JPH09501573A - 硝酸イオン又は亜硝酸イオン検出用バイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 硝酸イオン又は亜硝酸イオンの存在下に生化学反応を生起し得る生化学物質、並びに硝酸イオン又は亜硝酸イオンの存在下に生化学物質により生起される反応によって直接的又は間接的に生成された変換可能な物質を検出するように配置されたトランスデューサを含むバイオセンサーであって、該生化学物質が、硝酸イオン又は亜硝酸イオンに対するレダクターゼと硝酸イオン又は亜硝酸イオンの還元により酸化される補助物質とを含み、補酵素の酸化により直接的又は間接的に前記物質としてフォトンを生成するフォトルミネセンス成分を含み、前記トランスデューサが光検出器を含むことを特徴とするバイオセンサー。

Description

【発明の詳細な説明】 硝酸イオン又は亜硝酸イオン検出用バイオセンサー 本発明は、バイオセンサー、より特定的には硝酸イオン又は亜硝酸イオン検出 用のバイオセンサーに関する。 硝酸塩及び亜硝酸塩による土地及び地表水の汚染が増大しつつあることに対す る懸念から、硝酸塩及び亜硝酸塩濃度の現地分析及び連続モニターに多大な関心 が寄せられている。これらの化学種は、慣用的には、必要とされる労力の点で費 用がかかり且つ時間がかかる湿式化学分析により溶液中で検出されている。 従来技術において、硝酸塩の検出用に、媒介供与体から電子を受容し得るレダ クターゼ酵素をベースとする電流滴定式バイオセンサーが提案された。しかし、 そのようなバイオセンサーに用いるために提案された媒介供与体、例えば、酸化 還元染料は、比較的に負の酸化還元電位（-400mV〜-700mV）を生ずるために、実 際の試料中に存在する酸素及び他の還元性物質が還元され、該試料中に重大な干 渉電流が発生する。 本発明の目的は、この問題を回避する改良型バイオセンサーを提供することで ある。 本発明の第１の態様によれば、バイオセンサーは、硝酸イオン又は亜硝酸イオ ンの存在下に生化学反応を生起し得る生化学物質、並びに硝酸イオン又は亜硝酸 イオンの存在下に生化学物質により生起される反応によって直接又は間接的に生 成された変換可能な出力物質を検出するように配置されたトランスデューサを含 み、該生化学物質が、硝酸イオン又は亜硝酸イオンに対するレダクターゼ酵素と 硝酸イオン又は亜硝酸イオンの還元により酸化される補酵素とを含み、前記補酵 素の酸化により直接又は間接的に前記出力物質としてフォトンを生成するフォト ルミネセンス成分を含み、前記トランスデューサが光検出器からなることを特徴 とする。 本発明の第２の態様の硝酸イオン又は亜硝酸イオンを検出するためのバイオセ ンサーは、一定量の硝酸又は亜硝酸レダクターゼ酵素；還元形及び酸化形を有し 且つ前記レダクターゼ酵素により還元されてその還元形からその酸化形に変換さ れる一定量の補助物質；前記酸化形の補助物質の存在下に酸化反応を誘発し、そ れによって前記補助物質をその還元形に変換し、該還元形の補助物質の供給量を 維持してレダクターゼ酵素によるさらなる還元を可能にし得る 一定量の他の捕酵素；並びに該第２の補酵素により誘発された酸化の程度を検出 するための手段を含む固定化酵素組成物を含み、該第２の補酵素による酸化の程 度が、酸化形の補助物質の形成の尺度となり、該尺度はレダクターゼ酵素により 還元された硝酸イオン又は亜硝酸イオンの量の尺度となり、前記検出手段は、第 ２の補酵素により誘発された酸化の結果として直接又は間接的に放出されるフォ トンを検出するための光検出器からなる。 バイオセンサーは、硝酸塩の還元により生成された亜硝酸塩が亜硝酸レダクタ ーゼ酵素によりさらに還元されるように、硝酸塩補酵素及び亜硝酸塩補酵素の両 方を含む固定化酵素組成物を含んでいてよい。 本発明は、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを検出する方法を提供し、該方 法は、第１又は第２の態様のバイオセンサーに硝酸イオン又は亜硝酸イオンを暴 露させ、それによってレダクターゼ酵素により硝酸イオン又は亜硝酸イオンを還 元して、補酵素の酸化により出力物質としてフォトンを生成させ、出力物質フォ トンを光検出器により検出することからなる。 前記補助物質は、ＮＡＤＰ⁺に酸化されると同時にレダ クターゼ酵素により還元され、次いで前記第２の補酵素により酸化されてＮＡＤ ＰＨに再還元され、それによってＮＡＤＰＨの供給量を維持するニコチンアミド 酵素ＮＡＤＰＨを含んでいてもよい。 前記第２の補酵素はそれ自体で前記フォトンを生成するか又は該フォトンは補 酵素の化学連鎖中で作用する他の１種以上の補酵素を介して生成され得る。 前記フォトンは酵素ルシフェラーゼにより生成され得る。該酵素は、生化学連 鎖反応において、例えば以下に記載の方法によりＮＡＤＰＨと共に用い得る。 レダクターゼは、該レダクターゼ酵素によりＮＯ₃ ^-又はＮＯ₂ ^-イオンを還元す ることによってＮＡＤＰ⁺に酸化される補酵素としてのニコチンアミド酵素ＮＡ ＤＰＨと共に用いるのが便利である。ＮＡＤＰ⁺の生成は、他の還元剤の酸化に より検出され得、該酸化により、直接又はさらなる酸化−還元反応を誘発するこ とにより前記出力物質のフォトンが生成される。 例えば、ＮＡＤＰ⁺の生成は、例えば、Thermoanaerobium brockiiから得られ るＴＡＤＨのようなアルコールデヒドロゲナーゼの存在下に、アルコール、例え ば第一級又は 第二級アルコール、例えば、ヘキサノール又はオクタノールのような脂肪族アル コールをその対応アルデヒドに酸化することにより検出し得る。そのようにして 生成されたアルデヒドは、酸素及び反応を触媒する酵素ルシフェラーゼの存在下 に、還元形フラビンＦＭＮＨ₂と反応させることにより検出し得る。ルシフェラ ーゼは、Vibrio harveyiから得てもよいし、市販もされている。ルシフェラーゼ は、アルデヒドの存在に対して感受性を有し、ルシフェラーゼが触媒する反応か ら光を放出すればｐｍｏｌ量程度の低い濃度をも検出し得る。放出された光の強 度は、ＮＡＤＰＨに変換されたＮＡＤＰ⁺の尺度となり、該尺度から存在する硝 酸塩又は亜硝酸塩の濃度が求められる。そのような連鎖反応の例を以下に示す。 適当なレダクターゼ酵素は市販されているが、真菌類、微小藻類又は植物から 公知の方法で分離してもよい。該酵素は、硝酸塩の還元の場合には、例えば、ア ルペルギルス種（EC 1.6.6.2）からなってよい。これらの酵素は、亜硝酸塩の還 元の場合には、例えば好気性細菌又は藻類及びより高等植物から公知の方法で容 易に分離し得る大腸菌（EC 1.9.6.1）からなってよい。そのような酵素は、従来 技術 において公知のように、公知の活性化剤、例えばＦＡＤの存在を必要とする。 そのような還元酵素は、例えばEP244,771号明細書に記載のような当業者には 公知の方法で安定化し得る。 本発明のバイオセンサーにおいては、酵素が長期間（例えば数カ月又は数年） その活性を維持し且つセンサーから失われないように、生化学物質をトランスデ ューサの極く近傍に固定化且つ安定化させるのが望ましい。固定化は、従来技術 におけるように、有機若しくは無機担体上での吸着、ゲル中への物理的封入、半 透膜の利用、二官能性若しくは多官能性試薬による架橋、又は直接若しくはリン カーを用いたトランスデューサへの共有結合により達成し得る。 本発明のバイオセンサーは、所与の試料中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオ ンの濃度を測定するための便利な手段を提供する。該バイオセンサーは電流滴定 式ではないので、従来技術の電流滴定式バイオセンサーの場合に経験する干渉電 流の問題がなく、従って、本質的により正確であるように設計し得る。生物発光 バイオセンサーは、検出すべきイオンに対して高い特異性及び高い感受性を有す るというさらなる利点を提供する。さらに、本発明のバイオセ ンサーは、レダクターゼ作用に従って酸化される補助物質例えばＮＡＤＰＨが酸 化−還元サイクル中に存在するので、補助物質の供給量が補充の必要なく一定に 維持されるという利点を有している。 添付図面を参照して本発明の実施態様を説明する。 図１は、本発明を具体化するバイオセンサー装置の側面図である。 図２は、本発明を具体化する別のバイオセンサー装置の側面図である。 図３は、本発明を具体化するバイオセンサーに用い得る生化学反応に係わる概 略プロセスの略図である。 図４は、本発明を具体化するバイオセンサーに用い得る生化学反応に係わる概 略プロセスの略図である。 図５は、本発明を具体化するバイオセンサーに用い得る生化学プロセスの実施 例の略図である。 図６は、本発明を具体化するバイオセンサーに用い得る生化学プロセスの別の 実施例の略図である。 図７は、本発明を具体化するバイオセンサーに用い得る生化学プロセスの実施 例の略図である。 図８は、本発明を具体化するバイオセンサーに用い得る 生化学プロセスの実施例の略図である。 図１に示されているように、バイオセンサー装置では、検査すべき水溶液から なる試料15中に半透膜13でコーティングされたレダクターゼを含む固定化され安 定化された酵素層11を含み、容器17中に保持されている。光学繊維ケーブル19は 、その一方の端部がフェルール21を介して層11と接触するように装着されている 。ケーブル19の他端は光量計（luminometer）25内に組み込まれている光検出器2 3に接続されている。光検出器23からの出力は、光量計25内部の電子機器27によ り処理され、出力信号が表示装置29上に視覚的に示される。 図１に示されている装置を使用する場合、試料15中の検出すべき硝酸イオン又 は亜硝酸イオンを本明細書に記載されている方法の中の1つを用いて層11中の酵 素により還元し、適切な一連の化学反応によりフォトンを生成させるが、フォト ンの数は、還元され、従って存在する硝酸イオン又は亜硝酸イオンの濃度の尺度 となる。フォトンは、ケーブル19を介して光検出器23によって検出され、光検出 器の出力は、表示装置29を作動させて検出された硝酸イオン又は亜硝酸イオンの 濃度レベルを表示するべく用いられる。 図２に示されている装置は図１に示されている装置と類似のものであるが、但 し、符号30で示されている固定化酵素層は図１の光量計の一部を形成し、従って 、該層と光量計との間の光学繊維ケーブルは必要でない。従って、図２において 、試料31中の硝酸/亜硝酸イオンは、半透膜35を介して接触している安定化且つ 固定化された酵素層33により変換され、それによって層33中に生成されたフォト ンは、電子機器39を介して表示装置41上に表示するための出力信号を提供する、 層33に隣接する光検出器37によって直接検出される。 図３は、本発明を具体化するバイオセンサーの動作を示す一般的な反応図式を 示している。検出すべき硝酸イオンは、硝酸レダクターゼ補酵素により亜硝酸塩 に還元され、同時に補助物質がその酸化形に、例えば、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ⁺ に酸化される。酸化形の補助物質の量は、補助物質がその還元形に再還元され ることにより検出され、それと共に、酸化されるべき化合物を酸化された化合物 に酸化する酸化補酵素の作用により酸化形の補助物質の供給量が維持され、生成 された酸化化合物の量は、生物発光酸化検出器により、図１又は図２を参照して 先に記載された方 法の中の１つにより直接的又は間接的に検出される。例えば、酸化されるべき化 合物はアルコールであってよく、酸化補酵素はアルコールデヒドロゲナーゼ、酸 化化合物はアルデヒドであってよい。 図４は、亜硝酸塩の検出用バイオセンサーの動作を図示する一般的な反応図式 を示している。亜硝酸イオンは図３に示されている物質中の硝酸イオンの還元に より生成され得る。あるいは、亜硝酸イオンが既に存在している可能性もある。 図４に示されている反応は、図３に示されている反応と同様に行われるが、但し 、図４では、亜硝酸塩は亜硝酸レダクターゼによりＮＨ₃に還元される。 上記の実施態様に用いるための固定化酵素層の例をこれから説明する。以下の 実施例において、硝酸イオン又は亜硝酸イオンは測定される試料中に存在するも のと仮定する。実施例１：硝酸塩の還元用ルシフェラーゼ生物発光結合系 この実施例は図５に示されている。この場合、レダクターゼはＮＯ₃ ^-をＮＯ₂ ^- に変換し、ＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ⁺に酸化される。該酸化生成物は、市販のTherm oanaerobium brockiiから得られ得る補酵素アルコールデヒドロゲナーゼにより 引き起こされるオクタノールからオクタナールへ の酸化により再還元される。アルコールデヒドロゲナーゼは図５にＴＡＤＨと記 されている。酸素の存在下に、ルシフェラーゼＬＵＣで触媒して、オクタナール を還元フラビンＦＭＨＮ₂と反応させて、図５に示されているような生成物、オ クタン酸、ＦＭＮ酸化還元酵素及び水を生成し、光を発生させ、これを図１又は 図２を参照して記載されている方法で検出し得る。 上記のように、生物発光バイオセンサーにより、酵素反応に起因する高い特異 性と光の量子を記録するに十分な感受性とが約束される。ルシフェラーゼは発光 バクテリアの発光反応を生起させる酵素であるのが好ましく、図５に示されてい るように、酵素分子と還元されたフラビン及び脂肪族アルデヒドとの反応を触媒 して、その分解により、以下のような、 ＦＭＮＨ₂＋ＲＣＨＯ＋Ｏ₂ → ＦＭＮ＋ＲＣＯＯＨ＋Ｈ₂Ｏ＋ｈν 〔式中、ＲＣＨＯは脂肪族アルデヒドを表し、ｈνは光を表す〕 かなり高い量子収率（〜10％）で発光を得るようなエネルギーを供給する持続性 中間体を形成するのに用い得る。 還元フラビンは、その場で、特異的ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：ＦＭＮ酸化還元酵素 ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋ＦＭＮ＋Ｈ⁺→ＮＡＤ（Ｐ）⁺ＦＭＮＨ₂ により生成され、それによってＮＡＤＰ⁺依存性アルコールデヒドロゲナーゼを 介して標的系に結合する。実施例２：亜硝酸塩還元用ルシフェラーゼ生物発光結合系 この実施例は図６に示されている。該プロセスは、図５に示されている硝酸塩 の検出法に類似のものであるが、但し、硝酸レダクターゼの代わりに亜硝酸レダ クターゼを用い、亜硝酸塩の還元によりアンモニアが生成される。 図６に示されている方法によって生成された放出光を図１又は図２に示されて いる方法で検出する。実施例３：硝酸塩還元用代替系 この実施例は図７に示されている。これは、図５に示されているものの代替例 である。該プロセスは、図５に示されている方法に類似しているが、但し、ＴＡ ＤＨによるオクタノールからオクタナールへの酸化は、同様なデカノールからデ カナールへの酸化、それに続くデカン酸への酸化に置き換えられている。実施例４ この実施例は図８に示されている。これは図６に示されているものの代替例で ある。該方法は、図７に示されている方法に類似しているが、但し、最初の還元 段階は亜硝酸レダクターゼによる亜硝酸塩からＮＨ₃への還元である。 実施例３及び４において、デカノールはＺ−テトラデカノールであってよく、 デカナールはＺ−テトラデカナールであってよい。アルコールデヒドロゲナーゼ 補酵素はThermoanaerobium ethanolicus alcohol dehidorogenaseであってよい 。 実施例１から４において、生成されたＦＭＮは、ＮＡＤＨ特異的ＦＭＮ酸化還 元酵素によりＦＭＮＨ₂に再還元され、それによってＦＭＮＨ₂の供給量が維持さ れ得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 21/76 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 21/76 31/00 0276−2Ｊ 31/00 Ｊ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．硝酸イオン又は亜硝酸イオンの存在下に生化学反応を生起し得る生化学物質 、並びに硝酸イオン又は亜硝酸イオンの存在下に生化学物質により生起された反 応によって直接的又は間接的に生成された変換可能な物質を検出するように配置 されたトランスデューサを含むバイオセンサーであって、前記生化学物質が、硝 酸イオン又は亜硝酸イオンに対するレダクターゼ、硝酸イオン又は亜硝酸イオン の還元により酸化された補助物質及び補酵素の酸化により直接的又は間接的に前 記物質としてフォトンを生成するフォトルミネセンス成分を含み、前記トランス デューサが光検出器を含むことを特徴とするバイオセンサー。 ２．一定量の硝酸塩又は亜硝酸レダクターゼ酵素；還元形及び酸化形を有し且つ 前記レダクターゼ酵素により還元されてその還元形からその酸化形に変換される 一定量の補助物質；前記酸化形の補助物質の存在下に酸化反応を誘発し、それに よってその還元形に変換されて還元形の該補助物質の供給量を維持してレダクタ ーゼによるさらなる還元を可能にし得る一定量の他の補酵素；並びに該第２の補 酵素に より誘発される酸化の程度を検出するための手段からなる固定化酵素組成物を含 み、該第２の補酵素による酸化の程度が、酸化形の補助物質の形成の尺度となり 、該尺度がレダクターゼ酵素により還元された硝酸イオン又は亜硝酸イオンの量 の尺度となり、前記検出手段が、該第２の補酵素により誘発された酸化の結果と して直接的又は間接的に放出されたフォトンを検出するための光検出器からなる 請求項１に記載のバイオセンサー。 ３．バイオセンサーが、硝酸塩の還元により生成された亜硝酸塩が亜硝酸レダク ターゼによりさらに還元されるように、硝酸塩補酵素及び亜硝酸塩補酵素の両方 を含む固定化酵素組成物を含む請求項２に記載のバイオセンサー。 ４．酸化される前記補助物質が、ＮＡＤＰ⁺に酸化されると同時にレダクターゼ により還元されるニコチンアミド酵素ＮＡＤＰＨからなる請求項１から３のいず れか一項に記載のバイオセンサー。 ５．前記フォトンが、補酵素の化学連鎖において作用する他の１種以上の補酵素 を介して生成される請求項１から４のいずれか一項に記載のバイオセンサー。 ６．前記フォトンが、生化学連鎖反応においてＮＡＤＰＨ と共に用いられる酵素ルシフェラーゼにより生成される請求項１から５のいずれ か一項に記載のバイオセンサー。 ７．ＮＡＤＰ⁺の生成が、アルコールデヒドロゲナーゼの存在下に有機アルコー ルをその対応アルデヒドに酸化することにより検出される請求項２から６のいず れか一項に記載のバイオセンサー。 ８．アルデヒドが、酸素及び反応を触媒する酵素ルシフェラーゼの存在下に還元 形フラビンＦＭＮＨ₂と反応することにより検出される請求項７に記載のバイオ センサー。