡＨＰの注入量範囲が赤血球細胞の濃度と（抗−ＣＲ１モノクローナル抗体によって認識される）１赤血球細胞当りのＣＲ１エピトープ部位の数に基づいて決定されることを示している。もしＡＨＰが過剰に添加された場合、そのＡＨＰの１部は赤血球細胞に結合しないが、その代わり赤血球細胞による自己抗体の取り込みを抑制する。その理由は、遊離のＡＨＰが溶液中にある場合、それが赤血球細胞に結合するＡＨＰと自己抗体の取り込みで単純に競合するからである。実施例８自己抗体濃度の関数としての用量応答試験ヒト赤血球細胞の５０％分散液を、ウシ血清アルブミンおよびＩｇＧＭｏの混合物中で検査した。図７はこの結合実験の結果を示したものである。この結果は、結合された計測値（結合されたＩｇＧのレベル）とＳＬＥＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体の注入量レベルの間に、ＡＨＰ媒介の結合による直線関係があることを示している。このデータは最小二乗法解析による単純な直線式に合致した。実施例９実験８と同様の実験を行った。ただしここでは、非常に高力価の抗−ｄｓＤＮＡ血漿（Ｍａ）を検査した。このサンプルを用いて希釈した場合は、すべての内因性ＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡが赤血球細胞に結合されるものではないことが明らかとなった。従って、いくつかのケースでは、このシステム（系）は飽和状態を示すことがあるが、それはＳＬＥ血漿中のＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体の濃度が非常に高いため、ＡＨＰの注入量が適当な場合であっても、標準条件下ではすべての自己抗体が赤血球細胞に結合できないことがあるからである（図８）。このことはファーの検定（下記）においても示されており、非常に力価が高い血漿の場合、その濃度が高いために抗−ｄｓＤＮＡ抗体の結合能力のかなりの部分は赤血球細胞への結合に働かないのである（表１参照）。幸いなことに、こうしたケースは例外的なものである。検討したループス腎炎患者からのＳＬＥ血漿の多く（並びに抗−ｄｓＤＮＡ抗体が病原性レベルのもの）では、この方法は９０％を超える抗−ｄｓＤＮＡ抗体を除去する。実施例１０ＡＲＰ“カクテル”を使用した場合のＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体濃度の関数としての結合。異なるＣＲ１部位に結合するモノクローナル抗体を含む組み合わせＡＨＰを調製した。モノクローナル抗体７Ｇ９および１Ｂ４は赤血球細胞のＣＲ１部位の別々で且つ非競合の部位に結合する。このようにして調製したカクテルはこれら個々のモノクローナル抗体で作られた２種のＡＨＰの混合物を含むものである。その結果は図９に示されているように、カクテルを使用するとＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ抗体の赤血球細胞への結合が高まることを示している。前記のように、血漿Ｍａはこれまでに検討した中で最も高い力価のＳＬＥＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡ血漿の１つである。抗−ＣＲ１モノクローナル抗体７Ｇ９または１Ｂ４のいずれか単体で調製された単一のＡＨＰは、無希釈の血漿中ですべての抗−ｄｓＤＮＡ抗体を赤血球細胞に吸収することはできない。しかしながら、“カクテル”が使用された場合、結合の直線性（たとえ無希釈血漿であっても）が維持されることは、血漿Ｍａ中のＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡの９０％以上を赤血球細胞が吸収できることを示唆している。これは血漿上清のファー検定において確認されており（表１参照）、この血漿がＡＨＰ“カクテル”およびヒト赤血球細胞で処理された場合、血漿Ｍａ中の抗−ｄｓＤＮＡ抗体結合活性の９０％以上が除去されることを示している。抗−ＣＲ１モノクローナル抗体１Ｂ４を用いて調製されたＡＨＰは、モノクローナル抗体７Ｇ９で調製されたＡＨＰより少し良好な結合を示した。しかしながら、この両者ともＭａの最高注入量で飽和が見られた。一方、両方のＡＨＰを含むカクテルを使用した場合、結合が著しく強化され、すべてのＩｇＧ抗−ｄｓＤＮＡが赤血球細胞に結合されうることを示唆している（図９）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/28 9356−4ＨＣ０７Ｋ 16/28 16/46 9356−4Ｈ 16/46 19/00 9356−4Ｈ 19/00 // Ｃ１２Ｐ 21/08 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファーグソン，ポリー，ジェー. アメリカ合衆国 22903 バージニア州, シャーロッツビル，ユニバーシティオブバージニア (72)発明者マーティン，エドワード，エヌ. アメリカ合衆国 22903 バージニア州, シャーロッツビル，ユニバーシティオブバージニア (72)発明者サザーランド，ウィリアム，エス. アメリカ合衆国 22903 バージニア州, シャーロッツビル，ユニバーシティオブバージニア (72)発明者レイスト，クライ，ジェー. アメリカ合衆国 22903 バージニア州, シャーロッツビル，ユニバーシティオブバージニア (72)発明者グリーン，キルストンアメリカ合衆国 22903 バージニア州, シャーロッツビル，ユニバーシティオブバージニア (72)発明者ジョンソン，シドアメリカ合衆国 22903 バージニア州, シャーロッツビル，ユニバーシティオブバージニア

Claims

【特許請求の範囲】１．霊長類赤血球上の補体レセプター（ＣＲ１）部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を包含する、抗原をベースとしたヘテロポリマー（ＡＨＰ）複合体であって、前記モノクローナル抗体が標的病原性抗体または自己抗体に特異的な抗原に架橋結合されている、抗原ベース・ヘテロポリマー複合体。２．モノクローナル抗体が、１Ｂ４、ＨＢ８５９２、および７Ｇ９で構成されるグループから選ばれる、請求項１に記載のＡＨＰ。３．標的抗体または自己抗体が次の抗原、即ち、第VIII因子、筋肉アセチルコリンレセプター、カルジオリピン、血小板に関係する蛋白質類、シェーグレン症候群に関係する抗原類、２本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、および１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、に対する抗体または自己抗体で構成されるグループから選ばれるものである、請求項１に記載のＡＨＰ。４．前記抗原が、第VIII因子、筋肉アセチルコリンレセプター、カルジオリピン、血小板に関係する蛋白質類、シェーグレン症候群に関係する抗原類、２本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、および１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で構成されるグループから選ばれる、請求項１に記載のＡＨＰ。５．少なくとも２種のＡＨＰを包含するＡＨＰカクテルであって、当該ＡＨＰが霊長類赤血球上の補体レセプター（ＣＲ１）部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を包含し、且つ当該モノクローナル抗体が標的病原性抗体または自己抗体に特異的な抗原に架橋結合されているものである、ＡＨＰカクテル。６．自己免疫疾患を治療する方法であって、１）ヒトまたは非ヒト霊長類に臨床的有効量のＡＨＰを投与し、ただし当該ＡＨＰは霊長類赤血球上の補体レセプター（ＣＲ１）部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を包含し、且つ当該モノクローナル抗体が標的病原性抗体または自己抗体に特異的な抗原に架橋結合されているものであり、２）前記ＡＨＰを、少なくとも１個の競合ＣＲ１部位と、前記病原性抗体または自己抗体に結合させ、３）前記の結合されたＡＨＰを、前記ヒトまたは非ヒト霊長類の循環系から一掃されるようにする、上記各段階を包含する治療方法。７．モノクローナル抗体が、１Ｂ４、ＨＢ８５９２、および７Ｇ９で構成されるグループから選ばれる、請求項６に記載の方法。８．標的抗体または自己抗体が次の抗原、即ち、第VIII因子、筋肉アセチルコリンレセプター、カルジオリピン、血小板に関係する蛋白質類、シェーグレン症候群に関係する抗原類、２本鎮デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、および１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、に対する抗体または自己抗体で構成されるグループから選ばれるものである、請求項６に記載のＡＨＰ。９．前記抗原が、第VIII因子、筋肉アセチルコリンレセプター、カルジオリピン、血小板に関係する蛋白質類、シェーグレン症候群に関係する抗原類、２本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、および１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で構成されるグループから選ばれる、請求項６に記載のＡＨＰ。１０．ＡＨＰをヒトまたは非ヒト霊長類に対して経静脈的に、臨床的有効量投与する、請求項６に記載の方法。１１．前記ＡＨＰをヒトに対して経静脈的に、１〜１０ｍｇの臨床的有効量を投与する、請求項１０に記載の方法。１２．前記臨床的有効量のＡＨＰの前記投与が、前記ヒトまたは非ヒト霊長類の循環系から病原性抗体または自己抗体が完全に一掃されるまで繰り返される、請求項６に記載の方法。１３．前記標的病原性抗体または自己抗体が霊長類の循環系から一掃され、かつ前記赤血球は循環系中を再循環される、請求項６に記載の方法。１４．自己免疫疾患を治療する方法であって、１）ヒトまたは非ヒト霊長類に、少なくとも２種のＡＨＰを包含するＡＨＰカクテルを臨床的有効量投与し、ただしそれぞれのＡＨＰは霊長類赤血球上の補体レセプター（ＣＲ１）部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を包含し、且つ当該モノクローナル抗体が標的病原性抗体または自己抗体に特異的な抗原に架橋結合されているものであり、２）前記ＡＨＰカクテルを、少なくとも１個の競合ＣＲ１部位と、前記病原性抗体または自己抗体に結合させ、そして３）前記の結合されたＡＨＰカクテルを、前記ヒトまたは非ヒト霊長類の循環系から一掃されるようにする、上記各段階を包含する治療方法。１５．自己免疫疾患を治療する方法であって、１）ヒトまたは非ヒト霊長類赤血球をＡＨＰで無害化させ、ただし当該ＡＨＰは霊長類赤血球上の補体レセプター（ＣＲ１）部位に特異的に結合するモノクローナル抗体を包含し、且つ当該モノクローナル抗体が標的病原性抗体または自己抗体に特異的な抗原に架橋結合されているものであり、２）ヒト又は非ヒト霊長類に臨床的有効量のＡＨＰ無害化赤血球を投与し、３）前記ＡＨＰを前記病原性抗体または自己抗体に結合させ、そして４）前記の結合されたＡＨＰを、前記ヒトまたは非ヒト霊長類の循環系から一掃されるようにする、上記各段階を包含する治療方法。