JPH09500202A

JPH09500202A - アルツハイマー病の細胞試験

Info

Publication number: JPH09500202A
Application number: JP6524573A
Authority: JP
Inventors: アルコン，ダニエル・エル; エトチェバーリガレイ，レン; 悦朗伊藤; ギブソン，ガリー・イー
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1993-05-03
Filing date: 1994-05-02
Publication date: 1997-01-07
Also published as: ATE155888T1; DE69404460T2; DE69404460D1; CA2162048A1; AU6778494A; WO1994025872A1; ES2108455T3; EP0697111A1; AU689776B2; GR3025126T3; US5580748A; EP0697111B1; DK0697111T3; HK1001500A1

Abstract

(57)【要約】本発明はヒト細胞を用いるアルツハイマー病の診断法である。詳細には、本方法はアルツハイマー病患者と正常なドナーからの細胞におけるカルシウムチャンネル間の差、および細胞内カルシウム水準を高めることが知られている化学物質に応答したアルツハイマー病細胞と正常細胞間の細胞内カルシウム濃度の差を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】アルツハイマー病の細胞試験発明の分野本発明は、アルツハイマー病の診断法に関するものである。本方法は、健康なドナーとアルツハイマー病を伴うものとの間に新たに見出された相異を利用する。１方法においては、機能性カリウムチャンネルの存在の相異を評価する。他の方法においては、カリウムチャンネル遮断薬による減極に応答した細胞内カルシウム水準の相異を評価する。さらに他の方法においては、細胞内貯蔵所からカルシウムを放出させることにより細胞内カルシウム水準を上昇させることが知られている化学物質に応答した細胞内カルシウム水準の相異を評価する。発明の背景アルツハイマー病は多量の脳の特異的ニューロンサブポビュレーションの喪失を伴い（シムズ（Ｓｉｍｅｓ，Ｎ．Ｒ.）ら，（１９８７）ＡｎｎａｌｓｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ２１：４５１）、記憶喪失が最も普遍的な症状である（カッツマン（Ｋａｔｚｍａｎ，Ｒ，）（１９８６）ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ３１４：９６４）。アルツハイマー病は遺伝的原因に関連があるとされてきた（シェレンバーグ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．Ｄ．）ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：６６８；リー（Ｌｉ，Ｇ．）ら（１９９１）ＰｓｙｃｈｉａｔｒｉｃＣｌｉｎｉｃｓｏｆＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａ１４：２６７；セント・ジョージ−ヒスロップ（Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ，Ｐ．Ｈ．）ら（１９８９）ＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＡｇｉｎｇ１０：４１７；セント・ジョージ−ヒスロップ（Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ，Ｐ．Ｈ．）ら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：８８５）。早期に発現するこの疾病の家族性の形態は、染色体２１に遺伝的欠陥を示す。セント・ジョージ−ヒスロップ（Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ−Ｈｙｓｌｏｐ，Ｐ．Ｈ．）ら（１９８７））。ニューロンの喪失をもたらす細胞性の変化、およびこの疾病の原因となる病因は依然として分かっていない。提唱された原因には下記のものが含まれる：環境因子（パール（Ｐｅｒｌ．Ｄ．Ｐ．）（１９８５）ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ６３：１４９；カッツマン（Ｋａｔｚｍａｎ，Ｒ，）（１９８６））、これには金属毒性が含まれる（パール（Ｐｅｒｌ．Ｄ．Ｐ．）ら（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２０８：２９７）、β−アミロイド蛋白質代謝の欠陥（ショージ（Ｓｈｏｊｉ，Ｍ．）ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：１２６；ヨアヒムおよびセルケ（Ｊｏａｃｈｉｍ，Ｃ．Ｌ．，Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．）（１９９２）ＡｌｚｈｅｉｍｅｒＤｅｓｅａｓｅＡｓｓｏｃ．Ｄｉｓｏｒｄ．６：７；コシク（Ｋｏｓｉｋ，Ｋ．Ｓ．）（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：７８０；セルケ（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．）（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ６：４８７；ハーディおよびアルソップ（Ｈａｒｄｙ，Ｈ．，Ａｌｌｓｏｐ，Ｄ．）（１９９１）ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ１２：３８３）、ならびに異常なカルシウムホメオスタシスおよび／またはカルシウム活性化されたキナーゼ（マトソン（Ｍａｔｔｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．）ら（１９９２）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１２：３７６；ボーデン（Ｂｏｒｄｅｎ，Ｌ．Ａ．）ら（１９９１）ＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＡｇｉｎｇ１３：３３；ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｅ．）ら（１９８９）ＡｎｎａｌｓｏｆＮｅｗＹｏｒｋＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ５６８：２６２；ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．）ら（１９８８）ＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＡｇｉｎｇ９：２６１；ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．）ら（１９８６）ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ８３：７９９９）。アルツハイマー病は神経病理学的変化に関しては十分に解明されている。しかし異常性は末梢組織において報告されており、これはアルツハイマー病が全身性障害であり、中枢神経系の病変が最も顕著であるという可能性を支持する（リゾポウロス（Ｒｉｚｏｐｏｕｌｏｓ．Ｅ．）ら（１９８９）ＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆＡｇｉｎｇ１０：７１７；ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）（１９８６））。カリウムチャンネルは記憶蓄積に際して変化することが認められている（エッチェベリカルイ（Ｅｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙ．Ｒ.）ら（１９９２）ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ８９：７１８４；サンチェ−アントルおよびアルコン（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ａｎｄｒｅｓ，Ｊ．Ｖ．，Ａｌｋｏｎ，Ｄ．Ｌ．）（１９９１）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６５：７９６；コリン（Ｃｏｌｌｉｎ，Ｃ．）ら（１９８８）ＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓＪｏｕｒｎａｌ５５：９５５；アルコン（Ａｌｋｏｎ，Ｄ．Ｌ．）ら（１９８５）ＢｅｈａｖｉｏｒａｌａｎｄＮｅｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ４４：２７８；アルコン（Ａｌｋｏｎ，Ｄ．Ｌ．）（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２６：１０３７）。この所見をアルツハイマー病患者におけるほとんど普遍的な記憶喪失と関連づけることにより、アルツハイマー病の病変の可能性のある部位としてのカリウムチャンネルの機能の研究がなされ、そして本発明に至った。細胞内の電流を調べるために、いわゆるパッチクランプ法（ｐａｔｃｈｃｌａｍｐｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）およびその改良法が開発された。この方法はチャンネルによるイオン伝達を調べるために用いられる。これらの電流を測定するためには、極めて密なシールが達成されるように細胞膜をパッチミクロピペットの開口に密着させる。このシールは電流がパッチミクロピペットの外側へ漏出するのを防止する。得られたシールにおける高い電気抵抗を利用して分解度の高い電流測定を行い、膜に電圧を印加することができる。種々の形態のパッチクランプ法を採用しうる（サクマンおよびネッカー（Ｓａｋｍａｎｎ，Ｂ，Ｎｅｃｋｅｒ，Ｅ.）（１９８４）ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ４６：４５５）。現在、アルツハイマー病の実験室的診断試験法はない。従ってアルツハイマー病患者、正常な老化した人々、および他の神経変性性疾患、たとえばパーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、ヴェルニッケ−コルサコフ病または精神分裂病に罹患した人々の間の相異を迅速かつ明瞭に区別する方法が大いに要望されている。幾人かの研究者が繊維芽細胞におけるカルシウムイメージ化測定法（ｃａｌｃｉｕｍｉｍａｇｉｎｇｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）をアルツハイマー病の診断に際して臨床的に使用しうる可能性があることを示唆し（ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）ら，１９８６，１９８８，前掲）、他の研究者は同様な細胞系および手法を用いて、アルツハイマー病と正常な対照との繊維芽細胞のカルシウム水準に差がないことを示した（ボーデン（Ｂｏｒｄｅｎ）ら，１９９１，前掲）。従って後者の研究は前者の研究の所見を否定している。患者から摘出された細胞を用いる本発明のアルツハイマー病診断法は要望されていたものであり、現在著しく複雑であるアルツハイマー病の臨床診断法を大幅に改良するであろう。これらの方法はアルツハイマー病を伴う患者を他の神経変性性疾患を伴う患者と区別しうるので、特に重要である。発明の概要本発明は患者から摘出された細胞を用いるアルツハイマー病アッセイ法を提供する。本発明の１態様においては、特定のカリウムチャンネルの存否を調べる。健康な対照からの細胞においては、１１３ｐＳ（ピコシーメンス）および１６６ｐＳのスロープ電導度（ｓｌｏｐｅｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）をもつカリウムチャンネルが存在し、かつ機能している。アルツハイマー病細胞においては、１１３ｐＳのカリウムチャンネルが存在しないか、または機能しない。本発明の第２態様においては、１１３ｐＳカリウムチャンネルに特異的なカリウムチャンネル遮断薬が細胞内カルシウム水準に及ぼす影響を評価する。この方法においては、細胞内カルシウム水準は正常細胞の場合はカリウムチャンネル遮断薬に応答して上昇するが、アルツハイマー病を伴うドナーからの細胞の場合には上昇しないことが見出された。好ましいカリウムチャンネル遮断薬は、最終的な細胞外濃度１００ｍＭのテトラエチルアンモニウム（“ＴＥＡ”）である。ただし１１３ｐＳカリウムチャンネルを特異的に遮断する他のカリウムチャンネル遮断薬も使用しうる。さらに、ＴＥＡを用いる場合、ＴＥＡの他の最終濃度も、その水準のＴＥＡが正常細胞において細胞内カルシウム水準を上昇させるがアルツハイマー病を伴うドナーからの細胞においては上昇させない限り採用しうる。本発明の第３態様においては、患者からの試料細胞を、細胞内貯蔵部位からカルシウムを放出させるのに十分な量の細胞内カルシウム放出活性化物質と接触させ、生じた細胞内カルシウム水準上昇を測定する。この態様においては、正常細胞およびアルツハイマー病患者からの細胞が両方とも細胞内カルシウム水準の上昇を示す；しかしこの上昇はアルツハイマー病患者の場合の方がはるかに大きい。細胞内カルシウム水準を上昇させるためにイノシトール−１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ₃）活性化物質を用いる場合、好ましい態様においては最終的な細胞外濃度１μｍで添加されるボンベシンを用いる。ただし他の最終濃度も採用しうる。実施例に示すように、本発明の第２および第３態様の組み合わせを連続使用して、偽陽性または偽陰性を伴わない極めて正確なＡＤ診断法を提供することができる。さらにこれらの方法は、アルツハイマー病を伴う患者を他の神経変性性疾患を伴う患者と区別しうる。パーキンソン病、精神分裂病、ハンティングトン舞踏病、およびヴェルニッケ−コルサコフ病はＴＥＡまたはボンベシンで処置した場合、正常細胞の応答を示す。現時点では、本発明方法により検出される欠損がアルツハイマー病の臨床的開始の前に出現するか、またはそれと同時に出現するかは分かっていない。しかし前者が真実である場合、本発明方法はアルツハイマー病の検出に際して診断のほか予想における有用性も備えていると期待される。図面の簡単な説明図１Ａ−１Ｂ。１１３ｐＳチャンネル。（ＩＡ）。アルツハイマー病および対照の繊維芽細胞からの細胞付着記録。等しい反応速度をもつ約４．５ｐＡの単位電流サイズ（ｕｎｉｔａｒｙｃｕｒｒｅｎｔｓｉｚｅ）（０ｍＶピペット電位）のカリウムチャンネルが同年齢対照（ＡＣ）および若齢対照（ＹＣ）の繊維芽細胞に見られたが、ＡＤ繊維芽細胞の記録には全く存在しなかった（１Ａ、下図）。下向きの振れは開放状態を表す。（１Ｂ）。Ｉ／Ｖの関係およびスロープ電導度。Ｉ／Ｖの関係およびスロープ電導度（線形回帰により判定）は、探査した範囲の電圧内ではほぼ等しく、ＹＣ繊維芽細胞については１１３．２±０．９ｐＳ（平均±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）、ｎ＝８）であり、ＡＣ繊維芽細胞については１１２．９±３．２ｐＳ（ｎ＝７）であった。図２Ａ−２Ｂ。１６６ｐＳチャンネル。（２Ａ）。アルツハイマー病および対照の繊維芽細胞からの細胞付着記録。第２チャンネル（１６６ｐＳ）は同一条件下で３群（ＡＤ、ＹＣおよびＡＣ）すべての繊維芽細胞から記録された。（２Ｂ）。Ｉ／Ｖの関係およびスロープ電導度。Ｉ／Ｖの関係およびスロープ電導度（ＹＣ＝１７４±５．７ｐＳ，ｎ＝４；ＡＣ＝１６９．２±２．８ｐＳ，ｎ＝４；ＡＤ＝１５７．６±４．７ｐＳ，ｎ＝６（平均±Ｓ．Ｄ．）は群全体においてほぼ等しかった。膜電位は対照（−４２．６±５．４，平均±Ｓ．Ｄ．，ｎ＝７）およびＡＤ（−４５．４±６．９，ｎ＝３）繊維芽細胞において等しかった。図３Ａ−３Ｃ。（３Ａ）および（３Ｂ）。５０ｍＭ塩化カリウムの添加に応答する細胞の％、および応答する細胞の平均［Ｃａ²⁺］_i（ｎＭ）。高カリウムにより誘発された減極が３群すべてにおいて（ＡＤＮ＝１３細胞系；ＡＣＮ＝１０，ＹＣＮ＝６）［Ｃａ²⁺］_i上昇（少なくとも１００％の増大）を引き起こした。応答する細胞の割合および［Ｃａ²⁺］_iピーク値は、ＹＣ（ｎ＝１８３細胞）繊維芽細胞においてはＡＣ（ｎ＝２９９）およびＡＤ（ｎ＝２６８）繊維芽細胞と比較して有意に高かった（χ²＝１４.２２，ｐ＜０.００１）（３Ａ）および（３Ｂ）。（３Ｃ）。５０ｍＭＫＣｌの添加後の細胞におけるＣａ²⁺応答の経時的試料追跡。［Ｃａ²⁺］_iピークは刺激の１０−１５秒後に起こり、１００秒後には基礎水準に戻る。外部［Ｃａ²⁺］を低下させた場合［“公称無Ｃａ²⁺ ”溶液、５ｍＭＥＧＴＡを添加(推定遊離Ｃａ²⁺＝０.０４μＭ)］、またはＣａ²⁺チャンネル遮断薬（０．１ｍＭＬａＣｌ₃、１０ｍＭＣｏＣｌ₂、１０ｍＭＮｉＣｌ₂、１０ｍＭＣｄＣｌ₂、または１０μＭニフェジピン）を刺激前に添加した場合（“０Ｃａ²⁺”）には、応答が見られなかった。図４Ａ−４Ｃ。ＴＥＡに応答した［Ｃａ²⁺］_iの上昇。（４Ａ）ＴＥＡの添加に応答する細胞の％および（４Ｂ）ＴＥＡ処理後の細胞における平均［Ｃａ²⁺］_i 応答。１ｍＭＴＥＡの適用は、［Ｃａ²⁺］_iをＹＣ繊維芽細胞（ｎ＝１３０細胞）においては上昇させたが、ＡＣ繊維芽細胞（ｎ＝１８４）またはＡＤ繊維芽細胞（ｎ＝１９５）においては上昇させなかった。１０ｍＭＴＥＡは、［Ｃａ²⁺ ］_iをＹＣ繊維芽細胞（ｎ＝１７６細胞）、ＡＣ繊維芽細胞（ｎ＝２３１）において上昇させたが、ＡＤ繊維芽細胞（ｎ＝２０４）においては上昇させなかった（χ１３４．００，ｐ＜０．００１）。同様に１００ｍＭＴＥＡは、［Ｃａ²⁺ ］_iをＹＣ繊維芽細胞（ｎ＝５３２細胞）、ＡＣ繊維芽細胞（ｎ＝４１７）において上昇させたが、ＡＤ繊維芽細胞（ｎ＝７３８）においては上昇させなかった（χ²２３１．４４，ｐ＜０．００１）（表２も参照されたい）。基礎［Ｃａ² ⁺ ］_i水準は実質的に同じであった（Ｓ．Ｅ．（標準誤差）＜２ｎＭ）から、標準誤差の棒はこれらの群についての算術平均を表す棒と区別できない。（４Ｃ）。Ｃａ²⁺ 応答の経時変化。［Ｃａ²⁺］_iビークは、ＹＣおよびＡＣ繊維芽細胞においては１００ｍＭＴＥＡ添加の２０−３０秒後に起こり、１００秒後には基礎水準に戻る。ＡＤ細胞においては基準（系の細胞の１０％が＞１００％の上昇を伴う）を満たす応答が見られなかった点を留意されたい。同様に、対照細胞において外部［Ｃａ²⁺］を低下させた場合にも応答がなかった。図５Ａ−５Ｂ。（５Ａ）。細胞外カルシウムの不在下で１μｍボンベシンにより誘発されたＣａ²⁺動態化。（５Ｂ）。１μＭボンベシン適用の４２秒後のＣａ²⁺ 応答。ＡＤ細胞における［Ｃａ²⁺］_i水準はＡＣおよびＹＣ細胞の場合よりはるかに高い。細胞系の数（Ｎ）はＡＤ、ＡＣおよびＹＣにおいてそれぞれ９、８および６である。数値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（平均値の標準誤差）である。図６Ａ−６Ｂ。（６Ａ）。細胞外カルシウムの存在下で１μｍボンベシンにより誘発されたＣａ²⁺応答。１μｍボンベシンは、細胞外２．５ｍＭＣａＣｌ₂ の存在下で［Ｃａ²⁺］_iの即時ピークを誘発し、続いてＹＣおよびＡＣ細胞については持続相を伴ったが、ＡＤ細胞については伴わなかった。矢印は薬物投与を示す。（６Ｂ）。ボンベシン適用の９０秒後に見られた差を示す棒グラフである。正常な細胞外カルシウム（２．５ｍＭ）の存在下で、対照細胞においては初期のボンベシン応答に続いて持続的カルシウム流入が起こったが、ＡＤ繊維芽細胞においては全く起こらなかった。ボンベシン適用の９０秒後に見られた差が示され、ｐ＜０．００１の有意水準を有する。発明の詳細な記述本発明はアルツハイマー病（ＡＤ）の診断法に関するものである。本方法は、ＡＤ患者の細胞における特定のカリウムイオンチャンネルの不在；ＡＤ患者の細胞中に存在しないカリウムイオンチャンネルに特異的なカリウムチャンネル遮断薬に応答したＡＤおよび非ＡＤ細胞における細胞内カルジウムイオン濃度の差；ならびに細胞内カルシウム放出の活性化物質、たとえばイノシトール−１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ₃）の活性化物質に応答したＡＤおよび非ＡＤ細胞間の差を検出することに基づく。本発明の第１態様は、ＡＤに罹患していない人々からの細胞はパッチクランプ法により測定して１１３ｐＳ（ビコシーメンス）および１６６ｐＳの電導度をもつ（少なくとも）２種類の機能性カリウムチャンネルを有するという本発明者らによる所見に基づく（実施例１参照）。１１３ｐＳチャンネルはＡＤを伴う人々においては存在しないか、または機能しない。本発明の第１態様は、患者の細胞が機能性１１３ｐＳカリウムチャンネルを有するか否かを測定することによるＡＤの診断を伴う。機能性１１３ｐＳカリウムチャンネルの存在は、その患者がＡＤを伴わないことを示す。しかし機能性１１３ｐＳカリウムチャンネルの不在は、その患者が実際にＡＤを伴うことを示す。本発明のこの態様においては、細胞の機能性１１３ｐＳカリウムチャンネルを検出するために細胞における電導度を記録するのに適した方法を用いなければならない。細胞における電導度をを測定しうるいかなる手法を採用してもよい。一例には細胞内ミクロ電極記録法（間接的測定）、二ミクロ電極式電圧クランプ法、および単一ミクロ電極式電圧クランプ法が含まれる。本明細書に記載するパッチクランプ法は小さな構造体における電導度を測定するために好ましい方法である。本発明の１態様においては、細胞付着方式のパッチクランプ法を採用してカリウムチャンネルの存在を記録し、裏返し（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）および表返し（ｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔ）のパッチ形状を用いて種々の化学物質に対するカリウムチャンネルの感受性を記録する。本発明の第２態様はＡＤを診断するための他の方法に関するものである。この第２態様においては、１１３ｐＳチャンネルを遮断するが、１６６ｐＳチャンネルを遮断しないカリウムチャンネル遮断薬と、細胞を接触させる。この遮断薬は実質的に１１３ｐＳチャンネルを遮断するが、実質的に１６６ｐＳチャンネルを遮断しないものであってもよい。それらの遮断薬の一例は、ＴＥＡ、すなわちテトラエチルアンモニウムである。この遮断薬は非ＡＤ細胞において細胞内Ｃａ²⁺ 濃度を一過性に上昇させる作用を示す。ＡＤ細胞においては、この遮断薬は実質的に作用を示さない（観察誤差または技術的誤差内での変動が許容される）。これに対し非ＡＤ細胞においては、細胞内カルシウムイオン濃度は１００ｍＭＴＥＡに暴露されたのち数倍上昇する（図４Ｂ参照）。細胞内Ｃａ²⁺濃度は種々の方法で、たとえば蛍光指示薬もしくは吸光指示薬の添加により、またはＣａ²⁺電極の使用により測定することができる。操作の容易さのため、蛍光指示薬を用いることが好ましい。本発明のこの態様においては、細胞をまず、カルシウム濃度に比例した強度で蛍光を発するＣａ²⁺指示薬、たとえばクインまたはフラ２と共に培養する。次いで、１１３ｐＳチャンネルを遮断するが、１６６ｐＳチャンネルを遮断しない効力をもつ特定のカリウムチャンネル遮断薬と、細胞を接触させる。カリウムチャンネル遮断薬の添加前および後の細胞の蛍光強度を測定する。ＡＤに罹患していない患者からの細胞においては、蛍光強度が急速に上昇し、ピークに達し、次いで元に戻る（図４Ｃ）。これは、遮断薬がカルシウムイオン濃度を一過性に上昇させる作用をもつことを示す。ＡＤ患者からの細胞においては、蛍光強度は遮断薬の添加前と後で実質的に同じである。これは、ＡＤ患者においては１１３ｐＳチャンネルが存在しないか、または機能しておらず、従って１１３ｐＳチャンネルを遮断するが、１６６ｐＳチャンネルを遮断しないカリウムチャンネル遮断薬は、ＡＤ細胞に対して作用しないという事実を反映する。上記のように本発明の第２態様に用いられる特定のカリウムチャンネル遮断薬は、１１３ｐＳカリウムチャンネルを遮断する効力をもつが、１６６ｐＳカリウムチャンネルに対してはほとんど、または全く作用しないものである。それらの遮断薬の一例は、生物学的に適合性の対向アニオンを含むＴＥＡである。好ましくは対向イオンはクロリドである。他の適切なカリウムチャンネル遮断薬は下記の方法で容易に見出すことができる。実施例１に記載したパッチクランプ法を用いて、生存ヒト細胞において１１３ｐＳおよび１６６ｐＳチャンネルを検出する。細胞を含む培養物に候補となるカリウムチャンネル遮断薬を添加し、再度パッチクランプ法を用いる。１６６ｐＳチャンネルはなお機能しているが、１１３ｐＳチャンネルは機能していない場合、その候補遮断薬は本発明に用いるのに適している。候補となるカリウムチャンネル遮断薬には、既知のカリウムチャンネル遮断薬であるチャリブドトキシン（ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ）、アパミン、デンドロトキシン（ｄｅｎｄｒｏｔｏｘｉｎ）、カリドトキシン（ｋａｌｉｄｏｔｏｘｉｎ）、ＭＣＤ−ペプチド、スシラトキシン（ｓｃｙｌｌａｔｏｘｉｎ）、バリウム、セシウム、レイウロトキシン（ｌｅｉｕｒｏｔｏｘｉｎ）Ｉ、およびノキシウストキシン（ｎｏｘｉｕｓｔｏｘｉｎ）が含まれる。実施例２に示すように、１０−１００ｍＭのＴＥＡ濃度が良好に作用した。ＡＤおよび非ＡＤ対照細胞を用いてこの作用濃度の範囲を拡張するのは容易である。実施例２は、特定のカリウムチャンネル遮断薬ＴＥＡを使用し、細胞内カルシウムイオンに対する作用を測定するための本発明の第２態様を例示する。この方法は極めて簡単にイエスまたはノーの回答が得られ、診断を行うのに例示したような複雑な装置を必要としない。特定のカリウムチャンネル遮断薬との接触の結果として細胞内カルシウムイオン濃度が上昇したか否かを教示する方法はいずれも診断を与えるのに十分であろう。好ましい方法においては、蛍光カルシウムイオン指示薬を使用する。この場合、細胞と特定のカリウムチャンネル遮断薬との接触の結果として指示薬の蛍光が増大したか否かを教示する方法はいずれも十分であろう。用いる方法はいずれも短期間での測定を可能にするものでなければならない。カルシウムイオンの流入は遮断薬との接触後、短期間でピークに達し、次いでベースライン値まで低下する。実施例２においては、ピークに達するのに要する時間は１分未満である。蛍光カルシウムイオン指示薬を検出するための簡単な方法は、蛍光光度計、すなわちカルシウムイオン指示薬を励起するための光源および蛍光強度を測定するための測光計を備えた装置を使用するものである。蛍光光度計は周知であり、市販されている。最も簡単な水準の場合、カルシウムイオン指示薬を患者から採取した細胞（新鮮なもの、または培養により増殖させたもの）に添加する。指示薬（約２μＭ濃度）と接触させた約１時間後に、懸濁液状の細胞を蛍光光度計に装入し、指示薬からの蛍光の強度を測定する。次いで選ばれたカリウムチャンネル遮断薬を添加する；ＴＥＡを用いる場合、それは約１００ｍＭの濃度になるように添加される。再び蛍光を測定する。２０−４０秒以内の強度がＴＥＡ添加前と実質的に等しい場合（ＴＥＡ添加による容量の変化を考慮して），ＡＤ陽性の診断を行う。強度が３０秒以内に増大し、さらに３０秒後に低下した場合、その患者はＡＤを伴わない。以上に概説した簡単な方式を改良するのは当業者が容易になしうる範囲のものである。たとえば２個の試料ホルダーを備えた蛍光光度計を用いることができ、その場合は２個の試料からの蛍光の差を測定する。各試料ホルダー中の患者の細胞の均等な試料（指示薬と共にインキュベートしたのち）から出発して、選ばれたカリウムチャンネル遮断薬を一方の試料にのみ添加する。差信号に変化がない（すなわち本質的にゼロのままである）場合、ＡＤの診断を行う。差信号が有意に変化した場合、その患者はＡＤを伴わない。示差法の利点は、それが組み込まれた対照（ｂｕｉｌｔｉｎｃｏｎｔｒｏｌ）を備えており、これによって測定精度が増大することである。選ばれたカリウムチャンネル遮断薬を自動的に添加し、２以上の測定を一度に行うこと；すなわち商業的医療実験室のために本方法を自動化することも、当業者が容易になしうる範囲のものである。本明細書に教示される方法を用いて診断を行う前に、非ＡＤおよびＡＤ対照細胞（これらは市販されている）を用いて実験室でその装置および条件に対して本方法を最適化すべきである。本発明の第３の態様は、ＡＤを診断するためのさらに他の方法である。この方法は、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ₃）を活性化するか、または他の形で細胞内貯蔵部位からのカルシウム放出を誘発する物質の作用に関するものである。このような貯蔵部位には、小胞体その他の、ＩＰ₃に対する受容体を有する細胞小器官が含まれる。好ましいＩＰ₃活性化物質はボンベシンである。本発明に有用な、細胞内貯蔵所からのカルシウム放出を活性化する他の物質には、トロンビン、ブラジキニン、プロスタグランジンＦ_2αおよびバソプレッシンが含まれる。たとえばベリッジおよびイルビン(Ｂｅｒｒｉｄｇｅ,Ｍ. Ｊ.,Ｉｒｖｉｎｅ,Ｒ.Ｆ.)(１９８４)Ｎａｔｕｒｅ３１２:１３５を参照されたい。ＡＤに罹患していない人々からの細胞およびＡＤに罹患している人々からの細胞が両方ともボンベシンに応答して一過性にカルシウムイオンを放出するが、生じる細胞内カルシウム濃度はＡＤ細胞の場合の方が非ＡＤ細胞の場合よりはるかに高いことが見出された。この判定は、本発明の第２態様に関して先に述べたように細胞内カルシウムイオン濃度を測定するためのいかなる方法を用いても容易になしうる。この場合も、蛍光カルシウム指示薬の使用が好ましい方法である。蛍光強度を測定するための前記と同じ試験機器、たとえば蛍光光度計を使用しうる。この方法においては、非ＡＤおよびＡＤ細胞を対照として用いて蛍光測定装置を標準化することもできる。こうして、その後は患者の細胞のみの測定により診断を行うことができる。あるいは患者の細胞を対照としての非ＡＤ細胞と比較することができる。実施例３はＩＰ₃活性化物質を使用し、それらが活性化物質との接触後に細胞内貯蔵部位から細胞質ゾル内へのカルシウムイオン放出に及ぼす作用を測定するＡＤ診断法に関する本発明の第３態様を例示する。放出されるカルシウムの量は、非ＡＤ細胞と比較してＡＤ細胞の場合の方が多い。細胞内カルシウム濃度の上昇は一過性である。すなわち濃度は活性化物質との接触の直後にピークに達し、９０秒でベースライン値に戻る。この作用は細胞外カルシウムイオン濃度がゼロまたはほぼゼロである場合（これは一般に細胞を公称無カルシウムＢＳＳで洗浄することにより達成されるが、細胞外カルシウムイオンの作用を停止させ、もしくは無効にする他の方法、たとえばＥＤＴＡの添加、またはカルシウムチャンネル遮断薬、たとえばニフェジピンの添加をそれぞれ採用しうる）に増強される。ＩＰ₃活性化物質、たとえばボンベシンとの接触後に、ＡＤ細胞の細胞内カルシウムイオン濃度はより高いピーク値に達し、そしてベースライン値に戻るのに若齢または老齢対照細胞より長時間を要する（図５Ａ）。実施例３に記載した実験計画において、ボンベシンを細胞に添加した４２秒後にＡＤ細胞および対照細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の差は最大になること、ならびにその時点で、すなわちボンベシンを適用した４２秒後に、カルシウムイオンの濃度はＡＤ細胞においては常に３００ｎＭより高く、対照の非ＡＤ細胞においては常に３００ｎＭより低かった（図５Ｂ）。ＡＤおよび非ＡＤ繊維芽細胞の基礎水準は共に８０ｎＭ±０．５ｎＭであった。ただし対照値が８０ｎＭと異なり、３００ｎＭより高いか、または低い基準水準のカルシウム信号が必要となる可能性があることを留意すべきである。さらに測定条件の差によって、ＡＤおよび非ＡＤ繊維芽細胞のカルシウム信号間の最大差を示すために４２秒より長いか、または短い時間を必要とする可能性がある。この場合も本明細書に例示した複雑な方法および装置を使用する必要はない。ＡＤを診断するための本発明方法は、より簡単に実施することができる。細胞内カルシウムの絶対濃度を測定する必要はない；その相対値の測定も有効である。実施例３において、休止（すなわち活性化されていない）細胞における細胞内カルシウムイオン濃度の基礎水準は、ＡＤおよび対照の非ＡＤ細胞の両方において同じく８０ｎＭ±０．５ｎＭであった。従ってＡＤおよび非ＡＤ細胞間の濃度差が最大である時点で（すなわちボンベシンおよび本発明者らの装置を用いた場合は４２秒であるが、異なる活性化物質および異なる機器については時間を経験的に求める必要がある）、非ＡＤ細胞における細胞内カルシウム濃度は基礎水準の（３００／８０＝）３．７５倍より低く、一方ＡＤ細胞における細胞内カルシウム濃度は基礎水準の（３００／８０＝）３．７５倍より高いであろう。市販のＡＤおよび非ＡＤ細胞を用いて、カルシウム濃度がＡＤおよび非ＡＤ細胞間で最大差となる時間を容易に判定ずることができる。これは休止細胞につき相対的な細胞内カルシウム濃度を測定し、ボンベシンまたは他のＩＰ₃活性化物質を添加し、相対カルシウムイオン濃度を１分間程度追跡し、相対カルシウムイオン濃度がその最大になる時間（活性化物質を添加したのち）を見出すことによる。次いで患者からの実際の試料について、当技術分野で既知のいずれかの手段によって相対的な細胞内基礎カルシウム濃度を測定し、活性化物質をその処方された濃度（ボンベシンについては約１μＭ）になるように添加し、予め定められた時間待ち、再び相対的な細胞内カルシウム濃度を測定する必要があるにすぎない。活性化物質添加“前”の細胞内カルシウム濃度に対する活性化物質添加“後”の細胞内カルシウム濃度の比率が３．７５より大きい場合、その患者はＡＤを伴う；それが３．７５より小さい場合、その患者はＡＤを伴わない。カルシウム濃度が最大差になる時間を測定する必要はない−−これらの比率間に再現性のある差が得られるいかなる時間も採用しうる。既知のＡＤおよび非ＡＤ対照細胞から選ばれた時間につき個々の比率を求める必要があるにすぎない。第２および第３の態様に用いられるカルシウムイオン指示薬には、細胞に侵入することができ、生物適合性であり、かつカルシウムイオンに結合して、その濃度がいずれかの物理化学的手段で容易に測定され、かつカルシウムイオン濃度に比例する物質種を生成しう化合物はいずれも含まれる。好ましくはその手段は蛍光または吸光である。好ましい蛍光指示薬は市販の指示薬であるフラ−２ＡＭ、フラ−２ペンタカリウム塩、キン−２、およびインド−１である：モレキュラー・プローブ（オレゴン州ユージーン）から。フラ−２ＡＭのＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ名は、５−オキサゾールカルボン酸，２−（６−（ビス（２ −（（アセチルオキシ）メトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）−５−（２− （２−（ビス（２−（（アセチルオキシ）メトキシ）−２−オキソエチル）アミノ）−５−メチルフェノキシ）エトキシ）−２−ベンゾフラニル）−，（アセチルオキシ）メチルエステルである。フラ−２ペンタカリウム塩のＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ名は５−オキサゾールカルボン酸，２−（６−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）−５−（２−（２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）−５−メチルフェノキシ）エトキシ）−２−ベンゾフラニル）−である。他の蛍光カルシウム指示薬には、フルオ（Ｆｌｕｏ）−３、ロド（Ｒｈｏｄ）− ２、カルシウム・グリーン（ＣａｌｃｉｕｍＧｒｅｅｎ、商標）、カルシウム・オレンジ（ＣａｌｃｉｕｍＯｒａｎｇｅ、商標）、カルシウム・クリムゾン（ＣａｌｃｉｕｍＣｒｉｍｓｏｎ、商標）、フラレッド（ＦｕｒａＲｅｄ、商標）、およびカルシウム・グリーン・デキストラン（ＣａｌｃｉｕｍＧｒｅｅｎＤｅｘｔｒａｎ、商標）（モレキュラー・ブローブズ（オレゴン州ユージーン））が含まれる。一般に細胞を約２μＭの濃度の指示薬と共に約６０分間インキュベートする。使用しうる吸光指示薬はアルゼナゾ（ａｒｓｅｎａｚｏ）である。最後に、本発明に関しては細胞に挿入されたカルシウム電極によりカルシウム水準を測定することもできる。例示した本発明の態様においては、パーソナルコンピュターの制御下にイメージ化システムを用いて蛍光を測定した。励起のためには濃度フィルターを備えた３４０ｎｍおよび３８０ｎｍのバンドパスフィルターを使用した。蛍光のイメージは二色ミラー（ｄｉｃｈｒｏｉｃｍｉｒｒｏｒ）、バリヤーフィルターおよび対物レンズを用いて得た。全イメージまたはその一部を記録することができる。顕微鏡の１０倍の倍率の１視野内に６０個の細胞をイメージ化するハママツ・フォトニクス製アーガス５０カルシウムイメージ化システムを使用した。細胞からの蛍光を１０倍の倍率の視野の１／４において定量した。このようなイメージ化システム（および現在入手しうる他の同様なシステム）をその顕微鏡と共に細胞のカルシウム信号の日常的な臨床実験室用分析のために注文設計することができる。他の計測器および／または測定器は他のカルシウム指示薬の使用に適合させなければならないであろう。本発明方法においては、患者から採取される細胞はいかなる生存細胞であってもよい。好ましくはそれらは繊維芽細胞；頬粘膜細胞；血球、たとえば赤血球、リンバ球およびリンパ芽球様細胞；または神経細胞、たとえば臭覚ニューロンである。細胞は新鮮であってもよく、または培養されたものであってもよい（実施例に記載）。繊維芽細胞のカリウムチャンネル機能障害、および本明細書に記載するようにその結果起こるＴＥＡ誘発性カルシウム信号不在は、主として脳細胞に影響を及ぼすＡＤが身体の多種多様なタイプの細胞においてカリウムチャンネルの機能を変化させるらしいことを示唆する。同様にＡＤは身体の多種多様なタイプの細胞においてボンベシンおよび関連物質によるカルシウム放出を変化させると思われる。従ってカリウムチャンネルの機能およびカルシウム放出を測定するための本明細書に記載される方法は、他の細胞タイプを用いるＡＤ診断にも適用しうるはずである。患者から皮膚の繊維芽細胞を得るためにパンチスキン生検を採用しうる。これらの繊維芽細胞は、本明細書に記載された手法で直接に分析するか、または細胞培養条件下に置くことができる。得られた培養繊維芽細胞は次いで、後記のコリエル・セル・レポジトリーズから得られる培養繊維芽細胞につき記載したように分析される。分析に使用しうる他のタイプの細胞、たとえば頬粘膜細胞、神経細胞、たとえば臭覚細胞、血球、たとえば赤血球およびリンパ球などを調製するためには他の工程が必要であろう。たとえば血球は抹消静脈から採血することによって容易に得られる。次いで細胞を標準法により（たとえばセルソーター、遠心分離などの採用により）分離したのち懸濁液中で、または固体支持体上で（たとえばペトリ皿内で）分析することができる。以下に本発明を実施例により記述するが、それらは説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１パッチクランプ診断試験コリエル・セル・レポジトリーズ（ニュージャージー州カムデン）から入手した培養された皮膚繊維芽細胞（表３に記載）を高度に標準化された条件下で増殖させた。クリスタファロおよびチャベンティール（Ｃｒｉｓｔａｆａｌｌｏ，Ｖ．Ｊ．，Ｃｈａｐｅｎｔｉｅｒ，Ｒ．Ｊ．）（１９８０）ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ６：１１７。下記の細胞系を実験に用いた：若齢対照繊維芽細胞（“ＹＣ”）３６５２、３６５１、２９８７、４３９０、３３７７、８３９９（２１．５±２．８才，平均±Ｓ．Ｄ．）；同年齢対照繊維芽細胞（ “ＡＣ”）３５４２、６０１０、６８４２、７６０３、９８７８（６５．２±６．０才）；およびアルツハイマー病繊維芽細胞（“ＡＤ”）６８４８、７６３７、５８０９、８１７０、６８４０、８２４３、６２６３（６０．６±６．８才）。５種類のＡＤ系は家族性患者からのものであった。上記系のうち幾つかは（２種類のＡＣおよび４種類のＡＤ）はカナダ人の一族からのものであった。文献と一致して、データは生育（ｐｈａｓｅｏｕｔ）の期間がＡＤと対照系（ＹＣおよびＡＣ）間で変化がないことを示す。細胞を３５ｍｍのナンク（Ｎｕｎｃ）ペトリ皿内で、１０％ウシ胎児血清を補給したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、ジブコ）に接種し（細胞約５個／ｍｍ²）、細胞密度がすべての細胞系において均等になった時点で（接種の２−４日後）使用した。平均するとＡＤ患者および対照からの繊維芽細胞はエロージョン密度（ｅｒｏｓｉｏｎｄｅｎｓｉｔｙ）（細胞約５０個／ｍｍ²）に達するまでに同じ時間を要した。パッチクランプ実験は室温（２１−２３℃）で、サクマンおよびネーエル（Ｓａｋｍａｎｎ，Ｂ.，Ｎｅｈｅｒ，Ｅ.）（１９８３）ＳｉｎｇｌｅＣｈａｎｎｅｌｓＲｅｃｏｒｄｉｎｇｓ（プレナム、ニューヨーク）、ならびにククルジャン(Ｋｕｋｕｌｊａｎ，Ｍ.)ら(１９９１)Ｊ.ＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌ.，１１９：１８７に述べられた標準法に従って実施された。記録する前に培地を下記の溶液と交換した:１５０ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＫＣｌ，２ｍＭＣａＣｌ₂,１ｍＭＭｇＣｌ₂，１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ＮａＣｌ），ｐＨ＝７．４。ブルー・チップ毛細管（内径１．１−１．２ｍｍ）からＢＢ−ＣＨメカネックス延伸装置（ＢＢ−ＣＨＭｅｃａｎｅｘｐｕｌｌｅｒ）を用いてピペットを作成し、次いで１４０ｍＭＫＣｌ，２ｍＭＣａＣｌ₂，１ｍＭＭｇＣｌ₂，１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨ），ｐＨ＝７．４の高カリウム溶液を充填した。ビペット抵抗はほぼ６ＭΩであった。記録はアキソパッチ（Ａｘｏｐａｔｃｈ）− ＩＣ増幅器（ｄｃ−１０ｋＨｚ）を用いて得られ、テープに保存され（東芝ＰＣＭビデオ記録装置）、のちにアキソラボ（Ａｘｏｌａｂ）インターフェイスを用いてパーソナルコンピューターに移された。少なくとも３分間持続する記録のみを最終分析とみなした。ピークランプ（ｐＣｌａｍｐ）スートのプログラムを単チャンネルデータ収集および分析に用いた。増幅器、インターフェイスおよびソフトウェアはアキソン・インスツルメント（カリフォルニア州フォスター・シティー）から入手された。細胞付着方式でヒト皮膚繊維芽細胞から２種類のカリウムチャンネルを記録した。ピペットには高カリウム溶液が充填されていたので、カリウム電流は予想通り内向きであり、それらの反転電位（ｒｅｖｅｒｓａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は細胞休止電位にほぼ対応していた。等しい反応速度をもつ約４．５ｐＡの単位電流サイズ（０ｍＶピペット電位）のカリウムチャンネル（１１３ｐＳ）がＹＣおよびＡＣ繊維芽細胞に見られたが、ＡＤ繊維芽細胞の記録には全く存在しなかった（図１Ａ）。下向きの振れは開放状態を表す。図１Ａ（図１Ｂ）における同一チャンネルのＩ／Ｖの関係およびスロープ電導度（線形回帰により判定）は、探査した範囲の電圧内ではほぼ等しく、ＹＣ繊維芽細胞については１１３．２± ０．９ｐＳ（平均±Ｓ．Ｄ．，ｎ＝８）であり、ＡＣ繊維芽細胞については１１２．９±３．２ｐＳ（ｎ＝７）であった。第２チャンネル（１６６ｐＳ）は同一条件下で３群すべての繊維芽細胞から記録された（図２Ａ）。Ｉ／Ｖの関係（図２Ｂ）および電導度（ＹＣ＝１７３．４ ±５．７ｐＳ，ｎ＝４；ＡＣ＝１６９．２±２．８ｐＳ，ｎ＝４；ＡＤ＝１５７．６±４．７ｐＳ，ｎ＝６（平均±Ｓ．Ｄ．）は群全体においてほぼ等しかった。膜電位は対照（−４２．６±５．４，平均±Ｓ．Ｄ．，ｎ＝７）およびＡＤ（ −４５．４±６．９，ｎ＝３）繊維芽細胞において等しかった。両方のチャンネルが直線的な電圧-電流の関係をもち、それぞれスロープ電導度１１３ｐＳおよび１６６ｐＳであった（図１Ａ−１Ｂおよび２Ａ−２Ｂ）。０ｍＶピペット電位において、これらのチャンネルはそれらの単位電流サイズ（図１Ａおよび２Ａ）によって、またそれらの開放時間の％（１１３ｐＳのＫ⁺チャンネルについては約６０％、１１６ｐＳのＫ⁺チャンネルについては約１０％）によって容易に区別することができた。両チャンネルにつき開放時間の％は有意の電圧依存性を示さなかった（＋６０ないし−４０ｍＶピペット電位）。１１３ｐＳのＫ⁺チャンネルはＹＣ細胞（ｎ＝３０）の４７％およびＡＣ細胞（ｎ＝１７）の９４％に見られたが、それはＡＤ繊維芽細胞（ｎ＝２４）には全く見られなかった(χ²＝１８．９６，ｐ＜０．００１（表１）)。観察しうる１１３ｐＳチャンネルをもつ繊維芽細胞を含むＡＤ細胞系（Ｎ＝６）はなかった。これに対しすべてのＡＣ細胞系（Ｎ＝５）および６例中３例のＹＣ細胞系は観察しうる１１３ｐＳチャンネルをもつ繊維芽細胞を含んでいた(χ²＝１１．９３，ｐ＜０．００５（表２）)。見出された１１６ｐＳチャンネルは３群すべてにおいて同様な頻度であった（χ²＝０．８９，Ｎ．Ｓ．（表１および２））。ＡＣ繊維芽細胞中に“存在しない”ことが認められた１１３ｐＳチャンネルは、存在するが機能していない可能性がある。このように機能障害はチャンネルの構造変化および／またはチャンネル活性調節に伴うプロセスの変化を伴う可能性がある。前記の方法に従い無細胞パッチを使用して、両方のチャンネルとも５０ｍＭＢａ²⁺に対して感受性である（裏返し、各チャンネルにつきｎ＝４）が、１１３ｐＳチャンネルのみはＫ⁺チャンネル遮断薬テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）に対して感受性（表返し、ｎ＝４ＹＣ，ｎ＝３ＡＣ）であることが認められた。対照細胞（ｎ＝４）は１００ｍＭのＴＥＡ添加後に１３−２０ｍＶ減極したので、１１３ｐＳチャンネルのＴＥＡ遮断は（恐らく他のチャンネルと一緒に）膜電位に有意に作用する。対照細胞を用いる場合、同年齢対照細胞を用いることが最良である。実施例２ＴＥＡ−Ｃａ²⁺診断試験コリエル・セル・レボジトリーズ（ニュージャージー州カムデン）から入手した培養された皮膚繊維芽細胞（表３に記載）を実施例１の記載に従って増殖させた。１３例のＡＤ、１０例のＡＣおよび６例のＹＣをカルシウムイメージ化実験に用いた。培地を交換し、１４０ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＫＣｌ，２．５ｍＭＣａＣｌ₂，１．５ｍＭＭｇＣｌ₂，５ｍＭグルコース，１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨ），ｐＨ＝７．４からなる基礎塩類溶液（“ＢＳＳ”）で３回洗浄した。ＢＳＳと同様にして、ＣａＣｌ₂を添加せずに公称無Ｃａ²⁺ ＢＳＳを調製した。フラ−２（アセチルオキシメチルエステル）（フラ−２ＡＭ）をモレキュラー・プローブズ（オレゴン州ユージーン）から購入し、ジメチルスルホキシド中の１ｍＭ溶液として保存した。フラ−２ＡＭを２μＭの最終濃度になるように添加し、細胞を室温（２１−２３℃）で６０分間インキュベートした。インキュベーション後に細胞を室温のＢＳＳで少なくとも３回洗浄したのち、［Ｃａ²⁺］_iを測定した。パーソナルコンピュター（ハママツ・イメージ化ソフトウェアパッケージ）の制御下にハママツ・アーガス５０カルシウムイメージ化システム（ハママツ・フォトニクス、日本）を用いて蛍光を測定した。３４０ｎｍおよび３８０ｎｍにおける励起を濃度フィルターで減衰させた。蛍光イメージは４００ｎｍの二色ミラーおよび５１０ｎｍのロングパスバリヤーフィルターを用いて得られた。対物レンズはＸ１０ニコンＵＶフルオルであった。蛍光は全イメージのうち均一に照射されている部分（１／４）において定量された。得られたサイトゾルおよび核の細胞コンパートメント中の１５×１５ピクセル内での平均Ｃａ²⁺応答を、３４０ｎｍで活性化されて５１０ｎｍで発光した蛍光と３８０ｎｍにおける活性化により５１０ｎｍで発光した蛍光との比率により定量化した。これらの比率を下記の方程式に基づく検量後に［Ｃａ²⁺］の絶対値に換算した：Ｒ＝Ｒ_max＋（Ｒ_min−Ｒ_max）／（１＋（［Ｃａ²⁺］_i／Ｋｄ）^b）式中のＲは３４０ｎｍで照射した蛍光強度を３８０ｎｍで照射した蛍光強度で割ったもの（Ｆ３４０／Ｆ３８０）を意味し、Ｒ_maxおよびＲ_minはカルシウム濃度がそれぞれ最小および最大である場合（すなわち計測条件下で計測器により測定された最大値および最小値）のＲの値である。ＫｄはＣａ²⁺に対するフラ−２の解離定数であり、２４０ｎＭにおいて測定された。非対称度を決定するｂの値は１．２であった。ＴＥＡの適用は若齢対照１例を除くすべての対照細胞系の少なくとも１８％の細胞において最低１００％の［Ｃａ²⁺］_i上昇を引き起こした。従って１系において少なくとも１０％の細胞における１００％［Ｃａ²⁺］_i上昇の応答を、陽性応答に関する保守基準であるとみなした。１例のＡＤ細胞系のみが基準よりはるかに低い応答（４％の細胞において１００％の［Ｃａ²⁺］_i上昇）を示す細胞を含んでいた。高い外部カリウム中での灌流による繊維芽細胞の減極は、ＡＣおよびＡＤ細胞と比較してＹＣ細胞においてより高い細胞内Ｃａ²⁺（［Ｃａ²⁺］_i）上昇を引き起こした（図３Ａ−３Ｃ）。この減極誘発性［Ｃａ²⁺］_i上昇は外部カルシウムの低下により、またはカルシウムチャンネル遮断薬の添加により除かれた（図３Ｃ）。高Ｋ⁺誘発性減極は、３群すべてにおいて著しい［Ｃａ²⁺］_i上昇（少なくとも１００％の上昇）を引き起こした（ＡＤ，ｎ＝１３細胞系；ＡＣ，ｎ＝１０：ＹＣ，ｎ＝６）。応答細胞の割合および［Ｃａ²⁺］_iピーク値は、ＡＣ（ｎ＝２９９）およびＡＤ（ｎ＝２６８）繊維芽細胞と比較してＹＣ（ｎ＝１８３細胞）繊維芽細胞において有意に高かった（χ²＝１４．２２，ｐ＜０．００１）。［Ｃａ²⁺］_iピークは刺激の１０−１５秒後に起こり、１００秒後に基礎水準に戻る。刺激前に“公称無Ｃａ²⁺”溶液または５ｍＭＥＧＴＡ（推定無Ｃａ²⁺＝０．０４μＭ）またはＣａ²⁺チャンネル遮断薬（０．１ｍＭＬａＣｌ₃，１０ｍＭＣｏＣｌ₂，１０ｍＭＮｉＣｌ₂，１０ｍＭＣｄＣｌ₂，または１０μ Ｍニフェジビン）の添加により外部カルシウムを低下させた場合、応答は見られなかった。ＴＥＡによる対照繊維芽細胞の減極も［Ｃａ²⁺］_i上昇を引き起こし、これは外部カルシウムの低下により、またはカルシウムチャンネル遮断薬の添加により除かれた。しかしＡＤ繊維芽細胞は高い外部カリウム中でのみ［Ｃａ²⁺］_i上昇を示し、１００ｍＭＴＥＡの添加すら［Ｃａ²⁺］_i応答を示さなかった。すべてのＡＣ細胞系（Ｎ＝１０）および１例を除くすべてのＹＣ細胞系（Ｎ＝６）がＴＥＡに応答する細胞を含んでいたが、１３例の被験ＡＤ細胞系のいずれも１００ｍＭＴＥＡに応答する細胞を含まなかった（χ²＝２５．６６，ｐ＜０．００１）（表３および５）。１ｍＭＴＥＡの適用は［Ｃａ²⁺］_iをＹＣ繊維芽細胞（ｎ＝１３０細胞）において上昇させたが、ＡＣ（ｎ＝１８４）またはＡＤ（ｎ＝１９５）繊維芽細胞においては上昇させなかった。１０ｍＭＴＥＡは［Ｃａ²⁺］_iをＹＣ（ｎ＝１７６）およびＡＣ（ｎ＝２３１）において上昇させたが、ＡＤ繊維芽細胞（ｎ＝２０４）においては上昇させなかった。同様に１００ｍＭＴＥＡは［Ｃａ²⁺］_i をＹＣ（ｎ＝５３２）およびＡＣ（ｎ＝４１７）において上昇させたが、ＡＤ繊維芽細胞（ｎ＝７３８）においては上昇させなかった（χ²＝２３１．４４，ｐ＜０．００１）。各実験群において少なくとも４１７の細胞を調べた（表４）。応答する細胞の［Ｃａ²⁺］_i値は、１０および１００ｍＭＴＥＡ添加後ではＹＣおよびＡＣ細胞において類似していた。基礎［Ｃａ²⁺］_i水準は実質的に同じであった（Ｓ．Ｅ．＜０．５ｎＭ）ので、標準誤差の棒はこれらの群についての算術平均を表す棒と区別できない（図４Ｂ）。Ｃａ²⁺応答の経時変化は、[Ｃａ²⁺]_iピークがＹＣおよびＡＣ繊維芽細胞においては１００ｍＭＴＥＡ添加の２０−３０秒後に起こり、１００秒後には基礎水準に戻ることを示す。ＡＤ細胞においては応答が見られなかった（＞１００％の上昇を伴うのが１系の細胞の１０％）。同様に、対照細胞において外部［Ｃａ²⁺］を低下させた場合にも応答がなかった（図４Ｃ）。アルツハイマー病および対照繊維芽細胞を含むコード化されたサブサンプルを用いて、ＴＥＡ誘発性［Ｃａ²⁺］_i上昇を反復した。実験および分析は細胞系の正体を実験者が知らない状態で実施された。結果は非盲検試料と完全に一致した。盲検ＡＤ細胞系（Ｎ＝１１）はいずれもＴＥＡに応答する［Ｃａ²⁺］_i上昇を示さず、１例を除くすべての対照細胞系（４例のＡＣおよび６例のＹＣ）がＴＥＡ応答を示した（χ²＝１７．３３，ｐ＜０．００１（表５））。高カリウムに応答した［Ｃａ²⁺］_i上昇はＡＣおよびＡＤ細胞については実質的に同じであるので、ＴＥＡに対するＡＤ細胞の応答がないのはほぼ確実にＫ⁺ チャンネルの機能障害によるものであって、Ｃａ²⁺チャンネルの機能障害によるものではない。［Ｃａ²⁺］_i測定とパッチクランプ測定は、それらが両方ともＡＤ繊維芽細胞におけるカリウムチャンネル機能障害を示すという点で一致する。表５を参照されたい。アルツハイマー病繊維芽細胞は家族性症例（Ｎ＝８）および非家族性症例（Ｎ＝５）からのものであった。５例（＋）はカナダ人家族９６４の構成員であり、１および２のみが近縁（血縁）である。“‡”は家族７４７の構成員（血縁）である。剖検により３例（＊）においてアルツハイマー病が確認された。同年齢対照（Ｎ＝１１）細胞系のうち２例はカナダ人家族（９６４）の非感染構成員である。若齢対照系（Ｎ＝６）はすべて正常な、ＡＤ家族歴のない個体からのものである。＋として示す基準［Ｃａ²⁺］_i応答（１００ｍＭＴＥＡに対する）が、用いたすべてのＡＣ系および１例を除くすべてのＹＣ系において観察された。１１３ｐＳＫ⁺チャンネルの存在は“＋”記号で示される。ＡＤ系はいずれも“ 陽性”応答を示さなかった。盲検プロトコルを実施して、アルツハイマー病（Ｎ＝１１）および対照（ＹＣ＝６，ＡＣ＝４）繊維芽細胞においてＴＥＡ応答を測定した。結果は非盲検試料のものを正確に再現した：ＡＤ細胞系はＴＥＡ応答を示さず、１０例中９例の対照細胞がＴＥＡ応答を示した；χ²＝１７．３３，ｐ＜０．００１。“Ｎ．Ｔ．”の記号は試験しなかった細胞系／条件を示す。実施例３ボンベシン−Ｃａ²⁺診断試験表３に挙げたヒト皮膚繊維芽細胞を使用した。使用したＡＤ細胞系に関する平均年齢は６０．５±５．９才であり；ＡＣ細胞系に関しては６２．３±９．６才であり；ＹＣ細胞系に関しては２１．５±２．２才である。細胞の維持方法は実施例１に記載した。すなわち３７℃でＣＯ₂／空気（５％／９５％）中において３−５日間維持して細胞５０個／ｍｍ²の密度に達したのちカルシウム測定を行った。培養継代数は１９未満であった。ボンベシンはカルビオケム（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入された。ボンベシンは蒸留水中の１ｍＭ溶液として保存された。フラ−２（アセチルオキシメチルエステル）、フラ−２（ペンタカリウム塩）、およびオメガ−コノトキシン（ω−ＣｇＴＸ）ＧＶＩＡはモレキュラー・プローブズ（オレゴン州ユージーン）から得た。フラ−２ＡＭはジメチルスルホキシド中の１ｍＭ溶液として保存された；フラ−２ペンタカリウム塩は酢酸カリウム中の６ｍＭ溶液として保存され、ω−ＣｇＴＸは蒸留水中の１００μＭ溶液として保存された。フェニトイン以外の化学物質はすべて−２０℃に保持され、遮光された。細胞をＢＳＳ（実施例１に記載）中の２μＭフラ−２ＡＭと共に室温（２１− ２３℃）で６０分間インキュベートした。細胞をＢＳＳで少なくとも３回洗浄したのち、室温で［Ｃａ²⁺］_iの測定に使用した。細胞の蛍光を実施例２の記載に従って測定した。絶対カルシウム値を実施例２に示したものに従って計算した。ボンベシンを細胞に１μＭの最終濃度で添加した。ボンベシン処理後にカルシウム移動水準を−３０秒から１５０秒まで測定した（図５Ａ）。この実験計画により、ボンベシンを添加したのち４２秒の時点でＡＤ細胞と対照細胞間において［Ｃａ²⁺］_iの最大差が得られた。細胞外Ｃａ²⁺の不在下では、ボンベシン処理の４２秒後にアルツハイマー病細胞における［Ｃａ²⁺］_i水準は同年齢および若齢対照の場合よりはるかに高い（ｐ＜０．０００１）。細胞系の数（Ｎ）はアルツハイマー病、同年齢および若齢細胞につきそれぞれ１０、８および６である。数値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である（図５Ｂ）。ボンベシンはすべての群の繊維芽細胞において細胞内貯蔵部位からのＩＰ₃誘発性Ｃａ²⁺放出を刺激したが、それはＡＤ繊維芽細胞において、より大きな、かつより持続的な応答を引き起こした。ＡＤ細胞におけるこの、より大きな、かつより持続的な応答は細胞外Ｃａ²⁺とは無関係であった。他方、ＡＣおよびＹＣにおけるＩＰ₃仲介によるＣａ²⁺応答はＣａ²⁺侵入を伴った。このＣａ²⁺侵入が細胞外Ｃａ²⁺の除去または無機Ｃａ²⁺遮断薬による遮断によって減少した場合、対照細胞におけるボンベシン誘発性Ｃａ²⁺応答はＡＤ細胞の場合より速やかに基礎水準に戻ることが見出された（図５Ａ）。図５Ａに示した結果は公称無Ｃａ²⁺ＢＳＳで洗浄した細胞についてのものである。ボンベシンにより誘発されたＣａ²⁺流入はＡＤ細胞においては見られなかったので、貯蔵カルシウムの減少に伴うこのＣａ²⁺流入経路が変化していると考えられる。この試験は独立して、カリウムチャンネル機能障害に基づく前記の試験によりなされた診断を確認した。特にＡＤ細胞において細胞外Ｃａ²⁺の不在下で１ μＭボンベシン刺激の４２秒後に起こるＣａ²⁺応答は、常に３００ｎＭより高かった。これに対しＡＣおよびＹＣにおいては［Ｃａ²⁺］はそれぞれ３００ｎＭおよび２００ｎＭより低かった（図５Ｂ）。前記実験の変法において、Ｃａ²⁺応答を細胞外カルシウムの存在下で１μＭボンベシンにより誘発した。２．５ｍＭＣａＣｌ₂の存在下で１μＭボンベシンは［Ｃａ²⁺］_iの速やかなピークを誘発し、ＹＣおよびＡＣ細胞についてはこれに持続期が続いたが、ＡＤ細胞にはなかった（図６Ａ）。この差はボンベシン適用の９０秒後に顕著となり、有意水準ｐ＜０．００１を伴った（図６Ｂ）。この細胞外カルシウムの存在下でのボンベシンに対するＡＤおよび非ＡＤ細胞の応答の差を利用して、ＡＤの“イエスまたはノー”診断を得ることができる。選ばれたカリウムチャンネル遮断薬（たとえばＴＥＡ）に対する応答における非ＡＤおよびＡＤ細胞間の差を検出することによりＡＤの診断を行う本発明の第２態様に関して先に述べたものと同様な検出法を採用しうる。さらにこの診断試験法と前記の診断試験法のいずれかとの組み合わせによって、ＡＤまたは非ＡＤの正確な診断の信頼水準がさらに高まる。実施例４神経病理学的な非ＡＤ繊維芽細胞における応答実施例２および３に記載した手法を用いて、他の疾患を伴うドナーからの細胞をＴＥＡまたはボンベシンに応答した細胞内カルシウムにつき測定した。パーキンソン病ドナーからの繊維芽細胞は正常なＴＥＡ応答（＋で示す）およびボンベシン応答（“Ｎ”）を示し、同年齢対照群において見られた応答と有意差がなかった。２人の精神分裂病患者からの繊維芽細胞も正常なＴＥＡおよびボンベシン応答を示した。さらにハンティングトン病の７例中５例において正常なＴＥＡ応答が見られ、ボンベシン応答はすべてのハンティングトン病の症例において正常であった。さらにヴェルニッケ−コルサコフ病の４例中４例において正常なＴＥＡおよびボンベシン応答が見られた（表６）。これらの応答はＡＤ繊維芽細胞のものとｐ＜０．０００１の水準で有意差がある（フィッシャーの完全試験、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓｅｘａｃｔｔｅｓｔ）。“★”は剖検による確認を示す。前記の参考文献の全体をすべて参考として本明細書に引用する。本発明を特にその好ましい態様に関して詳述したが、本発明は他の異なる態様の可能性があることは理解されるであろう。当業者に自明のとおり、本発明の精神および範囲内において変更および修正を行うことができる。従って以上の開示および記載は例示のためのものにすぎず、本発明を限定するものではない。本発明は請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アルコン，ダニエル・エルアメリカ合衆国メリーランド州20817，ベセズダ，ボナヴェントゥルー・コート 6701 (72)発明者エトチェバーリガレイ，レンアメリカ合衆国メリーランド州20852，ロックヴィル，ヴィリッジ・スクエア・テラス 12221 (72)発明者伊藤悦朗北海道札幌市中央区南18条西17丁目１―45 ―106 (72)発明者ギブソン，ガリー・イーアメリカ合衆国ニューヨーク州10538，ラーチモント，ファーンウッド・ロード 60 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．患者においてアルツハイマー病（ＡＤ）を診断する方法であって、ａ．患者から細胞の試料を採取し；そしてｂ．機能性１１３ｐＳカリウムイオンチャンネルの存在または不在を検出する工程を含み；該カリウムイオンチャンネルの不在がＡＤを指示するものである方法。２．細胞が繊維芽細胞、頬粘膜細胞、ニューロンおよび血球よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。３．細胞が繊維芽細胞である、請求項２に記載の方法。４．検出工程ｂがパッチクランプ法により実施される、請求項１に記載の方法。５．患者においてアルツハイマー病（ＡＤ）を診断する方法であって、ａ．患者から細胞の試料を採取し；ｂ．細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定し；ｃ．細胞を選ばれたカリウムイオンチャンネル遮断薬と接触させ、該遮断薬は１１３ｐＳカリウムイオンチャンネルを遮断するが、１６６ｐＳカリウムイオンチャンネルを遮断しない効力を有し；そしてｄ．接触工程ｃののち１分未満の期間内に、工程ｂの場合と同じ方法により細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程を含み；その際、細胞内カルシウムイオン濃度が接触工程ｃののちその１分の期間内に上昇しない場合はその患者はＡＤを有し、細胞内カルシウムイオン濃度が上昇した場合はその患者はＡＤを有しないものである方法。６．患者においてアルツハイマー病（ＡＤ）を診断する方法であって、ａ．患者から細胞の試料を採取し；ｂ．細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定し；ｃ．細胞を選ばれたカリウムイオンチャンネル遮断薬と接触させ、該遮断薬は１１３ｐＳカリウムイオンチャンネルを遮断するが、１６６ｐＳカリウムイオンチャンネルを遮断しない効力を有し；そしてｄ．ＡＤ細胞と対照細胞間の細胞内カルシウムイオン濃度に最大の差がある時点で、工程ｂの場合と同じ方法により細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程を含み；その際、工程ｃと工程ｄの間の期間に患者からの細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇がないことはその患者がＡＤを有することを指示し、工程ｃと工程ｄの間の期間に患者からの細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇があることはその患者がＡＤを有しないことを指示するものである方法。７．工程ｄが、接触工程ｃののち１分未満の期間内に細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することを含む、患者のアルツハイマー病を診断するための請求項６に記載の方法。８．選ばれたカリウムイオンチャンネル遮断薬がテトラエチルアンモニウムである、請求項５に記載の方法。９．細胞が繊維芽細胞、頬粘膜細胞、ニューロンおよび血球よりなる群から選ばれる、請求項５に記載の方法。１０．細胞が繊維芽細胞である、請求項９に記載の方法。１１．測定工程ｂおよびｄが蛍光カルシウムイオン指示薬および蛍光光度計を用いて実施される、請求項５に記載の方法。１２．カルシウムイオン指示薬がフラ−２ＡＭ、フラ−２ペンタカリウム塩およびクイン−２よりなる群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。１３．患者においてアルツハイマー病（ＡＤ）を診断する方法であって、ａ．患者から細胞の試料を採取し；ｂ．細胞の細胞内カルシウムイオンの基礎水準濃度を測定し；ｃ．細胞を細胞内カルシウム放出の活性化剤と接触させ；ｄ．接触工程ｃののち、予め定められた時点で細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定し；そしてｅ．工程ｂに対する工程ｄの測定濃度の比を、既知のＡＤ細胞および非ＡＤ細胞につき前記の予め定められた時点において先に定められた比と比較する工程を含み；その際、工程ｅの比が既知のＡＤ細胞につき先に定められた比と等しいか、またはそれより大きい場合はその患者はＡＤを有し、工程ｅの比が既知の非ＡＤ細胞につき先に定められた比と等しいか、またはそれより小さい場合はその患者はＡＤを有しないものである方法。１４．工程ｄの予め定められた時点が、ＡＤ細胞と対照細胞の相対的細胞内カルシウムイオン濃度間の差が最大となる時点である、請求項１３に記載の方法。１５．細胞内カルシウム放出の活性化剤がＩＰ₃活性化剤ボンベシンである、請求項１３に記載の方法。１６．細胞外カルシウムイオン濃度がゼロまたはほぼゼロである、請求項１３に記載の方法。１７．細胞が繊維芽細胞、頬粘膜細胞、ニューロンおよび血球よりなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。１８．細胞が繊維芽細胞である、請求項１７に記載の方法。１９．工程ｂおよびｄが蛍光カルシウムイオン指示薬および蛍光光度計を用いて実施される、請求項１３に記載の方法。２０．カルシウムイオン指示薬がフラ−２ＡＭ、フラ−２ペンタカリウム塩およびクイン−２よりなる群から選ばれる、請求項１９に記載の方法。２１．患者においてアルツハイマー病（ＡＤ）を診断する方法であって、ａ．患者から細胞の試料を採取し；ｂ．細胞外カルシウムの存在下で細胞の細胞内カルシウムイオンの基礎水準濃度を測定し；ｃ．細胞を細胞内カルシウム放出の活性化剤と接触させ；そしてｄ．接触工程ｃののち、予め定められた時点で細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定する工程を含み；その際、細胞内カルシウムイオン濃度が工程ｂで測定したものと等しい場合はその患者はＡＤを有し、細胞内カルシウムイオン濃度が工程ｂで測定したものより大きい場合はその患者はＡＤを有しないものである方法。