JPH09504681A

JPH09504681A - 多嚢胞性卵巣症候群及び男子パターン脱毛症のための試験及びモデル

Info

Publication number: JPH09504681A
Application number: JP7500392A
Authority: JP
Inventors: フランクス，ステファン; ウイリアムソン，ロバート; キャレイ，アダム，ヘンリー
Original assignee: インペリアルカレッジオブサイエンス，テクノロジーアンドメディシン
Priority date: 1992-05-29
Filing date: 1994-05-26
Publication date: 1997-05-13
Anticipated expiration: 2012-12-24
Also published as: KR100258828B1; DE69325908T2; WO1993024055A1; DE69325908D1; EP0642761A4; EP0642761A1; US5521955A; JP2694674B2; EP0642761B1

Abstract

(57)【要約】多嚢胞性卵巣（ＰＣＯ）症候群は、その根源となる遺伝子的病因を有することが発見された。さらに、男性では、疾患の発現型が、男子パターン脱毛症（ＭＰＢ）であることが見いだされた。P450c17酵素の遺伝情報を伝えるＣＹＰ１７遺伝子における突然変異がこの発現型との関連性を実証している。この突然変異は、この遺伝子の５’転写領域内でのＴのＣによる置換である。このような知見に基づいて、この疾患のモデル化、診断、及び治療のための組替えＤＮＡシステムが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】多嚢胞性卵巣症候群及び男子パターン脱毛症のための試験及びモデル本発明は、多嚢胞性卵巣症候群及び男子パターン脱毛症の遺伝子的原因の確認に基づくものであり、この発見の診断、治療及びモデル化の目的への応用に関するものである。多嚢胞性卵巣症候群（polycystic ovary syndorome：ＰＣＯＳ）はごく普通の内分泌性疾患であり[Adams et al,The Lancet(ii):1375-78(1985),Adams et al, British Medical Jouranal 293:355-59(1986),Fox etal,Clinical Endocrinolog y 34:127-131(1990),Hull,M.G.,Gynecol.Endocrinol.1(3):235-45(1987),Sagle et al,British Medical Journal297(6655):1027-8(1988)及びPolson et al,The Lancet 1(8590):870-2(1988)]、その病因はまだ明らかではない。臨床的所見はさまざまで、多毛症、月経障害、あるいは不妊症を含めて、ある症状又はいくつかの症状の組合せを示す。これは、単一根源的な異常であるかどうかについて疑いを抱かせる。ＰＣＯを有する女子のすべてのグループにおいて最も一致した生化学的知見は、臨床的提示に関わりなく、血清中のアンドロゲンの上昇である［Franks S.,Cl in.Endocrinol.Oxf.31(1):87-120(1989)及びFranks S.,Journal of Endocrinolo gy 129:317-319(1991)］。このことは、種々の臨床的表現型にも関わらず、多嚢胞性卵巣は、アンドロゲンの生合成あるいは代謝における共通した根源的な障害によって引き起こされるという仮説を裏付けるものである。いくつかの報告書で、ＰＣＯSの症例の家族集積性が報じられている［Goldzic hcr et al,Journal of Clinical Endocrinology 22:325(1962),Llague et al,Cl in.Endocrinol.Oxf.29(6):593-605(1988),Cooper et al,American Journal of O bstetrics and Gynaecology 100:371-87(1968),Givens J.R.,Endocrinol.Metab. Clin.North.Am.17(4)771-83(1988),Ferriman et al,Clinical Endocrinology11: 291-300(1979)及びLunde et al,Gynecol.Obstet.Invest.28(1):23-30(1989)］。これらは遺伝子成分について示唆しているが、いずれも、明確な遺伝的様式を実証できていない。患者から得られた家族病歴に基づいて、優性の遺伝様式が示唆されている［Ferriman et al,Clinical Endocrinology 11:291-300(1979)］。しかし、卵巣の超音波検査で罹病近親者を確認した最近の研究において、単なるメンデルの優性遺伝によって説明するには、家族のＰＣＯの頻発度はあまりにも高すぎた［Llague et al,Clin.Endocrinol.Oxf.29(6):593-605(1988)］。入手し得る文献を最近検討したところでは、Simpsonは、遺伝様式は不明のままであり、一つの遺伝子の欠損に基づく形質遺伝は恐らくないであろう、と結論している［ Simpson J.L.,Elucidating the genetics of polycystic ovary syndrome.In:Du naif A.,Givens J.R.,Haseltine F.P.,Merriam G.R.,eds.PolycysticOvary Synd rome．Oxford:Blackwell Scientific Publications,1992:59-77］。しかし、ＰＣＯについて種々の診断基準が含まれているこれまでの研究を解釈する場合に、いくつかの問題が存在する。批判的にいえば、主要な研究の多くは、第１段階の親族及びそれに続く家族メンバーについての唯一の情報源として、発端者（proband）への面談又は質問状を採用しており、男子家族メンバーへの面談や検査は含まれていない。加えて、遅発性（非古典的）先天性副腎肥厚を排除する試みはほとんど行なわれておらず、患者の人種的由来はほとんど述べられていない。男子に起こり得る表現型にはほとんど注意が払われておらず、ただ、二つの研究がＰＣＯと早発性男子脱毛（男子パターン脱毛症(male pattern baldness):ＭＰＢ）との関連性を示している［Ferriman et al,Clinical Endocrinology 11:291-300(1979)及びLunde et al,Gynecol.Obstet.Invest.28(1):23-30(1989)］。本発明の根源となった研究においては、罹病したメンバーの確認と古典的な分離分析（segregation analysis）によって、10の大家族の遺伝様式を判定した。ＰＣＯは根源となる遺伝的病因を有し、この障害の男子における表現型は男子パターン脱毛症（ＭＰＢ）であることが発見された。また、ＣＹＰ１７遺伝子における多型性がこの疾患との関連性を示すことも発見された。この突然変異のＰＣＯ及び／又はＭＰＢとの関連性は、完全な分離が不十分な（short of complet e segregation）ためであり、このことは、ＣＹＰ１７が多嚢胞性卵巣及び男子パターン脱毛症にとって主要な調節遺伝子の一つであるが、これだけで原因となるものではないことを示唆している。ＣＹＰ１７遺伝子は、P450XVIIA1と名付けられでおり、クロモソーム10上にあり、ステロイドホルモンの生合成において17α−ヒドロキシラーゼ及び12、20リアーゼの両者の活性を仲介するシングル・シトクロームP450酵素であるp450c17に遺伝情報を伝える(encode)。この遺伝子は、Picado-Lconard & Miller［DNA 6(5)439-448(1987)］によってクロン化され、配列順序が決定されており、本明細書では、その報告書の第３図に示されている番号システムを採用する。 P450c17はプレグネノロン及びプロゲステロンに対して17α−ヒドロキシラーゼとして作用して、それぞれ、17ＯＨ−プログネノロン及び17ＯＨ−プロゲステロンを形成する。このものはさらに、17ＯＨ−プレグネノロン及び17ＯＨ−プロゲステロンに対して17,20リアーゼとして作用して、ＤＨＥＡ及びアンドロステンジオンを形成する。P450c17は、アンドロゲン生合成における律速酵素であると信じられる。本発明は、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯ）及ひ／又は男子パターン脱毛症（ＭＰＢ）のモデル系、ならびに、このようなモデル系において、かつ／あるいは、診断又は遺伝子治療において有用なＤＮＡ分子を提供するものであり、このモデル系及びＤＮＡ分子は、アンドロゲン生合成を増強させる突然変異を含んだＣＹＰ１７遺伝子の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列からなるものである。本発明の第１の態様によれば、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯ）及ひ／又は男子パターン脱毛症（ＭＰＢ）に関連性を持つ変異体ＣＹＰ１７対立遺伝子（mutant CYP17 allele）の遺伝情報を有する単離ＤＮＡ又は組替えＤＮＡが提供される。この突然変異は、ＣＹＰ１７遺伝子の蛋白質指定(protein-coding)領域におけるものでもよく、P450c17酵素活性を増強させる役目を果たすものでもよい。あるいはこの突然変異は、翻訳されておらず、蛋白質指定領域への５’に位置するプロモーター領域におけるものでもよい。このような突然変異は、遺伝子生産物の発現の増加につながる。特定の具体例では、このＤＮＡ配列順序は、ＣＹＰ１７遺伝子の５’非翻訳領域の少なくとも一部分を含み、そこでは、翻訳開始部位から−34位置でＴがＣによって置換されている。このＴ →Ｃ変化によってＳＰ−１型部位が発生し、これによって遺伝子が完全に調整されるものと信じられる。その結果、この突然変異によって、アンドロゲン生合成が増強される。本ＤＮＡ配列は、全官能プロモーターを含むことができ、一部の好ましい具体例では、蛋白質指定領域をも含むことができる。ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡは本発明の範囲に含まれる。本発明の特定の具体例は、−34位にＴ→Ｃ変異を有する変異体ＣＹＰ１７対立遺伝子を含む単離ＤＮＡ又は組替えＤＮＡに関するものである。本発明による組替えＤＮＡは、通常はプロモーターが人為的に結合されず、また検知可能な蛋白質（「リポーター」）を指定するような遺伝子（「リポーター遺伝子」）に人為的に結合させた変異体ＣＹＰ１７プロモーターを含むことができ、この遺伝子は、このプロモーターを研究する目的から、検知し得る変化を触媒する酵素であってもよい。本発明の組替えＤＮＡは、宿主細胞を形質変換(transform)又は形質導入(tran sfect)させるのに用い得る、プラスミド、コスミド、ファージミドあるいはウイルスなどのベクターの形態のものでもよい。蛋白質指定ＤＮＡに人為的に結合させたプロモーターを含むベクターは発現ベクターとして有用であり、蛋白質指定ＤＮＡを発現することのできないベクターもクロン化ベクターとして有用である。本発明の第２の態様では、前記のようなベクターで形質変換又は形質導入させた宿主細胞が提供される。この宿主細胞は、原核生物の細胞あるいは真核生物の細胞でもよい。適切な原核宿主は大腸菌（Escherichia coli）である。適切な真核宿主は、酵母（Saccharomyces cerevisiaeなど）、昆虫細胞（Spodoptera fru giperdaなど）、及び哺乳類の細胞を含む。これらは一次細胞あるいは不死化細胞系であってもよい。本発明による組替えＤＮＡあるいは単離ＤＮＡは、形質変換動物（transgenic animal）を発生させるに適した構成体（construct）の形態のものでもよい。本発明の第３の態様によれば、生殖系列が、変換形質（transgene）として現われるような構成体を含んだ形質変換非人間動物が提供される。従って、本発明の形質変換動物は、ＰＣＯ及び／又はＭＰＢと関連性を有する変異体ＣＹＰ１７対立遺伝子の遺伝情報を有する変換形質を持った動物を含む。このような形質変換動物は、任意の所望の種のものでよく、本技術分野で知られている方法によって調製することができる。マウスについては、標準ホーガン微量注射プロトコール(the standard Hogan microinjection protocol)［Hogan et al.,"Manipulati ng the Mouse Embryo:A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory P ress,Cold Spring Harbor,New York, USA(1986)］を用いることができる。本発明による形質変換した、あるいは形質導入した細胞、及び形質変換動物は、ＰＣＯ／ＭＰＢの遺伝子的根拠とその関連生化学の研究にとってだけでなく、薬剤のスクリーニングや薬効の評価にとっても有用である。本発明の第４の態様によれば、ＰＣＯ及び／又はＭＰＢの治療又は予防に潜在的に有用な化合物のスクリーニングにおけるこのような細胞又は動物の使用が提供される。供試化合物をこの細胞又は動物に提供又は投与することができ、アンドロゲン生合成、とくにP450c17によって仲介されるアンドロゲン生合成をモニターすることができる。本発明はまた、ＰＣＯ及び／又はＭＰＢに対する遺伝子的素質、ならびにその他の遺伝子的解析の判定において応用面を有する。本発明の第５の態様によれば、特に被検者のＰＣＯ及び／又はＭＰＢに対する遺伝子的素質を判定する目的の、遺伝子的解析方法が提供される。この方法は、被検者のＤＮＡにおいてＣＹＰ１７対立遺伝子の存在を検知することを包含する。ＤＮＡ配列順序の決定を含む場合もあるこの検知は、被検者の身体から取り出して返還しない試料について実施することができる。その代わりに、あるいはそれに加えて、この検知にはプローブ（probe）の使用を関与させることができる。この場合には、以下に記述するようなオリゴ−あるいはポリ−ヌクレオチドが有益であろう。本発明の第６の態様によれば、−34位にＴ→Ｃ変異を有する変異体ＣＹＰ１７対立遺伝子に特定的にハイブリッド形成するオリゴ −、又はポリ−ヌクレオチドが提供される。このハイブリッド形成条件は、特定的なハイブリッド形成を生じるに十分なほど厳密のものとなるであろう。このオリゴ−、又はポリ−ヌクレオチドは、ヌクレオチド数が少なくとも10,1 5,20又は25の長さ（この順に好ましさが増す）であってもよく、これはラジオアイソトープなど、検知可能な標識で標識付けすることができる。しかし、これは必須要件ではない。例えば、このオリゴ−、又はポリ−ヌクレオチドは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に基づく検知方法においてプライマー(primer)として用いることができる。−34位におけるＴ→Ｃ変異によってMspAI制限部位が生じるという事実は、少なくともこの特定的な突然変異によって、ＰＣＲ反応生成物を制限酵素消化によって分析することができる、ということを意味する。このような検知方法はまた、ＰＣＲに基づく方法においても用い得るであろう。これは、変異部位自体からとるのではなく、突然変異部位の近くの配列に基づくプライマーを用いるものである。ある個体のＣＹＰ１７遺伝子における遺伝子突然変異を検知したことから、ＰＣＯ／ＭＰＢの進展を阻止するために、遺伝子植込体の形で、遺伝子治療を採用することが可能であろう。正常な、あるいは少なくとも受け入れられるようなＣＹＰ１７発現レベルを復原させるには、種々の手段を用いることができる。例えば、正常なＣＹＰ１７遺伝子又はプロモーターを用いて遺伝子植込体の基盤を形成させてもよく、あるいは、変異体ＣＹＰ１７遺伝子によるP450c17の生成、あるいは、そうして生成したP450c17の活性を調節させてもよい。 P450c17の生成の調節に関する具体例としては、変異ＣＹＰ１７遺伝子、あるいはもっと特定していえば、プロモーター、の全て又は一部に相補的な、特定のアンチセンス（antisense）ポリヌクレオチドを用いる方法が含まれる。このような相補的アンチセンスポリヌクレオチドには、好ましい具体例としては-34位の領域にある関係目標配列への特定的なハイブリッド形成能がそのポリヌクレオチドの性質として保持されている限り、ヌクレオチドの置換体、添加体、欠失体又は転移体(transposition)が含まれる。アンチセンスポリヌクレオチドは、野性のＣＹＰ１７と違って、優先的に変異体ＣＹＰ１７遺伝子配列に結合するはずである。本発明の各態様における好ましい特徴は、必要な改変を施して、他の各態様についても当てはまる。本発明において頂点に達する作業では、多嚢胞性卵巣（ＰＣＯ）を有するものと継続的に確認された患者の家族を、彼らの遺伝子構造、卵巣の形態学、診療及び内分泌の状態、を判断するために詳しく検査した。その後の研究には、10家族で十分な数となることがわかった。罹病個体の第１段階の女子血縁者は、51％の罹病の危険性があった。早発性男子パターン脱毛症（ＭＰＢ）が、必常男子キャリアーに対する正確な表現形であることがわかった。全ての家族が、90％以上の表現率でＰＣＯの常染色体優性遺伝を示した。この個体群における常染色体ＰＣＯの頻発度は約20％である。ＰＣＯ及び男子パターン脱毛症は、アンドロゲンの生成又は作用に影響する同一遺伝子の対立遺伝子によって引き起こされるようである。ＰＣＯとＭＰＢとで頻発度が異なるのは、それぞれ女子及び男子における表現型発現の閾値が異なるためである。表現型が多少ばらつくことは、恐らく他の遺伝子の修飾効果によって説明がつく。次に、本発明を以下の非限定的な実施例によって例示する。実施例１多嚢胞性卵巣症候群及び男子パターン脱毛症の原因となる単一遺伝子効果の証拠ロンドンのSamaritan and St.Mary's Hospitalsの内分泌及び不妊症診療部から将来的に、かつ継続的に患者を募った（発端者）。各発端者は、骨盤超音波スキャンによって多嚢胞性卵巣を有するものと診断された者であり、罹病していると考えられるかどうかは別にして、少なくとも一人の姉妹を持つことが知られていた。この超音波スキャンは、Acuson（登録商標）128超音波機を用いて実施し、すでに述べられているように卵巣形態学を定義した［Adamset al,The Lancet( ii):1375-78(1985),Adams et al,British Medical Journal 293:355-59(1986)］。発端者たちは、いくつかの人種及び国籍にわたることが記録され、あるいは種々の兆候を示していた。14人の女子の内の９人は月経不順であり（その内の４名はまた多毛であった）、４名は多毛症の兆候を示していたが、周期は正常であった。１名は原発性不妊症の病歴を有していた。各自に面接して、完全な病歴を把握し、特にPolsonら［Polson et al,The Lancet 1(8590):870-2(1988)］によって記述されているように月経障害の基準、ならびに、にきびと多毛症の程度に関する被検者の自覚的評価について質問した。身長、体重及び血圧測定を含めて、一般的検査を実施した。多毛症の程度は、Ferriman及びGallweyのスコア［Ferriman et al,Jo urnal of Clinical Mctabolism 21:1440-5(1961)］を用いて評価し、にきびの存否を記録した。各被検者について体質量係数（body mass index:ＢＭＩ）を計算した。ただし、肥満症はＰＣＯ Sの特定の兆候としてはとらなかった。同様に、反復性流産及び不妊症の病歴を記録したが、正の予報値としては用いなかった。放射線免疫検定［Adams et al,The Lancet(ii):1375-78(1985)及び Franks S., Clin.Endocrinol.Oxf.31(1):87-120(1989)］によって、性腺刺激ホルモン（ＦＳＨ及びＬＨ）、テストステロン、プロラクチン、及び17−α−ヒドロキシプロゲステロンを評価するために血液サンプルを採取した。全家族メンバーにおいて、黒色表皮腫及びその他のＡ型インシュリン抵抗性の臨床的特徴の有無［Moller e t al,The New England Journal of Medicine 325:938-948(1991)］を記録した。肥満した発端者について、標準75g経口ブドウ糖負荷試験に対するブドウ糖及びインシュリンの反応を評価した。 14人の発端者について全ての第１段階の血縁者に接触し、その中で10人の近親関係者を、解析し得る家族構成を有し、本研究のための試料採取及び評価に活用できる者として確認した。これら10人の近親関係者におけるそれそれ第１段階の縁戚者（62個体）に面接し、さきのプロトコールに従ってスクリーニングを行なった。加えて、各男子家族メンバーについても脱毛の発症の程度と時期を評価した。早期男子脱毛症は、40才以前の顕著な前頭頂骨部毛髪喪失として定義した［Ferriman et al,Clinical Endocrinology 11:291-300(1 979)］が、本研究の目的には年令の下限として30才を採用した。さらに107人の拡大家族メンバーにも接触し、面接して、これらの家族の24人の死亡者について他の縁戚者からデータを得た。グループにおける頻度差の統計的解析は％²又はフィッシャーのイグザクトテスト（exact test）を用いて評価した。内分泌及び超音波測定における平均値の差を計算するにはスチューデンツのｔ−テスト(students t-test)を用いた。統計的有意性はp＜0.05としてとった。本研究の承認はParksidc Area Health Authorityの倫理委員会から得た。全体で81人の近親関係グループ（その内の１名だけが死亡）を、本研究に応募した14名の発端者の第１段階の血縁者として確定した。これらの家系の69人について完全なスクリーニングが可能であり、さらに６人について面接を行なった。ある１家族の５人が海外に居住しており、接触できなかった。11の家族において、白人系が10（アイルランド系が２）、イラン系が２、カリブ黒人系が１、アジア系が１であった。４家族（２白人系、１カリブ黒人系、及び１イラン系）は分離分析から除いた。それは、全ての第１段階血縁者についてスクリーニングを完了することができなかったからである。 10の近親関係グループから、62人の内の58人について完全なスクリーニングを行なった。１人は死亡し、３人（男子２人、女子１人の兄弟姉妹）は完全なスクリーニングを回避したが、面接はできた。また、これら10の近親関係グループからの、知られた、さらに離れた家族メンバーが88人あり、これらの内の28人（二つの大きな近親関係グループから27人）について現在まで完全なスクリーニングが可能であった。また、24人の死亡者について医学的病歴を得た。全ての近親関係グループから全体で89人について完全なスクリーニングを行なった。内訳は、女子67人と男子22人であった。これらの女子の内、17人は統計分析から除いた。３人は初潮以前、９人は閉経後、１人は妊娠中であった。３人について、信頼度をもって卵巣形態学を評価できなかった。また１人の女子は、超音波スキャンを受けることを避けた。４人の女子について、周期の中間に（mid- cyclc）血液試料を採取し、そのＬＨ値をその分析から除いた。月経の不整（複合経口避妊用ピルの服用を始める前）及び／又は望ましからぬ発毛（にきびのある場合も、ない場合も）が病歴に含まれている場合は、それをＰＣＯについて陽性とした。これらの近親関係グループにおいて、17α−ヒドロキシプロゲステロン及びプロラクチンの評価結果は全て正常範囲内であった。Ａ型インシュリン抵抗性の典型的な表現型を示す家族はいなかった。ＢＭＩ＞25の発端者が８人いた。肥満を制御しているグループについて、経口ブドウ糖に対するインシュリン応答性が範囲外であるものは被検者にはいなかった。分析が可能であった50人の女子の内で、16人が複合経口避妊用ピル（ＣＯＣＰ）を服用中であった。必要ある場合（例えばＬＨ及びテストステロンの測定のため）、これら２グループの結果は分けて考察されている。スクリーニングの時点でＣＯＣＰを服用していた16人の内の11人は、月経障害または多毛症の治療のためにそれを服用していた。予想どおり、超音波で多嚢胞の形態学がみられる女子においては、正常な卵巣の女子よりも平均［ＳＤ］卵巣容積が大きかった（ＰＣＯ：13.1[4.9]cm³,正常：4.6[1.7]cm³）。15人の女子が経口避妊用ピルを服用していたという事実にも関わらず、37人のＰＣＯを有する女子の内の29人（78％）が＞9ml³の卵巣容積（正常卵巣の平均値からの２標準偏差）を有していた［Polson et al,The Lancet 1(8590):870-2(1988)］。ＣＯＣＰを服用中の女子の内で、16人中の15人がＰＣＯを有してた。卵巣形態学とＰＣＯ陽性病歴との間には高度に有意の関連性があった（p＜0.0 034）。ＰＣＯの超音波診断を受けた女子の84％が症候を有していた。月経不順及び／又は多毛症の32人の女子の内の31人がＰＣＯを有していた（97％感度）。ＰＣＯを有する37人の女子の内の31人が症候的であった（84％の正の予測値）。反対に、陰性の病歴は92％の負の予測値を有していた。卵巣形態学あるいは症候学とＢＭＩとの間には関連性はなかった。経口避妊薬を服用していない者では、正常な女子のＬＨ値（平均［S.D.］）は、ＰＣＯを有する女子のその値とは顕著に違っていた（正常：5.0[2.4]U/I,ＰＣＯ：10.2[4.6]U/I:p=0.003）。経口避妊薬を服用している者を含めた場合、ＬＨ値に顕著な差はなかった。血清テストステロン濃度は、正常な卵巣の女子（1.5[0.5]nmol/l）におけるよりも、ＰＣＯを有する女子（2.2[0.7]nmol/l）における方が著しく高かった（p=0. 015）。この違いは、経口避妊薬を服用している女子のデータをも含ませても、維持されていた（p=0.007）。生化学的異常をＰＣＯの指標として用いた場合、ＬＨ及びテストステロンの測定の組合せによって、超音波でＰＣＯを有するとされた女子の54％が確認された。生化学的マーカーに症候学を組み合わせれば、多嚢胞性卵巣の超音波による証拠を有する女子の92％を確認することができた（p ＜0.001）。本研究でスクリーニングにかけた22人の男子の内で、８人は早発性男子パターン脱毛症を示し、10人は正常であり、４人は評価するには若すぎた。正常な被検者の内の２人は内分泌分析から除いた。１人は腎臓移植後に高薬量のステロイドを服用中であり、もう一人は非常に低い血清テストステロン濃度（4.4nmol/l）を有しており、現在さらに検査中である。ＢＭＩと早発性ＭＰＢとの間に関連性はなかった。平均テストステロン濃度は、ＭＰＢに罹病していない男子に比べて、ＭＰＢの男子においてわずかに、ただし有意にではなく、大であった（12.3[4 .2]nmol/l,対10.7[4.2]nmol/l）。これらの家族における早発性ＭＰＢの罹患率（31％）は、これまで出版されている研究で報告されているところと一致し［Ferrimanet al,Clinical Endocrinolo gy 11:291-300(1979)及びLunde et al,Gynecol.Obstet.Invest.28(1):23-30(198 9)］、ＰＣＯを持たないことが知られている家族における罹患率（７％）よりもはるかに大であった（χ(カイ)²=19.3;p=0.0001）［Fcrriman et al,Clinical Endocrinology 11:291-300(1979)及びLunde et al,Gynecol.Obset.Invest.28(1) :23-30(1989)］。次いで、スクリーニングの操作手順に基づいて、10の家系の各員について罹病体質（affection status）の指定(assignment)を判断した。閉経後の女子及び外科的閉経を受けている女子に対しては、陽性の病歴に基づいて罹病体質を割り当てた。男子は、早発性ＭＰＢの病歴に基づいて陽性の罹病体質を指定した。また、これによって、12人の男子の死去者について、近い家族縁戚者から得た病歴を用いて指定ができた。その内の８例は、写真による証拠によって裏付けられた。家族Ｎ．Ｓ．では、女子II-４を指定することができなかった。それは、彼女が閉経後であり、信頼できる婦人科病歴を提供できなかったからである。女子II I-10及び-11は、初潮以前であるために指定できない。罹病家族について計算した分離率は、確認の偏りを避けるためにこの発端者を除いて、51.4％であった。いずれの場合も、男子パターン脱毛症を男子の発現型としてとる場合、この分離（segregation）は常染色体優性遺伝に一致した。本研究において、超音波によるＰＣＯの典型的な知見は、症候学的病歴に高度に一致（84％）することが実証されている。症候と生化学的マーカーとを組み合わせれば、罹病個体の94％を診断することができた。これらのデータは、正常な個体群においてＰＣＯの罹患率を評価した本センターによるこれまでの研究と一致した［Polson et al,The Lancet 1(8590):870-2(1988)］。この研究では、ＰＣＯを有する女子の94％が症候だけで確認することができた。これらの観察結果は、ＰＣＯの遺伝様式を判断する上で重要である。なぜなら、現在のところ、罹病体質を指定できる可能性は生殖能力のある女子に限定されており、分析は１世代か、せいぜい２世代になるからである。陽性の病歴は多嚢胞卵巣の強力な予測要因であるから、完全なスクリーニングが可能でなく、信頼できる病歴を得られない女子を、これだけに基づいて罹病体質であると指定することは合理的であるように思える。本研究では、経口避妊薬を服用しているかどうかに関わらず、正常グループ及びＰＣＯグループについて、卵巣容積、ＬＨ及びテストステロン値がこれまでの研究結果と一致することが見いだされた［Polson et al,The Lancet 1(8590):87 0-2(1988)及びFranks S.,Clin.Endocrinol.Oxf.31(1):87-120(1989)］。検討された家族における早発性ＭＰＢの罹患率は、これまで報告されているように、非罹病家族について予期されたよりも高かった［Ferriman et al,Clinica l Endocrinology 11:291-300(1979)及びLunde et al,Gynecol.Obstet.Invest.28 (1):23-30(1989)］。男子発現型としての早発性ＭＰＢ、初潮後閉経前の女子の陽性超音波検査結果、及び閉経後の女子の陽性病歴を取り上げて罹病体質の指定を行なった場合、分離率は、指標の事例（indcx case）を除いて、51.4％であった。全ての10家族について、遺伝様式は常染色体優性疾患と一致した。さらに、このモデルは、他の４家族の内の３家族において適切であった。この場合は、第１段階の全てのメンバーに接触することができたが、面接だけで罹病体質が指定された。本研究及び従来の研究［Polson et al,The Lancet 1(8590):870-2 (1988)］のいずれにおいても、ＰＣＯの超音波による証拠を有する正常な女子の８％が、月経障害及び又は多毛症を持たなかった。ただし、もっと最近の個体群研究では、ＰＣＯを有する女子のむしろさらに高い率の者が症候を示していない［Clayton et al,Clinical Endocrinology 37:127-134(1992)］。これらの女子の内のあるものは反復性早期流産を示すことが考えられる。このような女子の約 80％が多嚢胞性卵巣の形態学の知見を有し、その内の40％未満が何かその他の症候を有していることが知られている［Sagle et al,British Medical Journal 29 7(6655):1027-8(1988)］。この疾患における根源的な異常は何であろうか？平均血清テストステロン濃度の増加が、多毛症又は反復性流産の病歴を示す正常周期の者も含めた、ＰＣＯを有する女子の各グループの特質である［Sagle et al,British Medical Journal 297(6655):1027-8(1988),Franks S.,Journal of Endocrinology 129:317-319(19 91)及びWatson et al,Journal of Endoclinology 129(Suppl.)Abstract No.206( 1991)］。この研究では、罹病女子は非罹病被検者よりも顕著に高い血清テストステロン濃度を有していた。ＭＰＢを有する男子とそうでない男子との間に顕著な差はなかったが、我々の研究グループにおける数が少なく、ＭＰＢの原因としてこれまでアンドロゲンが関係付けられているのである。ＰＣＯを有する女子では、卵巣及び副腎におけるアンドロゲン生合成の律速段階を触媒するP450c17α 酵素の調節異常があることがすでに示唆されている［Rosenfield et al,Fertil. Steril.53(5):785-91(1990)及びBarnes et al,N.Engl.J.Med.320(9):559-65(198 9)］。アンドロゲン生化学／代謝のこのような異常がＰＣＯ及び早発性ＭＰＢを引き起こすという考えは非常に魅力的である。それは、先天性副腎肥厚を有する女子の80％より多くにおいてＰＣＯが存在するというような見かけ上の矛盾を説明することができるような統一的仮説が提供されるからである［Hague et al,Clin.Endocrinol.33:501-10(1990)］。ＰＣＯの発現を修飾するいくつか他の遺伝子が存在するらしく思える。例えば、肥満症について遺伝子的傾向があり、ＰＣＯを有する肥満性女子は、痩せた女子よりも症候の現われる可能性が比較的高い［Kiddy et al,Clin.Endocrinol.Ox f.32(2):213-20(1990)］。ＰＣＯにおける肥満症の影響は、インシュリン抵抗性又は過インシュリン症によって仲介されるらしい。インシュリン抵抗性は、体重に関係なく、ＰＣＯを有する女子の特徴であることが知られている［Robinson e t al,Clinical Endocrinology 36:537-543(1992)及びDunaif et al,Diabetes 38 :1165-1174(1989)］。さらに、症候に対する肥満症の影響は、少なくとも部分的に、カロリー制限によって逆転する可能性がある。ＰＣＯを有する肥満性の無排卵女子は、体重減少だけに応答して排卵し、懐妊することになる［Kiddy et al, Clinical Endocrinology 36:105-111(1992)］。同様に、アンドロゲン依存性毛嚢の生物学には、明らかな人種的遺伝子的ばらつきがあり、これは多毛症の存在及び程度に現われる。しかし、二次的遺伝子効果にも関わらず、ＰＣＯは、全ての人種グループにおいて、実質的に完全な表現率で、常染色体優性疾患とみなすことができる。実施例２遺伝子連鎖の解析本発明の基盤となる発見は、多嚢胞性卵巣（ＰＣＯ）が常染色体優性の遺伝的障害であり、男子発現型は男子パターン脱毛症であることである。根源的な生化学的異常は、卵巣及び副腎におけるアンドロゲン生合成の律速段階を触媒するP4 50c 17α酵素の調節作用に影響するものかもしれない。この酵素はＣＹＰ１７遺伝子によって遺伝情報を指定されるものである。ＣＹＰ１７を含むＹＡＣクロンはすでに単離されている。その存在は、制限酵素地図の作成や、エクソン２及び５からのＰＣＲ生成物の配列順序決定によって確認されている。精製ＹＡＣ・ＤＮＡはＡｌｕ・ＰＣＲの鋳型として用いられ、その生成物は、染色体10q24-25に対してヒトＣＹＰ１７遺伝子の地図を作成するために、蛍光in situハイブリッド形成によって標識された。 Weissenbachらによって作られた最近の連鎖マップを用いて、領域10q23-26を含むマーカーを使用して疾患遺伝子座を有する連鎖を確認した。これらのマーカーは、反復（ＡＣ）ｎの短いトラクト（tract）を含むＰＣＲに基づく多型遺伝子座である。各マーカーへのＰＣＲは、20ngのヒトＤＮＡ、50pmolの各プライマー、それぞれαP32-dATP/dCTP/dGTP/dTTP（Pharmacia）100μＭを含むＣＡＭＢＩＯ（登録商標）反応緩衝液、及び１単位のTaqポリメラーゼ（Cambio）を含有する全反応容積25μl中で実施した。この反応は、自動化サーモサイクラー（Perkin-Elmer/ Cetus）中で、94℃（１分間）の変性、56℃（１分間）のアニーリング、及び72 ℃（１分間）の伸長で１サイクルの35サイクルをもって実施した。最初の変性段階として94℃における10分間を採用して、最後の伸長を72 ℃で10分間行なった。このＰＣＲ生成物４μlを、続いて、６％ポリアクリルアミド配列決定用ゲル電気泳動（６ワット）にかけた。このゲルを乾燥させ、KODACK X-OMAT（登録商標）フイルムに36時間暴露させた。この操作によって、二つのマーカー、D10S198及びD10S209について、10家系からの各個人の遺伝子型の対立遺伝子の型の決定ができた。ＣＹＰ１７が染色体10q24にマッピングされるという証拠に基づいて、この領域への連鎖はすでに調査されている。常染色体優性遺伝形式、及び10中１の疾患頻度を仮定して、ＰＣＯ遺伝子座とマーカー遺伝子座との間でLINKAGE 5.2パッケージを用いて連鎖分析を実施した。候補遺伝子ＣＹＰ１７はこの間隔にマッピングされるという先験的な知識によって、ＰＣＯ遺伝子座とD10S198との間にZ=1 .38,θ=0.11の対をなすロッド・スコアが生成するということは、この遺伝子がこの領域に存在することを強く示唆する。マルチポイント分析は、D10S198近辺の位置を裏付けることになる。実施例３多型性の確認と罹病個体に対するＰＣＲによるテスト罹病個体において、プリントされた配列から−34bpのＣＹＰ１７遺伝子の５’ 転写領域内に、ＴがＣで置換された多型体が存在することが見いだされた［Pica do-Lenard & Miller,DNA6(5)439-448 (1987)］。この塩基変換は、制限酵素MspAI（NEB）に対する認識部位を生み出す。この多型を含む459bpsのＰＣＲ断片は、次のプライマーを用いて生成される。前進(Forward)CATTCGCACTCTGGAGTC(SEQ.ID.1) 逆転(Reverse)AGGCTCTTGGGGTACTTG(SEQ.ID.2) AMPLITAQ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Cambio）及びPERKIN ELMER-CETUS （登録商標）サーモサイクラーを用いてゲノムＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行なった。この増幅混合物25μlは、25nｇのゲノムＤＮＡ、50pmol eの各プライマー、各100μMのdTTP/dCTP/dGTP/dATPを含む1xCAMBIO（登録商標）反応緩衝液、及び１単位のTaｑポリメラーゼ(Cetu s)を含むものであった。この反応は、９５℃（１分間）での変性、５６℃（１分間）でのアニーリング、及び 72℃（１分間）での伸長で１サイクル、の35サイクルで行なった。最初の変性を 95℃で５分間実施して、最後の伸長を72℃で10分間行なった。緩衝液3μl（+BSＡ）を用いて、反応当たり0.2-0.5単位の酵素量を、このＰＣＲ混合物に直接加えて、最終容積を30μlとし、37℃の孵卵器中で一夜放置した。各試料に、6xゲル負荷緩衝液[Sambrook et al.,"Molecular Cloning-A Labora tory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2nd Edition)1989］を加え、その20μlを６％ポリアクリルアミド非変性ゲル(Severn Biotech)に負荷させた。次いで電気泳動によってこの断片を分離した。このゲルを続いて1xTBＥ(0 .9Ｍトリス、0.9M 硼酸、0.5M ＥＤＴＡ）中でエチジウム・ブロマイド(10mg/ ml Sigma 100μl)で30分間染色し、次いで1xTBＥ中で10分間脱色した。もし塩基変換が両方の対立遺伝子（ホモ接合体罹病個体）中に存在すれば、12 4及び335bpの断片が生成するであろう。この変異についてヘテロ接合の個体には 459,335及び124bｐの三つの断片が存在するであろう。ホモ結合非罹病個体は、4 59bpの切断されていない生成物を示すだけであろう。実施例４本変異に基づく関連性の検討各グループにおける変異の発生度は次に示すとおりである。ＰＣＯを有する継続的発端者 74％(50人中37人) ＰＣＯ家族メンバー 71％(136人中96人) 継続的正常女子 41％(17人中７人) ランダムＤＮＡサンプル 46％(117人中54人) χ²分析を用い、各グループを比較しているので、 1．継続的ＰＣＯ、対、継続的正常者：変異はＰＣＯグループと関連性を有する(p=0.03)。 2．継続的ＰＣＯ、対、ランダムＤＮＡサンプル：変異はＰＣＯグループと関連性を有する(ｐ<0.002)。 3．確実な証拠（女子ではＰＣＯの超音波スキャン、男子ではＭＰＢの写真による証拠）によって判定した全ての罹病家族メンバー、対、確実な証拠によって判定された全正常家族メンバー：罹病家族メンバー88人中66人(75％)が変異を有しており、これに対して、正常な家族メンバー48人中24人（50％）が変異を有している。変異は罹病グループと関連性を持つ(p=0.01)。これらのグループは全て白人系の、年令が揃った女子であった。結論として、この変異はＰＣＯ／ＭＰＢに対する危険要因である、といえる。実施例５遺伝子分離分析２点分析によって、５家族が1.8の正のロッド・スコアを生じ、12家族が-2.65 （すなわち、除外）の負のロッド・スコアを生じ、５家族が情報を得られないことが示された。正のロッド・スコアを生じた５家族の内で、変異分離は大部分一致している。このことは、次のことを示唆する。 (1) ＣＹＰ１７における変異はＰＣＯ／ＭＢＰと関連性を持つ。 (2) いくつかの家族にとっては、この変異が病因であるとしてよい。 (3) その他の家族にとっては、この変異は恐らく、表現型を調整する一つ、あるいは多分二つの別の遺伝子と相互関連性を有するであろう。この変異の存否とテストステロン及びアンドロステンジオン濃度との関連性に注目すれば、 (1) 男子では、この変異の存在によって、アンペアード・ｔ−テスト(unpair d t-test)によって判定して、(a) 全ての男子全体、(b) 罹病男子、及び(c) 正常男子について、アンドロゲン濃度が著しく増加する(ｐ<0.05)。 (2) ＰＣＯを有し、排卵中（正常周期）の、すなわち過インシュリン症を持たない女子では、アンドロゲン濃度が増加するが、有意とするにはこのグループは小さすぎる。そして、 (3) この家族の正常個体及びＰＣＯを有する家族の無排卵女子の両方において、この遺伝子の不存在は、高いアンドロゲンと関連性を持つ。これは、これらのグループにおけるインシュリンの作用によるものと考えられる。この場合、アンドロゲン濃度は、ＰＣＯを有し、周期が正常な、すなわち排卵中の女子よりも全て著しく高い。従って、ある家族あるいは個体では、ＰＣＯ／ＭＰＢはＣＹＰ１７の変異のみによって引き起こされ、この変異によってアンドロゲン生合成の律速段階においてアップレギュレーションを起こす。一つ又は二つの他の遺伝子がＰＣＯ／ＭＰＢに病因として関連性を持つ可能性がある。これらの他の遺伝子は、アンドロゲン合成に関与するのかも知れず、あるいはインシュリン濃度又は作用に影響するのかも知れない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年５月２６日【補正内容】請求の範囲１．多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯ）及び男子パターン脱毛症（ＭＰＢ）と関連性を有する変異体チトクロームＰ４５０ＣＹＰ１７対立遺伝子を含む単離又は組替えＤＮＡ分子。２．変異がチトクロームＰ４５０ＣＹＰ１７遺伝子のプロモーター領域において存在している、請求項１で特許請求するＤＮＡ分子。３．翻訳開始部位から−34位においてＴがＣで置換されている、請求項２で特許請求するＤＮＡ分子。４．−34位にＴ→Ｃ変異を有する変異体チトクロームＰ４５０ＣＹＰ１７対立遺伝子を含んだ、単離又は組替えＤＮＡ分子。５．自然には結合されないリポータ遺伝子に人為的に結合させた変異体チトクロームＰ４５０ＣＹＰ１７プロモーターを含んだ、単離又は組替えＤＮＡ分子。６．ベクターの形態である、請求項１ないし５のいずれか一つで特許請求する組替えＤＮＡ。７．請求項６で特許請求するベクターで形質変換又は形質導入された宿主細胞。８．形質変換動物を発生させるに適した構成体の形態にある、請求項１ないし５のいずれか一つで特許請求する組替え又は単離ＤＮＡ。９．生殖系列が、請求項８で特許請求する形質変換構成体を含む、形質変換非人間動物。 10．請求項７で特許請求する宿主細胞、又は、請求項９で特許請求する動物の、ＰＣＯ及びＭＰＢの治療又は予防に潜在的に有用な化合物のスクリーニングへの使用 11．被検者のＤＮＡにおけるチトクロームＰ４５０ＣＹＰ１７対立遺伝子の存在を検知することを包含する、遺伝子分析方法。 12．被検者のＰＣＯ及びＭＰＢに対する遺伝的素質を判定する方法である、請求項11で特許請求する方法。 13．−34位にＴ→Ｃ変異を有する非野性型チトクロームＰ４５０ＣＹＰ１７対立遺伝子に特定的にハイブリッド形成するオリゴ−又はポリ−ヌクレオチド。 14．正常チトクロームＰ４５０ＣＹＰ１７遺伝子又はプロモーターの、ＰＣＯ及びＭＰＢの治療又は予防のための遺伝子植込体の調製への使用。 15．変異体チトクロームＰ４５０ＣＹＰ１７対立遺伝子によるP450c17の生成、あるいは、そうして生成されたP450c17の活性のモジュレーターの、ＰＣＯ及びＭＰＢの治療又は予防のための薬剤の調製への使用。 16．このモジュレーターが、変異チトクロームＰ４５０ＣＹＰ１７遺伝子の全て又は一部分に対して相補的な特定のアンチセンスポリヌクレオチドを包含する、請求項15で特許請求する使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウイリアムソン，ロバートイギリス国、ダブリュ２１ピージーロンドン、ノーフォークプレース、インペリアルカレッジ、セント．マリーズホスピタルメディカルスクール (72)発明者キャレイ，アダム，ヘンリーイギリス国、ダブリュ２１ピージーロンドン、ノーフォークプレース、インペリアルカレッジ、セント．マリーズホスピタルメディカルスクール

Claims

【特許請求の範囲】１．多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯ）及び／又は男子パターン脱毛症（ＭＰＢ）と関連性を有する変異体ＣＹＰ１７対立遺伝子を含む単離又は組替えＤＮＡ分子。２．変異がＣＹＰ１７遺伝子のプロモーター領域に存在している、請求項１で特許請求するＤＮＡ分子。３．翻訳開始部位から−34位においてＴがＣで置換されている、請求項２で特許請求するＤＮＡ分子。４．−34位にＴ→Ｃ変異を有する変異体ＣＹＰ１７対立遺伝子を含んだ、単離又は組替えＤＮＡ分子。５．自然には結合されないリポータ遺伝子に人為的に結合させた変異体ＣＹＰ１７プロモーターを含んだ、単離又は組替えＤＮＡ分子。６．ベクターの形態である、請求項１ないし５のいずれか一つで特許請求する組替えＤＮＡ。７．請求項６で特許請求するベクターで形質変換又は形質導入された宿主細胞。８．形質変換動物を発生させるに適した構成体の形態にある、請求項１ないし５のいずれか一つで特許請求する組替え又は単離ＤＮＡ。９．生殖系列が、請求項８で特許請求する形質変換構成体を含む、形質変換非人間動物 10．請求項７で特許請求する宿主細胞、又は、請求項９で特許請求する動物の、ＰＣＯ及び／又はＭＰＢの治療又は予防に潜在的に有用な化合物のスクリーニングへの使用。 11．被検者のＤＮＡにおけるＣＹＰ１７対立遺伝子の存在を検知することを包含する、遺伝子分析方法。 12．被検者のＰＣＯ及び／又はＭＰＢに対する遺伝的素質を判定する方法である、請求項11で特許請求する方法。 13．−34位にＴ→Ｃ変異を有する変異体ＣＹＰ１７対立遺伝子に特定的にハイブリッド形成するオリゴ−又はポリ−ヌクレオチド。 14．正常ＣＹＰ１７遺伝子又はプロモーターの、ＰＣＯ及び／又はＭＰＢの治療又は予防のための遺伝子植込体の調製への使用。 15．変異体ＣＹＰ１７によるP450c17の生成、あるいは、そうして生成されたP 450c17の活性、のモジュレーターの、ＰＣＯ及び／又はＭＰＢの治療又は予防のための薬剤の調製への使用。 16．このモジュレーターが、変異ＣＹＰ１７遺伝子の全て又は一部分に対して相補的な特定のアンチセンスポリヌクレオチドを包含する、請求項15で特許請求する使用。