JPH09504161A - 治療関連遺伝子の発現のためのベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の目的は、癌治療をより効果的に、従ってより好都合良くすることである。この目的は、哺乳類細胞において発現のために適切である構造体に基づいて治療関連タンパク質の発現のためのベクターにより達成される。このベクターは、細胞増殖抑制剤により誘発できるmdrlプロモーター又はその定義された配列により、治療関連タンパク質をコードする遺伝子により及びたぶん、前記遺伝子の前又は後に配列されたmdrlエンハンサー要素により特徴づけられる。

Description

【発明の詳細な説明】 治療関連遺伝子の発現のためのベクター 本発明は、ベクター及び哺乳類細胞における治療的に関連した遺伝子の発現の ためへのその使用に関する。本発明の適用の分野は、医薬産業及び医薬において である。 細胞増殖抑制剤による癌患者の処理においては、耐性の徴候がしばしば起り(I gor B.Roninson，Molecular and cellular biology of mulkdrug resistance in tumor cells，Plenum Press，New York and London，1991)、そしてこれは、所 望する治療結果を達成するための障害である。この理由のために、多くの異なっ た化学療法が、細胞増殖抑制剤の適用及びそれらの投与量を変えることにより開 発されて来た。さらに、他のグループの物質、たとえばサイトキン(cytokine)、 モノクローナル抗体、等と共に細胞増殖抑制剤を組合すことによって化学療法を 高める試みが行なわれた。腫瘍化学療法をより効果的にする他の手段は、細胞増 殖抑制剤の癌細胞への輸送を達成し、そしてその細胞において有効性を達成する ために抗体−結合された細胞増殖抑制剤の使用である(H.M.Pinedo，et al.Cance r chemothorapy and biology response modifiers.Annual 12.Elsevier，Amster dam-New York-Oxford，1991)、一部の成功がいくつかの場合において達成された が、十分な臨床学的成功はそれらの方法のいづれによってもまだ達成されていな い。 本発明の目的は、癌療法をより効果的にし、そして従って、より好結果をもた らすことである。その目的は特に、適用された治療剤（細胞増殖抑制剤）と第２ の治療剤（抗−腫瘍的に効果的なタンパク質）とを組合すことであり、これは癌 細胞内でのみ形成され、そ して従って、癌細胞に対して効果を直接的に付与する。 本発明の目的は、請求の範囲第１項記載の発現ベクターの使用により達成され 、前記ベクターは従属項２〜６によりさらに十分に特徴づけられる。ベクターの 使用は、請求の範囲第７〜９項に定義される。 本発明は、mdrl遺伝子の性質を使用し、その遺伝子生成物Ｐ−糖タンパク質（ 耐多種薬物のタイプの耐性を担当する）は細胞静止剤、たとえばビンクリスチン 及びアドリアマイシンにより誘発できる。この細胞増殖抑制剤−誘発性遺伝子発 現はmdrl遺伝子の一定のプロモーター及びエンハンサー要素を通して仲介される 。驚くべきことには、それらのプロモーター及びエンハンサー要素はまた、他の 遺伝子、たとえば治療において興味の対象である遺伝子、たとえばサイトキニン 遺伝子又はモノクローナル抗体のための遺伝子を発現できることが見出された。 請求の範囲第１項記載の本発明のベクターは、身体細胞における細胞増殖抑制剤 −誘発性外来遺伝子の発現、及び従って、化学療法及び免疫治療の“現場での” 組合せを可能にする。 本発明のベクターについての基本構造体として、哺乳類細胞における発現のた めに適切である有用なすべての構造体が存在し、それによって、たとえばアデノ ウィルスベクターは別として、特にレトロウィルス発現ベクター(N2A，pM3-neo ，pM5-neo)が選択される。ベクターの構成は、患者における標的細胞への輸送を 可能にするために、それ自体知られている態様で、適切なキャリヤーシステム、 たとえば免疫リポソーム、レトロウィルス粒子、等を用いて、腫瘍特異的標的決 定と意図的に関連がある。ここで、それらは細胞中に組込まれ、そして次に、そ れらの治療効果を進めることができ、すなわちその後に開始される化学療法の結 果として、腫瘍細胞におい て、抗腫瘍物質は細胞中に及び腫瘍をとりかこむ領域中に誘発可能な要素を通し て放されるであろう。 従って、本発明によれば、化学療法は、誘発されたタンパク質の抗腫瘍効果を 伴って新規手段で組合され得る。 本発明の構造体は細胞内で機能し、化学療法によれば、外来性遺伝子の発現は プロモーター／エンハンサーを通して一定の細胞静止剤により誘発され、この外 来性遺伝子は、次に、“現場での”その抗腫瘍効果を直接的に進行せしめること ができる。この手段においては、細胞増殖抑制剤及び外来性遺伝子生成物は標的 細胞（腫瘍細胞）に対して同時に使用し、そして前記外来性遺伝子生成物は、さ らに、全身性効果を付与することができる。たとえばサイトキンに関しては、こ れは、それらが標的細胞に対するそれらの直接的な細胞毒性／細胞増殖抑制効果 の他に、生物の免疫防御に対する効果、たとえばＴリンパ球、マクロファージ、 等の活性化を示すことを包含する。それらは、腫瘍治療において支持効果を付与 する。 本発明はこの後、例により一層十分に例示されるであろう。 例１ 治療的に関連する遺伝子の細胞増殖抑制剤−誘発性発現のためのベクター CVS− SW1 の構成 ポリメラーゼ鎖反応(PCR) 高分子量ヒト DNAを、インビトロ細胞系又は腫瘍材料からそれ自体知られてい る手段で単離する。次に、請求の範囲第２ａ）〜ｄ）及び３ａ）及びｂ）項に言 及されるmdrl遺伝子のプロモーター配列、及び４で言及されたmdrl遺伝子のエン ハンサー配列を PCRにより増幅する（１分、94℃；１分、45℃；２分、72℃；30 サイクル）（Kimitoshi Kohno et al.J.Biol.Chem.265:19690-19696，1990）。 本発明の構造体の場合、mdrlプロモーター配列のPCRを実施する ためには、プライマー(５′−及び３′−mdrlプロモーター配列の17個の塩基＋ それぞれの制限エンドヌクレアーゼの塩基＋保護基TAC)が使用され、この５′端 でApa Ｉクローニングのための特定配列(GGGCCC)及びその３′端で、Sma Ｉ(CCC GGG)及び BglII(AGATCT)クローニングのための配列が位置する。 請求の範囲第４項に言及されるmdrl遺伝子のエンハンサー配列の増幅を、この 例においては、５′−SstII(CCGCCG)及びSmaＩ(CCCGGG)プライマー及び３′−Ml u Ｉ(ACGCG)プライマー(再び、５′−及び３′−mdrlエンハンサー配列の17個の 塩基＋それぞれの制限エンドヌクレアーゼの塩基＋保護基TAC)により実施する。 次に、mdrlプロモーター及びエンハンサー配列のその得られた増幅物を、Apa Ｉ／BglIIにより及び SstII／MluＩによりそれぞれ切断し、精製し、そして従っ て、ベクターN2A 中へのクローニングのために利用できる。 クローニング 9,678kb のサイズを有するレトロウィルス“二重コピー”ベクタ−N2A(Petros A.Hantzopoulos et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3519-3523，1989)をまず、 ApaＩ／BglIIにより切断し、そして請求の範囲２項ａ）〜ｄ）のmdrlプロモータ ー配列の増幅物により連結する。この中間構造体Ｉを適切な細菌中で形質転換し 、そして細菌懸濁液(OD₆₀₀＝0.4)500mlから、それ自体既知の方法でプラスミド 増幅の方法により単離する。プラスミド DNAの精製を、Csclグラジエント遠心分 離を通して良く知られた方法により行なう。得られたプラスミド DNAから、Apa Ｉ及びBglIIによる他の制限酵素切断を実施することにより、それぞれのプロモ ーターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で検出し、従って、クローニン グを試験する。 この中間構造体Ｉ(細胞増殖抑制剤−誘発性mdrlプロモーター配列を有するベ クターN2A)を、制限酵素 SstII及びMluＩにより切断し、中間構造体Ｉとmdrlエ ンハンサー配列（５′− SstII；３′MluＩ）とを連結する。次に、得られた中 間構造体IIを細菌中で形質転換し、そして500ml の細菌培養物の規模で増殖し、 そして単離する。クローニングを調節するために、Csclグラジエント精製にゆだ ねられたプラスミド DNAを SstII／MluＩにより切断する。前記切断フラグメン トのサイズを再び、アガロースゲル電気泳動により試験する。従って、細胞増殖 抑制剤−誘発性の“現場”発現のために、治療対象のものである外来性遺伝子、 たとえばサイトキン、モノクローナル抗体又は抗−腫瘍遺伝子のクローニング（ たとえば SMAＩ部位又は Sna BＩ部位で）のためのカセットベクターシステムＣ VS−SW1 を遺伝子−治療原理として提供される（図１）。 カセットベクターシステム CVS−SW1 における外来性遺伝子の誘発 カセットベクターシステム CVS−SW1 における外来性遺伝子の誘発能力を、CA T−ELISA（トランスフェクトされた真核細胞におけるクロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼの定量決定のための酵素イムノアッセイ）により、COS 細胞おける CAT遺伝子による構造体 CVS−SW1 のトランスフェクションの後、CA T遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を例として取る ことにより試験する。 治療関連遺伝子の誘発能力の試験を、RNA及びタンパク質レベルでの発現分析 により、及び外来性遺伝子生成物の性質及び機能に関連しての生物学的活性を試 験することにより実施する。 構造体のリポソーム封入及び適用 治療関連遺伝子による細胞増殖抑制剤−誘発性カセットベクターシステム(た とえば CVS−SW1)の封入、リポソームによる腫瘍特異的標的決定、及びインビト ロ細胞培養物及びインビボシステム（ヌードマウス）への導入を、NICOLAU(Clau de Nicolau.Amelia Cudd.Critical reviews in therapeutic drug carrier syst ems 6:239-271，CRC Press，Inc.，1989)及びHUG(Peter Hug.Richard G.Steight .Biochim.Biophys.Acta 1097:l-17，1991)に従って、それ自体既知の手段により 達成する。 癌患者へのそれぞれの適用を、すでに行なわれた種々の研究により誘導する（ A.Dusty Miller.Nature 357:455-460，1991;W.Calver Kenneth et al.Science 2 56:1550-1552,1992;Zvi Ram.Cancer Res.53:83-88，1993）。 パッケージング細胞系中へのトランスダクション 治療関連遺伝子による細胞増殖抑制剤−誘発性カセットベクターシステムのパ ッケージングを、パッケージング細胞系中への構造体 のトランスダクションにより達成する。この目的のために特に適切な細胞系は、 パッケージング系PA317 である。 例２ 治療関連遺伝子の細胞増殖抑制剤−誘発性発現のためのベクター CVS-SW2 の構 成 類似する態様で、但し対応して変更されたクローニング部位を伴って、次のシ リーズ：１．mdrlエンハンサー配列、２．mdrlプロモーター配列及び３．治療対 象のものである遺伝子を含んで成るカセットベクターシステム CVS−SW2 のクロ ーニングを行なう。 例３及び４ 治療関連遺伝子の細胞増殖抑制剤−誘発性発現のためのベクター CVS-SW3 及び CVS-SW4 の構成 カセットベクターシステム CVS−SW3 及び４のクローニングを、例１及び２に 記載される方法に類似する方法により、但し、対応して変更されたクローニング 部位及びベクターBluescript M13＋における前でのクローニングを伴って実施す る。請求の範囲第３ａ）及びｂ）の変異誘発されたmdrlプロモーター配列がここ で関係する。例３及び４に言及される切断部位は別として、それぞれのベクター CVS−SW3 及び CVS−SW4 中への治療的に関連する遺伝子のクローニングのため には、またBamHＩ， SpeＩ， XbaＩ， Eag Ｉ及び NotＩ部位が利用できる（図 ２）。 類似する態様で、他の真核生物発現ベクターがまた、細胞増殖抑制剤により誘 発できる外来性遺伝子発現のために利用され得る。カセットベクターシステム C VS−SW２，３及び４中への外来性遺伝子の誘発、構造体のリポソーム封入及び例 １に言及されるようなパッケージング細胞系中へのトランスダクション並びに適 用の追加の段階が存在する。

【手続補正書】 【提出日】１９９５年１１月１４日 【補正内容】 (1) 請求の範囲を別紙のとおり補正する。 (2)（イ）明細書第６頁及び第９頁を削除する。 （ロ）同第３頁第15行の後に次の文章を挿入する： 『図面の簡単な説明 図１は、mdrlプロモーター配列、治療関連遺伝子及びmdrlエンハンサー配列を 含んで成る本発明のレトロウィルスベクター CVS−SW1 を示し；そして 図２は、変異誘発されたmdrlプロモーター配列及び治療関連遺伝子を含んで成 る、それぞれ本発明のレトロウィルスベクター CVS−SW3 及びCVS −SW4 を示す 。』 (3) 図面（図１及び図２）を別紙のとおり補正する。 請求の範囲 １．哺乳類細胞における発現のために適切である構造体に基づく治療関連タン パク質の発現のためのベクターであって、細胞増殖抑制剤により誘発できるmdrl プロモーター又はその定義された配列、治療関連タンパク質をコードする遺伝子 及びたぶん、前記遺伝子の前又は後に配列されるmdrlエンハンサー要素により特 徴づけられる発現ベクター。 ２．次のmdrlプロモーター配列： ａ）配列： ｂ）配列： ｃ）配列： 又は ｄ）配列： 又はそれらの一部により特徴づけられる請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 ３．下記変異誘発されたmdrlプロモーター配列： ａ）配列：変異＋ 103Ｔ→Ｃ ｂ）配列：変異＋ 137Ｇ→Ｔ 又は 又はその一部により特徴づけられる請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 ４．次の配列： 又はその一部を含むmdrl遺伝子のエンハンサー要素により特徴づけられる請求の 範囲第１項記載の発現ベクター。 ５．サイトキン、たとえば腫瘍壊死因子α、インターフェロンα及びγ、及び インターロイキン−２及び６の遺伝子により特徴づけられる請求の範囲第１及び ４項記載の発現ベクター。 【図１】 【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/21 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 39/00 9051−4Ｃ 37/02 ＡＥＤ 39/395 9051−4Ｃ 37/66 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類細胞における発現のために適切である構造体に基づく治療関連タン パク質の発現のためのベクターであって、細胞増殖抑制剤により誘発できるmdrl プロモーター又はその定義された配列、治療関連タンパク質をコードする遺伝子 及びたぶん、前記遺伝子の前又は後に配列されるmdrlエンハンサー要素により特 徴づけられる発現ベクター。 ２．次のmdrlプロモーター配列： ａ）配列： ｂ）配列： ｃ）配列： ｄ）配列： 又はそれらの一部により特徴づけられる請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 ３．下記変異誘発されたmdrlプロモーター配列： ａ）配列：変異＋ 103Ｔ→Ｃ ｂ）配列：変異＋ 137G→Ｔ 又はその一部により特徴づけられる請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 ４．次の配列： 又はその一部を含むmdrl遺伝子のエンハンサー要素により特徴づけられる請求の 範囲第１項記載の発現ベクター。 ５．酵素、サイトキン、抗体又は抗−腫瘍遺伝子の遺伝子により特徴づけられ る請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 ６．サイトキン、たとえば腫瘍壊死因子α、インターフェロンα及びγ、及び インターロイキン−２及び６の遺伝子により特徴づけられる請求の範囲第１及び ４項記載の発現ベクター。 ７．治療剤の調製のためへの請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載の発現ベ クターの使用であって、キャリヤーシステム、好ましくは免疫リポソーム又はレ トロウィルス粒子にレトロウィルス又はアデノウィルス由来のベクターをパッケ ージングすることにより特徴づけられる使用。 ８．レトロウィルス介在遺伝子トランスファーのための両親和性レトロウィル ス粒子を調製するためへの請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載の発現ベクタ ーの使用であって、パッケージング細胞系中のトランスダクション及び組込みに より特徴づけられる使用。 ９．細胞系 PA317がパッケージング細胞系として使用されることを特徴とする 請求の範囲第８項記載の発現ベクターの使用。