JPH09506635A

JPH09506635A - Extract of Stefania tetrandra that inhibits interleukin-6 production

Info

Publication number: JPH09506635A
Application number: JP8500687A
Authority: JP
Inventors: ピュン，クワンホー; チョイ，インピョー; カン，ヒュンシク; リー，ジュンジョン; キム，ヨンホー
Original assignee: コリア・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー
Priority date: 1994-06-09
Filing date: 1995-06-05
Publication date: 1997-06-30
Also published as: WO1995033473A1; CN1150389A; EP0759766A1; KR960000242A; KR0161145B1

Abstract

(57)【要約】インターロイキン−６の生産を阻害するステファニアテトランドラエス．ムーア（Stephania tetrandra S. Moore）の種々の抽出物、これらの製造方法およびインターロイキン−６の過剰生産によって惹起される免疫疾患の治療に有用な前記抽出物を含む医薬組成物。 (57) [Summary] Stefania Tetrandra es., Which inhibits interleukin-6 production. A variety of extracts of Moore ( Stephania tetrandra S. Moore ), a method for producing them, and a pharmaceutical composition containing the extract useful for treating immune diseases caused by overproduction of interleukin-6.

Description

【発明の詳細な説明】インターロイキン−６の生産を阻害するステファニアテトランドラの抽出物発明の分野本発明は、インターロイキン−６（interleukin−６、以下、ＩＬ−６と略称）の生産を阻害するステファニアテトランドラエスムーア（Stephania te trandra S.Moore）の抽出物、この抽出物の製造方法およびＩＬ−６の過剰生産によって惹起される免疫疾患の治療に有用な前記抽出物を含む医薬組成物に関する。発明の背景大韓民国の南部地方や済州島に見られるステファニアジャポニカミアース（Stephania japonica Miers）およびシノメニウムアクタムレドエウィルス（Sinomenium acutum rehd et Wils）（メニスペルマケアエ（Menispermace ae））は、鎮痛剤および抗炎症剤として長い間用いられてきた。一方、大韓民国に見られないエス．テトランドラエス．ムーア（メニスペルマケアエ）は、中国などで神経痛および関節炎の治療剤として伝統的に用いられてきた。特に、アルカロイドであるテトランドリンは抗炎症剤および抗高血圧剤として用いられてきた。エス．テトランドラエス．ムーアは、食作用阻止効果および酸化防止効果を有し（Seow,W.k.,et al.,Int.Archs Allergy Appl.Immun.,85,404(1988)）、臨床および実験的な硅肺症モデルにおいて効果を示すと報告され（Li,Q.,et a l.,Chinese J.Tuberc.Resp.Dis.,4,321(1981);Xu,X.,et al.,Eoltoxicol.Enviro n.Safety,7,306(1983)；およびLiu，B.,et al.,Ecotoxicol.Environ.Safety,7,3 23(1983)）、ヒト単球によって分泌されるインターロイキン−１および腫瘍壊死因子−αの生産を阻害する能力を有することが知られている（Seow,W.K.,et.,Cl in.Exp.Immunol.,75,47(1989)；およびFerrante,A.,et al.,Clin.Exp.Immunol.,80 ,232(1990)）。テトランドリンおよびその誘導体は、脳機能を活発にするものと報告され（Tsumura & CO,WPI Acc.No.:92-231935(1992)）、マラリア治療剤および毛髪成長促進剤として開発された（Sunstar KK,WPI Acc.No.:89-117236(1989)）。周知のように、ＩＬ−６は細胞の成長、分化および活性化に関与する調節因子である。これは種々の器官細胞によって生産および分泌され、人体の防御機構に重要な役割をする（Hirano,T.,et al.,Immunol.Today,11,443(1990)）。単球の培養液から初めて発見されたＩＬ−６はＢ細胞による抗体生産を誘導すると報告された（Muraguchi,A.,et al.,J.Immunol.，127,412(1981)）。ＩＬ− ６のｃＤＮＡがヒラノら（Hirano,T.at al.）によって成功裡にクローニングされて以降（Nature,324,73(1986)）、ＩＬ−６は、Ｂ細胞ハイブリドーマ（hybri doma）および形質細胞腫に対して成長因子として作用し（Snick,V.J.,et al.,Pr oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，83,9679(1986)）、また造血作用に関与する因子としての役割をすると報告された（Koike,K.,et.,J.Exp.Med.,168,879(1988)）。さらに、ＩＬ−６は、Ｔ細胞の活性化および成長を刺激し（Lotz,M.,et al.,J.Exp .Med.,167,1253(1988)）、肝細胞の急性段階反応（acute phase response）を誘発し（Geiger,T.,et al.,Eur.J.Immunol.,18,717(1988)）、神経系での細胞分化を調節し（Satoh,T.,Mol.Cell.Biol.,8,3546(1988)）、ケラチノサイトの成長を刺激し、骨の新陳代謝を調節し、メサンギウム細胞の成長を刺激し、黒色腫および乳がん細胞の成長を阻害するなどの機能を有すると報告された。すでに、報告されているように、ＩＬ−６の生産を適切に調節しないと種々の疾病が生じる。報告された疾病の例としては慢性関節リウマチ（Hirano,T.,et a l.,Eur.J.Immunol.,18,1797(1988)）、肝硬変（Deviere,J.,et al.,Clin.Exp.Im munol.,77,221(1989)）、乾せん（Grossman,R.M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U .S.A.,86,6367(1989)）、多発性骨髄腫（Bataille,R.,et al.,J.Clin.Invest.,8 4 ,2008(1989)）、心臓粘液腫（cardiac myxoma）、ＡＩＤＳ（Miles,S.A.,et al .,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,87,4068(1990)）および他の自己免疫疾患がある。かかる観察は、人体内の免疫体系の恒常性維持および疾病の治療や予防のためにＩＬ−６生産の調節が重要であるという事実を支持している。したがって、インターロイキンの生産を調節するための多数の研究法が提案されてきた。たとえば、ＩＬ−６またはＩＬ−６受容体に対する抗体を用いてＩＬ −６の過度な分泌によって骨髄腫にかかった患者の骨髄球の増殖を阻害した（Su zuki,H.,Eur.J.Immuno.,22,1989(1992)）。しかし、ＩＬ−６の生産を特異的に阻害する物質または方法は今のところ報告されおらず、したがって、ＩＬ−６の生産を特異的に阻害できる阻害剤の発見が必要とされていた。発明の概要したがって、本発明の目的は、ＩＬ−６の生産を特異的に阻害するエス．テトランドラエス．ムーアの根から得られた抽出物を提供することである。本発明の他の目的は、ＩＬ−６の過剰生産によって惹起される免疫疾患の治療に有効な量の該抽出物を含有する医薬組成物を提供することである。図面の簡単な説明本発明の前記および他の目的と特徴は本願に添付された図面を参照する下記の説明から明らかになる。図１は、ヒト単球およびマクロファージに対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物ＡおよびＢの細胞毒性を示し、図２は、ヒト単球およびマクロファージでＩＬ−６の生産に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物ＡおよびＢの阻害効果を示し、図３は、ラット肺マクロファージでＩＬ−６の生産に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ａの阻害効果を示し、図４は、ラットでＩＬ−６の生産に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ｃの阻害効果を示し、図５は、ラット肺繊維芽細胞でＩＬ−６の生産に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ｃの阻害効果を示し、図６は、関節炎患者の滑膜細胞でＩＬ−６遺伝子の発現に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ｂの阻害効果を示し、図７は、関節炎患者で滑膜細胞の増殖に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ａの阻害効果を示し、図８は、ラット肺繊維芽細胞でコラーゲンの生産に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ａの阻害効果を示し、図９は、ラット肺組織でコラーゲンの生産に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ｃの阻害効果を示し、図１０は、ヒト単球およびマクロファージで反応性酸素類の生産に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ａの阻害効果を示し、図１１は、誘発された肝硬変を患うラット血清中のＧＯＴおよびＧＰＴ濃度に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの効果を示し、図１２は、ラットの肝硬変に対するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの効果を示す。発明の詳細な説明本明細書で言及した全ての文献はここに引用して本明細書の記載とする。本発明によって、ステファニアテトランドラエス．ムーア（Stephania te trandra S.Moore）の根からの抽出物は、ＩＬ−６の生産を特異的に阻害する能力を有し、したがって、ＩＬ−６の過剰生産によって惹起される種々の免疫疾患の治療に有用であるということが見出された。エス．テトランドラエス．ムーアの前記抽出物は、種々の溶媒、たとえば、メタノール、エタノール、ヘキサン、ＣＨ₂Ｃl₂またはこれらの混合物、生理食塩水、蒸留水などを用いて製造できる。特に、下記にさらに詳細に説明されるエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは下記の好ましい態様によって製造できる。乾燥したエス．テトランドラエス．ムーア根１kgにメタノール１ないし３ｌ、好ましくは２ｌを加え、混合物を５０ないし７０℃の温度で６ないし１２時間、または室温で少なくとも２４時間撹拌した後、濾過する。前記手順を好ましくは３回繰り返し、濾液を集めて減圧下、たとえば、７mmＨgのもとで濃縮して抽出物Ａを得る。前記抽出物Ａ１００ｇをメタノール２００ないし４００ml、好ましくは２５０ mlとヘキサン２００ないし４００ml、好ましくは２５０mlとに分配する。これからメタノール分画を分離した後、減圧濃縮する。水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムを用いて残留物をpＨ９ないし１１の範囲に調整する。生成物を蒸留水とＣＨ₂Ｃl₂との混合液（１：１（ｖ／ｖ））４００ないし８００ml、好ましくは５００mlに分配する。これからＣＨ₂Ｃl₂分画、すなわちアルカロイド分画を分離した後、減圧濃縮して抽出物Ｂを得る。一方、乾燥したエス．テトランドラエス．ムーア根１kgを粉砕し、篩いにかけた後、蒸留水または生理食塩水に５０ないし２００mg／ml、好ましくは１００ mg／mlの濃度で懸濁する。この懸濁液を８０ないし１００℃、好ましくは９５℃ で４ないし１２時間、好ましくは６時間加熱する。加熱した懸濁液を濾過し、濾液を減圧濃縮して抽出物Ｃを得る。他の方法としては、乾燥したエス．テトランドラエス．ムーア根１kgを蒸留水１ないし３ｌ、好ましくは２ｌと混合し、８０ないし１００℃、好ましくは９５℃で４ないし１５時間、好ましくは１２時間加熱する。加熱した混合物を濾過し、濾液を減圧濃縮する。残留物を−７０ないし−９０℃、好ましくは−８０℃ で２ないし１０時間、好ましくは８時間貯蔵した後、４ないし８時間、好ましくは６時間凍結乾燥して粉末状の抽出物Ｃを得る。また、抽出物Ｄは乾燥したエス．テトランドラエス．ムーア根１kgにエタノール１ないし３ｌ、好ましくは２ｌを加え、混合物を６０ないし９０℃で６ないし１２時間、または室温で２４時間以上撹拌する手順を含む抽出過程を好ましくは３回繰り返して集めた濾液を減圧濃縮することによって得られる。前記抽出物Ａ、Ｂ、ＣおよびＤはそれぞれ抗炎症効果を示し、コラーゲンの合成および反応性酸素類（reactive oxygen species）の生産を阻害し、血清中のＧＯＴおよびＧＰＴ濃度を減少させる。したがって、これらはそれぞれ単独で、または混合物として慢性関節リウマチ、肝硬変、乾せん、多発性骨髄腫、心臓粘液腫、硅肺症およびＡＩＤＳのようなＩＬ−６の過剰生産によって惹起される免疫疾患治療用の医薬組成物に使用され得る。ここで好ましくは、抽出物Ａは炎症性疾患、関節炎および繊維化疾患の治療用；抽出物Ｂは関節炎および自己免疫肝硬変の治療用；抽出物Ｃは硅肺症および肝の繊維化疾患の治療用；抽出物Ｄは肝硬変の治療用に使用され得る。ＩＬ−６の過剰生産による免疫疾患の治療に有用な本発明の医薬組成物は、活性成分であるエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物と共に薬剤学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤を含むことができる。医薬製剤は通常の方法によって製造できる。組成物の製造において、活性成分は担体に混合、希釈するか、またはカプセル、におい袋（sachet）または他の容器形態の担体に封入することが好ましい。担体が希釈剤として働く場合、これは活性成分の溶剤、賦形剤または媒質として作用する固体、半固体または液体物質であり得る。したがって、この組成物は錠剤、丸剤、粉末、香粉、エリキシル、懸濁剤、乳化剤、液剤、シロップ、エアロゾール、軟質および硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射剤、滅菌包装粉末などのような形態であり得る。適当な担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油などがある。該組成物は潤滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤および防腐剤などをさらに含むことができる。本発明の組成物は、患者に投与してから、活性成分を迅速に、または持続的に、または遅延放出させるため、当分野で周知の任意の方法によって調剤できる。前記医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内および筋肉内投与をはじめ、種々の経路を通じて投与できる。通常の活性成分の１日投与量は約１ないし５００ μg／kg体重、好ましくは３０ないし３００μg／kg体重の範囲であり、一回または数回にかけて投与できる。しかし、実際に投与する活性成分の量は治療すべき症状、投与経路、患者の年齢および体重、および患者の症状を含む種々の関連因子を考慮して決定しなければならないことは勿論であり、したがって、前述した投与量は本発明を限定しない。下記製造例および実施例は本発明の範囲を限定することではなく、本発明をさらに詳細に説明するためのもので、特に言及しない限り、実施例で用いられた実験方法は下記参照実施例によって実施できる。また、以下固体混合物中の固体、液体中の液体および液体中の固体に対する百分率は特に言及しない限り、それぞれ重量／重量、体積／体積および重量／体積に基づいたものである。製造例：エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物の製造よく乾燥したエス．テトランドラエス．ムーア根約４．０kgを細かく切り刻み、メタノール約５１で二日間抽出した。この抽出手順を３回繰り返して集めた抽出物を減圧濃縮して５.６％収率でメタノール抽出物約２２４ｇ（抽出物Ａ）を得た。抽出物Ａ２００ｇを９０％メタノール５００mlとｎ−ヘキサン５００mlの混合物に分配した後、９０％メタノール層を分離して減圧濃縮してメタノールを除いた。残留物を０.１ＭＭＨ₄ＯＨでpＨ１０に調整して蒸留水：ＣＨ₂Ｃl₂（１：１（ｖ／ｖ））混合物６００mlに分配させた。次いで、ＣＨ₂Ｃl₂層、すなわち、アルカロイド分画を分離し、減圧濃縮して０.６％収率で抽出物Ｂ２５ｇを得た。一方、硅肺症治療試験に用いるための抽出物Ｃは次のように製造した。よく乾燥したエス．テトランドラエス．ムーア根１kgを粉砕し、篩い（６０メッシュ）にかけた後、蒸留水に１００mg／mlの濃度で懸濁させた。この懸濁液を１００ ℃で６時間加熱して濾過した。濾液を減圧濃縮して８％収率でエス．テトランドラエス．ムーアの水抽出物（抽出物Ｃ）８０ｇを得た後、これを−２０℃で貯蔵した。肝硬変治療試験に用いるための抽出物Ｃを製造するために、よく乾燥したエス．テトランドラエス．ムーア根１１１３.５ｇを蒸留水２１と共に冷却装置が備えられた３１丸底フラスコに入れ、混合物を９５℃で１２時間加熱した後濾過した。濾液を回転真空蒸発器（Buchi451）を使って減圧濃縮し、ディープフリーザー（SANYO、Japan）で−８４℃で３時間冷却した後、凍結乾燥器（ＥＹＥＬＡ，Ｊapan）を使って４時間凍結乾燥して５．１％収率で粉末状抽出物Ｃ５６.５５ｇを得た。また、よく乾燥したエス．テトランドラエス．ムーア根５００ｇをエタノール約１.５１を用いて室温で３日間抽出した。この抽出手順を３回繰り返して集めた抽出物を減圧濃縮して２.６％収率でエス．テトランドラエス．ムーアのエタノール抽出物１３ｇを得た。参照例１：検定用細胞の分離（１）ヒト単球、マクロファージおよび好中球の分離正常なヒト末梢血液をヘパリンで処理し、同量のハンクス細胞培養用塩類溶液（Hank's balanced salt solution(HBSS)：Ｍｇ²⁺およびＣａ²⁺を含有しない）で希釈した。希釈した血液を、密度１.１１９のフィコル−ヒパク（Ficoll-Hypa que,Sigma,St.Louis,MO,U.S.A.）層上に積み重ねた密度１.０７７のフィコル− ヒパク層を含む遠沈管に入れ、７００ｘｇで３０分間遠心して密度１.０７７のフィコル−ヒパク層と血漿層との間の層から単球を、そして密度１.０７７のフィコル−ヒパク層と密度１.１１９のフィコル−ヒパク層との間の層から好中球を得た。分離された細胞を４℃ＨＢＳＳ（Ｃａ²⁺およびＭｇ²⁺を含有しない）で２回洗浄し、１０％牛胎児血清（FBS,Hyclone,Logan,UT,U.S.A.）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco,Grand Island,NY,U.S.A.）に懸濁させた。懸濁液を２４ −ウェル培養平板（Costar,Cambridge,MA,U.S.A.）のウェルに入れ、３７℃で２時間培養して単球、マクロファージおよび好中球を得た。（２）繊維芽細胞の分離ファンらの方法（Phan S.H.,et al.,J.Clin.Invest.,76,241(1985)）の変形を用いてラットから繊維芽細胞を次のように分離した。ラットをエーテルで麻酔させ、無菌作業台で肺臓を取り出した。肺臓を２ないし４ｍｍの大きさに細かく切り刻み、コラゲナーゼおよび０.５％トリプシンを含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させて３７℃で２時間組織を消化した。懸濁液を滅菌したガーゼに通して濾過し、消化されなかった組織などを除いた。分離した細胞はＰＢＳで２回または３回洗浄し、１０％牛胎児血清（FBS,Hycl one,Logan,UT,U.S.A.）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco,Grand Island,NY,U .S.A.）を懸濁させた。懸濁液を培養平板のウェルに入れ、５％ＣＯ₂培養器（Lu naire Environ,Inc.,Pennsylvania,U.S.A.）を用いて３７℃で１ないし２日間培養した。平板をＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して平板に付着していない細胞を除いた。新鮮な培地を平板に加え、密集層が形成されるまで培養を続けた。５回以下の継代培養を経た細胞を下記試験に用いた。ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞（ATCC CRL 1658）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で前述した条件下で培養した。（３）慢性関節リウマチ患者から滑膜細胞の分離慢性関節リウマチ患者の滑膜組織を冷ＰＢＳで３回洗浄し、滅菌はさみを使って２mmの大きさに細かく切った後、これをコラゲナーゼＡ（５mg／ml，BM,India napolis,IN,U.S.A.）とＤＮaseタイプＩ（０.１５mg／ml，Sigma）を含むＤＭＥＭ（Sigma,U.S.A.）に懸濁し、５％ＣＯ₂培養器を用いて３７℃で２時間培養した。その後、ここに０.５％トリプシン−０.２％ＥＤＴＡを加えて３０分間培養を続けた。消化された組織をＰＢＳで２回、およびＤＭＥＭで１回洗浄し、分離した細胞を１０％ＦＢＳを含有したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ）に懸濁させて一週間培養した。その後、トリプシン−ＥＤＴＡで滑液付着細胞を分離し、ＤＭＥＭで洗浄した後、ＤＭＥＭ−５％ＦＢＳに１０⁵細胞／mlの濃度で懸濁させた。懸濁液を２４ −ウェル培養プレートのウェルに１ml／ウェルの量で加え、３７℃で２４時間培養した。生成した培養液を次の実験に用いるために−２０℃で貯蔵し、その一部は継代培養して凍結状態で液体窒素タンクに貯蔵した。（４）エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物を用いた細胞の処理エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物を前記手順で得られた細胞５ｘ１０⁵／mlに種々の濃度で加え、細胞を５％ＣＯ₂培養器で３７℃で１時間前培養した。その後、シリカ（１００μｇ／ml）１mlおよび２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地１mlをそこに加え、細胞を前記と同一の条件下で４８時間培養した。培養上澄液を集め、１,５００rpmで１０分間遠心分離して細胞およびシリカを除いた。得られた上澄液をＰＢＳに対して透析し、０.２μm濾過注射器で濾過した後、濾液を−２０℃で貯蔵した。参照例２：エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物の細胞毒性検定エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物の細胞毒性は下記手順によって決定した。参照例１（１）で得られた単球およびマクロファージ５ｘ１０⁵細胞／mlずつをそれぞれ参照例１（４）の手順に従って、製造例で得られた抽出物ＡおよびＢ０.１、１および１０μg／mlずつで処理し、同一条件下で培養した。アリー（Al ley,M.C.）らの方法（Cancer Res.,48,589(1988)）によって、培養液を１ml／ウェルの量で培養プレートのウェルに入れ、３−４，５−ジメチルチアゾール−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ，Sigma）０.５mgを各ウェルに加えた。３７℃で４時間培養した後、培養液を遠心分離して上澄液を除いた。酸性化されたイソプロパノール０.０４ＮＨＣl（イソプロパノール溶液）１００μlずつを各ウェルの細胞に加えて生きている細胞によって生産されたホルマザンを溶離し、ＥＬＩＳＡリーダー（Titertek multiskan Ｍｃｃ／３４０）を用いて５４０nmでの光学密度（Ｏ.Ｄ.）を測定した（図１）。図１は、抽出物ＡまたはＢで処理しなかった対照群の光学密度を１００％と見なす場合、抽出物ＡまたはＢの濃度に対する試料の光学密度の相対値を示す。エス．テトランドラエス．ムーア抽出物の毒性によって単球およびマクロファージの生存率が減少するとホルマザンの生産も減少し、これによって光学密度が減小する。抽出物Ａで処理した試料は、抽出物Ａの濃度が１０μg／mlに及ぶまで、対照群と比べて大きい差を示さず、抽出物Ｂで処理された試料も同じような結果を示す。したがって、抽出物ＡおよびＢは１０μg／ml以下の濃度では細胞毒性を示さないことを確認し、以降、すべての試験は前記濃度範囲内で行った。抽出物ＡおよびＢ共に１００μg／mlの濃度では細胞毒性を示した。一方、抽出物ＣおよびＤの細胞毒性はラットを使って検査した。抽出物ＣおよびＤ４０mgをそれぞれ週２回１７週間ラットに経口投与した結果、ラットに対する毒性（死亡、体重減少など）がないことが判明した。実施例１：エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物によるヒト単球およびマクロファージでのＩＬ−６生産の阻害参照例１（１）で得られた単球／マクロファージを抽出物ＡまたはＢ０.１ないし１０μg／mlと共に１時間培養し、シリカ１００μg／mlで４８時間処理した。培養液を遠心分離して上澄液を得た後、これをＰＢＳに対して透析した。上澄液中のＩＬ−６の活性はＩＬ−６の依存性Ｂ９ハイブリドーマ菌株を用いて測定した。２Ｕ／mlの組み換えヒトＩＬ−６を加えた１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でＢ９菌株（Dr.Kishimoto,T.,Osaka University,Japan）を培養し、細胞を無血清培地で３回洗浄した。細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に５ｘ１０⁴細胞／mlの濃度で懸濁し、懸濁液を９６−ウェル培養プレートのウェルに１００μl／ウェルの量で入れた。その後、プレートを３７℃で５％ＣＯ₂ 下で６８時間培養した。³Ｈ−チミジン０.５μＣiを５０μl／ウェルの量でウェルに加え、培養を４時間続けた。培養が終わると、多重細胞採取機（Inotech）を使って細胞をガラス繊維濾過器に集め、結合された³Ｈ−チミジンの量を液体シンチレーション計測器（Beckman）で測定した。図２は、抽出物ＡまたはＢで処理しなかった対照群の³Ｈ−チミジン結合量を１００％と見なす場合、抽出物ＡまたはＢの濃度による³Ｈ−チミジン結合量の相対値を示す。図２から理解されるように、単球／マクロファージでのＩＬ−６の生産は、エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物ＡまたはＢの濃度に依存して阻害され、エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物ＡまたはＢの濃度が１０μg／mlである時５０％阻害された。実施例２：エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物によるラット肺マクロファージでのＩＬ−６生産の阻害ラットをケタミンで麻酔し、気管支に滅菌された細い管を挿入し、３０ml注射器を使ってＲＰＭＩ１６４０培地１０mlを３回繰り返して注入および吸入することによって肺マクロファージを得た。得られた細胞を４００ｘｇで５分間遠心分離し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地５０mlに懸濁させた後、３７℃ で２時間培養して培養プレートに付着させた。プレートをＰＢＳで２回洗浄して肺胞リンパ球（浮き上がる細胞）を除いて肺マクロファージを得た。肺マクロファージを２４−ウェル培養プレートのウェルに２ｘ１０⁵細胞／ウェルの量で入れ、シリカ１００μg／mlおよび抽出物Ａ１０μg／mlで３日間処理した。培養液を遠心分離して上澄液を得た後、これをＰＢＳに対して透析した。透析液中のＩＬ−６活性度は実施例１と同様の方法によってＩＬ−６依存性Ｂ９ハイブリドーマ菌株を用いて測定した。その結果、ラット肺マクロファージでのＩＬ−６の生産も抽出物Ａによって阻害されることが観察された（図３）。図３で、培地は何らの処理もしなかった対照群、Ｓiはシリカで刺激した試料、そしてＳi＋ＥＸＴはシリカで刺激し、抽出物Ａで処理した試料をそれぞれ示す。実施例３：抽出物ＣによるＩＬ−６生産の阻害実験的な硅肺症モデルを作るために、処理群当り各５匹のスプラグ−ダウリーラット（体重約１５０ｇ）の気管支をむき出しにした後、０.５mlのＰＢＳに溶解させたシリカ５００mgを注入した。シリカを注入してから１週間後、前記ラットに一週間に２回ずつ１７週間抽出物Ｃ４０mgを経口投与するか、またはマウスＩＬ−６抗体（ＭＩＬ−６Ａｂ、Im munex,Seatle,U.S.A.）２５０μgを静脈内にまたは腹腔内に注射した。実施例１と同様な方法で、血清でのＩＬ−６活性度（図４）および参照例１の２で得られた肺繊維芽細胞培養液でのＩＬ−６活性度（図５）を測定した。図４および図５から分かるように、ＩＬ−６の活性はいずれの場合でも抽出物Ｃによって阻害され、これはエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物が動物けい肺症モデルに対して阻害効果を有することを示す。図４および図５で、正常はＰＢＳで処理した対照群、siはシリカで刺激した試料、si＋ＥＸＴ．Ｃはシリカで刺激した後抽出物Ｃで処理した試料、si＋ＭＩＬ−６はシリカで刺激し後ＭＩＬ−６Ａbで処理した試料をそれぞれ示す。実施例４：エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物によるＩＬ−６遺伝子発現の阻害エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物がＩＬ−６遺伝子の発現を阻害するかの可否を確認するため、ＩＬ−６の過剰生産によって惹起された慢性関節リウマチ患者から得られた滑膜細胞（Hirano,T.,et al.,Eur.J.Immunol.,18,1797( 1988)）に対する前記抽出物の効果を次のように測定した。参照例１（３）で分離した滑膜細胞を培養プレートのウェル６個に１.５ｘ１０⁶細胞／ウェルの量で入れ、５％ＣＯ₂下で２４時間培養してウェルに付着させた。抽出物Ａｌμg／mlまたは１０μg／mlをウェルに加え、プレートを３７℃で５％ＣＯ₂下で３日間培養した。培養が終わると、培養液を遠心分離して上澄液を除き、沈殿した細胞をＰＢＳで洗浄した後、変性溶液（４Ｍチオシアン酸グアニジニウム、２５mＭクエン酸ナトリウム、pＨ７.０、０.１Ｍ２−メルカプトエタノール、０.５％サルコシン）５００μlをウェルに入れ、ピペッティングして破砕した。この溶液を管に移し、２Ｍクエン酸ナトリウム（pＨ４.０）５０μlおよび水−飽和性フェノール（water-saturated phenol）５００μlを加えてよく混合した。その後、２倍容量のクロロホルムを混合物に加え、生成した混合物を氷上に１０分間放置した後１２,０００rpmで遠心分離して上澄液を得た。上澄液にイソプロピルアルコール１mlを入れて−２０℃で２時間放置した後、１２,０００rpmで２０分間遠心分離して沈殿したペレットを得た。ペレットを７０％メタノールで洗浄し、乾燥した後、０.１％ジエチルピロカボネート水溶液２０μlに最終濃度１０μg／mlになるように溶解させた。このようにして得られたＲＮＡから単鎖ｃＤＮＡを合成するために、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Promega,U.S.A.）を用いて次のように逆転写反応を行った。反応管に５倍濃度の緩衝液（２５０mＭトリス−ＨＣｌ、pＨ８．３、３７５mＭＫＣl、１５mＭＭgＣl₂、５０mＭＤＴＴ）５μl、５μＭｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰがそれぞれ５μＭ）２μl、プライマーＮｏｔＩ−ｄＴ（５′−ｄＣＧＣＣＧＧＣＧ（Ｔ）₁₈−３′）１μl（０. ２μg）、蒸留水１μl、前記細胞ＲＮＡ１０μlおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（P romega,U.S.A.）１μl（２００Ｕ）を入れ、生成した溶液をよく混合した後、４２℃で３０分間反応させた。この溶液を９０℃で５分間加熱して反応を終えた。前記生成溶液を用いてｃＤＮＡを増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。前記逆転写反応生成溶液２０μl、１０倍濃度のＰＣＲ緩衝液（１００mＭトリス−ＨＣl，pＨ８.３、４００mＭＫＣl，１０mＭＤＴＴ，１５mＭＭgＣ l₂，５μg／mlＢＳＡ）８μl、５′−末端プライマー（５′−ＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣ−３′）１μl（２０pmol）、３′−末端プライマー（５′−ＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧ−３′）１μl （２０pmol）、蒸留水６９μlおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（promega,U.S . A.）１μl（２.５Ｕ）をよく混合し、混合物を９５℃で５分間処理して他の望ましくない酵素を阻害した。９５℃で１.５分；５５℃で１分；７２℃で１.５分で構成された温度サイクルを３０回繰り返すことによってＰＣＲを行い、反応混合物を最後に９５℃で１.５分；５５℃で１分；および７２℃で５分間反応させた。ＰＣＲ産物１０μlを１.０％アガロースゲルで１００Ｖで３０分間電気泳動させた。ゲルＥｔＢｒ溶液で１０分間染色し、蒸留水で洗浄した後、写真を取った（図６）。図６から分かるように、対照群として用いられた一定に発現されるアデニンホスホリボシル転移酵素（ＡＰＲＴ）ＲＮＡの発現は、抽出物Ｂの影響を受けないが、ＩＬ−６ＲＮＡの発現は抽出物Ｂの濃度１０μg／mlで著しく阻害される。この結果はエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物がＩＬ−６遺伝子の発現を阻害できるということを示す。図６で、Ｍ列は標準ＤＮＡサイズマーカーで、１０、１および０は抽出物Ｂの濃度（μg／ml）を示す。実施例５：エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物による滑膜細胞の増殖阻害参照例１（４）と同様の手順によって、ヒト単球／マクロファージを０.１ないし１００μg／ml範囲の濃度で抽出物Ａで処理して培養した。培養液をＰＢＳに対して透析し、透析液を滑膜細胞１ｘ１０⁴細胞に加えた後、細胞を５日間培養した。培養液に³Ｈ−チミジンを加えた後、細胞を４時間さらに培養し、液体シンチレーション計数器を使って細胞に結合された³Ｈ−チミジンの量を測定した（図７）。図７で分かるように、抽出物Ａは１０μg／mlの濃度で滑膜細胞の増殖を著しく阻害した。実施例６：エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物によるコラーゲン合成の阻害ＩＬ−６は繊維化を引き起こすサイトカインとして知られており、ラット繊維芽細胞でコラーゲン合成を誘導する（Kang,H.S.et al.,Korean J.Immunol.,14,1 93(1992)）。ＩＬ−６の前記作用を阻害するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物の能力を確認するため、ラット肺繊維芽細胞および肺組織でのコラーゲン合成に対する抽出物の阻害効果を測定した。ラット肺繊維芽細胞の培養液中に生成したコラーゲンの量は間接ＥＬＩＳＡ方法で測定し、肺組織の培養液中に生成したコラーゲンの量はヒドロキシプロリンの濃度を測定すると共に内部対照群の標準曲線を用いてコラーゲンの量を計算することによって決定した。ラット肺繊維芽細胞培養液中に合成されたコラーゲンの量を測定するため、内部対照群としてコラーゲン（Sigma、Type I）をペプシン１mg／mlを含む１Ｍ酢酸に溶かし、この溶液をコーティング緩衝液（０.０５Ｍ炭酸塩、pＨ９.６）で１μgないし１６pg範囲の濃度で５倍ずつ連続希釈した。希釈した溶液を平底マイクロタイタープレート（Dynatech,Cantilly,VA,U.S.A.,Immulon2）のウェルに１００μl／ウェルの量で加えた。一方、参照例１（２）で得たラット肺繊維芽細胞の培養上澄液１mlをスピードバック乾燥器（Savant,Hicksville,NY,U.S.A.）を使って１０ないし２０倍濃縮し、コーティング緩衝液（０.１ＭＮaＨＣＯ₃，０.０２％ＮａＮ₃；Ｎa₂ＣＯ₃でpＨを９.６に調整）１００μlに溶かし、この溶液を１００μl／ウェルの量でウェルに加えた後、４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ，０.０５ツイン２０、pＨ７.４）で３回洗浄し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ，Sigma）を１００μl／ウェルの量でウェルに加えた。プレートを室温で２時間培養してコーティングされない部分をブロックした。プレートを前記と同じ緩衝液で４回洗浄し、希釈緩衝液（０.０５ＭＴris−ＨＣl，１mＭＭgＣl₂・６Ｈ₂Ｏ、０.１５ＭＮaＣl，０.０２％Ｎa Ｎ₃、１％ＢＳＡ，０.０５％ツイン２０、pＨ８.１）で１、０００倍希釈したアルカリ性ホスファターぜ結合されたウサギ抗−ヤギＩgＧ（Cappel,Durham,NC,U. S.A.）を１００μl／ウェルの量でウェルに加えた。プレートを３７℃で２時間培養した後、前記と同じ緩衝液で３回洗浄した。基質緩衝液（０.０５ＭＮaＨＣＯ₃、１０mＭＭgＣl₂・６Ｈ₂Ｏ、pＨ９.８）で１mg／mlの濃度に希釈したｐ−ニトロフェニルリン酸１００μl／ウェルをウェルに加え、ＥＬＩＳＡリーダーを使って４０５nmで培養液のＯ.Ｄ.を測定した。生産されたコラーゲンの量はこのＯ.Ｄ.値と内部対照群のＯ.Ｄ.値から計算した。その結果、抽出物Ａの濃度１０μl／mlで３７℃で１時間前処理し、シリカ１００μl／mlで４８時間処理したラット肺繊維芽細胞の培養液では産生されたコラーゲンの量が著しく減少したことが観察された（図８）。図８で、si＋ＰＢＳはシリカで刺激した試料を示し、si＋ＥＸＴ．Ａは抽出物Ａで処理してシリカで刺激した試料を示す。また、実施例３の手順によって、ラット肺組織で合成されたコラーゲンの量を測定するために、ラットの気管支をむき出しにした後、シリカ５００mgを注入し、このラットに週２回ずつ１７週間１％ＤＭＳＯに溶かした抽出物Ｃ４０mgまたは１％ＤＭＳＯのみを経口投与させた後、次のようにヒドロキシプロリンの量を測定した。ラット肺組織０.１ないし０.２ｇをＰＢＳ１mlと混合した後、パイレックス管（Corning,Rochester,NY,U.S.A.）の中で粉砕した。生成した組織抽出物を超音波機（Heat system,Ｗ−３８０）で破砕し、ここにヒドロクロン酸（hydrochron ic acid）１mlを加え、この混合物を１２０℃乾燥器で一晩乾燥した。生成物を冷凍器で冷凍し、凍結乾燥器（Labconco）で凍結乾燥し、蒸留水１mlを加えて完全に溶解させた。生成した溶液５０μlを微量遠心分離管に加え、そこに蒸留水５０μlを加えて溶液を希釈した。内部対照群として、トランス−γ−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（Sigma）を２０μgないし１５０pg範囲の濃度に希釈し、それぞれの希釈液１００μlずつを微量遠心分離管に加えた。クロラミン−Ｔ（ナトリウムＮ−クロロ−Ｐ−トルエンスルホンアミド）１. ４１ｇをｎ−プロパノール１０mlと蒸留水１０mlに溶解させて製造した溶液０. ９mlを前記管に加え、これを室温で２０分間放置した後、この混合液に、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１５ｇをｎ−プロパノール６２mlに溶解させてから６０％過塩素酸２６mlを総容量１００mlになるように加えて作ったアルデヒド／過塩素酸溶液１mlを加えてよく混合した。微量遠心分離管を６５℃水浴に１５分間入れて発色させ、６５０nmで試料のＯ.Ｄ.を測定し、内部対照群の標準曲線を用いて試料中のヒドロキシプロリン量を計算した。図９から分かるように、正常なラット肺組織（正常）で生産されたコラーゲンの量を１００％と見なす場合、シリカのみで処理したか（si）、シリカおよびジメチルスルホキシドで処理した（si＋ＤＭＳＯ）ラット肺組織で合成されたコラーゲンの量は著しく多かったが、シリカ、ＤＭＳＯおよび抽出物Ｃで処理したラット肺組織（si＋ＥＸＴ．Ｃ）では、産生したコラーゲンの量が５０％減少した。この結果はエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物が抗繊維化活性を有することを示す。実施例７：エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物による反応性酸素類の生産阻害炎症反応は、種々の刺激剤で刺激された免疫細胞からＩＬ−６のような種々のサイトカインの分泌；前記サイトカインで刺激された他の免疫細胞によるホスホリパーゼＡ₂、リソソーム酵素、反応性酸素類などの生産；および前記生成物によって誘発される組織の損傷を含む一連の反応として知られている（Pruzanski, W.and Vadas,P.,Immunol.Today,12,143(1991)）。炎症反応を遮断するエス．テトランドラエス．ムーアの抽出物の能力は、反応性酸素類、たとえば、Ｈ₂Ｏ₂ およびＯ₂ ^-の生産に対する阻害活性を測定することによって評価した。Ｈ₂Ｏ₂の量は、９６−ウェルマイクロプレートを使った微量検定法によって次のように測定した。ＲＰＭＩ１６４０培地の入っている各ウェルに好中球５ｘ１０⁵細胞を加え、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（５００μg／ml，type II,Si gma）２５μlおよびフェノールレッド（１mg／ml）７５μlを各ウェル加えた。その後、細胞を抽出物Ａ１０、２０、および５０μg／mlで１時間処理し、１０^- ⁷ Ｍホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）で刺激した後、３７℃で６０分間反応させた。培養が終わった後、３ＭＮaＯＨを２５μl／ウェルの量でウェルに加えて反応を中止し、ＥＬＩＳＡリーダー（Dynatech Lab.Inc.）を使って６２０nmでＯ.Ｄ.を測定してフェノールの酸化による色の変化を測定し、Ｈ₂ Ｏ₂ の量は希釈したＨ₂Ｏ₂（Sigma）を用いて作成した標準曲線によって決定した。生産されたＯ₂ ^-の量を測定するため、ＲＰＭＩ１６４０培地に１ｘ１０⁶細胞／８００μlの濃度で懸濁した好中球を２４−ウェルプレートのウェルの一部に加え、空いているウェルにはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ，Sigma）１０μg／mlを加えた。プレートを３７℃で２分間放置し、チトクロムＣ（３mg ／ml，Sigma）を１００μl／ウェルの濃度でウェルに加えた。細胞を１０、２０および５０μg／mlの濃度の抽出物Ａで１時間処理し、刺激剤として１０^-7ＭＰＭＡを導入して３７℃で２０分間反応させた。１mＭＮ−エチルマレイミド（Sigma）をウェルに加えて反応を中止させ、培養液を１,６００ｘｇで１０分間遠心分離して上澄液を得た。チトクロムＣの還元によって惹起された上澄液の色の変化をＵＶ−Ｖis分光光度計（Kontron Instrument,Milano,Italy）を使って５５０ｎｍで測定した。生成したＯ₂ ^-の量をチトクロムＣの吸光計数（Ｅ_550nm ＝１.８３ｘ１０⁴mＭ^-1cm^-1）を使って２０分間１ｘ１０⁶細胞でチトクロムＣの還元を阻害できるＳＯＤの濃度で表した。表Ｉから分かるように、抽出物Ａは濃度５０μg／mlｇでＨ₂Ｏ₂生産を５０％阻害し、Ｏ₂ ^-の生産を２５％阻害する。この結果は抽出物Ａが炎症反応に対して強い阻害活性を有することを示す。一方、濃度１０μg／mlの抽出物Ａを用いて３７℃で１時間処理した後、シリカ１００μg／mlで刺激したヒト単球／マクロファージ５ｘ１０⁵細胞によって生産されたＨ₂Ｏ₂およびＯ₂ ^-の量を測定するために前記と同様な手順を繰り返した。図１０から分かるように、シリカで刺激し、抽出物Ａで処理した単球／マクロファージ（si＋ＥＸＴ．Ａ）は、シリカのみで刺激した対照群（si＋ＭＥＤ）に比べてＨ₂Ｏ₂およびＯ₂ ^-の量が著しく減少した。実施例８：エス．テトランドラエス．ムーア抽出物による肝硬変の阻害肝硬変（肝硬化）は肝全体の繊維化、繊維性中隔による肝実質の完全な破壊および再生性結節の形成を特徴とする。肝硬変は大部分慢性肝炎または慢性アルコール中毒から由来するが、その正確な原因は明らかではない。肝硬変患者の場合、炎症および繊維化に関与するＩＬ−６のようなサイトカインの量が増大した状態であり、したがって、エス．テトランドラエス．ムーアの抽出物による肝硬変の阻害はＩＬ−６に対する阻害活性によって測定できる。４週齢の雄スプラグダウリーラット（Nakataukasa,H.,et al.,J.Clin.Invest. ,85,1833-1843(1990)）に実験的に肝硬変を誘発させるために、ラットに１.０ml ／１００ｇ体重のＣＣｌ₄溶液（５０％ＣＣl₄＋５０％とうもろこし油）を１週間に２回腹腔内に注射し、抽出物Ａ、Ｂ、ＣまたはＤをそれぞれ０.２mlずつ１週間に２回ＣＣｌ₄の注射時に経口投与した。試験開始１３週後、各ラットをエーテルで麻酔し、心臓から血液試料を取って血清グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（sＧＯＴ）および血清グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（sＧＰＴ）値を測定した（図１１）。図１１から分かるように、対照群として用いられたＣＣl₄、ＤＭＳＯおよびＰＢＳで処理したラットから得られた血液試料と比べる際、抽出物ＡまたはＣで処理したラットから得られた血液試料のsＧＯＴ値は減少しなかったが、抽出物ＤまたはＢで処理したラットから得られた試料の場合、それぞれ２０％および４０％減少する。また、抽出物Ｂで処理したラットから得られた血液試料のsＧＰＴは６０％以上減少した。前記ラットから分離された肝の病理組織学的検査のため、肝を１０％中性ホルマリン水溶液に固定し、４mm厚さに展開した後、パラフィンに埋め込んだ。埋め込まれた組織を５mm厚さに切断し、ヘマトキシリンエオシンおよびマソン３色染色法で染色した後、顕微鏡で観察した（図１２）。図１２から理解されるように、正常の肝（Ａ）に比べてＣＣl₄のみを投与したラットの肝（Ｂ）においては厚くなった繊維性バンドを有する肝小葉の結節形成が明らかであった。ＣＣl₄および抽出物Ｂを投与したラットの肝（Ｆ）、ＣＣl₄ および抽出物Ｃを投与したラットの肝（Ｅ）およびＣＣl₄および抽出物Ｄを投与したラットの肝（Ｄ）では肝硬変の徴候が見られたが、肝小葉の結節を取り囲んでいる繊維性バンドはＣＣl₄のみで処理したラットから得られた肝に比べて減少した。ＣＣl₄および抽出物Ａを投与したラットの肝（Ｃ）では前記Ｄ、ＥおよびＦのものと比べて肝硬変に対する阻害効果が低かった。下記製剤例は例示するのみで、いずれの点でも本発明の範囲を制限するものではない。調製例下記成分を用いて硬質ゼラチンカプセルを製造した。量（mg／カプセル）活性成分２０乾燥澱粉１６０ステアリン酸マグネシウム２０合計２００mg 前記成分を混合して２００mg単位量で硬質ゼラチンカプセルに詰め込んだ。本発明を前記特定実施形態と関連させて記述したが、当該分野の熟練者は本発明を多様に変形および変化させ得、それらは添付した特許請求範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれると理解されるべきである。Detailed Description of the InventionStefania tetrandra extract that inhibits interleukin-6 production Field of the invention The present invention refers to interleukin-6 (hereinafter referred to as IL-6). ) Production of Stefania tetrandra esmoore (Stephania te trandra S. Moore) Extract, method for producing this extract and overproduction of IL-6 A pharmaceutical composition containing the extract, which is useful for the treatment of immune diseases caused by You. Background of the Invention Stefania japonica miers found in the southern region of South Korea and Jeju Island (Stephania japonica Miers) And Sinomenium Actam Red Ewi Ruth (Sinomenium acutum rehd et Wils) (Menispermace ae)) has long been used as an analgesic and anti-inflammatory agent. Meanwhile, South Korea Es not seen in. Tetrandra S. Moore (Menisperma keae) is in It has been traditionally used as a therapeutic agent for neuralgia and arthritis in countries and the like. In particular, Lucaloid tetrandrine is used as an anti-inflammatory and antihypertensive agent Came. S. Tetrandra S. Moore is a phagocytosis and antioxidant With fruits (Seow, W.k., et al., Int. Archs Allergy Appl. Immun.,85, 404 (1988)) , Was reported to be effective in clinical and experimental pneumoconiosis models (Li, Q., Et a l., Chinese J.Tuberc.Resp.Dis.,Four, 321 (1981); Xu, X., et al., Eoltoxicol.Enviro n.Safety,7, 306 (1983); and Liu, B., et al., Ecotoxicol.Environ.Safety,7, 3 23 (1983)), interleukin-1 secreted by human monocytes and tumor necrosis. It is known to have the ability to inhibit the production of factor-α (Seow, W.K., et., Cl in.Exp.Immunol.,75, 47 (1989); and Ferrante, A., et al., Clin. Exp. Immunol.,80 , 232 (1990)). Tetrandrine and its derivatives activate brain function And report (Tsumura & CO, WPI Acc.No.:92-231935(1992)) Developed as a hair growth promoter (Sunstar KK, WPI Acc. No .: 89-117236 (1989)) . As is well known, IL-6 is a regulatory factor involved in cell growth, differentiation and activation. It is. It is produced and secreted by various organ cells and is involved in the defense mechanism of the human body. Play an important role (Hirano, T., et al., Immunol. Today,11, 443 (1990)). IL-6, first discovered in monocyte cultures, induces antibody production by B cells (Muraguchi, A., et al., J. Immunol.,127, 412 (1981)). IL- 6 cDNAs were successfully cloned by Hirano, T. at al. Since (Nature,324, 73 (1986)), IL-6 is a B cell hybridoma (hybri doma) and plasmacytoma as growth factors (Snick, V.J., et al., Pr oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,83, 9679 (1986)), and as a factor involved in hematopoiesis (Koike, K., et., J.Exp.Med.,168, 879 (1988)). Sa Moreover, IL-6 stimulates T cell activation and growth (Lotz, M., et al., J. Exp. .Med.,167, 1253 (1988)), induces an acute phase response of hepatocytes. (Geiger, T., et al., Eur.J.Immunol.,18, 717 (1988)), cell differentiation in the nervous system (Satoh, T., Mol.Cell.Biol.,8, 3546 (1988)), the growth of keratinocytes Stimulates and regulates bone metabolism, stimulates mesangial cell growth, and It was reported to have functions such as inhibiting the growth of breast cancer cells. As previously reported, various factors have been reported if IL-6 production was not properly regulated. Disease occurs. Examples of reported diseases include rheumatoid arthritis (Hirano, T., et a l., Eur.J.Immunol.,18, 1797 (1988)), cirrhosis (Deviere, J., et al., Clin.Exp.Im munol.,77, 221 (1989)), psoriasis (Grossman, R.M., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U .S.A.,86, 6367 (1989)), multiple myeloma (Bataille, R., et al., J. Clin. Invest.,8 Four , 2008 (1989)), cardiac myxoma, AIDS (Miles, S.A., et al. ., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,87, 4068 (1990)) and other autoimmune diseases. Such observations are used to maintain homeostasis of the immune system in the human body and to treat and prevent diseases. I Supporting the fact that regulation of L-6 production is important. Therefore, numerous research methods have been proposed to regulate the production of interleukins. It has come. For example, using an antibody to IL-6 or the IL-6 receptor, IL Inhibition of myeloid cell proliferation in patients with myeloma by excessive secretion of -6 (Su zuki, H., Eur.J.Immuno.,twenty two, 1989 (1992)). However, IL-6 production was specifically No substance or method of inhibition has been reported so far, and therefore IL-6 There was a need to find inhibitors that could specifically inhibit production. Summary of the invention Therefore, an object of the present invention is to specifically inhibit the production of IL-6. Tet Randraes. To provide an extract obtained from the roots of Moore. Another object of the present invention is the treatment of immune disorders caused by overproduction of IL-6. To provide a pharmaceutical composition containing an effective amount of the extract. Brief description of the drawings The above and other objects and features of the present invention will be described below with reference to the accompanying drawings. It will be clear from the explanation. FIG. 1 shows S. cerevisiae on human monocytes and macrophages. Tetrandra S. Shows the cytotoxicity of Moore extracts A and B, FIG. 2 shows S. cerevisiae for IL-6 production in human monocytes and macrophages. Tet Randraes. Showing the inhibitory effect of Moore extracts A and B, FIG. 3 shows S. cerevisiae production of IL-6 in rat lung macrophages. Tetland Laes. Showing the inhibitory effect of Moore Extract A, FIG. 4 shows S. cerevisiae for IL-6 production in rats. Tetrandra S. Moore Showing the inhibitory effect of extract C of FIG. 5: S. cerevisiae for IL-6 production in rat lung fibroblasts. Tetrandra S. Showing the inhibitory effect of Moore Extract C, FIG. 6 shows S. cerevisiae on the expression of IL-6 gene in synovial cells of arthritis patients. Tetra Andraes. Showing the inhibitory effect of Moore Extract B, FIG. 7 shows S. cerevisiae on synovial cell proliferation in arthritis patients. Tetrandra S. M Showing the inhibitory effect of extract A of FIG. 8 shows S. cerevisiae on collagen production in rat lung fibroblasts. Tetrandra S. Showing the inhibitory effect of Moore Extract A, FIG. 9 shows S. cerevisiae on collagen production in rat lung tissue. Tetran de la es . Showing the inhibitory effect of Moore Extract C, FIG. 10 shows the production of reactive oxygen species in human monocytes and macrophages. . Tetrandra S. Showing the inhibitory effect of Moore Extract A, FIG. 11 shows GOT and GPT concentrations in serum of rats with induced cirrhosis. For S. Tetrandra S. The effects of Moore extracts A, B, C and D Shows, FIG. 12 shows S. cerevisiae for cirrhosis in rats. Tetrandra S. Moore extraction The effects of objects A, B, C and D are shown. Detailed description of the invention All documents referred to in this specification are incorporated herein by reference. In accordance with the present invention, Stefania Tetrandra es. Moore (Stephania te trandra S. Moore) Extract from the root of A.) is capable of specifically inhibiting the production of IL-6. Various immune disorders that have power and are therefore caused by overproduction of IL-6 It has been found to be useful in the treatment of S. Tetrandra S. The extract of Moore can be extracted from various solvents such as Methanol, ethanol, hexane, CH₂Cl₂Or a mixture of these, a physiological diet It can be produced using salt water, distilled water or the like. In particular, the Su. Tetrandra S. Moore extracts A, B, C and D are preferred below It can be manufactured according to the embodiment. Dried es. Tetrandra S. 1 to 3 liters of methanol per kg of moorish root Preferably 2 liters are added and the mixture is left at a temperature of 50 to 70 ° C. for 6 to 12 hours. Or at room temperature for at least 24 hours and then filtered. The above procedure is preferred Is Repeat 3 times, collect the filtrate, concentrate under reduced pressure, eg, under 7 mmHg and extract. Get thing A. 100 g of the extract A is added to 200 to 400 ml of methanol, preferably 250 ml and 200 to 400 ml of hexane, preferably 250 ml. This? The methanol fraction is separated and concentrated under reduced pressure. Ammonium hydroxide or hydroxide The residue is adjusted to pH 9 to 11 with sodium iodide. Steam product Water and CH₂Cl₂400 to 800 ml of mixed solution with (1: 1 (v / v)), preferably Dispense into 500 ml. CH from now on₂Cl₂Fraction, or alkaloid fraction After separating the fractions, the extract B is obtained by concentration under reduced pressure. On the other hand, dried S. Tetrandra S. 1kg of moorish root is crushed and sifted After pouring, add 50 to 200 mg / ml, preferably 100 to distilled water or physiological saline. Suspend at a concentration of mg / ml. This suspension at 80 to 100 ° C, preferably 95 ° C For 4 to 12 hours, preferably 6 hours. Filter the heated suspension and filter The liquid is concentrated under reduced pressure to obtain an extract C. Alternatively, dry es. Tetrandra S. Distill 1 kg of Moore root Mix with 1 to 3 liters of water, preferably 2 liters, 80 to 100 ° C, preferably 9 Heat at 5 ° C. for 4 to 15 hours, preferably 12 hours. Filter the heated mixture The filtrate is concentrated under reduced pressure. The residue is -70 to -90 ° C, preferably -80 ° C. Storage for 2 to 10 hours, preferably 8 hours, then 4 to 8 hours, preferably Is freeze-dried for 6 hours to obtain a powdery extract C. Further, the extract D was dried S. Tetrandra S. 1 kg of Moore root with ethano 1 to 3 liters, preferably 2 liters, and mix at 60 to 90 ° C For 12 hours or at room temperature for 24 hours or more Is obtained by concentrating the filtrate, which is collected by repeating three times, under reduced pressure. The extracts A, B, C and D each have an anti-inflammatory effect, And inhibits production of reactive oxygen species and Decrease GOT and GPT concentrations. So each of these alone Or as a mixture, rheumatoid arthritis, liver cirrhosis, psoriasis, multiple myeloma, cardiac mucus Immunity caused by overproduction of IL-6 such as edema, pneumoconiosis and AIDS It can be used in a pharmaceutical composition for the treatment of epidemics. Here, preferably, the extract A is inflammatory. For the treatment of sexually transmitted diseases, arthritis and fibrotic diseases; Extract B is arthritis and autoimmune liver Extract C for treatment of cirrhosis; Extract C for treatment of pneumoconiosis and liver fibrosis; Extract D for liver It can be used for the treatment of cirrhosis. Useful for treating immune diseases caused by overproduction of IL-6 The pharmaceutical composition of the present invention comprises S. Tetrandra S. Moorish A pharmaceutically acceptable excipient, carrier or diluent may be included with the extract. You. The pharmaceutical preparation can be manufactured by a conventional method. In preparing the composition, the active ingredient is mixed with a carrier, diluted, or encapsulated. Preferably, it is enclosed in a sachet or other carrier in the form of a container. Responsible When the body acts as a diluent, it acts as a solvent, excipient or medium for the active ingredient. It can be a solid, semi-solid or liquid substance used. Therefore, this composition is a tablet , Pills, powders, fragrances, elixirs, suspensions, emulsifiers, solutions, syrups, aerosols Such as capsules, soft and hard gelatin capsules, sterile injections, sterile packaging powders, etc. Can be in any form. Examples of suitable carriers, excipients and diluents are lactose, dextrose , Sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, algi Phosphate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, hydroxyammonium Methyl benzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate And mineral oil. The composition comprises a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and a protective agent. A preservative and the like can be further included. The composition of the invention is administered to a patient before Well known in the art for the rapid, sustained or delayed release of active ingredients Can be prepared by any method of The pharmaceutical composition may include oral, transdermal, subcutaneous, intravenous and intramuscular administration, It can be administered via various routes. The usual daily dose of the active ingredient is about 1 to 500. μg / kg body weight, preferably in the range of 30 to 300 μg / kg body weight, once Can be administered over several doses. However, the actual amount of active ingredient administered should be treated A variety of related factors, including symptoms, route of administration, patient age and weight, and patient symptoms Of course, the decision must be taken into account for the child, and therefore The dose does not limit the invention. The following Production Examples and Examples do not limit the scope of the invention, but the invention. It is for the purpose of detailed description, and unless otherwise specified, the The test method can be carried out by the following reference examples. In addition, the percentage of solids in liquids, liquids in liquids, and solids in liquids Fractions are weight / weight, volume / volume and weight / volume, respectively, unless otherwise noted. It is based on. Manufacturing example: S. Tetrandra S. Moore extract production Well dried es. Tetrandra S. Finely chopped Moore root (4.0 kg) And extracted with about 51 parts of methanol for 2 days. This extraction procedure was repeated 3 times and collected The extract was concentrated under reduced pressure to give about 224 g of methanol extract (extract A) in 5.6% yield. I got 200 g of Extract A was mixed with 500 ml of 90% methanol and 500 ml of n-hexane. 90% methanol layer is separated and concentrated under reduced pressure to remove methanol. Was. The residue was adjusted to 0.1M MH_FourAdjust to pH 10 with OH and distilled water: CH₂Cl₂(1: 1 (v / v)) mixture was distributed into 600 ml. Then CH₂Cl₂Layers, ie , The alkaloid fraction was separated and concentrated under reduced pressure to obtain 25 g of extract B in a yield of 0.6%. Was. On the other hand, Extract C for use in the pneumoconiosis treatment test was prepared as follows. Dry well Dry S. Tetrandra S. 1 kg of moorish root is crushed and sieved (60 mesh ) And then suspended in distilled water at a concentration of 100 mg / ml. 100 this suspension Heat at 6 ° C. for 6 hours and filter. The filtrate was concentrated under reduced pressure to give 8% yield. Tetland Laes. After obtaining 80 g of Moore's water extract (Extract C), it was stored at -20 ° C. Warehouse did. To produce Extract C for use in a cirrhosis treatment test, a well-dried S . Tetrandra S. Moorish roots 1113.5g with distilled water 21 Place in a 31 round bottom flask provided and heat the mixture at 95 ° C. for 12 hours then filter. did. The filtrate is concentrated under reduced pressure using a rotary vacuum evaporator (Buchi451) and is deep free. (SANYO, Japan) at -84 ° C for 3 hours and then freeze-dryer (EYELA) , Japan) and freeze-dried for 4 hours to obtain powdered extract C56.5 in 5.1% yield. 5 g were obtained. In addition, well dried S. Tetrandra S. 500 g of Moore root with ethanol Extraction with room temperature 1.51 for 3 days at room temperature. Repeat this extraction procedure three times The extract was concentrated under reduced pressure to give 2.6% yield. Tetrandra S. Moorish 13 g of ethanol extract was obtained. Reference Example 1: Separation of assay cells (1) Separation of human monocytes, macrophages and neutrophils Normal human peripheral blood is treated with heparin and the same amount of saline solution for Hanks cell culture is used. (Hank's balanced salt solution (HBSS): Mg²⁺And Ca²⁺Does not contain) Diluted. The diluted blood was treated with Ficoll-Hypa with a density of 1.119. que, Sigma, St.Louis, MO, U.S.A.) Ficoll with a density of 1.077 Place the tube in a centrifuge tube containing the Hipac layer and centrifuge at 700 xg for 30 minutes to obtain a density of 1.077. The monocytes from the layer between the Ficoll-Hipaku layer and the plasma layer and a density of 1.077 Neutrophils from the layer between the Ikol-Hipak layer and the Ficol-Hipak layer of density 1.119 I got Separated cells were incubated at 4 ° C in HBSS (Ca²⁺And Mg²⁺Does not contain) RPM containing twice washed 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Logan, UT, U.S.A.) I1640 medium (Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.) was suspended. 24 suspensions -Place in the wells of a well culture plate (Costar, Cambridge, MA, U.S.A.) at 37 ° C for 2 The cells were cultured for a period of time to obtain monocytes, macrophages and neutrophils. (2) Separation of fibroblasts Fan's method (Phan S.H., et al., J.Clin.Invest.,76, 241 (1985)) Fibroblasts were isolated from the rat using as follows. Rats were anesthetized with ether and lungs were removed on a sterile workbench. No 2 lungs Finely chop it into 4 mm pieces and add collagenase and 0.5% trypsin. The tissue was digested for 2 hours at 37 ° C. by suspending it in phosphate buffered saline (PBS) containing . The suspension was filtered through sterile gauze to remove undigested tissue etc. . The separated cells were washed 2 or 3 times with PBS and washed with 10% fetal bovine serum (FBS, Hycl RPMI1640 medium (Gibco, Grand Island, NY, U) containing one, Logan, UT, U.S.A. .S.A.) Was suspended. Put the suspension into the wells of the culture plate and add 5% CO₂Incubator (Lu naire Environ, Inc., Pennsylvania, U.S.A.) at 37 ° C for 1 to 2 days Nourished. The plate is washed with RPMI1640 medium to remove cells not attached to the plate. Was. Fresh medium was added to the plates and the culture continued until a confluent layer was formed. 5 times or more The cells that underwent the subculture below were used in the following test. RPMI1 containing NIH3T3 fibroblast (ATCC CRL 1658) in 10% FBS The cells were cultured in 640 medium under the conditions described above. (3) Isolation of synovial cells from patients with rheumatoid arthritis Wash synovial tissue of rheumatoid arthritis patient 3 times with cold PBS and use sterile scissors And then cut it into 2 mm pieces, and then use this for collagenase A (5 mg / ml, BM, India napolis, IN, U.S.A.) and DNase type I (0.15 mg / ml, Sigma) containing DME Suspended in M (Sigma, U.S.A.), 5% CO₂Incubate at 37 ° C for 2 hours using an incubator Was. After that, 0.5% trypsin-0.2% EDTA was added here and incubated for 30 minutes. Continued. The digested tissue was washed twice with PBS and once with DMEM and separated Suspended cells in DMEM containing 10% FBS (DMEM-10% FBS) Then, the cells were cultured for one week. Then, synovial fluid-adherent cells were separated with trypsin-EDTA and washed with DMEM. Then, add 10 to DMEM-5% FBS.^FiveSuspended at a concentration of cells / ml. 24 suspensions -Add 1 ml / well to wells of well culture plate and incubate at 37 ℃ for 24 hours. Nourished. The resulting culture solution was stored at -20 ° C for use in the next experiment, and a part thereof was stored. Were subcultured and stored in a liquid nitrogen tank in a frozen state. (4) S. Tetrandra S. Treatment of cells with Moore extract S. Tetrandra S. Moore extract 5x1 cells obtained by the above procedure 0^Five/ Ml at various concentrations and add 5% CO₂Pre-incubate for 1 hour at 37 ° C in an incubator Was. Then, RPMI1 containing 1 ml of silica (100 μg / ml) and 2% FBS. 1 ml of 640 medium was added thereto, and the cells were cultured under the same conditions as above for 48 hours. The culture supernatant was collected and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes to remove cells and silica. Was. The resulting supernatant was dialyzed against PBS and filtered with a 0.2 μm filter syringe. The filtrate was then stored at -20 ° C. Reference Example 2: S. Tetrandra S. Moore Extract Cytotoxicity Assay S. Tetrandra S. The cytotoxicity of Moore extract was determined by the following procedure. Specified. Monocytes and macrophages 5x10 obtained in Reference Example 1 (1)^FiveCells / ml According to the procedure of Reference Example 1 (4), respectively. The cells were treated with 0.1, 1 and 10 μg / ml each and cultured under the same conditions. Ally (Al ley, M.C.) et al.Cancer Res.,48, 589 (1988)), 1 ml / well of culture solution Volume of the wells in the wells of the culture plate and add 3-4,5-dimethylthiazole-2 , 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma) 0.5 mg in each well Added. After culturing at 37 ° C. for 4 hours, the culture solution was centrifuged to remove the supernatant. Acidified isopropanol 0.04N HCl (isopropanol solution) 10 Forma produced by living cells by adding 0 μl to each well Elute the xanthanes and use an ELISA reader (Titertek multiskan Mcc / 340) Was used to measure the optical density (OD) at 540 nm (FIG. 1). FIG. 1 shows that the optical density of the control group not treated with extract A or B was 100%. When done, the relative value of the optical density of the sample to the concentration of extract A or B is shown. D Su. Tetrandra S. Monocytes and macrophores due to the toxicity of Moore extract A decrease in the viability of diarrhea also reduces the production of formazan, which reduces the optical density. To reduce. Samples treated with Extract A until the concentration of Extract A reaches 10 μg / ml , The sample treated with extract B showed no significant difference compared with the control group, and the similar results were obtained. The result is shown. Therefore, extracts A and B were cytotoxic at concentrations below 10 μg / ml. It was confirmed that the substance did not show the property, and thereafter, all the tests were conducted within the above concentration range. Lottery Both the products A and B showed cytotoxicity at a concentration of 100 μg / ml. On the other hand, the cytotoxicity of extracts C and D was examined using rats. Extract C and And D40mg were orally administered to rats twice a week for 17 weeks. It was found that there was no toxicity (death, weight loss, etc.). Example 1: S. Tetrandra S. Human monocytes with Moore extract and Inhibition of IL-6 production in macrophages The monocytes / macrophages obtained in Reference Example 1 (1) were extracted with extract A or B0.1. Incubate with 10 μg / ml of chair for 1 hour and treat with 100 μg / ml of silica for 48 hours. . The culture solution was centrifuged to obtain a supernatant, which was dialyzed against PBS. Supernatant The IL-6 activity in the solution was measured using an IL-6-dependent B9 hybridoma strain. did. RPMI164 containing 10% FBS with 2 U / ml recombinant human IL-6 Culture B9 strain (Dr.Kishimoto, T., Osaka University, Japan) in 0 medium Were washed 3 times with serum-free medium. RPMI 1640 medium containing 10% FBS 5x10^FourSuspend at a concentration of cells / ml and add the suspension to a 96-well culture plate. 100 μl / well. Then plate the plate at 37 ° C with 5% CO₂ Incubated for 68 hours under.^Three0.5 μCi of H-thymidine was added in an amount of 50 μl / well. The culture was continued for 4 hours. After culturing, multiple cell harvester (Inotech) Cells were collected in a glass fiber strainer using^ThreeLiquid amount of H-thymidine It measured with the scintillation measuring device (Beckman). FIG. 2 shows a control group not treated with extract A or B.^ThreeThe amount of H-thymidine bound When considered as 100%, it depends on the concentration of extract A or B^ThreeOf the amount of H-thymidine bound Indicates a relative value. As can be seen from Figure 2, IL-6 on monocytes / macrophages The production of S. Tetrandra S. Depends on the concentration of Moore extract A or B And then blocked, S. Tetrandra S. The concentration of Moore extract A or B 50% inhibition was obtained at 10 μg / ml. Example 2: S. Tetrandra S. Rat lung macro with Moore extract Inhibition of IL-6 production in phage Anesthetize rat with ketamine, insert sterile thin tube into bronchus, and inject 30 ml Using a vessel, inject and inhale 10 ml of RPMI1640 medium three times. Lung macrophages were obtained by and. Centrifuge the obtained cells for 5 minutes at 400 xg Separate and suspend in 50 ml of RPMI1640 medium containing 10% FBS, then 37 ° C After culturing for 2 hours, the cells were attached to the culture plate. Wash the plate twice with PBS Lung macrophages were obtained except for alveolar lymphocytes (floating cells). Lung macrophages were added to the wells of a 24-well culture plate at 2x10.^FiveCell / c Of silica gel and treated with 100 μg / ml silica and 10 μg / ml extract A for 3 days did. The culture solution was centrifuged to obtain a supernatant, which was dialyzed against PBS. The IL-6 activity in the dialysate was determined by the same method as in Example 1 to depend on IL-6 B9. It measured using the hybridoma strain. As a result, IL-6 production in rat lung macrophages was also blocked by extract A. It was observed to be harmed (Figure 3). In Figure 3, the medium was treated without any treatment. Terumo, Si is a silica-stimulated sample, and Si + EXT is a silica-stimulated and extracted The samples treated with the item A are shown respectively. Example 3: Inhibition of IL-6 production by Extract C 5 sprag-dowley each per treatment group to create an experimental silicosis model After exposing the bronchus of a rat (body weight about 150 g), dissolve it in 0.5 ml of PBS. 500 mg of fumed silica were injected. One week after the silica injection, the rats were extracted twice a week for 17 weeks. Substance C 40 mg orally, or mouse IL-6 antibody (MIL-6 Ab, Im munex, Seatle, U.S.A.) 250 μg was injected intravenously or intraperitoneally. Example 1 In the same manner as in IL-6 activity in serum (FIG. 4) and Reference Example 1-2. The IL-6 activity (FIG. 5) in the cultured lung fibroblast culture medium was measured. As can be seen from FIGS. 4 and 5, the activity of IL-6 was in any case the extract. Inhibited by C. Tetrandra S. Moore extract is an animal It shows that it has an inhibitory effect on a pneumoconiosis model. Normal in Figures 4 and 5 Is a control group treated with PBS, si is a sample stimulated with silica, si + EXT. C is Siri Samples treated with extract C after stimulation with mosquitoes, si + MIL-6 were M after stimulation with silica Each of the samples treated with IL-6Ab is shown. Example 4: S. Tetrandra S. IL-6 gene from Moore extract Inhibition of expression S. Tetrandra S. Moore extract inhibits IL-6 gene expression In order to confirm whether or not there is a possibility of chronic arthritis induced by overproduction of IL-6, Synovial cells (Hirano, T., et al., Eur.J.Immunol.,18, 1797 ( 1988)) was measured as follows. The synovial cells isolated in Reference Example 1 (3) were added to 6 wells of the culture plate at 1.5 × 1. 0⁶Fill in the amount of cells / well, 5% CO₂Incubate for 24 hours under Was. Extract Al μg / ml or 10 μg / ml was added to the wells and the plate was incubated at 37 ° C. 5% CO₂Cultivated under 3 days. After culturing, the culture solution is centrifuged to remove the supernatant, and the precipitated cells are washed with PBS. After washing with water, denatured solution (4M guanidinium thiocyanate, 25 mM Sodium acidate, pH 7.0, 0.1M 2-mercaptoethanol, 0.5% sarcosine 500 μl) was put into a well and pipetted to disrupt. This solution into a tube Transfer, 50 μl of 2M sodium citrate (pH 4.0) and water-saturated phenol (Water-saturated phenol) (500 μl) was added and mixed well. Then double A volume of chloroform was added to the mixture and the resulting mixture was left on ice for 10 minutes. After that, centrifugation was performed at 12,000 rpm to obtain a supernatant. Isopropyl alcohol in the supernatant Add 1 ml of the solution and leave at -20 ° C for 2 hours, then centrifuge for 20 minutes at 12,000 rpm. A pellet was obtained which was separated and precipitated. Wash the pellet with 70% methanol, dry Then, add a final concentration of 10 μg / ml to 20 μl of 0.1% diethylpyrocarbonate aqueous solution. It was dissolved so that. In order to synthesize single-stranded cDNA from the RNA thus obtained, M-ML Reverse transcription reaction was carried out as follows using V reverse transcriptase (Promega, U.S.A.). reaction Add 5x concentrated buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM K) to the tube. Cl, 15 mM MgCl₂, 50 mM DTT) 5 μl, 5 μM dNTP mixture ( 5 μM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP) 2 μl Immers NotI-dT (5'-dCGCCGGCG (T)₁₈-3 ') 1 μl (0. 2 μg), 1 μl of distilled water, 10 μl of the cellular RNA and M-MLV reverse transcriptase (P Romega, U.S.A.) 1 μl (200 U) was added, and the resulting solution was mixed well and then 4 The reaction was carried out at 2 ° C for 30 minutes. This solution was heated at 90 ° C. for 5 minutes to complete the reaction. In order to amplify cDNA using the production solution, polymerase chain reaction (P CR). 20 μl of the above-mentioned solution for reverse transcription reaction, 10 times concentration of PCR buffer (100 mM Squirrel-HCl, pH 8.3, 400 mM KCl, 10 mM DTT, 15 mM MgC l₂, 5 μg / ml BSA) 8 μl, 5′-terminal primer (5′-ATGAACTC CTTCTCCACAAGCGC-3 ′) 1 μl (20 pmol), 3′-terminal plastic Immer (5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3 ') 1 μl (20 pmol), 69 μl of distilled water and Taq DNA polymerase (promega, U.S. . A.) 1 μl (2.5 U) was mixed well and the mixture was treated at 95 ° C. for 5 minutes to obtain the other desired Inhibited the wrong enzyme. 95 ° C for 1.5 minutes; 55 ° C for 1 minute; 72 ° C for 1.5 minutes PCR is performed by repeating the constructed temperature cycle 30 times, and the reaction mixture The product was finally reacted at 95 ° C for 1.5 minutes; 55 ° C for 1 minute; and 72 ° C for 5 minutes. . 10 μl of the PCR product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel at 100 V for 30 minutes. I let you. Stained with gel EtBr solution for 10 minutes, washed with distilled water, and photographed (FIG. 6). As can be seen from FIG. 6, the constantly expressed genes used as the control group. Expression of denine phosphoribosyl transferase (APRT) RNA affected the effect of extract B Although not affected, the expression of IL-6 RNA was significantly inhibited at a concentration of extract B of 10 μg / ml. Is done. This result is S. Tetrandra S. Moore extract is IL-6 inherited It shows that the expression of offspring can be inhibited. In Figure 6, column M is the standard DNA size marker. In Kerr, 10, 1 and 0 indicate the concentration of extract B (μg / ml). Example 5: S. Tetrandra S. Proliferation of synovial cells by Moore extract Inhibition By the same procedure as in Reference Example 1 (4), human monocytes / macrophages were treated with 0.1 The cells were treated with Extract A at a concentration in the range of 100 μg / ml and cultured. The culture solution is PBS Dialyzed against and dialyzed with synovial cells 1 x 10^FourAfter adding to cells, cultivate cells for 5 days Nourished. In culture^ThreeAfter addition of H-thymidine, the cells are further incubated for 4 hours and the liquid Bound to cells using a scintillation counter^ThreeMeasure the amount of H-thymidine (FIG. 7). As can be seen in FIG. 7, Extract A was enriched in synovial cells at a concentration of 10 μg / ml. The growth was significantly inhibited. Example 6: S. Tetrandra S. Collagen synthesis by Moore extract Inhibition IL-6 is known to be a cytokine that causes fibrosis, and rat fiber Induces collagen synthesis in blast cells (Kang, H.S. et al., Korean J. Immunol.,14, 1 93 (1992)). Which inhibits the action of IL-6. Tetrandra S. Moore In order to confirm the ability of the extract of L. corneum, collagen in rat lung fibroblasts and lung tissue The inhibitory effect of the extract on the biosynthesis was measured. In rat lung fibroblast culture The amount of collagen produced was measured by the indirect ELISA method, and the amount of collagen produced in the culture solution of lung tissue was measured. The amount of collagen formed was measured by the concentration of hydroxyproline and the internal control group Was determined by calculating the amount of collagen using the standard curve of. To measure the amount of collagen synthesized in rat lung fibroblast culture medium, Collagen (Sigma, Type I) as a control group 1M vinegar containing 1 mg / ml pepsin Dissolve in acid and add this solution with coating buffer (0.05M carbonate, pH 9.6). Five-fold serial dilutions were made in concentrations ranging from 1 μg to 16 pg. Add the diluted solution to a flat-bottom In a well of an icrotiter plate (Dynatech, Cantilly, VA, U.S.A., Immulon2) 100 μl / well was added. On the other hand, 1 ml of the culture supernatant of rat lung fibroblasts obtained in Reference Example 1 (2) was spun. Concentrate 10 to 20 times using a back dryer (Savant, Hicksville, NY, U.S.A.) Coating buffer (0.1M NaHCO 3_Three, 0.02% NaN_Three; Na₂C O_ThreePH was adjusted to 9.6) and dissolved in 100 μl, and this solution was added at 100 μl / well. Quantities were added to the wells and then coated overnight at 4 ° C. Wash plate 3 times with wash buffer (PBS, 0.05 Twin 20, pH 7.4) 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma) at 100 μl / well Added. Incubate the plate at room temperature for 2 hours to block the uncoated area. I'm sorry. The plate was washed 4 times with the same buffer as above and diluted with dilution buffer (0.05M). Tris-HCl, 1 mM MgCl₂・ 6H₂O, 0.15M NaCl, 0.02% Na N_ThreeDiluted 1,000 times with 1% BSA, 0.05% Twin 20, pH 8.1). Rukali phosphatase conjugated rabbit anti-goat IgG (Cappel, Durham, NC, U. S.A.) was added to the wells in a volume of 100 μl / well. The plate was incubated at 37 ° C. for 2 hours and then washed 3 times with the same buffer as above. Base Quality buffer (0.05M NaHCO_Three10 mM MgCl₂・ 6H₂O, pH 9.8) 100 μl / well of p-nitrophenyl phosphate diluted to a concentration of 1 mg / ml was used as a wafer. OD of the culture was measured at 405 nm using an ELISA reader. The amount of collagen produced was calculated from this OD value and the OD value of the internal control group. . As a result, silica A was pretreated with a concentration of extract A of 10 μl / ml at 37 ° C. for 1 hour. In the culture medium of rat lung fibroblasts treated with 00 μl / ml for 48 hours, It was observed that the amount of Lagen was significantly reduced (Figure 8). In Figure 8, si + PBS Indicates a sample stimulated with silica, and si + EXT. A is silica treated with Extract A The stimulated sample is shown. In addition, according to the procedure of Example 3, the amount of collagen synthesized in rat lung tissue was determined. For the measurement, after exposing the bronchus of the rat, 500 mg of silica was injected. , 40 mg of extract C dissolved in 1% DMSO twice a week for 17 weeks After oral administration of 1% DMSO only, the amount of hydroxyproline was determined as follows. It was measured. Rat lung tissue 0.1-0.2 g was mixed with 1 ml PBS and then Pyrex tube (Corning, Rochester, NY, U.S.A.). Ultrasonic generated tissue extract It is crushed with a wave machine (Heat system, W-380), and hydrochloric acid (hydrochronic acid) is added here. ic acid) 1 ml was added and the mixture was dried in a 120 ° C. oven overnight. Product Freeze in a freezer, freeze-dry in a freeze dryer (Labconco), and add 1 ml of distilled water to finish. It was completely dissolved. Add 50 μl of the resulting solution to a microcentrifuge tube and add distilled water to it. The solution was diluted by adding 50 μl. As an internal control group, trans-γ-hydroxy was used. Dilute S-L-proline (Sigma) to concentrations ranging from 20 μg to 150 pg, which 100 μl of each dilution was added to a microcentrifuge tube. Chloramine-T (sodium N-chloro-P-toluenesulfonamide) 1. A solution prepared by dissolving 41 g in 10 ml of n-propanol and 10 ml of distilled water was prepared. After adding 9 ml to the tube and allowing it to stand at room temperature for 20 minutes, p-di Dissolve 15 g of methylaminobenzaldehyde in 62 ml of n-propanol. Aldehyde made by adding 26 ml of 60% perchloric acid to a total volume of 100 ml / 1 ml of perchloric acid solution was added and mixed well. Place the microcentrifuge tube in a 65 ° C water bath for 15 The sample was placed for a minute to develop color, and the OD of the sample was measured at 650 nm, and the standard curve of the internal control group was measured. Was used to calculate the amount of hydroxyproline in the sample. As shown in FIG. 9, collagen produced in normal rat lung tissue (normal) When considering the amount of 100% to be treated with only silica (si), silica and di Collagen synthesized in rat lung tissue treated with methylsulfoxide (si + DMSO) The amount of DNA was significantly higher, but it was treated with silica, DMSO and extract C. In lung tissue (si + EXT.C), the amount of collagen produced was reduced by 50% . This result is S. Tetrandra S. Moore extract has anti-fibrotic activity Indicates that Example 7: S. Tetrandra S. Of reactive oxygen species by Moore extract Production inhibition Inflammatory responses can be induced by immune cells stimulated by various stimulants in various ways such as IL-6. Secretion of cytokines; phosphos by other immune cells stimulated by said cytokines Lipase A₂Production of lysosomal enzymes, reactive oxygens, etc .; It is therefore known as a series of reactions that include tissue damage induced (Pruzanski, W.and Vadas, P., Immunol.Today,12, 143 (1991)). S that blocks inflammatory reaction. Te Trandra Es. The capacity of Moore's extract depends on reactive oxygen species such as H 2₂O₂ And O₂ ^-It was evaluated by measuring the inhibitory activity against the production of. H₂O₂The amount of was determined by microassay using a 96-well microplate. Was measured. Neutrophil 5x1 in each well containing RPMI1640 medium 0^FiveAdd cells and add horseradish peroxidase (500 μg / ml, type II, Si 25 μl of gma) and 75 μl of phenol red (1 mg / ml) were added to each well. The cells were then treated with Extract A10, 20, and 50 μg / ml for 1 hour, 10^- ⁷ After stimulation with M phorbol myristate acetate (PMA), 60 at 37 ° C Let react for minutes. After culturing, add 3M NaOH at a volume of 25 μl / well. Well, stop the reaction and use an ELISA reader (Dynatech Lab. Inc.) OD at 620 nm to measure the color change due to the oxidation of phenol.₂ O₂ Amount of diluted H₂O₂(Sigma) was used to determine the standard curve. O produced₂ ^-1x10 in RPMI1640 medium to measure the amount of⁶cell / 800 μl of neutrophils suspended in a part of the wells of a 24-well plate In addition, empty wells have superoxide dismutase (SOD, Sigma) 10 μg / ml was added. The plate was left at 37 ° C for 2 minutes, and cytochrome C (3 mg / Ml, Sigma) was added to the wells at a concentration of 100 μl / well. 10 to 20 cells And treated with Extract A at a concentration of 50 μg / ml for 1 hour and used as stimulant 10^-7M PMA was introduced and reacted at 37 ° C. for 20 minutes. 1 mM N-ethylmaleimide (Sigma) was added to the wells to stop the reaction, and the culture medium was added at 1,600 xg for 10 minutes. Centrifugation gave a supernatant. Color of supernatant caused by reduction of cytochrome C Of the change in UV-Vis spectrophotometer (Kontron Instrument, Milano, Italy) It was measured at 550 nm. Generated O₂ ^-Of the amount of cytochrome C (E_550nm = 1.83 x 10^FourmM^-1cm^-1) For 20 minutes 1x10⁶Cytochrome C in cells It was expressed as the concentration of SOD that can inhibit the reduction. As can be seen from Table I, Extract A is concentrated H at 50 μg / mlg₂O₂Production is inhibited by 50%, O₂ ^-25% inhibition of the production of This result shows that Extract A has a strong inhibitory activity on the inflammatory response. On the other hand, after treating with Extract A having a concentration of 10 μg / ml at 37 ° C. for 1 hour, Human monocytes / macrophage 5x10 stimulated with 100 μg / ml^FiveLive by cells H was born₂O₂And O₂ ^-Repeat the same procedure as above to determine the amount of . As can be seen in Figure 10, monocytes / macros stimulated with silica and treated with extract A. Phage (si + EXT.A) was added to a control group (si + MED) stimulated with silica only. Compared to H₂O₂And O₂ ^-The amount of was significantly reduced. Example 8: S. Tetrandra S. Inhibition of cirrhosis by Moore extract Cirrhosis (liver cirrhosis) is a fibrosis of the entire liver and complete destruction of the liver parenchyma due to fibrous septum. And the formation of regenerative nodules. Cirrhosis is mostly chronic hepatitis or chronic alcohol The exact cause of this is unclear. For patients with cirrhosis , Increased levels of cytokines such as IL-6 involved in inflammation and fibrosis Therefore, S. Tetrandra S. Liver cirrhosis with Moore extract Inhibition of the alteration can be measured by the inhibitory activity against IL-6. 4-week-old male Sprague Dawley rats (Nakataukasa, H., et al., J. Clin. Invest. ,85, 1833-1843 (1990)) to induce cirrhosis experimentally in rats with 1.0 ml / 100g body weight CCl_FourSolution (50% CCl_Four+ 50% corn oil) for 1 week Inject twice intraperitoneally with 0.2 ml each of Extract A, B, C or D. CCl twice a week_FourWas orally administered at the time of injection. 13 weeks after the start of the test, each rat was Anesthetize with blood, take a blood sample from the heart, and collect serum glutamate-oxaloacetate. Lance aminase (sGOT) and serum glutamate-pyruvate transa Minase (sGPT) values were measured (Fig. 11). As shown in FIG. 11, CCl used as a control group_Four, DMSO and P Treated with extract A or C when compared to blood samples obtained from rats treated with BS. The sGOT value of the blood sample obtained from the treated rat did not decrease, but the extract D Or 20% and 40% respectively for samples obtained from rats treated with B %Decrease. Also, sGPT of a blood sample obtained from a rat treated with Extract B Has decreased by more than 60%. For the histopathological examination of the liver isolated from the rat, the liver was washed with 10% neutral hormon. It was fixed in a marine aqueous solution, developed to a thickness of 4 mm, and then embedded in paraffin. Filling Cut the embedded tissue to a thickness of 5 mm and stain with hematoxylin-eosin and mason 3 colors After staining with the color method, the cells were observed under a microscope (Fig. 12). As can be seen from FIG. 12, CCl is higher than that of normal liver (A)._FourAdministered only Nodular formation of hepatic lobules with thickened fibrous bands in rat liver (B) Was evident. CCl_FourAnd liver of rat treated with extract B (F), CCl_Four (E) and CCl of rats treated with C and extract C_FourAnd administer extract D Signs of liver cirrhosis were seen in the liver (D) of the isolated rat, which surrounded the nodule of the hepatic lobe. The extensible fibrous band is CCl_FourDecreased compared to liver obtained from rats treated with only did. CCl_FourAnd the liver (C) of the rat to which the extract A was administered, the D, E and The inhibitory effect on liver cirrhosis was lower than that of F. The following formulation examples are merely examples and are not intended to limit the scope of the present invention in any respect. There is no. Preparation example Hard gelatin capsules were prepared using the following ingredients. Amount (mg / capsule) Active ingredient 20 Dried starch 160Magnesium stearate 20 200 mg in total The above ingredients were mixed and packed into hard gelatin capsules in 200 mg units. Although the present invention has been described in connection with the above specific embodiments, those skilled in the art will appreciate that The light can be variously modified and varied, which are defined by the appended claims. It should be understood that it is included within the scope of the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者カン，ヒュンシク大韓民国302−280テジョン、ソー−ク、ウォルピュン−ドン（番地の表示なし）ジョンウォン・アパートメント102−1401 (72)発明者リー，ジュンジョン大韓民国305−333テジョン、ユソン−ク、エウン−ドン（番地の表示なし）ハンビット・アパートメント132−201 (72)発明者キム，ヨンホー大韓民国305−333テジョン、ユソン−ク、エウン−ドン（番地の表示なし）ハンビット・アパートメント125−1504────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (72) Inventor Kang, Hyunsik Republic of Korea 302-280 Daejeong, soak, w Orpyun-Don (No address displayed) Yongwon Apartment 102-1401 (72) Inventor Lee, Junjung Republic of Korea 305-333 Daejeon, Yousung-ku, Eun-Don (No address displayed) Hambi Apartment 132-201 (72) Inventor Kim, Yongho Republic of Korea 305-333 Daejeon, Yousung-ku, Eun-Don (No address displayed) Hambi Apartment 125-1504

Claims

[Claims] 1. Stefania tetrandras., Useful in the treatment of immune disorders caused by overproduction of interleukin-6. Extract of Moore ( Stephania tetrandra S. Moore ) root. 2. The extract according to claim 1, which has been extracted with methanol, ethanol, CH ₂ Cl ₂ , water or a mixture thereof. 3. S. Tetrandra S. Add methanol to Moore roots; heat the mixture in the temperature range of 50-70 ° C. for 6-12 hours or stir at room temperature for at least 24 hours; filter the mixture to obtain a filtrate; concentrate the filtrate The extract according to claim 2, which is produced by a method including a step of obtaining an extract A by the method. 4. Partitioning the extract A obtained in claim 3 with methanol and hexane to obtain a methanol fraction; concentrating the methanol fraction; adjusting the pH of the concentrate to a range of 9 to 11; adjusting the pH A concentrated solution obtained by partitioning the concentrated solution with distilled water and CH ₂ Cl ₂ to obtain a CH ₂ Cl ₂ fraction; and concentrating the CH ₂ Cl ₂ fraction to obtain an extract B. Item 2. The extract according to Item 2. 5. S. Tetrandra S. Moorish root powder is suspended in an aqueous solution at a concentration of 50 to 200 mg / ml; the suspension is heated at a temperature range of 80 to 100 ° C. for 4 to 12 hours; the heated suspension is filtered; The extract according to claim 2, which is produced by a method including a step of obtaining an extract C by the method. 6. S. Tetrandra S. Water is added to the Moorish roots; the mixture is heated in the temperature range of 80 to 100 ° C for 4 to 12 hours; the heated mixture is filtered; the filtrate is concentrated; the filtrate is in the temperature range of -70 to -90 ° C. The extract according to claim 2, which is prepared by a method comprising storing for 2 to 10 hours; and lyophilizing it for 4 to 8 hours to obtain an extract C. 7. S. Tetrandra S. Ethanol is added to Moorish roots; the mixture is heated in the temperature range of 60 to 90 ° C. for at least 4 hours; the heated mixture is filtered; the filtrate is concentrated to obtain the extract D. The extract according to claim 2. 8. A pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the extract of claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.