JPH09265A - 新規ヒトｓｍａｌｌ ＴＩＭＰ２遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】新規ヒトsmall ＴＩＭＰ２遺伝子ＤＮＡ、ヒト
ＴＩＭＰ２ＤＮＡの一部をプライマ−またはプロ−ブと
して用いたヒトsmall ＴＩＭＰ２遺伝子解析方法および
試薬を提供することにある。 【構成】ヒト悪性グリオーマの外科摘出標本から新規ヒ
トsmall ＴＩＭＰ２遺伝子をクローニングし構造決定し
た。本発明遺伝子の発現量の低下と、ヒトグリオーマに
おける腫瘍の悪性化とが、明確に相関していることを確
認した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規ヒトsmall ＴＩＭＰ
２（Tissue Inhibitor Metaro Protease 2)遺伝子ＤＮ
Ａおよび該ＤＮＡを用いる遺伝子解析法および試薬に関
し、医療、診断等の分野で利用される。

【０００２】

【従来の技術】癌細胞の浸潤においては、細胞間物質
（細胞外マトリックス）の構成蛋白質を局部的に分解す
るプロテアーゼの作用が必須であり、細胞外マトリック
スを破壊する一群のメタロプロテアーゼ（マトリックス
メタロプロテアーゼ；ＭＭＰ）が、その中心的役割を果
たしていることが広く認められている。さらに最近の研
究によって、ＭＭＰ特異的な生体内インヒビターである
ＴＩＭＰがＭＭＰの活性調節機構の一つとして重要な役
割を担っていることが明らかになりつつある（宮崎香
ら、組織培養，18，280-285 ，1992）。これまでにヒト
ＴＩＭＰ−１、ヒトＴＩＭＰ−２およびニワトリＴＩＭ
Ｐ−３の遺伝子がクローニングされており、ＴＩＭＰ−
１やＴＩＭＰ−２が癌細胞の浸潤を抑制することが確か
められている（中島元夫、実験医学，12，971-979 ，19
94）。すなわち、ＭＭＰとＴＩＭＰとのバランスの異常
が癌細胞の浸潤における極めて重要な要因であると考え
られている。しかし、色々なタイプのＭＭＰやＴＩＭＰ
が、癌細胞のみならず周辺の宿主細胞によっても産生さ
れ血液中にもかなり高濃度で存在する例が知られている
上、それらの産生の抑制、亢進についても多くの生体内
因子が関与していることが明らかになっている。従って
ＭＭＰとＴＩＭＰとのバランスと言っても、癌細胞とそ
の周囲の環境によって、多種多様な調節がなされている
と考えられる。

【０００３】ヒト腫瘍において、その転移、浸潤、増殖
性などの悪性度を判断するための指標の一つとして、こ
れらＭＭＰやＴＩＭＰの発現状況を解析する方法は、当
然考えられる方法であり、一部の癌においては指標にな
りうると考えられる。例えば、大腸癌におけるＭＭＰ−
９の発現量とその転移性とはよく相関すると報告されて
いる（Nakajima M. et al. J. Natl.Cancer Inst.,82,1
890-1898,1990 ）。しかしながら多くの場合は、これら
の多様な因子の発現状況が複雑に関係し合っているため
に、必ずしもどれかの指標が悪性度と明確に相関すると
は限らず、矛盾する結果や判断困難な結果を示すことに
なる。例えば、ＭＭＰ−２のメラノーマ、乳癌、腎癌、
膀胱癌などにおける転移能との相関が報告されている
が、一方でＭＭＰ−２は多くの癌細胞で転移性とは無関
係に産生が維持されていることも報告されている（中島
元夫、実験医学，12，971-979 ，1994）。ヒト中枢神経
に発生する悪性グリオーマの浸潤性増殖は、根治を妨げ
る主要な原因となっており、その浸潤能を調べることは
治療法の開発研究を進める上で重要な課題であるばかり
でなく、臨床上の判定、治療方針の決定などにとって緊
急の課題でもある。ヒト脳腫瘍における、ＴＩＭＰ−１
およびＴＩＭＰ−２の発現も調べられているが、その発
現度合は、ＴＩＭＰ−１で良性腫瘍(meningioma)＞Grad
e2(low grade glioma) ＞正常(Normal Brain)＞Grade3
(anaplastic astrocytoma)＞Grade4 (glioblastoma) 、
ＴＩＭＰ−２でGrade2(low grade glioma)＞良性腫瘍(m
eningioma)＞正常(Normal Brain)＞Grade3(anaplastic
astrocytoma)＞Grade4 (glioblastoma) という順番で高
く、悪性度の指標という観点からは必ずしも満足できる
ものではない(S.Mohanam et al.,Clin.Exp. Metastasi
s,13,57-62,1995) 。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、脳腫瘍の悪
性化に関わる新規なヒトsmall ＴＩＭＰ２遺伝子、それ
を用いた脳腫瘍の検査方法、検査試薬を提供する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ヒトＴＩＭ
Ｐ２遺伝子ＤＮＡ部分配列を設計し、合成して、これら
をプライマーとして、ヒト脳組織およびヒト脳腫瘍組織
由来ＲＮＡから作成したｃＤＮＡを対象としたＰＣＲ法
によって、ヒト脳腫瘍組織におけるＴＩＭＰ２遺伝子類
縁体遺伝子ＤＮＡ配列を増幅した。その結果、脳組織で
最も高く発現し、グリオーマの悪性度が高くなるにつれ
て発現が低くなる明確な相関を示す約７００ｂｐのＰＣ
Ｒ産物の存在を発見した。このＰＣＲ産物のサイズは、
使用したプライマーの位置から予想されるＴＩＭＰ２由
来産物のサイズよりも小さく、その塩基配列を決定した
結果、これまでに報告されていない特徴的配列を有する
新規なヒトsmall ＴＩＭＰ２遺伝子ＤＮＡ配列であるこ
とを確認し本発明を完成するに到った。すなわち本発明
は（１）配列番号１で表わされる新規ヒトsmall ＴＩＭ
Ｐ２遺伝子ＤＮＡ、（２）ヒトＴＩＭＰ２ＤＮＡ配列の
一部を含むＤＮＡをプライマーまたはプローブとして用
い、被検ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズさせ、ヒ
トsmall ＴＩＭＰ２遺伝子を検出する方法及び試薬、に
関する。本発明は、ヒトＴＩＭＰ２ＤＮＡまたは本発明
ＤＮＡの全部または一部を、プライマーあるいはプロー
ブとして利用してヒトsmall ＴＩＭＰ２遺伝子を検出す
ることによって、少なくとも、ヒト脳腫瘍についての悪
性度をより正確に検査する方法を提供し、さらには癌の
リスク診断、予防的処置、経過観察、治療方針の決定、
予後の推定などに対する解決方法をも提供し得るという
点できわめて重要である。また、ヒトＴＩＭＰ２の腫瘍
悪性化における役割のさらなる解明に役立つことが期待
され、遺伝子治療への応用も期待し得る。

【０００６】本発明において、ヒトＴＩＭＰ２ＤＮＡま
たは配列番号１に記載のＤＮＡ配列の一部を含むものを
プライマ−またはプロ−ブとしてヒトsmall ＴＩＭＰ２
の検出に使用するが、「一部」とは少なくとも連続８個
からなるＤＮＡ、好ましくは連続１０個からなるＤＮ
Ａ、さらに好ましくは連続１５個からなるＤＮＡ、さら
に好ましくは１６〜２５個からなるＤＮＡを意味する。
なお実施例２に示すごとく、本発明ＤＮＡは公知のＴＩ
ＭＰ２ＤＮＡ配列の中間部267 個または266 個の塩基が
欠失したものであり、配列番号１において44位と45位の
間が該欠失ＤＮＡの存在部位であることが判明したもの
である。それゆえ、ヒトＴＩＭＰ２ＤＮＡ配列の一部を
プライマ−として本発明ＤＮＡを検出する際には、配列
番号１に記載のＤＮＡ配列における44位45位に相当する
ヒトＴＩＭＰ２ＤＮＡの両サイド、いわゆる44位以前と
45位以後に相当するそれぞれのＤＮＡ配列の一部を含む
ＤＮＡをプライマ−として用い、ＰＣＲ法により増幅さ
せた部分配列を構造解析し、本発明ＤＮＡの特徴的配列
である44-45 位付近を含むＤＮＡ配列の有無を確認する
ことにより本発明ＤＮＡを検出することが可能である。
具体的には例えば、配列番号１に記載のＤＮＡ配列にお
ける1-44位及び45-671位の一部を含むＤＮＡをプライマ
−として使用すればよい。一方、プロ−ブとして用いる
場合は配列番号１に記載のＤＮＡ配列の一部を含むＤＮ
Ａを使用し、被検ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズ
するもののうち約700bp のＤＮＡまたはＲＮＡを選択し
て構造解析することで本発明ＤＮＡを検出することがで
きる。なお、実施例に記載のごとく、生体試料中の本発
明ＤＮＡの検出は該ＤＮＡ相補ｍＲＮＡの検出と同義で
あるゆえ、生体試料中の該ｍＲＮＡの検出方法および試
薬も本発明に含まれる。また、ヒトＴＩＭＰ２ＤＮＡの
相補ＲＮＡの全部または一部を含むＲＮＡ、またはその
誘導体をヒトsmall ＴＩＭＰ２遺伝子検出への利用も本
発明に含まれる。本発明試薬の構成は、上記説明のプラ
イマ−またはプロ−ブを必須の構成成分とするものであ
り、必要に応じて標識物質、反応溶液など添付されるこ
とは自由である。以下に本発明を詳細に説明する。

【０００７】（１）遺伝子ＤＮＡの構造 本遺伝子ＤＮＡは、配列番号１のＤＮＡ配列であること
が確認された。本発明者は、本遺伝子ＤＮＡ塩基配列に
ついて、ＴＩＭＰ２遺伝子ＤＮＡ塩基配列（国際ＤＮＡ
データベースAccession No. S48568,J05593,M32304) と
の詳細な比較を行った。その結果、本遺伝子ＤＮＡは、
ＴＩＭＰ２遺伝子ＤＮＡ塩基配列（国際ＤＮＡデータベ
ースAccession No. S48568,J05593)と比べて中間部分
（配列番号１の塩基番号４４と４５の間）で２６７ｂｐ
が存在せず、ＴＩＭＰ２遺伝子ＤＮＡ塩基配列（国際Ｄ
ＮＡデータベースAccession No.M32304)と比べても同様
に中間部分で２６６ｂｐが存在しない短い配列であるこ
とが判った。本発明者は配列番号１で表される遺伝子Ｄ
ＮＡをヒトsmall ＴＩＭＰ２と命名した。本遺伝子はヒ
トＴＩＭＰ２の可変化スプライシング(alternative spl
icing)により生ずるものと考えられ、これまでまったく
報告されていない新規遺伝子である。すなわち本発明は
ここに新しいヒトＴＩＭＰ２関連遺伝子の塩基配列を開
示した。本発明の遺伝子ＤＮＡは、その発現量を検査す
ることにより、ヒト脳腫瘍についての悪性度の解析、診
断に利用することができる。

【０００８】（２）生体試料の遺伝子解析 遺伝子解析される生体試料はヒト正常組織、各種ヒト癌
組織、病理組織などを用いることができる。ＤＮＡの抽
出・調製は、例えば（Sato T., et al. CancerRes., 5
0, 7184, 1990 ）の方法で行う。本発明により提供さ
れる遺伝子ＤＮＡの制限酵素断片をプローブとして、ま
たはヒトＴＩＭＰ２ＤＮＡの中から適切な位置の塩基配
列を適宜選択し、その合成オリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いることにより該遺伝子の発現を解析する
ことができる。解析の方法としては、例えば選ばれた２
種の配列のプライマーによりＰＣＲ法で部分配列を増幅
させ、増幅産物のサイズを解析するかあるいは塩基配列
を直接解析するすることができる。あるいはまた、選ば
れたＤＮＡ配列を含むプローブを用いて、ノーザンハイ
ブリダイゼーション法での試料中の該遺伝子の発現量を
検査することができる。

【０００９】

【発明の効果】本発明によって、少なくとも、ヒトＴＩ
ＭＰ２ＤＮＡの全部または一部を、プライマーあるいは
プローブとして利用してヒトsmall ＴＩＭＰ２遺伝子の
発現量を解析することによる、ヒト脳腫瘍の悪性度を検
査する方法が提供された。さらに癌についてのリスク診
断、予防的処置、経過観察、治療方針の決定、予後の推
定などに対する解決方法として、遺伝子による診断・検
査、の方法および材料を提供し得る。

【００１０】

【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。

【００１１】（実施例１）ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトsm
all ＴＩＭＰ２遺伝子の検出 医学的理由により外科的に切除されたヒト normal brai
n, astrocytoma(grade2),anaplastic astrocytoma(grad
e3),glioblastoma(grade4) の各組織について、それぞ
れ、4M guanidium isothiocyanate 溶液で溶解後、5.7M
塩化セシウム溶液に上層して超遠心（150,000 ｇ、18時
間）を行い、ＲＮＡ画分を沈澱として回収した。沈澱を
TE-buffer に溶解後、フェノール・クロロホルム抽出を
１回、エタノール沈澱を２回行い、得られた沈澱をTE-b
uffer に溶解して精製ＲＮＡ画分を得た。各精製ＲＮＡ
画分につき、それぞれ、２０μｇを用いてoligo dT 12-
18mer（Pharmacia 社製）をプライマーとした逆転写酵
素反応によりｃＤＮＡを合成し、得られた１本鎖ｃＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲを行った。用いたプライマーのＤ
ＮＡ配列を下記に示す。 （センス鎖プライマー）Ｓ１；配列番号１の塩基番号１
−２０に相当 ５’−ＣＣＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡ−
３’ （アンチセンス鎖プライマー）Ａ１；配列番号１
の塩基番号６５２−６７１の アンチセンスに相当
５’−ＴＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧ−
３’ ＰＣＲはThermocycler(Perkin-Elmer Cetus 社製）を用
い、0.25μg の鋳型ＤＮＡ、各20 pmol のプライマー、
各2.5nmol のdATP,dGTP,dCTP,dTTP 、0.5UのTaq ポリメ
ラーゼ(Boehringer-Manheim 社製) を加えた５０μｌの
反応buffer(10mM Tris-HCl,1.5mM MgCl₂,50mM KCl,1% f
ormamide,pH8.3) 中で95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒の
サイクルを３０回行った。ＰＣＲ反応液について1.5 ％
アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド
染色の後、ナイロンメンブラン Hybond N(Amersham社
製) に転写し、³²Ｐで末端標識したプローブを用いてサ
ザンブロットハイブリダイゼーションを行った。用いた
プローブのＤＮＡ配列を下記に示す。 （プローブ）Ｐ１；配列番号１の塩基番号７３−９２に相当 ５’−ＧＧＡＡＧＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＧ−３’ その結果、図１に示すように、脳組織で最も高く発現
し、グリオーマの悪性度が高くなるにつれて発現が低く
なる明確な相関を示す約７００ｂｐのＰＣＲ産物の存在
を発見した。この遺伝子の発現量は、Normal Brain＞Gr
ade2 (astrocytoma)＞Grade3(anaplastic astrocytoma)
＞Grade4 (glioblastoma) という順番で高く、悪性度に
対して明らかな負相関を示した。

【００１２】（実施例２）ヒトsmall ＴＩＭＰ２遺伝子
のクローニングと塩基配列の決定 実施例１で得られた約７００ｂｐのバンドをアガロース
ゲルから切り出して、TE-buffer 中に電気溶出して回収
した。回収ＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出とエ
タノール沈澱により精製後、各10nmolのdATP,dGTP,dCT
P,dTTP 、5Uの Klenow enzyme(Boehringer Manheim 社
製) を加えた５０μｌのfill in buffer(Boehringer Ma
nheim 社製) 中で３７℃１０分間反応させ、末端を平滑
化した。次いで40nmolのATP 、１０Ｕの polynucleotid
e kinase(TOYOBO,Japan)を加えた１０μｌのkinase buf
fer 中で３７℃３０分間反応させ、５’端をリン酸化し
た。この、末端を平滑化しリン酸化したＤＮＡをEcoRV
で切断後、Calf intestine alkaline phosphatase で脱
リン酸化したベクター pBluescript II SK (-)(Stratag
ene,LaJolla,CA) 150ng と、T4 DNA ligase(Boehringer
Manheim社製) 存在下１６℃１６時間反応させて結合し
た。ligate後のＤＮＡで Competent cell(TAKARA,Japa
n) を形質転換し、５０μｇ／ｍｌの ampicilinを含む
ＬＢ(Luria-Bertani) 寒天培地(1% Bacto-tryptone,0.5
% Bacto-yeast extract,1% NaCl,pH7.5,1.5% Bacto-Aga
r)上にコロニーを形成させ、目的のクローンを得た。得
られたクローンの塩基配列を、Nigro らの方法(Nigro
J.M.et al., Nature, 342, 705-708,1989) およびdideo
xy 法 (Hattori M et al., Anal. Biochem., 152, 232-
238,1986) (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 74, 5463-5467, 1977) によって決定した。そ
の結果、配列番号１に示した新規な配列のｃＤＮＡが得
られた。本遺伝子ＤＮＡ塩基配列について、ＴＩＭＰ２
遺伝子ＤＮＡ塩基配列（国際ＤＮＡデータベースAccess
ion No. S48568,J05593,M32304) との詳細な比較を行っ
た。その結果、本遺伝子ＤＮＡは、ＴＩＭＰ２遺伝子Ｄ
ＮＡ塩基配列（国際ＤＮＡデータベースAccession No.
S48568,J05593)と比べて中間部分（配列番号１の塩基番
号４４と４５の間）で２６７ｂｐが存在せず、ＴＩＭＰ
２遺伝子ＤＮＡ塩基配列（国際ＤＮＡデータベースAcce
ssion No.M32304)と比べても同様に中間部分で２６６ｂ
ｐが存在しない短い配列であることが判った。

【００１３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６７１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNAtomRNA 起源 生物名：ホモサピエンス 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCGAGACAAA GAGGAGAGAA AGTTTGCGCG GCCGAGCGGG GCAGTGATCA GGGCCAAAGC 60 GGTCAGTGAG AAGGAAGTGG ACTCTGGAAA CGACATTTAT GGCAACCCTA TCAAGAGGAT 120 CCAGTATGAG ATCAAGCAGA TAAAGATGTT CAAAGGGCCT GAGAAGGATA TAGAGTTTAT 180 CTACACGGCC CCCTCCTCGG CAGTGTGTGG GGTCTCGCTG GACGTTGGAG GAAAGAAGGA 240 ATATCTCATT GCAGGAAAGG CCGAGGGGGA CGGCAAGATG CACATCACCC TCTGTGACTT 300 CATCGTGCCC TGGGACACCC TGAGCACCAC CCAGAAGAAG AGCCTGAACC ACAGGTACCA 360 GATGGGCTGC GAGTGCAAGA TCACGCGCTG CCCCATGATC CCGTGCTACA TCTCCTCCCC 420 GGACGAGTGC CTCTGGATGG ACTGGGTCAC AGAGAAGAAC ATCAACGGGC ACCAGGCCAA 480 GTTCTTCGCC TGCATCAAGA GAAGTGACGG CTCCTGTGCG TGGTACCGCG GCGCGGCGCC 540 CCCCAAGCAG GAGTTTCTCG ACATCGAGGA CCCATAAGCA GGCCTCCAAC GCCCCTGTGG 600 CCAACTGCAA AAAAAGCCTC CAAGGGTTTC GACTGGTCCA GCTCTGACAT CCCTTCCTGG 660 AAACAGCATG A 671

【図面の簡単な説明】

【図１】各種脳腫瘍組織における small TIMP 2 遺伝子
の発現

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１に記載のヒトsmall ＴＩＭＰ２
   ＤＮＡ
2. 【請求項２】配列番号１に記載のＤＮＡ配列における44
   位45位に相当するヒトＴＩＭＰ２ＤＮＡの、両サイド
   （44位以前と45位以後相当部位）に位置するＤＮＡ配列
   の一部を含むＤＮＡをプライマ−として用い、被検ＤＮ
   ＡまたはＲＮＡとハイブリダイズすることを特徴とす
   る、ヒトsmall ＴＩＭＰ２ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方
   法。
3. 【請求項３】プライマ−が配列番号１に記載のＤＮＡ配
   列の1-44位および45-671位の一部を含むＤＮＡである、
   請求項２記載のヒトsmall ＴＩＭＰ２ＤＮＡまたはＲＮ
   Ａの検出方法。
4. 【請求項４】プライマ−が配列番号１に記載のＤＮＡ配
   列の1-20位センス鎖プライマ−および652-671 位アンチ
   センス鎖プライマ−である、請求項２記載のヒトsmall
   ＴＩＭＰ２ＤＮＡまたはＲＮＡの検出方法。
5. 【請求項５】配列番号１に記載のＤＮＡ配列における44
   位45位に相当するヒトＴＩＭＰ２ＤＮＡの、両サイド
   （44位以前と45位以後相当部位）に位置するＤＮＡ配列
   の一部を含むＤＮＡをプライマ−として含有することを
   特徴とする、ヒトsmall ＴＩＭＰ２ＤＮＡまたはＲＮＡ
   の検出試薬。
6. 【請求項６】プライマ−が配列番号１に記載のＤＮＡ配
   列の1-44位および45-671位の一部を含むＤＮＡである、
   請求項５記載のヒトsmall ＴＩＭＰ２ＤＮＡまたはＲＮ
   Ａの検出試薬。
7. 【請求項７】プライマ−が配列番号１に記載のＤＮＡ配
   列の1-20位センス鎖プライマ−および652-671 位アンチ
   センス鎖プライマ−である、請求項５または６記載のヒ
   トsmall ＴＩＭＰ２ＤＮＡまたはＲＮＡの検出試薬。
8. 【請求項８】配列番号１に記載のＤＮＡ配列の全部、一
   部または相補配列を含む１本鎖ＤＮＡをプロ−ブとして
   用い、被検ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズするこ
   とを特徴とする、ヒトsmall ＴＩＭＰ２ＤＮＡまたはＲ
   ＮＡの検出方法。
9. 【請求項９】配列番号１に記載のＤＮＡ配列の全部、一
   部または相補配列を含む１本鎖ＤＮＡをプロ−ブとして
   含有することを特徴とする、生体試料中のヒトsmall Ｔ
   ＩＭＰ２ＤＮＡまたはＲＮＡの検出試薬。
10. 【請求項１０】ＤＮＡ配列の一部が、少なくとも連続し
    てなる１０個のＤＮＡからなる、請求項２、３または８
    記載の生体試料中のヒトsmall ＴＩＭＰ２ＤＮＡまたは
    ＲＮＡの検出方法。
11. 【請求項１１】配列番号１に記載のＤＮＡ配列の一部
    が、少なくとも連続してなる１０個のＤＮＡからなる、
    請求項５、６または９記載の生体試料中のヒトsmall Ｔ
    ＩＭＰ２ＤＮＡまたはＲＮＡの検出試薬。