JPH09509310A - Ｎｅｕ仲介トランスフォーメーションを抑制するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 neu癌遺伝子の発現を抑制するため、ならびにneu遺伝子仲介トランスフォーメーション、腫瘍発生、および転移を抑制するための、方法および組成物を開示する。開示する方法は、アデノウイルス初期１Ａ遺伝子（Ｅ１Ａ遺伝子）産物、あるいは大型Ｔ抗原（ＬＴ遺伝子産物）、またはその両者を罹患細胞に導入することを含む。Ｅ１Ａ遺伝子を罹患細胞にトランスフェクトすることによって好ましく導入されるこれらの産物は、ｐ１８５細胞増殖の低下によって測定されるような、neu遺伝子発現の抑制に役立つ。さらに、Ｅ１Ａ遺伝子産物は細胞増殖、ソフトアガーにおける増殖、ならびにインビボでの腫瘍発生能および転移能の低減によって表される、癌遺伝子表現型の抑制を驚くほど助ける。発明者は、女性の生殖管癌や乳癌など、neu仲介癌の治療モダリティとして、Ｅ１Ａ遺伝子産物、ＬＴ遺伝子産物あるいはそれらの誘導体を最終的に採用することが可能であると提案する。発明者は、アデノウイルスベクターまたはリポソームを使用して、Ｅ１Ａ遺伝子産物またはＬＴ遺伝子産物のいずれかで細胞をトランスフェクトする方法も提案する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＮＥＵ仲介トランスフォーメーションを抑制するための方法および組成物 発明の背景 本発明は１９９３年１２月３日に提出した米国特許出願第０８／１６２，４０ ６号の一部継続出願である。前記開示内容の全文および図は、引用することによ り、放棄されることなく、本明細書に明確に組み入れられるものである。 Ａ．発明の分野 本発明は、癌遺伝子が仲介する、トランスフォーメーション、腫瘍発生(tumor igenesis)および転移(metastasis)を抑制するための方法およびそれに関連した 遺伝子構造物に関する。特に、本発明は、ヒトの乳癌および卵巣癌の悪い予後と 関連づけられている癌遺伝子であるHER-2/c-erb B-2/neu癌遺伝子が仲介する発 癌の抑制に関する。 Ｂ.関連技術の背景 過去１０年間に、多数のヒト悪性腫瘍が、ヒトゲノムにおける「癌遺伝子」の 存在および発現と相関関係を示すことが発見された。現在、２０種類以上の異な る癌遺伝子が腫瘍発生に関係するとされており、ヒトの癌において直接的な役割 を演じると考えられる（Weinberg、１９８５）。これらの癌遺伝子の多くは明ら かに、発現産物の発現または活性のいずれかに変化をきたす、「プロトオンコジ ーン」と呼ばれる、対応する正常細胞の突然変異誘発によって生起する。プロト オンコジーンを、ある一定の増殖シグナルに応答した発現（例えば、Campisi et al.，１９８３を参照）や胚発生中の発現（Muller et al.，１９８２）を含め 、細胞増殖と関連づけるかなりのデータがある。さらに、多数のプロトオンコジ ーンは成長因子または成長因子受容体と関連している。 c-erbB遺伝子は、表皮成長因子受容体（ＥＧＦｒ）をコードし、トリ赤芽球症 ウイルスのトランスフォーミング遺伝子と高度に相応する（Downward et al.， １９８４）。c-erbB遺伝子は、多くのプロトオンコジーンが属するチロシン特異 的プロテインキナーゼ・ファミリーの一員である。c-erbB遺伝子は、c-erbB-2、 HER-2あるいはneu癌遺伝子と様々に呼ばれる（本明細書では単純にneu癌遺伝子 と呼ぶ）遺伝子と類似しているが、別個であることが最近確認され、現在、女性 の乳癌および生殖管癌の病因論と密接な関係があることが判明している。 ｐ１８５腫瘍抗原をコードするneu癌遺伝子は、化学的に誘導されたラット神 経膠芽腫由来のＤＮＡでNIH 3T3細胞をトランスフェクトしたトランスフェクシ ョン試験で初めて同定された（Shih et a1.，１９８１）。ｐ１８５蛋白は細胞 外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを有し、したがって成長因 子受容体の構造と一致する構造を有する（Schechter et al.，１９８４）。ヒト neu遺伝子は、v-erbBプローブおよびEGF-rプローブと相同であるため、最初に分 離された（Senba et al.，１９８５）。 トランスフォーミングneu癌遺伝子およびそれに対応する正常細胞であるneuプ ロトオンコジーンの分子クローニングにより、neuコード化ｐ１８５蛋白の膜貫 通ドメインのアミノ酸１個の変化によって生じるneu癌遺伝子の活性化は単一点 突然変異に起因することがわかった（Bargmann et al.，１９８６；Hung et al. ，１９８９）。 neu癌遺伝子の存在はヒト乳癌および女性の生殖管癌の発生率と相関関係があ るため、neu癌遺伝子は医科学に特に重要である。さらに、本遺伝子の増幅／過 剰発現は、ヒト乳癌の再発および生存率と直接関連することが明らかにされてい る（Slamon et al.，１９８７）。したがって、neu癌遺伝子に関する情報、特に 本遺伝子の存在もしくは活性化によって誘発されると考えられる癌遺伝子進行の 逆転または抑制に応用できる情報を導き出すことが、医科学の極めて重要な目的 で ある。不運なことに、neu癌遺伝子のような癌遺伝子の存在に関連した癌遺伝子 表現型の抑制を始めることがとのようにできるのかについての知見は、これまで ほとんどない。 正常細胞が腫瘍発生表現型に変換する際に多段過程が関与すること裏付ける大 量の調査研究がある（例えば、Land et al.，１９８３を参照）。この仮説を裏 付ける分子モデルは、アデノウイルスとポリオーマウイルスという２種類のＤＮ Ａ腫瘍ウイルスの試験で初めて提供された。アデノウイルスの場合、一次細胞の トランスフォーメーションは初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺伝子および初期領域１Ｂ （Ｅ１Ｂ）遺伝子の両者の発現を必要とすることが判明した（Houweling et al. ，１９８０）。Ｅ１Ａ遺伝子産物は、中間Ｔ抗原または活性H-ras遺伝子と協同 して一次細胞をトランスフォームできることが後日判明した（Ruley、１９８５ ）。これらの観察結果から、複数の機能がトランスフォーメーション過程に関与 すること、また種々の癌遺伝子が細胞レベルで類似した機能を発現することがわ かった。 アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子は、多数の興味深い特性が属すると考えられる幾 つかの関連蛋白をコードする。トランスフォーメーションにおいて第２癌遺伝子 を補足する能力のほかに、密接に関連した機能によってＥ１Ａが一次細胞を不滅 化または不死化することが可能になる（Ruley、１９８５）。例えば、Ｅ１Ａ遺 伝子産物を一次細胞に導入すると、血清の存在下で培養したとき、これらの細胞 は無制限な増殖能を有する。 Ｅ１Ａ機能の興味深い別の作用は、いわゆる「トランス活性化」であって、Ｅ １Ａ遺伝子産物が、アデノウイルス初期プロモータおよび主後期プロモータを含 め、様々なウイルスプロモータや細胞性プロモータからの転写を刺激する。しか し、トランス活性化はすべてのプロモータに普遍的ではない。エンハンサー要素 に連結している細胞性プロモタからの転写を、Ｅ１Ａが減少させる場合もある （Haley et al.，１９８４）。最近、外来的に加えたＥ１Ａ遺伝子が、より低い 転移能力を有するとされる細胞性ＮＭ２３遺伝子を活性化することによって、ra sトランスフォームラット胚線維芽細胞の転移能力を低減できることが証明され た（Pozzatti et al.，１９８８；Wallich et al.，１９８５）。 Ｅ１Ａ遺伝子産物は、遺伝子によって産生される２種類のｍＲＮＡの沈降値を 考慮して、１３Ｓ産物および１２Ｓ産物と呼ばれる。これらの２種類のｍＲＮＡ は共通の前駆体の分別スプライシングよって生じ、それぞれアミノ酸２８９個お よびアミノ酸２４３個の関連蛋白をコードする。この蛋白は、１３Ｓ蛋白独特の アミノ酸４６個によって内的に異なる。多数のＥ１Ａ蛋白種は、ＰＡＧＥ分析に よって分離することができ、おそらく一次翻訳産物の広範な翻訳後修飾の結果と して生じる（Harlow et al.，１９８５）。 別のウイルス腫瘍蛋白、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＬＴ）は、Ｅ１Ａおよびc-my cと構造的相同性および機能的相同性を共有する（Figge et al.，１９８８）。 ＬＴ、Ｅ１Ａおよびc-mycは、アミノ酸配列相同性および類似した二次構造を共 有するトランスフォーミングドメインを有する（Figge et al.，１９８８）。３ 種類の蛋白はすべて、腫瘍サプレッサである網膜芽腫遺伝子産物（Ｒｂ）と複合 し（Whyte et al.，１９８８、DeCaprio et al.，１９８８、Rustgi et al.，１ ９９１）、ＬＴおよびＥ１ＡのＲｂ結合ドメインは、それらのトランスフォーミ ングドメインと一致する。これらの類似性に基づいて、ＬＴおよびＥ１Ａは細胞 性Ｒｂを結合し、その腫瘍サプレッサー機能を排除することによって細胞をトラ ンスフォームすると考えられてきた。ＬＴ、Ｅ１Ａおよびc-mycは、ラット胚線 維芽細胞を使用する癌遺伝子協同アッセイで決定される、不滅化癌遺伝子として も分類される（Weinberg、１９８５）。 ＬＴのＲｂ結合ドメインとＥ１ＡのＲｂ結合ドメインが類似しているにも拘わ らず、２種類の蛋白は、その他に関して実質的に異なる。事実、酸性アミノ酸の 等価範囲は明らかに短い（Gigge et al.，１９８８）。この範囲は、ＬＴのアミ ノ酸１０６〜１１４とＥ１Ａのアミノ酸１２１〜１３９にある。ラージＴ抗原は 、ポリオーマウイル・ファミリーの一員であるシミアンウイルス４０によってコ ードされる。対照的に、Ｅ１Ａは、アデノウイルス・ファミリーの一員であるア デノウイルス５ウイルスによってコードされる。ＬＴはアミノ酸７０８個の長さ であるが、Ｅ１Ａはアミノ酸２９８個で、実質的に短い。ＬＴはある一定のＤＮ Ａ配列に直接結合することが確認されているが、Ｅ１Ａは確認されていない。Ｌ Ｔは腫瘍サプレッサＲｂと結合し、ｐ５３とも結合する。Ｅ１ＡはＲｂと複合す るが、ｐ５３とは複合しない。Ｅ１Ａは細胞にアポトーシスを誘導することが証 明されているが、ＬＴに関しては証明されていない。 さらに、ＬＴは、癌遺伝子分類の枠組みにおいて、明らかに変則的である。癌 遺伝子は、一般に細胞質癌遺伝子または核癌遺伝子として分類される。しかし、 ＬＴは、単一蛋白の作用により、不滅化（または不死化）のような「細胞質」特 性および細胞における固着部(anchorage)非依存性のような「核」特性を誘導す ることができる（Weinberg、１９８５）。ＬＴ抗原は核にも原形質膜にもみられ 、ＬＴの核への輸送を阻害する突然変異は、ＬＴの不滅化能を低減させるものの 、その足場非依存性に対する作用ならびに既に不滅化されている細胞をトランス フォームする能力は無傷のままのようである。結論として、本癌遺伝子は、２つ の別個の細胞部位で作用するようにその遺伝子産物を送り出すため、核癌遺伝子 クラスと細胞質癌遺伝子クラスの両者の一員であると考えられる（Weinberg、１ ９８５）。対照的に、Ｅ１Ａは核癌遺伝子としてのみ知られている。 悪性腫瘍の発生に貢献する、ある一定の成分の同定は進歩したものの、その技 術は未だ発癌を抑制する有効な手段を欠いていることは明白である。例えば、ne u癌遺伝子活性化、あるいは乳癌や生殖管癌など、分子事象と関連して種々の癌 の発生を抑制する特に好結果の方法は今のところない。 発明の概要 本発明は、neu仲介性の発癌を抑制する方法を提供することによって、これら および他の先行技術固有の欠点を克服しようとする。本発明のある態様では、Ｅ １Ａ遺伝子およびＬＴ遺伝子がトランスフォーメーションの促進に関与するとい う以前の知見とは異なり、Ｅ１Ａ遺伝子産物およびＬＴ遺伝子産物はneu癌遺伝 子の発現の抑制を実際に助けるだけではなく、neu癌遺伝子活性化に随伴する癌 遺伝子表現型を抑制することができるという、発明者の驚くべき発見に関する。 興味深いことに、これらの２種類の遺伝子産物は、異なる機序によってそのよう に作用する。この刺激的な発見は、neu癌遺伝子仲介癌の治療の新しいアプロー チ、ならびに詳細にはこの癌遺伝子の調節、そして一般には癌遺伝子表現型の調 節に関する理解の向上に通じるドアを開くと考えられる。 それゆえ、本発明は、それ自身が癌遺伝子の役割をすることが知られている遺 伝子であるアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の産物を有効に使用して、neu癌遺伝子 のトランスフォーミング能を抑制するという、発明者の驚くべき発見から生まれ る。したがって、本発明は一般的な意味で細胞のneu癌遺伝子仲介トランスフォ ーメーションを抑制する方法に関する。その方法は、細胞のトランスフォーミン グ能や、腫瘍発生能、転移能の低減によって示されるような、癌遺伝子表現型に 有効なやり方で、このような細胞にＥ１Ａ遺伝子産物を誘導することを含むこと を特徴とする。 本発明は、ＬＴ抗原を細胞に誘導するとｐ１８５をコードしたneuの発現を著 しく低減させるという発明者の驚くべき立証事実から生まれる。ＬＴは、Ｅ１Ａ およびc-mycと同様、neuの上流調節配列を抑制する。しかし、ＬＴはＥ１Ａおよ びc-mycと比べてneu調節配列の異なる領域を抑制し、ＬＴは異なる経路によって neu発現に影響することが示唆される。 先に行われている研究では、腫瘍サプレッサＲｂがneuプロモータの活性を抑 制 することが分かっている（Yu et al.，１９９２）。ＲｂはＬＴと複合すること が判明していたため、発明者はＬＴ−Ｒｂ複合体がＬＴ仲介neu抑制に影響する かどうかを調査した。意外なことに、発明者は、ＬＴのＲｂ結合ドメインは、ne uプロモータを抑制する際に、その機能を必要としないことを確認し、ＬＴはＲ ｂを結合せずにneu発現を抑制できることがわかった。このことから、ＬＴおよ びＥ１Ａは同じように作用していないことがわかる。さらに、neuのトランスフ ォーミング活性を抑制できる、ＬＴの非トランスフォーミング突然変異体（Ｋ１ ）が発見されている。したがって、ＬＴによるneuの抑制は、Ｒｂを複合し、細 胞をトランスフォームするＬＴの能力と無関係である。したがって、Ｅ１Ａ、Ｌ Ｔおよびc-mycはトランスフォーメーション（Figge et al.，１９８８）および Ｒｂ結合（Whyte et al.，１９８８；DeCaprio et al.，１９８８；Rustigi et al.，１９９１）の共通ドメインを共有するものの、このドメインは、少なくと もＬＴでは、neuプロモータの抑制に必要ではない。このことにより、ＬＴはＥ １Ａおよびc-mycと比べて異なる経路でneuを抑制するという観察結果が裏付けら れる。 この結果は、Ｒｂ結合とトランスフォーメーションの両方について欠陥のある ＬＴ突然変異体であるＫ１は、活性neu癌遺伝子のトランスフォーメーション・ サプレッサとして機能することができる。この知見により、ヒト癌におけるneu 発現をダウンモジュレートする治療剤の開発が可能になる。 一般に、Ｅ１Ａ遺伝子産物およびＬＴは、癌遺伝子表現型の観察された抑制に 直接的に関与していると言われるため、本発明の目的は、例えば、ウイルス仲介 遺伝子転移や、カルシウムホスファターゼまたはリポソーム法によるＤＮＡトラ ンスフェクション、および微量注入による遺伝子産物の直接注入さえも含む、都 合のよい任意の方法でＥ１Ａ遺伝子産物またはＬＴを細胞内に導入することによ って達成することが可能であると考えられる。例えば、neu癌遺伝子抑制を研究 しようとする場合、上記のような方法は十分に役に立つと考えられる。しかし、 治 療方法を考える場合、neuの抑制に必要なＥ１Ａ蛋白またはＬＴの特定のドメイ ンをコードするＤＮＡセグメントの細胞内導入によって、選択されたＥ１Ａ遺伝 子産物またはＬＴを導入する必要があると思われる。 あらゆる事象で、Ｅ１Ａ遺伝子産物は広く特徴が調べられており、遺伝子その ものがクローン化されている（例えば、Berk et al.，１９７８参照）ため、本 発明を実施したい当業者は、出発材料、すなわちＥ１Ａ産物および遺伝子を容易 に入手できる。 ＬＴもその特徴が調べられていて、遺伝子がクローン化されている。ＳＶ４０ ヌクレオチド配列全体が書籍”Molecular Biology of Tumor Viruses，Part 2， 2d．ed.”(腫瘍ウイルスの分子生物学、パート２、第２版）、Tooze，J.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York（１９８１）、Appe ndix A，pp．799〜813に開示されている。Molecular Biology of Tumor Viruses には、ゲノムの配列のほか、ＳＶ４０ゲノム内のラージＴ抗原の位置を含め、Ｓ Ｖ４０ランドマークのマップが記載されている［ｐ.813］。参考文献であるFier s et al.，１９７８や、Reddy et al.，１９７８の論文も、ＳＶ４０の遺伝子配 列を報告している。Molecular Biology of Tumor Virusesの８５４ページおよび ８５７〜８６１ページにＬＴのアミノ酸配列が記載されている。自然のＬＴの様 々な突然変異体が記載されている。例えば、Kalderonら（１９８４）は、自然の ＬＴ遺伝子の欠失および点突然変異の結果である、多くのＬＴ突然変異を記述し ている。Kalderonらが報告した各ＬＴ突然変異の関連アミノ酸配列は、同参考文 献の表２に記載されている。Kalderonら（１９８４）の情報とMolecular Biolog y of Tumor Virusesに記載されている自然のＬＴの配列情報を結びつけることに よって、これらの突然変異体のあらゆる配列を決定することができる。本段落に 引用した参考文献に記載されている自然のＬＴおよびＬＴ突然変異体のゲノム配 列およびアミノ酸配列は全て、引用することにより本明細書に組み込まれるもの である。遺伝子産物の導入 遺伝子産物の導入に遺伝子そのものを使用する場合、都合のよい導入方法は、 望ましい遺伝子を、それに関連した制御配列と一緒に組み込んだ組換えベクター を使用する方法であろう。組換えベクターの調製は、当業者には周知であり、た とえばSambrookら（１９８９）など、特に引用することより本明細書に組み込ま れる多くの参考文献に記述されている。 ベクターを使用する場合、発現されるＤＮＡコード配列、この場合、neu抑制 遺伝子産物をコードしている配列は、プロモータの隣に配置され、プロモータの 制御下にあると理解されている。このようなプロモータの制御下でコード配列を 運んでくるためには、一般に、遺伝子産物の転写読み枠の転写開始部位の５’末 端を、選択されたプロモータの約１〜約５０個のヌクレオチド分「下流」（すな わち３’側）に発現されるように配置すると技術上理解される。挿入された最初 のＤＮＡ内に含まれていない場合、適切なポリアデニル化部位（例えば、５’− ＡＡＴＡＡＡ−３’）をベクターの転写単位に組み込みたいこともある。一般に 、ポリＡ付加部位は、転写終結より前の位置のコード配列の約３０〜２０００個 のヌクレオチドだけ「下流」に定められる。 特定の遺伝子の制御配列（すなわち、Ｅ１Ａの場合はＥ１Ａプロモータ、ＬＴ の場合はＬＴプロモータ）を使用することが好ましいが、制御配列が処理される 細胞の表現型と一致する限りは、他の制御配列を使用できない理由はない。この ように、例えば、ＳＶ４０初期プロモータ、レトロウイルス由来の長末端反復プ ロモータ、アクチン・プロモータ、熱ショック・プロモータ、メタロチオネイン ・プロモータ等を含め、他の有用なプロモータを例として挙げることが可能であ る。 Ｅ１Ａ遺伝子またはＬＴ遺伝子の導入の場合、望ましい遺伝子を罹患細胞に送 達するベクター構造物を好ましく使用したいと考えられる。もちろん、このため には、構造物が標的腫瘍細胞、例えば乳癌細胞、生殖癌細胞、肺癌細胞に送達さ れることが一般に必要である。これは、Ｅ１Ａ配列またはＬＴ配列のいずれかを 運び、腫瘍または前腫瘍状組織を効率良く感染させるように、ウイルスのベクタ ーを使用して遺伝Ｅ１Ａを導入することにより、最も好ましく達成されると考え られる。これらのベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクタ ー、ワクシニアウイルスベクター、またはアデノウイルス伴生ウイルスであるこ とが好ましい。これらのベクターは、望ましい配列を細胞に送達するために使用 されて、成功しており、感染効率が高い傾向があるので、好ましい。 一般に発現ベクターに使用されるウイルス・プロモータは、ポリオーマ、サイ トメガロウイルス、アデノウイルス２、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０ ）由来のものである。ＳＶ４０の初期プロモータおよび後期プロモータは、両者 ともにＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むフラグメントとしてウイルスから容易 に得られるため、特に有用である。ウイルスの複製起点に位置するHind III部位 からBgl I部位まで伸びる約２５０bpの配列が含まれれば、より小さいＳＶ４０ フラグメントやより大きいＳＶ４０フラグメントを使用することも可能である。 さらに、このような制御配列が宿主細胞系に適合すれば、通常、望ましい遺伝子 配列に関連したプロモータまたは制御配列を使用することも可能であり、望まし い場合が多い。 複製起点は、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、ア デノウイルス、ＶＳＶ、あるいはＢＰＶ）起源に由来するような、外因性起点を 含むベクターを構築することによって提供しても、宿主細胞染色体複製機構によ って提供してもよい。ベクターが宿主細胞の染色体に統合されるのであれば、多 くの場合、後者で十分である。 少なくとも起点として、特に望ましいベクターは、Robert et al,．1985の論 文 に記載されていた、pSVXE1A-Gと呼ばれるレトロウイルスベクター含有Ｅ１Ａで ある。本ベクターは、ＳＶ−４０初期プロモータの制御下で運ばれるＥ１Ａ遺伝 子を含む。ＬＴ発現の場合、pZ189ベクタ（ＳＶ−８０プロモータによって操縦 される）およびpVU-0ベクタは、両者ともＬＴを含む。ＬＴ突然変異体は、例え ば、ｐＫ１およびｐＫ２、ならびにKalderonら（Kalderon et al.，１９８４） が報告した他のベクーに含まれる。発明者は、これらの構造物は、本発明の実施 に直接使用することもでき、上記のような、より望ましいプロモータを導入する 起点として使用することも可能であると考える。 Ｅ１Ａ遺伝子を動物に導入する好ましい方法は、Ｅ１Ａ遺伝子を含有する複製 能不全(replication deficient)アデノウイルスの導入である。このようなアデ ノウイルスの例は、Ad.E1A(+)である。事実上、アデノウイルスはヒトを冒す普 通のウイルスであり、Ｅ１Ａ遺伝子は自然のアデノウイルスに存在する遺伝子で あるため、複製能不全Ｅ１Ａウイルスを遺伝子の導入に使用すると、Ｅ１Ａを効 率良く標的細胞に送達し、発現することが可能である。Ｅ１ＢおよびＥ３欠失に よって作られた複製能不全Ｅ１Ａウイルスも、細胞内のウイルス再生ならびに他 の細胞への転移および他の人々の感染を避けるが、これは、標的細胞を感染させ た後、ウイルスの感染活性が妨げられることを意味する。Ｅ１Ａ遺伝子は依然と して細胞内で発現される。また、増殖中の細胞にしか感染することができないレ トロウイルスと違って、アデノウイルスは、Ｅ１Ａ遺伝子を増殖中の細胞にも、 非増殖中の細胞にも転移することができる。さらに、感染した細胞におけるアデ ノウイルスが染色体外の位置にあることは、処理動物体内の細胞性癌遺伝子活性 化の機会を減少させる。野生型アデノウイルスを使用して、Ｅ１Ａ遺伝子をHER- 2/neu発現癌細胞に直接転移させることも可能であるが、野生型ウイルスは人体 内で大量のアデノウイルスを生産し、そのため野生型アデノウイルスの複製成分 の性質による潜在的な副作用を引き起こす可能性がある。したがって、このよう な副作 用を防止するために、Ｅ１ＢおよびＥ３欠失突然変異体Ad.E1A(+)のような複製 能不全アデノウイルスを使用すると有利である。事実、天然のアデノウイルスに おける多くの修飾により、本発明の目的に有用な修飾されたウイルスを得ること ができる。Ｅ２Ａ欠失のようなさらなるアデノウイルスの修飾により、Ｅ１Ａ発 現効率を高め、副作用を減少させることも可能である。自然のアデノウイルスま たは修飾されたアデノウイルスの唯一の必要条件は、本発明の有用性のために、 Ｅ１Ａ遺伝子をを発現すべきことである。 Ｅ１Ａ遺伝子含有アデノウイルスの適切な宿主への導入は、一般に緩衝液に含 まれたウイルスを注入することによって行われる。 アデノウイルスに含まれるＥ１Ａ遺伝子を使用することができる１つのやり方 は、同じ処理方法の一部として、このような細胞にＬＴ遺伝子産物を導入するこ とによる。ＬＴ遺伝子産物は、ＬＴ突然変異体、特に、Ｋ１のような非トランス フォーミング突然変異体であってよい。このような導入では、一般にＬＴ遺伝子 を導入する。幾つかの好ましい方法では、Ｅ１Ａ遺伝子とＬＴ遺伝子の両者を含 むアデノウイルスを使用することによって、ＬＴ遺伝子を導入することができる 。この場合、アデノウイルスは、Ad.E1A(+)アデノウイルスのような複製能不全 アデノウイルスが好ましい。しかし、ＬＴ遺伝子の導入は、ウイルスベクター、 プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、あるいはリポソームなど、本明 細書に記述されているか、当業者に周知の任意の方法によることが可能である。 本発明は、neu抑制遺伝子産物を細胞に導入するための、特に有用な方法も提 供する。細胞にトランスフェクトされた遺伝子の発現に導くことができるインビ ボ遺伝子転移の１つの方法では、リポソームを使用する。インビトロ・トランス フェクションにもインビボ・トランスフェクションにも、リポソームを使用する ことができる。リポソーム仲介遺伝子転移は、動物における生体内適用の可能性 が大きいと思われる（Nicolau et al.，１９８７）。静脈内注入したリポソーム は、 マクロファージおよび細胞内皮系により、実質的に肝臓および脾臓で取り込まれ る。注入されたリポソームを取り込む特異的細胞部位は、主に脾臓マクロファー ジおよび肝臓クッパー細胞と考えられる。リポソーム／ＤＮＡ複合体を静脈内注 入すると、これらの細胞部位によってＤＮＡが取り込まれることになり、結果と してＤＮＡにコードされた遺伝子産物が発現する（Nicolau、１９８３）。 発明者は、リポソーム仲介性の遺伝子転移を使用してneu抑制遺伝子産物を細 胞に導入することができると考える。Nabelら（１９９０）が記述している通り 、このような構造物をリポソームと結合させ、カテーテルで直接導入することが できると考えられる。これらの方法を用いることにより、静脈内注入でアクセス できる肝細胞および脾細胞だけでなく、インビボで特定の部位にneu抑制遺伝子 産物を効率良く発現させることができる。したがって、本発明はＤＮＡ／リポソ ーム複合体として調合されたneu抑制遺伝子産物をコードするＤＮＡ構造物の組 成物およびこのような構造物を使用する方法も含む。 リポソームのトランスフェクションは、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ ）、ホシファチジルセリン（ＰＳ）、コレステロール（Chol）、N-［1-(2,3-ジ オレイルオキシ)プロピル］-N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および／また は３β[N-(N'N'-ジメチルアミノエタン)−カルバモイルコレステロール（ＤＣ-C hol）、ならびにその他の当業者に周知の脂質エタノールアミンを含むリポソー ムによって行うことができる。当業者は、本発明に有用な種々のリポソーム・ト ランスフェクション技法があることを理解することになる。Nicolau et al.，１ ９８７、Nabel et al.，１９９０、およびGao et al.，１９９１の論文に記載さ れている技法は、これらの技法の中に入っている。発明者は、ＤＣ−Cholを含む リポソームを使用して特に成功をおさめた。さらに詳細には、本発明は、好まし い実施態様の節に記述されている方法で、Gaoら（Gao et al.，１９９１）の指 示にしたが って調製されたＤＣ−CholおよびＤＯＰＥを使用して特に成功をおさめた。本発 明は、Vical，Inc.（カリフォルニア州サンディエゴ）からLipofectin^TMの商標 で市販されているリポソームなど、ＤＯＴＭＡが含まれるリポソームの有用性も 予期する。 様々な方法で、トランスフェクトされる細胞にリポソームを接触させることも 可能である。細胞培養では、細胞培養溶液にリポソームを簡単に分散させること ができる。インビボで応用する場合、リポソームは一般に注入される。静脈内注 入により、例えば、肝臓や脾臓へのリポソーム−ＤＮＡ複合体のリポソーム介入 転移が可能になる。静脈内注入ではアクセスできない細胞へのＤＮＡのトランス フェクションを可能にするために、動物体内の特定の位置にリポソーム−ＤＮＡ 複合体を直接注入することが可能である。例えば、Nabelらはカテーテルによる 動脈壁への注入を教示している。別の例で、発明者はマウスへの遺伝子転移を可 能にするため、腹腔内注入を使用した。 本発明ではリポソーム複合体を含む組成物も考慮する。このリポソーム複合体 は脂質成分およびneu抑制遺伝子をコードするＤＮＡセグメントも含むことにな る。リポソーム複合体に使用されるneu抑制遺伝子は、例えば、ＬＴ遺伝子また はＥ１Ａ遺伝子であることが可能である。ＬＴ突然変異体を含むリポソーム複合 体には、ある一定の長所があると考えられる。これらの長所は、ＬＴ遺伝子がＫ １のような非トランスフォーミングＬＴ突然変異体をコードするとき、特に明確 である。Ｅ１Ａ １２Ｓ遺伝子産物またはＥ１Ａ １３Ｓ遺伝子産物、あるいは その両方をコードしているＥ１Ａ遺伝子は、脂質と複合してリポソーム複合体を 形成することが可能である。 リポソーム複合体の作製に使用される脂質は、上記脂質のいずれであってもよ い。特に、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、および／またはＤＣ−Cholは、リポソーム複 合体の全部もしくは一部を形成することが可能である。発明者は、ＤＣ−Cholを 含む複合体で特に成功をおさめた。好ましい実施態様では、脂質はＤＣ−Cholお よびＤＯＰＥを含むことになる。どのような比率のＤＣ−CholとＤＯＰＥにも有 用性があると考えられるが、１：２０〜２０：１の比率でＤＣ−CholとＤＯＰＥ を含むものが特に有利であろうと考えられる。発明者が実施した試験では、約１ ：１０〜約１：５の比率のＤＣ−CholとＤＯＰＥから調製されたリポソームが有 用であった。ほとんどの試験で、発明者はＤＣ−Chol 1.2μmol：ＤＯＰＥ 8.0 μmolの比率を使用した。 本発明は、neu抑制ＤＮＡ／リポソーム複合体を含む細胞に、neu抑制遺伝子産 物を導入するためのキットも含む。 発明者の試験で、１２Ｓ Ｅ１Ａ遺伝子産物、１３Ｓ Ｅ１Ａ遺伝子産物およ びＬＴ遺伝子産物は三者ともneu遺伝子発現を抑制できることを示したため、本 発明を実施する際に、任意の遺伝子産物、あるいは二者以上を一緒に使用するこ とが可能であると考えられる。もちろん、１２Ｓ産物および１３Ｓ産物は、実質 的に同一遺伝子配列に由来し、単に分別スプライシングの結果にすぎないため、 Ｅ１Ａ遺伝子そのものを使用する場合、単純に、野生型Ｅ１Ａ遺伝子を直接する ことが最も便利であろう。しかし、それぞれ、野生型Ｅ１Ａ遺伝子またはＬＴ遺 伝子全体を使用せずに、Ｅ１Ａ遺伝子またはＬＴ遺伝子のある一定の領域のみが 使用される可能性がある。neu遺伝子を抑制するために必要な最小領域を使用す ることが最終的に好ましく、したがってＥ１Ａ構造物またはＬＴ構造物のいずれ かを受ける細胞に、不要なＤＮＡを導入しないことが薦められる。このことは、 かなり大きい、アミノ酸７０８個の、ＬＴ蛋白に関して特に当てはまる。制限酵 素の使用など、当業者に周知の技法で、小領域のＥ１ＡおよびＬＴを創ることが 可能である。これらの領域がneuを阻害する能力は、実施例で報告するアッセイ によって容易に決定することができる。 一般に、トランスフォーミング能、腫瘍発生能あるいは転移能の低減を評価す る方法は、技術上周知である。たとえば、最も簡単なアッセイは、ＤＮＡ合成が 細胞増殖能の優れた尺度であるので、処理細胞と非処理細胞のＤＮＡ合成レベル を測定することである。さらに、非トランスフォーム細胞と比較して、トランス フォーム細胞のもつソフトアガーで増殖する能力が、トランスフォーメーション の尺度として広く使用されてきた。このように、neu癌遺伝子の仲介によるトラ ンスフォーメーションの抑制に使用されるＥ１Ａ産物またはＬＴ産物の能力を評 価するために、これらの２種類のアッセイ方法のいずれかが便利に使用される。 neu癌遺伝子仲介性の腫瘍発生能または転移能の抑制を評価したい場合、一般 に是認された多数のアッセイを利用することもできる。腫瘍発生能の最も便利な 指標であり、実際に最も信頼できる指標は、処理細胞がマウスに腫瘍を引き起こ す能力を評価する、ヌードマウスを用いたインビボ・アッセイである。例えば、 実験マウスの肺に、処理細胞が転移性小結節を形成する能力を決定することによ って転移能を評価したい場合、同様にヌードマウスが使用される。 発明者は、Ｅ１Ａ遺伝子産物およびＬＴが、neu癌遺伝子遺伝子発現の直接的 な抑制の作用を行うことを確認しており、本発明はさらに、neu癌遺伝子遺伝子 発現または過剰発現を抑制する方法に関する。これらの実施態様では、細胞レベ ルのneuｐ１８５膜貫通蛋白の抑制に有効なやり方で、Ｅ１Ａ遺伝子産物または ＬＴを罹患細胞に導入することが方法に含まれる。ｐ１８５発現の抑制は、最も 便利には、ｐ１８５レベルの低減を決定するための電気泳動ゲル分析を含め、多 数の利用可能な方法によって容易に評価することが可能である。Ｅ１Ａ遺伝子、 その産物、あるいはＬＴを導入する同じ手段は、上記トランスフォーメーション 実施態様と関連して検討したように、これらのさらなる実施態様において適用で きる。neu仲介癌発生の抑制 本発明のある実施態様は、癌遺伝子表現型の抑制に有効な方法で、トランスフ ォーメーション抑制量のＬＴ遺伝子産物を細胞内に導入することを含む、細胞の neu癌遺伝子仲介トランスフォーメーションを抑制する方法に関する。癌遺伝子 表現型の抑制は、上述のアッセイで測定できる、細胞のトランスフォーミング能 や、腫瘍発生能、転移能の低減によって表される。 本発明の若干の実施態様では、非トランスフォーミングであるＬＴ突然変異体 によって細胞の新たな癌遺伝子仲介トランスフォーメーションが抑制されること になる。このような非トランスフォーメーミング突然変異体はＫ１およびＫ７で ある。 ＬＴ遺伝子産物を細胞に導入する方法は、ＬＴ遺伝子産物をコードするＤＮＡ セグメントの導入を含む。多くの場合、ＬＴ遺伝子を含むＤＮＡセグメントは、 ＬＴ遺伝子由来の制御された関連配列も含むことになる。ＬＴ遺伝子産物をコー ドするＤＮＡセグメントの導入は、当業者に周知の様々な手段のいずれかで達成 することができる。しかし、発明者は、特にすぐれた結果は、ベクターによるＤ ＮＡの導入か、あるいは精確に記述されたリポソーム仲介遺伝子転移法によるＤ ＮＡの導入によって得られると予期する。もちろん、当業者は、レトロウイルス ・ベクター、アデノウイルス・ベクター、アデノウイルス伴生ウイルス・ベクタ ーなど、他の遺伝子転移方法も本発明に関して有用なことを理解するであろう。 プラスミド・ベクター、およびアデノウイルス・ベクター、レトロウイルス・ ベクター、ポリオーマ・ベクター、サイトメガロウイルス・ベクター、ＳＶ４０ ベクターなどのウイルス・ベクターは全て、本発明の方法に関して有用性を有す ると予期される。しかし、ある好ましい実施態様はＬＴ遺伝子産物をコードする ＤＮＡセグメントを含むプラスミド・ベクターの使用を含むことになる。典型的 なプラスミド・ベクターはpZ189、PVU-0、pK1、pK7、pSV21421、pSVdl423、psVd l425、pSVdl428、およびpSVdl451を含む。pSVdlシリーズのベクターは、Sulleng er et al.，１９９０の論文に記述されている。本発明に関して使用される典型 的なレトロウイルス・ベクターは、pBabe-neoである（Morgenstern et al.，１ ９９ ０）。 本発明のある好ましい実施態様で、ＬＴ遺伝子産物を多細胞生物の細胞に導入 する。一般に、本発明の商業上の実施態様はＬＴ遺伝子産物を哺乳動物に導入す ることを含むが、これは、家畜と医療の両方の分野において商業上最も重要であ る動物が哺乳動物に含まれるからである。明らかに、本発明の最も重要な実施態 様の幾つかはヒトのneu仲介癌の抑制に向けられる。 本発明の方法で、様々なneu仲介癌遺伝子表現型の抑制が可能になる。このよ うな表現型の例は、（１）ソフトアガーで増殖する能力、（２）病巣を形成する 能力、および（３）形態のトランスフォーメーションである。本発明の好ましい 諸実施態様では、癌遺伝子表現型は癌である。本発明が最も有用であると予測さ れる癌は、ヒト乳房、卵巣、肺、消化器系、口腔粘膜、および前立腺の癌など、 neu過剰発現を示すものである。本発明の方法は、細胞の腫瘍発生能、細胞の転 移能の、またはその両者の組合せのいずれかの抑制に向けられる場合もある。 本発明のある実施態様は、ＬＴ抗原遺伝子産物とＥ１Ａ遺伝子産物の両者を同 一細胞に導入することを含む。Ｅ１Ａ遺伝子産物にもＬＴ遺伝子産物にもneu仲 介癌を抑制する能力がある。しかし、発明者は、これらの２種類の蛋白質が異な るやり方でneu仲介癌を抑制するという、驚くべき予想外の結果を報告した。Ｅ １Ａ遺伝子産物にもＬＴ遺伝子産物にも独自のトランスフォーミング特性がある ことが判明しているため、Ｅ１ＡまたはＬＴがneu仲介癌を抑制することは、本 来、意外である。しかし、Ｅ１ＡとＬＴが異なる機構を用いてneu仲介癌の抑制 を可能にすることは、技術にかんがみて、全く予想されなかった。ＬＴとＥ１Ａ が異なるneu抑制機構を用いるため、両遺伝子産物を併用して、neu仲介抑制に対 して二重に保護することが可能であろう。 Ｅ１Ａ遺伝子産物とＬＴ遺伝子産物の両者を同一細胞集団に導入する必要があ る実施態様で、各々の遺伝子産物を導入する一般的な方法は、各遺伝子産物をコ ードするＤＮＡセグメントを導入するものであろう。これらのセグメントは、同 時にトランスフェクトすることも、別々の時にトランスフェクトすることも可能 である。トランスフェクションは、上述のベクターのいずれかによって、リポソ ーム介入遺伝子転移によって、あるいは当業者に周知の他の遺伝子転移方法のど れかによって行うことが可能である。上述のＬＴ抗原遺伝子産物のいずれも、本 発明の実施態様において有用性を示すであろう。例えば、ＬＴ、Ｋ１、およびＫ ７は全て、Ｅ１Ａ遺伝子産物と一緒に導入すると、有用性があると予想される。 本発明に有用な典型的なＥ１Ａ遺伝子産物は、Ｅ１Ａ １２ＳおよびＥ１Ａ １ ３Ｓを含む。もちろん、特定の細胞の必要性に応じて、Ｅ１Ａ遺伝子産物および ＬＴ遺伝子産物を細胞に直接導入することも、一方の遺伝子産物を直接導入し、 他方をＤＮＡトランスフェクションによって導入することも可能である。 本発明の若干の実施態様では、Ｅ１Ａ遺伝子産物とＬＴ遺伝子産物の両者をコ ードするＤＮＡセグメントを同一ＤＮＡセグメントに連結することができる。さ らに、これらの遺伝子産物の各々を同一セットの調節配列の制御下に置くことも 可能である。この方法により、Ｅ１Ａ遺伝子産物とＬＴ遺伝子産物の同時トラン スフェクションおよび発現を達成することも可能である。 Ｅ１ＡおよびＬＴで同時トランスフェクションを行うと、２種類のneu抑制作 用が得られるため、併用すれば癌予防に特に有用であろうと予期される。これら の実施態様の方法は、細胞のトランスフォーミング能、腫瘍発生能および／また は転移能の低減にも使用することが可能である。 長年にわたる特許分野の決まりにしたがって、“ａ”および“ａｎ”という用 語は、請求の範囲を含め、本願で使用されたときには、「１つまたはそれ以上」 を意味する。定義ならびに遺伝子産物および遺伝子に影響を及ぼす方法 Ｅ１Ａ遺伝子産物および遺伝子 本発明で、「Ｅ１Ａ遺伝子産物」および「Ｅ１Ａ」という用語は、自然のＥ１ Ａアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有し、さらに、Ｒｂに結合するこ とができるか、neu癌遺伝子仲介トランスフォーメーションを抑制することがで きるか、細胞を不滅化することができるか、あるいはＥ１Ａに対して生じた抗Ｅ １Ａ抗体と交差反応することができる点で、生物学的に活性である蛋白質のこと を言う。このような配列は、例えば、Berkら（Berk et al.，１９７８）により 開示されている。「Ｅ１Ａ遺伝子産物」という用語は、少なくとも若干の、自然 のＥ１Ａと共通した生物学的活性を示すＥ１Ａ分子の類似体も含む。さらに、突 然変異誘発の技術における当業者は、その他の、未だ開示されたり発見されたり していない類似体もＥ１Ａ類似体の構築に使用できることを高く評価するであろ う。このような類似体は、Kalderonら（Kalderon et al.，１９８４）がＬＴ突 然変異体の発生について説明したやり方で発生させることも可能である。「Ｅ１ Ａ遺伝子産物」または「Ｅ１Ａ」が、自然のＥ１Ａ遺伝子のアミノ酸配列の全部 、あるいは実質的に全部を含む必要はない。短い配列または長い配列が本発明に 有用と予想される。 「Ｅ１Ａ遺伝子」という用語は、上述のＥ１Ａ遺伝子産物をコードするＤＮＡ 配列と実質的に同じであるＤＮＡ配列のことをいう。本用語は、ＲＮＡ、あるい はこのようなＤＮＡ配列と適合するアンチセンス配列のことも言う。「Ｅ１Ａ遺 伝子」は、関連した制御配列の任意の組合せも含むことがある。 「実質的に同じ」という用語は、Ｅ１Ａアミノ酸配列またはＥ１Ａ遺伝子核酸 配列のいずれかを定義するために使用されるとき、特定の対象配列、例えば、変 異体配列が、１つ以上の置換、欠失、または付加により、天然の配列から変化し 、その最終的な効果が、少なくとも若干の、Ｅ１Ａ蛋白質の生物学的活性を保持 することを意味する。その代わり、（ａ）ＤＮＡ類似体配列が天然のＥ１Ａ遺伝 子のコーディング領域に由来するか、（ｂ）中等度の緊縮条件下でＤＮＡ類似体 配 列が（ａ）のＤＮＡ配列のハイブリッド形成することができ、生物学的に活性な Ｅ１Ａをコードするか、あるいは（ｃ）遺伝子コード化の結果として、（ａ）ま たは（ｂ）で定義されたＤＮＡ類似体配列に変性しやすいＤＮＡ配列の場合、Ｄ ＮＡ類似体配列は本明細書に開示される特異的ＤＮＡ配列と「実質的に同じ」で ある。実質的に同じ類似体蛋白質は、対応する天然の蛋白質の配列に約８０％以 上類似することになる。類似性はそれより低いものの、生物学的活性が匹敵する 配列は等価であると考えられる。核酸配列の決定において、実質的に類似したア ミノ酸配列をコードすることが可能な対象核酸配列は全て、コドン配列の違いに 関係なく、ある基準となる核酸配列と実質的に同じであると考えられる。ＬＴ遺伝子産物および遺伝子 本明細書で、「ＬＴ遺伝子産物」および「ＬＴ」という用語は、自然のＬＴア ミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有し、さらに、Ｒｂに結合することが できるか、neu癌遺伝子仲介トランスフォーメーションを抑制することができる か、細胞を不滅化することができるか、固着部非依存性(anchorage independenc e)を誘導できるか、あるいはＬＴに対して生じた抗ＬＴ抗体と交差反応すること ができる点で生物学的に活性である蛋白質のことを言う。このような配列は、例 えば、ToozeのMolecular Biology of Tumor Virusesと題する本や、Fiers et al .，１９７８、Reddy et al.，１９７８の論文に開示されている。「ＬＴ遺伝子 産物」という用語は、少なくとも若干の、自然のＬＴと共通した生物学的活性を 示すＬＴ分子の類似体も含む。このようなＬＴ類似体の例はＫ１およびＫ７であ り、細胞のトランスフォーメーションが不完全である（Kalderon et al.，１９ ８４）。その他の多くの典型的なＬＴ類似体例が、Kalderonら（Kalderon et al .，１９８４）に、特に表２に、開示されている。さらに、突然変異誘発の技術 における当業者は、その他の、未だ開示されたり発見されたりしていない類似体 もＬＴ類似体の構築に使用できることを高く評価するであろう。「ＬＴ遺伝子産 物」または「Ｌ Ｔ」が、天然のＥ１Ａ遺伝子のアミノ酸配列の全部、あるいは実質的に全部を含 む必要はない。短い配列または長い配列が本発明に有用と予想される。 「ＬＴ遺伝子」という用語は、上述のＬＴ遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列 と実質的に同じであるＤＮＡ配列のことをいう。本用語は、ＲＮＡ、あるいはこ のようなＤＮＡ配列と適合するアンチセンス配列のことも言う。「ＬＴ遺伝子」 は、関連した制御配列の任意の組合せも含むことがある。 「実質的に同じ」という用語は、ＬＴアミノ酸配列またはＬＴ核酸配列のいず れかを定義するために使用されるとき、特定の対象配列、例えば、変異体配列が 、１つ以上の置換、欠失、または付加により、天然の配列から変化し、その最終 的な効果が、少なくとも若干の、ＬＴ蛋白質の生物学的活性を保持することを意 味する。その代わり、（ａ）ＤＮＡ類似体配列が天然のＬＴ遺伝子のコーディン グ領域に由来するか、（ｂ）中等度の緊縮条件下でＤＮＡ類似体配列が（ａ）の ＤＮＡ配列のハイブリッド形成をすることができ、生物学的に活性なＬＴをコー ドするか、あるいは（ｃ）遺伝子コード化の結果として、（ａ）または（ｂ）で 定義されたＤＮＡ類似体配列に変性しやすいＤＮＡ配列の場合、ＤＮＡ類似体配 列は本明細書に開示される特異的ＤＮＡ配列と「実質的に同じ」である。実質的 に同じ類似体蛋白質は、対応する天然の蛋白質の配列に約８０％以上類似するこ とになる。類似性はそれより低いものの、生物学的活性が匹敵する配列は、等価 であると考えられる。核酸配列の決定において、実質的に類似したアミノ酸配列 をコードすることが可能な対象核酸配列は全て、コドン配列の違いに関係なく、 参考核酸配列と実質的に同じであると考えられる。類似度のパーセント 例えば、ウィスコンシン大学遺伝学者コンピュータ・グループから入手できる ＧＡＰコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することにより、類 似度のパーセント値を決定することが可能である。ＧＡＰプログラムは、Smith ら （Smith et al.，１９８１）が修正した、Needlemanら（Needleman et al.，１ ９７０）のアラインメント法を使用する。簡単に記述すると、ＧＡＰプログラム は、類似度を、２つの配列のうち、短い方の配列中の符号の総数で割った、一直 線に並べられた類似した符号（すなわち、ヌクレオチドおよびアミノ酸）の数と して定義する。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォールト・パラメータは、（１ ）Schwartz et al.，１９７９に記載されている通り、各ヌクレオチドのユニタ リ比較マトリックス（同一の場合は１、非同一の場合は０という１つの値を含む ）およびGribskov et al.，１９８６の重みつき比較マトリックス、（２）各ギ ャップに対する3.0のペナルティと、各符号および各ギャップに対する更に0.01 のペナルティ、（３）末端ギャップに対するペナルティ無し、を含む。核酸配列 ある実施態様で、本発明はneu癌遺伝子抑制遺伝子、ならびに本質的に既知の ＬＴ抗原遺伝子またはＥ１Ａ遺伝子、あるいは対応する蛋白質の配列である配列 をそれぞれの配列内に含む、ＬＴ抗原遺伝子産物またはＥ１Ａ遺伝子産物あるい はその両者などの遺伝子産物の使用に関する。「本質的にＬＴ抗原またはＥ１Ａ の配列としての配列」という用語は、本質的にＬＴ抗原またはＥ１Ａ遺伝子の蛋 白質に対応し、ＬＴまたはＥ１Ａの塩基もしくはアミノ酸（あるいは、蛋白質に 関しては、その生物学的機能的等価物）とは同じでない比較的少ない塩基もしく はアミノ酸（ＤＮＡであれ蛋白質であれ）を有することを意味する。「生物学的 機能的等価」という用語は、技術上十分に理解され、本明細書でさらに詳細に定 義される。したがって、ＬＴ抗原またはＥ１Ａのアミノ酸と同じであるか機能的 に等価であるアミノ酸を約７０〜８０％、あるいはさらに好ましくは、約８１〜 ９０％、さらに好ましくは約９１〜９９％有する配列は、「本質的に同じ」配列 になる。 機能的に等価のコドンを有するＬＴ抗原およびＥ１Ａ遺伝子も、本発明に包含 される。「機能的に等価のコドン」という用語は、本明細書では、アルギニンや セリンの６個のコドンのように、同じアミノ酸をコードするコドンのことを言う ために使用され、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンのことも言う（ 表１）。 アミノ酸配列および核酸配列は、付加的Ｎ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸 あるいは５’配列または３’配列など、付加的残基を含んでもよいと考えられ、 蛋白質発現に関する場合、生物学的蛋白質活性の維持を始めとする上記基準を配 列が満たす限りは、本質的に本明細書に開示される配列の１つに記述される通り である。末端配列の付加は、例えば、５’蛋白質または３’蛋白質のいずれかに 隣接するコーディング領域の種々の非コーディング配列を含むこともあり、種々 の内部配列、すなわち、遺伝子内に存在することが判明しているイントロンを含 むこともある、核酸配列に特に適用される。 本発明は、本明細書に記載される配列に相補的な、あるいは本質的に相補的な 、ＤＮＡセグメントの使用も含む。「相補的」である核酸配列は、標準的ワトソ ン・クリック（Watson-Crick）相補性法則にしたがって塩基対合が可能な配列で ある。本明細書で使用する、「相補的配列」という用語は、上述の同一ヌクレオ チド比較で評価することが可能であるか、本明細書に記述されたような比較的緊 縮条件下で問題の核酸セグメントにハイブリッド形成が可能であると定義される 、実質的に相補的である核酸配列を意味する。生物学的機能的等価物 上述の通り、Ｅ１ＡまたはＬＴの構造に修飾および変化を施すことが可能であ り、類似した望ましい特性、あるいはそれ以外は望ましい特性を有する分子が得 られる。例えば、neu癌遺伝子のような構造により相互に影響を及ぼす結合能を かなり損失することなく、あるアミノ酸を蛋白質構造中の他のアミノ酸と置換す ることも可能である。その蛋白質の生物学的機能活性を明確に限定するものは、 その蛋白質の相互に作用する能力および性質であるため、蛋白質配列（あるいは 、もちろん、その基本となるＤＮＡコーディング配列）に、ある一定のアミノ酸 配列置換を施すことができ、類似した特性あるいは相殺する特性（例えば、拮抗 的と作動的）さえ有する蛋白質が得られる。したがって、発明者は、Ｅ１Ａ蛋白 質 またはＥ１ＡペプチドあるいはＬＴ蛋白質またはＬＴペプチド（あるいは基礎と なるＤＮＡ）に、それらの生物学的有用性または活性を相当に損失することなく 、様々な変化を施すことが可能と考える。 明確に限定された分子の部分の範囲内で施すことが可能な変化の数に制限があ り、なおかつ結果として容認できる等価の生物学的活性レベルを持つ分子となる ということが、生物学的機能的等価の蛋白質またはペプチドの定義における本来 の概念であることも、当業者には十分に理解できる。それゆえ、生物学的機能的 等価のペプチドは、ほとんどまたは全てではないが、若干のアミノ酸を置換する ことが可能なペプチドであると本明細書では定義される。もちろん、本発明に従 って、異なる置換を含む多数の性質の異なる蛋白質／ペプチドが容易に作られ、 使用される可能性がある。 例えば、活性部位の残基など、ある一定の残基が蛋白質またはペプチドの生物 学的特性あるいは構造上の特性に特に重要であることが証明されている場合、こ のような残基は一般に交換してはならないことも十分に理解される。neu仲介ト ランスフォーメーションができないペプチドにするＥ１ＡまたはＬＴのいずれか のneu結合部位における何らかの変化が、本発明にとって、結果として生じるペ プチドの有用性を失うことなるような場合、このことは本発明にも当てはまる。 Ｅ１ＡまたはＬＴのいずれかの修飾に使用されるようなアミノ酸置換は、一般 にアミノ酸側鎖置換基の相対類似性、たとえば、それらの疎水性、親水性、電荷 、サイズなどに基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状およびタイプの分析 から、アルギニン、リジンおよびヒスチジンは全て陽電荷残基であり、アラニン 、グリシンおよびセリンは全て類似したサイズであり、フェニルアラニン、トリ プトファン、およびチロシンは全て一般に類似した形であることが明らかである 。したがって、これらの考察に基づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン ；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファ ン、 およびチロシンは、生物学的機能的等価物であると本明細書で定義される。 このようは変化を施す際に、アミノ酸のハイドロパシー指数(hydropathy inde x)を考えることがある。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷特性を基礎に して、ハイドロパシー指数が割り付けられている。これらは、イソロイシン（＋ 4.5）、バリン（＋4.2）、ロイシン（＋3.8）、フェニルアラニン（＋2.8）、シ ステイン／シスチン（＋2.5）、メチオニン（＋1.9）、アラニン（＋1.8）、グ リシン（−0.4）、トレオニン（−0.7）、セリン（−0.8）、トリプトファン（ −0.9）、チロシン（−1.3）、プロリン（−1.6）、ヒスチジン（−3.2）、グル タミン（−3.5）、アスパレート（−3.5）、アスパラギン（−3.5）、リジン（ −3.9）、アルギニン（−4.5）である。 相互に影響を及ぼす生物学的機能を蛋白質に与える上でのハイドロパシー・ア ミノ酸指数の重要性は、当該分野において、一般的に理解されている（Kyte & D oolittle、１９８２、引用することにより本明細書に組み込まれる）。若干のア ミノ酸を、類似したハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置 換することが可能であり、それでも類似した生物学的活性を保持することが判明 している。ハイドロパシー指数に基づいて変化を施す場合、ハイドロパシー指数 が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものは特に好まし く、±0.5以内のものはさらに特に好ましい。 アミノ酸のような置換は親水性を基礎にして効果的に行えることも、技術上理 解できる。引用することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第４,５５４, １０１号には、蛋白質の最大局所平均親水性は、その隣接したアミノ酸の親水性 によって支配されるため、その免疫原性および抗原性、すなわち、蛋白質の生物 学的特性と相関関係があると述べられている。アミノ酸は、類似した親水性値を 持つ別のものと置換することができ、それでも生物学的に等価の蛋白質が得られ ることが理解される。 米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されている通り、下記の親水性値がア ミノ酸残基に割付られている。アルギニン（＋3.0）、リジン（＋3.0）、アスパ レート（＋3.0±１）、グルタメート（＋3.0±１）、セリン（＋0.3）、アスパ ラギン(＋0.2）、グルタミン（＋0.2）＋、グリシン（０）、トレオニン（−0.4 ）、プロリン（−0.5±１）、アラニン（−0.5）、ヒスチジン（−0.5）、シス テイン（−1.0）、メチオニン（−1.3）、バリン（−1.5）、ロイシン（−1.8） 、イソロイン（−1.8）、チロシン（−2.3）、フェニルアラニン（−2.5）、ト リプトファン（−3.4）。 類似した親水性値に基づいて変化を施す場合、親水性値が±２以内のアミノ酸 の置換が好ましく、±１以内のものは特に好ましく、±0.5以内のものはさらに 特に好ましい。 アミノ酸変化により生じる機能的に等価のポリペプチドに焦点を合わせて検討 してきたが、遺伝子コードが変性することと、２つ以上のコドンが同一アミノ酸 をコードすることがあることを考慮に入れれば、これらの変化はコード化ＤＮＡ の変化によって影響を受ける可能性があることが理解されるであろう。配列修飾方法 部位指向突然変異誘発などの技法を使用して、Ｅ１ＡペプチドおよびＬＴペプ チドを修飾することが可能である。部位特異的突然変異誘発は、個々のペプチド の調製、生物学的に機能上等価の蛋白質またはペプチドの調製、基本となるＤＮ Ａの特異的突然変異誘発による調製に有用な方法である。この方法によれば、さ らに、例えば、前述の配慮事項を１つ以上考えて、１つ以上のヌクレオチド配列 の変化をＤＮＡに導入することにより、試験配列変異型を調製する能力を容易に 得ることができる。部位特異的突然変異誘発によって、望ましい突然変異のＤＮ Ａ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌク レオチドを使用する突然変異体の産生が可能になり、検討すべき欠失接合点の両 側に安定したデュプレックスを形成するのに十分なサイズのプライマー配列と配 列の複雑度を提供する。一般に、変化すべき配列の接合点の両側に残基が５〜１ ０個ある、長さがヌクレオチド約１７〜２５のプライマーが好ましい。 一般に、部位特異的突然変異誘発の技法は、出版物（Adelman et al.，１９８ ３）によって例証されている通り、技術上周知である。予想通り、本技法は一般 に１本鎖型でも２本鎖型でも存在するファージ・ベクターを使用する。部位指向 突然変異誘発に有用な典型的なベクターとしては、Ｍ１３ファージ（Messing et al.，１９８１）などのベクターがある。これらのファージは市販されており、 その使用は一般に当業者に周知である。２本鎖プラスミドも、関心遺伝子をプラ スミドからファージへ転移させるステップを排除する部位指向突然変異誘発に、 日常的に使用される。 一般に、本明細書に従った部位指向突然変異は、１本鎖ベクターを最初に得る か、Ｅ１Ａ遺伝子またはＬＴ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を配列内に含む２本 鎖ベクターを別個に溶解することにより、実施される。突然変異した望ましい配 列を担持するオリゴヌクレオチド・プライマーを、一般に合成的に、例えば、Cr ea et al.，１９７８の方法によって、調製する。１本鎖ベクターを用いて、こ のプライマーをアニーリングし、突然変異担持鎖の合成を完成するために、E．c oliポリメラーゼＩ KlenowフラグメントなどのＤＮＡ重合酵素にさらした。この ようにして、１本鎖が最初の非突然変異配列をコードし、２本目の鎖が望ましい 突然変異を担持することを特徴とするヘテロデュプレックスが形成される。この ヘテロデュプレックス・ベクターを使用して、E．coli細胞など、適切な細胞を トランスフォームし、突然変異した配列の組合せを担持する組換えベクターを含 むクローンを選択する。 Kalderonら（Kalderon et al.，１９８４）は、自然のＬＴ遺伝子の突然変異 に有用であった幾つかの突然変異誘発方法を報告している。詳細には、Kalderon ら は置換ループ突然変異誘発、およびＬＴ遺伝子へのEcoRIリンカーのランダム挿 入による欠失突然変異を教示している。さらに、欠失ループ突然変異誘発による 点突然変異を教示している。参考文献は、このような突然変異の成功を決定する スクリーニング手順も教示している。Kalderonら（Kalderon et al.，１９８４ ）の教示は、引用することにより本出願に組み入れられる。 部位指向突然変異誘発を使用して選択された遺伝子の配列変異型の調製は、潜 在的に有用なＥ１Ａ、ＬＴ、あるいは他のneu抑制種を産生する手段として提供 され、これらのペプチドの配列変異型が得られる他の方法があるとして制限を受 けることを意味するものではない。例えば、ヒドロキシラミンを使用するプラス ミドＤＮＡの突然変異誘発の場合、配列変異体を得るために、望ましい遺伝子を コードしている組換えベクターを突然変異誘発剤で処理することも可能である（ 例えば、Eichenlaub（Eichenlaub，１９７９）が記述した方法を参照されたい） 。その他の構造上の等価物 本明細書に記載されるＥ１Ａペプチジル化合物およびＬＴペプチジル化合物に 加えて、発明者は、ペプチド構造の重要部分を模倣するために、他の立体配置的 に類似した化合物を作ることも可能であると考える。このような化合物は、本発 明のペプチドと同じように使用することが可能であり、したがって、やはり機能 的等価物である。構造的機能的等価物の作製は、当業者に周知の模型製作技法お よび化学デザインによって達成される。このような立体配置的に類似した構造物 は本発明の範囲内に分類されることは理解されるであろう。 図面の簡単な説明 第１図Ａおよび第１図Ｂは、neuプロモータに影響を及ぼすＥ１Ａ遺伝子産物 を表す図である。 第１図Ａ．Ｅ１Ａ遺伝子産物によるneuプロモータの転写抑制。Rat-1細胞は、 2.2kb上流のＤＮＡ配列を含むneu癌遺伝子プロモータで操縦されるＣＡＴ遺伝子 を含む、pneuEcoR1-CAT構造物５μgでトランスフェクトした。レーン１、neu癌 遺伝子プロモータ基礎活性（その相対的ＣＡＴ活性を100％と定義する）；レー ン２〜４、キャリアＤＮＡ pSP64ベクター１０μgで共トランスフェクションし た後のＣＡＴ活性（レーン２、102％）；Ｅ１Ａ発現プラスミドpE1A（レーン３ 、34％）；pE1Apr、Ｅ１Ａプロモータのみを含むプラスミド（レーン４、98％） 。RSV LTRの調節下でＣＡＴ遺伝子を含むレポータ・プラスミドRSV-CATのＣＡＴ 活性は（レーン５、10％）、pE1A１０μg（レーン６、98％）または、pE1A２０ μg（レーン７、96％）の共トランスフェクションによって有意に変化しなかっ た。 第１図Ｂ．種々のアデノウイルス早期遺伝子がneuプロモータ活性に及ぼす影 響。表示通りに、pneuEcoR1-CATを、pSP64ベクター、または種々のアデノウイル ス早期遺伝子、Ｅ１Ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２Ａ、およびＥ３で共トランスフェクトした 。相対ＣＡＴ活性は次の通りである：ＳＰ６４、１００％；Ｅ１Ａ、３５％；Ｅ １Ｂ、９７％；Ｅ２Ａ、９９％；Ｅ３、１０２％。ＲＳＶ−ＣＡＴを陽性コント ロールとして使用した。 第２図Ａ、第２図Ｂ、第２図Ｃ、第２図Ｄおよび第２図Ｅは、漸増量のpE1A（ 第２図Ａ）、pE1A-13S（第２図Ｂ）、pE1A-12S（第２図Ｃ）およびpE1Ad1346（ 第２図Ｄ）を共トランスフェクションしたneuプロモータによる過渡的な発現を 表す図である。一定量（５μg）のpneuEcoR1-CAT構造物と、５、１０、１５およ び２０μgの試験構造物を、Rat-1細胞に共トランスフェクトした。適量のキャリ ヤＤＮＡ pSP64を加えることにより、トランスフェクトされるＤＮＡの総量を一 定に保った。Ｅ１Ａを含まない相対ＣＡＴ活性（第２図Ａ、第２図Ｂ、第２図Ｃ 、および第２図Ｄのレーン０）を１００％と定義する。５、１０、１５および２ ０μgの試験構造物による相対ＣＡＴ活性は次の通りである。Ｅ１Ａ、６８％、 ３５％、２６％、１７％；E1A-13S、７２％、４８％、３６％、２４％；E1A−12 S、６６％、４６％、２８％、２１％；E1Ad1346、１０２％、１０３％、９９％ 、１０ ２％（第２図Ｅ）。異なるＥ１Ａ突然変異体が、neuプロモターによる過渡的な 発現に及ぼす作用の概要。異なるＥ１Ａ突然変異体がコードする蛋白質の概略構 造を棒グラフで表す。平行線をつけた領域は、Ｅ１Ａ産物の保存蛋白質領域を表 す。棒グラフは、一定の縮尺で描かれていない。 第３図Ａおよび第３図Ｂは、neuプロモータの上流領域におけるＥ１Ａ応答性 ＤＮＡ要素の位置推定を表す図である。 第３図Ａ：構造物の作製に使用した制限酵素の名称で表示した通り、プラスミ ドを創るために、個々にＣＡＴ遺伝子と融合させたneuプロモータ５’欠失構造 物の概略マップ。 第３図Ｂ：共トランスフェクトされたpE1A(E)またはキャリアＤＮＡ pSP64（C ）１０μgと一緒に、プラスミド５μgをRat-1細胞にトランスフェクトした後の 、プロモータ・フラグメント構造物の各々によってＣＡＴ遺伝子の発現レベル。 各トリプレット・アッセイの上の制限酵素の名称は、マップに表示した構造物の ことである。 第４図Ａおよび第４図Ｂは、競合量のStu/-Xhol neuプロモータ・フラグメン トの共トランスフェクションによるneuの抑制解除を表す図である。 第４図Ａ：neuプロモータ基礎活性を示すpneuEcoR1-CATプラスミド５μgで、R at-1細胞をトランスフェクトした（レーン１）；ｐE1A５μgで共トランスフェク トした後の、抑制されたＣＡＴ活性をレーン２に示す。pSp64でクローニングさ れたStu-Xho/neuプロモータ・フラグメントを含むプラスミドpSP64/Stu-Xhoを、 pneuEcoR1-CATおよびpE1Aで共トランスフェクトした。レーン３〜６は、漸増量 （それぞれ、５、１０、１５および２０μg）のpSP64/Stu-Xhoの競合作用を示す 。プラスミドEcoR1-Xbal neuプロモータ・フラグメントを含むpSP64/R1-Xbaも、 pneuEcoR1-CATおよびpE1Aで共トランスフェクトした。レーン７〜９は、それぞ れ、５、１０、および２０μgのpSP64/R1-Xba共トランスフェクションによるneu プロモー タのＣＡＴ活性を表す。レーン１〜９の相対ＣＡＴ活性は次の通りである：１０ ０％、３２％、２７％、３１％、５８％、７９％、３８％、３１％、２４％。 第４図Ｂ：pneuEcoRV-CATでトランスフェクトしたＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞の 細胞溶解物中のｐ１８５蛋白質のイムノブロット。各サンプルの蛋白質７５μg を、ニトロセルロースに移す前に、７％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルを用いた電気泳動 にかけた。一次抗体ｍＡｂ−３でフィルターをブロットした。レーン１、pE1A５ μgでトランスフエクトしたSK-BR-3細胞の溶解物。レーン２、Ｅ１Ａ５μgとpSP 64/R1-Xbal２０μgで共トランスフェクトした。レーン３、Ｅ１Ａ５μgとpSP64/ Stu-Xho２０μgで共トランスフェクトした。レーン４、模擬トランスフェクショ ン後SK-BR-3細胞の溶解物。蛋白質サイズ・マーカーを右側に示す。矢印は、ｐ １８５蛋白質の位置を示す。ｐ１８５蛋白質相対濃度を決定するために、Bio-Ra dビデオ・デンシトメーター６２０型でｐ１８５蛋白質帯を走査した。模擬トラ ンスフェクション・サンプル中のｐ１８５蛋白質濃度を１００％と定義すると、 レーン１〜３のｐ１８５蛋白質の相対量は、それぞれ５７％、５４％、８９％で ある。 第５図は、共通配列を含む-merオリゴヌクレオチド（SEQ ID No:1）の共トラ ンスフェクションによるneuのＥ１Ａ仲介抑制の除去を表す図である。neuプロモ ータ基礎活性を示す、pneuEcoRV-CATプラスミド３μgでRat-1細胞をトランスフ ェクトした（レーン１）；pE1A１０μgで共トランスフェクションした後のＣＡ Ｔ活性をレーン４に示す。２つの共通配列を含む0-mer二本鎖オリゴヌクレオチ ドの２種類の微生物（レーン２、Cons）をpneuEcoRV-CATとpE1A（オリゴーマ：p neuEcoRV-CATのモル比＝３５：１）で共トランスフェクトし、結果として有意な 抑制が得られた。pneuEcoRV-CATとpE1Aで、22-merランダム非均質オリゴヌクレ オチド２μgを共トランスフェクトしても、有意な抑制作用を示さなかった（レ ーン３、無し）。相対ＣＡＴ活性の値は、３試験の平均である。合成20-merオリ ゴヌクレオチドの上方鎖配列を最下部に示す。Ｅ１Ａ応答配列案を下線で示す。 第６図Ａ、第６図Ｂ、第６図Ｃおよび第６図Ｄは、細胞におけるＥ１Ａ遺伝子 存在および蛋白質産生を表す図である。 第６図Ａ：EcoRl-Sstl E1AＤＮＡプローブを使用した、NIN3T3、B104-1-1およ びそれらのトランスフェクタントのサザンブロット解析。表示した細胞株由来の ゲノムＤＮＡ１０μgを消化し、EcoRl制限エンドヌクレアーゼおよびSstl制限エ ンドヌクレアーゼで完了し、１％アガロース・ゲルを用いた電気泳動にかけた。 ＤＮＡをNitran濾紙に移し、Ｅ１Ａプローブでハイブリッド形成した。ＤＮＡマ ーカーを左側に示す。 第６図Ｂ：表示した細胞株の細胞溶解物中のＥ１Ａ蛋白質のイムノブロット解 析。各サンプル５０μgを、ニトロセルロースに移す前に、１０％ＳＤＳーＰＡ ＧＥによる電気泳動にかけた。オハイオ州立大学のDr．L．S．Changから入手し た、Ｅ１Ａに対する一次抗体Ｍ７３抗体と共にフィルターをインキュベートした 。蛋白質分子量マーカーおよびＥ１Ａ蛋白質の位置を右側に示す。２９３個の細 胞からの細胞溶解物２５μgを陽性コントロールとして使用した。 第６図Ｃ：表示した細胞株の細胞溶解物中のneuにコードされるｐ１８５蛋白 質のイムノブロット解析。本試験は、上記セクション（第６図Ｂ）に記述した通 りに実施した。一次抗体は、Oncogene Science Inc.から購入した、ｐ１８５に 対するｍＡＢ−３であった。 第６図Ｄ：ラットneuＤＮＡプローブを使用した、表示した細胞株のサザンブ ロット解析。本試験は、上記セクション（第６図Ａ）に記述した通りに実施した 。ＤＮＡは、Bamhl制限エンドヌクレアーゼで消化した。 第７図Ａ、第７図Ｂ、第７図Ｃ、第７図Ｄ、第７図Ｅ、および第７図Ｆは、ne uトランスフォームしたB104-1-1-細胞におけるＥ１Ａ発現の形態学的作用を表す 図である。 （第７図Ａ）B104-1-1；（第７図Ｂ）B-E1Apr；（第７図Ｃ）N-E1A-1；（第７図 Ｄ）B-E1A-1；（第７図Ｅ）B-E1A-2；（第７図Ｆ）B-E1A-3（倍率：１３０×） 。 第８図Ａおよび第８図Ｂは、ＤＮＡ合成に対するＥ１Ａ効果を表す図である。 第８図Ａ：表示した細胞株の［³Ｈ］チミジン取り込み。９×１０³個の細胞を ９６ウェルの多ウェル・プレートにプレーティングし、１０％ウシ血清を補足し たDulbeccoのEagle改良培地で１６、４０および６４時間培養した。収集前に、 ＤＮＡを合成している細胞を標識するため、ウェル当たり１μCiの［³Ｈ］チミ ジンの２時間パルスを細胞に与えた。個々のサンプルの放射能をシンチレーショ ン・カウンターでカウントした。平均cpmカウントを複製サンプルから算出した 。 第８図Ｂ：Ｅ１ＡトランスフェクトしたB104-1-1細胞およびNIH3T3細胞の固着 部非依存性増殖。１×１０³個の細胞を、0.7％寒天下層上の0.35％ソフトアガー にプレーティングした。４週間後にコロニーを計数した。各群の、代表的なプレ ートおよび３重のサンプルの平均±平均値の標準誤差を示す。 第９図Ａおよび第９図Ｂは、腫瘍発生性試験の影響を表す図である。 第９図Ａ：B-104-1-1、NIH3T3およびそれらのトランスフェクタントの腫瘍発 生性の概要。１×１０⁵個の可変細胞を、それぞれメス同型接合nu/nuマウスの左 側腹部に皮下注射した。可視腫瘍塊の有無として、指示された日に腫瘍形成をス コア化した。注射後１６日に、腫瘍体積を３次元カリパス測定値（最長表面長お よび幅、ならびに腫瘍の厚さ）の積として推定した。N.D：評価時に検出できず 。 第９図Ｂ：腫瘍発生性試験の代表的結果。左から右へ：写真撮影データの１８ 日前に、B-104-1-1細胞、B-E1A-2細胞またはNIH3T3細胞を動物に注射した。 第１０図Ａ、第１０図Ｂ、第１０図Ｃ１、第１０図Ｃ２、第１０図Ｃ３、およ び第１０図Ｃ４は、neuトランスフォーム細胞のＥ１Ａ阻害を表す図である。 第１０図Ａ：Ｅ１Ａ遺伝子産物はneuトランスフォーム３Ｔ３細胞の運動性を 阻害した。N-E1A：Ｅ１ＡでトランスフェクトしたNIH3T3細胞；B-neo：ネオマイ シン耐性遺伝子でトランスフェクトしたB104-1-1細胞；B-E1A-1〜B-E1A-5：Ｅ１ Ａ 遺伝子をB104-1-1細胞にトランスフェクトすることによって生じた５種類の独立 した細胞株。２４ウェル・クラスター・プレート（Costar）中にポアサイズが５ μmのポリカーボネートフィルターが入っているトランスウェルユニットを使用 して、運動性アッセイを実施した。トランスウェルの下方コンパートメントは、 化学誘引物質：２０μmのフィブロネクチン（ＦＮ）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２に 溶解した１００μmのＦＮ、または肝内皮細胞条件培地（ＨＳＥ）、あるいは陰 性コントロールとしてＤＭＥＭ／Ｆ１２媒体のみ、のうちの１つを６００μl含 んでいた。細胞（ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、３×１０⁴細胞／0.1 ml）を上方コンパ ートメントにプレーティングし、加湿した５％ＣＯ₂大気中、３７℃で６時間、 インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳ緩衝液中の３％グルタルア ルデヒドでフィルターを固定し、Geimsaで染色した。各サンプルを３重にアッセ イし、フィルターの下側に移動していた細胞数を計数することによって、細胞運 動性を測定した。フィルター当たり少なくとも４つの高倍率視野を計数した。バ ックグラウンドを消去するために、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に移動した細胞数を各サン プルから差し引き、全てのアッセイを３回ずつ行った。 第１０図Ｂ：Ｅ１Ａ遺伝子産物はneuトランスフォーム３Ｔ３細胞の侵襲性を 阻害した。基本的には、Albini et al.，１９８７、およびRepesh，１９８９に 記載されている通りに、インビトロ侵襲性のアッセイを実施した。ベースメント 膜調製物であるマトリゲルは、Collaborative Research，Inc.から購入した。ト ランスウェル・ユニットのフィルター（運動性アッセイで使用したものと同じ） を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２媒体中のマトリゲルの１：２０希釈0.1 mlでコーティング した。下方コンパートメントは、化学誘引物質としてＨＳＥか、または陰性コン トロールとしてＤＭＥＭ／Ｆ１２を0.6 ml含んでいた。細胞（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 中の５×１０⁴細胞／0.1 ml）を上方コンパートメントにプレーティングし、加 湿した５％ＣＯ₂大気中、３７℃で７２時間、インキュベートした。細胞を固定 し、染色し、 計数した。全てのアッセイは３重に行い、アッセイを２回繰り返した。 第１０図Ｃ：B-neo細胞（第１０図１Ｃ）、N-E1A細胞（第１０図Ｃ２）、B-E1 A-1細胞（第１０図Ｃ３）、およびB-E1A-2細胞（第１０図Ｃ４）を注入したマウ スの肺の肉眼概観；Ｅ１Ａ遺伝子産物は、neuトランスフォーム細胞の肺クロー ン化を阻害した。方法論上の詳細に関しては、表２の凡例を参照されたい。 第１１図Ａおよび第１１図Ｂは、ヌードマウスにおけるインビボneu誘導性腫 瘍形成および転移をＥ１Ａが抑制することを表す図である。 第１１図Ａ：最上、neu癌遺伝子トランスフォームNIH3T3細胞株であるB-104-1 -1細胞を注射した動物；最下、B-104-1-1のＥ１ＡトランスフェクタントであるB -E1A-2細胞を注射した動物。写真は注射後１８日に撮影し、結果は、他の腫瘍発 生試験の代表である。 第１１図Ｂ：左、B-104-1-1細胞を注射した肺の肉眼概観；右、Ｅ１Ａトラン スフェクト細胞であるB-E1A-2を注射した肺の肉眼概観；第０日に、外側尾静脈 によりＰＢＳ中の１×１０⁵細胞／0.1 mlをマウスに接種し、注射後２１日に屠 殺した。墨汁を浸透させた後、肺腫瘍小結節の数を測定し、直径が１mmを超える 肺小結節のみをアッセイで計数した。 第１２図Ａ、第１２図Ｂおよび第１２図Ｃは、iP1,、Ｅ１Ａおよび実施例IVに 記述されているip1.Efsトランスフェクタントの分子特性を表す図である。 第１２図Ａ：表示した細胞株の細胞溶解物中のＥ１Ａ蛋白質のイムノブロット 解析。各サンプルの蛋白質７５mgを、ニトロセルロースに移す前に、１０％ドデ シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いた電気 泳動にかけた。Ｅ１Ａ蛋白質を認識する、一次抗体Ｍ７３と共にフィルターをイ ンキュベートした。Ｅ１Ａ蛋白質の位置を、Ａの左に示す。 第１２図Ｂ：表示した細胞株の細胞溶解物中のc-erbB-2/neuにコードされるｐ １８５蛋白質のイムノブロット解析。各サンプルの蛋白質７５mgを、ニトロセル ロースに移す前に、１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いた電気泳動にかけた。フィルターをｐ１８５に対する一 次抗体c-neu-Ab-3と共にフィルターをインキュベートした。ｐ１８５蛋白質の位 置を、Ｂの左に示す。 第１２図Ｃ：ip1.E1Aトランスフェクタントおよびip1.Efsトランスフェクタン ト由来のＤＮＡのサザン・ブロット。表示した細胞株由来のゲノムＤＮＡ１０mg を、全長c-erbB-2/neucDＮＡプローブでハイブリド形成した。ＤＮＡマーカーを 右に示す。 第１３図Ａ、第１３図Ｂおよび第１３図Ｃは、それぞれ、ip1.E1Aトランスフ ェクタントとコントロールip1.Efs細胞の増殖速度低下、ip1.E1Aトランスフェク タントとコントロールip1.Efs細胞による［3Ｈ］チミジン取り込み減少、および ip1.E1Aトランスフェクタントとコントロールip1.Efs細胞の有意なコロニー形成 阻害を示す図である。 第１３図Ａ：ip1.E1Aトランスフェクタントとコントロールip1.Efs細胞の増殖 速度低下。ＭＴＴアッセイ（Alley et al.，１９８８）で細胞数の増加を測定す ることによって、細胞株のインビトロ増殖速度を評価した。細胞（２×１０³細 胞／ウェル）を、0.2 mlの培地中、９６ウェル培養プレートにプレーティングし た。総計５枚のプレート（９ウェル／細胞株／プレート）を使用した。ＭＴＴ（ Sigm a Chemical Co.，St．Louis，MO）保存溶液（1.25 mgＭＴＴ/mlリン酸緩衝 液）４０μlをプレートの各ウェルに加えた後、２４時間間隔でプレートのうち １枚を分析した。細胞を３７℃で2.5時間インキュベートし、培地を吸引し、ジ メチルスルホキシド１００μl中で細胞を溶解した。代謝的に成育可能な細胞に よるＭＴＴのホルマザンへの変換を、４５０ nmの波長で、Dynatech MR 5000蛍 光マイクロプレート読み取り装置によりモニタリングした。結果を、回帰分析で 解析した。各細胞株について少なくとも２回、各試験を繰り返した。 第１３図Ｂ：ip1.E1Aトランスフェクタントとコントロールip1.Efs細胞による ［³Ｈ］チミジン取り込み減少。本アッセイに関しては、複製細胞１０サンプル を、９６ウェルプレートで、培地中８×１０³細胞／ウェルの密度で、プレーテ ィングした。それぞれ、２４時間、４８時間、および７２時間に各ウェルに［3 Ｈ］チミジン(１μl)を加え、各々の添加後、３７℃で１２時間、連続的にイン キュベートした。細胞を収集し、細胞のＤＮＡをファイバーグラス・フィルター に結合させた。各フィルターの放射能をシンチレーション・カウンターでカウン トした。平均cpmを複製サンプルから算出した。 第１３図Ｃ：ip1.E1Aトランスフェクタントとコントロールip1.Efs細胞の有意 なコロニー形成阻害（ｐ＜0.01）。前述（Matin et al.，１９９０）の通り、ソ フトアガー・アッセイを実施した。0.7％アガロース層を上に重ねた0.35％アガ ロース（BRL，Gainthersburg，MD）を含む培地中、２４ウェルプレートに細胞（ １×１０³細胞／ウェル）をプレーティングした。次に細胞を３７℃で５週間イ ンキュベートし、その後、プレートをｐ−ヨードニトロテトラゾリウム・バイオ レット（１mg/ml）で、３７℃で４８時間染色した。各皿および各細胞株につい て、１００μmを超えるコロニーを計数した。ソフトアガー・コロニー数を図に 示す。各細胞株について、試験を４回繰り返した。 第１４図Ａおよび第１４図Ｂは、Ｅ１Ａにより抑制される、c-erbB2-/neu-過 剰発現性卵巣癌細胞による腫瘍形成、およびＥ１Ａ発現性ip1.E1A細胞を注入し たマウスとiP1.Efsヒト卵巣腫瘍癌細胞を注入したマウスの、より長い生存。 第１４図Ａ：Ｅ１Ａにより抑制される、c-erbB2-/neu-過剰発現性卵巣癌細胞 による腫瘍形成。４〜６週齢の無胸腺、メス、同型接合nu/nuマウスをAnimal pr oduction Area，National Cancer Institute - Frederick Cancer Research Fac ility（Frederick，MD）またはHarlan Sprauge Dawley，Inc.,（Indianapolis， IN）から購入した。動物の世話および使用は、研究施設のガイドラインに従った 。腫 瘍発生性アッセイに関しては、対数期増殖の細胞をトリプシン処理し、リン酸緩 衝食塩水で２回洗浄し、２５０×ｇで遠心分離した。成育可能な細胞を計数し、 その中から、リン酸緩衝食塩水0.1 ml中の３×１０⁶個の細胞を、無菌条件下、 メス・マウスの左右両側腹部に皮下注射（s.c）した。腫瘍体積を３次元カリパ ス測定値（最長表面長および幅、ならびに腫瘍の厚さ）の積として推定した。図 に示した日数からわかるように、最低８０日間、最高１６０日間、腫瘍の成長を モニタリングした。 第１４図Ｂ：Ｅ１Ａ発現性ip1.E1A細胞を注入したマウスとiP1.Efsヒト卵巣腫 瘍癌細胞を注入したマウスの、より長い生存（ｐ＜0.01）。腹腔内注射後の悪性 腹水の形成を評価するため、Hankの平衡塩溶液0.2 ml中に１×１０⁶細胞の濃度 の細胞（上記の通り収集した）懸濁液を、個々のメスnu/nuマウスに腹腔内注射 した。２つの試験で、合計９匹のマウスにip1.Efs系を、８匹にiP1.E1A1系を、 ９匹にipE1A2系を注射した。最初は１週間に２回、腫瘍発生の徴候についてマウ スを観察し、下記の腫瘍症状の何らかが、または全てが発現したときはマウスを 毎日観察した。腹部鼓脹、皮下脂肪の喪失、背を曲げた姿勢、および運動の減少 。マウスは、瀕死に見えたとき、あるいは発明者の以前の経験から判断して２４ 〜４８時間以上生存しないと考えられたとき、屠殺した。無症状のマウスは、注 射後１２０日に屠殺した。屠殺した全てのマウスに剖検を実施した。２つの試験 から類似した結果が得られたので、解析のため、結果を合併した。 第１５図Ａ、第１５図Ｂおよび第１５図Ｃは、プラスミドコーディングＬＴで しっかりとトランスフェクトされたB104-1-1細胞における、neuコード化ｐ１８ ５およびＬＴの発現を表す図である。 第１５図Ａ：ＬＴでしっかりトランスフェクトされたB104-1-1細胞由来の全細 胞溶解物の抗ｐ１８５のイムノブロッティング：BTn16細胞株（レーン１）、BTn 14細胞株（レーン２）、BEn5細胞株（レーン３）、およびNIH3T3細胞株（レーン ４）。ニトロセルロースに移した後、モノクローナル抗ｐ１８５抗体（c-neu，A b-3、Oncogene Science）でブロットを精査し、続いてホースラディッシュ・ペ ルオキシダーゼに複合したヤギ抗マウスで精査した。次に、ホースラディッシュ ・ペルオキシダーゼ基質と過酸化水素を使用して、ブロットを展開した。 第１５図Ｂ：安定したトランスフェクタントの全細胞溶解物のＬＴのイムノブ ロット。抗ＬＴ（SV 40 T-Ag，Ab-2、Oncogene Science）でブロットを精査し、 次に［125Ｉ］蛋白質Ａで精査した。オートラジオグラフィーのため、洗浄し、 乾燥させたブロットを暴露した。BTn16、レーン１；BTn14、レーン２;BEn5、レ ーン３；およびNIH3T3細胞株、レーン４の溶解物。 第１５図Ｃ：BTn16、レーン１；BTn14、レーン２;BEn5、レーン３およびNIH3T 3細胞株、レーン４から分離下のBamHl消化ゲノムＤＮＡでハイブリッド形成する ための、neu cＤＮＡプローブ由来の、32Ｐ標識した、0.4 kbおよび0.8 kbのBam Hlフラグメント（11）を使用したゲノムneuのサザンブロッティング。ラットのn eu特異的帯を三角で示す。 第１６図は、neuおよび上皮成長因子受容体の上流調節配列に及ぼすＬＴの作 用を表す図である。１mgのpneuEcoR1-CAT（レーン１およびレーン２）またはpEG FrCAT（レーン３およびレーン４）を、ＬＴをコードするプラスミドであるpVU-0 （レーン２およびレーン４）１０mgと共に、あるいはＬＴコーディング領域を含 まないコントロール・プラスミドpSV2E（レーン１およびレーン３）と共に、NIH 3T3細胞に共トランスフェクトした。上述（Yu et al.，１９９２）の通りに、ト ランスフェクションおよびＣＡＴアッセイを実施した。細胞抽出物の蛋白質濃度 と等しくするため、ＣＡＴアッセイを標準化した。試験を４回繰り返したところ 、実験誤差は１３％以内であった。代表的な１組のデータを示す。 第１７図は、漸増濃度のＬＴがneuの調節配列に及ぼす影響を表す図である。 ２mgおよび１０mgのpVU-0を１mgのpneuEcoR1-CATと共に、NIH3T3細胞に共トラン ス フェクトした。トランスフェクトしたＤＮＡの総量は全ての反応で等しく、最終 ＤＮＡ濃度を１１mgにするためにpSV2Eを使用した。レーン４、Ｍは、非トラン スフェクトNIH3T3細胞からの抽出物のコントロールＣＡＴアッセイである。３試 験の代表的データを示す。標準偏差は１１％であった。 第１８図Ａおよび第１８図Ｂは、連続欠失のデータを示す。 第１８図Ａ：ラットneuプロモータの連続欠失ＣＡＴ構造物。 第１８図Ｂ：neu欠失ＣＡＴ構造物を使用した。neu上流調節配列のＬＴ応答領 域のマッピング。各neu欠失ＣＡＴ構造物１mgを、ＬＴ産生プラスミドpVU-0（＋ で表示）１０mg、またはフィラー・プラスミドpSV2E（・で表示）１０mgと共にN IHT3T細胞に共トランスフェクトした。セット１、pneuEcoR1CAT；セット２、pne uXbalCAT；セット３、pneuEcoRV2CAT；セット４、pneuEcoRVCAT；セット５、pne uStulCAT；セット６、pneuXholCAT；Ｍ、非トランスフェクトNIH3T3細胞からの 抽出物のコントロールＣＡＴアッセイ。蛋白質濃度を等しくするために、（＋） を含み、ＬＴ（・）を含まないＣＡＴ反応の各セット（セット１、セット２など ）を標準化した。 第１９図は、neuプロモータのXhol-Nar1領域と共に形成されるＤＮＡ蛋白質複 合体を示すゲル・シフト・アッセイを表す図である。³²Ｐ標識ＤＮＡは、９４塩 基対のXhol-Nar1フラグメントである。レーン１およびレーン２、NIH3T3細胞か らの核抽出物；レーン３およびレーン４、Btn14細胞株からの核抽出物。レーン ２およびレーン４は特異的競合体として、約２５０倍の非標識Xhol-Nar1フラグ メントを含む。レーン５、³²Ｐ標識Xhol-Nar1フラグメントのみ。報告されてい る（Dynlacht et al.，１９９１）通りに、プローブ（１０⁵cpm）と核抽出物（ ３μg）とのインキュベーションを実施し、４０℃で2.5時間、サンプルを、0.5X TBE（４５mMホウ酸、１mM ＥＤＴＡ、pH８）を含む自然ままのの4.5％ポリアク リルアミドゲル（８０：１、アクリルアミド：ビスアクリルアミド）による電気 泳動にかけ た。Ｆは、非結合プローブを示す。 第２０図Ａ、第２０図Ｂおよび第２０図Ｃは、neuプロモータ活性に及ぼす突 然変異体ＬＴの影響を表す図である。 第２０図Ａ：Ｒｂ結合ドメイン（黒い影）を表す概略図である。Ｋ１は、アミ ノ酸７０８個のＬＴ蛋白質のＲｂ結合領域にアミノ酸変化（glu 107がlysに）が １つあるＬＴをコードする。 第２０図Ｂ：pneuXholCAT（とコントロール・プラスミドpSV2E）の活性および 野生型ＬＴ（ＷＴ）および突然変異体ＬＴ（Ｋ１）の存在下における活性の阻害 。１mgのpneuXholCATを１０mgのフィラー・プラスミドpSV2E、あるいは野生型Ｌ Ｔ（pVU-0）または突然変異体ＬＴ（pK1）で共トランスフェクトした。 第２０図Ｃ：活性neuのトランスフォーミング活性に及ぼすＫ１の影響。１mg のcNeu-104を２mgのＫ１および0.1 mgのpSV2neoと共に、Rat-1細胞に共トランス フェクトした。細胞はトランスフェクション後４８時間に１：４に分断し、その 後、標準培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２と１０％ウシ血清）または２５０mg/mLのＧ４ １８を補足した標準培地中で重複プレートが成長した。焦点またはＧ４１８耐性 コロニーを染色し、３〜４週後に計数した。トランスフェクション効率の補正を するため、各トランスフェクションによる焦点とＧ４１８耐性コロニーの焦点の 比として結果を表す。cNeu-104のみのトランスフェクションによる焦点の数を１ ００％に設定した。 第２１図は、Ｅ１Ａ遺伝子をneu過剰発現性SK-OV-3ヒト卵巣癌細胞に送達でき るリポソーム由来の直接遺伝子転移技法を表す図である。マウス３匹に、各々SK -OV-3細胞を注射した。５日後、マウスに（１）Ｅ１Ａ ＤＮＡのみ、（２）リ ポソームとＥｆｓ ＤＮＡ（活性Ｅ１Ａを産生させないＥ１Ａフレーム・シフト 突然変異体）の複合体、および（３）リポソームとＥ１Ａ ＤＮＡの複合体を注 射した。マウスの寿命が残っている間、１週に１度のベースで、同一組成物のブ ー スター注射を、それぞれのマウスに行った。マウス１は、大量の血性腹水が発生 し、SK-OV-3注射後６５日に死亡した。マウス２は、大量の血性腹水および大型 腫瘍が発生し、SK-OV-3細胞注射後７６日に死亡した。マウス３は健康で、SK-OV -3注射後１６０日に生存していた。 第２２図は、卵巣癌SK-OV-3(i.p.)におけるアデノウイルスの感染効率を表す 図である。異なるウイルス／腫瘍比率のAd.RSVβgalにより、６ウェル・プレー ト（2.5×１０⁵／ウェル）中のSK-OV-3(i.p.)を一度感染させた。２日後、細胞 を固定し、X-Galで染色した。感染効率＝陽性細胞数／総細胞数×１００％。 第２３図は、インビトロで、Ad.E1A処理した後のSK-OV-3(i.p.)の増殖曲線を 表す図である。２×１０⁵のアデノウイルスにより、１２ウェル・プレート（１ ０⁴／ウェル）中のSK-OV-3(i.p.)を一度感染させ、細胞増殖を７日間追跡した。 第２４図は、ソフトアガー中のコロニー形成を表す図である。SK-OV-3(i.p.) 細胞を、２０／１のウイルス／腫瘍比率のアデノウイルスに一度感染させた。そ の一部５×１０⁴細胞をＤＭＥＭ培地中0.35％アガロースと混合し、0.7％アガロ ースの基底層の上にプレーティングした。６ウェル／プレート（ｎ＝３）で、培 地を硬化させた。約６週後にコロニーを染色して計数した。 第２５図は、卵巣癌SK-OV-3(i.p.)に対するAd．E1A治療効果を表す図である。 SK-OV-3(i.p.)（１０⁶／マウス）をメスnu/nuマウスに腹腔内注射した。５日後 、ウイルス溶液（力価；２×１０⁹PFU/ml）0.1 mlを１日１回、３日間、マウス に腹腔内注射し、その後１週に１回、4.5カ月間注射した。半年以上にわたって 、応答率および生存率を観察した（ｎ＝５）。 第２６図Ａおよび第２６図Ｂは、lacZ遺伝子の腹腔内SK-OV-3(i.p.)へのイン ビボAd.RSVβgal仲介転移、第２６図Ａ；および気管内Ｈ８２０へのインビボAd. RSVβgal仲介転移、第２６図Ｂを表す図である。 第２６図Ａ：マウスに腹腔内SK-OV-3(i.p.)を投与し、腫瘍発生後２カ月に、 Ad.RSVβgalを腹腔内投与した。X-Galを使用して、βgalの存在について腫瘍お よび器官を評価した。腫瘍細胞ではlacz遺伝子を定位し、正常器官では、僅かな βgal活性が検出されただけであった。 第２６図Ｂ：マウスにＨ８２０を気管内投与した。腫瘍発生後２カ月に、Ad.R SVβgalを腹腔内投与した。X-Galを使用して、βgalの存在について腫瘍および 器官を評価した。腫瘍細胞ではlacz遺伝子を定位し、正常器官では、僅かなβga l活性が検出されただけであった。 第２７図は、Ad.E1A処理後の、卵巣癌２７７４担持マウスの生存率を表す図で ある。低レベル発現のHER-2/neuを有するヒト卵巣癌細胞株２７７４をnu/nuマウ スに腹腔内注射した（５×１０⁵／マウス）。５日後、ウイルス溶液（力価；２ ×１０⁹/ml）0.1 mlを１日１回ずつ３日間、マウスに腹腔内注射し、その後１週 に１回ずつ4.5カ月間、注射した。応答率および生存率を観察した。Ad.E1A（＋ ）は、２７７４において有意な治療効果を示さなかった。高発現レベルのHER-2/ neuを有するSK-OV-3(i.p.)の結果の解析およびデータは、Ad.E1A（＋）が、高発 現レベルのHER-2/neuを有する腫瘍の成長を特異的に阻害することを示す。 第２８図Ａ、第２８図Ｂ、および第２８図Ｃは、投与マウスとコントロールマ ウスの代表的な組織学的切片の組織免疫化学解析を表す図である。 第２８図Ａ：ヘマトキシリン・エオジン染色した腹腔内SK-OV-3(i.p.)の組織 学的切片。 第２８図Ｂ：HER-2/neuｐ１８５蛋白質の発現レベル：ｐ１８５に対するポリ クローナル抗体とＡＢＣアルカリホスファターゼ基質キットで染色した。陽性： 赤色。 第２８図Ｃ：Ad.E1A蛋白質の発現：Ad.E1Aに対するモノクローナル抗体とホー スラディッシュ・ペルオキシダーゼ用ＡＢＣ ＡＣＥ基質キットで染色した。陽 性：暗赤色。Ad.E1A蛋白質は、インビボでAd.E1A（＋）投与した腫瘍組織で検出 された。投与マウス腫瘍組織では、HER-2/neuｐ１８５の発現レベルレベルが大 きく阻害された。 好適な実施例の詳細な説明 neu癌遺伝子は、最初、ラットの神経芽腫/グリア芽腫から同定されたトランス フォーム遺伝子である(Shih et al.，1981)。そして、活性化されたneu癌遺伝子 と、正常細胞における対応遺伝子であるneu遺伝子がともに、ラットおよびヒト のライブラリーからクローニングされた(Barmann et al.，1986; Coussens et a l.，1986; Yamamoto et al.，1986)。neu遺伝子は、185キロダルトン(KDa)の膜 移行蛋白質(p185)をコードしている。この蛋白質は上皮増殖因子受容体(EGF-r) に関連するが、それとは異なる蛋白質である。neu遺伝子がコードするp185は、 リガンド結合、膜移行および細胞内キナーゼドメインを含む全体的な構造的組成 において、EGF-rと同一であり、また、広範な配列においても高い相同性を持つ 。特に、チロシンキナーゼドメインのアミノ酸配列の80％以上が相同である。最 近、ラット細胞において、neu遺伝子がコードするp185に結合するリガンドが、 機能的方法で同定され、また、ヒトの乳癌細胞から単離されたが、これによって 、正常細胞と悪性細胞の成長と増殖における、neu遺伝子がコードするp185蛋白 質の機能をさらによく理解できるようになろう(Lupu et al.，1990; Yarden et al.，1989)。 活性化されたneu癌遺伝子は、膜移行ドメインで１アミノ酸が置換されており 、正常細胞の対応遺伝子に較べて強いチロシンキナーゼ活性を持つ。さらに、一 箇所の点突然変異によって、neu癌原遺伝子は増幅されて、癌化活性が増大する( Hung at al.，1989)。ラットのneu癌遺伝子のヒトにおける相同遺伝子は、HER-2 あるいはcerbB2と名付けられているが、この遺伝子はヒトの原発性乳癌や卵巣癌 の25-30％において増幅ないし過剰発現することが分かっている(Hung et al.，1 988; Slamon et al.，1987)。neuが過剰発現している乳癌患者の全生存率は有意 に低く、また、neuが過剰発現しない患者に較べて、再発までの期間が短かいた め、 neuの過剰発現を予後因子(ld.)として利用できると考えられる。ヒトのneu遺伝 子の増幅/過剰発現も、乳癌患者(ld.)の転移陽性を示す腋窩リンパ節の数と相関 することが明らかになっている。これらの研究はneu癌遺伝子が悪性の形質転換 と転移に重要な役割を担っていることを強く示唆している。 Ａ．E1Aによるneu抑制の実施例 アデノウイルスE1A遺伝子の主要な機能は、ウイルスの増殖感染中に、宿主細 胞の転写装置を改変して他のアデノウイルスの遺伝子を活性化することであり、 その結果、アデノウイルスの早期領域全部によるトランスフォーメーションで宿 主細胞が不死化される(Berk et al.，1986)。E1A蛋白質によるアデノウイルス以 外の遺伝子の転写の活性化も、転写の抑制も報告されている(Borreli et al.，1 984; Hen et al.，1985; Lillie et al.，1989; Sassome-Lorsi et al.，1987; Stein et al.，1987)が、それらのもつ機能的意義や生理的影響は、多くの場合 明らかでない。興味深いことに、E1A遺伝子を外から加えると、近年クローニン グされ、その性質が解明された細胞性の転移抑制遺伝子である、細胞nm23遺伝子 (Pozzaati et al.，1988)を活性化し、また、rasでトランスフォームしたラット の胚線維芽(REF)細胞の転移能を低下させることができる。さらに、E1A遺伝子で 形質転換すると、分泌プロテアーゼ遺伝子の発現を転写段階で抑制し、ヒトの腫 瘍細胞の転移を阻害することが示されている(Liotta，1989)。 最近、本発明者らはneu遺伝子のプロモーター活性に対するE1A遺伝子産物の効 果を調べて、E1A蛋白質が転写段階でヒトおよびラットのneu癌遺伝子の発現を抑 制することを発見した。neu遺伝子もE1A遺伝子も公知のトランスフォーム遺伝子 であるため、これらの発見によって興味深い疑問が起きた。E1A蛋白質はneuでト ランスフォームした細胞に対して転写抑制を通してトランスフォーメーション抑 制因子として働きうるだろうか。 この疑問に取り組むために、発明者らはE1Aを調べるための生物学的機能アッ セ イ系を開発することにした。neuで形質転換したB104-1-1細胞にE1A遺伝子を導入 して、E1A遺伝子産物を安定して発現する派生細胞を作出し、この細胞をB-E1Aと 名付けた。そして、neuでトランスフォームされた親株のB104-1-1細胞系とB-E1A 細胞系の転換形質を、それぞれの型の細胞をヌードマウスに注入して較べた。そ の結果、E1Aはneu癌遺伝子が仲介する細胞のトランスフォーメーションと転移を 抑制しうることが明確に示された。 以下の実施例で、発明者らは、E1A遺伝子にneu遺伝子の発現を抑制し(実施例 １)、neu遺伝子介在の腫瘍形成を抑制し(実施例II)、また、neu遺伝子が仲介す る転移(実施例III)を抑制し、ヒトの卵巣癌におけるc-erbB-2/neuの発現を抑制 する能力があることを明らかにする。また、E1Aによる遺伝子治療(実施例VIII) について明らかにした研究を示す。実施例VIではLT抗原によるneuの抑制を明ら かにする。これらの研究は、本発明を具体的に例示したものであるが、本発明の 意図と範囲を逸脱することなく、これらの態様に多くの修正や変更を加えること は、当業者によって理解されるであろう。 実施例Ｉ アデノウイルス５ E1A遺伝子産物によるneu癌原遺伝子の転写抑制 本実施例は、発明者らが行なった研究で、アデノウイルス12Sと13Sの産物がne uプロモーターの転写活性を抑制するのに効果的であることを明らかにした研究 に関する。特に、E1A蛋白質の保存領域２(CR2)が抑制のために必要なことが示さ れる。さらに、これらの研究により、neuプロモーターの上流域にある、シス作 用DNA因子が、E1A遺伝子産物によるプロモーターのトランス阻害に関与すること が明らかになった。 １．材料および方法 ａ．プラスミド 本研究で用いた組換え体を説明する。pE1A(Chang et al.，1989; Hearing et al.，1985)はE1A領域のみを発現しているプラスミドであり、pE1A12SおよびpE1A 13S(Hearing et al.，1985)は、それぞれ12S E1A蛋白質と13S E1A蛋白質を発現 し、pE1A-d1343(Hearing et al.，1985)は、E1Aをコードする配列中において２ 塩基の欠失によってフレームシフトを起こした配列(アデノウイルスの塩基配列 中621番目と622番目)をもち、pE1A-d1346(Hearing et al.，1985)は、読み枠は 変えないが、859番目から907番目(48 bp)の塩基を欠失していて、そのためにE1A 蛋白質のCR2内部の16アミノ酸を欠失している。pE1AprはE1Aのプロモーター(E1A のキャップ部位の-499番目から+113番目)のみを持つ。pE2A-CAT(Chung et al.， 1989)は、E2初期プロモーターにレポーター遺伝子のクロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ(CAT)を融合させた配列をもつレポータープラスミド、p RSV-CATは、ラウス肉腫ウイルス(RSV)の長い末端繰り返し配列(LTR)の制御下にC AT遺伝子を置いたレポータープラスミドで、pE1B、pE2およびpE3は、それぞれE1 B、E2およびE3遺伝子を発現しているプラスミドである。pneuEcoRI-CATは、2.2 キロベース(kb)のラットneuプロモーターとその上流域をもち、CAT遺伝子に連結 している。本研究で用いたneuプロモーターの欠失突然変異体は、図３と４の説 明文に説明してある。pRSV-β-galは、RSV LTRにβガラクトシダーゼ遺伝子をつ ないだ配列をもち、トランスフェクションの効率をみるための内部的コントロー ルに用いた。 ｂ．細胞培養 細胞培養はすでに説明されているように行なった(Hung et al.，1989; Matin et al.，1984)。Rat-1細胞とSK-BR-3細胞をダルベッコ(Dulbecco)の修正イーグ ル(Eagle)培地(DMEM)にそれぞれ10％のウシ血清とウシ胎児血清を添加した培地 で増殖させた。 ｃ．DNA形質転換 形質転換はすべて、アンダーソン(Anderson)らにより修正されたグラハム(Gra ham)とファンデルEB(Van der EB)によるリン酸カルシウム沈殿法を用いて行なっ た(Hung et al.，1989; Anderson et al.，1979; Ausubel et al.，1987)。形質 転換の度に8 x10⁵個のRat-1細胞あるいは2 x 10⁶個のSK-BR-3細胞(2 x 10 cmの プレート)を形質転換24時間前に撒いた。形質転換用全DNA量は、同じ実験では、 異なるサンプル間でもキャリアDNA(pSP64)を加えて一定にした(最大30μg)。 ｄ．CATアッセイ 形質転換後40時間で細胞抽出物を調製した。細胞破砕物の一部で同時形質転換 したpRSV-β-galプラスミドからのβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。すべて のCATアッセイ(Gorman et al.，1982)は、形質転換の効率を測るための内部コン トロールに対して標準化した。CATアッセイは細胞抽出物中の[¹⁴C]クロラムフェ ニコールのアセチル化を測定する。つまり、[¹⁴C]クロラムフェニコールとその 産物を薄層クロマトグラフィー(TLC)によって分離して、オートラジオグラフィ ーによって可視化する。TCL紙上のそれぞれのスポットを切り出して放射能を液 体シンチレーション分析器で測定し、それによって相対的なCAT活性を計算した 。各実験は最低３回反復し、数回の実験の代表値を示した。 ｅ．免疫ブロット 形質転換して40時間経過後に、SK-BR-3細胞破砕物を作製してイムノブロット を説明通りに行なった(Matin et al.，1984)。ヒトのneu遺伝子産物p185に対す るモノクローナル抗体mAb-3をOncogene Science社から購入した。 ２．結果 ａ．アデノウイルス５(AD5)E1A産物によるneuの転写抑制 neuプロモーターとその上流域配列を含む2.2 kbのDNA断片をCAT発現ベクター に融合してpneuEcoRI-CATプラスミドを作出した。Rat-1細胞を用いた過渡的発現 アッセイ(図１A)において、pneuEcoRI-CATをE1A遺伝子を発現しているプラスミ ドpE1Aと同時形質転換するとCAT活性が有意に減少する。プラスミドベクターのp SP64と同時形質転換してもCAT活性に影響はなかった。neuプロモーターからの転 写 の減少が、同時形質転換したE1Aプロモーターによって細胞内の転写因子が希釈 される結果になるからだという可能性を排除するために、E1Aプロモーターのみ をもつ欠失変異体pE1AprとpneuEcoRI-CATとで同時形質転換した。このときCAT活 性に対する効果は観察されなかった。RSV LTRの制御下にCAT遺伝子を置いたレポ ータープラスミドは、E1Aに反応しなかった。これはCAT発現の低下が、E1Aに転 写減少をもたらす一般的効果によるせいではないことを示している。 並行した実験において、pE1AとpE2A-CAT(E2初期プロモーターによってCAT遺伝 子が働く)で同時形質転換して、E2A転写ユニットからの転写がE1A産物によって 刺激を受けるかを測定した。この結果、neuの抑制とE2Aプロモーターに対するト ランス作用がpE1A濃度と同じレベルで起こることが分かった。他のアデノウイル スの初期遺伝子がneuプロモーターを抑制できるか否かをみるため、アデノウイ ルスの初期遺伝子を発現しているプラスミドをそれぞれpneuEcoRI-CATと一緒に して形質転換した(図１Ｂ)。E1B、E2あるいはE3のみではCAT活性に変化は見られ なかったため、これらのアデノウイルス遺伝子の中ではE1A遺伝子のみがneuプロ モーターのリプレッサーとして機能し得た。 ｂ．neu抑制はE1A濃度に依存し、かつ、E1Aの保存領域２が必要である。 E1A遺伝子産物とneuプロモーターの相互作用をさらに調べるため、pE1Aの量を 増やしてpneuEcoRI-CATとの割合を、1:1、2:1、3:1および4:1にして同時形質転 換した(図２Ａ)。neuプロモーターに支配される遺伝子発現の阻害はpE1Aの濃度 に依存して起こり、pE1A:pneuEcoRI-CATの割合が1:1という低さで50％の抑制が 観察された。 Ad5のE1A遺伝子は12SmRNAと13SmRNAという２つの主なスプライシング産物を産 生するが、これらはそれぞれ243アミノ酸と289アミノ酸長をもつ蛋白質をコード している(Moran et al.，1987)。どちらのE1A遺伝子産物が、観察された抑制に 関与するのかを決めるために、12Sあるいは13S遺伝子産物のどちらかを発現する 組 換えプラスミド(pE1A-12SおよびpE1A-13S)を用いて同様の実験を行なった。図２ Ｂおよび図２Ｃで示されているように、12S産物も13S産物もともに濃度依存的な 態様でneuを抑制する効果があった。 E1A遺伝子産物には３つのよく保存された領域CR1、CR2およびCR3がある(Moran et al.，1987; Van Dam et al.，1989)。CR1とCR2は12Sと13Sの両方に存在して いるが、CR3は13S産物にだけ存在する。12Sだけでもneuを効果的に抑制したこと から、発明者らはE1Aによるneuの転写抑制にCR3は必要ではないことを論証した 。 E1A蛋白質中のCR1とCR2のいずれかneuを効果的に抑制するかを、さらに位置づ けるためにpE1Ad1343とpE1Ad1346という欠失変異体(Hearing et al.，1985)を用 いて並行した実験を行なった。pE1Ad1343変異体は、E1Aのコード配列に２塩基の 欠失があるためE1A産物の３つの保存領域のすべてにフレームシフトが起き、Ｎ 末端の40アミノ酸だけが元のままになっている。pE1Ad1343変異体をpneuEcoRI-C ATとともに形質転換に用いても、CAT活性への影響は観察されなかった。pE1Ad13 46変異体はフレームを変えない欠失をもち、CR2の中の16アミノ酸を失っている が、CR1は保存されている。この変異体はneuの転写発現(の抑制)に失敗した(図 ２Ｄ)。発明者らはE1A遺伝子産物CR2がneuの転写を効率的に抑制するのに必要だ と結論した(図２Ｅ)。 ｃ．E1Aによる抑制に応答するneuプロモーター中の標的DNA分子の位置づけ E1A産物による転写抑制を仲介する、neuプロモーター中のDNA因子を位置づけ るために、機能CAT遺伝子につないだneuプロモーターの一部を含みつつ、その5' 末端を欠失した構造になっている一連のプラスミドとpE1AでRat-1細胞を同時形 質転換した(図３Ａ)。コントロールのプラスミドベクターpSP64あるいはpE1Aを1 :2の割合で形質転換した後の、これらプロモーター断片それぞれの作用によるCA T遺伝子の過渡的発現を図３Ｂに示す。最も短いプロモーター断片をもつpneuXho I-CATだけがE1Aによる抑制を受けなかった。StuI-XhoIの制限酵素断片の中にあ る部位 の活性が、E1Aによる抑制を感知するのは明らかである。このStuI-XhoI断片は、 neuの転写開始位置から数えて-198と-59の位置にある。発明者らは、E1Aによる 抑制に反応する標的DNA分子は、この139塩基対のStuI-XhoI断片中にあると結論 した。 ｄ．トランス作用因子が関与する証拠 E1A産物によるこの抑制がトランスに働く作用か否かを調べるため、発明者ら はStuI-XhoI制限酵素断片のみをpSP64にクローニングした第三の組換え体である pSP64/StuI-XhoIで同時形質転換して抑制を除こうと考えた。pneuEcoRI-CATの転 写をE1Aに抑制させる同時形質転換において、pSP64/StuI-XhoIの量を増やすと濃 度依存的な態様でneu転写の抑制が弱くなる(図４Ａ)。これに対して、pSP64にEc o RI-XbaI制限酵素断片をクローニングしたpSP64/RI-XbaIで同時形質転換しても 抑制の低下は見られなかった。抑制の低下はpSP64/StuI-XhoI：pneuEcoRI-CATの 比が4:1のときに効果的だった(図４Ａ、レーン6)が、これはE1Aによるneuの抑制 に関係する転写因子について、StuI-XhoI断片とneuプロモーターとが効率よく競 合することを示している。これらの結果によって、neuプロモーターにおけるE1A 抑制の標的は、このプロモーターのStuI-XhoI断片の中にあるシスDNA因子である ことが確認された。さらに、この転写抑制にはDNA因子とE1A産物間の相互作用、 あるいは何らかの細胞内の転写因子でE1A産物と相互作用するかE1Aに誘導される ものとの間の相互作用が含まれるかもしれない。 ｅ．SK-BR-3細胞におけるヒトneu発現の抑制 ラットのneuプロモーターの配列中のStuI-XhoI断片をヒトのneuプロモーター の対応配列(Tal et al.，1982)と較べると86％以上の相同性を示す。発明者らは 、ヒトのneu遺伝子も同様の機序により、転写レベルでE1Aによって抑制されるだ ろうかと考えた。もしそうだとすれば、ラットのneuプロモーターのStuI-XhoI断 片で同時形質転換すれば、ヒトneuのE1Aによる抑制も緩和できるかもしれない。 この可能性を調べるために、ヒトneuのmRNAとp185蛋白質を過剰発現している こ とが知られている(Kraus et al.，1987)ヒト乳癌細胞系Sk-Br-3を受容細胞に用 いて同時形質転換実験を行なった。Sk-Br-3細胞溶砕物の免疫ブロッティング実 験によって、ヒトのneu遺伝子産物であるp185蛋白質の発現はE1Aを導入すると抑 えられることが明らかになった(図４Ｂ、レーン1と4を比較のこと)。pSP64/RI X ba IプラスミドとpE1Aを4:1の割合で同時形質転換に用いても、E1Aによるp185の 発現抑制を解除できなかったが、同じ割合でpSP64/StuI-XhoIとpE1Aで同時形質 転換するとE1Aによる抑制が弱められた。 過渡的形質転換の効率は最大でもせいぜい50％に過ぎないことが知られている (Chen et al.，1988)。つまり、残りの非転換Sk-Br-3細胞が依然高レベルのp185 蛋白質を産生し続ける結果、E1Aが仲介するp185の抑制のバックグランドが高く なりうる。したがって、neuによってコードされる内生的なp185に対する抑制効 果を、E1Aの過渡的形質転換によって免疫ブロッティングで見ようとしても、CAT アッセイ法で見られたようにははっきりしない。しかし、小さな差異が再現性よ く検出された。これらの結果の最もよい解釈は、ラットのneuプロモーターのStu I-XhoI断片に相当する、ヒトのneuプロモーター中のシスに働くDNA因子を標的に して、E1Aがヒトのneuプロモーターを転写レベルで抑制できるというものである 。 ｆ．TGGAATG配列がE1A仲介による抑制にとって重要である。 E1Aは、シミアンウイルス40(Borrel et al.，1984)、ポリオーマウイルス(Vel cich et al.，1986)、免疫グロブリンの重(Ｈ)鎖(Hen et al.，1985)およびイン シュリン遺伝子(Stein et al.，1987)の、エンハンサーが介在する転写の活性化 を抑制することが報告されている。これらの遺伝子のエンハンサーの配列を較べ るとコンセンサス配列(下に示す)があることが分かるが、これはE1A応答因子の 中心的配列と考えられる。 AAA (G)TGGTTT(G) しかしながら、この考えを支持する証拠はまだない。コンセンサス配列に一致 する配列TGGAATGが、ラットのneuプロモーターのStuI-XhoI間のE1A応答因子中に 見つけられている。また、同じ配列がヒトのneuプロモーターの対応領域に存在 する(Tal et al.，1987)。したがって、TGGAATG配列は、E1Aに誘導される抑制に とって重要な標的配列であろうと考えられる。 この可能性を調べるために、TGGAATG配列を含むラットのneuプロモーターから 20個のオリゴヌクレオチド(配列ID番号:１)を合成した(図５)。このオリゴヌク レオチドは、E1Aによる抑制に関与する転写因子に対して、neuプロモーターと効 果的に競合し、抑制低下効果をもたらした(図５、レーン２)が、ランダムな非相 同配列をもつ22塩基のオリゴヌクレオチドは抑制低下効果をもたなかった(図５ 、レーン３)。これらのデータは20塩基のオリゴヌクレオチドが、E1A誘導による 阻害に必要不可欠な配列を有していることの実験的な証拠を提供する。20塩基の オリゴヌクレオチド中のTGGAATG配列は、E1Aによる抑制を受けうる他の遺伝子の エンハンサー配列中のコンセンサス配列に似ているため、この７塩基の配列がE1 A効果の仲介に決定的な配列だと考えられる。 ３．検討 前述の結果は、同時形質転換系において、E1A遺伝子産物が転写レベルでneu発 現を抑制することを示している。さらに、E1A産物のCR2の一部(120-136アミノ酸 )を欠失すると、neu発現を抑制する効果は失われる。特筆すべきことは、アデノ ウイルスE1A CR2のこの欠失部位の構造モチーフが、パポバウイルスのラージ腫 瘍抗原、v-およびc-myc発癌蛋白質、ヒトのパピローマウイルスのE7形質転換蛋 白質、および、酵母の細胞分裂調節因子DCD25遺伝子産物に共通して見られるこ とである(Figge et al.，1988)。共通のモチーフをコードしているこの領域は、 E1A、シミアンウイルス40のラージＴ抗原、あるいはヒトパピローマウイルスの1 6E7が、ヒトの網膜芽腫遺伝子産物のRB蛋白質に特異的に結合するのにも必要で ある(Whyte et al.，1988; Whyte et al.，1989)。 これらの研究により、さらにneuプロモーターの上流領域でE1Aに誘導される抑 制を仲介するオリゴヌクレオチド配列が明らかになっている。TGGAATG配列はラ ットとヒトのneuプロモーターで完全に保存されており、機能的な重要性を示し ている。さらに、この配列は、転写レベルでE1Aによって抑制を受ける他の遺伝 子の保存配列に一致する。結局、これらの発見は、E1Aが仲介する抑制タイプに 関して共通の機序が存在することを示している。E1Aが細胞内の転写因子と複合 体を形成して、転写因子が転写にとって重要なエンハンサーに特異的に結合する のを変更するという議論がなされてきた(Mitchell et al.，1989)。E1Aが仲介す るneuの転写阻害に関与することが明らかなDNA配列を同定することで、このプロ セスに関与する転写因子の同定が可能になるであろう。 neu癌原遺伝子は明らかに転移性の乳癌患者の体内で増幅する。E1A遺伝子を発 現させると、ras癌原遺伝子によって形質転換されたラットの胚細胞の実験的転 移を阻害できる。つまり、確立されたラットの胚線維芽細胞系Rat-1において、n euの転写がE1A産物により抑制されうることが示されている。さらに、発明者ら は、ヒトの乳癌細胞SK-BR-3において、ヒトneu遺伝子の産物であるp185蛋白質の 発現が、E1A遺伝子の導入によって減少することを発見した。StuI-XhoI断片を用 いた同時形質転換実験において観察された抑制低下効果は、このp185蛋白質の減 少も同じ転写抑制メカニズムによることを明らかにした。 実施例IIアデノウイルス-5 E1A遺伝子産物はneu癌遺伝子のトランスフォーメーション抑 制因子として作用する 実施例Ｉにおいて、過渡的形質転換測定法によると、neu癌原遺伝子の転写が 、アデノウイルス-5 E1A遺伝子産物によって強く抑制されることが分かった。本 実施例では、E1Aが仲介するneu抑制によって、neuが仲介する形質転換活性を抑 えう ることを明らかにするため、neuでトランスフォームされたB104-1-1細胞にE1A遺 伝子を安定的に導入した。これらの実験で、E1A産物を発現する細胞では形質転 換活性と腫瘍形成活性が低下していることが、標準的なアッセイ法を用いて明ら かになった。これらの結果、E1A遺伝子産物がneu癌原遺伝子の形質転換表現を抑 制するようネガティブに作用することが明らかになったが、このE1A遺伝子は、 ある場面ではトランスフォーム癌遺伝子として作用し、別の場面ではトランスフ ォームを抑制する遺伝子として作用する遺伝子の最初の例であると思われる。 B104-1-1細胞系は、突然変異活性をもつneu癌遺伝子をゲノム中に約10-20コピ ーもつNIH 3T3の形質転換細胞であるが、強いトランスフォーム性と腫瘍形成性 をもつことが分かっている(Bargmann et al.，1986; Stern et al.，1986)。本 研究では、B104-1-1細胞とコントロール用のNIH3T3細胞を、アデノウイルス-5 E 1A遺伝子を発現するE1Aプラスミド(pE1A)か、これに由来するプラスミドでE1Aコ ーディング配列を持たずE1Aプロモーターだけを含むプラスミド(pE1Apr)で形質 転換した。細胞はネオマイシン抵抗性のマーカー遺伝子をもつpSV2neoプラスミ ドで同時に形質転換した(Southern et al.，1982)。 形質転換は、チェン(Chen)と岡山(Okayama)による修正リン酸カルシウム沈殿 法(1988)によって行なった。5 x 10⁵個のB104-1-1細胞とNIH 3T3細胞(2 x 10 cm )を形質転換の24時間前にプレートに撒いた。E1Aを発現するpE1AプラスミドDNA あるいはそれに由来するpE1AprプラスミドDNAどちらか10μgと、１μgのpSV2-ne oプラスミドDNAで、細胞を形質転換した(Southern et al.，1982)。形質転換か らおよそ14時間後、細胞を洗って、新しい培地で24時間培養して1:10に分割した 。そして、500μg/mlのG418を含む選択培地の中で細胞を2-3週間培養し、G418抵 抗性コロニーの一つずつを、クローンニングと大量培養によって増殖させた。 このようにして次の３種類の安定した形質転換細胞を作製した。すなわち、(1 )B-E1A形質転換細胞：E1A遺伝子をもつB104-1-1形質転換細胞、(2)B-E1Apr形質 転 換細胞：E1Aプロモーター配列を含むB104-1-1形質転換細胞で、本研究のコント ロール用の細胞系として用いられたもの、(3)N-E1A形質転換細胞：E1A遺伝子で 形質転換したNIH3T3細胞である。 細胞培養は以前に報告されているところに従って行なった(Hung et al.，1989 ; Matin et al.，1989)。B104-1-1細胞系とNIH3T3細胞系は、10％ウシ血清を添 加したダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)中、5％CO₂、37℃の加湿した空気の 中で培養した。B-E1A形質転換細胞とN-E1A形質転換細胞は、G418(500μg/ml)を 培養培地に加えて同じ条件下で培養した。 図６にはサザンブロットと免疫ブロットによって、本研究で用いられた安定形 質転換細胞の代表株の分子的な特徴が示してある。サザンブロットは基本的には 以前説明され、出版された技術を用いて行なった(Zhang et al.，1989)。培養細 胞から抽出したゲノムDNAを２倍過剰量の制限酵素(EcoRI、SstIあるいはBamHIの いずれか)で一晩37℃に置いて消化した。そして、それぞれのサンプル10μgを１ ％アガロースゲルで電気泳動して分離し、10 x SSC(1.5 M NaCl，0.15 M クエン 酸ナトリウム)を用いて、ナイロン膜(Schleicher & Schuell，Keen，NH)にトラ ンスファーした。ブロットしたDNAは非常に厳しい条件下(68℃)、ランダムプラ イマーDNA標識キット(Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN) を用いて[³²P]放射性プローブ(1-5 x 10⁸CPMμg^-1)とハイブリダイズした。ブロ ットした膜は2xSSC，0.1% SDSで室温にて15分間２回洗い、さらに、２回、0.1xS SC，0.1% SDSで68℃にて30分間絶えず振盪しながら洗った。膜は室温で乾燥させ てからコダック(Kodak)社のX-OMAT^TMARフィルムに-80℃で１〜３日間露光した。 免疫ブロットは基本的には以前説明したように(Matin et al.，1990)、出版さ れた技術(Towbin et al.，1979)を用いて行なった。10 cmプレートで集密状態に 増殖した細胞をRIPA-B緩衝液(20 mM リン酸ナトリウム pH 7.4，150 mM NaCl，5 mM EDTA，1% Triton，10 μg/ml Aprotinin，2 mM PMSF，10 μg/ml Leupeptin および4 mMヨード酢酸)中で破砕してから4℃で20分間、10 x gで遠心した。上清 中の蛋白質濃度をバイオーラド蛋白質測定法(Bio-Rad Laboratories，Richmond ，CA)で測定した。各サンプル50μgをSDSポリアクリルアミドゲル(10％)電気泳 動にかけてからニトロセルロースにトランスファーした。ニトロセルロースフィ ルタを3％スキムミルク入りのTPBS緩衝液(0.05% Tween-20，138mM NaCl，2.7mM KCl，4.3 mM Na₂HPO₄・7H₂O，1.4 mM KH₂PO₄)中、室温で１時間処理し、続いて、 E1A蛋白質に対するモノクローナル抗体M73(オハイオ州立大学のL.S．Chang博士 から頂いた)か、neuがコードするp185蛋白質に対するmAb-3（Oncogene Science Inc．Manhasset，NYから購入した）の何れかの一次抗体とともに4℃で一晩イン キュベートした。TPBS緩衝液で10分間ずつ３回洗滌した後、ニトロセルロースを ホースラディシュ・ペルオキシダーゼを結合したヤギ抗マウス免疫グロブリン(Bi o-Rad Laboratories)を1:1000に希釈した緩衝液とともに１時間室温に置いた。 ニトロセルロースフィルタをTPBS緩衝液で３回洗ってから、ホースラディシュ・ ペルオキシダーゼ基質を用いて発色反応させた(Kirkegaard & Perry Laboratori es，Inc.，Gaithersburg，MD)。 外から入れたE1A遺伝子とE1AプロモーターDNAが形質転換細胞のゲノムに組み 込まれたことを確認するために、E1Aプローブを用いたDNAブロット解析を行なっ た結果、形質転換して、外来DNAが組み込まれたことが確認された(図６Ａ)。注 意すべきは、調べられた３種のB-E1A形質転換細胞が異なったコピー数のE1A遺伝 子を獲得したことである。免疫ブロットによるE1Aの検出により、B-E1AおよびN- E1A形質転換細胞が実際にE1A蛋白質を産生することが確認され、また、これらの 形質転換細胞中のE1A蛋白質のレベルは、アデノウイルスDNAによってトランスフ ォームして作製されたヒト胚腎臓の初期細胞系の293細胞系よりも低かった(図６ Ｂ)。 E1Aの発現がneuの発現を阻害できるかを調べるために、neuがコードするp185 蛋白質についても免疫ブロットを行なったが、p185蛋白質は、ホースラディシュ・ ペ ルオキシダーゼ検出法を用いたときは、実質的に検出できなかった(図６Ｃ)。し かし、より高感度の¹²⁵I-プロテインＡ検出法を用いると、B-E1A-3で、B-E1A-1 およびB-E1A-2よりも僅かに高いレベルのp185蛋白質を検出した。p185蛋白質がB -E1A形質転換細胞では殆ど検出されなかったため、neu遺伝子が失われていない ことを確認するためにラットのneu遺伝子に関するDNAブロット解析が行われた。 図６Ｄに示すように、E1A遺伝子のゲノムへの取り込みは、DNAレベルではneu遺 伝子に変更を加えてはいなかった。 ３つのB-E1A形質転換細胞の中でも、B-E1A-2とB-E1A-3は、neu遺伝子について は親細胞系B104-1-1のレベルに匹敵するレベルを示した。一方、B-E1A-1のneu遺 伝子レベルは低いようだった。これは、この形質転換細胞系を確立するうちにne u遺伝子が一部失われたためであろう。図６に示した３つのB-E1A形質転換細胞を さらに形質転換アッセイを行なうために選んだ。なぜなら、これらのB-E1A形質 転換細胞は、３つの異なったサブタイプを表すからである。すなわち、(1)B-E1A -1は、B104-1-1に較べてneu遺伝子のコピー数が少なく、E1A遺伝子のコピー数が 多い。(2)B-E1A-2は、B104-1-1と同じレベルのneuを保持し、高レベルのE1A遺伝 子を持つ。(3)B-E1A-3は、B104-1-1と同量のneuをもつが、E1A遺伝子の量は少な い。 neuでトランスフォームした細胞の転換形質には,通常、形質転換形態、細胞増 殖パターンの接触非阻害、DNA合成率の増加、固着部非依存的な増殖、さらにnu/ nuマウスで腫瘍誘導する能力が含まれる。neuでトランスフォームしたB104-1-1 細胞の形質転換能に対する、E1A発現の影響を測定するために、B-E1A形質転換細 胞とコントロール細胞系について、標準的なプロトコールを用いて上記のトラン スフォームのパラメーターすべてについて測定した。 これらの実験の結果、B104-1-1細胞の高度の形質転換形態は、pE1Aprで形質転 換した後も実質的には変わらなかったが、pE1Aで形質転換したときは顕著に変化 することが明らかになった(図7)。B-E1A形質転換細胞は、非トランスフォーム型 の平坦な形態と接触阻止型の増殖パターンを示す(図７)。NIH3T3細胞でE1A蛋白 質を発現させても、単層形態に有意な変化はなかった。この結果は、E1A遺伝子 産物が、neuでトランスフォームした細胞の形態を特異的に元に戻せることを示 した。 B-E1A形質転換細胞がコントロールに較べて活発にDNAを合成しているか否かを みるために、細胞増殖の目安としてDNA合成も調べられた。これらの実験は[³H]- チミジンアッセイ法を用いて行なった。これらの実験のために、細胞を96ウェル ・プレートに密度9 x 10³細胞/ウェルで、10個のレプリカができるようにプレー トし、10％ウシ血清を添加したDMEMで培養した。16時間、40時間あるいは64時間 経過した時点で、[³H]-チミジン(1μCl)を各ウエルに加えて、37℃で２時間イン キュベートした。そして、細胞を回収して、細胞のDNAをガラス繊維のフィルタ ーに結合させた。各サンプルの放射能をシンチレーション計測器で測定した。10 個の反復サンプルから平均のcpm値を計算した。 DNA合成率は、[³H]-チミジンの取り込みで示されるが、３つのB-E1A形質転換 細胞の間で異なっていた(図８Ａ)。B-E1A-1とB-E1A-2は、非常に低いDNA合成率 を示したが、これはそれらの細胞の増殖がB104-1-1細胞に較べて遅いことと符合 する。このE1Aが原因の[³H]-チミジン取り込みの減少は、E1A蛋白質のレベルが 低いために、B-E1A-3細胞系では顕著ではなかった。これらのデータは、E1A蛋白 質がneu癌遺伝子のDNA合成や細胞増殖に対する効果を阻害できることを示した。 固着部非依存的な増殖に対するE1A蛋白質の影響を調べるために、B104-1-1細 胞とB-E1A形質転換細胞のソフト寒天培地中での増殖能を測定した。B104-1-1細 胞、B-E1A形質転換細胞、NIH3T3細胞およびN-E1A形質転換細胞のソフトアガロー ス中での増殖能を、以前述べたようにして(Matin et al.，1990)測定した。細胞 (1x 10³細胞/プレート)を10％ウシ血清と0.35％アガロース(BRL，Gaithersburg ，MD)を含むDMEMに入れて24ウェル・プレートの0.7％下層アガロースの上に撒い た。この細胞を37℃で３週間インキュベートしてから、プレートをp-ヨードニト ロテト ラゾリウム紫(1 mg/ml)で24時間、37℃で染色し、コロニーを数えた。 ソフトアガー実験の結果、E1A形質転換細胞のコロニー形成数が、B104-1-1やB -E1Apr形質転換細胞に較べて著しく少ないことが明らかになった(図８Ｂ)。留意 すべきは、NIH3T3とN-E1A-1系のコロニー形成にはあまりばらつきがなかったこ とである。 腫瘍形成作用についての最も厳格な実験的テストは、ヌードマウスに注入した 細胞の腫瘍形成能をみることである。インビボにおけるneu媒介の腫瘍形成性をE 1Aが抑制するか否かを調べることがE1Aの有効性にとって決定的だと考えられた ため、ヌードマウス実験を行なった。腫瘍形成実験を行うにあたって、対数増殖 期にあるB104-1-1細胞、B-E1A形質転換細胞、NIH3T3細胞およびN-E1A形質転換細 胞をトリプシン処理し、リン酸緩衝食塩水で２回洗い、250 x gで遠心した。そ して、生存細胞を数えてから0.1 mlのリン酸緩衝食塩水に1 x 10⁵個の細胞を混 ぜて、無菌状態下で５から６週令の雌のホモ接合体nu/nu(ヌード)マウス(Harlan Sprague Dawley Co.)の左右の脇腹に皮下注射した。指示日毎に可視腫瘍塊の有 無を記録して腫瘍形成を調べた。注射後16日目に腫瘍量を３元のカリパス計測値 の積(最長表面長と幅と腫瘍の厚さ)で評価した。腫瘍増殖は最低16日、最長２カ 月間観察された。 親株B104-1-1系細胞をヌードマウスに皮下注射すると、注射後８日目までに固 い腫瘍を形成したが、同量のE1A形質転換細胞は、注射後12-26日経過するまでヌ ードマウスで腫瘍を形成しなかった。そして、いずれの場合も、腫瘍はB104-1-1 細胞の腫瘍よりもずっと小さかった(図９Ａ)。 B-E1A-1とB-E1A-2形質転換細胞は同量のE1A遺伝子をもっているにも拘わらす 、B-E1A-1細胞はずっと後になるまで腫瘍を増殖しなかった。これは多分、この 細胞系ではneu遺伝子のレベルが低いためであろう。他方、B-E1A-2とB-E1A-3両 形質転換細胞はともに、B104-1-1細胞と同じレベルのneu遺伝子を持っているが 、B-E1A -3に対するトランスフォーム抑制効果はB-E1A-2に対するほど強くなかった。こ れはB-E1A-3におけるE1A遺伝子のレベルが低いためだと考えられる。neu癌遺伝 子に誘導される腫瘍形成性に対するE1A発現の典型的な効果が図９Ｂと図11Ａの 写真に示されている。注射後18日目で観ると、B104-1-1細胞を注入した動物には 巨大な腫瘍ができていたが、B-E1A-2形質転換細胞を注入した動物には、かなり 小さな腫瘍節ができただけだった。予想通り、NIH3T3細胞を注射したコントロー ル用動物は腫瘍を形成した徴候を示さなかった。 ウイルムス腫細胞とヒト前立腺癌DU145細胞に関する過去の研究から、ウイル ムス腫細胞には11番染色体を再導入し、ヒト前立腺癌DU145細胞にはRB遺伝子を 回復させると、腫瘍形成は抑制されるが、細胞の形態や増殖率、コロニー形成能 には変化が見られないことが分かっている(Weissman et al.，1987; Bookstine et al.，1990)。これらのデータは培養における増殖率とヌードマウスでの腫瘍 形成性とは別の現象だということを示している。本研究において、B-E1A-1とB-E 1A-2細胞は、ゆっくりした増殖率と非常に弱い腫瘍形成能を示した。しかし、腫 瘍形成性の抑制は、増殖率が悪いことと[³H]-チミジンの取り込みが減少するこ ととで完全に説明することはできない。例えば、B-E1A-3細胞は、B104-1-1細胞 と同じ[³H]-チミジンの取り込み量と細胞増殖率を示すが、前者の腫瘍形成活性 はやはり著しく抑制されている。結局、これらの結果は、E1A遺伝子をB104-1-1 細胞に導入すると、neu形質転換細胞がもつトランスフォーム形質がすべて抑制 されることをはっきり示している。 実施例III E1A遺伝子産物による、neuが仲介する転移(metastasis)の抑制 E1A産物がneu介在による転移をも抑制することを示すために、B104-1-1のB-E1 Aによる形質転換細胞を用いて補足実験を行なった。これらの実験には、B-E1A形 質転換細胞(B-E1A-1からB-E1A-5)ならびにネガティブおよびポジティブコントロ ールとして、それぞれNIH/3T3およびB104-1-1を用いて、細胞運動性、インビト ロでの侵襲性および実験的な転移アッセイを行なった。 転移実験は、主にウェクスラー(Wexler，1966)の述べた通りに行なった。要す るに、６週令の病原菌をもたない雌のヌードマウス(Harland)を一週間隔離して から実験に用いた。一つの実験グループにつき７匹から10匹のマウスに、0.1 ml のPBS中１ｘ10⁵細胞を尾の外側の静脈から接種して０日目とした。そして、それ ぞれの細胞系を、異なった継代回数のときに２回検定した。注射後21日目にマウ スを殺し、染色液(India ink)を染み込ませて肺転移数を測定した。直径が１mm より大きい肺結節のみを数えた。さらに調べても、肺臓外の転移は見られなかっ た。これらの動物から取った肺臓全体の外観の代表的な写真を図11Bに示すが、 これらの実験から得た量的なデータは下の表２に詳しく示す。 neuが介在する転移阻害におけるE1Aの効果が図11Ｂにはっきりと示されている 。さらに、すべての実験はこの結果に代表される。NIH/3T3とE1Aで形質転換した NIH/3T3(N-E1A)を接種したネガティブコントロールマウスはいずれも、転移性の 肺結節を生じなかった。しかし、すべてのポジティブコントロール(B104-1-1とB -neo)は転移性結節を生じ、結節の平均数は約10個であった。これに対して、す べての実験用細胞系(B-E1A-1からB-E1A-5)は、頻度が１から３匹(それぞれ10匹 、９匹のうち)低い転移能を示し、陽性を示した動物の平均結節数は0.1から0.8 個であった。注目すべきことに、２つの細胞系B-E1A-1とB-E1A-3では、全く転移 が見られなかった。 転移能が高くなるのに比例して細胞運動性が増大することが分かっている。し たがって、フィブロネクチンあるいは肺洞様毛細血管の内皮細胞で馴化した培地 などの化学的誘引物質に対する被検細胞の移動を測定する運動アッセイ法を行な った。図10Ａに示されるように、すべてのB-E1A形質転換細胞は、異なった誘引 物質に対してB-neo細胞系の移動度よりも低い移動度を示した。ここで、B-neo細 胞系とは、ネオマイシン抵抗性遺伝子(neo^r)のみで形質転換したB104-1-1細胞で ある。N-E1A細胞もまた、NIH3T3細胞の移動度と同じ程度の低い移動度を示した 。 転移作用の別の段階で組織と基底膜の侵襲が起こる。また、インビトロの侵襲 アッセイにより、B-neo細胞とB-E1A細胞系の重要な差異が明らかになった。B-ne o細胞は、B104-1-1細胞の侵襲性と同様の高い侵襲性を示したが、B-E1A形質転換 細胞はマトリゲル(Matrigel)を侵襲しなかった。B-neo細胞と５つのB-E1A細胞系 をヌードマウスの尾静脈に注射すると、肺結節の頻度と個数に顕著な差異が見ら れた(図10Ｂおよび表２)。５つのB-E1A形質転換細胞のうち２つは、実験的な転 移腫を全く形成せず、他の３つのB-E1A細胞系はB-neo細胞の転移に較べて非常に 低い(p> 0.01)実験転移を起こした。予想通り、N-E1A細胞は転移性肺結節を発生 させることができなかった。これらの結果から、明らかにE1A遺伝子産物は、お そら くneu遺伝子の発現を転写段階で抑制して、neuがトランスフォームした3T3細胞 の転移能を低下させることができる。 図11Ｂで典型的に示されているように、これらの結果から、E1A遺伝子産物は 、neu遺伝子が仲介する腫瘍形成およびトランスフォーメーションの過程を抑制 する(実施例II)だけでなく、さらに、neuが仲介する転移現象を抑制することも できる。 実施例IV E1Aはヒト卵巣癌の重度悪性に関連するc-erbB-2/neuの発現を抑制する。 本実施例は、SKOV3.ip1細胞におけるc-erbB-2/neuの過剰発現の抑制に関するE 1Aの作用と、c-erbB-2/neuを過剰発現しているヒト癌細胞の腫瘍抑制遺伝子とし てのE1Aの機能に関する実験を目的としている。 １．E1Aを発現する卵巣癌形質転換細胞における、c-erbB-2/neuコードのp185の 発現阻害 E1Aを発現するプラスミドを、ネオマイシン抵抗性マーカー遺伝子をもつpSV2- neoプラスミドとともに用いて、SKOV3.ip1細胞を形質転換した。そしてE1A発現 卵巣癌の安定形質転換細胞を作製した。G418抵抗性クローンを選抜して細胞系に 展開し、ip1.E1A細胞系と名付けた。同じ方法を用いてコントロールの細胞系を 選抜した。すなわち、E1Aをコードする配列中に２塩基対のフレームシフト欠失 を含み、無機能な蛋白質産物を産生するpE1Ad1343プラスミドをSKOV3.ip1細胞に 導入してip1.Efs細胞系を作製した。 この同時形質転換法で選抜された安定的形質転換細胞には、ネオマイシン抵抗 性遺伝子のみをもち、E1A遺伝子をもたないというものもあり得る。したがって 、E1A遺伝子が組み込まれ、実際にE1A蛋白質を産生するip1.E1A形質転換細胞を 同定するために、抗E1A抗体を用いた免疫ブロット解析を行なった(図12Ａ)。ハ ーローら(Harlow et al.，1985)が述べたように、２つのip1.E1A形質転換細胞が 複数種のE1A蛋白質を発現し、一方、コントロールのip1.Efs細胞系は、予想通り E1A蛋白 質を発現しなかった。 このようにして、発明者らは２種の安定した形質転換細胞を確立した。すまわ ち、(a)ip1.E1A細胞(すなわち、E1Aを発現するSKOV3.ip1細胞の形質転換細胞)で 、これはE1Aの腫瘍抑制機能をテストするために用いられた。また、(b)ip1.Efs 細胞(すなわち、E1Aのフレームシフト変異をもつSKOV3.ip1細胞の形質転換体)は 、コントロール用の細胞系として、もしip1.E1A形質転換細胞のトランスフォー メーション形質に変化が見られても、選抜過程やプラスミドおよびpSV2-neo遺伝 子による形質転換が原因ではないことを確認するために用いた。 ここで示されるように、E1A蛋白質は、c-erbB-2/neu発癌遺伝子でトランスフ ォームしたNIH3T3細胞で、c-erbB-2/neuがコードするp185の発現を抑制すること ができる。さらに、c-erbB-2/neuを過剰発現する乳癌細胞系において、E1A蛋白 質がc-erbB-2/neuのコードするp185だけでなく、c-erbB-2/neuのmRNA量も減少さ せ得ることがここで示されている。ip1.E1A形質転換細胞におけるE1Aの発現がp1 85の発現を阻害するかを判定するために、c-erbB-2/neuコードのp185蛋白質の免 疫ブロットを行なった。 p185蛋白質のレベルは、ip1.E1A1細胞系においても、ip1.E1A2細胞系において も、コントロールのip1.Efs細胞系に較べて極端に減少していることが分かった( 図12Ｂ)。コントロールのip1.Efs細胞は、親株SKOV3.ip1細胞系と同程度に、c-e rbB-2/neuにコードされたp185蛋白質を発現していた。ip1.E1A形質転換細胞にお いてp185蛋白質が顕著に減少したため、このc-erbB-2/neuコードのp185蛋白質の レベルの低下が、c-erbB-2/neu遺伝子の喪失によるものではないことを確認する ために、c-erbB-2/neu遺伝子のDNAブロット解析を行なった。図12Ｃに示される ように、ip1.E1A1細胞系もip1.E1A2細胞系も、ip1.Efs細胞系と同じコピー数のc -erbB-2/neu遺伝子を持っていた。したがって、SKOV3.ip1細胞のゲノムへのE1A 遺伝子の取り込みは、DNAレベルでc-erbB-2/neu遺伝子を変えてはいなかった。 さらに、 これらの結果、E1Aが、1.E1A形質転換細胞において、c-erbB-2/neuコードのp185 蛋白質の発現を抑制しうることが示された。 ２．E1A発現による、SKOV3.ip1細胞トランスフォーメーションのインビトロでの 抑制 E1Aを発現するip1.E1A細胞が確立されると、発明者らは、c-erbB-2/neuを過剰 発現する卵巣癌細胞に対するE1A発現の効果をインビトロで調べて、細胞増殖性 、DNA合成速度、および、ソフトアガー中でのコロニー形成を測定した。E1Aを発 現するip1.E1A1およびip1.E1A2細胞系と、コントロール用のip1.Efs細胞系の増 殖曲線は、E1A発現が、これら卵巣癌細胞の増殖速度をコントロール細胞に較べ て僅かに低下させることを示した(図13Ａ)。DNAの合成速度を[³H]チミジン取り 込みアッセイで測定したところ、コントロールのip1.Efs細胞は、SKOV3.ip1細胞 と同じ高レベルで[³H]チミジンを取り込み、E1Aを発現するip1.E1A1およびip1.E 1A2細胞系における[³H]チミジン取り込みより有意に高かった(図13Ｂ)。 図13Ｂは、c-erbB-2/neuを発現しているip1.Efs細胞細胞が、高効率でソフト アガーコロニーを形成したことを示す一方で、ip1.E1A形質転換細胞のコロニー 形成効率が著しく低下したことを示している。これらのデータは、E1A蛋白質が 卵巣癌細胞におけるc-erbB-2/neuの過剰発現効果を抑制しうることを示唆し、ま た、細胞増殖、DNA合成および固着部非依存的増殖を阻害することを示唆した。 ３．c-erbB-2/neuを過剰発現するヒト卵巣癌SKOV3.ip1細胞に対する腫瘍抑制因 子としてのE1A 卵巣癌細胞における、E1Aが仲介するトランスフォーメーション抑制機能に不 可欠なテストは、インビボで、E1Aに腫瘍形成を抑制する能力があるかをみるこ とである。そこで、E1Aを発現するip1.E1A1およびip1.E1A2細胞系、あるいはコ ントロールのip1.Efs細胞系のいずれかから採った3×10⁵個の細胞を、上記の方 法で注射したマウスを用いて、腫瘍発生アッセイを行なった(図14Ａ)。親細胞SK OV3.ip1を 注射されたマウスと同じように、コントロールのip1.Efs細胞細胞を注射された マウスは注射後７日で腫瘍を形成し、注射後80日までに3280±1310 mm³の巨大な 腫瘍量を生じた。しかし、同数のip1.E1A1形質転換細胞を注射されたnu/nuマウ スは、注射後21〜31日まで腫瘍を形成せず、注射後80日が経過しても腫瘍の大き さは、僅か460±170 mm³だった。 E1Aの腫瘍抑制機能は、ip1.E1A2形質転換細胞を注射されたマウスにおいて一 層顕著で、注射後40〜50日まで腫瘍を誘導せず、６匹のうち２匹のマウスは、注 射後160日が経過しても、全く腫瘍を形成しなかった。ip1.E1A2を注射された４ 匹のマウスの注射後160日目の腫瘍の大きさは、290±220 mm³であった。したが って、これらの結果は、E1Aが卵巣癌SKOV3.ip1細胞の腫瘍形成能を抑制できるこ とを明確に示した。 SKOV3.ip1細胞は、SK-OV-3細胞に較べると、これを腹膜内注射されたnu/nuマ ウスに高い致死率と短い生存期間をもたらす。SKOV3.ip1細胞でのE1A発現がc-er bB-2/neu過剰発現を抑制できるか、また、死亡率を低下させることができるかを 判定するために、発明者らはE1Aを発現しているip1.E1A1とip1.E1A2細胞系、お よびコントロールのip1.Efs細胞系を腹腔内注射によってマウスに投与した。1× 10⁴個のip1.Efs細胞をマウスに投与すると、前の段落で述べたのと同様の腫瘍症 状を起こし、一匹のマウスは注射後19日で腫瘍のために死に、注射後75日以内に すべてのマウスが死んだ(図14Ａ)。しかし、E1A形質転換細胞系を注射したマウ スは、SKOV3.ip1親細胞やフレームシフト形質転換細胞ip1.Efs細胞系を注射した ものに較べて、生存率がかなり増加した(P<0.01)(図14Ｂ)。この結果、E1A発現 によって、c-erbB-2/neuを過剰発現するヒト卵巣癌細胞を注射したマウスの死亡 率を抑えられることが示された。 ４．検討 本発明者らは、ヒト卵巣癌SK-OV-3細胞を注射したマウスの腹水から、SKOV3.i p1と名付けた派生細胞系を分離した。SK-OV-3親細胞に較べて、SKOV3.ip1細胞系 は、c-erbB-2/neuがコードするp185蛋白質を高レベルで発現し、これに関連して 、インビトロのアッセイで測定しても、インビボのアッセイで測定しても、より 悪性の形態を示す。c-erbB-2/neu発現を促進すると悪性がひどくなるという関係 は、卵巣癌患者の予後の悪さにも比例する(Slamon et al.，1989)。 発明者らのデータは、c-erbB-2/neuの過剰発現を卵巣癌患者の予後因子として 用いたり、卵巣癌のようなある種のヒトの悪性疾患の発病においてc-erbB-2/neu が重要な役割を担うという臨床的な研究を支持する実際的な証拠を提供した。本 請求の範囲に係わる発明を利用する上では重要ではないが、c-erbB-2/neuの過剰 発現とそれに関連する悪性形質に関する分子的機構と生化学的経路をさらに研究 することは興味深い。最近、c-erbB-2/neuがコードするp185蛋白質に対するリガ ンドが同定され、分子的にクローニングされた。これはp185中のチロシンのリン 酸化を促進する。これによって、将来、ヒトの癌や癌転移におけるc-erbB-2/neu 過剰発現の分子的機構と生物学的効果を直接調べることができるであろう(Peles et al.，1992; Holmes et al.，1992; Lupe et al.,1990; Yarden &Peles，199 1; Huang & HUang，1992; Dobashi et al.，1991)。 アデノウイルスE1A遺伝子は、始め、初期胚の線維芽細胞のras同時形質転換実 験で、myo癌遺伝子やシミアンウイルス40のラージ腫瘍抗原に代わりうるトラン スフォーム癌遺伝子として定義された(Land et al.，1983; Ruley，1983; Weinb erg，1985)。ここで詳述したように、発明者らはE1A産物が、突然変異によって 活性化された、ラットのneuでトランスフォームしたマウスの3T3細胞のトランス フォーメーションと転移を抑制する因子として作用しうることを発見した。特に この実施例においては、さらに、E1A遺伝子産物が、SKOV3.ip1卵巣癌細胞におけ るc-erbB-2/neu遺伝子の発現を効果的に抑制して、インビトロでトランスフォー メーション形質を抑え、インビボで腫瘍形成率と死亡率を低下させることを明ら かに した。これらの結果、アデノウイルスE1A遺伝子は、c-erbB-2/neuを過剰発現す るヒト癌細胞の腫瘍抑制遺伝子として機能し、また、齧歯類の細胞で突然変異に よって活性化されるneu癌遺伝子に誘導されるトランスフォーメーションを阻害 する遺伝子として機能することが示された。 発明者らは、以前、ヒト乳癌細胞系で、E1A産物が、c-erbB-2/neuのmRNAレベ ルとc-erbB-2/neuがコードするp185の発現を顕著に阻害することを明らかにし、 E1A遺伝子産物が、neu遺伝子プロモーター中の特異的なDNA因子を標的にして、 転写レベルでneu遺伝子の発現を抑制しうることを示してきたが、ip1.Efs細胞系 でp185の発現が低下するのは、c-erbB-2/neu遺伝子の過剰発現を転写レベルで抑 制するためと考えられる。これは、SKOV3.ip1卵巣癌細胞におけるE1Aの腫瘍抑制 機能を説明する、さまざまな分子的機構の一つかもしれない。興味深いことに、 アデノウイルスのE1Aによって、ハムスターの細胞系はナチュラルキラー細胞や マクロファージに破壊されやすくなり(Cook et al.，1984; Sawada et al.，198 5)、形質転換したNIH3T3細胞の腫瘍壊死因子による細胞毒性に対する感受性が高 くなることが示されてきた(Cook et al.，1984)。したがって、E1Aの腫瘍抑制機 能は、ある程度、細胞破壊性のリンパ様細胞および分子に対する感受性の増加に よることが考えられる。 最近、E1A蛋白質が、プログラムされた細胞死(アポトーシス)に似た細胞障害 応答を誘導することが示された(Rao et al，1992)が、これもE1Aの腫瘍抑制機能 に役立っているだろう。さらに、E1Aが、互いに関連のない３つの型のヒトの癌 細胞をトランスフォームできない状態に変化させると報告されている(Frisch，1 991)。これは、E1Aが、c-erbB-2/neuを過剰発現していない、ある種のヒト癌細 胞でも腫瘍抑制因子として機能しうることを示している。c-erbB-2/neuがコード するp185蛋白質と結合する増殖シグナルが、これらのヒトの癌細胞の中で活性化 されるか否か、そして、E1Aが、c-erbB-2/neu発現を抑制しながら、p185蛋白質 に関連した シグナル伝達経路を阻害して、これらヒト癌細胞のトランスフォーム形質を抑制 するのか、あるいは、他の機構によって、ある種のヒト癌細胞で、E1Aが腫瘍形 成を抑制するのかは未だ明らかではない。別の分子的機構が関与する可能性はあ るが、これらの結果は、E1Aが、c-erbB-2/neuを過剰発現しているヒト卵巣癌細 胞にとって腫瘍抑制遺伝子であることを確証し、E1Aがこれらのヒトの癌を治療 するための治療薬となりうることを示している。 細胞性の「E1A様」因子があり、ある種の細胞型においてE1Aの機能を模倣するら しいという見解が出されている(Nelson et al.，1990)。E1Aとc-mycに共通する 多くの性質があることから、c-myc遺伝子産物は細胞の中にある、E1A蛋白質の類 似体かもしれないと考えられる。これらの共通の性質には以下のものが含まれる 。すなわち、E1Aとc-mycは同じ構造モチーフを持ち(Figge and Smith，1988; Fi gge et al.，1988)、E1Aもc-mycも、ras癌遺伝子とともに、初期胚の線維芽細胞 をトランスフォームでき(Land et al.，1983; Ruley，1983)、どちらもヒトのRB 遺伝子産物であるRB蛋白質に特異的に結合でき(Whyte et al.，1988; Rustgi et al.，1991)、どちらもある種の細胞型でアポトーシスを誘導でき(Rao et al.， 1992; Frisch，1991; Nelson et al.，1990; Figge and Smith，1988; Figge et al.，1988; Whyte et al.，1988; Rustgi et al.，1991; Evan et al.，1992) 、また、どちらもある種のトランスフォームされた細胞系のトランスフォーメー ションを阻害することが明らかになっている(Frisch，1991; Nelson et al.，19 90; Figge and Smith，1988; Figge et al.，1988; Whyte et al.，1988; Rustg i et al.，1991; Evan et al.，1992; Suen and Hung，1991)。さらに、発明者 らは、E1A蛋白質と同様、c-myc遺伝子産物もc-erbB-2/neu遺伝子の発現を転写レ ベルで抑制でき、その結果、neu誘導によるトランスフォーム形態が、NIH3T3細 胞で元に戻ることを発見した(Wang et al.，1991)。c-mycがc-erbB-2/neuを過剰 発現するヒトの癌細胞の悪性化を抑制しうるかは、発明者らが確かめようとして いる興味 深い問題である。 E1Aは、Rb遺伝子産物と複合体になり、RB蛋白質のリン酸化を誘導してRb腫瘍 抑制遺伝子を不活化できる(Whyte et al.，1988; Rustgi et al.，1991; Evan e t al.，1992; Suen and Hung，1991; Wang et al.，1991)。このため、最近、発 明者らは、RBもc-erbB-2/neuの発現を制御しているか調べた。E1A同様、RBもc-e rbB-2/neu遺伝子の発現を転写レベルで抑制できる(Yu et al.，1992)。E1AとRB に応答するシス作用因子は異なっているが、互いに僅か数塩基対しか離れていな い。c-erbB-2/neuの転写を調節するために、E1AとRBが互いに相互作用している 可能性をさらに調べることは興味深いことであろう。 アデノウイルス5に近い血清型をもつアデノウイルス2のE1A遺伝子は、rasでト ランスフォームしたラットの胚細胞の転移能を低下させることが示されている(P ozzatti et al.，1988)。Ad-2 E1A遺伝子が、転移形質とnm23の発現に寄与する 一つ以上の遺伝子を調節するとの仮説が立てられた。nm23は、ある種の細胞型に おける低い転移能に関係する遺伝子で、後に、E1Aを発現している、rasでトラン スフォームしたラットの胚細胞での発現が高くなる遺伝子である(Steeg et al. ，1988)。発明者らは、E1Aがc-erbB-2/neu遺伝子の発現を抑制し、c-erbB-2/neu でトランスフォームした3T3細胞の転移能を抑制することを発見したが、親細胞 である、rasでトランスフォームしたラット胚細胞、および、E1Aを発現する、ra sでトランスフォームしたラットの胚細胞におけるc-erbB-2/neu遺伝子の発現レ ベルは未だ明らかではない。つまり、現時点では、c-erbB-2/neu遺伝子発現が、 rasでトランスフォームしたラット胚細胞における転移抑制機能に役立っている か否か明らかではない。 ヒトの乳癌および卵巣癌における、c-erbB-2/neuの過剰発現と臨床結果の悪さ の間の相関関係についての興味深い問題の一つは、c-erbB-2/neuの過剰発現が、 攻撃性の強い腫瘍の結果なのか、あるいは腫瘍の攻撃性の原因なのかという点で ある。ここで示したデータは、攻撃性の強い腫瘍の病原における、c-erbB-2/neu 過剰発現の役割は直接的なものであることを裏付けている。まず、SK-OV-3細胞 系とその派生細胞であるSKOV3.ip1細胞系とを較べると、c-erbB-2/neuの発現レ ベルの上昇と、インビトロおよびインビボで測定した形質の悪性度の増加との間 に直接的な関係があることが分かった。次に、E1Aを発現するip1.E1A細胞におけ るc-erbB-2/neuの発現が顕著に抑制されることによって、これらの細胞の悪性は 消失した。結局これらの観察事実は、悪性度の強い腫瘍パターンにおいて、c-er bB-2/neuの過剰発現がその原因であることを物語っている。c-erbB-2/neuを過剰 発現している卵巣腫瘍はより悪性であるから、c-erbB-2/neuがコードするp185を 過剰発現する腫瘍をもつ患者には、より攻撃的な治療が適している。 実施例V Neu PromoterのLTによる抑制 １．材料および方法 ａ．細胞培養 NIH3T3、B104-1-1およびRat-1細胞は、５％CO₂とダルベッコの修正イーグル培 地(DMEM/F-12)に10％ウシ血清と100 IU/mlペニシリンおよび100 IU/mlストレプ トマイシンを添加したもので維持した。薬剤選抜したプラスミドで形質転換した 細胞を、上記の培地に400mg/ml G418を加えたもので培養した。 ｂ．プラスミド 次のプラスミドについて説明されている。すなわち、neu欠失-CAT構築物(Suen et al.，1990)、EGF受容体-CAT構築物のpERCAT-9(37)、活性化ゲノミックneuを コードするプラスミドcNeu-104(Hung et al.，1986)、および、コントロールの 濃度調節用プラスミドpSV2E(Suen et al.，1990)。LTをコードするプラスミド、 pZ189あるいはpVU-0を２つ用いたが、どちらも結果は同じだった。プラスミドpV U-0(Seidman et al.，1985)および変異LTをコードするプラスミドpK1とpK7(Ka lderon et al.，1984)は、リビングストン博士(Dr.Livingston)の厚意により頂 いたものである。 ｃ．安定形質転換細胞 薬剤選抜プラスミドpSV2neoを、LTをコードするプラスミドとともにB104-1-1 細胞に入れて、同時形質転換した。形質転換体のプレートを48時間後にトリプシ ン処理し、４枚のプレートに分けた後、400 mg/ml G418入りの培地で維持した。 ３週間後、コロニーを単離して、G418入りの培地で安定させた。 ｄ．過渡的形質転換とCATアッセイ 修正リン酸カルシウム沈殿法(Cheng et al.，1987)を用いて、細胞を形質転換 した。形質転換後48時間で細胞を回収し、凍結融解によって細胞抽出物を得た。 LTを含む形質転換実験では、抽出物の一部（アリコート）を用いて蛋白質濃度を 測定した。等量の蛋白質を含む、抽出物のアリコートをCATアッセイに用いた(Go rman et al.，1982)。形質転換とCATアッセイは３回から４回反復し、代表的な データが示されている。 ｅ．免疫ブロッティング 既述されているところに従って免疫ブロッティングを行なった(Matin et al. ，1990)。10cmプレートで増殖した集密状態の細胞を洗滌して、溶解用緩衝液で 溶解して、100mgの蛋白質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ニトロセ ルロースにトランスファーした。p185の発現を検出するため、ブロットを抗neu 抗体(c-neu，Ab-3，Oncogene Science，Manhasset，NY)とインキュベートした後 、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼを結合した二次抗体のヤギ抗マウス抗体 と反応させた。さらに、このニトロセルロース膜を、ホースラディシュ・ペルオ キシダーゼの基質である4-クロロ-1-ナフトールおよび過酸化水素を用いて発色 させた。LT抗原の発現を解析するためには、ブロットをLTに特異的なモノクロー ナル抗体(SV40 T-Ag，Ab-2，Oncogene Science)で検出した。、ブロットしたフ ィルターを １mg/ml[¹²⁵I]-プロテインＡとともにインキュベートした。さらに洗滌した後、 フィルターを乾燥してオートラジオグラフィーにかけた。 ｆ．サザンブロッテイング 既述のように、ゲノムDNAを細胞から取り出して、サザンブロッティングを行 うためにBamHIで制限消化した(Zhang et al.，1989)。³²P標識したラットのcDNA プローブとハイブリダイズさせた。 ｇ．フォーカス形成アッセイ 既述のように(Yu et al.，1992)、フォーカス形成アッセイを行なった。コス ミドクローンcNeu-104(Hung et al.，1986)は、2.2 kbのneuプロモーターを含む 30 kbの活性neuのラットゲノム配列をもっている。cNeu-104(0.5 mg)は、0.1 mg の薬剤選抜プラスミドのpSV2neo、および、5-10 mgのLT変異配列をコードするプ ラスミド(pK1)またはコントロール用プラスミドpSV2Eとともに正常な線維芽細胞 (Rat-1細胞)の形質転換に用いられた。細胞を48時間後にトリプシン処理し、４ 枚のプレートに分けた。２枚のプレートは、通常の培地で維持したが、他の２枚 はG418を添加した培地中で維持した。３週間通常の培地で維持した細胞は、非形 質転換細胞の単層のバックグランドの上に、形質転換細胞のフォーカスを出現さ せた。G418抵抗性のコロニーが、G418培地で培養しているプレートに出現した。 フォーカスとG418抵抗性コロニーは、１％クリスタルバイオレットで染色してか ら数を数えた。形質転換効率を標準化するために、各形質転換実験毎に形成され たフォーカス数をG418抵抗性コロニー数で割った。 ２．結果 ａ．LTはp185を過剰発現している細胞でneuがコードするp185のレベルを低下 させた。 neuコードのp185を過剰発現している細胞でのLTの効果を調べるために、LTを コードしているプラスミドpZ189(SV40のプロモーターによって制御を受ける)を 、 pSVneo(ネオマイシン抵抗性遺伝子をコードするプラスミド)とともにB104-1-1細 胞を形質転換するのに用いた。B104-1-1は、突然変異によって活性化されたラッ トのゲノムneu癌遺伝子でトランスフォームしたNIH3T3に由来している(Shih，et al.，1981; Hung et al.，1986)。B104-1-1細胞はneuコードのp185を高レベル で発現し、表現形質上もトランスフォームされており(Padhy et al.，1982; Shi h et al.，1981)、腫瘍形成性が高く(Yu et al.，1991; Hung et al.,1989)、転 移能も増加している(Yu et al.，1991; Yu et al.，1992)。LTで形質転換され、 G418抵抗性のB104-1-1細胞を３週間後にクローン化し、このクローンから展開し た２つの細胞系(BTn14およびBTn16と名付けた)を、LTおよびp185の発現に関して 解析した。抗LT抗体(SV40 T-Ag，Ab-2，Oncogene Science)を用いたLT溶解物の 免疫ブロッティングによって、111 kdより小さな分子量の２本のバンドが検出さ れ、BTn14およびBTn16においてLTが発現していることを示した(図15Ｂ、レーン １と２)。２本のバンドは、以前報告された(Livingston et al.，1987)ように、 LTのリン酸化の態様が異なるためであろう。コントロール用細胞系のBEn5は、B1 04-1-1細胞をpSV2neoおよびpSV2E(pZ189と同じコントロールプラスミドで、SV40 プロモーターをもつが、LTのコーディング領域を欠いている)で形質転換して作 製したものである。予想通り、BEn5とNIH3T3細胞はLTを発現しなかった(図15Ｂ 、レーン３と４)。 これらの細胞系におけるneuコードのp185のレベルを、全細胞溶解物をモノク ローナル抗p185抗体(c-neu，Ab-3，Oncogene Science)で免疫ブロッティングし て解析した。この抗体は、p185のＣ末端を認識する。コントロール細胞系のBEn5 は、親細胞B104-1-1と同様に(データは示さない)、ラットのneuコードのp185を 高レベルで発現している(図15Ａ、レーン３)。この抗体と検出システムを用いる と、ネガティブコントロール用細胞NIH3T3では、p185の発現は見られなかった( 図15Ａ、レーン４)。LT抗原を発現している２つの細胞系(BTn14およびBTn16細胞 系)では、p185の発現レベル(図15Ａ、レーン１と２)は、LTを発現しないBEn5細 胞と較べる と有意に低かった。LTで形質転換された細胞でのp185発現は、ほぼ60％から80％ 減少した。 p185の発現が減少したのは、ラットゲノムのneu癌遺伝子のコピー数が減った せいではないことを確かめるために、これらの細胞中のneuDNAのレベルを、サザ ンブロットティングによって解析した。BTn14とBTn16細胞系におけるラットのゲ ノムneu癌遺伝子のレベル(図15Ｃ、レーン1と2)は、BEn5細胞系のレベルに等し かった(図15Ｃ、レーン３)。コントロールとして用いられた親細胞NIH3T3には、 ラットのneuDNAはなかった。これらの実験から、本来はneuコードのp185を高レ ベルで発現する細胞の中でLTが安定して発現すると、その結果p185のレベルが低 下し、c-mycやE1Aと同様にneu発現を抑制する。 ｂ．LTは特異的にneuプロモーターを阻害する。 LT抗原がラットneuの発現を転写レベルで阻害するか否かを判定するために、L Tのneu配列の上流領域に対する効果を、過渡的形質転換アッセイを用いて実験を 行なった。NIH 3T3細胞を、T抗原をコードするプラスミド(pVU-0あるいはpZ189) (Kalderon et al.，1984)、および、2.2 kbのラットneuの上流調節領域とレポー ター遺伝子のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を つないだプラスミド(pNeuEcoRICAT)(Suen et al.，1990)で形質転換した。コン トロールのプラスミドpSV2Eは、同時形質転換における濃度を調節するための調 節プラスミドとして用いられた。LTプラスミドを10倍過剰に入れると、2.2 kbの neuプロモーターの活性を80％阻害した(図16、レーン1と2)。LTの阻害活性はneu 特異的であった、なぜなら、同量のLTを入れても、上皮増殖因子レセプターの調 節配列(pEGFrCAT)(Johnson et al.，1988)の活性に影響しなかったからである( 図16、レーン3と4)。さらに、LTの量を増加するとpEGFrCATのCAT活性が低下する こと(図17)から、LTはneuの調節配列の活性に用量依存的効果をもった。このよ うに、LTはラットのneuプロモーターの活性を特異的に阻害する。 ｃ．LTによるneuの抑制は、xhoI-NarI領域に媒介される。 LTに応答する2.2 kbのneuの調節配列がマップされた。このために、neuの調節 配列-CATの連続したデリーション構築物を(図18Ａ)(Suen et al.，1990)LTをコ ードするプラスミドと一緒にNIH3T3に入れて同時形質転換した。図18Ｂは、neu- デリーション構築物それぞれのCAT活性と、LT存在(pVU-0あるいはpZ189)下での 、この活性の阻害を示す。pneuXbaICATとpneuEcoRV2CATを除いて、殆どのneu-デ リーション構築物で、70％〜80％のCAT活性阻害が見られた。実験を繰り返すう ちに、発明者らは、これら２つの構築物ではLTによる抑制が少ないことに気づい た。全体的に見て、すべてのデリーション構築物の活性が、pneuXhoICATも含め て、LTによって抑制された。これは、LTによるneuの抑制が、ラットneuプロモー ターのxhoI-NarI領域の94塩基対(一番目のATGから見て-172から-79)の配列の媒 介によることを示している。 Ｓ１プロテクション実験によって、neuプロモーター中の４つの転写開始部位 が同定された。このうち２つの主要部位(-158から-147)を含む３つの部位は、Xh o I部位から30 bp以内の下流にあった(Suen et al.，1990)。Bal31消化(Yanisch- Perron et al.，1985)を用いてXhoI部位の下流のヌクレオチドをさらに削った。 すると、neuプロモーターの活性が顕著に低下した(データは示さない)。したが って、neuのxhoI-NarI領域にラットのneu遺伝子の最小プロモーターが広がって おり、LTがこの最小プロモーターの活性を阻害する。 ゲルシフトアッセイによって、94塩基のxhoI-NarIDNA断片は、NIH3T3細胞の核 抽出物中の蛋白質と特異的に複合体を形成することが示された(図19、レーン１) 。このＡという複合体は、転写開始に関係するDNA-蛋白質の分子量の大きい複合 体を検出できることが以前示された(Dynlacht et al.，1991)、孔径の大きなゲ ル(4.5％ゲルでアクリルアミド:ビスアクリルアミド=80:1)を用いると検出でき るが、小さな孔径のゲル(アクリルアミド:ビスアクリルアミド=29:1)では検出で きない (データは示さない)。これはＡが、neuの転写開始または伸長因子を含む大きなD NA-蛋白質複合体であることを示唆している。しかし、このゲルシフトアッセイ では、LTを発現する細胞であるBTn14細胞系からの核抽出物も、同じDNA-蛋白質 複合体のプロフィールを持つ(図19レーン３)。したがって、核抽出物の中にLTが あっても、Ａ複合体の移動度に影響しなかった。これに対する一つの説明は、Ａ 複合体が大きすぎるためにLT(BTn14細胞からの核抽出物)があっても、移動度に 目に見える違いを与えない。実際、Ａ複合体はゲルの最上部近くに現れ、ブロー ドなバンドになることから、複数のタイプのDNA-蛋白質複合体があると思われる 。別の可能性としては、蛋白質因子のリン酸化に変化を加える、あるいは、ゲル シフトアッセイでは検出できないいくつかの因子のコンフォメーションを変える など、LTがxhoI-NarI断片の部位で、間接的あるいは微妙な影響をＡ複合体に与 えるというものである。 ｄ．LT(K1)の非トランスフォーム変異体はneu抑制因子である。 LTおよびRbは、蛋白質複合体を形成し(DeCaprio et al.，1988)、Rbはneu発現 を変更もする(Yu et al.，1992)。このため、LT-RB複合体がneu抑制に関与する と予想されよう。このことを調べるために、入手可能なLT変異体(K1)を利用した 。K1はRbに結合するのに必要な領域(LTの105-114番目のアミノ酸)に内の１アミ ノ酸が変化している（図20Ａ)(Kalderon et al.，1984)。K1は、Rbと複合体形成 できない変異LT蛋白質を発現しており(DeCaprio et al.，1988)、Rat-1細胞でフ ォーカス形成アッセイを行なったところ、トランスフォーメーション欠損体であ った(Kalderon et al.，1984; Cherington et al.，1988)。pneuXhoICATを野生 型LTをコードするプラスミド(pVU-O)、あるいは変異LT(K1)とともにNIH3T3細胞 の形質転換に用いた。驚いたことに、K1は、野生型LTと同じ位効果的にneuを抑 制した(図20Ｂ)。したがって、LTとRbが複合体を形成することは、LTが仲介する neu抑制に必要ではない。 K1は、野生型LTと異なり、フォーカス形成アッセイにおいて、Rat-1細胞をト ランスフォームできなかった(Kalderon et al.，1984)。したがって、上記の結 果は、K1がRat-1細胞の中で、活性化neuのトランスフォーメーション抑制因子と して機能するのかという興味深い疑問を生じさせる。この可能性を調べるために 、ゲノムneuをもち、安定的に形質転換するK1の効果を測定するために、フォー カス形成アッセイが行われた。プラスミドcNeu-104は、膜移行部位に一箇所の突 然変異をもつ活性化ゲノムneuをコードしており、2.2 kbのneu上流の調節配列に よって制御を受ける(Hung et al.，1986)。cNeu-104を正常なRat-1の線維芽細胞 に導入するにあたって、これらの細胞で活性化neuを発現するものを形質転換し た。すると、3-4週間後、正常な単層細胞のバックグランド中に目に見えるフォ ーカスを形成した。cNeu-104とともに、K1でRat-1細胞形質転換すると、cNeu-10 4が形成するフォーカス数を50％減少させる(図20Ｃ)。K1のみで形質転換したと きは、フォーカス数は減らない。野生型LT自体が形質転換フォーカスをRat-1細 胞で形成するという事実(データを示さない)が、neuのトランスフォーム活性の 野生型LT(pVU-O)による抑制を複雑にするため、このデータを解析することを不 可能である。したがって、Rbと複合できない変異LTは、活性化neuのトランスフ ォーメーション抑制因子として作用するため、臨床的には最も有用なLT遺伝子産 物である。 ３．検討 これらの実験の結果、ラットのneuプロモーターの機能が、トランスフォーム 作用をもつウイルス癌蛋白質のSV40 LT抗原によって抑制されることを明らかに している。LTのこの活性は、アデノウイルス５のE1Aとc-myc癌遺伝子で観察され たところと同じで、これらとLTは、いくつか同じ構造と機能を持つが、顕著な違 いもある。LTの阻害活性は、LTで形質転換した安定細胞系で、neup185とLT蛋白 質の発現が反比例しているもので明らかである。したがって、細胞内でのLTの発 現は、neuがコードするp185の細胞中での発現低下をもたらす。 LTは最小neuプロモーターの活性を抑制することで、neuを阻害する。neuの上 流調節配列の連続的デリーションアッセイは、LTによる抑制が94塩基対のneu遺 伝子のXhoI-NarI領域によって仲介されることを明らかにした。この領域はxhoI 部位から30 bp下流に最小プロモーターを含んでいる。この結果は、c-mycおよび E1Aでの結果とは異なっている。というのは、これらはneuの調節配列の上流領域 を通してneuを抑制しているからである。このようにLTはc-mycおよびE1Aとは異 なった経路でneu抑制に介在する。したがって、これらの構造的に似ている癌遺 伝子が、neuの調節配列の異なった領域に作用して、neuプロモーターの活性を抑 制している。上皮細胞増殖因子レセプターのプロモーターおよびneuのプロモー ターにはいくつか共通の性質がある(Suen et al.，1990; Johnson et al.，1988 )が、LTは上皮細胞増殖因子レセプターのプロモーター活性を阻害しなかった。 したがって、LTはある種の増殖因子のレセプターのプロモーターに特異的に影響 をあたえる。 LTは、２つの主要な転写開始部位の上流の最小配列のみを含むXhoI-NarI領域 によってneuの抑制に介在するため、LTがneuプロモーターからの転写開始および 伸長に変更を加えることは可能である。LTがAP-2のような細胞の転写因子と相互 作用して、その機能を失わせることが知られている(Mitchell et al.，1987)。 しかし、XhoI-NarI領域内の94bpの配列を調べたところ、AP-2に有意に相同なモ チーフは見られなかった(Suen et al.，1990)。 実施例VI LTによる、neuの介在する癌の抑制 １．LTによる、neuが介在する癌のマウスにおける抑制 発明者らは、雌のホモ接合体nu/nu(ヌード)マウスにおいて、pK1がneuを発現 しているヒトの卵巣癌細胞(SK-OV-3)の増殖および転移を抑制する能力に関する 研究を目下行なっているところである。SK-OV-3細胞は、ヌードマウスにおいて 、neuを高レベルで発現させ、非常に転移しやすい(Yu et al.，1993)。これらの 研究は、 これらのマウスを脂質とpK1を含むリポソーム複合体で治療することも含む。pK1 は、LTの非トランスフォーム変異体をコードするDNAを含む(Kalderon et al.，1 984)。本研究の詳細については、実施例VII,2で述べられている。 ２．ヒトにおける、neuが介在する癌のLTによる抑制 本出願書に述べられている細胞系や動物モデルを用いて得られた結果は、人間 の治療法としても成功が望めるタイプのものであると、当業者によって広く認め られているものである。実際、ヒトにおいてneuの発現を抑制するためにLT使用 に関する臨床実験が考えられている。しかし、あらゆる新薬に付随させることが 必要とされている事前措置があるために、本発明の組成物および方法は、未だそ のような臨床場面では調べられていない。それにも拘わらず、ここに示された結 果は、乳癌、卵巣癌、肺癌、胃癌、喉頭癌あるいは前立腺癌などのneu発現を示 す癌を克服する上で有用なことを合理的に示している。 最初に行われるべき臨床試験の一つには、例えばK1などのLTの非トランスフォ ーム変異体が含まれる。これらの非トランスフォーム変異体は、細胞培養実験に おいても、インビボの動物モデル実験においても、neuが介在する癌を抑制でき ることが明らかになっている。このような変異体は、トランスフォーメーション に伴う問題を回避できる。これらの臨床実験で、K1はneu産生を抑えるためにヒ トの癌細胞に導入される。 この治療法で恩恵を受ける患者には、neuを高レベルで発現する癌細胞をもつ 患者が含まれる。該患者のneu発現のレベルは、免疫組織化学あるいはウエスタ ンブロッティングなどの日常的な技術を用いて癌組織の生体サンプルを解析して 測定される。これらの診断技術は日常的に実施されており、当業者に公知である 。 neuを過剰発現している癌組織のターゲティングは、さまざまな方法からひと つを選んで行われる。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、アデノウ イルスベクターあるいは他のウイルスベクターはすべて、ヒトの癌をターゲティ ン グする方法を提示している。発明者らは、癌細胞にLT遺伝子をターゲティングす るためにリポソームを用いることは特に有効だと予想している。実施される最初 の一連の臨床段階の一つは、K1のような非トランスフォーム変異体をコードする DNAを、実施例VIIで述べる方法によってリポソームと複合させることであろう。 そして、このDNA/リポソーム複合体を、乳癌などの一定の形態の癌をもつ患者に 注射する。neuを過剰発現する細胞を含むすべての細胞にK1遺伝子を入れるため には静脈注射が行われうる。リポソーム複合体を癌細胞の近くに直接注入するこ とも、ある種の形態の癌に複合体を入れ込むための方法として提供され得よう。 例えば、リポソーム混合液を直接、卵巣癌患者のparataenial腔に注入して卵巣 癌狙うことができよう。当然、リポソームには癌細胞の集団に選択的に取り込ま れる能力が存在し、また、そのようなリポソームはLT遺伝子をターゲティングす るのにも有用である。 当業者は、neu仲介の癌を抑制するためにLTを用いる最善の治療法が容易に決 められることを了解できよう。これは実験法の問題ではなく、むしろ最適化の問 題であって、医療技術においては日常的に行われている。ヌードマウスでのイン ビボの実験は、容量と輸送方法を至適化し始めるための出発点を提供する。注射 の頻度は、マウス実験で行なったように、最初は週に一度にする。しかし、この 頻度は、最初の臨床実験から得られた結果によって、あるいは個々の患者の必要 に応じて、毎日から２週間おき、毎月などと至適化するために調節されるであろ う。ヒトへの投与量は、初めはマウスで用いられたLT量を基にして決定されるが 、50 gの体重に対しておよそ15μｇのプラスミドDNAが投与されよう。これに基 づくと、50 kgの女性の治療には１用量として15 mg必要だということになる。勿 論、この用量は、このような治療のプロトコールで日常的に行われているように 、最初の臨床実験の結果および個々の患者の必要に応じて、上げることも下げる こともできよう。 ３．neu介在の癌を抑制するための、E1Aおよび/またLTを用いたリポソーム・ト ランスフェクション neu介在の形質を抑制するために、E1Aおよび/またLTを用いた方法で特に有用 なのは、癌遺伝子をもつ細胞に抑制因子となるDNAを輸送するために、リポソー ムを用いて行なうものである。 実施例VII リポソーム/DNA複合体の調製およびこの複合体によるneu介在の腫瘍の阻害 １．リポソームの調製 E1A、LT遺伝子のどちらにとっても、動物細胞を形質転換するのに効果的な試 薬である緊縮型(Catatonic)のリポソームを、ガオら(Gao et al.，1991)の方法 を用いて調製した。ガオらは、一段階で合成できる新しい緊縮型コレステロール 誘導体を説明している。報告されたところによると、この脂質から作られたリポ ソームは、リポフェクチン(Lipofectin)を用いて作ったものよりも、形質転換効 率がよく処理した細胞に対して毒性が低い。これらの脂質はDC-Chol("3bβ(N-(N '-N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイルコレステロール")とDOPE("ジオレオ イルフォスファチジルエタノアミン')の混合物である。これらのリポソームを産 生する過程を以下に示す。 コレステリルクロロホメート(cholesteryl chloroformate)とN-N-ジメチルエ チレンジアミンを一回反応させてDC-Cholを合成する。コレステリルクロロホメ ート溶液(2.25 g．5 mlの無水クロロホルム中5 mmol)を滴下しながら、0℃で、 過剰N-N-ジメチルエチレンジアミン溶液(2 ml，3 ml無水クロロホルム中18.2mmo l)に加えた。有機溶媒を蒸発させて除去してから、残渣を４℃の無水アルコール 中で再結晶させて、真空中で乾燥させた。白い粉末状のDC-Cholを回収できる。 1.2μmolのDC-Cholと8.0μmolのDOPEを混ぜて、カチオン性のリポソームを調 製する。この混合液を乾燥させて、真空脱水してから、チューブの中で１mlステ ロ ールと20 mM HEPES緩衝液(pH 7.8)に再懸濁した。４℃で24時間水和した後、分 散物を超音波破砕器で5-10分間破砕して平均直径が150-200 nmのリポソームにし た。 リポソーム/DNA複合体を調製するために、以下の過程によった。形質転換に用 いられるDNAは、DMEM/F12培地の中に、培地50μlにDNA15μgの割合で入れた。次 に、DMEM/F12は、100μlのリポソームに対し50μlのDMEM/F12という割合で、DC- Chol/DOPEリポソーム混合液を希釈するのに用いた。DNA希釈液とリポソーム希釈 液をゆっくり混合して、37℃で10分間インキュベートした。インキュベーション した後、注射用のDNA/リポソーム複合体ができる。 ２．リポソームによるneu介在の癌のインビボでの治療 発明者らは、リポソーム仲介による遺伝子の直接移入技術が、生きている宿主 の中でneuを過剰発現しているヒト癌細胞をE1Aで抑制するために用いられた。こ の実験のプロトコールを以下に示す。 雌のヌードマウス(5-6週令)に、SK-OV-3細胞(2×10⁶/100μl)を腹膜内注射し た。SK-OV-3細胞は、ヌードマウスの腹腔内で増殖することが分かっているヒト の卵巣癌細胞である。５日後、マウスにさまざまな化合物を注射した。E1A DNA のみを与えたマウスもあり、上記の方法で調製したリポソーム/E1A DNA複合体を 与えたマウスもあり、リポソーム/Efs(E1Aフレームシフト変異体)DNAの複合体を 与えたマウスもある。該化合物は、該マウスに200μl与えた。最初の注射後、マ ウスが生きている間ずっと、７日毎に注射を繰り返した。 図21に、この実験の結果を示す。マウス１には、E1A DNAのみを注射したが、 大量の血が混じった腹水ができた。マウス１はSK-OV-3細胞を注射してから65日 後に死んだ。まうす２には、リポソーム/Efs複合体を注射した。マウス２には大 量の血が混じった腹水と大きな腫瘍を生じ、SK-OV-3細胞を注射してから76日後 に死んだ。マウス３にはリポソーム/E1A DNA複合体を注射した。このマウスは健 康で正常に見え、SK-OV-3細胞を注射してから160日が経過しても、まだ生きてい た。 これらの結果から、リポソームが仲介するE1A遺伝子の移入によって、neuを過 剰発現しているヒトの卵巣癌細胞の増殖を阻害することが示された。したがって 、リポソーム仲介によるE1AあるいはLT遺伝子治療は、HER-2 neu癌遺伝子にE1A またはLTを直接入れることで、HER-2 neuを過剰発現するヒト卵巣癌に対する強 力な治療剤として役立つことが予測できる。 発明者らは目下、LT変異体のpK1のヒト卵巣癌細胞SK-OV-3の増殖と転移に対す る効果を、E1Aのこの細胞に対する効果を調べたのと、実質的には同じ方法でテ ストしているところである。これらの実験において、リン酸緩衝食塩水１ml当た り1.8×10⁶個のSK-OV-3細胞を腹膜内注射した。次の週から毎週、15μgのpK1懸 濁液に1μmolのリポソーム(以前述べられたところにしたがって調製されたDC-Ch olを含むリポソーム)を加えて、マウスに注射した。コントロールとして、５匹 のマウスにSK-OV-3細胞を注射して、コントロールプラスミドpGEMとリポソーム を毎週注射した。以前のデータから、pK1がneuの誘導するフォーカスと転写を抑 制できることがわかっていたため、pK1を注射すれば、マウスの中でSK-OV-3細胞 の腫瘍増殖を抑制することが期待できた。 ３．人間を治療するためのE1Aおよび/またLTによるリポソームを用いた形質転換 上述したインビボでの動物実験の結果に基づいて、当業者はneuが介在する癌 をリポソームと複合体になったE1Aおよび/またLTDNAで治療できる可能性が大き いことを理解し予測できるであろう。これらの効果を明らかにするための臨床実 験が考えられている。そのような実験の一組が実施例VI,2で述べられているが、 そこではリポソームに結合したLTの使用に関する臨床実験について述べられてい る。E1A、あるいは他のneuを抑制する遺伝子産物がリポソームと複合体になって 、LTについて述べたところと同様の方法で用いられよう。これらの臨床実験によ って、ヒトの中でneuを過剰発現している癌の治療に、LTやE1Aあるいは他のneu 抑制遺伝子産物が利用できることが明らかになると期待できる。用量と回数につ いての処 方は、実施例VI,2で述べたように、インビボの動物実験から得たデータに基づい て最初は決められる。 実施例VIII p185を高レベルで発現する、ヒトの癌のアデノウイルスE1A遺伝子による治療 本実施例は、p185を高レベルで発現している、ヒトの癌を治療するために、E1 AまたはLT遺伝子を導入するのに備えるものである。これはE1AとLT配列のいずれ かを輸送して、効率的に腫瘍あるいは前腫瘍組織に感染させるために、ウイルス ベクターを利用して、目的の遺伝子を導入すれば、最も好ましい形で実現する。 これらのベクターは、好ましくはアデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニア ウイルス、または、アデノ関連ウイルス(Muro-cacho et al.，1992)である。こ れらのベクターは、移入したい配列を細胞に輸送するために用いられて成功して おり、感染効率も高いので、好ましい。発明者らは、元からあるアデノウイルス を、本発明に従って、E1A遺伝子の移入に用いることができることを示す実験を 行なっているところである。しかし、特に好ましいアデノウイルスのタイプは、 複製欠損をもつグループである。 HER-2/neu癌遺伝子は、分子量185,000の上皮細胞増殖因子レセプターの仲間の 膜移行蛋白質(p185)で、内在性のチロシンキナーゼ活性をもつ。正常なヒトHER- 2/neu癌原遺伝子が過剰発現すると、チロシンキナーゼ活性も全体的に高くなる が、これは、乳癌、卵巣癌、肺癌、子宮頸部癌、胃および結腸癌など、多くのタ イプのヒト癌でよく起こる現象である。HER-2/neuの過剰発現と乳癌患者におけ るリンパ節転移数とは比例関係にあり、また、乳癌でも卵巣癌でも生存率が減少 することが報告されている。本発明者らは、前の実施例において、アデノウイル ス５ E1A遺伝子産物は、HER-2/neuの発現を抑制し、活性化されたラットのneu癌 遺伝子でトランスフォームされたマウス3T3細胞の腫瘍形成能と転移能を抑制し た。E1A遺伝子をヒト卵巣癌細胞系SK-OV-3(i.p.)に導入すると、インビトロでも インビボ でも悪性形質が弱くなった。それらのデータは、E1A遺伝子が、HER-2/neuを過剰 発現しているヒト癌細胞の腫瘍抑制遺伝子といえることを示していた。 複製欠損アデノウイルスは、インビボで腫瘍細胞に直接、外来遺伝子を効率的 に輸送することができる遺伝子輸送システムの代表的なものである。増殖中の細 胞だけに感染できるレトロウイルスなど、遺伝子輸送に当たって標的細胞の増殖 を必要とするベクターとは異なり、アデノウイルスは増殖している細胞にも、し ていない細胞にも遺伝子を移送する。アデノウイルスが細胞中の染色体外に局在 する(染色体に組み込まれていない)と、細胞中の癌遺伝子を活性化する機会が減 る。高濃度のアデノウイルスを簡単に産生させ、精製することができる。欠失変 異体のE３とE1B(E３とE1Bはアデノウイルスの複製に必要である)からE1Aを含む 複製欠損アデノウイルスが構築された。コントロールウイルスは、別のE1Aの欠 失変異体から構築された。 本実施例は、E1A遺伝子を含む複製欠損アデノウイルス[Ad.E1A(+)]の、インビ トロおよびインビボでのヒトの細胞への導入を提供する。腫瘍抑制遺伝子E1Aを ヒト卵巣癌細胞SKOV3(i.p.)細胞に、Ad.E1A(+)によってインビトロおよびインビ ボで効率的に形質導入した(図22と図26)。最高100％までの細胞に、ウイルス/腫 瘍割合＞50/1か、あるいは多重感染よりは少ない割合で感染させることができた 。インビボでの腫瘍増殖(図23)、ソフトアガー内でのコロニー形成能(図24)は、 Ad.E1A(+)によって強く阻害された。SKOV3(i.p.)細胞(10⁶/マウス)をnu/nuマウ スの腹腔に移植した。５日後、腹腔内注射で、Ad.E1A(+)、Ad.E1A(-)。あるいは 、PBSのみから採ったウイルス溶液の接種を３日間続け(濃度：2×10⁹PFU/ml)、 その後4.5カ月間週に一回ずつ注射した。臨床観察と生存率から、Ad.E1A(+)はマ ウスの生存期間を有意に伸長し、マウスの中には腫瘍が形成されないものもあっ た(図25)。組織免疫化学解析は、インビボで遺伝子輸送した後、Ad.E1A蛋白質が 腫瘍の中で発現しており、HER-2/neu p185蛋白質の発現が大いに抑制されている (図28Ａ、 図28および図28Ｃ)。ことを示した。 卵巣癌細胞系2774は、HER-2/neu p185蛋白質の発現は非常に低いが、Ad.E1A(+ )の治療効果をみるために調べた(図27)。結果を見ると、Ad.E1A(+)は2774細胞系 の生存率を有意にのばすことはできなかった。このことは、Ad.E1A(+)がp185を 強く発現する細胞を特異的に標的にしていることを示している。 nu/nuマウスにおいて、通常のヒト肺癌モデルを用いて、インビボで高レベル のp185を発現しているNCI-H820ヒト肺癌細胞系の腫瘍形成に対するAd.E1A(+)の 効果を調べた。マウスの腫瘍細胞(5×10⁶)を気管内に接種した。５日後、Ad.E1A (+)、Ad.E1A(-)のウイルス溶液(濃度:2×10⁹PFU/ml)、あるいはPBSのみを気管内 滴注によって、マウスに処置した。この後2.5カ月間、週に一度静脈注射処置を し続けた。解剖すると、コントロールマウスでは80％以上が、処置したマウスで は僅か20％が、表３、および図29Ａ、29Ｂ、29Ｃに示したように腫瘍を生じた。 この表３に示すのは、HER-2/neuを強く発現する、ヒトの非小細胞肺癌系NCI-H82 0を気管切開によってnu/nuマウスに気管内注入した(5×10⁶個/マウス)実験の結 果である。５日後、PBS、Ad.E1A(-)、Ad.E1A(+)の何れか(濃度:2×10⁹PFU/ml)で 、一度気管内注射(0.1 ml)をしてから、毎週静脈注射で2.5ヶ月処置した。そし て、縦隔のブロックを除いて腫瘍の容量を計算した。その結果、Ad.E1A(+)が、n u/nu マウスの正常な位置に移植したヒトの肺癌細胞の増殖を阻害できることを示す。 以上のデータから、アデノウイルスの遺伝子輸送系は効果的であり、また、Ad .E1A(+)はHER-2/neuを発現しているヒト卵巣癌および肺癌腫瘍に対して治療的効 果があることが明らかになった。 ＊＊＊＊＊ 本発明の組成物と方法は、好ましい態様との関係で説明されているが、本発明 の概念、意図および範囲を逸脱せずに、組成物、方法および、ここで説明されて いる方法のステップあるいはステップの順序に変化を加えて応用しうることは、 当業者にとって明らかである。より特異的には、同じあるいは同様の結果が得ら れるのであれば、ここで述べている薬剤に代えて、化学的かつ生理学的に関連す る一定の薬剤を用いることができる。当業者にとって明らかな、そのような同等 の代替および変更はすべて、添付の請求の範囲で明確にした本発明の意図、範囲 および概念に含まれると考える。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マティン，アンガビン アメリカ合衆国、77054 テキサス、ヒュ ーストン、ケンブリッジ 7900、＃14−１ ジー (72)発明者 ツァン，ユージャオ・ジョー アメリカ合衆国、77030 テキサス、ヒュ ーストン、スタッフォードシャー 7204、 ＃１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞のトランスフォーミング能、腫瘍発生能、あるいは転移能の低下で示 されるような癌遺伝子表現型の抑制に有効なように、トランスフォーメーション 抑制量のＬＴ遺伝子産物を細胞に導入することを含む、細胞のneu癌遺伝子仲介 トランスフォーメーションを抑制する方法に使用するためのＬＴ遺伝子産物。 ２．ＬＴ遺伝子産物がＬＴ突然変異体であることを特徴とする、請求項１に記 載の遺伝子産物。 ３．ＬＴ突然変異体が非トランスフォーミング突然変異体であることを特徴と する、請求項２に記載の遺伝子産物。 ４．非トランスフォーミング突然変異体がＫ１であることを特徴とする、請求 項３に記載の遺伝子産物。 ５．ＬＴ遺伝子産物がＬＴ遺伝子の導入によって細胞に導入されることを特徴 とする、請求項１に記載の遺伝子産物。 ６．ＬＴ遺伝子がＬＴ遺伝子とその関連制御配列を含むことを特徴とする、請 求項５に記載の遺伝子産物。 ７．ＬＴ遺伝子がベクター上に存在することを特徴とする、請求項５に記載の 遺伝子産物。 ８．ベクターがプラスミドベクターを含むことを特徴とする、請求項７に記載 の遺伝子産物。 ９．プラスミドベクターがpZ189、pVO-0、pK1あるいはpK7であることを特徴と する、請求項８に記載の遺伝子産物。 １０．ベクターがウイルスベクターを含むことを特徴とする、請求項７に記載 の遺伝子産物。 １１．ベクターがレトロウイルスベクターを含むことを特徴とする、請求項１ ０に記載の遺伝子産物。 １２．リポソームを使用してＬＴ遺伝子を導入することを特徴とする、請求項 ５に記載の遺伝子産物。 １３．リポソームがＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、またはＤＣ−Cholを含むことを特 徴とする、請求項１２に記載の遺伝子産物。 １４．リポソームがＤＣ−Cholを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の 遺伝子産物。 １５．リポソームがＤＣ−CholとＤＯＰＥを含むことを特徴とする、請求項１ ４に記載の遺伝子産物。 １６．遺伝子産物が多細胞生物の細胞に導入されることを特徴とする、請求項 １に記載の遺伝子産物。 １７．多細胞生物が哺乳動物であることを特徴とする、請求項１６に記載の遺 伝子産物。 １８．リポソームと結合したＬＴ遺伝子の導入によって遺伝子産物が導入され 、該リポソームが哺乳動物に注入されることを特徴とする、請求項１７に記載の 遺伝子産物。 １９．neu癌遺伝子仲介トランスフォーメーションの抑制が必要な細胞を含む 部位にリポソームが直接注入されるされることを特徴とする、請求項１８に記載 の遺伝子産物。 ２０．哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１７に記載の遺伝子産 物。 ２１．癌遺伝子表現型細胞が上記哺乳動物に癌を形成することを特徴とする、 請求項１７に記載の遺伝子産物。 ２２．癌が乳癌であることを特徴とする、請求項２１に記載の遺伝子産物。 ２３．癌が卵巣癌であることを特徴とする、請求項２１に記載の遺伝子産物。 ２４．細胞の腫瘍発生能が抑制されることを特徴とする、請求項１に記載の遺 伝子産物。 ２５．細胞の転移能が抑制されることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子 産物。 ２６．ＬＴ遺伝子産物およびＥ１Ａ遺伝子産物を、細胞に導入することを特徴 とする、請求項１に記載の遺伝子産物。 ２７．Ｅ１Ａ遺伝子の導入によってＥ１Ａ遺伝子産物が導入されることを特徴 とする、請求項２６に記載の遺伝子産物。 ２８．Ｅ１Ａ遺伝子が関連制御配列を含むことを特徴とする、請求項２７に記 載の遺伝子産物。 ２９．Ｅ１Ａ遺伝子がベクター上に存在することを特徴とする、請求項２７に 記載の遺伝子産物。 ３０．ＬＴ遺伝子とＥ１Ａ遺伝子が同一ベクター上に存在することを特徴とす る、請求項２９に記載の遺伝子産物。 ３１．ベクターがプラスミドベクターを含むことを特徴とする、請求項２９に 記載の遺伝子産物。 ３２．ベクターがウイルスベクターを含むことを特徴とする、請求項２９に記 載の遺伝子産物。 ３３．ベクターがレトロウイルスベクターを含むことを特徴とする、請求項３ ２に記載の遺伝子産物。 ３４．Ｅ１Ａ遺伝子産物がＥ１Ａ １２Ｓ遺伝子産物またはＥ１Ａ １３Ｓ遺 伝子産物を含むことを特徴とする、請求項２６に記載の遺伝子産物。 ３５．Ｅ１Ａ遺伝子がＥ１Ａ １２Ｓ遺伝子またはＥ１Ａ １３Ｓ遺伝子を含 むことを特徴とする、請求項２７に記載の遺伝子産物。 ３６．Ｅ１Ａ遺伝子がＥ１Ａ １２Ｓ遺伝子およびＥ１Ａ １３Ｓ遺伝子を含 むことを特徴とする、請求項３５に記載の遺伝子産物。 ３７．細胞の腫瘍発生能が抑制されることを特徴とする、請求項２６に記載の 遺伝子産物。 ３８．細胞の転移能が抑制されることを特徴とする、請求項２６に記載の遺伝 子産物。 ３９．neu抑制遺伝子産物を細胞に導入するための方法に使用する、neu抑制遺 伝子ＤＮＡ／リポソーム複合体。 ４０．リポソームがＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、またはＤＣ-Cholを含むことを特 徴とする、請求項３９に記載のＤＮＡ／リポソーム複合体。 ４１．リポソームがＤＣ-Cholを含むことを特徴とする、請求項４０に記載の ＤＮＡ／リポソーム複合体。 ４２．リポソームがＤＣ-CholおよびＤＯＰＥを含むことを特徴とする、請求 項４１に記載のＤＮＡ／リポソーム複合体。 ４３．多細胞生物にneu抑制遺伝子産物を導入する方法にＤＮＡ／リポソーム 複合体が使用されることを特徴とする、請求項３９に記載のＤＮＡ／リポソーム 複合体。 ４４．多細胞生物が哺乳動物であることを特徴とする、請求項４３に記載のＤ ＮＡ／リポソーム複合体。 ４５．哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項４４に記載のＤＮＡ／ リポソーム複合体。 ４６．ＤＮＡ／リポソーム複合体が注入によって哺乳動物に投与されることを 特徴とする、請求項４４に記載の遺伝子産物。 ４７．脂質とneu抑制遺伝子をコードするＤＮＡセグメントとのリポソーム複 合体を含む組成物。 ４８．neu抑制遺伝子がＬＴ遺伝子であることを特徴とする、請求項４７に記 載の組成物。 ４９．ＬＴ遺伝子がＬＴ突然変異体をコードすることを特徴とする、請求項４ ８に記載の組成物。 ５０．ＬＴ突然変異体が非トランスフォーミング突然変異体であることを特徴 とする、請求項４９に記載の組成物。 ５１．非トランスフォーミング突然変異体がＫ１であることを特徴とする、請 求項５０に記載の組成物。 ５２．neu抑制遺伝子がＥ１Ａ遺伝子であることを特徴とする、請求項４７に 記載の組成物。 ５３．Ｅ１Ａ遺伝子がＥ１Ａ １２Ｓ遺伝子産物またはＥ１Ａ １３Ｓ遺伝子 産物をコードすることを特徴とする、請求項５２に記載の組成物。 ５４．Ｅ１Ａ遺伝子がＥ１Ａ １２Ｓ遺伝子産物およびＥ１Ａ １３Ｓ遺伝子 産物をコードすることを特徴とする、請求項５２に記載の組成物。 ５５．脂質がＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、またはＤＣ−Cholを含むことを特徴とす る、請求項４７に記載の組成物。 ５６．脂質がＤＯＰＥを含むことを特徴とする、請求項５５に記載の組成物。 ５７．脂質がＤＣ−Cholを含むことを特徴とする、請求項５５に記載の組成物 。 ５８．脂質がＤＣ−CholおよびＤＯＰＥを含むことを特徴とする、請求項５７ に記載の組成物。 ５９．適当な容器に入った、neu抑制遺伝子をコードするＤＮＡセグメントと 脂質とのリポソーム複合体を有する組成物を含むキット。 ６０．細胞のトランスフォーミング能、腫瘍発生能、あるいは転移能の低下で 示されるような、癌遺伝子表現型の抑制に有効なように、トランスフォーメーシ ョン抑制量のＥ１Ａ含有アデノウイルスを細胞に導入することを含む、細胞のne u癌遺伝子仲介トランスフォーメーションを抑制する方法に使用するためのＥ１ Ａ 遺伝子含有アデノウイルス。 ６１．アデノウイルスが複製能不全アデノウイルスであることを特徴とする、 請求項６０に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ６２．複製能不完全アデノウイルスがAd.E1A(+)アデノウイルスであることを 特徴とする、請求項６１に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ６３．Ｅ１Ａ遺伝子が関連制御配列を含むことを特徴とする、請求項６０に記 載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ６４．Ｅ１Ａ遺伝子がベクター上に存在し、前記ベクターをアデノウイルスに 導入することを特徴とする、請求項６０に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイル ス。 ６５．Ｅ１Ａ遺伝子がＥ１Ａ １２Ｓ遺伝子産物またはＥ１Ａ １３Ｓ遺伝子 産物をコードすることを特徴とする、請求項６０に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデ ノウイルス。 ６６．Ｅ１Ａ遺伝子がＥ１Ａ １２Ｓ遺伝子産物およびＥ１Ａ １３Ｓ遺伝子 産物をコードすることを特徴とする、請求項６５に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデ ノウイルス。 ６７．細胞の腫瘍発生能が抑制されることを特徴とする、請求項６０に記載の Ｅ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ６８．細胞の転移能が抑制されることを特徴とする、請求項６０に記載のＥ１ Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ６９．Ｅ１Ａ遺伝子含有アデノウイルスが多細胞生物の細胞に導入されること を特徴とする、請求項６０に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ７０．多細胞生物が哺乳動物であることを特徴とする、請求項６９に記載のＥ １Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ７１．哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項７０に記載のＥ１Ａ遺 伝子含有アデノウイルス。 ７２．癌遺伝子表現型細胞が上記哺乳動物に癌を形成することを特徴とする、 請求項７０に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ７３．癌が乳癌であることを特徴とする、請求項７２に記載のＥ１Ａ遺伝子含 有アデノウイルス。 ７４．癌が卵巣癌であることを特徴とする、請求項７２に記載のＥ１Ａ遺伝子 含有アデノウイルス。 ７５．癌が肺癌であることを特徴とする、請求項７２に記載のＥ１Ａ遺伝子含 有アデノウイルス。 ７６．Ｅ１Ａ遺伝子含有アデノウイルスがＬＴ遺伝子をさらに含むことを特徴 とする、請求項６０に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ７７．ＬＴ遺伝子がＬＴ突然変異遺伝子であることを特徴とする、請求項７６ に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ７８．ＬＴ突然変異体が非トランスフォーミング突然変異遺伝子であることを 特徴とする、請求項７７に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ７９．非トランスフォーミング突然変異遺伝子がＫ１遺伝子であることを特徴 とする、請求項７８に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ８０．ＬＴ遺伝子がＬＴ遺伝子とその関連制御配列を含むことを特徴とする、 請求項７６に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ８１．ＬＴ遺伝子がベクター上に存在し、前記ベクターをアデノウイルスに導 入することを特徴とする、請求項７６に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス 。 ８２．ベクターがpZ189、pVO-0、pK1またはpK7であることを特徴とする、請求 項８１に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。 ８３．アデノウイルスがAd.E1A(+)アデノウイルスであることを特徴とする、 請求項７６に記載のＥ１Ａ遺伝子含有アデノウイルス。