JPH09234063A - 新規なα−グルコシダーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 α−グルコシド結合を加水分解して、α−Ｄ
−グルコースを生成し、マルトース、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、ＰＮＰＧ、ＰＮＰＧ２、イソ
マルトース、シュークロースに作用するが、マルトペン
タオシド以上の重合度を持つマルトオリゴサッカライド
にはほとんど作用せず、可溶性澱粉には全く作用しな
い、熱、ｐＨなどに対する安定性に優れた、新規なα−
グルコシダーゼおよびバチルス属に属し、α−グルコシ
ダーゼ生産能を有する菌株を用いた該酵素の製造方法。 【効果】 α−アミラーゼ活性測定などの定量の際の共
役酵素として、またオリゴ糖類からのグルコース、フル
クトースなどの単糖類の生成、並びにヘテロ少糖類の酵
素的合成などに有用なα−グルコシダーゼを、容易にま
た安価に製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マルトース、マル
トトリオース、マルトテトラオース、パラニトロフェニ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシド（以下「ＰＮＰＧ」とい
う）、パラニトロフェニル−α−Ｄ−マルトシド（以下
「ＰＮＰＧ２」という）、イソマルトース、シュークロ
ースなどに作用して、α−Ｄ−グルコシド結合を加水分
解してα−Ｄ−グルコースを生成するが、マルトペンタ
オシド以上の重合度を持つマルトオリゴサッカライドに
はほとんど作用せず、可溶性澱粉には全く作用しない基
質特異性を有し、耐熱性、ｐＨ耐性などに優れた、α−
アミラーゼ活性測定やクロルイオン定量の際の共役酵素
として、又マルトオリゴ糖の定量並びに消去用酵素など
として有用な、新規なα−グルコシダーゼ及びその製造
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】α−１，４−グルコシド結合を加水分解
し、α−Ｄ−グルコースを生成する酵素は、広く生物界
に存在し、例えば酵母、糸状菌、細菌、哺乳動物、植物
種子などに存在しているα−グルコシダーゼや、例えば
カーボハイドレート リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ
ｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第１９７巻、第２２７−２３
５頁、１９９０年に記載のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属由来のオリゴ−１，６−Ｄ−グルコシダーゼなど
が知られている。従来知られているマルトース及びＰＮ
ＰＧによく作用するα−グルコシダーゼとしては、バイ
オサイエンス バイオテクノロジー バイオケミストリ
ー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）第５７巻、第１１号、第１９０２−１９０５頁、
１９９３年に記載の酵母由来のもの、バイオケミカ バ
イオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）第７８７巻、第２８
１〜２８９頁、１９８４年、に記載のバチルス ステア
ロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のものなどが知られてい
る。また該市販酵素として、酵母由来のもの（シグマ
社、東洋紡績（株））、そして微生物由来酵素のもの
（東洋紡績（株））などがある。

【０００３】しかしながら、前記のα−グルコシダーゼ
において、酵母由来のα−グルコシダーゼは、熱、ｐ
Ｈ、阻害剤などの安定性に欠け、酵素製造や、常温での
使用に支障をきたす。また、バチルス ステアロサーモ
フィラス由来酵素及び市販微生物由来酵素は、耐熱性に
は優れているものの、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、ｐ−クロロメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）などの
阻害剤に対する安定性に欠け、基質特異性においてα−
１，６−グリコシド結合に作用せず、同結合を加水分解
するような反応、さらにはマルトペンターオース以上の
重合度を持つマルトオオリゴサッカライドや可溶性澱粉
にも作用するため、それらを基質に用いたα−アミラー
ゼ活性測定時に使用する共役酵素としては不向きであ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前述した従
来のα−グルコシダーゼが有する欠点を克服し、例え
ば、α−アミラーゼ活性測定やクロルイオンの定量など
の際に用いられる、マルトテトラオース以下の重合度を
持つマルトオリゴサッカライド及びＰＮＰＧ、ＰＮＰＧ
２などに作用し得る共役酵素として、また、マルトース
などのマルトオリゴサッカライドの測定並びに消去用酵
素として、あるいはオリゴ糖類からのグルコース、並び
にフルクトースなどの単糖類糖の生成などの工業的生産
において使用可能なα−グルコシダーゼ、及びこの酵素
を安価に、そして容易に製造する方法を提供することを
目的としてなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、広く自然
界よりα−グルコシダーゼを生産し得る微生物の検索を
行った結果、土壌中より分離したバチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）属に属する一菌株が、マルトース、マルトトリ
オース、マルトテトラオース、ＰＮＰＧ、ＰＮＰＧ２に
は作用するが、可溶性澱粉には作用しないという性質を
有する、安定性に優れた新規なα−グルコシダーゼを生
産することを見出し、この知見に基づき本発明を完成す
るに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、下記の理化学的性
質、 (ａ)作用：α−グルコシド結合を加水分解して、α−Ｄ
−グルコースを生成する。 (ｂ)基質特異性：マルトース、マルトトリオース、マル
トテトラオース、パラニトロフェニル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシド、パラニトロフェニル−α−Ｄ−マルトシ
ド、イソマルトース、シュークロースに作用するが、マ
ルトペンタオシド以上の重合度を持つマルトオリゴサッ
カライドにはほとんど作用せず、可溶性澱粉には全く作
用しない。 (ｃ)至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは６．０〜
９．０近辺であり、安定ｐＨ範囲は、０．２％牛血清ア
ルブミン存在下で２５℃、２０時間処理で、ｐＨ５．０
〜１０．０である。 (ｄ)作用適温の範囲：作用適温の範囲は５２〜５５℃近
辺である。 (ｅ）ｐＨ、温度などによる失活の条件：０．２％牛血
清アルブミン存在下で２５℃、２０時間処理で、ｐＨ
５．０〜１０．０の範囲で安定であり、ｐＨ４．５以下
またはｐＨ１１．０以上で完全に失活する。また、熱安
定性はｐＨ７．０、１５分処理で５０℃まで安定であ
り、６０℃以上で完全に失活する。 (ｆ) 分子量：約６１，３００±５，０００（ゲル濾過
法）。 を有する新規α−グルコシダーゼであり、また、バチル
ス属に属し、α−グルコシダーゼ生産能を有する菌株を
培地に培養し、その培養物から該α−グルコシダーゼを
採取することを特徴とするα−グルコシダーゼの製造方
法である。以下、本発明について詳細に説明する。

【０００７】

【発明の実施の形態】まず、本発明の新規なα−グルコ
シダーゼ（以下「本酵素」ということもある）の理化学
的性質の詳細は以下の通りである。

【０００８】（１）作用：本酵素は、α−グルコシド結
合をもつ配糖体もしくは少糖類をその非還元末端側から
加水分解し、α−Ｄ−グルコースを生成する。

【０００９】（２）基質特異性：本酵素は、マルトー
ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、ＰＮＰ
Ｇ、ＰＮＰＧ２、イソマルトース、シュークロースに作
用するが、マルトペンタオシド以上の重合度を持つマル
トオリゴサッカライドにはほとんど作用せず、可溶性澱
粉、アミロペクチン、アミロースには全く作用しない。
本酵素の各種基質に対する相対活性を調べた結果の一例
を表１に示す。

【００１０】

【表１】

【００１１】なお、相対活性の測定条件および方法は、
次の通りである。各基質（２０ｍＭ）０．１１ｍｌ、
０．１％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡという）含有
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．４
９ｍｌ、蒸留水０．３９ｍｌを混和し、３７℃５分間プ
レインキュベーションをした。その後、ＢＳＡ ０．１
％を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で希釈した本酵素液（０．３０３ｍｇ／ｍｌ）を
０．０１ｍｌ反応液に添加、３７℃、１５分間正確に加
水分解反応を行った。反応時間終了後、沸騰水中に反応
液の入った試験管を投入し、酵素反応を止め、生成した
グルコース量を、グルコースＣＩＩテストワコ−（和光
純薬社製）を用いて、グルコースオキシターゼ法により
測定し、生じたグルコース生成量を、ＰＮＰＧのグルコ
ース生成量を１００％とした相対活性比で示した。

【００１２】（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐ
Ｈは、緩衝液として、１００ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ３．５〜５．５）、１００ｍＭ ＭＥＳ
−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．５〜７．０） １
００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０〜８．０）、１００ｍＭ ＴＡＰＳ−水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ ８．０〜９．０）、１００ｍＭ
ＣＨＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ ９．０〜
１０．０）、１００ｍＭ ＣＡＰＳ−水酸化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ １０．０〜１１．０）、を用いた。活性
測定は各緩衝液０．７ｍｌ、２０ｍＭ ＰＮＰＧ溶液
０．２５ｍｌを添加後、３７℃５分間のプレインキュベ
ーションを行い、その後、酵素液（０．００３２７ｍｇ
／ｍｌに濃度を調製し、希釈緩衝液として、０．２％Ｂ
ＳＡ含有１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０を使
用）０．０５ｍｌを添加し、正確に３７℃１５分間反応
を行った。反応時間経過後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム液
１ｍｌを添加して反応を停止させ、生成したパラニトロ
フェノールを発色させた後、その生成量を日立分光光度
計（Ｕ−２０００Ａ 日立社製）を用いて４００ｎｍに
おける吸光度を測定することにより求めた。その結果
は、図１に示すとおりであり、本酵素の至適ｐＨは、
６．０−９．０である。

【００１３】また、安定ｐＨ範囲は、緩衝液として、１
００ｍＭ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ３．５
〜５．５）、１００ｍＭ ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ ５．５〜７．０） １００ｍＭ ＨＥＰＥＳ
−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０〜８．０）、
１００ｍＭ ＴＡＰＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．０〜９．０）、１００ｍＭ ＣＨＥＳ−水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ ９．０〜１０．０）、１００ｍＭ
ＣＡＰＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ １０．０
〜１１．０）、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６．５−８．０）および１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５〜９．０）を用いた。各緩衝液０．０５
ｍｌに、０．３４ｍｇ／ｍｌの酵素０．０１ｍｌ、０．
５％ＢＳＡ ０．０４ｍｌを添加し、２５℃で２０時間
処理を行った。処理後０．２％ＢＳＡ含有１００ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で１００倍に希釈し１０
分放置後、その酵素活性を定法により測定し、その酵素
活性残存度を求めた。その結果は、図２に示すとおりで
あり、本酵素の安定ｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜１０．０
である。

【００１４】（４）作用適温の範囲：後述する力価測定
法における基質、酵素混合液を用い、種々の温度にて本
酵素の力価を測定した。その結果は図３に示す通りであ
り、本酵素の至適温度は５２〜５５℃付近である。

【００１５】（５）ｐＨ、温度等による失活の条件：本
酵素は、０．２％ＢＳＡ存在下２５℃、２０時間処理
で、ｐＨ５．０〜１０．０の範囲で安定であり、図２か
らわかるように、ｐＨ４．５以下またはｐＨ１１．０以
上で完全に失活する。また、熱安定性については、緩衝
液として１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で
酵素濃度を０．０６０６ｍｇ／ｍｌとなるように調整し
た後、各温度にて１５分間インキュベーションを行っ
た。インキュベーション後、０．２％ＢＳＡ含有１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で１００倍希釈、そ
の酵素活性を定法により測定、その酵素活性残存度を求
めた。その結果は、図４に示すとおりであり、本酵素
は、本条件で５０℃まで安定であり、ｐＨ７．０、１５
分処理で６０℃以上で完全に失活する。

【００１６】（６）分子量：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００
ＳＷＸＬ（東ソー社製）によるゲル濾過法で、分子量は
約６１，３００±５，０００と算出された。また、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（使用ゲル：マ
ルチゲル１０−２０、第一化学社製アクリルアミド勾配
１０−２０％のグラジエントゲル）により電気泳動を行
った結果、単一のバンドが得られ、充分純化精製されて
いることが確認された。またその分子量は６０，２００
と算出され、ゲル濾過の結果と併せ、本酵素は、モノマ
ー構造であると判断した。

【００１７】（７）力価の測定法：本酵素の力価の測定
は、下記の方法で行い、ＰＮＰＧより１分間に１μｍｏ
ｌのパラニトロフェノールを遊離する酵素量を１単位
（Ｕ）とした。

【００１８】（基質液、緩衝液、反応停止液、酵素希釈
液の調製） １液；基質液 ２０ｍＭ ＰＮＰＧ溶液 ＰＮＰＧ ０．６０３ｇを蒸留水に溶解し、１００ｍｌ
とした。 ２液；緩衝液 ０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０ ０．１Ｍ−リン酸１カリウム液と０．１Ｍ−リン酸２カ
リウム液を混合してｐＨ７．０に調製した。 ３液；反応停止液 ０．２Ｍ 炭酸ナトリウム液 ２１．２ｇの無水炭酸ナトリウムを蒸留水に溶解し１０
００ｍｌとした。 酵素希釈液 ０．２％ＢＳＡ含有０．０１Ｍ リン酸カリウム緩衝液
ｐＨ７．０を調製した。

【００１９】（測定手順）まず、前記した１液 ０．２
５ｍｌ、２液 ０．５ｍｌを混合し、３７℃にて５分間
プレインキュベーションした後、該プレインキュベーシ
ョンした液と０．００５〜０．０３Ｕ／ｍｌ付近に調製
した酵素液０．２５ｍｌを混合し、３７℃において１５
分間正確に反応させた。次いで、反応時間終了後、３液
１ｍｌを添加して反応を停止させ、パラニトロフェノー
ルを発色させ、その発色液を分光光度計（Ｕ−２０００
Ａ、日立社製）で４００ｎｍにおけるサンプルの吸光度
を測定した。なお、ブランク値の測定は、基質液、緩衝
液を混合、プレインキュベーションの後、酵素液を添加
せず正確に１５分間インキュベーションを行い、３液１
ｍｌを添加し、その後に酵素液を添加してブランク吸光
度を測定した。

【００２０】（力価の計算）前記の測定法で求めたサン
プル吸光度、ブランク吸光度の各値から、下記の計算式
数１によって力価を求めた。

【００２１】

【数１】

【００２２】（８）阻害剤処理に対する安定性：各種阻
害剤処理による影響は、以下の方法で行った。まず２２
ｍＭ該阻害剤０．０１ｍｌ（界面活性剤においては１．
１％）に、０．０６６７ｍｇ／ｍｌの酵素液を含む０．
２％ＢＳＡ含有１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ７．０を０．１ｍｌ添加し、２５℃、１
時間の処理を行った。次いで前記処理後、０．２％ＢＳ
Ａ含有１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を
用いて１００倍に希釈し、その酵素残存活性度を前記の
活性測定法により求めた。その結果は、表２に示すとお
りであり、本酵素は、鉛、銅、水銀及び銀の重金属イオ
ンで失活する。しかし、ＳＤＳ、ＰＣＭＢ、Ｎ−エチル
マレイミドには影響されなかった。

【００２３】

【表２】

【００２４】（９）（Ｋｍ値） ラインウエーバー・バークのプロットからＫｍ値は、Ｐ
ＮＰＧを基質としてｐＨ７．０、３７℃において、５．
５×１０^-5Ｍであり、合成基質に対する親和性が極めて
高い。

【００２５】（１０）精製方法：本酵素の単離、精製は
常法に従って行うことができ、例えば、硫安塩析法、有
機溶媒沈殿法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過
クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、アフィニテ
ィークロマトグラフ法、電気泳動法、疎水クロマトグラ
フ法などを単独、あるいは適切に組み合わせて用いられ
る。

【００２６】本発明の酵素の理化学的性質は前記の通り
であるが、この酵素が新規である根拠を次に示す。前述
のごとく、従来から種々の微生物由来のα−グルコシダ
ーゼが見出され、本酵素とそれらの酵母、バチルス ス
テアロサーモフィラス由来の各公知酵素との比較をする
ため、主要な理化学的性質を表３に示す。なお、表３
中、（注１）の酵母由来α−グルコシダーゼのデータ
は、バイオサイエンス バイオテクノロジー バイオケ
ミストリー（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．）第５７巻、第１１号、第１９０２−１９０５
頁、１９９３年から、また、（注２）のバチルス ステ
アロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来α−グルコシダーゼの
データは、バイオケミカ バイオフィジカ アクタ（Ｂ
ｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ）第７８７巻、第２８１〜２８９頁、１９８４
年、から引用したものである。

【００２７】

【表３】

【００２８】表３からわかるかるように、本酵素は、そ
の基質特異性においてマルトペンタオース以上のマルト
オリゴ糖にはほとんど作用せず、アミロース、アミロペ
クチン、可溶性澱粉には全く作用しないことから、バチ
ルス ステアロサーモフィラス由来酵素とは異なる。そ
して、本酵素は、例えば中性付近のｐＨで行なう可溶性
澱粉を用いたアミラーゼ活性測定の際の共役酵素などと
して有用である。また、本酵素は、酵母由来酵素と比較
して、その基質特異性の傾向は似ているが、安定ｐＨ範
囲、熱安定性において異なり優れている。したがって、
本酵素は、通常使用されている温度２５〜４５℃付近で
の使用においても安定であり、またｐＨ５．０〜１０．
０の幅広い範囲で酵素精製が可能であるので、本酵素の
製造においても精製が容易であるという効果をもたら
し、有用である。これらのことから、本酵素は、従来の
α−グルコシダーゼにはない有用な性質を有する新規な
α−グルコシダーゼである。

【００２９】次に、本酵素の製造方法について説明す
る。先ず、使用される菌としてはバチルス属に属し、本
酵素生産能を有する菌株であればいかなる菌でもよく、
またこれらの菌の変種又は変異株でもよい。そして、そ
の微生物の具体例としては、バチルス エスピー（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳ−１０８ａが挙げられ、該
菌株の変種又は変異株も用いることができる。このバチ
ルス エスピー ＫＳ−１０８ａは、本発明者らが熊本
県内の土壌より採取して得た菌株であり、その菌学的性
質は以下に示すとおりである。なお菌学的性質の同定の
ための実験は、主として長谷川武治編著「微生物の分類
と同定東京大学出版会（1975年）によって行った。また
分類同定の基準として、バージーズ マニュアル オブ
デターミネィネィテブ バクテリオロジー（第８版）
（１９７４年）を参考にした。

【００３０】バチルス エスピー ＫＳ−１０８ａの菌
学的性質 （Ａ）形態的性質 顕微鏡的観察（肉汁寒天培地（ｐＨ７．０）上で、５０
℃、５〜７時間培養）。 （１）細胞の形及び大きさ：０．１〜０．５×１〜７ミ
クロンの桿菌。 （２）運動性の有無：運動性あり。 （３）胞子の有無：あり。 （４）グラム染色性：陽性。

【００３１】（Ｂ）各培地（ｐＨ７．０）における生育
状態 （１）肉汁寒天平板培養 ５０℃、１６時間の静置培養で、淡茶色の円形コロニ−
を形成する。色素の産生は認められない。 （２）肉汁寒天斜面培養 ５０℃、１６時間の培養で生育を示す。 （３）肉汁液体培養 ５０℃、１６時間の静置培養で培地全体に微かな生育
（濁り）が認められる。厚い菌膜生ずる。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養 ５０℃、３日間の静置培養で、ゼラチンを液化しない。 （５）リトマスミルク培養 ５０℃、４８時間の静置培養で、リトマスミルクの凝
固、液化は認められず、酸もしくはアルカリの産生も認
められない。

【００３２】（Ｃ）生理的性質 主に、ｐＨ７．０ に調製した培地を用いて試験した。 (１）硝酸塩の還元：還元する。 （２）脱窒反応：無し。 （３）ＭＲテスト：陰性。 （４）ＶＰテスト：非常に弱いが陽性。 （５）インド−ルの生成：生成しない。 （６）硫化水素の生成：生成しない。 （７）デンプンの加水分解：加水分解しない。 （８）クエン酸の利用：利用する。 （９）無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩共に
利用する。 （１０）色素の生成：生成しない。 （１１）ウレア−ゼ：陽性。 （１２）オキシダ−ゼ：弱いが陽性。 （１３）カタラ−ゼ：陽性。 （１４）生育の範囲：温度；３３〜５５℃，ｐＨ；６．
１〜９．４ （１５）酸素に対する態度：好気性。 （１６）Ｏ〜Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ
法）：酸化（炭素源としてグルコースを０．５％添
加。） （１７）糖類からの酸及びガスの生成の有無：表４に示
すごとく、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マ
ンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビノース、シュー
クロース、マルトース、Ｄ−マンニトールより酸の生成
が認められるが、ガスの生成は認められない。

【００３３】

【表４】

【００３４】前記した菌学的性質を有し、新規なα−グ
ルコシダーゼ生産能を有する本菌株は、グラム染色が陽
性であること、運動性を有すること、胞子形成能を有す
ることなどから、バチルス属に属するものと判定され
る。従って本菌株をバチルスエスピー（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｐ．）ＫＳ−１０８ａと同定命名した。本菌株は
工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ ＢＰ
−５３３７として寄託されている。なお、本発明におけ
るα−グルコシダーゼとしては、前記した作用、基質特
異性、などの主要な理化学的性質を有するものであれば
良く、その他の理化学的性質が多少の相違を示すもので
あっても本酵素として包含される。そして前記の微生物
はこのようなα−グルコシダーゼを得るための使用菌の
一例であって、本発明においてはバチルス属に属し、前
記α−グルコシダーゼ生産能を有するものであれば使用
できる。

【００３５】次に、バチルス属に属し、α−グルコシダ
ーゼ生産能を有する菌株を用いて本酵素を生産するに
は、培地として炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養
素をほどよく含有するものであれば、合成培地または天
然培地のいずれでも使用できる。炭素源としては、本酵
素を誘導することが可能な炭素化合物であればよく、例
えば粉末水飴を含む培地とするのが望ましい。窒素源と
しては、利用可能な窒素化合物であればよく、例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカ
ー、大豆粉、アミノ酸、硫安、硝酸アンモニウムなどが
使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄、リン酸第一カリウ
ム、リン酸第二カリウム、炭酸ナトリウムなどの種々の
塩類、ビタミン類、消泡剤などが使用される。これらの
栄養源はそれぞれ単独で用いることもでき、またこれら
を組み合わせて用いることもできる。

【００３６】上記のごとくして調製した液体培地を用い
て本酵素を生産するには、通気攪拌深部培養または振盪
培養などにより好気的に培養することが好ましい。その
際に、培地の初発ｐＨを６．５〜７．０程度に調整し、
３５〜５５℃、好ましくは５０℃前後の温度で７時間以
上培養する。培養終了後、培養物から本酵素を採取する
には、通常の酵素採取手段を用いることができる。

【００３７】本酵素は、主に菌体内に存在する酵素であ
るため、培養物から例えば濾過、遠心分離などの操作に
より菌体を分離し、この菌体からα−グルコシダーゼを
採取することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用
いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、
ダイナミルなどの種々の破壊手段を用いて菌体を破壊す
る方法、リゾチームのごとき細胞壁溶解酵素を用いて菌
体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００などの界
面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法などを、
単独または適宜組み合わせて採用することができる。次
いで、濾過または遠心分離などにより不純物を除き、本
酵素の粗酵素液を得る。このようにして得られた粗酵素
液から本酵素を単離するには、前記したごとき通常の酵
素精製に用いられる方法が適用できる。

【００３８】以上のごとくして得られた本酵素は、例え
ばα−アミラーゼ活性測定やクロルイオン定量時の共役
酵素として、またマルトースなどのマルトオリゴサッカ
ライドの測定並びに消去用酵素として、あるいはまたオ
リゴ糖類からのグルコース、並びにフルクトースなどの
単糖類糖生成などの工業的生産酵素として利用が可能で
ある。

【００３９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら
限定されるものではない。 （実施例）粉末水飴（昭和産業社製）２．０％、ポリペ
プトン ２．０％、酵母エキス１．０％、リン酸１カリ
ウム ０．０１％、リン酸２カリウム ０．０１％、硫
酸マグネシウム７水和物０．０１％および水道水からな
る培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを坂口コルベンに入
れ、１２１℃で７分間殺菌した。この培地に、バチルス
エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳ−１０８
ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３７）の保存スラントより１
白金耳を接種し、これを振盪機にて４０℃で約１６時間
振盪培養し、種培養液とした。次いで、別に前記と同様
の培地に、消泡剤（ニッサンディスホームＣＣ−４８
５）を２ｍｌ添加し、１２１℃、７分間殺菌して調製し
た培地２０Ｌを含む３０Ｌ容ジャーファメンターへ、前
記種培養液１００ｍｌ（坂口コルベン １本分）を接種
し、回転数 ３００ｒｐｍ、内圧０．５Ｌ、通気量 ２
０Ｌ／ｍｉｎ、温度５０℃で約７時間培養した。培養終
了後、培養液２０Ｌから、マイクローザ ＰＷ−３０３
（旭化成社製）を用いて菌体を集め、水道水にて菌体を
洗浄した後、菌体を約１０Ｌに濃縮した。

【００４０】本酵素の精製は、以下に示す操作により行
なった。 ステップ１（粗酵素液の調製）：前記菌体濃縮液に、
０．５５Ｍ ＥＤＴＡ ２ナトリウム塩（ｐＨ８．０）
を１Ｌ添加、混合し、２０℃で２晩溶菌させた後、５％
プロタミン水溶液（ｐＨ８．０）２００ｍｌを攪拌しな
がら滴下して除核酸処理を行った。この上澄液を限外濾
過膜を用いて０．１Ｍ塩化カリウムを含む０．０１Ｍリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（以下「緩衝液Ａ」
という）に対して透析した。

【００４１】ステップ２（ＤＥＡＥーセルロース処
理）：前記の透析液（約 １０Ｌ）に、湿重量で約９Ｋ
ｇのＤＥＡＥーセルロースを添加、混合して、本酵素を
吸着させた後、０．１Ｍ塩化カリウム含有緩衝液Ａにて
ＤＥＡＥ−セルロースを洗浄し、次に、０．３Ｍ塩化カ
リウム含有緩衝液Ａにて本酵素を溶出し、その溶出液を
フォロファイバータイプ限外濾過装置を使用して濃縮
し、０．１Ｍ塩化カリウム含有緩衝液Ａに置換する透析
を行った。

【００４２】ステップ３（ＱＡＥ−セファデックスＡ−
５０ バッチワイズ処理)：前記の透析液（１０００ｍ
ｌ）に、１０００ｍｌのＱＡＥ−セファデックスＡ−５
０を添加、混合して、本酵素を吸着させた後、０．１５
Ｍ 塩化カリウム含有緩衝液ＡにてＱＡＥ−セファデッ
クス Ａ−５０を洗浄し、次に、０．２Ｍ塩化カリウム
含有緩衝液Ａにて本酵素を溶出した。その溶出液をフォ
ロファイバータイプ限外濾過装置を使用して濃縮し、
０．０８Ｍ塩化カリウム含有緩衝液Ａに置換する透析を
行った。

【００４３】ステップ４（ＤＥＡＥトヨパール ６５０
Ｃカラムクロマトグラフィー）：前記の透析液（５００
ｍｌ）を、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｃのカラム
（４．２×３０ｃｍ）に吸着させ、０．０８Ｍ塩化カリ
ウム含有緩衝液Ａにて洗浄し、次に、０．０８Ｍ〜０．
２Ｍ塩化カリウム含有緩衝液Ａにて直線濃度勾配法によ
り溶出させた。溶出された活性画分は、フォロファイバ
ータイプ限外濾過装置を使用して濃縮、及び緩衝液Ａに
置換する透析を行った。

【００４４】ステップ５（ブチルトヨパール６５０Ｃカ
ラムクロマトグラフィ−）：前記透析液（２００ｍｌ）
に、２Ｍ硫安含有緩衝液Ａを２００ｍｌ添加した。添加
後、同酵素液をブチル−トヨパール６５０Ｃのカラム
（４．２×３０ｃｍ）に吸着させ、１Ｍ硫安含有緩衝液
Ａにて洗浄し、次に１Ｍ〜０．７Ｍ硫安含有緩衝液Ａに
て直線濃度勾配法により溶出させた。溶出された活性画
分は、フォロファイバータイプ及び平膜タイプの限外濾
過装置を使用して濃縮し、０．１Ｍ塩化カリウム含有緩
衝液Ａに置換する透析を行った。

【００４５】ステップ６ ゲル濾過（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ
Ａ１．５ｍ２００−４００ｍｅｓｈ）： 前記の透析液
（約２ｍｌ）を、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ１．５ｍ２００−
４００ｍｅｓｈを充填したカラム（２．５×９５ｃｍ）
に通過させ、０．１Ｍ塩化カリウム含有緩衝液Ａにてゲ
ル濾過を行い、溶出された活性画分を採取した。以上の
精製操作により、精製酵素標品（約１，０６１Ｕ、３
３．１Ｕ／ｍｇ蛋白質）を得た。

【００４６】

【発明の効果】本酵素は、特に基質特異性において、マ
ルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、パ
ラニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、パラニ
トロフェニル−α−Ｄ−マルトシド、イソマルトース、
シュークロースに作用するが、マルトペンタオシド以上
の重合度を持つマルトオリゴサッカライドにはほとんど
作用せず、可溶性澱粉には全く作用しないという特性、
さらに熱安定性がよく、安定ｐＨ範囲が広く、界面活性
剤などに対する安定性に優れているという特性を有して
いるため、従来の酵母由来の酵素などに代わって、α−
アミラーゼ活性測定やクロルイオン定量時に用いられ
る、マルトテトラオース以下の重合度を持つマルトオリ
ゴサッカライド及びＰＮＰＧ、ＰＮＰＧ２などに作用し
得る共役酵素として、またマルトースなどのマルトオリ
ゴサッカライドの定量並びに消去用酵素として利用価値
が非常に高い。また本酵素は、オリゴ糖類からのグルコ
ース、並びにフルクトースなどの単糖類の生成、並びに
糖転移作用を利用した希少なヘテロ少糖類の酵素的合成
などの工業的生産においても利用が可能である。さらに
また、本発明の方法によれば、本酵素を微生物の培養に
よって極めて短時間に大量に得ることができること、し
かも本酵素は熱、ｐＨに対する安定性に優れているた
め、５０℃までの熱処理が可能であり、さらにｐＨ５〜
１０の幅広い範囲で精製が可能であることなどから、本
酵素を容易にまた、安価に製造が可能であり、産業上極
めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本酵素の３７℃における至適ｐＨを示すグラ
フ。

【図２】 本酵素の０．２％ＢＳＡ存在下で、２５℃、
２０時間処理における安定ｐＨ範囲を示すグラフ。

【図３】 本酵素のｐＨ７．０における作用適温の範囲
を示すグラフ。

【図４】 本酵素のｐＨ７．０における熱安定性を示す
グラフ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する新規α−グ
   ルコシダーゼ。 (ａ)作用：α−グルコシド結合を加水分解して、α−Ｄ
   −グルコースを生成する。 (ｂ)基質特異性：マルトース、マルトトリオース、マル
   トテトラオース、パラニトロフェニル−α−Ｄ−グルコ
   ピラノシド、パラニトロフェニル−α−Ｄ−マルトシ
   ド、イソマルトース、シュークロースに作用するが、マ
   ルトペンタオシド以上の重合度を持つマルトオリゴサッ
   カライドにはほとんど作用せず、可溶性澱粉には全く作
   用しない。 (ｃ)至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは６．０〜
   ９．０近辺であり、安定ｐＨ範囲は、０．２％牛血清ア
   ルブミン存在下で２５℃、２０時間処理で、ｐＨ５．０
   〜１０．０である。 (ｄ)作用適温の範囲：作用適温の範囲は５２〜５５℃近
   辺である。 (ｅ）ｐＨ、温度などによる失活の条件：０．２％牛血
   清アルブミン存在下で２５℃、２０時間処理で、ｐＨ
   ５．０〜１０．０の範囲で安定であり、ｐＨ４．５以下
   またはｐＨ１１．０以上で完全に失活する。また、熱安
   定性はｐＨ７．０、１５分処理で５０℃まで安定であ
   り、６０℃以上で完全に失活する。 (ｆ) 分子量：約６１，３００±５，０００（ゲル濾過
   法）。
2. 【請求項２】 バチルス属に属し、請求項１記載のα−
   グルコシダーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、そ
   の培養物から該α−グルコシダーゼを採取することを特
   徴とする請求項１記載のα−グルコシダーゼの製造方
   法。
3. 【請求項３】 バチルス属に属する菌株が、バチルス
   エスピー ＫＳ−１０８ａであることを特徴とする請求
   項２記載のα−グルコシダーゼの製造方法。