JPH09218198A - 骨吸収速度測定方法 - Google Patents

骨吸収速度測定方法

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JPH09218198A JP8195241A JP19524196A JPH09218198A JP H09218198 A JPH09218198 A JP H09218198A JP 8195241 A JP8195241 A JP 8195241A JP 19524196 A JP19524196 A JP 19524196A JP H09218198 A JPH09218198 A JP H09218198A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】尿などの体液を使用して、人の全身骨吸収速度
を簡単にかつ高感度で測定する方法を提供する。 【解決手段】骨コラーゲン吸収に由来し３−ヒドロキシ
ピリジニウム架橋を含むペプチド断片の体液中の濃度を
定量する骨吸収速度測定方法において、該ペプチドとし
て骨Ｉ型コラーゲンのαＩ（Ｉ）鎖のカルボキシ末端テ
ロペプチド領域に由来する２個のアミノ酸配列を有する
ペプチド断片を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は骨吸収速度測定方法
に関するものである。さらに詳しく述べるならば、それ
は特殊な尿中架橋アミノ酸、並びに分解した骨コラーゲ
ンに由来するアミノ酸を含むペプチド断片を定量化する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】骨粗鬆症は人における最も一般的な骨疾
患である。骨折し易くなる初期骨粗鬆症は骨格骨量の進
行性正味喪失に起因する。米国では１５００〜２０００
万人がこの疾患にかかっていると推定される。その根本
原理は、骨再形成における、すなわち骨組織の合成速度
と分解速度との、年齢依存性不平衡である。毎年約１２
０万の骨粗鬆症関連骨折が老人におこり、そのうち約５
３８，０００例は背骨の圧迫骨折で、約２２７，０００
例は股関節部骨折で、その他にかなりの数の以前に骨折
した末梢骨がある。股関節骨折の１２〜２０％は、ひど
い外傷及び出血をおこすため致命的であり、生きている
患者の半数は療養所のケアを必要とする。骨粗鬆症関連
損傷による総コストは年間最低７０億ドルに達する［バ
ーンズ（Ｂａｒｎｅｓ，Ｏ．Ｍ．）、科学（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）２３６巻９１４ページ（１９８７）］。骨粗鬆症
は閉経後女性に最も一般的であり、彼女らは平均して、
閉経後１０年間で骨量の１５％を失う。この病気は年を
とった男性および若い無月経の女性運動家にもおこる。
骨粗鬆症の重大かつ増大しつつある社会的および経済的
結果にもかかわらず、患者または健常者の骨吸収速度を
測定する方法はない。この病気をモニターすることがむ
ずかしい主な理由は、骨吸収速度測定法がないことであ
る。
【０００３】骨量測定法は、中性子活性化分析による全
身的カルシウム測定または光子吸収法による或る骨の鉱
質量測定に依ることが多い。これらの方法は骨量が減少
しているかどうかの長期的印象を与え得るだけである。
摂取量を排出量と比較することによるカルシウム平衡の
測定は時間がかかり、信頼できない。そして骨鉱質が長
期にわたって失われているかどうかを間接的に評価でき
るに過ぎない。減少した骨量および変化した骨代謝を測
定するために現在使用できるその他の方法としては、選
択した骨部分（腰、踵骨）での定量的走査ラジオメトリ
ーおよび腸骨稜バイオプシーの組織形態測定がある。前
者は単一の骨の特定部位の骨鉱質含量の粗測定値を与え
る。組織形態測定は、新しく沈着した骨のつぎ目（ｓｅ
ａｍ）と吸収面との釣合いの半定量的評価である。
【０００４】２４時間の分解骨の全身排出量を知るため
の尿検査はずっとより有効である。鉱質研究（たとえば
カルシウム平衡）は信頼性をもって、或いは容易にはこ
れをすることができない。骨吸収は鉱質および有機基質
の分解を含むから、体液中の新たに分解した骨生成物の
特異的生化学的マーカーが理想的インデックスになる。
幾つかの可能性のある有機インデックスが試験された。
たとえば、オキシプロリン（ほとんどコラーゲンに限定
されるアミノ酸であり骨およびその他の結合組織の主要
構造蛋白質）が尿中に排泄される。その排出速度はある
状態、特に骨ターンオーバーが大きく増加する代謝的骨
疾患であるページェット病においては増加することが知
られている。この理由で尿中オキシプロリンは、コラー
ゲン分解を示すアミノ酸マーカーとして広く用いられて
いる［シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ，Ｆ．Ｒ．）ら（１９７
８）の“骨代謝疾患（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂｏｎｅ
Ｄｉｓｅａｓｅ）”II巻（Ａｖｉｏｌｉ，Ｌ．Ｖ．およ
びＫｒａｎｅ，Ｓ．Ｍ．編）４８９−５７５ページ、ア
カデミックプレス、ニューヨーク］。
【０００５】ゴヴァード（Ｇｏｖｅｒｄｅ）（米国特許
第３，６００，１３２号）は、体液、たとえば血清、
尿、腰椎液、その他の細胞間液中のオキシプロリンを測
定してコラーゲン代謝の変化をモニターする方法を開示
している。詳しく述べるならば、この発明者は、たとえ
ばページェット病、マルファン症候群、骨形成不全症、
コラーゲン組織の新生物増殖および種々の形の矮小発育
症などの病的状態において、生物学的液体中のオキシプ
ロリン量によって測定されるコラーゲン同化または異化
の増加を明らかにすることができた。この発明者はオキ
シプロリンを過酸化水素およびＮ−クロロ−ｐ−トルエ
ンスルフォンアミドで酸化してピロールにし、それをｐ
−ジメチル−アミノ−ベンズアルデヒド中で比色測定す
ることによってオキシプロリンを測定した。
【０００６】ページェット病の場合には増加した尿中オ
キシプロリンは多分ほとんどが骨分解に由来するが、オ
キシプロリンは概して、特異的指数として用いることが
できない。尿中オキシプロリンの多くは新しいコラーゲ
ン合成に由来し（新しく形成された蛋白質のうちのかな
りの量は組織構造に組み込まれることなく分解し、排泄
される）、またある種の血液蛋白質並びにオキシプロリ
ンを含むその他の蛋白質のターンオーバーに由来するか
もしれない。その上蛋白質分解に由来する遊離オキシプ
ロリンの約８０％が肝臓で代謝され、尿中には決してあ
らわれない［キヴィリコ（Ｋｉｖｉｒｉｋｏ，Ｋ．
Ｉ．）（１９７０）のＩｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｏｎｎｅｃ
ｔ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｏｓ．５巻９３ページおよびヴァ
イス（Ｗｅｉｓｓ，Ｐ．Ｈ．）およびクライン（Ｋｌｅ
ｉｎ，Ｌ．）（１９６９）のＪ．Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅ
ｓｔ．４８巻１ページ］。
【０００７】ヒドロキシリジンおよびそのグリコシド誘
導体（両方共コラーゲン蛋白質に独特である）はコラー
ゲン分解のマーカーとしてオキシプロリンより正確であ
ると考えられた。しかしながらオキシプロリンについて
上に記したと同じ理由で、ヒドロキシリジンおよびその
グリコシドは多分等しく非特異的な骨吸収マーカーであ
る［クレイン（Ｋｒａｎｅ，Ｓ．Ｍ．）およびシモン
（Ｓｉｍｏｎ，Ｌ．Ｓ．）（１９８１）のＤｅｖｅｌｏ
ｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２巻１８５ページ］。
【０００８】コラーゲンに特異なアミノ酸に加えて、骨
質の種々の非コラーゲン性蛋白質、たとえばオステオカ
ルシン、またはその分解産物が、骨代謝測定を目的とす
るイムノアッセイの基礎を形成した［プライス（Ｐｒｉ
ｃｅ，Ｐ．Ａ．）ら（１９８０）、Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｉ
ｎｖｅｓｔ．６６巻８７８ページおよびガンドバーグ
（Ｇｕｎｄｂｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．）ら（１９８４）Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０７巻５１６ページ］。しかし
ながら、現在では、骨由来の非コラーゲン蛋白は、骨代
謝活動の有用な指標となる可能性はあるものの、それ自
身が骨吸収の定量手段とはなりそうもないということが
明らかになっている。例えば、オステオカルシンの血清
中の濃度は、正常な及び代謝性骨疾病の両者で巾広く変
動する。その濃度は、骨格のターンオーバーが高められ
た状態では上昇するが、このことが増加した骨の合成又
は分解によるものかどうかは不明である。［クレイン
（Ｋｒａｎｅ，Ｓ．Ｍ．）ら（１９８１）Ｄｅｖｅｌｏ
ｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２巻１８５ページ，プライス
（Ｐｒｉｃｅ，Ｐ．Ａ．）ら（１９８０）Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６６巻８７８ページ，及びガンドバ
ーグ（Ｇｕｎｄｂｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．）ら（１９８４）Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０７巻５１６ページ。］
【０００９】（コラーゲンの架橋）最も遺伝的タイプの
脊椎コラーゲンのポリマーは、正常に機能するためには
アルデヒド仲介性架橋の形成を必要とする。コラーゲン
アルデヒドは二，三の特異的リジンまたはヒドロキシリ
ジン側鎖から、リジン酸化酵素の作用によって誘導され
る。新しく形成されたコラーゲンポリマー内のこれらア
ルデヒドの自発的分子内および分子間反応によって、種
々の２−、３−および４官能性架橋アミノ酸が形成され
る。架橋残基の種類は組織の種類と共に特異的に変化す
る［Ｅｙｒｅ，Ｄ．Ｒ．ら（１９８４），Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３巻７１７−７４８ページ参
照］。架橋の二つの基礎的径路は、一つはリジンアルデ
ヒドに基礎を置き、他はヒドロキシリジンアルデヒドに
基礎を置く縞模様の（６７ｎｍ反復）繊維性コラーゲン
で区別される。リジンアルデヒド径路は成人皮膚、角
膜、強膜およびラット尾腱に優勢であり、その他の軟結
合組織にもよくおこる。ヒドロキシリジンアルデヒド径
路は骨、軟骨、靭帯、大部分の腱および体内の大部分の
内部結合組織に優勢である［Ｅｙｒｅ，Ｄ．Ｒ．ら（１
９７４）、上記参照］。機能する径路は、リジン残基が
テロペプチド部位（ここには後に、リジル酸化酵素によ
ってアルデヒドが形成される）でヒドロキシル化される
かどうかによって支配される［バーンズ（Ｂａｒｎｅ
ｓ，Ｍ．Ｊ）ら（１９７４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１
３９巻４６１ページ］。
【００１０】リジンアルデヒド径路の成熟した架橋アミ
ノ酸の化学構造は未知であるが、ヒドロキシリジンアル
デヒド径路の成熟産物としてはヒドロキシピリジニウム
残基が確認された。どちらの径路でも、その大部分の組
織で、中間体である水素化硼素還元可能の架橋残基は新
しく形成されたコラーゲンが成熟するにつれて消失す
る。これはそれらが比較的短命の中間体であることを示
唆している［Ｂａｉｌｅｙ，Ａ．Ｊ．ら（１９７１）、
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、１６巻８６ページ］。例外は骨と
歯である。ここでは還元可能残基がかなりの濃度で生存
期間中存在する。この理由は一部には明らかに、新しく
つくられたコラーゲン繊維の急速な鉱質化がその後の自
発的架橋による相互作用を阻害するからである［Ｅｙｒ
ｅ，Ｄ．Ｒ．（１９８１）“鉱質化結合組織の化学およ
び生物学（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｃｏｎｎ
ｅｃｔｉｎｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ）（Ｖｅｉｓ，Ａ．編
集）５１−５５ページ、エルセヴィール、ニューヨー
ク、およびウォルターズ（Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｃ．）ら
（１９８３）Ｃａｌｃ．Ｔｉｓｓ．Ｉｎｔｌ．３５巻４
０１−４０５ページ）］。
【００１１】３−ヒドロキシピリジニウム架橋の二つの
化学構造が確認された（下記構造式ＩおよびII）。両化
合物共、本来蛍光性で、同じ特異的励起と発光スペクト
ルを有する［フジモトＤ．ら（１９７７）、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６巻
１１２４ページ、およびＥｙｒｅ，Ｄ．Ｒ．（１９８
１）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２巻５０ペー
ジ］。これらのアミノ酸を組織加水分解産物中に溶か
し、逆相ＨＰＬＣおよび蛍光検出を用いて高感度で直接
測定することができる（Ｅｙｒｅ，Ｄ．Ｒ．ら（１９８
４）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７巻３８０−
３８８ページ）。
【００１２】
【化１】
【００１３】
【化２】
【００１４】成長しつつある動物ではこれらの成熟架橋
は鉱質化コラーゲンよりも骨の非鉱質化コラーゲンフラ
クションにより多く集中することが報告された（ベイン
ズＡ．Ｊ．ら１９８３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１３巻、１９７５）。し
かしながら若いウシまたは成人の骨に対するその他の研
究はこの概念を支持していない［Ｅｙｒｅ，Ｄ．Ｒ．
（１９８５）著“鉱質化組織の化学および生物学（Ｔｈ
ｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ Ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ）”、バ
トラー（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｗ．Ｔ．）編、１０５ページ、
Ｅｂｓｃａ Ｍｅｄｉａ社、バーミンガム、アラバ
マ］。
【００１５】冗長なペプチド分離法と一般的アミノ酸分
析を用いて、人尿中にコラーゲンヒドロキシピリジニウ
ム架橋が存在することを始めて報告したのは、Ｇｕｎｊ
ａ−ＳｍｉｔｈおよびＢｏｕｃｅｋであった（Ｇｕｎｊ
ｉ−Ｓｍｉｔｈ，ＺおよびＢｏｕｃｅｋ，Ｒ．Ｊ．１９
８１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７巻７５９−７６２ペ
ージ）。その当時彼等はＨＰ型の架橋しか知らなかっ
た。
【００１６】ロビンズ（Ｒｏｂｉｎｓ，Ｓ．Ｐ．１９８
２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０７巻６１７−６２０ペー
ジ）は、ウシ血清アルブミンに抱合した遊離アミノ酸に
対する高濃度のポリクローナル抗体を用いる、尿中ＨＰ
を測定するための酵素結合免疫測定法を報告した。この
測定法は関節疾患でおこる関節破壊の増加をモニターす
るための指数を提供するためのものであり、ロビンズに
よると、ピリジノリンは骨コラーゲンよりも軟骨にずっ
と多く分布するという研究結果に基づいている。酵素結
合免疫測定法に関するさらに最近の研究で、ロビンズ
は、ウシ血清アルブミンに共有結合したピリジノリンに
対する抗血清に対してリジルピリジノリンは反応しない
と報告した（ロビンズら１９８６、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕ
ｍ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ４５巻９６９−９７３ページ）。
軟骨破壊をあらわすロビンズの尿指数は、主として軟骨
に由来するヒドロキシリジルピリジノリンが関節軟骨吸
収度に比例する濃度で尿中に見出されるという発見に基
づいている。原則としてこの指数は総体内軟骨喪失量を
測定するために用いられる。しかしながら骨吸収に関す
る情報は手に入らない。実際、ロビンズの測定法は軟骨
破壊よりもむしろ、リウマチ様関節炎におこる増加した
骨再形成を広く測定していたようにみえる。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】そこで人における全身
骨吸収速度を測定できる方法が必要である。最も有用な
この種の方法は、体液、特に尿に適用できる方法であ
る。その方法は敏感で、すなわち１ピコモルまで定量で
きなければならない。そして２４時間骨吸収速度を速や
かに測定して種々の治療（たとえばエストロゲン）の経
過を評価できるようでなければならない。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は、骨コラーゲン
吸収に由来する３−ヒドロキシピリジニウム架橋をもつ
ペプチドフラクションの体液中濃度を定量することから
成る絶対的骨吸収速度測定法を提供する。定量段階は、
骨コラーゲン吸収に由来する３−ヒドロキシピリジニウ
ム架橋をもつペプチドフラクションに特異的な免疫学的
結合パートナーと、体液とを接触させることから成る。
発明の一実施態様では、体液を接触前に任意に精製す
る。この精製段階は、カートリッジ吸着および溶出、分
子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミナ
クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグ
ラフィー、これらの組み合わせなどを含む多数の標準的
方法の中から選択される。
【００１９】本発明は、体液中の３−ヒドロキシピリジ
ニウム架橋をもつペプチド断片濃度を定量するその他の
方法も含む。これらの方法としては電気化学的滴定、自
然蛍光スペクトル分析、および紫外線吸収がある。電気
化学的滴定は、さらに精製することなく体液で直接行う
ことができる。しかしながら過剰量の汚染物質のために
これが不可能の場合は、体液を電気化学的滴定前に先づ
精製する。電気化学的検出前の適した精製法としては、
透析、イオン交換クロマトグラフィー、アルミナクロマ
トグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、ヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィー、およびイオン交換吸着
および溶出がある。
【００２０】３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含む体
液の蛍光測定法は、骨吸収を定量するもう一つの方法で
ある。蛍光測定法は、さらに精製することなく体液で直
接行うことができる。しかしある種の体液、特に尿で
は、蛍光測定法の前に体液の精製を行うことが好まし
い。この精製段階は尿の一部を水溶液に対して透析し、
非透析物内に保持される一部精製されたペプチド断片を
生成することから成る。それから非透析物を凍結乾燥
し、イオン対溶液に溶かし、アフィニティークロマトグ
ラフィーカラム上に吸着させた。クロマトグラフィーカ
ラムをある量のイオン対溶液で洗い、その後ペプチド断
片を溶出液でカラムから溶出する。これら精製したペプ
チド断片をそれから加水分解し、加水分解物をクロマト
グラフィーで分離する。クロマトグラフィー分離は、高
性能液体クロマトグラフィーか、ミクロボア（ｍｉｃｒ
ｏｂｏｒｅ）高性能液体クロマトグラフィーで行われ
る。
【００２１】本発明は、体液から得られる、他のヒトペ
プチドをほとんど含まない、骨コラーゲン由来のペプチ
ド断片を含む。ペプチド断片は３−ヒドロキシピリジニ
ウム架橋、特にリジルピリジノリン架橋およびヒドロキ
シリジルピリジノリン架橋を含む。骨Ｉ型コラーゲンの
アミノ末端テロペプチド領域から誘導される３−ヒドロ
キシピリジニウム架橋をもつ特異的ペプチド断片は次の
アミノ酸配列を有する。
【００２２】
【化３】
【００２３】ここでK-K-K はヒドロキシリジルピリジノ
リンまたはリジルピリジノリンで、Gln はグルタミンか
または完全に環化したピロリドンカルボン酸である。
【００２４】本発明は、骨Ｉ型コラーゲンのカルボキシ
末端テロペプチド領域から誘導される３−ヒドロキシピ
リジニウム架橋含有ペプチド断片をも包含する。これら
のカルボキシ末端テロペプチド配列は、リジルピリジノ
リンまたはヒドロキシリジルピリジノリンのどちらかと
架橋する。このようなペプチド配列の例は次の構造式に
よってあらわされる。
【００２５】
【化４】
【００２６】ここでK-K-K はヒドロキシリジルピリジノ
リンまたはリジルピリジノリンである。
【００２７】本発明は、３−ヒドロキシピリジニウム架
橋を有する骨コラーゲン由来のペプチド断片に特異的な
モノクローナル抗体を産生する融合細胞ハイブリッド
（ハイブリドーマ）を含む。本発明は、融合細胞ハイブ
リッドによって産生されるモノクローナル抗体（検出可
能マーカーに結合した抗体も含む）をも含む。検出可能
マーカーの例は、酵素、発色団、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏ
ｐｈｏｒｅｓ）、補酵素、酵素阻害物質、化学ルミネッ
セント物質、常磁性金属、スピンラベル、放射性核種で
ある。
【００２８】本発明は、骨コラーゲンから誘導され、３
−ヒドロキシピリジニウム架橋を含むペプチド断片に特
異的なモノクローナル抗体を含んで成る、体液中に認め
られる骨コラーゲン吸収に由来する３−ヒドロキシピリ
ジニウム架橋含有ペプチド断片の量を測定するのに有用
な試験キットを含む。この試験キットのモノクローナル
抗体は上記の検出可能のマーカーに結合させることがで
きる。
【００２９】
【発明の実施の形態】本発明は再吸収された骨コラーゲ
ンに由来するリジルピリジノリン（ＬＰ）およびヒドロ
キシリジルピリジノリン（ＨＰ）ペプチド断片は両方
共、代謝されずに尿中に排泄されるという発見に基づい
ている。本発明は、その他の結合組織は明白な量のＬＰ
を含まず、成熟骨コラーゲンのＨＰ：ＬＰの比は一生を
通じて比較的一定である、という発見にも基づいてい
る。
【００３０】図１は人の皮質骨及び海綿状骨のＨＰおよ
びＬＰ濃度を年令に関して比較したものである。骨コラ
ーゲン中のＨＰ＋ＬＰ架橋の濃度は１０才ないし１５才
までに最大に達し、成人寿命中適当に一定に保たれるこ
とがわかる。さらに、図２に示されるＨＰ：ＬＰの比は
生涯を通じてほとんど変化せず、約３．５：１のところ
で一定している。これらの基礎データは、骨コラーゲン
中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋が比較的一定にと
どまり、したがって骨コラーゲン分解に由来する体液
は、絶対的骨吸収速度に比例する濃度の３−ヒドロキシ
ピリジニウム架橋ペプチド断片を含むことを示してい
る。
【００３１】ＬＰは骨コラーゲンに特異的な３−ヒドロ
キシピリジニウム架橋であるから、最も簡単に絶対的骨
吸収速度を測定する方法は、体液中の３−ヒドロキシピ
リジニウム架橋、より好ましくはリジルピリジノリン
（ＬＰ）架橋を含むペプチド断片の濃度の定量に基づく
ものである。この説明および添付の請求の範囲に用いら
れる定量（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ）という語は、分
光光度法、重量測定、容量測定、電量分析、免疫測定、
電位差測定または電流測定手段を含む（だがこれらに限
定されるわけではない）適した手段によって、体液の部
分中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋含有ペプチド断
片の濃度を測定することを意味する。適した体液として
は尿、血清および滑液がある。好ましい体液は尿であ
る。
【００３２】尿中ペプチド濃度は尿量が増加するにつれ
て減少するから、尿を体液として選ぶ場合は固定時間
中、たとえば２４時間中に集めた尿プールからの一部を
とることが好ましい。この方法で２４時間の絶対的骨吸
収速度が計算される。別法として、尿中ペプチドを、尿
中に見出されるマーカー物質、たとえばクレアチニンに
対する比として測定する。この場合は骨吸収の尿指数は
尿量に無関係である。
【００３３】本発明の一実施態様において、尿中に見出
されるリジルピリジノリン架橋含有ペプチド断片に特異
的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体がつ
くられる。ペプチド断片はどの患者の尿からも分離され
る。しかしながらこれらペプチドはページェット病患者
または副甲状腺機能亢進症患者の尿から分離するのが好
ましい。それは、これら患者に見出されるペプチド断片
の濃度が高いからである。
【００３４】
【実施例】
（尿ペプチドの分離）活性ページェット病患者から得た
尿を低多孔度透析チューブ（＞３，５００スペクトロポ
ア）で４℃で４８時間透析し、かさの大きい溶質を除去
する。これらの状態では問題のペプチドは大部分が除去
されずにとどまる。凍結乾燥した非透析質をその後Ｂｉ
ｏ−Ｇｅｌ Ｐ２（２００−４００メッシュ）のカラム
（９０ｃｍ×２．５ｃｍ）から１０％酢酸で室温で溶出
する（２００ｍｇ部分ずつ）。集めたフラクションの２
９７ｎｍ励起／３９５ｎｍ発光の蛍光を測定することに
よって、架橋ペプチドを含む溶出液部分を確認し、この
プールを凍結乾燥する。この材料をＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ
−４カラム（２００−４００メッシュ、９０ｃｍ×２．
５ｃｍ）で１０％酢酸で溶出することによりさらに分離
する。上の溶出液の蛍光をモニターすることによって二
つの隣接するフラクションプールを見分ける。より早く
溶出されるフラクションは、骨Ｉ型コラーゲンの三重ら
せん体に由来する第三の配列に結合した骨Ｉ型コラーゲ
ンαＩ（Ｉ）鎖のカルボキシ末端テロペプチド領域に由
来する二つのアミノ酸配列を有するペプチド断片に富
む。これら三つのペプチド配列は３−ヒドロキシピリジ
ニウムで架橋されている。これと重なり合う遅い方のフ
ラクションは、３−ヒドロキシピリジニウム架橋によっ
て結合した骨Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド
領域に由来するアミノ酸配列を有するペプチド断片に富
む。
【００３５】その後個々のペプチドは、ＴＳＫ ＤＥＡ
Ｅ−５−ＰＷカラム（Ｂｉｏ Ｒａｄ ７．５ｃｍ×
７．５ｍｍ）上のイオン交換ＨＰＬＣによって上で得ら
れた二つのフラクションの各々から分離される。その際
溶出は１０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含む０．０２
Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５中ＮａＣｌ（０−０．２
Ｍ）の勾配で行われた。アミノ末端テロペプチド基礎お
よびカルボキシ末端テロペプチド基礎架橋ペプチドは、
０．０８Ｍおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌ間の、蛍光の連
続３〜４ピークに溶出する。カルボキシ末端テロペプチ
ド基礎架橋ペプチドが最初に一連の蛍光ピークとして溶
出し、主要（ｍａｊｏｒ）および少量（ｍｉｎｏｒ）ア
ミノ末端テロペプチド基礎架橋ペプチドが勾配の終りの
方で特徴的ピークとして溶出する。これらの各々を集
め、凍結乾燥し、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄ
ａｃ ２１８ ＴＰ５４，２５ｃｍ×４．６ｍｍ）上ク
ロマトグラフィーにかけ、０．０１Ｍトリフルオロ酢酸
中アセトニトリル：ｎ−プロパノール（３：１Ｖ／Ｖ）
の勾配（０−１０％）で溶出した。
【００３６】この方法によって、ページェット病患者の
単一２４時間尿から、３−ヒドロキシピリジニウム架橋
を含む個々のペプチド断片が、約１００〜５００μｇ分
離される。分離された主要ペプチドのアミノ酸組成は、
回収アミノ酸の全数化学量論（ｗｈｏｌｅ ｎｕｍｂｅ
ｒ ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ）によって、純度およ
び分子の大きさが確認された。エドマン分解によるアミ
ノ末端配列分析は、Ｉ型コラーゲンの公知の架橋部位の
配列並びにぴったり合う（ｍａｔｃｈｉｎｇ）アミノ酸
組成から予測される基本的コア構造を確認した。α２
（Ｉ）鎖のアミノ末端テロペプチド配列は、多分アミノ
末端グルタミンが公知のように環化してピロリドンカル
ボン酸を生成するため、配列分析からさえぎられた。
【００３７】上記の方法によって得られるアミノ酸末端
テロペプチドの典型的溶出曲線は図３に示される。得ら
れた主要ペプチド断片は、アミノ酸組成：（Ａｓｘ）2
（Ｇｌｘ）2 （Ｇｌｙ）5 Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｈｒを有する。ここで、Ａｓｘはアミノ酸ＡｓｐかＡｓ
ｎであり、Ｇｌｘはアミノ酸ＧｌｎかＧｌｕである。こ
のペプチドの配列は下記の構造式III によってあらわさ
れる。正常尿は構造式III によって示されるペプチド断
片を、ページェット病患者の尿より少量含む。
【００３８】
【化５】
【００３９】ここでK-K-K はＨＰまたはＬＰ架橋アミノ
酸をあらわし、Gln はグルタミン又は完全に環化したピ
ロリドンカルボン酸をあらわす。
【００４０】上記のように逆相ＨＰＬＣによって分離し
たカルボキシ末端テロペプチド基礎架橋ペプチドを図４
に示す。この図からわかるように、これらのペプチドは
さらに、各々が３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含む
一連のカルボキシ末端テロペプチドに分離される。図４
に示される主要ペプチドを上記のように分析し、アミノ
酸組成：（Ａｓｐ）5 （Ｇｌｕ）4 （Ｇｌｙ）10（Ｈｉ
ｓ）2 （Ａｒｇ）2 （Ｈｙｐ）2 （Ａｌａ）5 を有する
ことが判明した。このペプチドの配列は下記の構造式IV
によって示される。図４の小さい（ｍｉｎｏｒ）ピーク
としてあらわれるその他のカルボキシ末端テロペプチド
基礎架橋ペプチドは、構造式IVで示される構造にアミノ
酸が付加したものおよびその構造からアミノ酸が欠落し
たものをあらわす。これらの小ピーク内に含まれるペプ
チドはいずれも下記のように免疫原としての使用に適し
てる。
【００４１】
【化６】
【００４２】ここでK-K-K はＨＰまたはＬＰ架橋アミノ
酸をあらわし、Gln はグルタミン又は完全に環化したピ
ロリドンカルボン酸をあらわす。
【００４３】上記構造式によってあらわされるペプチド
の同等物としては、尿中ペプチド構造に若干の変化が生
じたものが含まれる。変化の例は、構造式III およびIV
のＮおよびＣ末端へのアミノ酸付加並びに若干の末端ア
ミノ酸欠落である。構造式IVによってあらわされる骨吸
収に由来する分子の、より小さいペプチド断片が、特に
尿中にあらわれる。これらは図４にみられるカルボキシ
テロペプチド断片の小ピークとなってあらわれ、アミノ
酸組成および配列分析によって確認される。構造式III
およびIVによってあらわされるハプテンに対して産生す
る抗体はわずかに変化した構造をもつ尿中ペプチドと交
差反応すると予想される。或る状態では、骨吸収に由来
する尿中ペプチドに対する患者特異的抗体が産生される
のが所望である。このような場合には上記と同じ方法を
用いて、構造式III およびIVによってあらわされる構造
からほんの少し変化した構造をもった尿中ペプチドを分
離する。
【００４４】（骨吸収を指数化するための免疫学的方
法）生理的液体から得られる骨コラーゲン由来のペプチ
ド断片に特異的に結合し得る免疫学的結合パートナー
は、当業者に公知の方法によってつくることができる。
これらのペプチド断片を分離するための好ましい方法は
上記の通りである。ここで用いる免疫学的結合パートナ
ーという語は、抗体および抗体断片を意味する。
【００４５】構造式III およびIVおよびそれらの同等物
によってあらわされるペプチドに特異的に結合するモノ
クローナル抗体及びポリクローナル抗体は当業者に公知
の方法によってつくられる。たとえば、キャンベル（Ｃ
ａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．）著（１９８６）“生物学お
よび分子生物学における実験技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ）”１３巻、エルセヴィールを参照されたい。上記ペ
プチドまたは分離されたその同等物に対する抗体をつく
ることは可能である。しかしながらこれらのペプチド断
片の分子量は５，０００以下であるから、ハプテンを担
体分子に結合させることが好ましい。適した担体分子と
してはウシ血清アルブミン、卵アルブミン、チログロブ
リンおよびスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）がある
が、これらに限られるわけではない。
【００４６】ハプテンが単体蛋白質に結合するとき、そ
のハプテンの配向は、抗血清の特異性にとって極めて重
要であることは当業者には公知である。その上、すべて
のハプテン−蛋白質結合物が等しく成功する免疫原とな
るわけではない。したがって特定のハプテンを担体蛋白
質に結合させるプロトコールの選択は、選択した尿中ペ
プチド断片のアミノ酸配列に依存する。たとえば、構造
式III によってあらわされる尿中ペプチド断片が選択さ
れる場合、好ましいプロトコールは、このハプテンをカ
ルボジイミドでＫＬＨまたはその他の適した担体と結合
させることを含む。これにより、ハプテンの大部分がＧ
ｌｙのカルボキシ末端によって結合し、それによって好
ましい抗原決定基、すなわちＴｙｒおよび３−ヒドロキ
シピリジニウム架橋、を感作された脊椎動物抗体産生細
胞（例、Ｂリンパ球）に与えることが確実になる。
【００４７】その他の尿中ペプチド断片は、その出所に
よって、異なる結合プロトコールを必要とするかもしれ
ない。よって、多数の結合剤が適切に用いられる。これ
らにはカルボジイミド、グルタールアルデヒド、混合無
水物並びにホモ二官能性およびヘテロ二官能性試薬があ
るが、これらに限られるわけではない［たとえば、ピア
ス（Ｐｉｅｒｃｅ）１９８６−８７カタログ、ピアスケ
ミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）、ロックフォード、ＩＬ，、参照］。好ましい結
合剤はカルボジイミドおよびヘテロ二官能性試薬、たと
えばｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル（ＭＢＳ）である。ハプテンを担体分子
に結合する方法は当業者には公知である。たとえば、チ
ャード（Ｃｈａｒｄ，Ｔ）（１９８７）著“生物学およ
び分子生物学における実験技術”６巻，（パーツ−エル
セヴィール，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
【００４８】ハプテン・担体分子免疫原に対するモノク
ローナルまたはポリクローナル抗体のどちらもつくるこ
とができる。しかしながらモノクローナル抗体（ＭＡ
ｂ）をつくるのが好ましい。この理由でマウスで免疫を
行うのが好ましい。マウスの免疫プロトコールはアジュ
バントを含むのが普通である。適したプロトコールの例
はチャード（１９８７）が記載している（上記参照）。
免疫マウスから脾細胞をとり、ホモジナイズし、その後
ポリエチレングリコールの存在下で癌細胞と融合させて
融合細胞ハイブリッドをつくる。これは骨コラーゲンに
由来するペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を
産生する。このようなペプチド断片の例は上記構造式II
I およびIVによってあらわされる。適した癌細胞として
は骨髄腫、肝癌、癌腫および肉腫細胞がある。スクリー
ニングプロトコール、選択したハイブリッド細胞を増殖
させ、選択したハイブリッド細胞によって産生されるモ
ノクローナル抗体を収獲するプロトコールを含むこの方
法の詳細な説明はガルフル（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ）および
ミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ）（１９８１）の
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３巻１ページに記されて
いる。好ましい予備的スクリーニングプロトコールは、
骨コラーゲン吸収に由来し、３−ヒドロキシピリジニウ
ム架橋を含むペプチド断片を固相ラジオイムノアッセイ
にかけることを含む。
【００４９】上記の方法またはこれと同等の方法によっ
てつくられた免疫学的結合パートナー、特にモノクロー
ナル抗体は、種々の免疫測定方法で用いられ、体液中
の、骨コラーゲン吸収に由来する３−ヒドロキシピリジ
ニウム架橋を有するペプチド断片の濃度を定量する。こ
れらの免疫測定法は検出マーカーに結合したモノクロー
ナル抗体または抗体断片を含む。検出可能マーカーの例
としては酵素、補酵素、酵素阻害物質、発色団、蛍光団
（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）、化学ルミネッセント物
質、常磁性金属、スピンラベル、および放射性核種があ
るが、これらに限られるわけではない。
【００５０】骨吸収を指数化するのに適した標準的免疫
測定法の例は、エライサ（ＥＬＩＳＡ）（ｅｎｚｙｍｅ
ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓ
ａｙ）［イングヴァル（Ｉｎｇｖａｌｌ，Ｅ．）（１９
８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０］、ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）および“サンドイッチ”免疫放射
定量測定法（ＩＲＭＡ）であるが、これらに限られるわ
けではない。最も簡単な形では、これらの免疫測定法を
用いて、体液を、骨コラーゲン吸収に由来する３−ヒド
ロキシピリジニウム架橋を有するペプチド断片に特異的
な免疫学的結合パートナーと単に接触させることによっ
て、骨吸収の絶対速度を知ることができる。上述の免疫
測定法は未処理体液に対して直接行うのが好ましい。し
かしながら場合によっては汚染物質がその測定を妨害す
ることがあり、体液の一部精製が必要となるかも知れな
い。部分的精製法には、カートリッジ吸着および溶出、
分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミ
ナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマト
グラフィーおよびこれらの組み合わせがあるが、これら
に限られるわけではない。
【００５１】本発明により使用するのに適した試験キッ
トは、上述のように製造された、体液中の骨コラーゲン
吸収に由来する３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有す
るペプチド断片に特異的に結合するモノクローナル抗体
を含む。この試験キットのモノクローナル抗体が上述の
種類の検出可能マーカーに結合するのが好ましい。
【００５２】（骨吸収を指数化するための電気化学的方
法）骨吸収を指数化するための別法は、３−ヒドロキシ
ピリジニウム架橋を有するペプチド断片の物理的特性を
測定することから成る。骨吸収の指数化に適したこのよ
うな物理的特性の一つは電気化学的検出による。この方
法はたとえば尿のような体液の一部を、３−ヒドロキシ
ピリジニウム環を含むペプチドの検出に適した酸化環元
電位と釣り合っている電気化学的検出器に注入すること
から成る。３−ヒドロキシピリジニウム環は、フェノー
ルであるから、可逆的酸化を受ける。したがって電気化
学的検出器（たとえば５１００Ａ型Ｃｏｕｌｏｃｈｅ
ｍ，販売元 ｅｓａ ４５ ウィギンズ アヴェニュ
ー，ベッド−フォード，Ｍ．Ａ．）は骨吸収に由来する
尿中ペプチドの濃度測定のために適した非常に好都合な
器具である。
【００５３】二つの基礎的型の電気化学的検出器が現在
市販されている［アンペア測定（例、Ｂｉｏ Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびクーロン測定
（ＥＳＡ社、ベッドフォード，ＭＡ ０１７３０）検出
器］。両方共、本発明による使用に適している。しかし
ながら後者の装置の方が本来感度がより高く、したがっ
てカラム溶出液中の分析すべき分子を完全に酸化または
還元できるからより好ましい。その上遮蔽または保護電
極が分析電極の上流に置かれ、妨害物質を選択的に酸化
または還元し、それによって選択性を改良することがで
きる。本来、分析電極の電圧は試料分子の酸化還元電位
に合わせられ、１個以上の前処理セル（ｐｒｅ−ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｃｅｌｌ）が試料中の妨害物を破壊する
ようにセットされる。好ましい測定法においては最適感
度を与える正しい電圧を決定するために、リジルピリジ
ノリンまたはヒドロキシリジルピリジノリンを含む標準
ペプチドの標準電流／電圧曲線が作成される。この正し
い電圧をその後体液に依って変化させ、汚染物質による
妨害を最小にし、感度を最適にする。電気化学的検出器
およびそれを使用する最適条件は熟練せる当業者には公
知である。複雑な体液混合物を電気化学的検出器で、妨
害なしに直接分析できることがよくある。よって大部分
の患者では体液の前処理は不要である。しかしながら若
干の場合には、妨害化合物が測定法の信頼性を減らすか
も知れない。そのような場合には体液（たとえば尿）の
前処理が必要かも知れない。
【００５４】よって、本発明のもう一つの実施態様で
は、精製ペプチド断片を電気化学的に滴定する前に、体
液を先づ精製する。その精製段階は、透析、イオン交換
クロマトグラフィー、アルミナクロマトグラフィー、ヒ
ドロキシアパタイトクロマトグラフィー、分子篩クロマ
トグラフィー、またはそれらの組み合わせを含む（だが
これらに限られない）種々の方法で行われる。好ましい
精製プロトコールでは、２４時間尿試料の計量した一部
（２５ｍｌ）を低多孔度透析チューブで透析して混入し
ている蛍光溶質を大部分除去する。非透析質をその後凍
結乾燥し、１％ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）（イオ
ン対溶液）に溶かし、ペプチドをＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ
−Ｐａｋ Ｃ−１８カートリッジに吸着させる。このカ
ートリッジをその後１％ＨＦＢＡ５ｍｌで洗い、それか
ら１％ＨＦＢＡ中５０％メタノール３ｍｌで溶出する。
【００５５】別の好ましい精製法は、尿の計量した部分
をイオン交換吸着フィルターに吸着させ、吸着フィルタ
ーを緩衝溶出液で溶出することから成る。３−ヒドロキ
シピリジニウム架橋を有するペプチド断片を含む溶出フ
ラクションを集め、測定する。もう一つの好ましい精製
法は分子篩クロマトグラフィーを用いる。たとえば尿の
一部をＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２またはセファデックスＧ−
２０カラムに入れ、１０００−５０００ダルトン範囲内
に溶出するフラクションを集める。上記方法の組み合わ
せを用いて尿またはその他の体液を精製または部分的に
精製し、３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプ
チド断片を分離することは熟練せる当業者には自明であ
る。上記の方法によって得られた精製または部分的に精
製したペプチド断片は付加的精製法にかけられるか、さ
らに処理するか、または部分的精製状態で直接測定され
る。付加的精製法としては、高性能液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）を用い、または高感度が所望の場合は
ミクロボアＨＰＬＣを用いて部分的精製ペプチド断片を
分離することを含む。これらのペプチドはその後電気化
学的滴定によって定量される。好ましい電気化学的滴定
プロトコールは、電気化学的検出器（Ｃｏｕｌｏｃｈｅ
ｍ ５１００Ａ型）の検出用セルの酸化還元電位を純粋
ＨＰで最大シグナルに合わせることから成る。その後そ
の検出器を用いて、部分的精製された尿中ペプチドを分
離するために用いたＣ−１８ＨＰＬＣカラムからの溶出
液をモニターする。
【００５６】（骨吸収を指数化するための蛍光測定法）
３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプチド断片
の濃度を定量するためのまた別の好ましい方法はこれら
ペプチド断片の特徴的自然蛍光を測定することである。
３−ヒドロキシピリジニウム架橋以外には天然に発生す
る蛍光物質をほとんど含まない体液では、それ以上体液
を精製せずに蛍光測定が直接行われる。この場合、Ｅｙ
ｒｅ，Ｄ．Ｒ．らのＡｎａｌｙｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
３７巻３８０ページ（１９８４）に記載されているもの
とほとんど同様の方法で、ペプチド断片はＨＰＬＣによ
って分離され、ＨＰおよびＬＰアミノ酸残基の自然蛍光
が２９７ｎｍで励起されて３９５ｎｍで測定される。
【００５７】本発明により、蛍光測定は尿で行うのが好
ましい。しかし尿は、蛍光測定を実施する前に除去しな
ければならない天然に発生する蛍光混入物を含むのが普
通である。よって尿試料を先づ、上で電気化学的検出の
ために記したように部分的に精製する。この部分的に精
製した尿試料をそれから上述のように蛍光測定すること
ができる。別法として、部分的に精製した尿試料または
その他の体液中のＨＰおよびＬＰ架橋ペプチドをＥｙｒ
ｅら（１９８４）（上記参照）が記載したように６Ｍ
ＨＣｌ中で約１０８℃、約２４時間で加水分解すること
ができる。このプロセスは、“トリペプチド”ＨＰおよ
びＬＰ架橋のリジン前駆体に結合したアミノ酸を加水分
解し、構造式ＩおよびIIによってあらわされる遊離ＨＰ
およびＬＰアミノ酸を生成する。これらの小さい“トリ
ペプチド”をその後上記の方法、好ましくはＨＰＬＣに
よって分離し、自然蛍光を測定する（励起２９７ｎｍ、
発光３９０ｎｍ）。
【００５８】任意に、体液（好ましくは尿）を、アセト
ニトリル／メタノール５〜１０Ｖ／Ｖ％を加えた後Ｃ−
１８逆相アフィニティーカートリッジを直接通過させ
る。非滞留物をたとえば水酸化テトラブチルアンモニウ
ムなどのカチオン性イオン対試薬で０．０５−０．０１
Ｍに調節し、第二のＣ−１８逆相カートリッジを通過さ
せる。洗浄した滞留物（蛍光ペプチドを含む）を第二カ
ートリッジからアセトニトリル：水（またはメタノー
ル：水）で溶出し、乾燥し、蛍光ペプチドを逆相ＨＰＬ
ＣまたはミクロボアＨＰＬＣによって、０．０１Ｍトリ
フルオロ酢酸（溶離剤中）などのアニオン性イオン対試
薬を用いて分析する。別法としての、またはこのペプチ
ド精製操作法に含まれる、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ２（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄｌａｂｓ）または同等のゲル濾過媒質を用い
る分子篩段階を用いることができる。
【００５９】図５は、正常人尿からのペプチド断片加水
分解物について、逆相ＨＰＬＣによって分離された自然
蛍光の溶出曲線を示す。与えられた成分の範囲内の積分
面積を測定することによって、試料中のその成分の濃度
を決める。正常人尿およびページェット病患者の尿（図
６）のＨＰ：ＬＰ比は両方共約４．５：１である。これ
は骨そのものに見出される比４：１よりわずかに高い
（Ｅｙｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。尿に見出され
る比較的高い比は、尿中のＨＰフラクションの一部がた
とえば食事などの骨以外のソースから、またはその他の
コラーゲン分解ソース、すなわち軟骨異化作用からくる
ことを示している。骨だけに由来するＬＰを用いて骨吸
収の絶対的指数を提供するのが好ましいのはこのためで
ある。しかしながらたとえばリウマチ様関節炎などの場
合のような過剰の軟骨分解がない場合、または骨が急速
に吸収される場合にはＨＰまたはＨＰ＋ＬＰの組み合わ
せが骨吸収の指数として用いられる。
【００６０】本発明を好ましい実施態様に関連づけて説
明したが、以上の明細書を読んだ当業者は、ここに示さ
れる内容に種々の変化、均等物の変換および変更を加え
ることができる。したがって本発明はここに詳細に説明
された以外の方法で実施され得る。よって、ここで特許
証によって付与される保護は、添付の特許請求の範囲お
よびその均等物によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】骨コラーゲン中のヒドロキシピリジニウム残基
対年令のグラフである。
【図２】図２はヒドロキシリジルピリジノリン（Ｈ
Ｐ）：リジルピリジノリン（ＬＰ）の比対年令のグラフ
である。
【図３】図３は３−ヒドロキシピリジニウ架橋を含む主
なペプチド断片の位置を示す、アミノ末端テロペプチド
の典型的逆相ＨＰＬＣ自然蛍光溶出曲線である。
【図４】図４は３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含む
主なペプチド断片の位置を示すカルボキシ末端テロペプ
チドの典型的逆相ＨＰＬＣ自然蛍光溶出曲線である。
【図５】図５は正常人尿のペプチド断片の加水分解物を
あらわす、自然蛍光の典型的逆相ＨＰＬＣ溶出曲線であ
る。
【図６】図６はページェット病患者の尿中ペプチド断片
の加水分解物をあらわす自然蛍光の典型的逆相ＨＰＬＣ
溶出曲線である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】骨コラーゲン吸収に由来し３−ヒドロキシ
    ピリジニウム架橋を含むペプチド断片の体液中の濃度を
    定量する骨吸収速度測定方法において、該ペプチドが骨
    Ｉ型コラーゲンのαＩ（Ｉ）鎖のカルボキシ末端テロペ
    プチド領域に由来する２個のアミノ酸配列を有すること
    を特徴とする骨吸収速度測定方法。
  2. 【請求項２】骨Ｉ型コラーゲンのαＩ（Ｉ）鎖のカルボ
    キシ末端テロペプチド領域に由来するアミノ酸配列が、
    次のアミノ酸配列を含むものであることを特徴とする請
    求項１に記載の測定方法。 Glu-K-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg （式中、Kは、K-K-Kで表わされるヒドロキシリジルピリ
    ジノリン及びリジルピリジノリンから選択された３−ヒ
    ドロキシピリジニウム架橋の一部を表わす）
  3. 【請求項３】ペプチド断片の分子量が５，０００未満で
    あることを特徴とする請求項１または２に記載の測定方
    法。
  4. 【請求項４】体液が尿、滑液および血清から選ばれたも
    のであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項
    に記載の測定方法。
  5. 【請求項５】体液をペプチド断片に特異的な免疫学的結
    合パートナーと接触させることにより定量することを特
    徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定方
    法。
  6. 【請求項６】接触段階の前に体液精製段階を含むことを
    特徴とする請求項５に記載の測定方法。
  7. 【請求項７】体液精製段階がカートリッジ吸着および溶
    出、分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、ア
    ルミナクロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイト
    クロマトグラフィーから成る群から選択されたものであ
    ることを特徴とする請求項６に記載の測定方法。
  8. 【請求項８】骨コラーゲン吸収に由来し３−ヒドロキシ
    ピリジニウム架橋を含み、骨Ｉ型コラーゲンのαＩ
    （Ｉ）鎖のカルボキシ末端テロペプチド領域に由来する
    ２個のアミノ酸配列を有するペプチド断片を認識し、こ
    れに結合する免疫学的結合パートナー。
  9. 【請求項９】モノクローナル抗体であることを特徴とす
    る請求項８に記載の免疫学的結合パートナー。
  10. 【請求項１０】検出可能マーカーに結合したものである
    ことを特徴とする請求項８または９に記載の免疫学的結
    合パートナー。
  11. 【請求項１１】検出可能マーカーが、酵素、発色団、蛍
    光団、補酵素、酵素阻害剤、化学ルミネッセント物質、
    常磁性金属、スピンラベルおよび放射性核種から成る群
    から選択されたものであることを特徴とする請求項１０
    に記載の免疫学的結合パートナー。
  12. 【請求項１２】請求項８〜１１のいずれか１項に記載の
    免疫学的結合パートナーを含有することを特徴とする体
    液中のペプチド断片の濃度測定用試薬キット。
  13. 【請求項１３】請求項９に記載の免疫学的結合パートナ
    ーを産生する融合細胞ハイブリッド。
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