JPH09505992A

JPH09505992A - 腫瘍サプレッサー遺伝子，それらによってコードされる蛋白質ならびにそれらの遺伝子および蛋白質の使用

Info

Publication number: JPH09505992A
Application number: JP7512034A
Authority: JP
Inventors: キムチ，アディ
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1993-10-12
Filing date: 1994-10-12
Publication date: 1997-06-17
Anticipated expiration: 2021-06-28
Also published as: EP0804613B1; DE69434315D1; IL107250A; IL107250A0; EP0804613A1; JP3791927B2; CA2174136A1; WO1995010630A1; EP1586642A2; ATE291619T1; EP0804613A4; ES2240971T3; DE69434315T2

Abstract

(57)【要約】本発明は，ある種の遺伝子の発現の阻害がサイトカイン誘導細胞死に拮抗するとの先駆的発見に基づくものである．これらの遺伝子が正常に機能する限り，サイトカインは細胞死を誘導するが，上記遺伝子の発現が阻害されるとサイトカイン誘導細胞死は阻害される．これから，その正常な発現がサイトカイン誘導細胞死であることになる．ＨｅＬａ細胞において，ＩＮＦ−γは，初期の細胞増殖抑制相とそれに続く細胞障害相（プログラム細胞死）からなる二相性の過程を誘発する．本発明によって発見された新規な遺伝子は，後者，すなわち細胞障害相にのみ影響することが見出された．「ＤＡＰ」（死関連蛋白質）遺伝子と呼ぶこれらの遺伝子には，ＤＡＰ遺伝子の発現産物またはそれと類似の生物活性を有する発現産物をコードするコード配列からなるＤＮＡ分子（時に集合的に「ＤＡＰＤＮＡ分子」と呼ぶ）が包含される．ＤＡＰＤＮＡ分子の発現産物は時に集合的に「ＤＡＰ産物」と呼ばれる．

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍サプレッサー遺伝子，それらによってコードされる蛋白質ならびにそれらの遺伝子および蛋白質の使用発明の分野本発明は，一般的には腫瘍サプレッサー遺伝子，とくにサイトカイン誘導細胞死に関する．発明の背景細胞の増殖状態を決定する因子の一つは，プロトオンコジーンの増殖促進作用と腫瘍サプレッサー遺伝子の増殖抑制作用の間のバランスである．これらの腫瘍サプレッサー遺伝子がそれらの増殖抑制作用を発揮する機構の一つは，細胞に生理学的タイプの死を誘導する機構である．このような制御された細胞死は，多くの生理学的状態，たとえば変態，ニューロンのシナプス形成，受容体レパトア選択時におけるリンパ球の死，骨髄および他の増殖性組織における制御されたホメオスタシス等において証明されている．このような細胞死は細胞と他の細胞または細胞産物との相互作用により，たとえば適当なサイトカインの活動を介して調節される．サプレッサー遺伝子を不活性化する遺伝子変異は細胞を他の細胞により負荷される正常な増殖抑制から開放し，その結果，外部シグナルとは無関係な制御されない細胞増殖を生じる．この制御されない増殖が腫瘍形成の第一歩である．今日まで，網膜芽細胞腫（Ｒｂ）遺伝子，ｐ５３，ＤＣＣ，ＮＭ２３，ＷＴ− １，ＮＦ−１，ＡＰＣ，およびｒａｓサプレッサー遺伝子を含めて，特性が完全に解明された腫瘍サプレッサー遺伝子は数種のみである．発現の遮断または欠陥蛋白質の産生を招く上記遺伝子のいずれか，多分両対立遺伝子における変異は，細胞の増殖および生存度の正常な制御を妨害し，癌を起こすことになる．増殖抑制サイトカインは標的細胞に対して二重の作用をもっている．それらは細胞増殖の阻止および／または細胞死の惹起が可能である．今日まで，既知の腫瘍サプレッサー遺伝子の発現の遮断または活性化は細胞増殖のサイトカインによる抑制にそれぞれ拮抗的または促進的に働くことが明らかにされた（A.Kimchi,1 992,J.Cell Biochem.，50:1-9 の総説参照）が，サイトカインの死促進作用には何ら影響を与えなかった．たとえば，サイトカインたとえばＴＧＦ−βに対する増殖抑制応答はＲｂ遺伝子の不活性化によって著明に低下し，またＩＬ−６に対する応答は活性化ｐ５３遺伝子の導入によって増大した（Pietenpolら,1990，Ce ll，61:777-785; Levyら,1993，Cell Biol．13:7942-7952）．小さな水素運搬蛋白質であるチオレドキシンは以前ＨｅＬａ細胞のＩＦＮ−γ 誘導増殖停止と関連づけられていた（Deiss,L.P．& Kimchi,A.,1991，Science， 234:117-120）．発明の要約以下の記述で，「プログラム細胞死（programmed cell death）」の語は，ある種の細胞性機構の活性化によって生じる生理学的タイプの細胞死，すなわち細胞機械によって制御される死を意味して使用される．プログラム細胞死は，たとえば，細胞死を導く外部の引き金たとえばサイトカインによる細胞機械の活性化によって起こるものと考えられる．本発明は，ある種の遺伝子の発現の阻害がサイトカイン誘導細胞死に拮抗するとの先駆的発見に基づくものである．すなわち，これらの遺伝子が正常に機能している限りはサイトカインは細胞死を誘導するが，上記遺伝子の発現が阻害されると，サイトカイン誘導細胞死は阻害される．これから，これら遺伝子の正常な発現産物がプログラム細胞死とくにサイトカイン誘導細胞死に関与することがわかる．ＨｅＬａ細胞において，ＩＦＮ−γは，初期の細胞増殖抑制相とそれに続く細胞傷害相（プログラム細胞死）からなる二相性の過程を誘導する．本発明によって発見された新規な遺伝子は，後者，細胞傷害相にのみ影響することが見出された．これらの遺伝子は，本明細書においては「ＤＡＰ（死関連蛋白質）遺伝子」と呼ぶことにする．ＤＡＰ遺伝子の発現産物，または類似の生物活性を有する発現産物をコードするコード配列からなるＤＮＡ分子は，本明細書においては時に集合的に「ＤＡＰＤＮＡ分子」と呼ぶ．ＤＡＰＤＮＡ分子の発現産物は本明細書においては時に集合的に「ＤＡＰ産物」と呼ばれる．本発明の一態様，以下「死促進態様」と呼ぶ態様においては，上述のＤＡＰＤＮＡ分子，それらからなる発現ベクターまたはＤＡＰ産物が，正常細胞または腫瘍細胞の死を促進するために使用される．死促進態様の特定の適用には，制御されない病的な細胞増殖を伴う疾患または障害，たとえば癌，乾癬等の治療への適用がある．本発明の死促進態様による，遺伝子療法におけるＤＡＰＤＮＡ分子の使用または細胞外で製造された場合のＤＡＰ産物の使用は，サイトカイン，たとえばＩＦＮ−γと併用することができる．本発明の他の態様，以下「死防止態様」と呼ぶ態様においては，上記ＤＡＰＤＮＡ分子の発現を防止する薬剤，またはＤＡＰ産物と拮抗するか，それを阻害または中和する薬剤がプログラム細胞死から細胞を保護するために使用される．本発明の死防止態様の可能な適用例には，様々な変性神経疾患たとえばニューロンの特定のサブセットの未熟死を伴うアルツハイマー病またはパーキンソン病における細胞死の防止，プログラム細胞死に類似するエイズ患者におけるＴ細胞の死の防止，その少なくとも一部はプログラム細胞死によって起こると考えられている移植体における拒絶に関連する細胞死の防止，ある種の抗癌療法の細胞傷害作用からの正常細胞の保護等がある．以下時に「スクリーニング態様」と呼ばれる本発明のさらに他の態様においては，ＤＡＰＤＮＡ分子は，癌の素因について個体をスクリーニングするために使用される．この態様によれば，スクリーニングは，個体において，それぞれのＤＡＰＤＮＡ分子の配列を対応するＤＡＰ遺伝子のそれぞれと比較することによって行われる．ＤＡＰ遺伝子の不存在，一部欠失，または必須領域における変異を指示する配列における他の差異は，機能の喪失，その結果として癌の素因を生じる可能性がある．スクリーニングには好ましくは，一連の異なるＤＡＰ遺伝子が使用される．ＤＡＰ遺伝子はプログラム細胞死に重要な役割を果たしていると思われ，それらの発現の阻害またはそれらの発現産物の中和は，細胞をサイトカイン促進細胞死から保護する．このような遺伝子の例には，その配列を図６，８および12に，その部分配列を図13および14に示す遺伝子がある．配列を図15に示す既知のプロテアーゼ，カテプシンＤの遺伝子もＤＡＰ遺伝子として機能することがここではじめて明らかにされる．本発明の死促進態様において有用なＤＡＰＤＮＡ分子は，ＤＡＰ遺伝子の核酸配列，またはＤＡＰ産物の場合と類似の生物活性を有する産物をコードする他の配列であってもよい．このようなＤＡＰ分子には，ＤＡＰ遺伝子とは異なる配列を有するＤＮＡ分子も包含されるが，これらは遺伝子コードの縮重の性質により，ＤＡＰ遺伝子によってコードされるのと同じ蛋白質またはポリペプチドをコードするものである．ある生物学的機能に必須ではないある種のアミノ酸の置換もしくは欠失，または蛋白質の生物学的機能に必須ではない領域でのアミノ酸の付加により，蛋白質の生物活性に本質的な影響を与えないで蛋白質を修飾できる場合があることはよく知られている．すなわち，本発明の死促進態様に有用なＤＡＰＤＮＡ分子もこのような修飾蛋白質をコードする修飾配列をもつことができる．修飾配列は，ＤＡＰ遺伝子の配列または上述の縮重配列から誘導され，１個または２個以上の核酸トリプレットが付加，欠失または置換され（配列のオープンリーデフィングフレームにおいて），それによってコードされる蛋白産物がそのＤＡＰ産物の主要な生物学位的性質を維持している配列を有する．さらに，蛋白質のフラグメントが時に，母体の断片化されていない蛋白質の主要な生物学的性質を維持することも知られている．したがって，本発明の死促進態様に有用なＤＡＰＤＮＡ分子はこのようなフラグメントをコードする配列を有していてもよい．本発明の死防止態様に有用なＤＮＡ分子は，ＤＡＰ遺伝子の配列に対してアンチセンス配列である配列，またはその遮断のみでＤＡＰ遺伝子の発現阻害に十分なＤＡＰ遺伝子の部分のアンチセンス配列とすることができる．この遺伝子部分はＤＡＰ遺伝子のコード部分または非コード部分のいずれであってもよい．アンチセンス配列のｍＲＮＡトランスクリプトはＤＡＰ遺伝子のｍＲＮＡトランスクリプトにハイブリダイズして，最終的な蛋白発現を妨害する．本発明の死防止態様に有用な他のＤＮＡ分子は，非修飾ＤＡＰ産物の活性を優性の負の様式で，たとえば触媒的に不活性なキナーゼ（ＤＡＰキナーゼ）またはその細胞内での存在がネイティブな蛋白質の正常な活性にたとえば修飾蛋白質と非修飾蛋白質からなり不活性な欠陥ヘテロダイマーの産生等によって干渉する他の修飾蛋白質によって阻害できる修飾ＤＡＰ産物をコードするＤＮＡ分子である．本発明のスクリーニング態様に有用なＤＮＡ分子はＤＡＰ遺伝子の配列またはそのフラグメント配列からなる．さらに，上述のアンチセンスＤＮＡ配列も本発明のスクリーニング態様に使用することができるしたがって，本発明は以下の群から選択される配列からなるＤＮＡ分子を提供する．（ａ）発現がサイトカイン誘導プログラム細胞死の誘発に必須の遺伝子，（ｂ）（ａ）に定義された遺伝子によってコードされるのと同じ蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列，（ｃ）１個または２個以上の核酸トリプレットが付加，欠失または置換された（ａ）または（ｂ）の修飾ＤＮＡ配列であり，その修飾ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質またはポリペプチドは（ａ）または（ｂ）に定義された遺伝子によってコードされる蛋白質またはポリペプチドと同様にサイトカイン誘導プログラム細胞死を誘発する修飾ＤＮＡ配列，（ｄ）上記生物活性を有する蛋白質またはポリペプチドをコードする（ａ），（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡ配列のフラグメント．（ｅ）（ａ）のＤＮＡ分子の全体または部分に対してアンチセンスであり，上記遺伝子の発現を阻害できる配列，ならびに（ｆ）１個または２個以上の核酸トリプレットが付加，欠失または置換された（ａ）または（ｂ）の修飾ＤＮＡ配列であり，その修飾配列によってコードされる蛋白質またはポリペプチドは，上記サイトカイン誘導プログラム細胞死を阻害する上記蛋白質またはポリペプチドの能力によって明白な優性の負の効果を有する修飾ＤＮＡ配列．特定の実施態様によれば，本発明は．以下の群から選択される核酸配列からなるＤＮＡ分子を提供する．（ａ）図６に示した配列の位置 160〜162 における核酸トリプレットに始まりトリプレット 466〜468 に終わるコード配列からなるＤＮＡ配列，（ｂ）図６に示した配列の位置 287〜289 における核酸トリプレットに始まりトリプレット 816〜818 に終わるコード配列からなるＤＮＡ配列，（ｃ）図８に示した配列の位置 337〜339 における核酸トリプレットに始まりトリプレット 4603〜4605 に終わるコード配列からなるＤＮＡ配列，（ｄ）図12に示した配列の位置 74〜76 に始まり位置 1268〜1270 に終わるコード配列からなるＤＮＡ配列，（ｅ）図13に示した配列からなるＤＮＡ配列，（ｆ）図14に示した配列からなるＤＮＡ配列，（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のＤＮＡ配列の一つによってコードされるのと同一の蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列，（ｈ）１個または２個以上の核酸トリプレットが付加，欠失または置換された（ａ）〜（ｇ）のＤＮＡ配列であり，その配列によってコードされる蛋白質またはポリペプチドは，それぞれ配列（ａ）〜（ｇ）のＤＮＡ配列の一つによってコードされるのと本質的に同じ生物活性を有するＤＮＡ配列．（ｉ）それぞれ（ａ）〜（ｈ）のＤＮＡ配列の一つによってコードされる蛋白質またはポリペプチドに存在する生物活性を維持している蛋白質またはポリペプチドをコードする（ａ）〜（ｈ）のＤＮＡ配列の一つのフラグメント．（ｊ）（ａ）〜（ｆ）の配列の一つまたはカテプシンＤ遺伝子の全体または部分に対するアンチセンスであり，上記配列の発現を阻害できる配列，および（ｋ）１個または２個以上の核酸トリプレットが付加，欠失または置換された配列（ａ）〜（ｆ）の一つの修飾ＤＮＡ配列であり，その修飾配列によってコードされる蛋白質またはポリペプチドは，優性の負の効果を有し，それぞれ（ａ）〜（ｆ）の配列の一つによってコードされる蛋白質またはポリペプチドの機能を阻害できる修飾ＤＮＡ配列．上記（ｊ）に定義された好ましいアンチセンス配列は，図６のＤＡＰ−１遺伝子の位置 1000 に始まり位置 1320 に終わる配列，図８のＤＡＰ−２遺伝子における 3781〜4148，図12のＤＡＰ−３遺伝子の 74〜1270，および図15のカテプシンＤ遺伝子の 1203〜1573 に対するアンチセンスである．本発明はまた任意の上記ＤＮＡ分子からなるベクターを提供し，このベクターはまた，それを宿主細胞内に維持しそこで複製するのに必要な配列も包含する．本発明によるベクターは，宿主細胞内でＤＮＡ配列の増殖および複製のためのトランスファーベクターでも，また上記ＤＮＡ配列をｍＲＮＡに翻訳するために必要な配列からなる発現ベクターであってもよい．このような発現ベクターの例にはプラスミドたとえばエピソームまたはウイルスがある．エピソームの例にはビヒクルｐＴＫＯ１，ｐＴＫＯ２およびｐＴＫＯ３を用いて構築されるエピソームがある（Deiss & Kimchi，前出）．本発明はまた，アンチセンス配列を有するＤＮＡ分子を除く本発明のＤＮＡ分子によってコードされる蛋白質またはポリペプチドであるＤＡＰ産物，またはたとえばメチル化，グリコシル化等によって化学的に修飾されたこの種の蛋白質またはポリペプチドを提供する．ＤＡＰ産物の例には，図６，８および12に記載されたアミノ酸配列を有するＤＡＰ産物がある．ＤＡＰ産物は本発明の死促進態様に有用である．この態様によれば，この蛋白質は患者とくに癌患者に投与され，その投与はトランスフォームされた細胞の死を招来する．本発明はさらに，ＤＡＰ産物に対して阻害，拮抗または中和作用を示す薬剤を提供する．これらは本発明の死防止態様において有用である．このような薬剤には，たとえばＤＡＰ産物に向けられた抗体，ＤＡＰ産物の作用に対して拮抗が可能でＤＡＰ産物の死促進活性を防止できるＤＡＰ産物のインヒビターまたはアンタゴニストがある．本発明はさらに，医薬的に許容される担体と，（ｉ）本発明のＤＮＡ分子またはカテプシンＤをコードするＤＮＡ分子からなる発現ベクター，（ii）本発明のＤＡＰ産物またはカテプシンＤ，および（iii）ＤＡＰ産物に対する抗体，インヒビターまたはアンタゴニストからなる群より選ばれる活性薬剤によって構成される医薬組成物を提供する．本発明の医薬組成物は上記活性薬剤を所望の細胞または組織に標的化するための手段を包含してもよい．活性薬剤の性質によって，組成物は本発明の死促進態様または死防止態様のいずれかに有用である．本発明の死促進態様では，医薬組成物には，適当なＤＡＰ産物または適当なＤＡＰ分子からなる発現ベクターとともに，サイトカインたとえばＩＦＮ−γを包含させることができる．さらに，本発明は，上記活性薬剤を個体に投与することからなる処置方法を提供する．医薬組成物の場合と同様に，上記活性薬剤の性質に応じて，この方法は本発明の死促進態様または本発明の死防止態様のいずれかに適用できる．本発明の死促進態様においては，上記活性薬剤はサイトカインたとえばＩＦＮ−γとともに投与することができる．本発明のスクリーニング態様では個体からのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを，ＤＡＰ遺伝子の完全もしくは部分配列またはＤＡＰ遺伝子の完全もしくは部分配列に対するアンチセンスである配列を有するＤＮＡプロープまたは多重ＤＮＡプロープで検査することからなる，ＤＡＰ遺伝子の不存在，個体のＤＡＰ遺伝子における部分欠失または変異（すなわち点変異，欠失または他の変異）を検出する方法を提供する．本発明のスクリーニング態様の特定の応用には，癌に対する素因を有する個体，遺伝子の不存在または個体がそのような素因をもつことを指示することが認められた変異もしくは欠失のスクリーニングがある．スクリーニング態様による方法は，通常以下の工程からなる．（ａ）個体の細胞からのゲノムＤＮＡまたは上記細胞のｍＲＮＡから産生されたｃＤＮＡのいずれかのサンプルの採取，（ｂ）ＤＡＰ遺伝子の完全もしくは部分配列またはＤＡＰ遺伝子の完全もしくは部分配列に対するアンチセンス配列である配列からなる１種または２種以上のＤＡＰプロープの添加，（ｃ）ＤＮＡプロープ（単数または複数）と上記サンプルのＤＮＡの間のハイブリダイゼーションのための条件の設定，（ｄ）ハイブリダイゼーションに基づく，ＤＡＰ遺伝子の不存在またはＤＮＡプロープ（単数または複数）の配列と上記サンプルのＤＮＡ中の配列の間のマッチングもしくはゲノムＤＮＡにおける欠失あるいは変異および試験された個体における癌素因を指示するミスマッチの存在の決定．本発明のスクリーニング態様の特定の実施態様には，図６．８，12〜14または 15に示された完全もしくは部分配列，または図６，８，12〜14または15に示された完全もしくは部分配列のアンチセンスの使用が包含される．癌に対する素因の可能性を指示するＤＡＰ遺伝子における変異はまた，変異した非機能性のＤＡＰ遺伝子産物と正常な機能性ＤＡＰ遺伝子産物を識別できる適当な抗体を用いても検出できる．図面の説明図１Ａ〜ＤはＤＡＰ−１遺伝子のＲＮＡおよび蛋白質発現を示す．図１（Ａ）は構築体 230，255，260，259 でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞ならびに対照細胞（親細胞）および構築体 230 からの標識ｃＤＮＡフラグメントでプロープされた細胞から得られたセンスおよびアンチセンスｍＲＮＡのノーザンプロット分析を示す．総ＲＮＡはＨｅＬａ細胞から，トランスフェクションの前（親）またはｐＴＫＯ１構築体 #230または #255（グループ１），#260 （グループ５）および #259（グループ３）によるトランスフェクション後（それぞれ 230-t1，255-t1，260-t1 および 259-t1 と命名）に調製した．20μｇのＲＮＡをノーザンブロットで処理し，プローブとしてＤＮＡフラグメント #230 を使用した．矢印はセンスおよびアンチセンスＲＮＡの位置を指示する．図１（Ｂ）は対照構築体（ＤＨＦＲ−t2），230 構築体でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞，または対照細胞（親細胞），750 Ｕ/mlのＩＦＮ−γで24時間処置した細胞（＋）または非処置細胞（−）から得られたセンスおよびアンチセンスｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す．ＲＮＡはＩＦＮ−γ（750 Ｕ/m l）の不存在下（−）または存在下（＋）に４日間増殖させた指示ＨｅＬａ細胞から抽出した．20μｇのＲＮＡサンプル含有するノーザンブロットをλ１ファージのｃＤＮＡ挿入体とハイブリダイズさせた．ｍＲＮＡサンプルのエチジウムブロミド染色を示す．図１（Ｃ）は網状赤血球溶解プレパレーション中インビトロにおいて翻訳されたＤＡＰ−１ｃＤＮＡの発現蛋白質産物のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルを示す．λ１ｃＤＮＡから（レーン２）およびサブクローンｐ６，ｐ４，ｐ５およびｐ８から転写されたＲＮＡ（0.5μg）のインビトロ翻訳をそれぞれレーン３〜６に示す．レーン１は網状赤血球溶解物へＲＮＡを投与しないで得られるバックグランドに相当する．標識蛋白質は12％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画した．放射性分子量マーカー（Amersham）の位置を表示する．２つの翻訳された蛋白質，主要な 15 kDa および微量の 22kDa 蛋白質を矢印で指示する．図１（Ｄ）は組換えおよび細胞性 15 kDa ＤＡＰ−１蛋白質のイムノプロット分析を示す．細菌産生ＤＡＰ−１蛋白質（300 ng）および指示されたＨｅＬａ細胞抽出物（350μg）はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（12％）上で分画化してニトロセルロースにブロットし，15 kDa ＤＡＰ−１に対して生成されアフィニティー精製された抗体と反応させた．細胞はそれらの抽出の前にＩＦＮ−γ（750 Ｕ/ml）で４日間処置した．２つの矢印は細胞性ＤＡＰ−１蛋白質の位置を指示する．抗体もアンチセンスＲＮＡ発現によって調節されない 60 および 45 kDa の２つの非関連バンドを認識する．ＤＡＰ−１蛋白質の減少の定量は濃度計測分析によって行った．各スロットにおける蛋白質含量の検量は非関連バンドのシグナルを参照して行った．予め染色した蛋白質マーカー（Sigma）を表示する．図２Ａ〜ＤはＤＡＰ−２遺伝子のＲＮＡおよび蛋白質発現を示す．図２（Ａ）は対照構築体（ＤＨＦＲ−t1およびＤＨＦＲ−t2）でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の２クローンと 256構築体（t1およびt2）でトランスフェクトされた細胞の２クローンから得られたセンスおよびアンチセンスｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す．総ＲＮＡは 256-t1 および 256-t2 ＨｅＬａ細胞トランスフェクタントから，ＩＮＦ−γ（750 Ｕ/ml）による処置前（０時間）または３および24時間後に調製し，20μｇのサンプルをノーザンブロットで処理した．プローブとしてはフラグメント #256 を使用した．センスおよびアンチセンスｍＲＮＡの位置を指示する．ＧＡＰＤＨｍＲＮＡのレベルを各プロット中のＲＮＡ量の検量に使用した．図２（Ｂ）では，ブロットはＫ562細胞，親ＨｅＬａ細胞，２つのＤＨＦＲでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞集団およびｐＴＫＯ1-256でトランスフェクトされた２つのＨｅＬａ細胞集団からの総ＲＮＡ（20μg）からなる．ブロットはλ29のｃＤＮＡ挿入体とハイブリダイズした．ＲＮＡサンプルのエチジウムブロミド染色を示す．図２（Ｃ）はインビトロリン酸化アッセイを示す．細胞溶解物はＣＯＳ−７細胞から，λ29ｃＤＮＡのコード領域をもつＰＥＣＥ−ＦＬＡＧ発現ベクターによるトランスフェクション前（レーン１）および後（レーン２）に調製した．サンプル 400μg を抗−ＦＬＡＧ^TM（Ｍ２）モノクローナル抗体（ＩＢＩ）で免疫沈降してリン酸化アッセイに付した．図２（Ｄ）は組換えおよび細胞性ＤＡＰ−２蛋白質のイムノブロット分析を示す．ＣＯＳ−７細胞をＰＥＣＥ−ＦＬＡＧ−ＤＡＰ−２発現ベクターで一過性にトランスフェクトした．細胞溶解物のサンプル，ＣＯＳ−７細胞から 100μg およびＨｅＬａ細胞から 400μg をＳＤＳポリアクリルアミドゲル（7.5％）上で分画化し．イムノブロットし，Ｎ末端ＤＡＰ−２ペプチドに対して生成され，アフィニティー精製したポリクローナル抗体と反応させた．下方のパネルでは，ブロットはビンクリン（Sigma Immunochemicals）に対するモノクローナル抗体と反応させた．レーン１：非トランスフェクトＣＯＳ−１細胞，２：トランスフェクトＣＯＳ−１細胞，３：ＤＨＦＲ−t1細胞，４：4,256-t1細胞，５：5,256-t2 細胞．レーン２では，同じ 160 kDa 蛋白質が抗−ＦＬＡＧ^TM（Ｍ２）モノクローナル抗体（ＩＢＩ）でも検出された（示していない）．図３Ａ〜ＣはＨｅＬａ細胞でのＩＮＦ−γに対する細胞増殖抑制性および細胞傷害性応答の形態学的特徴を示す．培養はすべて，初期濃度 10,000 細胞／cm² で接種した．図３（Ａ）はｐＴＫＯ１−ＤＨＦＲ構築体でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞（ＤＨＦＲ−t1細胞）のＩＦＮ−γ（750 U/ml）の不存在下（ａ，ｃ）または存在下（ｂ，ｄ）での培養３および８日における光学顕微鏡像を示す（倍率× 400）．ＩＦＮ−γに対する応答の細胞増殖抑制相における屈折性有糸分裂細胞の不存在（ｂ），ならびに細胞傷害相における基層から解離した丸い細胞の出現（ｄ）に注目されたい．図３（Ｂ）はＤＮＡのＤＡＰ１による染色を示す．ａ．トリプシン処理によって除きガラススライド上に載せたＤＨＦＲ−t1非処置細胞．ｂ．ＩＦＮ−γ処置後７日に集めた解離ＤＨＦＲ−t1細胞．凝縮または断片化したクロマチンをもっ核を矢印で指示する（倍率×1000）．図３（Ｃ）は対照構築体ＤＨＦＲ−t1および230-t1構築体でトランスフェクトされた細胞の走査および透過電子顕微鏡像を示す．ＤＨＦＲ−t1 ＨｅＬａ細胞集団（ａ〜ｄ）および230-t1アンチセンスでトランスフェクトされた細胞（ｅおよびｆ）をＩＦＮ−γ（750 U/ml）不存在下（ａ，ｃ，ｅ）または存在下（ｂ，ｄ，ｆ）に培養した．（ａ，ｂ，ｅ，ｆ），走査電子顕微鏡像は，ＧＳＭ 6400 ＳＥＭ（Jeol）を用いて７日後に撮影した．バー＝10 mm（４サンプルすべてで倍率は×2200）．（ｃおよびｄ），透過電子顕微鏡像はＴＥＭ（Philips 410）を用いて７日後に倍率×2800で撮影した．凝縮した核および表面の泡沫を矢印で指示する．図４Ａ〜Ｃは，グループ１および２のプラスミドからのアンチセンスＲＮＡ発現がＩＮＦ−γの細胞傷害作用に対するＨｅＬａ細胞の感受性を低下させるが，初期のＩＮＦ−γのシグナリングには影響しないことを示す．図４（Ａ〜Ｂ）は時間の関数として 540 nm における光吸収によって測定した生存細胞の数を示す．細胞は対照構築体ＤＨＦＲ−t1（●−１Ａおよび１Ｂ）， 255 もしくは 230 構築体（▲−１Ａ），または 256 構築体の２つのクローン， t1 および t2（▲−１Ｂ）によりトランスフェクトされた．結果はいずれもＩＦＮ−γ（750 U/ml）の投与あり（＋）およびなし（−）での細胞増殖を示している．各点は４回の測定の平均で，ＳＤは２〜５％の範囲であった．図４（Ｃ）は２−５Ａシンターゼ遺伝子誘導のノーザンブロット分析を示す．指示されたＨｅＬａ細胞トランスフェクタントはＩＦＮ−γ（750 U/ml）の存在下（＋）または不存在下（−）に24時間インキュベートした．20μg の総ＲＮＡを分析した．２−５ＡシンターゼのｃＤＮＡをプローブとして用いた．図５は，ＤＡＰ−１ｃＤＮＡをもつλ１ｃＤＮＡクローンの制限酵素地図を示す．図６は，ＤＡＰ−１のＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列を示す．図７は，ＤＡＰ−２ｃＤＮＡをもつλ29ｃＤＮＡクローンの制限酵素地図を示す．図８は，ＤＡＰ−２のＤＮＡ配列および予測されるアミノ酸配列を示す．図９Ａ〜Ｃは，他のセリン／スレオニンキナーゼに対するＤＡＰ−２配列のホモロジーおよびＤＡＰ−２のアンキリンリピートのアラインメントを示す図９（Ａ）には，ＤＡＰ−２の蛋白質キナーゼドメイン配列を他のカルモジュリン依存性キナーゼの相当するドメインと整列させる．キナーゼのサブドメイン構造（Ｉ〜IXの番号を付ず）ならびにカルモジュリンの認識および結合に関わる領域（カルモジュリン調節領域と呼ばれる）を指示する．キナーゼドメイン内の絶対保存アミノ酸は星印で標識する．右側の数字は各キナーゼの一次翻訳産物のＮ末端に対する位置を示す．白抜き文字は比較したキナーゼ内での同一アミノ酸を指示する．点を付した部分はアミノ酸は同一ではないが類似している位置を示している． nm-mlck−非筋肉ミオシン軽鎖キナーゼ（ニワトリ）；sm-mlck−平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ニワトリ）；skm-mlck−骨格筋ミオシンの軽鎖キナーゼ（ラット）；camdk-α，-βおよび-γ−それぞれカルシウム／カルモジュリン依存性蛋白キナーゼII-α，-βおよび-γサブユニット；mlck-dicdi−dictyostelium dis coldiuｍ（粘菌）ミオシンの軽鎖キナーゼ．図９（Ｂ）はＤＡＰ−２のキナーゼサブドメインIIおよびIIIならびに異なる細胞周期依存性キナーゼの相当するドメインとのアラインメントである． dm2−ショウジョウバエＣＤＣ２ホモローグ；pssalre−ヒトのセリン／スレオニンキナーゼＰＳＳＡＬＲＥ；kpt2−ヒトのセリン／スレオニン蛋白質キナーゼＰＣＴＡＩＲＥ−２；kin28−酵母（S.csrevisiae）推定蛋白質キナーゼ；mol5 −成熟分裂成熟の負のレギュレーターであるｃｄｃ２に類似のアフリカツメガエル蛋白質キナーゼ；kkialre−ヒトのセリン／スレオニン蛋白質キナーゼＫＫＩＡＬＲＥ．図９（Ｃ）はＤＡＰ−２のアンキリンリピートのアラインメントを示す．白抜き文字は同一のアミノ酸を指示する．ＤＡＰ−２のアンキリンリピートのコンセンサス配列は最下部に示す．ｃＤＮＡに沿った各リピートそれぞれの位置は図９（Ｂ）に示してある．ar1〜8，アンキリンリピート図10は，標識ＤＡＰ−１ｃＤＮＡプロープを用いて数種の造血細胞から得られたｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す．図11は，いずれもＤＡＰ−１もしくはＤＡＰ−２の標識ｃＤＮＡプローブを用いて正常胚の肝臓，脾臓もしくは脳（２）またはダウン症候群の胚（１）から得られたｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す．総ｍＲＮＡのレベルを評価するために，ＧＡＰＤＨを用いた（最下部）．図12は，ＤＡＰ−３のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す．図13は，ＤＡＰ−４の部分ＤＮＡ配列を示す．図14は，ＤＡＰ−５の部分ＤＮＡ配列を示す．図15は，カテプシンＤのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す．発明の詳細な説明Ｉ．ＩＦＮ−γの細胞傷害作用から細胞を保護するアンチセンスｃＤＮＡの単離（Ａ）実験操作（Ａ₁）ｃＤＮＡクローンの取得ｃＤＮＡライブラリー（100μｇＤＮＡ）は，ＩＦＮ−γ（200 U/ml）によるＨｅＬａ細胞の処置前ならびに１，２，４，12，24 および 48 時間後に収穫されたｍＲＮＡ混合物から発生させた．それを，以前に詳細に報告されているようにして（Deiss & Kimchi,前出），ＥＢＶベースのｐＴＫＯ１発現ベクターにアンチセンス方向にクローン化した．得られた約10⁵個の独立したクローンの発現ライブラリーを，８×10⁶ＨｅＬａ細胞（10⁶細胞／９cmプレート）にリン酸カルシウムトランスフェクション法によって導入した．トランスフェクション効率を測定するために，トランスフェクタントの分画をハイグロマイシンＢ（200μg/m l,Calbiochem）で選択した．得られた効率は約５％であった．平行して，大部分のトランスフェクトされた細胞は細胞濃度 1500細胞／cm²でプレーティングし，ハイグロマイシンＢ（200μg/ml）およびＩＦＮ−γ（750 U/ml）の両者で選択した．選択培地は３〜４日ごとに交換した．28日後，ＩＦＮ−γの存在下に生残および／または増殖した細胞を２週間増殖させて，プールした．染色体外ＤＮＡはHirt（Hirt,B．1967，J.Mol.Biol.,26: 365）の方法で採取し制限酵素 DpnＩで切断し大腸菌ＨＢ101 宿主細胞に導入した．DpnＩによる切断はＨｅＬａ細胞内で複製したエピソームＤＮＡのみの細菌へのトランスフェクションを保証した．上述の操作によってアンチセンスＤＮＡ配列を含む数個の細菌性クローンが得られ，その一部はＩＦＮ−γの死促進作用から細胞を保護することができた．（Ａ₂）アンチセンスｃＤＮＡクローンの分類プラスミドＤＮＡは10個の各細菌クローンから調製した．ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ挿入体はｐＴＫＯ１ベクターにおけるｃＤＮＡ挿入部位体の直接隣接配列に相当する特異的プライマーを用いて各プラスミドから発生させた．ｃＤＮＡ挿入体のサイズは 300〜800 bp の範囲であった．ＰＣＲフラグメントはレスキューされたアンチセンスｃＤＮＡクローンの一部の間での交差ハイブリダイゼーションの可能性をサザンブロットで検索するための標識プローブとして使用した．（Ｂ）結果（Ｂ₁）クローンの分類上述の10個のｃＤＮＡクローンは６個の異なる非重複グループに分類され，一部は数個のメンバー（クローン）から，一部は単一のメンバーから構成された．本発明に関係するクローンを以下の表１に示す．グループ１の挿入体 230，254，255，264および 258 は互いに完全に同一であるようにみえる．ＰＣＲフラグメントを配列決定し，結果をＥＭＢＡ核酸データベース中にある配列と比較した．グループ１〜５の挿入体はすべて新規であることがわかった．（Ｂ₂）ｍＲＮＡの検出このようにして得られたＤＮＡフラグメントを用いて，これらのフラグメントにハイブリダイズしたｍＲＮＡのＨｅＬａ細胞中での検出および発現レベルの測定を行った．親ＨｅＬａ細胞からの総ＲＮＡ 20μｇをゲル上で分画し，ブロットし，異なるプローブと反応させた．各プローブがサイズの異なる単一ｍＲＮＡトランスクリプトを認識した（表１）．グループ２と反応性のｍＲＮＡの発現レベルは低かったが，グループ１と反応性の場合は比較的に高かった． II．単離アンチセンスｃＤＮＡによる２回目のトランスフェクション第二のトランスフェクタントにおけるアンチセンスＲＮＡの発現レベル（Ａ）実験操作上に単離されたアンチセンスＤＮＡがＩＦＮ−γの死促進作用の保護に十分であることを確認するため，ＨｅＬａ細胞のサブコンフルーエントな単層を個々のレスキューされたｐＴＫＯ１プラスミド 40μｇでトランスフェクトして（二重に）ハイグロマイシンＢの単一選択に付した．約10⁴のハイグロマイシン抵抗性クローンのプールを各トランスフェクションから発生させ，安定なポリクローナル集団の６つのデュプリケートとして保存された．ついで，ＩＦＮ−γの適用に対する上記クローンの感受性を測定した．非関連構築体をもつベクターｐＴＫＯ１−ＤＨＥＲ（Deiss & Kimchi，前出）を対照に用いた．対照ベクターは平行してＨｅＬａ細胞に導入し，２つの独立した安定なトランスフェクタントのポリクローナル集団を生成させ，ＤＨＥＲ−t1 および t2 と命名した．非トランスフェクトおよびトランスフェクトＨｅＬａ細胞の両者でｍＲＮＡトランスクリプトを検出するために，構築体 230 および 256（それぞれグループ１および２から）からの二重鎖ｃＤＮＡフラグメントをプローブとして用いた．これらの２つの特異的ｃＤＮＡ挿入体は共通に使用された市販の標識キットによって標識した．これらはそれらからのｃＤＮＡ挿入体の調製および単一鎖ＲＮＡの製造の両者を容易にするためにBluescript^TMベクター（Stratagene，USA）にサブクローン化した．（Ｂ）結果（Ｂ₁）構築体 230（グループ１）図１Ａから明らかなように，この構築体中のｃＤＮＡ挿入体は非トランスフェクトおよびトランスフェクトＨｅＬａ細胞の両者において単一の内因性 2.4 Kb ｍＲＮＡトランスクリプトにハイブリダイズした．クローン 230 および 255 のアンチセンス構築体を含む安定なトランスフェクタント中に，付加的な組成をもつアンチセンストランスクリプトがこの 230 プロープによって検出された．それは，320 塩基の元のｃＤＮＡ挿入体と発現カセットに由来する配列の 800 付加的塩基（ＳＶ40初期プロモーターとポリアデニル化シグナルまでの配列）から構成された．Bluescript^TMベクターによって産生されたＲＮＡ標識鎖の一方はもっぱら内因性 2.4 Kb ｍＲＮＡにハイブリダイズしたが，相補性鎖は 1.1 Kb のｍＲＮＡにのみハイブリダイズし，後者は実際にアンチセンスｍＲＮＡであることが確認された（データは示していない）クローン 230 および 255 中のアンチセンスＲＮＡの量はセンスｍＲＮＡの量の３〜６倍を越えていた（図１Ａ，１Ｂ）．ＩＦＮ−γ処置後，アンチセンス発現のレベルはｐＴＫＯ１ベクター中（Deiss & Kimchi,前出）ＩＦＮ−γ刺激応答要素（ＩＳＲＥ）の存在によりさらに増大し，アンチセンストランスクリプトは下センストランスクリプトの15倍以上に達した（図１Ｂ）．内因性 2.4 Kb ｍＲＮＡのレベルはＩＦＮ−γによって修飾されず，また高いアンチセンス発現によっても影響されなかた．構築体 256（グループ２）図２Ａと２Ｂから明らかなように 256クローンの構築体（サイズ 367 bp）は試験した細胞すべてに比較的低レベルに発現された単一内因性 6.3 Kb ｍＲＮＡにノーザンブロットでハイブリダイズした．256-t1 および t2 トランスフェクタト細胞でも，それは，367 塩基のｃＤＮＡ挿入体とベクター中の発現カセットに由来する 800 塩基の配列からなる 1.2 Kb ＲＮＡ組成にもハイブリダイズした（図２）．ｐＴＫＯ１ベクター中アンチセンス方向のフラグメント #256 はセンスｃＤＮＡクローンの配列決定に際して確認された（図７）．非処置ＨｅＬａ細胞中ｐＴＫＯ１プラスミドの #256 から発現したアンチセンスＲＮＡの量は，センスｍＲＮＡのレベルより100倍以上多かった．しかも，ｐＴＫＯ１ベクター中におけるＩＦＮ−刺激応答要素（ＩＳＲＥ）の存在により，ＩＦＮ−γ処置後にはアンチセンスｍＲＮＡの発現レベルはさらに増大した（図３）． III．アンチセンスｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のＩＦＮ−γに対する応答（Ａ）実験操作各アンチセンスｃＤＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａポリクローナル集団を，ハイグロマイシンＢおよびＩＦＮ−γ（750 U/ml）両者の存在下に培養した．増殖および生存度パラメーターを調べた．すなわち，（１）光学顕微鏡下，（２）電子顕微鏡により，および（３）ＤＡＰＩ染色（0.5μg）によって検査した．さらに詳細な定量には，中性レッド取り込みアッセイを行った．すなわち，異なるポリクローナルＨｅＬａ細胞集団をサブコンフルーエントな細胞濃度において 96-ウエルマイクロタイタープレート中で培養し，ついでＩＦＮ−γ（750 U/ml）により処置するかまたは非処置としたすべての細胞を引き続いてハイグロマイシンＢ含有培地に維持し，トランスフェクトされた細胞を選択した．上述のようにして調製されて，ＩＦＮ−γに対して典型的な増殖感受性曲線を示す２つのＤＨＦＲ−トランスフェクトＨｅＬａ細胞集団（t1，t2）を対照培地として用いた．検査したアンチセンスｃＤＮＡトランスフェクト細胞は，230-t1，255-t1 （グループ１）および 256-t1，256-t2（グループ２）であった．生存細胞を中性レッドで染色し，実験の14日間に 540 nmnn における O.D．で４重に測定して染料の取り込みを定量化した（Ｂ）結果親細胞およびＤＨＦＲ−トランスフェクトＨｅＬａ細胞の顕微鏡検査により，ＩＦＮ−γは応答の二相性パターンを誘発した．細胞はＩＦＮ−γ処置の最初の４日間に増殖を停止したが，生存性はなお維持し（トリパンブルー排除試験），ＩＦＮ−γに対する細胞増殖抑制性応答の形態的特徴である平板化を示した（図３Ａｂ）．この時期における増殖率の低下も，ＤＮＡ中へのチミジンの取り込みにおける急峻な低下（90％以上）によって測定された（示していない）．この型のＩＦＮ−γ誘発増殖停止に続いて，以後の10日の間に非同調的様式で起こる大量の細胞死が観察された．細胞のサイズが徐々に縮小し，丸くなり，基板から解離した（図３Ａｄ）．基板からの細胞の解離後にＤＮＡをＤＡＰＩで染色するとプログラム細胞死に特徴的な核の形態的な肉眼的変化が明らかにされた．これには，核の濃縮，場合により核の周辺に優先的に検出されるクロマチンの凝縮，およびクロマチン沈降が包含される（図３Ｂｇ）．ＩＦＮ−γ処置細胞の解離前における透過電子顕微鏡像により，核の濃縮およびクロマチンの凝縮に加えて，他の形態学的変化，たとえば表面微絨毛の消失，表面の泡沫化，細胞質突起の分離および細胞質の崩壊が明らかにされた（詳細は図３Ｃｄに示す）．グループ１のｐＴＫＯ−１プラスミドからのアンチセンスＲＮＡ発現はＩＦＮ−γの細胞傷害作用に対する細胞の感受性を低下させた．すなわち，プレート上の生残細胞が増加し，上述の死に伴う形態学的変化の出現頻度は著しく低下した（図３ＣｂにおけるＩＦＮ−γ処置，ＤＨＦＲトランスフェクト細胞と図３ＣｆにおけるＩＦＮ −γ処置 230-t1 細胞の走査電子顕微鏡像を比較されたい）．ＩＦＮ−γ誘発細胞死からの保護を示す顕微鏡による類似の観察は，上述のグループのアンチセンスｃＤＮＡすなわち２，３および７からの他のクローンについても得られた（示していない）．ついで，対照培養体のＩＦＮ−γに対する典型的な二相性応答およびアンチセンス発現培養体のＩＦＮ−γ誘導細胞死に対する感受性の低下の両者をさらに性格に定量的ベースで測定するために，中性レッド取り込みアッセイを実施した．このアッセイにおいては，２つのＤＨＦＲ−トランスフェクトＨｅＬａ細胞集団（t1，t2）を対照培養として用い，検査するアンチセンストランスフェクト細胞は230-t1，255-t1（グループ１）（図４Ａ）ならびに 256-t1，256-t2（グループ２）（図４Ｂ）とした．ＩＦＮ−γの不存在下には，トランスフェクトされたすべてのＨｅＬａ細胞は，同じ挙動を取り，実質的に同一の増殖曲線を示し，アンチセンスＲＮＡの発現は細胞の正常増殖には影響しないことが示唆された．アンチセンスＲＮＡの発現によって変化しなかったもう一つの特徴は，ＩＦＮ−γ に対する細胞増殖抑制応答の程度であった．図４Ａおよび４Ｂから明らかなように，ＩＦＮ−γは，トランスフェクトされたすべての培養体の増殖率を低下させて，それらはすべて最初の４日間には（細胞死が顕微鏡的に明らかに開始される前）同程度の中性レッド染料の取り込み低下を示した．４日間の処置後には，像は劇的に変化した．ほとんどすべての対照細胞がＩＦＮ−γ処置の以後の日に死滅し，日14には中性レッド染料取り込みの最小値を生じたのに対し，アンチセンスＲＮＡを発現した細胞の有意な分画は，染料取り込みの維持された値に反映されたように，がＩＦＮ−γの存在下にも生残した．ＩＦＮ−γ誘導細胞傷害作用に対する抵抗性は，２つの異なるアンチセンスＲＮＡを発現した４つの試験培養においてきわめて類似していた（図４Ａ，４Ｂ）．これらのデータは，グループ１および２からのアンチセンスＲＮＡの発現はＨｅＬａ細胞をもっぱらＩＦＮ− γ誘導細胞死から保護し，細胞増殖抑制作用からは保護しないことを指示している．アンチセンスＲＮＡの発現が，これらのトランスフェクトされた細胞における２−５Ａシンターゼ遺伝子のＩＦＮ−γによる正常ｍＲＮＡの誘導（図４Ｃ）から推察されるように，ＩＦＮ−γのシグナリングにおける初期の生化学工程には影響しなかったことは注目すべきである．以上をまとめると，試験されたすべての尺度の中で，アンチセンスＲＮＡによって遮断されたものはＩＦＮ−γの死誘導作用のみであった． IV．アンチセンス構築体によってトランスフェクトされた細胞の壊死性細胞死に対する応答この段階では，アンチセンスＲＮＡの発現がＨｅＬａ細胞を壊死型の細胞死からも保護するかをチェックすることに興味がもたれた．このために，シクロヘキシミド（ＣＨＸ）と組み合わせて添加したＴＮＦ−αの作用を様々なＨｅＬａ細胞集団で検討した．ＩＦＮ−γの作用とは異なり，ＨｅＬａ細胞でＴＮＦ−α＋ＣＨＸにより誘導された細胞の死はきわめて迅速で（３時間後には５０％が死滅）壊死に典型的な特徴，たとえば溶解前の細胞の膨潤を示した．表２に示すようにグループ１および２からのアンチセンスＲＮＡの発現はＩＦＮ−γ誘導細胞傷害を保護したのに対して，ＴＮＦ−α誘導壊死性細胞死からは保護されなかった．検査したすべてのＨｅＬａ細胞トランスフェクタントは，ＴＮＦ−α＋ＣＨＸの組合せにより，類似の時間キネティックスおよび同じ効率で死滅した．ノーザンブロット分析によれば，256-t1 細胞中のアンチセンスｍＲＮＡトランスクリプトのレベルはＴＮＦ−α＋ＣＨＸ処置によって５時間の時点でも低下していなかった（示していない）ことから，処置によって生じたアンチセンスＲＮＡ発現の喪失が壊死性細胞死からの保護作用の喪失の理由である可能性は排除される．これはさらに，細胞傷害のタイプに関する保護機構のある種の特異性を示唆するものである．Ｖ．ＤＡＰ−１ｃＤＮＡのクローニングおよびアミノ酸配列の決定 λgt10 ベクター中に構築されたＨＬ-60 ｃＤＮＡライブラリーをｐＴＫＯ 1- 230 のｃＤＮＡ挿入体でスクリーニングした．ほぼ完全に重複し，約 2.3 Kb のｃＤＮＡ挿入体をもつ２つの独立したクローンλ１およびλ２を分析した．λ１ｃＤＮＡクローンは5'-非翻訳領域，短いコード領域およびｃＤＮＡクローンの6 0％以上を構成する比較的長い3'-非翻訳領域を包含する（図５）． λ１およびλ２がもつｃＤＮＡの核酸配列およびその予測されるアミノ酸配列は図６に示す．このｃＤＮＡは 2232 bp 長であり，その3'-末端にポリアデニル化ングナルの可能性のある配列ＡＴＴＡＡＡを含有する．オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はきわめて短く，ヌクレオチド位置 160〜162 の開始コドンに始まり，位置 466〜468 の終結コドンＴＧＡで終わる．このＯＲＦは，先行する著しくＧＣに富んだ5'-翻訳領域をもち，102 のアミノ酸からなり，計算分子量 11.2 kDa の蛋白質を多分コードする．アミノ酸組成は塩基性蛋白質を予測させ（等電点＝10），プロリンに富み（15％），これは２ブロックの荷電残基を示し，一方は中央に他方は蛋白質の 3'-末端にある．高いプロリン含量はゲル上の蛋白質の移動に異常を起こす可能性がある．Motifs（"Motifs"プログラム： GCG Software Package）の検索では，蛋白質はカゼインキナーゼIIリン酸化部位の可能性がある２つの部位を位置３および36に，単一の蛋白質キナーゼＣリン酸化部位の可能性のある部位をＣ末端に（位置91），および cdks のコンセンサスリン酸化部位を位置51に含有する．さらに，この蛋白質は位置 65〜67 にコンセンサス配列ＲＧＤ，一部の蛋白質では細胞接着に役割を果たすトリプレット，および位置 49〜53 にＳＨ３結合モチーフ，ＳＰＳＰＰの可能性のある部位を有する（Cowburn，1994，Struc.Biol．1，489-491）．シグナルペプチドまたは膜通過ドメインの存在の指標は見出されなかった（ＳＡＰＳ予測；Brendelら，PNAS USA，89: 2002-2006）．アミノ酸配列は既知の蛋白質に有意なホモロジーを示さなかった．フラグメント #230 はそれを切断しない様々な制限酵素で消化したヒトゲノムＤＮＡを含むサザンブロットのプローブとして用いた．EcoRＩ，BamHＩ，PstＩおよび XbaＩで切断したＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより単一バンドが可視化され，これは単一のコピー遺伝子の存在を示唆する（示していない）．この新しい遺伝子はＤＡＰ−１（Death Associated Protein-1）と命名された．網状赤血球溶解物中でのインビトロ翻訳アッセイにより，予想されたＯＲＦはクローン化された 2.4 Kb トランスクリプトから翻訳される 15 kDa 蛋白質をコードすることが確認された．完全長ｃＤＮＡ挿入体および分子の異なる領域をまたぐ４つのサブクローン（すなわち，ｐ６，ｐ５，ｐ８およびｐ４，図５参照）がインビトロで転写され翻訳された．試験したすべてのサブクローン中ＤＡＰ− １ｃＤＮＡの5'１Kb（ｐ６）のみが蛋白質のインビトロ合成を指示した．主要な翻訳産物は 15 kDa 蛋白質としてゲル上を移動した．位置 160〜162 におけるＡＴＧコドンの変異（ＡＴＧをＧＧＣに）は 15 kDa 蛋白質の合成を完全に消失させ，この蛋白質の開始点の位置が確認された（データは示していない）．15kD a 蛋白質生成物に加えて，22 kDa の第二の蛋白質もλ１およびｐ６ｃＤＮＡからより低い効率で翻訳された（図１Ｃ）．その翻訳は位置160のＡＴＧコドンの消失によって影響されなかったが，ｐ６サブクローンのそれぞれ DraＩおよびBs tYＩ制限エンドヌクレアーゼによる切断でザイズは 16 および 18 kDa に短縮した（示していない．制限地図は図５参照）．これらの基準は最初のＯＲＦに関して異なる相におけるヌクレオチドに検出された可能性のある他のオープンリーディングフレーム（図６）に適合する．それはＡＴＧコドン（位置287〜289）に始まり，終結コドンＴＧＡ（位置816〜818）に終わる．それは176のアミノ酸からなり，計算分子量 19.9 kDa の蛋白質をコードするものと思われる．既知の蛋白質と有意なホモロジーを示さなかった．細胞内での主要なＤＡＰ−１蛋白質の発現を分析するために細菌で産生された 15 kDa 蛋白質に対してウサギポリクローナル抗体を調製した．アフィニティー精製抗体はイムノブロットにおいて，ＨｅＬａ細胞の抽出物中の２つの接近して移動する蛋白質を認識した．低いバンドはゲル上で細菌で産生された 15 kDa のＤＡＰ−１蛋白質と共移動した．移動が遅い型は蛋白質の翻訳後修飾型を示すものと思われる．ＩＦＮ−γ（比15:1）の存在下に生じるアンチセンスＲＮＡの発現レベルが増大したＨｅＬａ細胞トランスフェクタント，230-t1 および 255-t1 では，ＤＨＦＲトランスフェクト培養体の場合（図１Ｄ）に比較してＤＡＰ−１蛋白質のレベルはそれぞれ75％および78％だけ低下した．２つの上方の非特異的バンド（これらは過剰の細菌産生ＤＡＰ−１と競合しない）はアンチセンスの発現によって影響されず，したがって作用の選択性を支持するものである． VI．ＤＡＰ−１のクローニングおよびアミノ酸配列の決定上述のように，発現試験は二重鎖ｃＤＮＡフラグメント#256（サイズ 367bp）がノーザンブロットで内因性 6.3 Kb ｍＲＮＡトランスクリプトにハイブリダイズすることを示した．同じ単一 6.3 Kb ｍＲＮＡトランスクリプトは，ＨｅＬａ細胞（親およびトランスフェクタント）およびＫ562細胞に，ノーザンブロットのプローブとして完全長ｃＤＮＡを用いた場合に検出された（図２Ｂ）．したがって，ｐＴＫＯ１-256 からのｃＤＮＡ挿入体をＫ562 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した．約４×10⁴pfu を #256 ｃＤＮＡ挿入体でスクリーニングして，２ラウンドの連続ウオーキングスクリーニング後に40個の陽性クローンが単離された．配列決定は，Applied Bio-system ＤＮＡシーケンサー 373A で実施した．配列の独自性および類似性はＦＡＳＴＡ（GCG software package）を用い核酸レベルで，またＦＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＯＣＫＳプログラムを用いてアミノ酸レベルで決定した（S.Henikoff & J.G.Henikoff，Nucleic Acids Res．19，6565， 1991）．２つのクローン，λ29およびλ32を配列決定に選択した（図７）．得られた両ｃＤＮＡの混成配列は 5886 にヌクレオチドから構成され，位置 5872 に始まるポリＡテールを含み，先行して２つのポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡを有する（図８）．3'-非翻訳領域はまた，短命ｍＲＮＡの 3'-非翻訳領域に見出される２つのＡＴＴＴＡ不安定モチーフを含有する（G.Saw & R.Kamen，Cell 46， 659，1986）．ｍＲＮＡは単一の長い，位置 337 に始まり位置 4605 に終わるオープンリーディングフレームを含有し，1423 アミノ酸の蛋白質をコードするものと思われる．蛋白質産物の計算分子量は約 160 kDa である．この蛋白質のＮ末端 20 ペプチドに対するアフィニティー精製抗体を作成した．これらの抗体はイムノプロットで，ｃＤＮＡの全コード領域（図２Ｄ）を発現するベクターでトランスフェクトしたのちのＣＯＳ−１細胞で産生された 160 kDa 組換え蛋白質を認識した．これらの抗体はＨｅＬａ細胞中で同じサイズの内因性蛋白質と反応した．アンチセンス発現細胞，256-t1 および 256-t2 では，160 kDa 蛋白質の定常状態レベルは，ＤＨＦＲ対照細胞の場合よりも10および15分の１と低く，一方，非関連蛋白質，ビンクリンはすべてのＨｅＬａ細胞トランスフェクタントで同様の発現レベルを示した（図２Ｄ）．すなわちＨｅＬａ細胞中でのｐＴＫＯ１プラスミド #256 からのアンチセンスＲＮＡの発現は相当する蛋白質の量に有意な低下を生じた．本発明者らはこの蛋白質中に存在する数個の既知ドメインおよびモチーフを確認することができた．そのＮ末端は位置 13〜267 の 255 のアミノ酸にわたる蛋白質キナーゼドメインから構成される．その構造に基づき，それはXIサブドメインの古典的組成を有し，すべての保存されたモチーフが存在するセリン／スレオニン型の蛋白質キナーゼであると考えられる（図８）（S.K.Hanks & A.M.Quinn, Methods Enzymol．200，38，1991）．この新規なキナーゼは，ＤＡＰ−２またはＤＡＰ−キナーゼ（Death Associated Protein-kinase）と命名された．このキナーゼドメインは，カルモジュリン依存性キナーゼのそれのファミリーに属する．このグループを構成するたとえばミオシン軽鎖キナーゼのような既知のキナーゼドメインに対するホモロジーは39％〜49％の範囲である（図９Ａ）．ＤＡＰ−１キナーゼのキナーゼドメインが他のカルモジュリン依存性キナーゼファミリーの場合と異なる３つの主要な差は，１）サブドメインIIは比較的長く，塩基性アミノ酸のストレッチ（ＫＫＲＲＴＫＳＳＲＲ）をもつこと，２）サブドメインIIIは細胞周期依存性キナーゼの場合に最も類似し（図９Ｂ），興味あることに細胞周期依存性キナーゼの典型的配列（ＰＳＴＡＩＲＥ，ＰＳＳＡＬＲＥ，ＰＣＴＡＩＲＥ，ＫＫＩＡＬＲＥ）がサブドメインIIIに存在すること，ならびに３）サブドメインVIIはきわめて短く，わずか７個のアミノ酸から構成されることである．キナーゼドメインの右側下流には，カルモジュリン依存性キナーゼファミリーのほとんどすべてのメンバーに存在する相同の付加的なストレッチがあり，カルモジュリン認識および結合部位と解釈されている（B.P.Herring，J.T.Stull，P. J.Gallagher，J.Biol.Chem．265，1724，1990; M.O.Shoemakerら，J.Cell Biol. 111,1107,1990; F.H.Cruzaleguiら,Proc.Nath.Acad.Sci.USA 89,12127,1990）．カルモジュリン認識ドメインの下流には，位置 365〜629 の 265 アミノ酸にわたるアンキリンリピートドメインが同定された．それは各33アミノ酸の８リピートから構成され，３個のＮ末端リピートを５個のＣ末端リピートから分離する単一のプロリン残基を除いてスペーサーは存在しない（図８および９Ｃ）．アンキリンリピートは様々な細胞で，蛋白質−蛋白質相互作用に関与する（P.Michaely & V.Bennett，Trends in Cell Biology 2，127，1992）が，前にセリン／スレオニンキナーゼの関連で報告されたことはない．アンキリンリピートをもつ一つのチロシンキナーゼが最近 Hydra vulgaris に同定された（T.A.Chanら，Oncogene 9,1253．1994）．ＤＡＰ−キナーゼでは．８つのアンキリンリピートがエフェクター候補もしくは調節分子との相互作用を仲介し，また基質選択性および／またはキナーゼ−基質相互作用の安定性に影響する可能性が考えられる．アンキリンリピートの直ぐ上流には２つの連続したＰ−ループモチーフの可能性のある配列，ＡＬＴＴＧＫＴおよびＧＨＳＧＳＧＫＴがあり，コンセンサス配列，Ｇ[Ａ]ＸＸＸＸＧＫＴ[Ｓ]として確認された．コンセンサス配列に相当するＤＡＰ−キナーゼのＰ−ループモチーフの可能性がある配列を７つのＡＴＰまたはＧＴＰ結合蛋白質ファミリー内で比較すると，3'Ｐ−ループのみが伸長ファクター，ＡＴＰシンターゼｂ−サブユニットおよびチミジンキナーゼのＰ−ループコンセンサスにある種の類似性をもつことが明らかである．現実に，5'Ｐ−ループ候補を包含する８番目のアンキリンリピートに続く33アミノ酸のストレッチは他に比べて保存度の低い９番目のアンキリンリピートを表すものであるかもしれない．ＤＡＰ−キナーゼはまた翻訳後修飾のための多くの可能性ある部位を有するが，膜貫通ドメインもシグナルペプチドももたない．プログラム Motifs（GCG Software Package）を用いて Prosite bank を検索したところ，ＤＡＰ−キナーゼ蛋白質は位置1376にＣ末端アミド化のためのコンセンサス配列を含有することがわかった（これは，47Ｃ末端アミノ酸は蛋白質本体から切断できることを示唆する）．それはまた６個のＮグリコシル化部位，ならびにｃＡＭＰ−依存性キナーゼ（６），カゼインキナーゼII（28），および蛋白質キナーゼＣ（20）のリン酸化部位と考えられる部位のコンセンサス配列も含有する．全体として，ＤＡＰ−キナーゼの推定されるアミノ酸配列は，きわめて独特な型のカルモジュリン調節セリン／スレオニンキナーゼがレスキューされてきたことを示唆する．一つの蛋白質内にセリン／スレオニンキナーゼドメイン，アンキリンリピートと，キナーゼドメイン外部の付加的なＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位と考えられる部位の組合せ（図10）はこれまで報告されていなかった．160 kDa のサイズはセリン／スレオニンキナーゼには稀であり，ＤＡＰ−キナーゼは実際，今日までに知られている最大のカルモジュリン依存性キナーゼである．最近，酵母の２ハイブリド系で確認されたＤＡＰ−キナーゼのカルモジュリン結合能（示されていない）は，多くの場合プログラム細胞死はＣａ²⁺依存性であるという見解（S.Sen,Biol.Rev.Camb.Philos.Soc．67，287，1992; S.Lee，S.Christakos，M. B.Small,Curr.Opin.Cell.Biol．5，286，1993）に一致する．さらに最近，カルモジュリンアンタゴニストがグルココルチコイド誘発アポトーシスを阻害し（D. R.Dowd，D.P.Mac，B.C.Komm，M.R.Hausster，R.Miesfeld，J．Biol．Chem．266, 18423，1991），ミオシン軽鎖キナーゼインヒビターによりＴＮＦ誘導アポトティック細胞死が遮断される（S.C.Wright，H.Zheng，J.Zhong，F.M.Torti，J.W.L arrick，J.Cell.Biochem．53，222，1993）と報告されている．ＤＡＰ−２が真にキナーゼであることを証明するため，ＣＯＳ細胞を全コード領域（上述の開始ＡＴＧコドンから 3'-末端における最初の EcoRＩ部位まで）を含む 129ｃＤＮＡのフラグメントをもつ発現ベクター（ＰＥＣＥ−ＦＬＡＧ）で一過性にトランスフェクトした．細胞溶解物を抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体で免疫沈降し，洗浄した免疫沈降物についてカルモジュリンとＣａ²⁺の存在下にインビトロ自己リン酸化をアッセイした．図２Ｃに示すように，インビトロ反応生成物をポリアクリルアミドゲル上で分画化すると，160 kDa の単一のリン酸化されたバンドが出現した．この実験は，この組換え蛋白質が，予測されたアミノ酸構造によって示唆されるように，固有のキナーゼ活性をもっことの最初の直接的証明を提供するものである． VII．様々な細胞および組織におけるＤＡＰ−１およびＤＡＰ−２蛋白質の発現様々な細胞系および組織の検討から，これらの２つの遺伝子は普遍的に発現されるように思われる．図10はＤＡＰ−１ｃＤＮＡでプローブされた様々な造血細胞からのＲＮＡのノーザンブロット分析を示す．この遺伝子の 2.4 Kb ｍＲＮＡトランスクリプトが顆粒球（ＨＬ-60），Ｂリンパ球（Daudi）およびマクロファージ（Ｕ937）細胞に検出された．造血細胞における発現レベルはＨｅＬａ細胞の場合より低かった．図11はヒト胚組織：脳，脾臓（主にＢ細胞）ならびに肝臓（主に赤血球）におけるｍＲＮＡ発現実験の結果を示す．この場合もＤＡＰ−１ｃＤＮＡプローブによって，これらの組織で単一の 2.4 Kb ｍＲＮＡトランスクリプトが検出された．ＤＡＰ−２ｃＤＮＡプロープ２は，これらの異なる組織中でこの遺伝子によってコードされた 6.3 Kb ｍＲＮＡを認識した（図11）．ダウン症候群からの胚肝臓および脾臓組織はこのブロットでさらに高いレベルのＤＡＰ−２遺伝子を発現するように思われ（ＧＡＰＤＨレベルとの比較），一方ダウン症候群からの脳組織は相当する正常脳よりも高レベルのＤＡＰ−１ｍＲＮＡを含有した． VIII．ＤＡＰ−３，ＤＡＰ−４およびＤＡＰ−５のクローニングおよび配列決定クローン259（ＤＡＰ−３）をＤＡＰ−１およびＤＡＰ−２について上述したように配列決定し，Ｋ562 λgt10 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した．ＤＡＰ−３の（ほぼ）完全長ｃＤＮＡの配列および推定されるアミノ酸配列を図12に示す．クローン253（ＤＡＰ−４）および260（ＤＡＰ−５）は，ＤＡＰ−１およびＤＡＰ−２について上述したように配列決定し，結果はそれぞれ図13および14に示す． IX．ＤＡＰ−７の同定救済された各ｐＴＫＯ１クローンでトランスフェクトされた様々なＨｅＬａ細胞について実施した初期の顕微鏡観察では（表１に記載），プラスミドｐＴＫＯ 1-229（グループ７）がグループ１からのプラスミドによって付与された作用と類似の作用をもつことが指示された．それはＩＮＦ−γ誘導細胞死に対する細胞の感受性を低下させたが，その細胞増殖抑制作用には影響しなかった．プラスミドｐＴＫＯ1-229がもつｃＤＮＡは配列決定によりヒトカテプシンＤｃＤＮＡのBamHＩ-HindIIIフラグメントと同一であった．これは発現ベクター中にアンチセンス方向で存在した．フラグメント #229 に相当するＤＮＡプローブは，期待されたように，対照およびトランスフェクトＨｅＬａ細胞の両者において単一の内因性 2.5 Kb ｍＲＮＡにハイブリダイズした．カテプシンＤセンスｍＲＮＡの定常状態レベルは，ＩＮＦ−γ処置によっては影響されなかった．ｐＴＫＯ1-229トランスフェクト細胞においては，そのＤＮＡプローブは混成アンチセンスＲＮＡにもハイブリダイズした．アンチセンスカテプシンＤＲＮＡのレベルは，ｐＴＫＯ１発現ベクター中のＩＳＲＥエンハンサーの存在によって，ＩＮＦ−γに対する応答における５倍に刺激された（示していない）．カテプシンＤ蛋白質は市販のポリクローナル抗体（Oncogene Science）を用いてイムノプロット上に同定された．対照クローンにおいては，ＩＮＦ−γは成熟 34 kDa 鎖の出現を防止したが，48 kDa 活性単一鎖プレカ−サーはこれらの細胞中には異常な高レベルに維持された．この単一鎖プレカ−サーは細胞死に際して機能する特異的なカテプシン型である．カテプシンＤは通常ライソソームに見出されるアスパラギン酸プロテアーゼであり，そこで蛋白質の異化に働く．しかし，ある種の病的状態では，このプロテアーゼはサイトゾルで機能することも可能で，その活性は変性脳変化，筋ジストロフィーおよび結合組織疾患の病理に関連することが示唆されている（Matus & Green，1987，Biochemistry，26，8083-8036）．本発明は，このプロテアーゼの発現がＩＮＦ−γによって誘導されるプログラム細胞死の実行に不可欠であることを初めて示したものである．すなわち，カテプシンＤはプログラム細胞死の異なるシナリオにおいて重要な役割を演じるプロテアーゼの拡大しつつあるリストの中に加えられるべきものである．カテプシンＤのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は図15に示す（Faust,P.L.ら， 1985,PNAS USA 82，4910-4914）．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＡＢ 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｈ 21/04 9356−4Ｈ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/47 9356−4Ｈ 16/18 14/52 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 16/18 9358−4Ｂ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 9453−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵＣ１２Ｑ 1/68 9051−4Ｃ 37/66 ＡＡＭＧ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）その発現がサイトカイン誘導プログラム細胞死の誘発に必須の遺伝子，（ｂ）（ａ）に定義された遺伝子によってコードされるのと同じ蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列，（ｃ）１個または２個以上の核酸トリプレットが付加，欠失または置換された（ａ）または（ｂ）の修飾ＤＮＡ配列であり，その修飾ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質またはポリペプチドは（ａ）または（ｂ）に定義された遺伝子によってコードされる蛋白質またはポリペプチドと同様にサイトカイン誘導プログラム細胞死を誘発する修飾ＤＮＡ配列，（ｄ）上記生物活性を有する蛋白質またはポリペプチドをコードする（ａ），（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡ配列のフラグメント，（ｅ）（ａ）のＤＮＡ分子の全体または部分に対してアンチセンスであり，上記遺伝子の発現を阻害できる配列，ならびに（ｆ）１個または２個以上の核酸トリプレットが付加，欠失または置換された（ａ）または（ｂ）の修飾ＤＮＡ配列であり，その修飾配列によってコードされる蛋白質またはポリペプチドは，上記サイトカイン誘導プログラム細胞死を阻害する上記蛋白質またはポリペブチドの能力によって明白な優性の負の効果を有する修飾ＤＮＡ配列，から構成される群より選ばれる配列からなるＤＮＡ分子．２．（ａ）図６に示した配列の位置 160〜162 における核酸トリプレットに始まりトリプレット 466〜468 に終わるコード配列からなるＤＮＡ配列，（ｂ）図６に示した配列の位置 287〜289 における核酸トリプレットに始まりトリプレット 816〜818 に終わるコード配列からなるＤＮＡ配列，（ｃ）図８に示した配列の位置 337〜339 における核酸トリプレットに始まりトリプレット 4603〜4605 に終わるコード配列からなるＤＮＡ配列，（ｄ）図12に示した配列の位置 74〜76 に始まり位置 1268〜1270 に終わるコード配列からなるＤＮＡ配列，（ｅ）図13に示した配列からなるＤＮＡ配列，（ｆ）図14に示した配列からなるＤＮＡ配列，（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のＤＮＡ配列の一つによってコードされるのと同一の蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列，（ｈ）１個または２個以上の核酸トリプレットが付加，欠失または置換された（ａ）〜（ｇ）のＤＮＡ配列であり，その配列によってコードされる蛋白質またはポリペプチドは，それぞれ配列（ａ）〜（ｇ）のＤＮＡ配列の一つによってコードされるのと本質的に同じ生物活性を有するＤＮＡ配列，（ｉ）それぞれ（ａ）〜（ｈ）のＤＮＡ配列の一つによってコードされる蛋白質またはポリペプチドに存在する生物活性を維持している蛋白質またはポリペプチドをコードする（ａ）〜（ｈ）のＤＮＡ配列の一つのフラグメント，（ｊ）（ａ）〜（ｆ）の配列の一つまたはカテプシンＤ遺伝子の全体または部分に対するアンチセンスであり，上記配列の発現を阻害できる配列，および（ｋ）１個または２個以上の核酸トリプレットが付加，欠失または置換された配列（ａ）〜（ｆ）の一つの修飾ＤＮＡ配列であり，その修飾配列によってコードされる蛋白質またはポリペプチドは，優性の負の効果を有し，それぞれ（ａ）〜（ｆ）の配列の一つによってコードされる蛋白質またはポリペプチドの機能を阻害できる修飾ＤＮＡ配列，から構成される群より選択される核酸配列からなる「請求項１」に記載のＤＮＡ分子．３．「請求項１または２」に定義されたＤＮＡ配列およびそのＤＮＡ配列を宿主細胞中で増殖および複製するのに必要な配列からなるベクター．４．上記ＤＮＡをｍＲＮＡに翻訳するために必要な配列も包含する発現ベクターである「請求項３」に記載のベクター．５．ベクターｐＴＫＯ１，ｐＴＫＯ２およびｐＴＫＯ３を用いて構築されるエピソームプラスミドである「請求項４」に記載のベクター６．「請求項１（ａ）〜（ｄ）または請求項２（ａ）〜（ｊ）」に定義されたＤＮＡ分子によってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質またはポリペプチド．７．１つまたは２つ以上のアミノ酸の残基が化学的に修飾されている「請求項６」に記載の蛋白質またはポリペプチド．８．図６，８または12に記載されたアミノ酸の配列を有する「請求項６または７」に記載の蛋白質．９．サイトカイン誘導プログラム細胞死の仲介におけるカテプシンＤの使用． 10．「請求項６〜９」の一つに記載の蛋白質またはその免疫原部分にに対して向けられた抗体． 11．医薬的に許容される担体ならびにａ．「請求項６〜９」の一つに記載の蛋白質またはポリペプチド，ｂ．「請求項４または５」のいずれかに記載の発現ベクター，ｃ．「請求項10」に記載の抗体，およびｄ．（ａ）の蛋白質のインヒビターまたはアンタゴニストから構成される群より選ばれる活性成分からなる医薬組成物． 12．サイトカイン誘導プログラム細胞死を誘発するための医薬組成物において活性成分はａ．「請求項６〜９」の一つに記載の蛋白質またはポリペプチド，およびｂ．ＤＮＡ分子は「請求項１（ａ）〜（ｄ）または請求項２（ａ）〜（ｊ）」のＤＮＡ分子である「請求項４」に記載の発現ベクターである「請求項11」に記載の医薬組成物． 13．さらにサイトカインを含む「請求項12」に記載の医薬組成物． 14．サイトカイン誘導プログラム細胞死を防止するための医薬組成物において活性成分はａ．「請求項10」の抗体，ｂ．「請求項６〜９」の蛋白質のインヒビターまたはアンタゴニスト，およびｃ．ＤＮＡ分子は「請求項１（ｅ）もしくは１（ｆ）または請求項２（ｊ）」のＤＮＡ分子からなる「請求項４または５」のいずれかに記載の発現ベクターから構成される群より選ばれる「請求項11」に記載の医薬組成物． 15．サイトカイン誘導プログラム細胞死に関与する生成物をコードする遺伝子における変異を検出する方法において，個体からのゲノムゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを「請求項１または２」に定義したＤＮＡ配列の完全配列または部分配列からなる１つまたは２つ以上のＤＮＡプロープで精査することからなる方法． 16．癌に対する素因をもつ個体をスクリーニングする方法において，（ａ）個体の細胞からのゲノムＤＮＡまたは上記細胞のｍＲＮＡから産生されるｃＤＮＡのいずれかのサンプルを採取し，（ｂ）ＤＡＰ遺伝子の完全もしくは部分配列またはＤＡＰ遺伝子の完全もしくは部分配列に対するアンチセンス配列である配列からなる１つまたは２つ以上のＤＡＰプロープを添加し，（ｃ）ＤＮＡプロープ（単数または複数）と上記サンプルのＤＮＡの間のハイブリダイゼーションのための条件を設定し，（ｄ）ハイブリダイゼーションに基づき，ＤＡＰ遺伝子が存在しないか否か，ＤＮＡプロープ（単数または複数）の配列と上記サンプルのＤＮＡ中の配列の間でマッチングするか否か，またはゲノムＤＮＡにおける欠失もしくは変異および試験された個体の癌に対する素因を指示するミスマッチが存在するか否かを決定する方法． 17．癌に対する素因をもつ個体をスクリーニングする方法において，「請求項６または10」の機能性蛋白質と非機能性変異蛋白質を識別できる抗体を使用する方法． 18．制御されない病的な細胞増殖を伴う疾患または障害の処置方法において，疾患のある個体に，ａ．「請求項６〜９」の一つに記載の蛋白質，およびｂ．ＤＮＡ分子は「請求項１（ａ）〜（ｄ）または請求項２（ａ）〜（ｊ）」のＤＮＡ分子である「請求項４」に記載の発現ベクターから構成される群より選ばれる活性成分の治療的有効量を投与する方法． 19．「請求項18」に記載の疾患の処置方法において，活性成分はサイトカインと併用して投与する方法． 20．サイトカイン誘導プログラム細胞死に関連する疾患または障害の処置方法において，ａ．「請求項10」の抗体，ｂ．「請求項６〜９」の蛋白質のインヒビターまたはアンタゴニスト，およびｃ．ＤＮＡ分子は「請求項１（ｅ）もしくは１（ｆ）または請求項２（ｊ）」のＤＮＡ分子からなる「請求項４または５」のいずれかに記載の発現ベクターから構成される群より選ばれる生理学的細胞死を阻害できる活性成分の治療有効量を投与することからなる方法．