【発明の詳細な説明】
真菌酵素及び細菌酵素を用いる下水処理用組成物及び方法
発明の分野
本発明は、真菌酵素及び細菌酵素によるセルロース分解に関する。酵素のこの
組合わせは、下水処理、特に浄化槽に有効である。
発明の背景
微生物による下水処理は、当該技術において既知である。多くの下水処理セン
ター及び個々の浄化槽は、汚水の分解に微生物を用いるものである。一般に、下
水は水、有機廃棄物（炭水化物、脂肪及びタンパク質を含む）及び紙製品からの
セルロースを含む。セルロースは、生（未処理）下水中の固形分の約１５％まで
を表すことがある。
典型的には、下水の非セルロース有機廃棄物成分はセルロース成分より容易に
分解される。有機廃棄物を構成する炭水化物、脂肪及びタンパク質は、選択され
た細菌の細胞の外に遊離した細胞外酵素によってかなり容易に消化される。しか
しながら、セルロースの分解は依然として多くの下水処理方式における課題であ
る。
セルロースのグルコースへの分解プロセスは、段階的である。まず、セルロー
スがエンドグルカナーゼの作用により加水分解され、セルロースの無定形領域に
沿って結合が破壊される。この酵素反応は、β（１＞４）結合の切断を行ってセ
ロビオースを生成し、β（１＞４）エキソグルカナーゼの作用により分子の非還
元端から除去される。この後、セロビオースがβ（１＞４）グルコシダーゼによ
ってグルコースに加水分解される。即ち、セルロースのグルコースへの分解は、
酵素の複合体を含んでいる。これらの酵素の十分量は、天然細菌によって生産さ
れないと考えられる。十分な酵素活性がないことは浄化槽において特に明白であ
り、セルロース沈殿物が問題となる。生下水中のセルロース沈殿物を減少させる
新規な方法が求められている。
発明の要約
前述の課題は、バシラス種(Bacillus spp.)培養物を真菌セルラーゼと組合わ
せて含む下水処理組成物の発見で解決した。バシラス種からの細菌培養物によっ
て生産された細胞外酵素と真菌セルラーゼの組合わせは相乗的セルロース分解を
もたらす。結果から、セルロースを含む下水を本発明の組成物と接触させるとセ
ルロース分解の結果としてグルコース生成の顕著な増大が示される。本組成物は
、セルロース分解の増大ほかに炭水化物、脂肪及びタンパク質を分解することが
できる幅広い成分の分解系である。本組成物が天然に存在する微生物からの酵素
を含むことから、浄化槽添加剤として特に有効である。
本発明は、また、炭水化物、タンパク質、脂肪及びセルロース並びにその混合
物を分解する、そのバシラス種培養物及び真菌セルラーゼの新規な使用方法を提
供するものである。
好適実施態様の詳細な説明
バシラス種は、Williams & Wilkins社によって出版されたBergey's Manual of
Determinative Bacteriologyの第８版、1986年の1105〜1139頁に同定されてい
る既知の天然に存在する細菌である。好ましいバシラス種としては、B.サチリス
(subtilis)、B.リケニホルミス(licheniformis)、B.メガテリウム(megaterium)
及びその混合物が挙げられる。細菌培養物は、B.サチリス、B.リケニホルミス及
びB.メガテリウムの混合物であることが更に好ましい。当業者に既知であるよう
に、細菌培養物は培養物が貯蔵される期間を延長するために胞子として調製され
る。貯蔵に便利のよいように、バシラス種培養物は胞子として組成物中に存在さ
せることが好ましい。胞子は、下水のような栄養物に曝されると酵素生産生物に
なる。胞子が汚水に曝されると細菌になり、炭水化物、脂肪及びタンパク質を分
解するのに特に有効な細胞外酵素を生産する。本組成物中に用いられるバシラス
種の胞子数は、処理されるべき下水の種類、下水処理施設の大きさ、下水を組成
物で処理する頻度等によってかなり変動させてもよい。
本明細書に用いられる組成物の有効成分は、細菌培養物及び真菌酵素として定
義される。典型的な浄化槽添加剤として調製された組成物用細菌培養物の濃度範
囲は、好ましくは少なくとも約１０4胞子／ｇ組成物（有効成分）を使用し、胞
子の上限濃度はたいていコストによってのみ制限される。更に好ましくは少なく
とも１０6胞子／ｇ組成物（有効成分）、最も好ましくは１０6〜１０8胞子／ｇ
組成物（有効成分）が組成物に用いられる。
セルラーゼは、真菌アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)から単離さ
れる。その酵素はその真菌培養物から既知の手段によって抽出され、例えば、No
vo Nordisk、コネチカット州；Sigma Chemical、セントルイス、ミズーリ州；及
びGeorge A．Jeffrey's Company、サレム、バージニア州から広く市販されてい
る。その真菌が好気性でありかつ下水処理が主に浸水式嫌気性環境であることか
ら、セルラーゼ酵素は本発明に用いられる真菌から単離されることが好ましい。
バシラス種菌は、通性嫌気性であり、下水処理の典型的な嫌気性条件で発育する
。
細菌培養物の胞子数のように、本組成物に使用した真菌セルラーゼ酵素の比活
性及び量は広く可変であり、本組成物を使用するシステムの酵素要求に従って調
節される。例えば、特に高含量のセルロースを有する廃棄物システムに関しては
、多量のセルロース酵素が好ましい。浄化槽添加剤としての使用の場合、用いら
れる真菌酵素の活性は好ましくは少なくとも約１０００ＣＵ／ｇ組成物の有効成
分である（酵素の濃度の上限はたいていコストによってのみ制限される）。浄化
槽添加剤を処方する際の経済的理由で、酵素範囲は更に好ましくは１５００〜２
５００ＣＵ／ｇ組成物の有効成分、最も好ましくは１５００〜２０００ＣＵ／ｇ
組成物の有効成分である。
細菌培養物の真菌酵素に対する割合は、かなり変動させてもよい。細菌培養物
：真菌酵素の比は、有効成分の好ましくは約１０：９０〜約９９.９９：０.０１
重量％である。当業者に既知であるように、処理されるべき材料の種類、胞子数
及び原料の比活性等によって調節される。
本組成物は、また、処理施設への胞子及び真菌酵素の貯蔵又は供給を容易にす
る任意の充填剤及び添加剤を含めてもよい。用いられる充填剤としては、アルカ
リ金属塩（例えば、ＮａＣｌ、ＮａＳＯ4、ＣａＣＯ3、その混合物等）、不活性
製剤（例えば、ミルオーガナイト）、その混合物等が含まれるが、決してこれら
に限定されない。
本組成物は、当業者に既知の手段によって液体又は粉末として調製される。
前述のように、本発明の組成物に使用された酵素は天然に存在する生物によっ
て生産される。即ち、本組成物は、下水の典型的な成分（例えば、炭水化物、タ
ンパク質、脂肪及びセルロース）の幅広い成分の分解が所望される多くの産業用
に有効である。
下記実施例の項で示されるように、バシラス種酵素と真菌セルラーゼの組合わ
せは相乗的であることがわかった。組合わせて用いられる少量の細菌と真菌酵素
は、多量の単独真菌酵素が用いられる場合よりセルロースを分解するのに有効で
あることがわかった。本発明の組合わせは、幅広い成分を含む下水処理及びセル
ロースが廃棄物である産業用に特に有効であるセルロースからグルコースを生成
するという手段を与える。
本発明の組成物の酵素作用は、広範囲のｐＨにわたって生じることができる。
最適には、処理されるべき培養液のｐＨ範囲は約４〜約１０であり、更に好まし
くはｐＨ６〜８である。処理されるべき培養液の温度範囲はかなり変動させるこ
とができるが、最適酵素作用は温度範囲好ましくは約１０〜約４５℃、更に好ま
しくは２０〜３５℃で生じる。セルロースの分解は、また、バシラス種から分離
されかつ真菌起原のセルラーゼと組合わせた酵素で起こることができる。当業者
に既知であるように、真菌は好気性微生物でありバシラス種は通性嫌気性微生物
であるので、組成物を調製する際に基質環境の酸素含量を考慮しなけければなら
ない。
当業者に既知であるように、本組成物の用量、使用頻度及び有効成分の濃度は
相互に依存する可変量であり、処理されるべき環境、分解されるべき粒子の濃度
、前の微生物の使用等によっても広く変動するであろう。これらの可変量に対す
る調整は、当業者に既知の通常の手順により達成される。例えば、浄化槽添加剤
としての使用の場合（浄化槽は典型的には約１０００ガロンの容量を有する）、
本組成物の有効成分の有効量は少なくとも約１０ｇ、更に好ましくは少なくとも
約１００ｇ（使用量の上限は主にコストによって制限される）、最も好ましくは
１５０〜１０００ｇである。
下記の実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらに限定されな
い。
実施例
セルロース分解はグルコース生成により測定され、Aibba，S.,K．Kitai & T.I
manaka，Applied Environmental Microbiology，Vol．46，pp.1059-1065（1983
）に記載されているジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ）よって求めた。
実施例に記載された組成物は、バシラス・サチリス、バシラス・リケニホルミ
ス及びバシラス・メガテリウムから単離された胞子及びアスペルギルス・ニガー
から単離された真菌セルラーゼを使用した。胞子及びセルラーゼは共に、George
A．Jeffreys Company から入手した。培養物の計数は、１０8胞子／ｇ組成物の
有効成分であった。セルラーゼの比活性は、１６００ＣＵ／ｇ組成物の有効成分
であった。（供給会社から入手した実際のセルラーゼ酵素活性は約１２８,００
０ＣＵ／ｇであった。）ミルオーガナイトは、Milwaukee Metropolitan Sewage
District、ミルウォーキー、ウィスコンシン州から購入した。
実施例１及び２並びに比較例１及び２
合成の下水は、タンパク質５％、脂肪５％、セルロース５％及び残りは蒸留水
で調製した。合成の廃棄物を、各試験組成物用の３５ml試験管に入れた。
本発明の組成物Ａ
実施例１
組成物Ａを、最終セルラーゼ濃度０.０５０％（６４ＣＵ／ｇ）に廃棄物で１
０％に希釈した。４８時間後、グルコース生成（もって、セルロース分解のレベ
ルを示す）をＤＮＳ法を用いて下記表１に示されるように４.８３ｇ／１ｔとし
て測定した。
実施例２
組成物Ａを、最終セルラーゼ濃度０.０１２５％（１６ＣＵ／ｇ）に廃棄物で
２.５％に希釈した。４７時間後、グルコース生成をＤＮＳにより下記表１に示
されるように１.３１ｇ／１ｔとして測定した。
比較例１
合成廃棄物にセルラーゼのみを０.５％の濃度（６４０ＣＵ／ｇ）で加えた以
外は、実施例１を繰り返した。４８時間後、グルコース生成をＤＮＳにより表１
に
示されるように１.４１ｇ／１ｔとして測定した。
比較例２
組成物Ａが真菌セルラーゼを含まずかつＣａＣＯ3とＮａＳＯ4を等価量のミル
オーガナイトで置き換えた以外は、実施例１を繰り返した。４８時間後、グルコ
ース生成をＤＮＳにより表１に示されるように１.３１ｇ／１ｔとして測定した
。
表１は、実施例１及び２並びに比較例１及び２で得られたデータの纏めである
。真菌セルラーゼを培養物に加えると、グルコース生成の顕著な増大が検出され
た。実施例１及び２が示すように、セルラーゼが添加されると、実施例１及び２
のセルラーゼ濃度が単独酵素より約１０倍少ないが、単独酵素より多いか又は同
じ量のグルコースが本組成物により生成された。従って、単独酵素と真菌酵素及
び細菌酵素の組合わせとの間のこれらの主な差は、細菌酵素と真菌酵素の相乗作
用によるものであった。同様の結果が生下水を用いて見られた（表２）。
本発明の組成物Ｂ
実施例３
生下水(Ridgewood排水処理工場、リッジウッド、ニュージャージー州から入手
した）を３５ml試験管に入れ、組成物Ｂを最終セルラーゼ濃度０.０１２５％（
１６ＣＵ／ｇ）として２.５％に希釈した。４８時間後、グルコース生成（もっ
て、セルラーゼ分解レベルを示す）をＤＮＳを用いて下記表２に示されるように
０.２９１ｇ／１ｔとして測定した。
組成物Ｂ又は酵素単独を存在させずにグルコース生成を測定する対照も実験し
た。表２に示されるように、試料をＤＮＳ法によって分析した際にグルコースが
検出されなかった。
比較例３
生下水にセルラーゼのみを０.５％の濃度（６４０ＣＵ／ｇ）で加えた以外は
、実施例３を繰り返した。４８時間後、グルコース生成をＤＮＳにより表２に示
さ
れるように０.１２８ｇ／１ｔとして測定した。
比較例４
組成物Ｂが真菌セルラーゼを含まずかつＣａＣＯ3とＮａＳＯ4をミルオーガナ
イトで置き換えた以外は、実施例３を繰り返した。４８時間後、グルコース生成
をＤＮＳにより表２に示されるように０.０２９ｇ／１ｔとして測定した。
以上、本発明を具体的な好適実施態様について記載してきた。上記の詳細な説
明に明るい当業者は、本発明の範囲及び真意から逸脱することなく多くの変更及
び置換を行うことができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Compositions and Methods for Sewage Treatment Using Fungal and Bacterial Enzymes FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to cellulolysis by fungal and bacterial enzymes. This combination of enzymes is useful in sewage treatment, especially septic tanks. Background of the Invention Sewage treatment by microorganisms is known in the art. Many sewage treatment centers and individual septic tanks use microorganisms to decompose sewage. Generally, sewage contains water, organic waste (including carbohydrates, fats and proteins) and cellulose from paper products. Cellulose may represent up to about 15% of solids in raw (untreated) sewage. Typically, sewage non-cellulosic organic waste components are more easily degraded than cellulosic components. The carbohydrates, fats and proteins that make up organic waste are fairly easily digested by extracellular enzymes released outside the cells of selected bacteria. However, cellulose degradation remains a challenge in many sewage treatment systems. The process of breaking down cellulose into glucose is gradual. First, cellulose is hydrolyzed by the action of endoglucanase, and bonds are broken along the amorphous region of cellulose. This enzymatic reaction cleaves the β (1> 4) bond to produce cellobiose, which is removed from the non-reducing end of the molecule by the action of β (1> 4) exoglucanase. After this, cellobiose is hydrolyzed to glucose by β (1> 4) glucosidase. That is, the breakdown of cellulose into glucose involves a complex of enzymes. It is believed that sufficient quantities of these enzymes are not produced by natural bacteria. The lack of sufficient enzymatic activity is especially apparent in septic tanks, where cellulose precipitates are a problem. There is a need for new methods to reduce cellulose precipitates in raw sewage. SUMMARY OF THE INVENTION The foregoing problems have been solved by the discovery of a sewage treatment composition comprising Bacillus spp. Culture in combination with a fungal cellulase. The combination of extracellular enzymes and fungal cellulases produced by bacterial cultures from Bacillus sp. Results in synergistic cellulolysis. The results show a significant increase in glucose production as a result of cellulolysis when sewage containing cellulose is contacted with the composition of the invention. The composition is a broad component degradative system capable of degrading carbohydrates, fats and proteins as well as increasing cellulolysis. This composition is particularly effective as a septic tank additive because it contains enzymes from naturally occurring microorganisms. The present invention also provides novel uses of the Bacillus seed culture and fungal cellulases for degrading carbohydrates, proteins, fats and celluloses and mixtures thereof. Detailed Description of the Preferred Embodiments Bacillus spp. Is a known naturally occurring bacterium identified in the 8th edition of Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, published by Williams & Wilkins, p. . Preferred Bacillus species include B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium and mixtures thereof. More preferably, the bacterial culture is a mixture of B. subtilis, B. licheniformis and B. megaterium. As is known to those of skill in the art, bacterial cultures are prepared as spores to prolong the storage period of the culture. For ease of storage, the Bacillus seed culture is preferably present in the composition as spores. Spores become enzyme-producing organisms when exposed to nutrients such as sewage. When spores are exposed to sewage, they become bacteria and produce extracellular enzymes that are particularly effective in breaking down carbohydrates, fats and proteins. The number of Bacillus sp. Used in the composition may vary considerably depending on the type of sewage to be treated, the size of the sewage treatment facility, the frequency with which the sewage is treated with the composition, and the like. The active ingredients of the compositions used herein are defined as bacterial cultures and fungal enzymes. The concentration range of the compositional bacterial culture prepared as a typical septic tank additive preferably uses at least about 10 4 spores / g composition (active ingredient), with the upper limit of spores usually limited only by cost. To be done. More preferably at least 10 6 spores / g composition (active ingredient), most preferably 10 6 to 10 8 spores / g composition (active ingredient) are used in the composition. Cellulase is isolated from the fungus Aspergillus niger. The enzyme was extracted from the fungal culture by known means, eg, Novo Nordisk, Connecticut; Sigma Chemical, St. Louis, Mo .; and George A. Widely available from Jeffrey's Company, Salem, VA. The cellulase enzyme is preferably isolated from the fungus used in the present invention, since the fungus is aerobic and the sewage treatment is predominantly a flooded anaerobic environment. Bacillus inoculum is facultatively anaerobic and develops under the anaerobic conditions typical of sewage treatment. The specific activity and amount of fungal cellulase enzyme used in the composition, such as the number of spores in the bacterial culture, is widely variable and is adjusted according to the enzyme requirements of the system using the composition. For example, high amounts of cellulosic enzyme are preferred, especially for waste systems with a high content of cellulose. When used as a septic tank additive, the activity of the fungal enzyme used is preferably at least about 1000 CU / g of the active ingredient of the composition (upper limit of enzyme concentration is usually limited only by cost). For economic reasons in formulating septic tank additives, the enzyme range is more preferably the active ingredient of 1500 to 2500 CU / g composition, most preferably 1500 to 2000 CU / g composition. The ratio of bacterial culture to fungal enzyme may vary considerably. The bacterial culture: fungal enzyme ratio is preferably from about 10:90 to about 99.99: 0.01% by weight of active ingredient. It is controlled by the type of material to be treated, the number of spores, the specific activity of the raw material, etc., as known to those skilled in the art. The composition may also include any fillers and additives that facilitate storage or delivery of spore and fungal enzymes to the processing facility. Fillers used include, but are not limited to, alkali metal salts (eg, NaCl, NaSO 4 , CaCO 3 , mixtures thereof, etc.), inert formulations (eg millorganite), mixtures thereof, etc. . The composition is prepared as a liquid or powder by means known to those skilled in the art. As mentioned above, the enzymes used in the compositions of the invention are produced by naturally occurring organisms. That is, the composition is useful for many industries where degradation of a wide range of typical sewage components (eg, carbohydrates, proteins, fats and celluloses) is desired. As shown in the Examples section below, the combination of Bacillus sp. Enzyme and fungal cellulase was found to be synergistic. It has been found that small amounts of bacterial and fungal enzymes used in combination are more effective in degrading cellulose than when large amounts of single fungal enzymes are used. The combination of the present invention provides a means to produce glucose from cellulose which is particularly effective for sewage treatment with a wide range of components and for industries where cellulose is a waste product. The enzymatic action of the compositions of the present invention can occur over a wide range of pH. Optimally, the pH range of the broth to be treated is from about 4 to about 10, more preferably pH 6-8. The temperature range of the broth to be treated can vary considerably, but optimal enzymatic action occurs in the temperature range, preferably about 10 to about 45 ° C, more preferably 20 to 35 ° C. Degradation of cellulose can also occur with enzymes isolated from Bacillus sp. And in combination with cellulase of fungal origin. As known to those of skill in the art, fungi are aerobic microorganisms and Bacillus spp. Are facultative anaerobic microorganisms, so the oxygen content of the substrate environment must be considered when preparing the composition. As known to the person skilled in the art, the dose of the composition, the frequency of use and the concentration of the active ingredient are interdependent and variable, depending on the environment to be treated, the concentration of particles to be degraded, the concentration of the previous microorganisms. It will vary widely depending on usage. Adjustments to these variable amounts are accomplished by routine procedures known to those of skill in the art. For example, for use as a septic tank additive (the septic tank typically has a capacity of about 1000 gallons), an effective amount of the active ingredient of the composition is at least about 10 g, more preferably at least about 100 g (of the amount used). The upper limit is mainly limited by cost), most preferably 150-1000 g. The present invention will be more specifically described by the following examples, but the present invention is not limited thereto. Example Cellulose degradation was measured by glucose production and was determined by Aibba, S., K. et al. Kitai & TI manaka, Applied Environmental Microbiology, Vol. 46, pp.1059-1065 (1983), and determined by the dinitrosalicylic acid method (DNS). The compositions described in the examples used spores isolated from Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis and Bacillus megaterium and fungal cellulases isolated from Aspergillus niger. Both spores and cellulases were produced by George A. et al. Obtained from Jeffreys Company. The culture count was the active ingredient of 10 8 spores / g composition. The specific activity of cellulase was the active ingredient of the 1600 CU / g composition. (The actual cellulase enzyme activity obtained from the supplier was approximately 128,000 CU / g.) Millorganite was purchased from Milwaukee Metropolitan Sewage District, Milwaukee, Wisconsin. Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2 Synthetic sewage was prepared with 5% protein, 5% fat, 5% cellulose and the balance distilled water. The synthetic waste was placed in a 35 ml test tube for each test composition. Composition A of the present invention Example 1 Composition A was diluted to 10% with waste to a final cellulase concentration of 0.050% (64 CU / g). After 48 hours, glucose production (and thus indicative of the level of cellulolysis) was measured using the DNS method as 4.83 g / 1 t as shown in Table 1 below. Example 2 Composition A was diluted with waste to 2.5% to a final cellulase concentration of 0.0125% (16 CU / g). After 47 hours, glucose production was measured by DNS as 1.31 g / 1t as shown in Table 1 below. Comparative Example 1 Example 1 was repeated except that only cellulase was added to the synthetic waste at a concentration of 0.5% (640 CU / g). After 48 hours, glucose production was measured by DNS as 1.41 g / 1t as shown in Table 1. Comparative Example 2 Example 1 was repeated, except that composition A contained no fungal cellulase and replaced CaCO 3 and NaSO 4 with equivalent amounts of millorganite. After 48 hours, glucose production was measured by DNS as 1.31 g / 1t as shown in Table 1. Table 1 is a summary of the data obtained in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2. A significant increase in glucose production was detected when fungal cellulase was added to the culture. As shown in Examples 1 and 2, when cellulase was added, the concentration of cellulase in Examples 1 and 2 was about 10 times lower than that of the single enzyme, but more or the same amount of glucose was obtained by the composition. Was generated. Therefore, these major differences between the single enzyme and the combination of fungal and bacterial enzymes were due to synergism of bacterial and fungal enzymes. Similar results were seen with raw sewage (Table 2). Composition B of the present invention Example 3 Raw sewage (obtained from Ridgewood Wastewater Treatment Plant, Ridgewood, NJ) was placed in a 35 ml test tube and Composition B was diluted to a final cellulase concentration of 0.0125% (16 CU / g) to 2.5%. did. After 48 hours, glucose production (hence indicating cellulase degradation level) was measured using DNS as 0.291 g / 1t as shown in Table 2 below. A control was also run that measures glucose production in the absence of Composition B or enzyme alone. As shown in Table 2, no glucose was detected when the samples were analyzed by the DNS method. Comparative Example 3 Example 3 was repeated except that cellulase alone was added to the raw sewage at a concentration of 0.5% (640 CU / g). After 48 hours, glucose production was measured by DNS as 0.128 g / 1t as shown in Table 2. Comparative Example 4 Example 3 was repeated, except that composition B contained no fungal cellulase and replaced CaCO 3 and NaSO 4 with millorganite. After 48 hours, glucose production was measured by DNS as 0.029 g / 1t as shown in Table 2. The present invention has been described above with reference to specific preferred embodiments. Those skilled in the art, who are familiar with the above detailed description, can make many changes and substitutions without departing from the scope and spirit of the invention.
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 1/20
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(Ｃ１２Ｎ 1/20
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Ｃ１２Ｒ 1:11）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ
，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，
ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ
Ｓ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 クーニー エドワード エム
アメリカ合衆国 ニュージャージー州
07052 ウェスト オレンジ ローレンス
アベニュー 23─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI (C12N 1/20 C12R 1:07) (C12N 1/20 C12R 1:10) (C12N 1/20 C12R 1: 11) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AM, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MN, MW, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SI, SK, T , TT, UA, U S, UZ, VN (72) inventor Cooney Edward M. United States, NJ 07052 West Orange Lawrence Avenue 23