JPH09502805A

JPH09502805A - 荷電したポリマーを用いることによる、ゲルのないポリマー媒体における電気泳動の間の電気浸透の抑制

Info

Publication number: JPH09502805A
Application number: JP7511914A
Authority: JP
Inventors: ズ，ミン−デ; ジェイ．シーバート，クリストファー
Original assignee: バイオ−ラッドラボラトリーズ，インコーポレイティド
Priority date: 1993-10-14
Filing date: 1994-10-05
Publication date: 1997-03-18
Anticipated expiration: 2015-02-21
Also published as: WO1995010771A1; DE69415339T2; EP0723660A1; US5545302A; JP3012003B2; CA2173994C; CA2173994A1; EP0723660B1; DE69415339D1

Abstract

(57)【要約】電気泳動分離に生起し、分離の効率、正確さおよび再生産性を妨害する、電気浸透の現象が、共有結合により結合したアミン基により変性された溶解された親水性ポリマーを分離媒体中にポリマーに比例する制御した割合で包含することによって抑制される。この変性ポリマーは、自由ゾーン電気泳動およびモレキュラーシーブ電気泳動の両方の電気浸透を抑制する。この変性ポリマーが毛細管内で用いられた時に電気浸透に引き起す減少は中性ポリマーで毛細管を被覆することによって達成される減少と変わらない。

Description

【発明の詳細な説明】荷電したポリマーを用いることによる、ゲルのないポリマー媒体における電気泳動の間の電気浸透の抑制この発明は電気泳動の分野、特にゲルのない液体媒体による電気泳動の分野にある。この発明の関心事は電気泳動分離における電気浸透並びに分解能および再現性へのその有害な影響の自然発生である。発明の背景電気浸透性の(electroendosmotic or electroosmotic)流れとも呼ばれる、電気浸透(electroendosmosis)は、溶媒または溶媒系に溶解された溶質イオンの電気泳動分離においてよく起こる現象である。電気浸透は、シリカを含有する物質製の毛細管で行なわれる電気泳動でとりわけ顕著である。電気浸透は、質量に対する電荷（charge-to-mass）の比および各イオンの極性とともに変化する速度で起こる溶質イオン自身の電気泳動的移動とは無関係に、電場に応じて溶媒系のバルク流れをもたらす。バルク流れは、溶質が溶解している溶液の一部と共通の速度ですべての溶質を動かすことの原因となり、それによって移動性に差異を生じさせない要素を追加するので溶質の分離を害する。これは、電気泳動自身に寄与する移動通路を効果的に短かくし、それによって与えられた距離のカラムでの電気泳動の分離の程度を減ずる。極端な場合、電気浸透はピークを広げ、分離の喪失をもたらす。分離を終えた後に留まった少量の溶質が電気浸透の効果を変更する傾向があり、そして１回の分離が次の分離に影響を及ぼす程度は分離領域内での溶質の保留と分離領域からの遊離との間のバランスに依存するので、同じセル、カラムまたは毛細管で繰り返した試験が実行されるとき、電気浸透はまた分離の再生産性をそこなう。現在まで、電気浸透は、毛細管壁または充てん床の中のビーズの表面のような固体表面と該固体表面に隣接する液相との間に存在する界面動電電位のみから生ずると信じられてきた。その結果、毛細管内の電気浸透は一般に毛細管の内部表面の被覆によって抑制される。被覆は一般に毛細管表面に共有結合で結合した中性または荷電した基よりなり、そうでないなら表面に露出している荷電した基を除去し、被覆物質に直接結合されていない表面付近に位置している荷電した基から、壁に隣接する液体媒体を保護する。しかしながら、繰り返し使用の後では、なお、電気浸透は被覆毛細管内で現われるので、被覆は電気浸透を除去する理想的な手段ではない。これは、延長した使用または苛酷な溶質または分離媒体にさらすことによる被覆の劣化もしくは過去の実験からの荷電した分析物の吸着のせいであると推定される。劣化は、被覆された毛細管の使用寿命を制限する。部分的に劣化した被覆を有する毛細管を等電点電気泳動に用いる時、たとえば、劣化はいかなる１回の試験のための電気泳動時間の長さをも制限する。毛細管中の電気浸透を減少するために用いられてきた他の方法は、媒体の粘度を上げるための分離媒体への少量のセルロース誘導体の混入である。これはあいにく、溶質の移動速度にも影響を及ぼし、単に電気浸透効果を除去するというよりむしろ妨害する。なお、更なる方法は、ウィクトロヴィクツ（Wiktrowicz）の、1993年１月26日に発行された米国特許第 5,181,999号によって開示されたように、試料の適用の前に、毛細管の壁を被覆するために高荷電疎水性ポリマーを適用する方法である。ポリブレン（１，３−ジブロムプロパンを含むＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミンポリマー）がこの目的のために用いられてきた。しかしながら、これらのポリマーは壁に堅く結合していなければならないし、毛細管は分離が行なわれる前に分離電解質で予備平衡化されねばならない。タンパク質の分析にとって、分析溶液に残存ポリブレンをも入り込ませて、そこで残存ポリブレンとタンパク質の調節できない相互作用が起こることをさけるために、試料の導入の前に結合と平衡化を行うことは重要である。発明の概要今や、電気泳動が特定の液相分離媒体中で行なわれる時、電気浸透は分離媒体自身から生ずることが発見された。これらの媒体は、参照によりこの明細書に組み入れられる、1992年２月19日に発行された米国特許第 5,089,111号に開示されているものを含む、親水性の水溶性ポリマーの水溶液である。特許第 5,089,111 号中の開示は、ポリマーが分離へのモレキュラーシーブ効果に寄与する、非架橋ポリマーの水溶液を通しての電気泳動による分子サイズに基づく、試料イオン、特に生体分子の分離である。ポリマーの分子量は分離されるべき試料イオンの分子量範囲内かそれに近く、その結果、試料イオンの該溶液を通る移動は、溶解されたポリマーによって、異なる程度で抑制される。この発見は、電気浸透が、ポリマーのアミンを用いる誘導体化によって減少され得る系および全く除去される場合の観察から生ずる。好ましい誘導体化は第４級アミン基のポリマー鎖への付着（attachment）に由来するものである。アミンまたはアミノ基の付着は必要なら連結基を用いて、好ましくは共有結合による。露出された水酸基を含有する親水性ポリマーにあっては、連結基およびこの理由で第４級アミン基は水酸基の酸素の位置で付着することができる。この発見に伴い、抑制効果は、誘導体化鎖上のアミン基の密度、すなわち、アミンが付着している鎖 100ｇに対するアミンの当量が約0.05またはそれより上であるアミン誘導体化ポリマー鎖によって達成される。誘導体化鎖中の、荷電したおよび非荷電のすべてのモノマーの合計に対する、誘導体化鎖の生成に用いられた荷電モノマーのモル％と定義される、パーセント荷電として、かわりに表現すると、抑制効果は約５％またはそれより大きいパーセント荷電で観察される。これらの誘導体化ポリマー鎖は、それら自身で、または非−誘導体化ポリマー鎖、すなわち、アミノ基が付着していないポリマー鎖との混合物としてのいずれかで用いることができる。驚くべきことに、誘導体化鎖と非−誘導体化鎖がいっしょに混合されたとき、電気浸透の抑制における誘導体化ポリマーの有益な影響が非−誘導体化ポリマーによる希釈によっても、誘導体化ポリマーの濃度増加によっても変更されないし、試験の結果が示すところによれば、有益な影響は、ポリマー混合物中のアミン基の全数によるというより、誘導体化の程度が明確な上限および下限を有している誘導体化鎖中のアミン誘導体化の高い程度に帰することができる。置換の度合がいかなるものであってもEOF(電気浸透性の流れ)の逆転は観察されなかった。上限を越える置換の度合において、EOF は誘導体化ポリマーを含有しない溶融シリカ毛細管と同じ方向に、すなわちアノードからカソードへ増加することが観察された。この発明の特に驚くべき態様は、溶解された上述の方法で誘導体化された親水性ポリマーの使用が、毛細管の内部の表面被覆の使用と同じ程度に毛細管中の電気浸透を減ずるということである。被覆の影響は、壁の近くに限定されるものと推定されるから、その影響が壁でというよりも分離媒体のバルクにある分離媒体の分子の変性によって、被覆されていない毛細管中で匹敵する効果が達成されることはまったく意外である。この発明のさらなる観点である、関連した発見は、封入物(enclosure)の壁での電気二重層から生ずる電気浸透もまたアミンで誘導体化されたポリマーの添加により抑制されることである。このように、溶解したポリマーの濃度が溶質のモレキュラーシーブ媒体として役立つには低すぎるような分離においては、ポリマー上の電荷は、なお、電気浸透効果を減じまたは除去する。この発明のこれらのおよび他の特徴、特質および利点は下記で詳細に説明される。図面の簡単な説明図１は、トリエタノールアミンでのデキストランの誘導体化の度合に対する、分離媒体としてデキストラン水溶液を用いる溶融シリカ毛細管における電気浸透性の流れのプロットである。図２ａおよび２ｂは、分離媒体としてデキストラン溶液を用い、溶融シリカ毛細管中での８つのSDS 処理したタンパク質の標準混合物の電気泳動分離を表わす、検出器トレースである。図２ａでは、電気泳動はデキストランの一部のトリエタノールアミンによる誘導体化によって抑制されているのに対し、図２ｂでは、電気泳動は毛細管内壁上のポリアクリルアミド被覆によって抑制されている。図３ａおよび３ｂは、分離媒体としてヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液を用いた溶融シリカ毛細管中でpBR322の AvaII／EcoRＩ制限消化物の電気泳動分離を表わす検出器トレースである。図３ａでは、HMC の一部はトリエタノールアミンで誘導体化されたものであるのに対し、図３ｂでは誘導体化されていない HMC がその内表面をポリアクリルアミドで被覆された毛細管中で用いられている。図４ａおよび４ｂは、モレキュラーシーブなしで自由ゾーン電気泳動の状態のもとで、溶融シリカ毛細管中のヒト・トランスフェリンのグリコシル化型の混合物の電気泳動分離を表わす検出器トレースである。図４ａでは、トリエタノールアミンで誘導体化された低濃度のデキストランが、被覆されていない毛細管中で用いられているのに対し、図４ｂでは、内壁をポリアクリルアミドで被覆された毛細管中で、ポリマーを含まない緩衝液が用いられている。この発明の詳細な説明および好ましい実施態様この発明は、電気泳動において分離媒体として第４級アミン基が結合している親水性ポリマーの使用に帰する。第４級アミン基の付着がポリマーまたは溶質のいずれかを沈降させ、媒体中で分離を引き起こさない限り、種々の第４級アミン基のいずれも使用することができる。ヒドロキシ置換アミン、特にジまたはトリ −（ヒドロキシアルキル）アミンは、このようなアミンの例である。これらの中では、トリエタノールアミンがもっとも好ましい。第４級アミン基のポリマーへの付着は、共有結合を生成するいかなる通常の手段を用いても達成することができる。露出した水酸基を有するポリマーに対しては、たとえば通常の化学現象を用いて、水酸基をエーテル結合に変換することができる。他の変更は、この種の化学における当業者にとって容易に明らかとなるだろう。ポリマーをアミン基に結合する結合基は、アルキル架橋、エーテル架橋、エステル架橋またはこれらの型の組み合せである架橋であり得る。好ましい結合剤はアリルグリシジルエーテルである。適当な結合方法は合成化学における当業者によく知られている。誘導体化の程度は、ポリマー全体の第４アミン基の密度、または、露出された水酸基での結合により誘導体化されているポリマーの場合には、第４級アミン基がエーテル結合を介して結合されている水酸基の数により決定される。誘導体化の度合は、限定された、すなわち、化学量論量よりも少ない、量の結合試薬、アミンを用いるか、所望の誘導体化の度合に等しい化学量論量に比例して用いられる量の割合の両方によって調節することができる。この発明の目的のための誘導体化の度合の範囲は重量基準で約１％から約20％、好ましくは約２％から約10％である。誘導体化されたポリマー 100ｇ当りのアミンの当量の表現で表わすと、好ましい範囲は約0.05から約0.25であり、もっとも好ましい範囲は約0.10から約 0.20である。誘導体化の度合は、誘導体化ポリマーに存在する、荷電されたおよび荷電されない、すべてのモノマーの合計に対する、荷電したモノマーのモル％として定義される、パーセント荷電の用語でもまた表現できる。この発明の目的のために、パーセント荷電は約５％またはそれより上、好ましくは約５％から約50％、最も好ましくは約15％から約40％である。この発明において用いる適当なポリマーの例は、セルロース誘導体、サッカリドを基礎とするポリマーおよび置換サッカリドを基礎とするポリマー、ポリシラン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンである。セルロース誘導体の例は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチル２−ヒドロキシメチルセルロース、２−ヒドロキシエチルセルロース、２−ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロースおよびヒドロキシエチルエチルセルロースである。サッカリドを基礎とするポリマーおよび置換サッカリドを基礎とするポリマーは、線状または分枝の両方であって、デキストラン、ヒアルロン酸（アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸を繰り返し単位とするポリマー）、イナゴマメの樹脂（本質的にガラクトマンナンであるポリサッカリド植物粘液）、ポリトラン（ミネソタ州，ミネアポリスのPillsbury Co．より入手できるスクレログルカン）、プスツラン（Pustulan，カリフォルニア州，サンディエゴのCalbioch em Corp.より入手できるポリサッカリド）、カラギーナン（荷電されたポリサッカリド）、グア−ガム（中性ポリサッカリド）、ペクチン（主に長鎖中に結合した部分的メトキシ化ガラクトウロン酸よりなるポリウロニド）、アミロース、アミロペクチン、溶解性殿粉およびヒドロキシプロピル殿粉である。特に興味あるポリマーは、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、デキストランおよびアガロースである。最も好ましいポリマーはヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびデキストランである。非誘導体化ポリマーが、モレキュラシーブ効果による試料イオンの分離のために分離媒体に含まれるとき、ポリマーの選択は通常は最適分離の達成に行ってなされ、そして、それは試料混合物中の特定のイオンにより変化するだろう。分子量を広く異にするポリマーも用いることができる。試料イオンの分析はしかしながら、ポリマーの分子量が試料イオンの分子量範囲に近づくにつれて、通常よくなるだろう。最良の結果は、試料イオンの最低分子量と最高分子量の間の平均分子量を有するポリマー、特にポリマーの分子量範囲が試料イオンの分子量範囲を含む（すなわち、少くとも同一の広がりをもつ）ポリマーで得られた。好ましい実施態様では、ポリマーは約10,000から約 2,000,000であって、試料イオンの平均（または疑わしい(suspe cted)平均）分子量の約 0.1から約200倍、もっと好ましくは約 0.2から約20倍、そして最も好ましくは約 0.5から約２倍以内の平均分子量を有している。これらの分子量の考察は、アミン誘導体化ポリマーにも同様に応用される。このように、誘導体化ポリマーが分離媒体中に存在する唯一のポリマーであろうと、非誘導体化ポリマーとの混合物で存在しても、いずれにせよ、誘導体化ポリマーは好ましくは約10,000から約 2,000,000で、試料イオンの平均（または疑わしい平均）分子量の約 0.1から約200倍、もっと好ましくは約 0.2から約20倍、そして最も好ましくは約 0.5から約２倍の平均分子量を有している。あるポリマーは最も便利にポリマーが溶解する水溶液の特定の濃度および温度での水溶液の粘度として特徴づけられる。セルロース誘導体は、たとえば、通常、この方法で特徴づけられる。この粘度による特徴づけの数値は広く変化し得るが、セルロース誘導体についての最良の結果は、通常、２重量％で水に溶解され 25℃で測定された時約15センチポワズから約17,000センチポワズの範囲の粘度を生成するものと特徴づけられるものから得られる。ただし、本発明の文脈上、それらは他の濃度においても使用できる。これらのようなポリマーは、約10から約 10,000塩基対の範囲の鎖を有するポリヌクレオチドを分離するのに有用である。好ましいセルロース誘導体は、２％水溶液として製造され25℃で測定されたとき、約 1,000から約10,000センチポワズの粘度を有するものである。これらの粘度による特徴づけは単にポリマーの分子量の標示を意図しているものであって、この発明の明細書において用いられた時のポリマーの実際の粘度ではないことを理解すべきである。種々の分子量が合目的的に組み合わされているポリマーの混合物もまた用いることができる。これは、広範囲の分子量を有する試料混合物を分離し、このように全範囲にわたる分離を提供するのに特に有用である。分離媒体中の溶解されたポリマーの量または濃度は広く変化し得る。非誘導体化ポリマーをそのモレキュラーシーブ効果のために含有する時、効果的な量は、分子サイズまたは質量に対する電荷の割合に基づく電気泳動分離が達成されるような変化する程度に分析物の分離を改良するいかなる量であってもよいだろう。これは、カラムの形状および長さ、電荷および電気泳動の移動性のような分離に影響を与える他の因子の存在および影響、ポリマー自身の分子構造、固有粘度および相互に作用する性質、並びに試料イオンの分子量範囲および試料イオン間の分子量の差を含む、この系の種々のパラメーターとともに変化するだろう。試料イオンの保持時間を最良の結果のために延長すべき程度は、用いられた試料組成物およびポリマーにより変化するだろう。巨大分子の種の分離には、保持時間の少くとも約25％好ましくは少くとも約35％、そして最も好ましくは少くとも約50 ％の増加が、最も良い結果を与えるだろう。非誘導体化ポリマーの好ましい濃度は、約0.05％またはそれより大、さらに好ましくは約 0.1％から約30％そして最も好ましくは約１％から約20％（すべてのパーセントは重量基準）である。アミン−誘導体化ポリマーの量もまた変化し得る。最良の結果は、しばしば、約0.05％またはそれより高濃度において得られ、好ましい範囲は約 0.1％から約 10％であり、最も好ましい範囲は約 0.1％から約５％（すべて重量基準）のポリマー濃度である。この発明による分離を行うために、適当に選択された緩衝系を含む、通常の電気泳動分離で用いられる、機器、物質、操作条件および手順を用いることができる。この発明は、毛細管内および特に溶融シリカのようなシリカを含有する毛細管内で行なわれる高性能電気泳動に特に有用である。好ましい毛細管は内径が約 200ミクロンより小さく、最も好ましくは約10ミクロンから約 100ミクロンであるものである。この発明はまた、スラブ形のセルおよび他の非毛細管系で行なわれる電気泳動分離にも応用できる。毛細管系には、毛細管の長さcm当り少なくとも約50ボルトの電圧が好ましく、約 100 Ｖ／cmから約1000Ｖ／cmの電圧範囲が特に好ましい。下記の例はまったく説明の目的のために提供されており、この発明をどのような風にも限定したり、制限することを意図するものではない。例１トリエタノールアミン−デキストラン(TEA−デキストラン)の製造Ａ．デキストランのアリルデキストランへの変換 10ｇのデキストラン(分子量2,000,000)を 100mlの水に溶解して溶液を調製した。該溶液にテトラヒドリド硼酸ナトリウム（14モルのNaOH中 4.4モル濃度で安定な水溶液の10ml）。生じた混合物を撹拌しながら70℃に加熱し、撹拌を続けながら10mlのアリルグリシジルエーテルを加えた。温度は急速に80℃に上昇し、その点で加熱を中止し、室温で１時間撹拌を続けた。次に該溶液を12−14,000の分子量カットオフを有する透析チューブに移し、透析を流動脱イオン水に対して14 時間行い、pHを 7.0より低くまたは 7.0に等しくした。Ｂ．アリルデキストランの臭化デキストランへの変換前項の生成物を 500mlビーカーに移し、撹拌しながら200μｌのBr₂を加えた。 Br₂のすべての滴が消えるまで撹拌を続けた。Ｃ．臭化デキストランの TEA−デキストランへの変換前項の臭化デキストラン溶液に撹拌しながらトリエタノールアミン（２ｇ）を加えた。次いで混合物を65℃の恒温浴に置き、そこで連続的な撹拌のもとに４時間維持した。次いで、混合物を12−14,000の分子量カットオフを有する透析チューブで流動する脱イオン水に対して14時間透析してpHを 7.0またはそれより低くした。生じた混合物を No.４紙フィルターでろ過し、４℃で貯蔵した。この例のＢで消費された臭素の量および全窒素の定量による確認に基づいて、荷電パーセント、すなわち、鎖中の置換および非置換の全グルコースモノマーの合計に対するデキストラン鎖中の TEA−置換モノマーの平均モルパーセントは25−30％であった。例２トリエタノールアミン−ヒドロキシプロピルメチルセルロース(TEA−HMC)の製造粘度4000センチポアズのヒドロキシプロピルメチルセルロースの２％（重量）溶液を用いて、例１の手順に再度従った。他の変更は該ポリマーのアリルグリシジルエーテルによるポリマーの誘導体化において５mlのイソプロパノールを加えたこと、純粋なBr₂の代りにBr₂飽和水を用い、Br₂飽和溶液は溶液が黄色に変るまで加えたことである。生成物はトリエタノールアミン−ヒドロキシプロピルメチルセルロース(TEA−HMC)であった。同様にここに、パーセント荷電、すなわち、HMC 鎖中のすべてのモノマーの合計に対して、デキストラン鎖中の TEA−置換モノマーの平均のモルパーセントは、25−30％であった。例３ TEA−デキストラン中の電気浸透性の流れの測定この例は、デキストラン溶液に TEA−デキストランを添加してそうでなければデキストラン溶液に起こる電気浸透性の流れを抑制または減少させる効果を説明する。すべてpH8.3 で 0.4ＮのTRIS−硼酸塩を含有する４つの水溶液を調製した。これらの溶液の２つはさらに 0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含んでいた。SDS を含有する溶液の一つおよびSDS を含有していない溶液の一つは、さらに分子量 2,000,000のデキストランを８％（重量基準）含んでいた。残る二つの溶液はさらに、その５％が上記例１で製造された TEA−デキストランである、分子量 2,000,000のデキストランを８％（重量基準）含んでいた。したがって、溶液は次のとおりであった。１． 0.4Ｎ TRIS−硼酸塩、SDS 、デキストラン２． 0.4Ｎ TRIS−硼酸塩、SDS 、デキストラン＋ TEA−デキストラン３． 0.4Ｎ TRIS−硼酸塩、（SDS 無、）デキストラン４． 0.4Ｎ TRIS−硼酸塩、（SDS 無、）デキストラン＋ TEA−デキストラン溶液を、各内径50ミクロンで全長寸法24cmの被覆されてない毛細管で行なわれた並行した試験で用いた。ニコチンアミドをマーカーとして、 0.1mg／mlの濃度で、毛細管の陽極端から入れて用いた。毛細管を横切って、15KVの電圧を印加し、インライン紫外光検出器によって検出を行なった。マーカーが入口端から検出器まで進んだ距離は 4.6cmであった。マーカーが検出器に達するのに要した時間Ｔ（分で）を測定した。この数値を毛細管の全長さ（Ｌ_t＝24cm）、検出器までの長さ（Ｌ_e＝ 4.6cm）および適用電圧（Ｖ＝15KV）を組み合わせて、次の式により電気浸透性の流れ（EOF，cm²／Ｖ −秒の単位）を決定した。各４つの試験の EOF値を表Ｉに示した。これらの結果は、電気浸透性の流れは、SDS の存在下およびSDS の不存在下の両方で、除去されるか、少なくともはっきりと減少されることを示している。例４ TEA−デキストラン中でのTEA の量を変えた電気泳動この例は、トリエタノールアミンによるデキストランの誘導体化の程度と、電気浸透性の流れが抑制される程度の間の関係を説明する。例３に従って、デキストランの合計量に対する第４級トリエタノールアミン基の割合が変化した以外は同じ物質を用いて一連の試験を行った。誘導体化の度合に対するEOF の数値に関する結果を図１に示す。これらの結果は、電気浸透は第４級トリエタノールアミン基により著しくそして十分に抑制されるという、上記例３の結果を確認し、そして、さらに最大抑制は、 100ｇのデキストラン当り0.1から 0.2当量の TEAの範囲で起こることを示す。例５被覆毛細管に対する、 TEA−デキストラン中の電気泳動この例は，デキストランおよび TEA−デキストランの両方が溶解している水溶性分離媒体を含有する被覆されてない溶融シリカ毛細管とデキストランが唯一の溶解しているポリマーである水溶性分離媒体である水溶性分離媒体を含有する被覆された溶融シリカ毛細管とを比較する、溶融シリカ毛細管で行なわれる電気泳動分離の結果を報告する。の米国特許第 4,680,201号に開示された方法にしたがって毛細管表面をビニルトリクロロシランで処理し、シラン化された表面を線状ポリアクリルアミドで共重合することにより被覆した。この毛細管および被覆されなかった第２の溶融シリカ毛細管の各々を 0.4Ｎ TRIS−硼酸塩、pH8.3，0.1％のSDS および８％のデキストラン（分子量 2,000,0 00）の水溶液で満たした。被覆されていない毛細管に対する溶液において用いられたデキストランは例１で製造された TEA−デキストランを全デキストランに基づき５％の量で含んでいた。８つのSDS 処理したタンパク質の標準的な混合物を各毛細管に試料として用いた。タンパク質および分子量は次のとおりであった。リゾチーム 14,400 トリプシン阻害剤 21,500 カルボニックアンヒドラーゼ 31,000 オボアルブミン 45,000 血清アルブミン 66,200 ホスホリラーゼ 97,400 β−ガラクトシダーゼ 116,200 ミオシン 200,000 長さ24cmおよび内径50ミクロンと測定された毛細管および例３の配置が、陽極に向って起る 220nmで検出する電気泳動の移動とともに用いられた。試料を10KV，８秒電気泳動的に負荷し、分離を15KVで行なった。 TEA−デキストランが分離媒体に含まれている被覆されていない毛細管中の分離の検出器トレースは図２ａに示されているのに対し、分離媒体が非誘導体化デキストランのみを含有する被覆された毛細管中の分離のトレースは図２ｂに示されている。二つのトレースは実質的に同一であり、デキストラン上の TEA基が、溶融シリカ毛細管上の被覆と同じ程度に電気浸透性の流れを抑制したことを示している。例６被覆された毛細管に対する TEA−HMC 中の電気泳動この例は、例２で調製された TEA−ヒドロキシプロピルメチルセルロースが、誘導体化されていないヒドロキシプロピルメチルセルロースと比較された以外は例５と同様な比較を表わす。例５と同じ方法により製造された被覆された溶融シリカ毛細管を用い、分離媒体はpH8.3 で 0.3Ｎ TRIS−硼酸塩および 0.5％のヒドロキシプロピルメチルセルロースの水溶液であった。被覆されていない毛細管のための溶液中で用いられたヒドロキシプロピルメチルセルロースは、 TEA−ヒドロキシプロピルメチルセルロースを全ヒドロキシプロピルメチルセルロースを基準にして５％の量で含んでいた。試料混合物はプラスミドpBR322の AvaII／EcoRＩ制限消化物であり、該消化物は長さ88から1746塩基対に変化する９つのフラグメントからなるものであった。長さ50cmおよび内径24ミクロンと測定された毛細管および例４の配置が再び用いられ、 260nmで検出を行った。試料は10KVで８秒電気泳動的に負荷され、分離は８KVで行なわれた。 TEA−HMC が分離媒体に含まれた、被覆されていない毛細管中の分離の検出器トレースは図３ａに示されているのに対し、分離媒体が誘導体化されていないHM C を含有した被覆された毛細管中での分離のトレースは図３ｂに示されている。二つのトレースは実質的に同一であり、HMC 上のTEA 基が、溶融シリカ毛細管上の被覆と同じ程度に電気浸透性の流れを抑制したことを示している。例７ポリマーのない被覆された毛細管に対する TEA−デキストラン中の電気泳動この例は、分離媒体中の荷電ポリマーをしかし、モレキュラーシーブが起る範囲よりも低い濃度で用いる電気泳動分離の結果を報告する。処理されていない毛細管中での緩衝液中に低濃度で溶解された荷電ポリマーを用いる電気泳動が、緩衝液中に全然ポリマーを含まない、処理された毛細管中の電気泳動と比較される。ヒト・トランスフェリンは、ヒトの血清中に存在し、約80,000の分子量および等電点がpH 5.0−6.0 の範囲にあるタンパク質である。ヒト・トランスフェリンは毛細管電気泳動により分離することのできる種々のグリコシル化形で存在する。通常、線状ポリマーで被覆された毛細管が分離カラムとして用いられる。長さ24cmおよび直径50μの溶融シリカ毛細管を上記例５に記載されている方法で被覆し、緩衝液にいかなるポリマーも溶解されていないpH8.0 のリン酸塩緩衝液を満たした。同じ寸法の第２の溶融シリカ毛細管を被覆されてないままとし、上記例１で製造されたもっぱら TEA−デキストランからなるポリマーをさらに重量で 0.4％含有する同じ緩衝液で満たした。グリコシル化ヒト・トランスフェリンの種々の形の混合物を各々の毛細管に適用し、電圧差15KVで試験が行なわれた。添加物として荷電ポリマーを用いた処理されていない毛細管中の分離の検出器トレースは図４ａに示されているのに対し、いかなるポリマーもなしでの被覆された毛細管での分離のトレースは図４ｂに示されている。二つのトレースは実質的に同一であり、この非ふるい法（non-sieving mode ）においても、荷電ポリマーは、被覆された毛細管と同じ程度に電気浸透を抑制し、分離はまったく自由ゾーン電気泳動の態様で起こった。前記のことは、主として説明の目的で提示されている。この明細書に記載された系の操作条件、物質、手順の段階および他のパラメーターは、この発明の精神および範囲からはずれることなく、種々の方法でさらに変更または置換できることは、当業者に容易に明らかであろう。

【手続補正書】【提出日】１９９６年６月１０日【補正内容】 (1)ａ）明細書第５頁第１８行及び第１９行の「電気泳動」を『電気浸透』に補正する。ｂ）明細書第１２頁第２２〜２３行の「デキストラン」を『ＨＭＣ』と補正する。 (2) 請求の範囲を別紙のとおり補正する。請求の範囲１．ゲルのない水溶液から本質上なる分離媒体中での試料イオン混合物の電気泳動分離における電気浸透性の流れを抑制する方法において、ポリマー 100ｇ当り約0.05またはそれより大きいアミン当量のアミンの結合により誘導体化された親水性ポリマーをゲルのない水溶液に含有せしめることを含んでなる方法。２．該誘導体化された親水性ポリマーが、該親水性ポリマーの全モノマーの合計に対して、少くとも約５％のモル％でアミン結合したモノマーを含有する請求項１に記載の方法。３．該親水性ポリマーが、セルロース誘導体、サッカリドを基礎とするポリマーおよび置換されたサッカリドを基礎とするポリマー、ポリシラン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンからなる群から選択された一員である請求項１に記載の方法。４．該ポリマーが 100ｇの該ポリマー当り約0.05から約0.25当量のアミンの程度で誘導体化されている請求項１に記載の方法。５．該ゲルのない水溶液中の該ポリマーの濃度が約 0.1重量％から約10重量％である請求項１に記載の方法。６．該ポリマーが該ゲルのない水溶液に溶解された唯一のポリマーである請求項１に記載の方法。７．該ポリマーが、該試料イオンの最低分子量および最高分子量の平均の約 0 .2倍から約20倍の範囲内である平均分子量を有している請求項６に記載の方法。８．該ゲルのない水溶液にさらに非−アミン誘導体化親水性ポリマーが約0.05 重量％またはそれより大なる濃度で溶解されている請求項１に記載の方法。９．該非−アミン誘導体化親水性ポリマーの濃度が約 0.1重量％から約30重量％である請求項８に記載の方法。 10．該非−アミン誘導体化親水性ポリマーが、該試料イオンの最低分子量および最高分子量の平均の約 0.2倍から約20倍の範囲内の平均分子量を有している請求項８に記載の方法。 11．該アミンが該ポリマーに第４級アミン基として結合されている請求項１に記載の方法。 12．該第４級アミン基が、第４級トリエタノールアミン基である請求項11に記載の方法。 13．該アミンがアリルグリシジルエーテルから誘導される連結基を介して該ポリマーに結合されている請求項１に記載の方法。 14．該第４級アミン基が、アリルグリシジルエーテルから誘導される連結基を介して該ポリマーに結合されている第４級トリエタノールアミン基である請求項 11に記載の方法。 15．該ポリマーが、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、デキストランおよびアガロースからなる群より選択される一員である請求項１に記載の方法。 16．該ゲルのない水溶液が、約 200ミクロンより小さい内径を有する毛細管内に含有されている請求項１に記載の方法。 17．該ゲルのない水溶液が該毛細管にわたって毛細管の長さcm当り少くとも約 50ボルトの電圧を適用することにより、該毛細管を電気泳動的に通過される請求項16に記載の方法。

Claims

【特許請求の範囲】１．ゲルのない水溶液から本質上なる分離媒体中での試料イオン混合物の電気泳動分離における電気浸透性の流れを抑制する方法において、ポリマー 100ｇ当り約0.05またはそれより大きいアミン当量のアミンの結合により誘導体化された親水性ポリマーをゲルのない水溶液に含有せしめることを含んでなる方法。２．該誘導体化された親水性ポリマーが、該親水性ポリマーの全モノマーの合計に対して、少くとも約５％のモル％でアミン結合したモノマーを含有する請求項１に記載の方法。３．該親水性ポリマーが、セルロース誘導体、サッカリドを基礎とするポリマーおよび置換されたサッカリドを基礎とするポリマー、ポリシラン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンからなる群から選択された一員である請求項１に記載の方法。４．該ポリマーが 100ｇの該ポリマー当り約0.05から約0.25当量のアミンの程度で誘導体化されている請求項１に記載の方法。５．該ゲルのない水溶液中の該ポリマーの濃度が約 0.1重量％から約10重量％である請求項１に記載の方法。６．該ポリマーが該ゲルのない水溶液に溶解された唯一のポリマーである請求項１に記載の方法。７．該非−アミン誘導体化親水性ポリマーが、該試料イオンの最低分子量および最高分子量の平均の約 0.2倍から約20倍の範囲内である平均分子量を有している請求項６に記載の方法。８．該ゲルのない水溶液にさらに非−アミン誘導体化親水性ポリマーが約0.05 重量％またはそれより大なる濃度で溶解されている請求項１に記載の方法。９．該非−アミン誘導体化親水性ポリマーの濃度が約 0.1重量％から約30重量％である請求項８に記載の方法。 10．該非−アミン誘導体化親水性ポリマーが、該試料イオンの最低分子量および最高分子量の平均の約 0.2倍から約20倍の範囲内の平均分子量を有している請求項８に記載の方法。 11．該アミンが該ポリマーに第４級アミン基として結合されている請求項１に記載の方法。 12．該第４級アミン基が、第４級トリエタノールアミン基である請求項11に記載の方法。 13．該アミンがアリルグリシジルエーテルから誘導される連結基を介して該ポリマーに結合されている請求項１に記載の方法。 14．該第４級アミン基が、アリルグリシジルエーテルから誘導される連結基を介して該ポリマーに結合されている第４級トリエタノールアミン基である請求項 11に記載の方法。 15．該ポリマーが、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、デキストランおよびアガロースからなる群より選択される一員である請求項１に記載の方法。 16．該ゲルのない水溶液が、約 200ミクロンより小さい内径を有する毛細管内に含有されている請求項１に記載の方法。 17．該混合物が該毛細管にわたって毛細管の長さcm当り少くとも約50ボルトの電圧を適用することにより、該毛細管を電気泳動的に通過される請求項16に記載の方法。