JPH09503671A

JPH09503671A - 不活性化ホルモン応答エレメントを有するデオキシリボ核酸

Info

Publication number: JPH09503671A
Application number: JP7511985A
Authority: JP
Inventors: エバート，カール・エム; ディトゥリオ，ポール; チェン，セン・ヒン; ミード，ハリー・エム; スミス，アラン・エドワード
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1993-10-13
Filing date: 1994-10-11
Publication date: 1997-04-15
Also published as: CA2172271A1; WO1995010606A1; US5688677A; EP0723587A1; AU7974194A; AU7617698A

Abstract

(57)【要約】少なくとも１つの不活性化ホルモン応答エレメントと膜結合蛋白をコードしている核酸配列とからなるＤＮＡを記載する。さらに該ＤＮＡを含有する治療組成物および細胞も記載する。本発明の他の態様は、対象に悪影響を与えないレベルで機能的な嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターが対象により産生されるように嚢胞性線維症を有する対象に有効量の該ＤＮＡを投与することを包含する嚢胞性線維症を有する対象の治療方法を包含する。さらに本発明は、細胞に悪影響を与えないレベルで各結合蛋白が産生されるように該ＤＮＡを細胞中に導入する方法、およびこの方法により製造される細胞に関する。本発明のさらなる他の態様は、ホルモン応答エレメントが機能的な種におけるホルモン応答エレメントの存在または不存在に関してＤＮＡをアッセイする方法、および対象とする蛋白を産生するメスのトランスジェニック哺乳動物を選択的に育種する方法を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】不活性化ホルモン応答エレメントを有するデオキシリボ核酸関連出願本願は、１９９０年３月５日出願の米国第０７／４８８,３０７号の一部継続出願である１９９０年９月２７日出願の米国第０７／５８９,２９５号の一部継続出願である１９９０年１１月１５日出願の米国０７／６１３,５９２号の継続出願である１９９３年７月２日出願の同時係属出願米国第０８／０８７,１３２号に記載されている主題に関連する。さらに本願は、１９９２年１２月２日出願の米国第０７／９８５,４７８号の一部継続出願である「嚢胞性線維症に対する遺伝子治療」と題された１９９３年１０月１日出願の同時係属出願である米国第０８／１３０,６８２号に記載されている主題、および１９９１年１０月２日出願の米国第０７／７７０,２０４号の継続出願である１９９３年６月７日出願の同時係属出願米国第０８／０８８,４１６号に記載されている主題にも関する。上記すべての同時係属特許出願の内容を参照により本明細書に取り入れる。本願に示されていない言葉または用語の定義は同時係属出願において示されたものと同じである。源が明示されていない本願実施例において使用されるすべての試薬または材料、例えば、ΔＦ５０８ＣＦＴＲ遺伝子およびＣＦＴＲ抗体も同時係属出願において説明されたものと同じである。発明の背景嚢胞性線維症（ＣＦ）は、ヒトにおける最もありふれた致命的な遺伝子疾患である（ボート,ティー・エフ（Boat,T.F.）ら，「ザ・メタボリック・ベイシス・オブ・インヘリッテッド・ディジージズ（The Metabolic Basis of Inherited D iseases）（スクイライバー,シー・アール（Scriver,C.R.）ら編,マクグロー− ヒル（McGraw-Hill）,ニューヨーク（New York）（１９８９年））。米国において、２５００人の乳児につき約１人が該疾患を有して誕生する。現在のところ、米国には約３００００人のＣＦ患者がいる。現在の標準的な治療にもかかわらず、平均生存年数はわずか２６年である。肺の気道の疾患は罹患率の主要な原因であり、死亡率のうちの９５％の原因である。肺疾患の最初の発現は、しばしば、咳であり、その後、進行性呼吸困難である。スタフィロコッカス（Staphylococc us）のコロニー形成、次いで、シュードモナス（Pseudomonas）を伴うコロニー形成により、しつこい痰は化膿性となる。慢性気管支炎および気管支拡張症は現在の治療により部分的に治療されるが、頻繁な肺疾患の再燃により経過は中断される。疾患が進行するにつれ、患者の活力はどんどん弱まる。終期の肺疾患は、低酸素血症、肺の高血圧、および肺性心により判明する。鼻および副鼻腔洞の上部気道もＣＦにかかる。大部分のＣＦ患者は慢性副鼻腔洞炎を生じている。鼻のポリプは１５〜２０％の患者に起こり、生涯における２番目の１０年間によく見られる。ＣＦにおいては胃腸の問題も頻発する。胎便イレウスにかかるかも知れない。吸収不良の徴候を生じる外分泌性膵不全はＣＦ患者の大部分に存在する。男性はほぼ画一的に受胎を起こさせるす能力に欠け、女性にいおては受胎能力が低下している。遺伝的および分子的分析により、ＣＦ関連遺伝子が２１個の個々のｃＤＮＡクローンの部分として単離され、その蛋白産物が推定された（ケレム,ビー・エス（Kerem,B.S.）ら（１９８９年）サイエンス(Science)第２４５巻：１０７３〜１０８０頁；リオーダン,ジェイ・アール（Riodan,J.R.）ら（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０６６〜１０７３頁；ロメンス,ジェイ・エム（Rommens,J .M.）ら（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０５９〜１０６５頁）。米国第０７／４８８,３０７号には、連続した鎖の中への該遺伝子の構築、機能性蛋白としての該遺伝子の発現、およびＣＦが該遺伝子の変異によるものであるという確証が記載されている（グレゴリー,アール・ジェイ（Gregory,R.J.）ら（１９９０年）ネイチャー（Nature）第３４７巻：３８２〜３８６頁；リッチ,ディー・ピー（Rich,D.P.）ら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３５８〜３６２頁も参照）。同時係属特許出願にも、野生型であって変異バージョンでない当該ｃＤＮＡから発現される蛋白が、ＣＦの特徴であると以前示されていたｃＡＭＰにより調節される塩化物チャンネルの欠損を補ったことを示す実験が開示されている。ＣＦ関連遺伝子の蛋白産物は嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）と呼ばれている（リオーダン，ジェイ・アールら（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０６６〜１０７３頁）。ＣＦＴＲは、それぞれが６個のトランスメンブランセグメントおよび１個のヌクレオチド結合ドメインからなる２個の繰り返しエレメントから構成されている約１４８０個のアミノ酸の蛋白である。該２個の繰り返しエレメントは、複数のホスホリレーションされうる部位を含んでいる大型で極性の、いわゆるＲ−ドメインにより分けられている。その推定ドメイン構造によると、ＣＦＴＲは、多剤耐性（ＭＤＲ）またはＰ−糖蛋白、ウシ・アデニルシクラーゼ、酵母・ＳＥＴ６蛋白ならびにいくつかの細菌・アミノ酸輸送蛋白を包含する１のクラスの関連蛋白のメンバーである（リオーダン,ジェイ・アールら（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０６６〜１０７３頁；ハイド,エス・シー（Hyde,S.C.）ら（１９９０年）ネイチャー第３４６巻：３６２〜３６５頁）。この群の蛋白は、特徴的に、細胞内外へのポンピング分子に包含される。ＣＦＴＲは、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼまたはプロテインキナーゼＣによるホスホリレーションに応答した上皮細胞から外側へのアニオンの流れを調節していると仮定されている（リオーダン,ジェイ・アールら（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０６６〜１０７３頁；ウェルシュ（Welsh）１９８６年；フリゼル,アール・エイ（Frizzell,R.A.）７７８７７８ら（１９８６年）サイエンス第２３３巻：５５８〜５６０頁；ウェルシュ,エム・ジェイ（W elsh,M.J.）およびリートケ,シー・エム（Liedtke,C.M）（１９８６年）ネイチャー第３２２巻：４６７頁；リ,エム（Li,M.）ら（１９８８年）ネイチャー第３３１巻：３５８〜３６０頁；フワング,ティー−シー（Hwang,T-C.）ら（１９８９年）サイエンス第２４４巻：１３５１〜１３５３頁）。ＣＦＴＲ遺伝子の配列分析により種々の変異が明らかとなっている（カッティング,ジー・アール（Cutting,G.R.）ら（１９９０年）ネイチャー第３４６巻：３６６〜３６９頁；ディーン,エム（Dean,M.）ら（１９９０年）セル（Cell）第６１巻：８６３〜８７０頁；およびケレム,ビー−エス（Kerem,B-S.）ら（１９８９年）サイエンス第２４５巻：１０７３〜１０８０頁；ケレムビー−エスら（１９９０年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８７巻：８４４７〜８４５１頁）。集団に関する研究により、大部分の共通したＣＦ変異、すなわち、ＣＦＴＲアミノ酸配列の位置５０８におけるフェニルアラニンをコードする３個のヌクレオチドの欠失（ΔＦ５０８）が、嚢胞性線維症のうちの約７０％のケースに関連していることが示されている。この変異は、ｃＡＭＰに応答した上皮細胞の塩化物チャンネルの欠損を生じる（フリゼル,アール・エイら（１９８６年）サイエンス第２３３巻：５５８〜５６０頁；ウェルシュ,エム・ジェイ（１９８６年）サイエンス第２３２巻：１６４８〜１６５０頁；リ,エムら（１９８８年）ネイチャー第３３１巻：３５８〜３６０頁；クイントン,ピー・エム（Quinton ,P.M.）（１９８９年）クリニ・ケミ（Clin.Chem.）第３５巻；７２６〜７３０頁）。このことは、気道細胞におけるイオンおよび流体の輸送のバランスの崩壊を導く。このことは、異常な粘膜分泌を引き起こし、最終的には肺の感染および上皮細胞損傷を引き起こすと広く信じられている。ＣＦＴＲ ΔＦ５０８ならびに他のＣＦＴＲ変異種の生合成に関する研究（チェン,エス・エイチ（Cheng,S.H.）ら（１９９０年）セル第６３巻：８２７〜８３４頁；グレゴリー・アール・ジェイら（１９９１年）モレ・セル・バイオロ（ Moll.Cell Biol.）第１１巻：３８８６〜３８９３頁）および局在化に関する研究（デニング,ジー・エム（Denning,G.M.）ら（１９９２年）ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー第１１８巻：５５１〜５５９頁）により、多くのＣＦＴＲ変異蛋白は正しくプロセッシングされず、結果として、原形質膜に送達されないということが示されている（グレゴリー,アール・ジェイら（１９９１年）モレ・セル・バイオロ第１１巻：３８８６〜３８９３頁）。これらの結論は、ＣＦＴＲ ΔＦ５０８を発現している細胞におけるｃＡＭＰにより刺激されるＣｌ^-チャンネルの検出に失敗した初期の機能に関する研究と矛盾しない（リッチ,ディー・ピー（Rich,D.P.）ら(１９９０年)ネイチャー第３４７巻：３５８〜３６３頁；アンダーソン,エム・ピー（Anderson,M.P.）ら（１９９１年）サイエンス第２５１巻：６７９〜６８２頁）。現在に至るまで、ＣＦ治療の主な目的は、感染の抑制、粘膜クリアランスの促進、および栄養状態の改善であった（ボート,ティー・エフ（Boat,T.F.）ら「ザ・メタボリック・ベイシス・オブ・インヘリテッド・ディジージズ（The Metabo lic Basis of Inherited Diseases）」中（スクイライバー,シー・アール（Scri ver,C.R.）ら編,マクグロー−ヒル（McGraw-Hill）,ニューヨーク（１９８９年）））。意図的な抗生物質の使用および胸部打診を用いるポスチュラル・ドレイネージ（postural drainage）のプログラムは治療の頼みの綱である。しかしながら、疾病が進行するにつれ、頻繁な入院が必要となる。栄養投与規則は膵臓酵素および脂溶性ビタミンを包含する。時々、気管支拡張剤が使用される。コルチコステロイドが炎症の抑制に用いられているが、それらは重大な副作用を生じ、それらの有益性は不確実である。極端なケースにおいては、時々、肺移植が試みられる（マーシャル,エス（Marshall,S.）ら（１９９０年）チェスト（Chest）第９８巻：１４８８頁）。ＣＦに対する新たな治療法を開発する努力の大部分は、肺の合併症に焦点を絞ってきた。ＣＦの粘膜は、溶解した好中球由来の高濃度のＤＮＡからなるので、１のアプローチは組み換え型ヒト・ＤＮａｓｅの開発であった（シャク,エス（S hak,S.）ら（１９９０年）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８７巻：９１８８頁）。予備的な報告は、エアロゾル化した酵素が粘膜の粘度の低下に有効であるかもしれないということを示唆した。このことは、気道の障害物のクリーニングに、さらにおそらくは感染の減少に役立ちうるものであった。好中球由来の過剰なエラスターゼにより引き起こされるダメージを制限する試みにおいて、プロテアーゼ阻害剤が試験された。例えば、ヒト・血漿より精製されたα−１−アンチトリプシンがエアロゾル化され、ＣＦ患者の肺に酵素活性が送達された（マクエルバニー,エヌ（McElv any,N.）ら（１９９１年）ザ・ランセット（The Lancet）第３３７巻：３９２頁）。別のアプローチは、好中球由来のオキシダントの作用を阻害する薬剤の使用であろう。生化学的パラメーターはうまく測定されたが、これらの治療の長期間の有益な効果は確立されていない。異なる理論的根拠を用いて、他の研究者は薬理学的要因を用いてＣＦ気道において異常に低下した塩化物分泌および上昇したナトリウム吸収を逆行させようとした。気道上皮による欠損した電解質輸送は、呼吸器の分泌物および粘膜の組成を変化させると考えられている（ボート,ティー・エフ（Boat,T.F.）ら「ザ・メタボリック・ベイシス・オブ・インヘリテッド・ディジージズ（The Metabolic Basis of Inherited Diseases）」中（スクイライバー,シー・アール（Scriver, C.R.）ら編,マクグロー−ヒル（McGraw-Hill）,ニューヨーク(１９８９年)）；クイントン,ピー・エム（１９９０年）ＦＡＳＥＢＪ．第４巻：２７０９〜２７１７頁）。それゆえ、電解質輸送における異常を修正する目的の薬理学的治療は有益でありうる。薬剤アミロライドのエアロゾル化バージョンを用いる試みが進行中である。アミロライドはナトリウムチャンネルを阻害することによりナトリウム吸収を阻害する利尿剤である。初期の結果は、該薬剤は安全であり、肺機能試験により測定されたように疾病進行速度をわずかに変化させることを示すものである（クノウルズ,エム（Knowles,M.）ら（１９９０年）ニュー・エングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（N.Eng.J.Med.）第３２２巻：１１８９〜１１９４頁；アッペ,イー（Appe,E.）（１９９０年）アメリカン・レビュー・レスピレ・ディジ（Am.Rev.Respir.Dis.）第１４１巻：６０５頁）。ＡＴＰまたはＵＴＰのごときヌクレオチドは、気道上皮におけるプリン作用性受容体を刺激する。結果として、それらは、ＣＦＴＲ塩化物チャンネルとは異なる１のクラスのチャンネルを開ける。インビトロ研究は、ＡＴＰおよびＵＴＰが塩化物分泌を剌激しうることを示している（ノウルズ,エムら（１９９１年）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン第３２５巻：５３３頁）。インビボにおいて分泌を刺激するヌクレオチドの能力を試験するための予備的な試行が行われている。治療法の発達にもかかわらず、嚢胞性線維症は致命的な疾病のままであり、根本的な欠損を治す現在の治療法はない。しかしながら、２つの一般的なアプローチが実行可能であることが分かるかもしれない。これらは：１）野生型蛋白を患者に送達してその欠損している蛋白を増加させるための蛋白置換療法、および ;２）野生型のＣＦ関連遺伝子のコピーを送達するための遺伝子置換療法である。最も生命を脅かすＣＦの徴候は肺の合併症を包含するため、上部気道上皮細胞は治療のための適当な標的である。野生型ｃＤＮＡをＣＦ患者由来の上皮細胞中に導入し、塩化物イオン輸送の著しい欠損の相補を示すことにより、遺伝子治療の実行可能性が確立された（リッチ,ディー・ピーら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻３５８〜３６３頁）。発明の概要本発明は、少なくとも一部には、培養細胞におけるＣＦＴＲの過剰発現がＧ２／Ｍ境界における増殖停止を引き起こすという知見、およびオスのトランシジェニックウサギにおける選択的致死性に基づく。オスのトランスジェニックウサギの致死性はＣＦＴＲｃＤＮＡにおけるステロイドホルモン応答性エレメントの活性化の結果である。ステロイドホルモン応答エレメントは、オスのトランスジェニックウサギの胎児の発達の間に活性化される。活性化されたホルモン応答エレメントはＣＦＴＲｃＤＮＡの転写を刺激する。よって、オスのウサギの胎児の発達の間において、ある組織ではＣＦＴＲ発現が不適当に増大し、最終的に死に至る。応答エレメントの活性化は循環ステロイド、例えばアンドロゲンによる。ＣＦＴＲｃＤＮＡにおけるステロイドホルモン応答エレメントの不活性化はこの問題に対する解決策を提供する。本発明は、少なくとも１つの不活性化された、アンドロゲン応答エレメントのごときホルモン応答エレメントとイオンチャンネルのごとき膜結合蛋白をコードしている核酸配列とからなるＤＮＡに関する。本発明の１の具体例において、膜結合蛋白はＣＦＴＲであり、アンドロゲン応答エレメントは、先にそれが機能的であった少なくとも１つの種において不活性化されているＣＦＴＲコーディング領域中の配列である。本発明の他の態様は、嚢胞性線維症（ＣＦ）にかかっている細胞のごとき細胞、哺乳動物の胚、および上記ＤＮＡを有する哺乳動物を包含する。さらに本発明は、ＣＦを有する対象を治療するための治療組成物に関する。該治療組成物は、少なくとも１つの不活性化ホルモン応答エレメントとＣＦＴＲをコードしている治療上有効量の核酸配列とからなるＤＮＡおよび医薬上許容される担体を含有する。さらに本発明はＣＦを有する対象の治療方法に関する。該方法は、少なくとも１つの不活性化ホルモン応答エレメントとＣＦＴＲをコードしている核酸配列とからなるＤＮＡを用意し、次いで、対象に悪影響を及ぼさないレベルで機能的なＣＦＴＲが対象により産生されるようにＣＦを有する対象に有効量のＤＮＡを投与することを包含する。本発明のもう１つの態様は、細胞中へのＤＮＡの導入方法である。該方法は、膜結合蛋白をコードしている核酸配列からなるＤＮＡを選択し、該ＤＮＡを細胞中に導入し、細胞に悪影響を及ぼさないレベルの該膜結合蛋白を発現させることからなる。また本発明は、この方法により製造された細胞に関する。さらにもう１つの本発明の態様は、細胞に悪影響を及ぼさないレベルのＣＦＴＲを産生するＣＦにかかった細胞である。本発明のさらにもう１つの態様は、ホルモン応答エレメントが機能的である種におけるホルモン応答エレメントの存在または不存在に関してＤＮＡをアッセイする方法である。該方法は、哺乳動物の胚中にＤＮＡを導入し、哺乳動物の胚から発達したオスまたはメスの哺乳動物の死亡率に対する該ＤＮＡの影響を調べ、次いで、死亡率に対する効果とホルモン応答エレメントを有する核酸配列からなるＤＮＡの存在または不存在とを関連づけることを包含する。また本発明は、対象とする蛋白を産生するメスのトランスジェニック哺乳動物を選択的に育種する方法に関する。該方法は、少なくとも１つのアンドロゲン応答エレメントおよび対象とする蛋白をコードしている核酸配列からなるＤＮＡを哺乳動物の胚中に導入し、該胚を妊娠したメスの哺乳動物中に移植し、次いで、アンドロゲン応答エレメントの有害な効果によりメスのトランスジェニック哺乳動物が出産時に生存しておりオスのトランスジェニック哺乳動物が出産時に生存していないように移植胚に懐胎期間を経過させることを包含する。図面の簡単な説明図１は、哺乳動物特異的発現ベクターの構造を示す。略号：Ｓ,ＳａｌＩ；Ｒ, ＥｃｏＲＩ；Ｎ,ＮｏｔＩ。図２Ａ〜２Ｃは、ＢＴＳ細胞中およびウサギ・胚中への導入用のＣＦＴＲｃＤＮＡを含んでいるベクター構築物を図式的に示したものである。図３は、ＢＴＳ細胞をトランスフェクションするのに用いたプラスミドｐＣＭＶ−ＣＦＴＲ−９３６ｃの地図である。図４は、ＣＦＴＲの過剰発現に用いたＢＴＳ細胞系の図式である。図５は、ＣＦＴＲｃＤＮＡでトランスフェクションされ３３℃で１１日間増殖したＢＴＳ細胞中のＣＦＴＲＤＮＡ、ＲＮＡおよび蛋白レベルを示すグラフである。図６は、３３℃（機能的大Ｔ抗原に関する許容温度）におけるＢＴＳ−親およびＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞の増殖曲線を示すグラフである。３９℃において、ＢＴＳ−親およびＢＴＳ−ＣＦＴＲは同様の速度で増殖する。温度を３３℃にシフトすると、ＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞は増殖を続けるが、増殖速度は低い。対照的に、ＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞は、３３℃にシフトしてから５日以内に増殖を停止する。図７は、ＢＴＳ−親およびＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞由来のＤＮＡのサイトフルオログラフィック（cytofluorographic）分析を示す。ＢＴＳ−親細胞は対数増殖と矛盾しない特性を示す。対照的に、ＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞は、細胞周期のＧ２段階において細胞数が増加し、ＣＦＴＲ発現によりＧ２段階においてＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞が停止すること示唆する。図８は、ＢＴＳ−親、ＢＴＳ−ＣＦＴＲ、およびＢＴＳ−Ｇ５５１Ｄ変異株の増殖曲線を示すグラフである（Ｇ５５１Ｄ変異は、翻訳前にプロセッシングされて原形質膜に送達されるがそのＣｌ^-チャンネル活性が重大に欠損しているＣＦＴＲ変種を合成する）。ＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞とは異なり、ＢＴＳ− Ｇ５５１Ｄ細胞は許容温度において増殖を続けるが、ＢＴＳ−親細胞よりも増殖速度がわずかに小さい。図９は、３３℃で５日間目のＢＴＳ−親、ＢＴＳ−Ｇ５５１Ｄ、およびＢＴＳ −ＣＦＴＲ細胞に対するＣｌ^-インジケーター染料ＳＰＱハライド流出アッセイを用いる単一細胞ハロゲン化物アッセイの結果を示す。ＳＰＱ蛍光の変化を、ＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞（ｎ＝１１、ｎは細胞数）、ＢＴＳ−親（ｎ＝１５）、ＢＴＳ−Ｇ５５１Ｄ,クローンＢ４３（ｎ＝３０）、ＢＴＳ−Ｇ５５１Ｄ,クローンＢ９１（ｎ＝１１）およびＢＴＳ−Ｇ５５１Ｄ,クローンＡ４６（ｎ＝２８）に関して示す。０分目に浴溶液中のＣｌ^-をＮＯ₃ ^-に置換した。４分後（矢印）、２０μＭのフォルスコリンおよび１００μＭのＩＢＭＸを用いて細胞を刺激してｃＡＭＰの細胞内レベルを増加させた。データは、蛍光の平均値士標準偏差（ＳＥＭ）である（Ｆ₀，イオン置換２分前のＣｌ^-存在下において測定された平均蛍光）。野生型ＣＦＴＲの発現は、ＢＴＳ細胞においてｃＡＭＰ依存性Ｃｌ^-チャンネルを付与する。変種Ｇ５５１Ｄは、測定可能であるがそれにもかかわらず重大に欠損したＣｌ^-チャンネル活性を示す。図１０は、サザンブロット分析による陽性のトランスジェニックウサギの同定を示す。バンドＩはウサギ・β−カゼインＤＮＡであり、バンドII、IIIおよびI VはＣＦＴＲＤＮＡである。レーン６は対照ウサギであり、レーン１から５までは５匹の創始者ウサギの結果を示す。レーン７は１０コピーのＣＦＴＲＤＮＡについて得られたシグナルを示す。ベータスコープ（Betascope）６０３アナライザーを用いてコピー数を定量した。系統内の導入遺伝子のコピー数は１ないし１０の間を変動した。図１１は、モノクローナル抗体ｍＡｂ２４−１を用いるトランスジェニックウサギの乳中のＣＦＴＲの検出を示す。レーン１は、トランスジェニックウサギ＃１４からの５０μｌの乳を含み、レーン２は対照ウサギからの５０μｌの乳、そしてレーン３はＣＦＴＲトランスジェニックマウス（ディトゥリオ，ピー（DiTu llio,P.）ら（１９９２年）バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）第１０巻（１）：７４〜７７頁）からの５０μｌの乳を示す。図１２は、野生型ＣＦＴＲの発現は、メスのトランスジェニックウサギにおいて致命的でなくオスのトランスジェニックウサギにおいては致命的であるということを示すデータを示した表である。また該表は、グリコシレーションされていないＣＦＴＲ変種の発現は、メスのトランスジェニックウサギにおいて致命的でなくオスのトランスジェニックウサギにおいては致命的であるが効力は低かったことを示すデータも示す。オスのウサギにおいて観察された選択的致命性は、Ｆ１世代においても明らかであったが表現率は低かった。図１３は、Ｇ５５１Ｄ−ＣＦＴＲを有するトランスジェニックウサギの生存率を示す表である。Ｇ５５１Ｄ変異は、翻訳前にプロセッシングされて原形質膜に送達されるがそのＣｌ^-チャンネル活性が重大に欠損しているＣＦＴＲ変種の合成を引き起こす。Ｇ５５１Ｄ−ＣＦＴＲ導入遺伝子を有する創始者動物においては致命性は観察されなかった。それゆえ、トランスジェニックウサギにおいて観察されたオスの致死性は、野生型ＣＦＴＲのＣｌ^-チャンネル活性の結果である可能性が最も強い。図１４は、アンドロゲン応答エレメントに対応するヒト・ＣＦＴＲをコードしている核酸からの代表的なコンセンサス配列を示す。発明の詳細な説明本発明は、少なくとも１つの不活性化されたアンドロゲン応答エレメントのごときホルモン応答エレメントとイオンチャンネルのごとき膜結合蛋白をコードしている核酸配列とからなるＤＮＡに関する。本発明の１の具体例において、膜結合蛋白はＣＦＴＲであり、アンドロゲン応答エレメントは、それが先に機能的であった少なくとも１つの種において不活性化されているＣＦＴＲコーディング領域中の配列である。本発明の他の態様は、嚢胞性線維症（ＣＦ）にかかっている細胞のごとき細胞、哺乳動物の胚、および上記ＤＮＡを有する哺乳動物を包含する。用語「ＤＮＡ」は、当該分野で認識されている用語であり、デオキシリボヌクレオチドをいう。ＤＮＡは、１本鎖または２本鎖のゲノムまたはコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をいうものとする。ＤＮＡは、生のＤＮＡ、プラスミド、またはウイルス中に封入された形態であってよい。用語「膜結合蛋白」は、トランスメンブラン蛋白、膜周辺蛋白、および膜内在性蛋白を包含するものとする。膜結合蛋白の例は、膜ステロイドホルモン受容体のごとき受容体、ウイルス糖蛋白、および輸送体を包含する。膜結合蛋白の他の例は、イオンチャンネル、特に、ＣＦＴＲのごとき塩化物イオンチャンネルを包含する（ＣＦＴＲをコードする核酸配列を配列番号：１に示す (この配列は、グレゴリー,アール・ジェイら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３８２〜３８６頁に示された配列に対応している)）。ＣＦＴＲのアミノ酸配列を配列番号：２に示す）を包含し、ＣＦＴＲは、ＣＦにかかっている細胞に導入された場合、ＣＦ徴候を減少および／または改善し、機能的なイオンチャンネルを生じるかまたはイオン輸送を媒介する。トランスメンブラン蛋白は膜を越えて伸長している。膜周辺蛋白は、一般的には、例えば、他の膜結合蛋白との相互作用により膜の１の面または他の面に結合している。膜の中に挿入された脂肪酸鎖との結合により、または膜の中に挿入された脂肪酸鎖に結合するオリゴサッカライドへの結合により膜周辺蛋白も膜と結合しうる。膜内在性蛋白は、一般的には、膜中の脂肪酸鎖に結合しているトランスメンブラン蛋白である。用語「膜」は、細胞において通常見いだされる、通常には膜結合蛋白が結合している脂質膜を包含する。例えば、ＣＦＴＲは、通常には、細胞の原形質膜中に存在する。しかしながら、本発明の他の膜結合蛋白は、通常、小胞体膜、ゴルジ体、または別の細胞オルガネラを封入している膜に結合している。用語「ホルモン応答エレメント」は当該分野において認識されており、不活性化の前に、少なくとも１つの種においてホルモン活性化に応答して遺伝子の転写を調節するＤＮＡ領域を包含するものとする。典型的には、ホルモン応答エレメントは長さ約１０ないし約４０ヌクレオチドであり、より典型的には長さ約１３ないし２０ヌクレオチドであって、ステロイドホルモンのごとき特別なホルモンがその細胞内受容体に結合して受容体のコンホーメーション変化を引き起こし、その変化によりホルモン応答エレメントに対する受容体の親和性が増大し、ホルモン受容体エレメントへの結合が可能になる場合に活性化されうる。次いで、ホルモン応答エレメントへの受容体結合は、種々の遺伝子の転写を刺激する（あるいは、いくつかの場合には抑制する）。ステロイドホルモン受容体が細胞の原形質膜上に存在しうることも知られている。本発明のホルモン応答エレメントは、ステロイドホルモン、特に、テストステロンおよびアンドロステロンのごときアンドロゲンにより活性化されうる。これとは別に、ホルモン応答エレメントは、グルココルチコイドまたはエストロゲンの代謝産物によっても活性化されうる。ホルモン応答エレメントのコンセンサス配列はＣＦＴＲをコードしているＤＮＡに存在し、ヌクレオチド２９８８から３００２まで（配列番号：３）（シー（See）ら（１９９２年モレ・エンドクリノロ（Mol.End ocrinol.）第６巻：２２２９〜２２３５頁）、ヌクレオチド３６５から３９９まで（配列番号：４）（クレセンス,エフ（Claessens,F.）ら（１９９０年）モレ・セル・エンドクリノロ(Mol.Cell Endocrinol.)第７４巻：２０３〜２１２頁）、ヌクレオチド２３３１から２３４４まで（配列番号：５）、ヌクレオチド２９１１から２９２６まで（配列番号：６）、ヌクレオチド３９９７から４０１４まで（配列番号：７）を包含する。本発明ホルモン応答エレメント、特に、オスまたはメスに特異的なホルモンにより活性化されるホルモン応答エレメントをオスまたはメスに特異的な蛋白をコードしている核酸配列に作動可能に結合して、反対の性の生殖器官におけるオスまたはメスに特異的な蛋白の発現の効果を研究することができる。例えば、アンドロゲン応答エレメントをウテログロビン（卵巣のごときメスの生殖組織において発現される蛋白）をコードしている遺伝子に作動可能に結合することができる。かかる構築物を哺乳動物の胚中に導入し、妊娠しているメス中に胚を再移植することができる。次いで、かかる胚から発達したオスのトランスジェニック哺乳動物の雄性生殖器官に対する効果を研究することができる。用語「不活性化」は、少なくとも１つの種においては機能的であるホルモン応答エレメントを機能的でなくすることを包含するものとする。例えば、ホルモン応答エレメントのヌクレオチド配列の変更、ヌクレオチド付加、欠失、または置換によりホルモン応答エレメントの不活性化を起こすことができる。しかしながら、ホルモン応答エレメントが膜結合蛋白のコーディング配列中に存在する場合には、ホルモン応答エレメントの不活性化は膜結合蛋白の通常の局在化および機能を有意に妨害してはならない。ホルモン応答エレメントのヌクレオチド配列の変更による不活性化は、膜結合蛋白のアミノ酸配列における対応アミノ酸の変化を引き起こし得るが、必ずしも引き起こすのではない。ヌクレオチド配列の変更が変化したアミノ酸配列を生じるる場合、そのアミノ酸変化は膜結合蛋白の通常の局在化および機能を有意に妨害してはならない。オリゴヌクレオチドによる突然変異によるヌクレオチド欠失、付加、または置換によるホルモン応答エレメントの変更方法は当業者によく知られており、当業者により通常に使用されている。サムブルック,ジェイ（Sambrook,J.）ら,モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Lab oratory Press）１９８９年。用語「嚢胞性線維症にかかっている細胞」は、自然界に存在している場合、正常または変異形態のＣＦＴＲを有する嚢胞性線維症（ＣＦ）に関連した細胞；自然界に存在している場合、正常または変異形態のＣＦＴＲを有していないが嚢胞性線維症に関連することによりその正常な機能が損傷を受けている細胞；または自然界に存在している場合、正常または変異形態のＣＦＴＲを有していないが、正常または変異形態のＣＦＴＲを発現するように操作された細胞を包含するものとする。自然界に存在している場合、ＣＦＴＲを有している細胞の例は、ＣＦに冒されている者の鼻および肺上皮のごとき気道上皮細胞を包含する。通常は変種ＣＦＴＲを含まないが変種ＣＦＴＲを発現するように操作されうる細胞の例は、ＢＴＳ細胞、一細胞の哺乳動物胚、３Ｔ３線維芽細胞、Ｃ１２７、およびＣＯＳ −７細胞を包含する。ＣＦＴＲΔ５０８のごとき変種ＣＦＴＲの発現をコードし指令する核酸でこれらの細胞をトランスフェクションすることができる。例えば、１９９２年８月２６日出願のＵＳＳＮ９３５,６０３の実施例１５参照。嚢胞性線維症にかかった細胞中にＤＮＡを導入する本発明方法を用いて、嚢胞性線維症にかかっていると見なされていない細胞中にＤＮＡを移行させることもできるということが理解されるべきである。細胞は、本発明ＤＮＡの導入による所望の効果を提供するいかなる細胞であってもよい。用語「胚」は、少なくとも１個の細胞からなる受精した胚を包含するものとする。用語「哺乳動物」は当該分野において認識されており、マンマリア（Mammal ia）のクラスの動物を包含するものとする。哺乳動物の例は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ラット、およびマウスを包含する。さらに本発明は、嚢胞性線維症を有する対象を治療するための治療組成物に関する。該治療組成物は、少なくとも１つの不活性化ホルモン応答エレメントと嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターとをコードする核酸配列および医薬上許容される担体からなる。用語「対象」は、ＣＦ感受性生物、例えば哺乳動物を包含するものとする。対象の例は、ヒト、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、ラットおよびマウスを包含する。さらに用語「対象」はトランスジェニック種を包含する。嚢胞性線維症（ＣＦ）はよく知られた病状である（例えば、ボート,ティー（B oat,T.）ら,「ザ・メタボリック・ベイシス・オブ・インヘリテッド・ディジーズ（The Metabolic Basis of Inherited Disease）」（シー・スクライバー(C.S criver)、エイ・ボーデ（A.Beaudet）、ダブリュ・スライ（W.Sly）およびディー・バレ(D.Valle)編、マクグロウ・ヒル,ニューヨーク(McGraw Hill,New York) ,１９８９年）中,２６４９〜２８６０頁,システィック・フィブロシス（Cystic fibrosis）参照）。ＣＦは、幼児、小児、青少年、および高齢でない成人の病気であり、外分泌腺、特にそれらの分泌粘膜にかかわっている。ＣＦ関連徴候は多種多様であり、例えば、膵不全、慢性肺疾患、異常に高い汗の電解質レベル、およびいくつかの場合には肝硬変を包含する。用語「治療上有効量」は、対象の徴候を有意に減少または除去するのに十分または必要な量を包含するものとする。治療すべき徴候のタイプおよび重さ、対象の体重および／または年齢、対象が以前受けていた薬物、および選択したＤＮＡ投与経路のごとき因子に基づいて該量を決定することができる。適当な「有効量」の決定は当業者の範囲内である。用語「医薬上許容される担体」は、該ＤＮＡと同時投与でき、ＤＮＡにその意図された機能を発揮させる、例えば、対象に悪影響を及ぼさないレベルのＣＦＴＲのごとき膜結合蛋白を発現させる物質を包含するものとする。かかる担体の例は、溶媒、分散媒、遅延剤（delay agents）等を包含する。医薬上活性のある物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は当該分野においてよく知られている。ＤＮＡに適合するいかなる慣用的な媒体および薬剤であっても本発明に関して使用することができる。本発明ＤＮＡを単独で投与することができ、あるいは医薬上許容される担体中に入れて投与することができる。さらに本発明は、少なくとも１つの不活性化ホルモン応答エレメント嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターとをコードする核酸配列からなるＤＮＡを用意し、次いで、効量の該ＤＮＡ嚢胞性線維症を有する対象に投与することによる、嚢胞性線維症を有する対象の治療方法に関する。嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターが対象に悪影響を及ぼさないレベルで対象により産生されるように該ＤＮＡを投与する。意図された機能を発揮させる、例えば、対象に悪影響を及ぼさないレベルでのＣＦＴＲのごとき膜結合蛋白を発現させる投与経路を通じて対象に本発明ＤＮＡを投与することができる。使用可能な投与経路の例は、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内等）、腸内、経皮、および直腸を包含する。ＣＦ治療に特に有用な投与経路は、呼吸器系を通じて行うもの、例えば、鼻、気管支もしくは肺内へのＤＮＡ滴下、あるいはエアロゾル化したＤＮＡ含有溶液の吸入による。投与経路によっては、ＤＮＡに悪影響を及ぼす天然の条件からＤＮＡを守るための物質でＤＮＡを被覆あるいはこれにＤＮＡを含有させて、その意図された機能を発揮させることができる。ＤＮＡの投与を単位用量ごとに、しかもＣＦ関連徴候を有意に減少または除去する効果のある時間間隔をおいて行う。例えば、数回に分けた用量を毎日投与してもよく、あるいは治療状況の切迫により指示される場合には比例して用量を減じてもよい。用語「産生」は、対象細胞におけるＣＦＴＲの発現を包含するものとする。用語「対象に悪影響を及ぼさないレベル」は、対象の正常な身体機能を有意には妨害しないＣＦＴＲ量を包含するものとする。好ましくは、嚢胞性線維症を有する対象に対して有益なレベル、例えば、ＣＦ関連徴候を減少させるレベルでＣＦＴＲが産生される。さらに本発明は、細胞中へのＤＮＡの導入方法に関する。該方法は、膜結合蛋白をコードする核酸配列からなるＤＮＡを選択し、該ＤＮＡを細胞中に導入し、次いで、細胞に悪影響を及ぼさないレベルで該膜結合蛋白を産生させることを包含する。１の具体例において、膜結合蛋白はＣＦＴＲであり、細胞はＣＦにかかっている細胞である。用語「導入」は、細胞中へのＤＮＡの挿入を包含するものとする。ＤＮＡを細胞中に導入するいくつかの方法はよく知られており、当業者により通常に行われている。細胞中へＤＮＡを挿入するよく知られた方法の例は、リン酸カルシウムによるＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞中へのマイクロインジェクション、例えば、トランスジェニック哺乳動物を得るための哺乳動物胚へのマイクロインジェクション、およびウイルスによる細胞へのＤＮＡ送達、例えば、レトロウイルスベクターもしくはアデノウイルスに基づくベクターを用いる送達を包含する。例えば、１９９２年１２月２日出願の米国第０７／９８５,４７８号参照。用語「細胞に対して悪影響を及ぼさないレベル」は、細胞の正常な機能を有意には妨害しないＣＦＴＲ量を包含するものとする。正常な細胞機能の妨害は、例えば、細胞に毒性のある様式で正常な細胞プロセスの速度または数を減少または増加させるレベルの膜結合蛋白の産生を包含する。例えば、イオンチャンネルが過剰発現されうる場合、正常な細胞内イオン勾配が壊され、チャンネル特異的な異常なイオンの流入または流出が起こる。カルシウムまたは塩素のごときイオンの異常な流入は細胞に対して毒性でありうる。本発明のもう１つの態様は、ホルモン応答エレメントが機能的である種におけるホルモン応答エレメントの存在または不存在に関してＤＮＡをアッセイする方法である。該方法は、哺乳動物胚中へＤＮＡを導入し、哺乳動物胚から発達したオスまたはメスの哺乳動物の死亡率に対するＤＮＡの影響を調べ、次いで、ホルモン応答エレメントを有する核酸配列からなるＤＮＡの存在または不存在と死亡率への影響とを関係づけることを包含する。用語「哺乳動物胚から発達したオスまたはメスの哺乳動物の死亡率に対するＤＮＡの影響を調べる」は、遺伝子操作された哺乳動物胚から発達したオスもしくはメスのトランスジェニック哺乳動物、あるいはオスもしくはメス両方のトランスジェニック哺乳動物が生きて生まれるか死んで生まれるかを確認することを包含する。哺乳動物が生きて生まれても生後間もなく死亡する場合、本発明目的のために誕生時に死亡しているものと見なす。用語「ホルモン応答エレメントを有する核酸配列からなるＤＮＡの存在または不存在と死亡率への影響とを関係づける」は、メスまたはオスにおいて主として存在するホルモンにより活性化（または抑制）されるＤＮＡ中のホルモン応答エレメントの存在と胚から発達した一方の性の哺乳動物の死亡とを関係づけること、オスおよびメス両方において存在するホルモンにより活性化（または抑制）されるホルモン応答エレメントの存在と両方の性の死亡とを関係づけること、あるいは、ＤＮＡ中のホルモン応答エレメントの存在と両方の性の生存率とを関係づけることを包含する。本発明のさらにもう１つの態様は、対象とする蛋白を産生するメスのトランスジェニック哺乳動物を選択的に育種する方法である。該方法は、少なくとも１つのアンドロゲン応答エレメントおよび対象蛋白をコードしている核酸配列からなるＤＮＡを哺乳動物胚中に導入し、その胚を妊娠したメスの哺乳動物中に移植し、次いで、アンドロゲン応答エレメントの悪影響によりメスのトランスジェニック哺乳動物が誕生時に生きておりオスのトランスジェニック哺乳動物が誕生時に生きていないように移植された胚に懐胎期間を経過させることを包含する。用語「トランスジェニック哺乳動物」は、外来ＤＮＡセグメントが導入されるように、細胞、例えば生殖系細胞または体細胞が遺伝子操作されている哺乳動物を包含する。トランスジェニック細胞の例は、トランスジェニックウシ、ヒツジ、ヤギ（エバート,ケイ（Ebert,K.）ら，（１９９１年）バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）第９巻：８３５頁）、ブタ、ウサギ、ラット、およびマウス（ディトゥリオ,ピー（DiTullio,P.）ら（１９９２年）バイオ／テクノロジー第１０巻：７４頁；ゴードン,ケイ（Gordon,K.）ら,（１９８７年）バイオ／テクノロジー第５巻：１１８３頁）を包含する。用語「対象とする蛋白」は、人が研究または商業的生産を所望する蛋白を包含するものとする。トランスジェニック哺乳動物により、好ましくはメスのトランスジェニック哺乳動物の乳中に対象とする蛋白を産生させることができる。対象とする蛋白の例は、人の医薬品を包含する。かかる医薬品の例は、インスリン、長期作用性組織型プラスミノゲンアクチベーター、抗スロンビンIII、α−１− 抗トリプシン、可溶性ＣＤ４、インターロイキン−２、免疫グロブリン、ＣＦＴＲ、および凝血因子VIIIならびにIXを包含する。用語「アンドロゲン応答エレメントの悪影響」は、アンドロゲンにより媒介されるオス特異的毒性を包含するものとする。例えば、オス特異的ホルモンが遺伝子の過剰発現または寡少発現を媒介するようにするためだけに、導入されたＤＮＡが、オス特異的ホルモンによって活性化される転写エンハンサー型のエレメントを含んでいてもよい。さらに本発明を以下の実施例により説明するが、実施例はさらなる限定を行うものではない。本願全体において引用されたすべての参考文献（文献、付与された特許、公開された特許出願、および同時係属特許出願）の内容を、参照により本願に取り入れる。実施例実施例１：ＤＮＡ構築物の生成グリコシレーションされたＣＦＴＲを含む構築物の生成乳中にＣＦＴＲを分泌することのできるトランスジェニックウサギを得るために用いる１７.８ｋｂのＤＮＡ構築物を図１に示す。該構築物は、内部潜在性細菌プロモーターを不活性化するために（該プロモーターは不活性化されないとｃＤＮＡを不安定にする（チェン，エス・エイチ（Cheng,S.H.）ら（１９９１年）セル（Cell）第６６巻：１０２７〜１０３６頁））、残基９３６における点突然変異を有するＣＦＴＲｃＤＮＡの全長にわたるコピーをヤギ・β−カゼイン遺伝子のエキソン２とエキソン７との間に挿入したものである。該β−カゼイン遺伝子は、所望遺伝子、例えば、ＣＦＴＲまたは他の膜結合蛋白を乳腺中に発現させる乳腺特異的プロモーターを含んでいる。代用できる他の乳特異的プロモーターは、α−カゼイン、小麦酸性蛋白、およびβ−ラクトグロブリンのプロモーターのごときよく知られたプロモーターを包含する。最も好ましい構築物は、当該分野において説明されているような遺伝子に典型的に結合した１つまたはそれ以上のエンハンサーエレメントを含むであろう。次いで、慣用的な組み換え法を用いてかかるプロモーター／エンハンサーを対象とする膜結合蛋白のコーディング配列と結合させる。かかるコーディング配列はｃＤＮＡ、部分的もしくは全体的なゲノムＤＮＡのいずれであってもよいが、より好ましくは、トランスジェニック系におけるより高い発現レベルが示されている後者の２種のカテゴリーである。より詳細には、ｐＭＴ−ＣＦＴＲ（チェン,エス・エイチら,（１９９０年）サイエンス第２５３巻：２０２〜２０５頁）由来の４.５ｋｂのＳａｌＩ−ＳａｌＩフラグメントをＣＡＳ１４４１のＸｈｏ部位中に組み込む。初期の研究によりヤギ・カゼイン遺伝子が特徴づけられ、それが組織特異的様式でトランスジェニックマウスおよびヤギの両方の乳における多くの遺伝子産物の合成を指令していることが示された（デンマン,ジェイ（Denma n,J.）ら（１９９１年）バイオ／テクノロジー第９巻：８３５〜８３８頁；エバート,ケイ・エム（Ebert,K.M.）ら（１９９１年）バイオ／テクノロジー第９巻８３９〜８４３頁）。欠失部分はエキソン２のＴａｑＩ部位からエキソン７のＰｐｕＭＩ部位まで伸長している。図２に関して説明すると、マニアティス,ティーら,モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス,ニューヨーク,１９８２年）により記載されたようにして、サーネンヤギ（Saanen goat）のＤＮＡをＭｂｏＩで部分消化することにより得られたＤＮＡフラグメントをＥＭＢＬ３ファージ中に組み込むことにより、ヤギ・ゲノムＤＮＡライブラリーを構築した。マニアティス,ティーら,モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス,ニューヨーク,１９８２年）により記載されたようにして、１.２ｘ１０⁶個の組み換え型ファージからなる該ライブラリーを、マウス・ベータカゼイン全ｃＤＮＡをコードしている１.５ｋのＨｉｎｄIII／ＴｔｈIII １ＤＮＡフラグメントを用いてスクリーニングした。３−７、３−８、および３ −１１と命名された３つのプラークが、高い緊縮性条件下において最強のハイブリダイゼーションシグナルを示し、それぞれを３ラウンドのプラーク精製に供した。制限酵素分析およびサザンブロッティング分析により、組み換え型ファージ３−７および３−８中の挿入物はファージ３−１１に含まれる１８.５ｋｂの挿入物のサブフラグメントであることが明らかになった。それゆえ、乳腺特異的発現ベクターの構築に用いたすべてのＤＮＡフラグメントは、図２Ａに示すクローン３−１１由来であったことになる。修飾ポリリンカーを用いてすべてのサブクローンをｐＵＣまたはｐＵＣ誘導体中に構築した。乳腺特異的発現ベクターを構築するために、ヤギ・ベータカゼイン遺伝子のＳａｌＩ部位からエキソン２に至る全上流（５'部分）領域およびエキソン７からＳａｌＩ部位に至る全下流（３'領域）領域を用いて乳腺への発現を指令した。β−カゼイン遺伝子の５'末端を処理加工するために、クローンＢｃ１０６のエキソン２のＴａｑＩ部位をＢａｍＨＩ制限ウイルスと置き換えてプラスミドＢｃ１５０（図２Ａ）を得た。サブクローンＢｃ１０４、Ｂｃ１４７、およびＢｃ１０３を順次付加することによりヤギ・β−カゼイン遺伝子の利用可能な５'領域全体を構築した（図２Ａ）。制限酵素による分析によりサブクローンＢｃ１４７の方向を確認した。Ｂｃ１１３と命名された最終ベクターは５'末端にＳａｌＩ部位および３'末端にＢａｍＨＩ部位を有する。次いで、下流のＢａｍＨＩ部位をＸｈｏＩ部位に交換してＢｃ１１４を得た。ヤギ・β−カゼイン遺伝子の３'末端を、５'末端と同様の方法で構築した。１ .８ｋｂのＢｃ１０８クローン（図２Ａ）をＰｐｕＭＩで消化してＢａｍＨＩリンカーを付加した。処理加工されたクローンＢｃ１０８から得たＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを、ヤギ・β−カゼイン遺伝子の末端の３'フランキング領域（flanking region）を有するベクターＢｃ１０９中に結合させた。Ｂｃ１０８由来の４.４ｋｂのＨｉｎｄIIIフラグメントを付加することにより３'末端全体を完成し、これを修飾Ｂｃ１０９ベクター中に組み込んで方向に関してスクリーニングした。その新たなベクターはＢｃ１１８と命名され、それはＥＭＢＬクローン３−１１のエキソン７からポリＡシグナルを経て５ｋｂ下流のＳａｌＩ部位までのβ−カゼインの３'領域全体を含んでいた。次いで、Ｂｃ１１８の５' 側のＢａｍＨＩ部位においてＸｈｏＩ部位を導入し、Ｂｃ１１８の３'側のＳａｌＩ部位においてＮｏｔＩ部位を導入してベクターＢｃ１１２を得た。ベータカゼインＣＦＴＲベクター（Ｂｃ８）を構築するために従った全クローニング工程を図２Ｂおよび２Ｃに示す。利用可能なすべての上流および下流配列を含んでいるヤギ・β−カゼインベクターを構築するために、唯一のＳａｃII部位を有する１.７ｋｂのＸｈｏＩからＳａｌＩまでのスタッファーフラグメント（stuffer fragment）をＢｃ１１４およびＢｃ１２２のＸｈｏＩ中に組み込んで、ベクターＢｃ１４３およびＢｃ１１４をそれぞれ得た。Ｂｃ１４３由来のＳａｌＩからＳａｃIIまでのフラグメントをＢｃ１１４のＳａｌＩからＳａｃII までのカット中に組み込むことにより完全なベクターを作ってプラスミドＢｃ６を得た。ＢａｍＨＩ消化によりスタッファーフラグメントをプラスミドから除去し、唯一のＸｈｏＩ部位を挿入してベクターＢｃ１４５を得た。５'および３'β −カゼイン配列を含んでいるＢｃ１４５由来のＳａｌＩからＮｏｔＩまでのフラグメントをコスミドクローンＣＡＳ１４３８中にサブクローン化してコスミドＣＡＳ１４４１を得た。ＣＡＳ１４３８は、処理加工されたＳａｌＩならびにＮｏｔＩ部位およびウシ・α−カゼイン遺伝子由来の２１ｋｂの５'フランキング配列を含むｐＨＣ７９中に構築されたコスミドベクターである（ミード,エイチ（M eade,H.）ら,バイオテクノロジー（Biotechnology）第８巻：４４３〜４４５頁（１９９０年））。ＣＡＳ１４４１をＸｈｏＩで消化し、ｐＭＴ−ＣＦＴＲ由来の４.５ｋｂのＳａｌＩフラグメントに結合することにより発現ベクターＢｃ８が構築された（グレゴリー,アール・ジェイ（Gregory,R.J.）ら（１９９１年）モレ・セル・バイオロ（Mol.Cell Biol.）第１１巻：３８８６〜３８９３頁；グレゴリー,アール・ジェイら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３８２〜３８６頁）。制限酵素分析によりＣＦＴＲｃＤＮＡの方向を確認した。マイクロインジェクション用のフラグメントを得るために、ベクターＢｃ８をＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化して、精製用にベクターのベータカゼインＣＦＴＲ部分を遊離させた。最終マイクロインジェクションフラグメントは、４.２ｋｂの５'フランキング配列、エキソン１、イントロン１、エキソン２の一部、４.５ｋｂのＣＦＴＲｃＤＮＡ、エキソン７の一部、イントロン７、エキソン８、イントロン８、エキソン９、および５.３ｋｂの３'フランキング配列を含んでいた。グリコシレーションされておらず機能的でない変種ＣＦＴＲを含んでいる構築物の生成グリコシレーションされておらず機能的でない変種ＣＦＴＲを製造するための乳腺発現ベクターを構築するために、β−カゼインクローニングベクターを修飾し、より小型のコスミドベクター中に組み込んでマイクロインジェクションフラグメントの単離を容易にした。ＣＡＳ１４４１の５'ＳａｌＩ部位をＮｏｔＩ部位に変換してベクターＣＡＳ１４５７を得た。ベクターＣＡＳ１４５７をＮｏｔＩで消化して３'フランキング領域を有するヤギ・β−カゼインプロモーターを単離し、これをコスミドスーパーコス（Supercos）（カリフォルニア州ラジョラ（LaJolla）のストラタジーン（Stratagene）社製）中に組み込んだ。その新たなβ−カゼインクローニングベクターをＢｃ１５７と命名した。Ｂｃ１５７をＸｈｏＩで消化し、ｐＭＴ−Ｎ８９４由来のＳａｌＩフラグメント９００ＱをＸｈｏＩ部位中に組み込んだ。制限酵素分析およびＤＮＡシークエンスによりｃＤＮＡの方向をチェックした。この新たな乳腺発現ベクターを、トランスジェニックウサギの乳へのグリコシレーションされていないＣＦＴＲ変種の直接発現に用い、この新たな乳腺発現ベクターをＢｃ３６と命名した。Ｂｃ３６ベクターをＮｏｔＩで消化してすべての細菌配列を除去し、フラクションをマイクロインジェクション用に調製した。機能的でないＣＦＴＲ変種をプラスミドｐＭＴ−Ｇ５５１ＤからＳａｌＩフラグメントとして単離し、Ｂｃ１５７のＸｈｏＩ部位中に組み込んだ。その新たな発現ベクターをＢｃ５９と命名し、制限酵素分析により方向をチェックした。ＮｏｔＩ消化によりβ−カゼインＣＦＴＲトランスジーンをＢｃ５９から切り出し、マイクロインジェクション用に調製した。実施例２：発現系第１の発現系：ＢＴＳ細胞ＣＦＴＲ発現の効果を研究するために用いた第１の発現系はＢＴＳ（ＳＶ４０大Ｔ抗原遺伝子のｔｓ５８アリールでトランスフェクションされたＢＣＳ−４０サル・細胞）細胞系（ササキ,アール（Sasaki,R.）およびイクラ・ケイ（Ikura, K.）ら編,「アニマル・セル・カルチャー・アンド・プロダクション・オブ・バイオロジカルズ（Animal Cell Culture and Production of Biologicals）」（クルワー・アカデミック・パブリッシャーズ（Kluwer Academic Publishers）１９９１年）２５１〜２５８頁）であった。ＣＦＴＲｃＤＮＡ、ｎｅｏ遺伝子、およびＳＶ４０複製開始点を含むプラスミド（図３に示すｐＣＭＶ−ＣＦＴＲ−９３６ｃ、ｐＲｃ／ＣＭＶの地図参照（より詳細なｐＣＭＶ９３６ｃの構造に関してはインビトロジェン・コーポレイション（Invitrogen Corporation）の１９９２年のカタログ参照））を用いて温度感受性ＳＶ４０大Ｔ抗原を発現するサル・腎臓細胞系を３９℃において安定にトランスフェクションした。安定な細胞系をＧ−４１８選択により単離し、非許容温度（３９℃）においてエクスパンドした（図４、段階Ｉ）。細胞系を機能的な大Ｔ抗原に関する許容温度（３３℃）にシフトダウンした。これを図４の段階IIとして示す。許容条件下において、組み込まれたＤＮＡ複製物を染色体から切り出し、高コピー数（細胞１個あたり１０００コピーまで）になるまで増幅した。培養中の大部分の細胞が増幅を受けた（「アニマル・セル・カルチャー・アンド・プロダクション・オブ・バイオロジカルズ」（クルワー・アカデミック・パブリッシャーズ）中、セディビー,ジェイ・エム（Sedivy,J.M.）,２５１〜２５８頁）。ＢＴＳ細胞を３３℃で１１日間増殖させた。蛋白溶解物、全ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡ試料を毎日単離した。約１０ μｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ナイロン膜に移し、次いで、１.４ｋｂのランダムにプライムされたｐＭＴ−ＣＦＴＲフラグメントとハイブリダイゼーションさせた。グアニジニウム法により全ＲＮＡを単離し、１％アガロース／１０％ホルムアミドゲルにより電気泳動を行い、ナイロン膜に移し、次いで、ｐＭＴ−ＣＦＴＲ由来の１.４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとハイブリダイゼーションさせた。ホスホイメージャー（phosphoimager）を用いてＤＮＡおよびＲＮＡを定量した。蛋白溶解物（２０μｇ）を４〜１５％のディアッキゲル（Diacchi gel）による電気泳動に供し、インモビロン（immobilon）に移し、次いで、ＥＣＬ検出法を用いて抗ＣＦＴＲ（２４−１）抗体とともにイムノブロッティングした。図５に示すように、許容温度へのシフトから３日以内に組み込まれたｃＤＮＡ（ＣＦＴＲ発現遺伝子）が１００コピーにまで増幅される。これに伴いＣＦＴＲＲＮＡおよび蛋白レベルは１００倍に増加した。ＣＦＴＲ発現は５日目までに最大濃度に達した。ＣＦＴＲ蛋白の誘導は一時的であり、７日目と８日目の間に劇的に減少した。この発現特性は、ＢＴＳ系において発現される他の蛋白には見られないものであった。ＤＮＡおよびＣＦＴＲ発現は３３℃でのインキュベーション後、時間とともに減少した。しかしながら、ＤＮＡコピー数およびＲＮＡ濃度の減少はより遅くに起こり、観察されたＣＦＴＲの減少よりは減少しなかった。これらの結果は、ＣＦＴＲ発現はＢＴＳ細胞において不安定であり、ダウン−レギュレーション（down-regulation）の主な点は蛋白発現レベルにおけるものであることを示唆する。図６は、ＢＴＳ−親およびＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞に関する３３℃における増殖曲線を示すグラフである。６０ｍｍのディッシュに細胞を２ｘ１０⁵の密度でプレーティングした。トリプシンを用いて細胞を収穫し、ヘモサイトメーター（he mocytometer）を用いて計数した。レプリカしたプレートからの３系において計数を行った。図６に示すデータは平均値±標準偏差を表す。ＢＴＳ−親およびＢＴＳ−ＣＦＴＲは３９℃においては同様に増殖する。３３℃にシフトさせるとＢＴＳ−親細胞は速度は低下するものの増殖を続ける。対照的に、ＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞の増殖は３３℃へのシフト後５日以内に停止する。細胞増殖特性の試験により、細胞の増殖停止における高いＣＦＴＲ発現との相関関係が明らかとなった。図７は、ＣＦＴＲ発現細胞のサイトフルオログラフ分析（cytofluorographic analysis）を示す。ＢＴＳ−親およびＣＦＴＲ系を３３℃で５日間増殖させ、ＥＤＴＡ存在下において収穫し、エタノールで固定した。７−ＡＡＤを用いてＤＮＡを染色し、ＤＮＡ含量をサイトフルオログラフィーにより分析した。ＢＴＳ− 親細胞は、対数期の増殖と矛盾しない特性を示した。対照的に、細胞周期のＧ２段階におけるＢＴＳ−ＣＦＴＲ細胞数の増加があり、ＣＦＴＲ発現によりＧ２においてＢＴＳ−ＣＦＴＲが停止することを示唆した。しかしながら、ＣＦＴＲのＧ５５１Ｄ変種形態は３３℃において増殖停止しなかった。ＣＦＴＲのＧ５５１Ｄ変種形態をＢＴＳ細胞中に導入した。蛋白発現は温度により誘導されうる。細胞の計数を図７について上で説明したように行った。図８におけるグラフにより示されるように、ＢＴＳ−ＣＦＴＲＧ５５１Ｄ細胞は許容温度において増殖を続けたが、ＢＴＳ−親細胞よりわずかに増殖速度が低かった。新たに得られた細胞系におけるＣＦＴＲの機能性を確認するために、Ｃｌ^-インジケーター染料ＳＰＱを用いる単一細胞膜ハライド透過性アッセイ(a singlec ell membrane halide permiability assay）（チェン,エス・エイチら（１９９１年）セル第６６巻：１０２７〜１０３６頁）を使用した。このアッセイにおいて、ＳＰＱ蛍光の変化速度の増加はハライド透過性を反映する。ＢＴＳ−ＣＦＴＲ（ｎ＝１１、ｎは細胞数）、ＢＴＳ−親（ｎ＝１５）、ＢＴＳ−Ｇ５５１Ｄ, クローンＢ４３（ｎ＝３０）、ＢＴＳ−Ｇ５５１Ｄ,クローンＢ９１（ｎ＝１１）およびＢＴＳ−Ｇ５５１Ｄ,クローンＡ４６（ｎ＝２８）に関するＳＰＱ蛍光の変化を図９に示す。０分目において浴の溶液中のＣｌ^-をＮＯ₃ ^-に置き換えた。４分後（矢印）、２０μＭのフォルスコリン（forskolin）および１００μＭのＩＢＭＸで細胞を刺激して細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させた。データは、時間ｔにおける蛍光（Ｆ_t）の平均値±標準偏差からベースライン蛍光（Ｆ₀、イオン置換前２分間Ｃｌ^-存在下において測定した平均蛍光）を差し引いたものである。野生型ＣＦＴＲの発現はＢＴＳ細胞においてｃＡＭＰ依存性Ｃｌ^-チャンネルを与える。変種Ｇ５５１Ｄは測定可能であるが重大に欠損したＣｌ^-チャンネル活性を示す。第２の発現系：トランスジェニックウサギ１５０ユニットのプレグマント・メアーズ・シーラム・ゴナドトロピン（Preg nant Mare's Serum Gonadotropin）（ＰＭＳＧ）、次いで、７２日後に１５０ユニットのヒト・絨毛性ゴナドトロピンIV（ＨＣＧ IV）を筋肉内注射することにより２６匹のメスのニュージーランド・ホワイト（New Zealand White）ドナーウサギにおいて過剰排卵を誘発した。試験済みのオスに対してメスを少なくとも２回交配させた。精管切除したオスに対して５４匹の受容者メスを少なくとも２回交配させ、ドナーウサギの排卵と同調させるために１５０ユニットのＨＣＧ IVを注射した。交配から１９時間後、１.５ｃｃのアセプロマジン／ケタミン（１ｍｇ／ｍｌ／１０ｍｇ／ｍｌ）の筋肉内注射によりドナーウサギを麻酔し、腹の中央部を剃毛し、ベタジン（Betadine）で拭いて洗浄し、ベタジン溶液を噴霧し、次いで、手術の準備をした。滅菌した外科用具を用いて腹の中央部の切開を行った。輸卵管を外在化させ、滅菌したリン酸緩衝化セイラインを用いて受精した単一細胞胚をそこから洗い流して集めた。上記のごとくヤギ・β−カゼインプロモーターの下流に組み込まれた野生型ＣＦＴＲｃＤＮＡ、グリコシレーションしていないＣＦＴＲｃＤＮＡの変種、またはＣＦＴＲ変種Ｇ５５１ＤｃＤＮＡのいずれかをドナー胚にマイクロインジェクションし、脇腹の切開により受容者ウサギの両方の輸卵管に再移植した。誕生後最初の１週間の間、ＰＣＲ分析用に、耳から小片を切り取ることにより子孫からの組織を集めた。得られた子孫の耳からのＤＮＡのサザンブロット分析によりトランスジェニックウサギを同定した。簡単に説明すると、各創始者ウサギ由来の約１５μｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲルにより分離し、マグナグラフナイロン（magnagraph nylon）（フィッシャー・サイエンテイフィック（Fi sher Scientific）社製）に移し、次いで、ヤギ・β−カゼインｃＤＮＡのエキソン７由来の３８４ｂｐのＰｖｕII−ＰｖｕIIフラグメント（ヨシムラ,エム（Y oshimura,M.）ら（１９８６年）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nuc.Acids Res.）第１４巻：８２２４頁）および４.５ｋｂのｐＭＴ−ＣＦＴＲのＳａｌＩ −ＳａｌＩフラグメントとハイブリダイゼーションさせた。ベータスコープ６０３アナライザー（Betascope 603 analyzer）を用いてコピー数を定量した。図１０は、陽性の創始者動物由来のＤＮＡを示す。バンドＩはウサギ・β−カゼインＤＮＡであり、バンドII、IIIおよびIVはＣＦＴＲＤＮＡである。レーン６は対照ウサギであり、レーン１から５までは５匹の創始者トランスジェニックウサギの結果を示す。レーン７はベータスコープ６０３アナライザーを用いて観察されたシグナルを示す。かかる分析は、系中のトランスジーン（transgene）のコピー数が１ないし１０の間を変動したことを示す。オスのトランスジェニックウサギにおけるＣＦＴＲ発現の観察された致命性野生型ＣＦＴＲｃＤＮＡまたはＣＦＴＲｃＤＮＡのグリコシレーションされていない変種を含む構築物を注射された胚から発達したオスのトランスジェニックウサギは死産であるかまたは生後まもなく死亡した。図１２は、オスのトランスジェニックウサギにおけるＣＦＴＲ発現の致死性を示す表である。「死亡」の欄は、死産または生後まもなく脂肪した動物を表す。図１２に示すように、野生型ＣＦＴＲトランスジーンを有するオスの創始者ウサギすべてが生きていなかった。さらにオスのウサギにおいて観察された選択的致死性はＦ１世代において明らかであったが表現率は低かった。また、グリコシレーションされていない変種を有するトランスジェニックウサギは、創始者およびＦ１動物において選択的なオスの致死性を示したが潜在能力は低かった。野生型ＣＦＴＲｃＤＮＡまたはＣＦＴＲｃＤＮＡのグリコシレーションされていない変種を有するオスのウサギにおいて観察された選択的致死性とは対照的に、ＣＦＴＲ変種Ｇ５５１ＤｃＤＮＡを有するオスのトランスジェニックウサギは生きて誕生した。図１３参照。Ｇ５５１Ｄ変異は翻訳後プロセッシングされて原形質膜に送達されるがそのＣｌ^-チャンネル活性が選択的に欠失している変種の合成を引き起こす。現在に至るまで、Ｇ５５１Ｄトランスジーンを有する創始者動物においては致死性は観察されておらず、そのことは、トランスジェニックウサギにおいて観察されたオスの致死性は野生型ＣＦＴＲのＣｌ^-チャンネル活性の結果であるという結論を導く。メスのトランスジェニックウサギの乳におけるＣＦＴＲの産生創始者ウサギを育種して乳を分泌させるトランスジェニックなメスを得た。かかる動物から乳を集め、ＰＢＳで１０倍希釈し、ＲＩＰＡ（５０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ［ｐＨ７.５］、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウムおよび０.１％ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝液で処理して膜蛋白を可溶化させた。ウサギにオキシトシンを注射し、５分後に吸引ドライブを用いて搾乳した。簡単に説明すると、モノクローナル抗体ｍＡｂ２４−１（１９９３年８月２７日出願の米国第０８／１１４,９５０号）を用いる免疫沈降、次いで、洗浄された免疫沈降物を［γ³²Ｐ］ＡＴＰ存在下においてプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）でインビトロにおいてリン酸化処理することによりＣＦＴＲの存在に関して試料を試験した（グレゴリー,アール・ジェイら（１９９０年）ネイチャー第３４７巻：３８２〜３８６頁；チェン,エス・エイチら（１９９０年）セル第６３巻：８２７〜８３４頁）。より詳細には、細胞溶解物の調製、抗ＣＦＴＲ抗体を用いる蛋白の免疫沈降、１次元ペプチド分析およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の方法は、チェンらにより記載されているごときものであった（チェン,エス・エイチら（１９９０年）セル第６３巻：８２７〜８３４頁；チェン,エス・エイチら（１９９１年）セル第６６巻：１０２７〜１０３６頁）。キナーゼ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７.５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂および１００μｇｍｌ^-1ウシ・血清アルブミン）中最終体積５０μｌとしてプロテインキナーゼＡおよび［γ³²Ｐ］ＡＴＰ（１０ μＣｉ）とともに３０℃で６０分インキュベーションすることによりＣＦＴＲ含有免疫沈降物のインビトロでのリン酸化を行った。図１１は、ウサギ＃１４、対照ウサギ、およびＣＦＴＲトランスジェニックマウス（ディトゥリオ,ピー（DiTullio,P.）ら（１９９２年）バイオ／テクノロジー第１０巻（１）：７４〜７７頁）の乳からの試料のポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１はトランスジェニックウサギ＃１４からの乳５０μｌを含み、レーン２は対照乳５０μｌを含み、レーン３はＣＦＴＲトランスジェニックマウスからの乳５０μｌを含む。ＣＦＴＲの位置を右余白に示す。露出時間は−７０℃ において３０分であった。結果からわかるように、トランスジェニックウサギの乳中のＣＦＴＲ発現レベルは低い。検出可能なＣＦＴＲがウサギ＃１４において観察されただけであった。トランスジェニックマウスにおけるＣＦＴＲ量の評価に基づくと、ウサギ＃１４の乳１ｍｌにつき約０.０１〜０.１μｇのＣＦＴＲが存在する。実施例３：アンドロゲン応答エレメントに対応するヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡにおけるコンセンサス配列の同定アンドロゲン応答エレメントに関するコンセンサス配列を公表された報告（ロシェ,ピー・ジェイ（Roche,P.J.）ら（１９９２年）モレキュラー・エンドクリノロジー（Mol.Endocrinol.）第６巻：２２２９〜２２３５頁；クレセンス,エフ（Claessens,F.）ら（１９９０年）モレ・セル・エンドクリノロジー（Mol.Cell Endocrinol.）第７４巻：２０３〜２１２頁）から導出した。ジェネティクス・コンピューター・グループ・シークエンス・アナリシス・ソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group sequence analysis software package）からのベイスフィットアナリシス（basfit analysis）またはマックベクター（MacVector ）用のＩＢＩ配列分析ソフトウェアを用いてアンドロゲン応答エレメント配列をヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡと併置し、ＣＦＴＲコンセンサス配列を決定した。図１４は、アンドロゲン応答エレメントに対応するヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡにおけるコンセンサス配列の例を示す。アンドロゲンのごときステロイドホルモンは、特異的な細胞内受容体（次いで、ステロイドホルモン応答エレメントと相互作用する）に結合することにより転写を調節する。かかるエレメントは、転写エンハンサーの特性を有するシス作用性（cis-acting）ＤＮＡ配列である。ヒト・ＣＦＴＲのコーディング配列に存在するいくつかのかかるエレメントは、「ホルモン応答エレメント」の定義下で上記されている。これらのエレメントは、アンドロゲンに応答して、胎児の発達の間においてある種の組織でのＣＦＴＲ発現を不適当に増大させうる。実施例４：ヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡにおけるホルモン応答エレメントの存在の確認アンドロゲン応答エレメントに対応するヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡにおけるコンセンサス配列はアンドロゲン応答エレメントであることを確認するために、別の実験を行うことができる。例えば、ヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクター（例えばカリフォルニア州サンディエゴのインビトロジェン（Invitrog rn）社のｐＲＥＰ４）中に組み込み、ＺＲ−７１細胞（ロシェ,ピー・ジェイら（１９９２年）モレキュラー・エンドクリノロジー第６巻：２２２９〜２２３５頁）またはＤＤＴ−ＭＦ−２細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７０１）（インビトロ（InVitro）第１９巻：９２９〜９３６頁）のごときアンドロゲン応答細胞系中にトランスフェクションすることができる。次いで、トランスフェクションされた細胞をテストステロンで処理し、ＣＦＴＲ発現の増大に関してアッセイすることができる。アンドロン処理に応答したＣＦＴＲ発現の増大は、ＣＦＴＲｃＤＮＡにおけるアンドロゲン応答エレメントの存在を示す。ホルモン応答エレメントに対応しているヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡにおけるコンセンサス配列がホルモン応答エレメントであることを確認するために行うことのできるもう１つの実験は、ホルモン受容体がヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡにおける推定上のホルモン応答エレメントに結合するかどうかを調べることである。ＣＦＴＲｃＤＮＡの重複フラグメントを単離するゲルにより、および移動度変化アッセイ（moobility shift assay）（ロシェ,ピー・ジェイら（１９９２年）モレキュラー・エンドクリノロジー第６巻：２２２９〜２２３５頁）においてフラグメントを用いて、かかる実験を行うことができる。ＣＦＴＲｃＤＮＡへのホルモン受容体の結合は、ホルモン受容体エレメントを有するＤＮＡのポリアクリルアミドゲル上での電気泳動度の変化を引き起こすであろう。それゆえ、ホルモン受容体エレメントを有するＣＦＴＲｃＤＮＡフラグメントを検出することができる。実施例５：ヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡにおけるホルモン応答エレメントの不活性化ＣＦＴＲｃＤＮＡに存在する応答エレメントのヌクレオチド配列の変更によりホルモン応答エレメントの不活性化を引き起こすことができる。部位特異的突然変異を用いて、ＣＦＴＲｃＤＮＡに存在するホルモン応答エレメントにおいてヌクレオチド欠失、付加、または置換のごときヌクレオチドの変更を引き起こすことができる。かかる方法は、特に、１つまたはそれ以上の変異を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（オリゴヌクレオチド媒介変異）を包含する。サムブルック,ジェイら,モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（コールド・スプリング・ハーバーラボラトリー・プレス（１９８９年））。例えば、部位特異的突然変異を用いてヒト・ＣＦＴＲｃＤＮＡのヌクレオチド２９８８から３００２まで（５'ＧＴＴＡＣＡＴＴＣＴＧＴＴＣＴ３'）（配列番号：３）を（５'ＧＣＴＧＣＡＴＴＣＣＧＴＧＣＴ３'）に変異させることができる。ＣＦＴＲｃＤＮＡにおけるホルモン応答エレメントのヌクレオチド配列の変更が完成したならば、ｃＤＮＡを肺表面活性物質プロモーター構築物（lung surfactant promoter construct）（肺ＳＰＣ）（ホイトセット,ジェイ・エイ（Whitsett,J.A.）ら（１９９２年）ネイチャー・ジェネ（Nature Gen.）第２巻：１３〜２０頁）中に組み込んで、ホルモン応答エレメントが不活性化されたことを確認することができる。この肺ＳＰＣプロモーターは、ＣＦＴＲｃＤＮＡの発現を指令している場合以外は厳格に調節されている組織特異的プロモーターとして特徴づけられている。ＳＰＣ−ＣＦＴＲトランスジーンを有するトランスジェニックマウスの試験において、おそらくはアンドロゲン応答エレメントの存在による高レベルのヒト・ＣＦＴＲが検出されている（ホイトセット,ジェイ・エイら（１９９２年）ネイチャー・ジェネ第２巻：１３〜２０頁）。アンドロゲン応答エレメントが変異しているＳＰＣ −ＣＦＴＲトランスジーンを有するトランスジェニックマウスは試験において発現を示さず、アンドロゲン応答エレメントの不活性化が確認されるはずである。別法として、同じＣＦＴＲｃＤＮＡを実施例１記載のヤギ・β−カゼインベクター中に組み込み、ウサギ・胚中にマイクロインジェクションすることもできる。正常なオスの子孫の誕生により、ｃＤＮＡ中のアンドロゲン応答エレメントが不活性化されていることが確認されるであろう。ＣＦＴＲｃＤＮＡ中のホルモン応答エレメントの不活性化を確認するさらにもう１つの方法は上記実施例４にある。簡単に説明すると、例えば、アンドロゲン応答エレメントを含んでいるＣＦＴＲｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターに組み込み、アンドロゲン応答細胞系中にトランスフェクションすることができる。次いで、該細胞系をテストステロンのごときアンドロゲンで処理し、ＣＦＴＲ発現についてアッセイすることができる。ＣＦＴＲ発現を、アンドロゲン処理された既知アンドロゲン応答エレメントをでトランスフェクションされたアンドロゲン応答細胞におけるＣＦＴＲ発現と比較することができる。アンドロゲン処理された既知アンドロゲン応答エレメントでトランスフェクションされたアンドロゲン応答細胞におけるＣＦＴＲ発現と比較して、変異したアンドロゲン応答エレメントを有するＣＦＴＲｃＤＮＡでトランスフェクションされたアンドロゲン応答細胞系におけるＣＦＴＲ発現の減少が見られるならば、アンドロゲン応答エレメントが不活性化されたことが示される。均等物当業者は、日常的な実験以上の実験を用いずに、本明細書記載の発明の特別な具体例の多くの均等物を認識し、あるいは確認することができよう。かかる均等物は以下の請求の範囲に包含されると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チェン，セン・ヒンアメリカ合衆国02181マサチューセッツ州ウェルズリー、ウォール・ストリート50番 (72)発明者ミード，ハリー・エムアメリカ合衆国02158マサチューセッツ州ニュートン、グラスミア・ストリート62番 (72)発明者スミス，アラン・エドワードアメリカ合衆国02030マサチューセッツ州ドーバー、ミル・ストリート１番

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つの不活性化ホルモン応答エレメントと膜結合蛋白をコードしている核酸配列とからなるＤＮＡ。２．少なくとも１つのホルモン応答エレメントが膜結合蛋白をコードしている核酸配列において存在する請求項１のＤＮＡ。３．膜結合蛋白が嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターである請求項１のＤＮＡ。４．膜結合蛋白が嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターである請求項２のＤＮＡ。５．ホルモン応答エレメントがステロイドホルモン応答エレメントである請求項１のＤＮＡ。６．ホルモン応答エレメントがグルココルチコイドホルモン応答エレメントである請求項１のＤＮＡ。７．ステロイドホルモン応答エレメントがアンドロゲン応答エレメントである請求項５のＤＮＡ。８．ホルモン応答エレメントがヌクレオチド配列２９８８から３００２まで（配列番号：３）、３６５から３９９まで（配列番号：４）、２３３１から２３４４まで（配列番号：５）、ヌクレオチド２９１１から２９２６ま（配列番号：６）、およびヌクレオチド３９９７から４０１４まで（配列番号：７）からなる嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターをコードしているヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列の群から選択される請求項４のＤＮＡ。９．ホルモン応答エレメントがヌクレオチド配列２９８８から３００２まで（配列番号：３）、３６５から３９９まで（配列番号：４）、２３３１から２３４４まで（配列番号：５）、ヌクレオチド２９１１から２９２６ま（配列番号：６）、およびヌクレオチド３９９７から４０１４まで（配列番号：７）からなる嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターをコードしているヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列の群から選択されるアンドロゲン応答エレメントである請求項４のＤＮＡ。１０．ホルモン応答エレメントがヌクレオチド置換により不活性化される請求項１のＤＮＡ。１１．ホルモン応答エレメントがヌクレオチド付加により不活性化される請求項１のＤＮＡ。１２．ホルモン応答エレメントがヌクレオチド欠失により不活性化される請求項１のＤＮＡ。１３．請求項１のＤＮＡを含む嚢胞性線維症にかかっている細胞。１４．請求項１のＤＮＡを含む哺乳動物の胚。１５．請求項１のＤＮＡを含む哺乳動物。１６．少なくとも１つの不活性化ホルモン応答エレメントと嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターをコードしている核酸配列とからなる治療上有効量のＤＮＡ；および医薬上許容される担体からなる、嚢胞性線維症を有する対象を治療するための治療組成物。１７．ホルモン応答エレメントがステロイドホルモン応答エレメントである請求項１６の治療組成物。１８．ステロイド応答エレメントがアンドロゲン応答エレメントである請求項１７の治療組成物。１９．ホルモン応答エレメントがヌクレオチド配列２９８８から３００２まで（配列番号：３）、３６５から３９９まで（配列番号：４）、２３３１から２３４４まで（配列番号：５）、ヌクレオチド２９１１から２９２６ま（配列番号：６）、およびヌクレオチド３９９７から４０１４まで（配列番号：７）からなる嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターをコードしているヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列の群から選択される請求項１７の治療組成物。２０．アンドロゲン応答エレメントがヌクレオチド配列２９８８から３００２まで（配列番号：３）、３６５から３９９まで（配列番号：４）、２３３１から２３４４まで（配列番号：５）、ヌクレオチド２９１１から２９２６ま（配列番号：６）、およびヌクレオチド３９９７から４０１４まで（配列番号：７）からなる嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターをコードしているヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列の群から選択される請求項１８の治療組成物。２１．少なくとも１つの不活性化ホルモン応答エレメントと嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターをコードしている核酸配列とからなるＤＮＡを用意し；機能的な嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターが対象に悪影響を及ぼさないレベルで対象により産生されるように治療上有効量の該ＤＮＡを嚢胞性線維症を有する対象に投与することからなる、嚢胞性線維症を有する対象の治療方法。２２．膜結合蛋白をコードしている核酸配列からなるＤＮＡを選択し；該ＤＮＡを細胞中に導入し；次いで、細胞に悪影響を及ぼさないレベルの膜結合蛋白を産生させることからなる、細胞中にＤＮＡを導入する方法。２３．膜結合蛋白が嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターであり、細胞が嚢胞性線維症にかかっている細胞である請求項２２の方法。２４．請求項２２の方法により製造される細胞。２５．細胞に悪影響を及ぼさないレベルで嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターを産生する嚢胞性線維症にかかっている細胞。２６．ＤＮＡを哺乳動物の胚中に導入し；該哺乳動物の胚から発達したオスおよびメスの哺乳動物の死亡率に対する該ＤＮＡの影響を調べ；次いで、死亡率に対する影響とホルモン応答エレメントを有する核酸配列からなるＤＮＡの存在または不存在とを関係づけることからなる、ホルモン応答エレメントが機能的である種におけるホルモン応答エレメントの存在または不存在に関してＤＮＡをアッセイする方法。２７．少なくとも１つのアンドロゲン応答エレメントと対象とする蛋白をコードしている核酸配列とからなるＤＮＡを哺乳動物の胚中に導入し；該胚を妊娠したメスの哺乳動物中に移植し；次いで、アンドロゲン応答エレメントの悪影響により、メスのトランスジェニック哺乳動物が誕生時に生きておりオスのトランスジェニック哺乳動物が誕生時に生きていないように移植された胚に懐胎期間を経過させることからなる、対象とする蛋白を産生するメスのトランスジェニック哺乳動物を選択的に育種する方法。２８．妊娠したメスの哺乳動物が偽妊娠している請求項２７の方法。２９．対象とする蛋白が膜結合蛋白である請求項２７の方法。３０．膜結合蛋白が嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーターである請求項２９の方法。