JPH0919299A - Ｄｎａ及び／又はｒｎａを特異的に増幅し検出する方法 - Google Patents
Ｄｎａ及び／又はｒｎａを特異的に増幅し検出する方法Info
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- JPH0919299A JPH0919299A JP8111918A JP11191896A JPH0919299A JP H0919299 A JPH0919299 A JP H0919299A JP 8111918 A JP8111918 A JP 8111918A JP 11191896 A JP11191896 A JP 11191896A JP H0919299 A JPH0919299 A JP H0919299A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】少なくとも１つの好適のプライマー対、ｐ
Ｈを７．０〜９．５の間に緩衝させる物質、ＤＮＡ鎖の
伸長に必要なすべてのヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、及
びピロコックス・ウオエシイのＤＮＡポリメラーゼ及び
テルムス・アクアティクスのＤＮＡポリメラーゼを含む
酵素混合物の存在下に、短い一本鎖又は二本鎖の核酸断
片を特異的に増幅する方法であって、酵素混合物が校正
活性のある好熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び校正活性のな
い好熱性ＤＮＡポリメラーゼよりなり、及び、二本鎖Ｄ
ＮＡ断片を分離させる可能性のある変性ステップの後
に、５秒〜８分間の伸長ステップを少なくとも７０℃で
行うことを特徴とする方法。 【効果】本発明により、従来技術により増幅できなかっ
た短い核酸配列を特異的に増幅するための方法が提供さ
れる。
Ｈを７．０〜９．５の間に緩衝させる物質、ＤＮＡ鎖の
伸長に必要なすべてのヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、及
びピロコックス・ウオエシイのＤＮＡポリメラーゼ及び
テルムス・アクアティクスのＤＮＡポリメラーゼを含む
酵素混合物の存在下に、短い一本鎖又は二本鎖の核酸断
片を特異的に増幅する方法であって、酵素混合物が校正
活性のある好熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び校正活性のな
い好熱性ＤＮＡポリメラーゼよりなり、及び、二本鎖Ｄ
ＮＡ断片を分離させる可能性のある変性ステップの後
に、５秒〜８分間の伸長ステップを少なくとも７０℃で
行うことを特徴とする方法。 【効果】本発明により、従来技術により増幅できなかっ
た短い核酸配列を特異的に増幅するための方法が提供さ
れる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、短い核酸配列の特
異的増幅を目的とする酵素混合物及びその使用、並び
に、試料特に生体液中に存在する該核酸配列を特異的に
増幅させる方法に関する。
異的増幅を目的とする酵素混合物及びその使用、並び
に、試料特に生体液中に存在する該核酸配列を特異的に
増幅させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】今日、ある種のプライマー及び耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素のような重合誘導剤の
存在下に行われる、一本鎖及び二本鎖の核酸配列の増幅
は、広範に用いられており、特に臨床診断の分野で著し
い。そのようなマルチサイクル法は、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）（ＥＰ ０２００３６２、ＥＰ ０２５
８０１７）として広く知られている。ＰＣＲ反応は、Ｔ
ａｑポリメラーゼとして知られるテルムス・アクアティ
クス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の好熱性
ＤＮＡポリメラーゼを用いて通常行われる。しかし、こ
の古典的なＰＣＲ法は、いくつかの適用と使用におい
て、非常に低効率しか示さず、度々特異的増幅に至らな
いことがある。例えば、ゲノムＤＮＡのような微量の核
酸配列を扱うとき又は修飾ヌクレオチドを使用するとき
などである。このことは、サイクル数を増加させても埋
め合わせできない。さらに、そのような現象は、より長
いＤＮＡ断片を増幅させるときに一層増加して発生す
る。すなわち、増幅過程の成熟前の中断は、重合の間の
酵素の読み間違いの特定の結果である。
ＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素のような重合誘導剤の
存在下に行われる、一本鎖及び二本鎖の核酸配列の増幅
は、広範に用いられており、特に臨床診断の分野で著し
い。そのようなマルチサイクル法は、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）（ＥＰ ０２００３６２、ＥＰ ０２５
８０１７）として広く知られている。ＰＣＲ反応は、Ｔ
ａｑポリメラーゼとして知られるテルムス・アクアティ
クス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の好熱性
ＤＮＡポリメラーゼを用いて通常行われる。しかし、こ
の古典的なＰＣＲ法は、いくつかの適用と使用におい
て、非常に低効率しか示さず、度々特異的増幅に至らな
いことがある。例えば、ゲノムＤＮＡのような微量の核
酸配列を扱うとき又は修飾ヌクレオチドを使用するとき
などである。このことは、サイクル数を増加させても埋
め合わせできない。さらに、そのような現象は、より長
いＤＮＡ断片を増幅させるときに一層増加して発生す
る。すなわち、増幅過程の成熟前の中断は、重合の間の
酵素の読み間違いの特定の結果である。
【０００３】それ故、今日、例えば、ピロコックス・フ
リオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）由
来のＰｆｕポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼが
頻繁に使用される〔ルントベルクら（Ｌｕｎｄｂｅｒ
ｇ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．）、Ｇｅｎｅ １０８（１９
９１）１−６〕。Ｐｆｕポリメラーゼは、該ポリメラー
ゼの１サイクル変異率を１０分の１まで減少できる本来
の３, −（削除）エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）
を付加的に有することにより区別される。しかし、５ｋ
ｂまでの短い配列を増幅するとき、校正ポリメラーゼは
すぐにその限界に達することを実験は示した。この事実
の改良は、バーネス〔（Ｗ．Ｂａｒｎｅｓ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（１９９
４）〕及びＷＯ ９４／２６７６６に記載されている。
バーネスの改良は、１つは校正活性を有し（Ｐｆｕな
ど）、他の過剰のＤＮＡポリメラーゼは校正活性を持た
ない（Ｔａｑなど）２つの異なるＤＮＡポリメラーゼよ
りなる混合物の使用を提案している。使用するプライマ
ー、サイクルの条件、サイクル数及び他の条件により、
この１０〜３６ｋｂのようなより長いＤＮＡ配列につい
てのこのＰＣＲ増幅法はより高い効率と収量を与える。
しかし、３ｋｂ以下のようなより短い核酸配列を処理す
るときは、収量と特異性に関して改良はみられないこと
を実験は示した。
リオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）由
来のＰｆｕポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼが
頻繁に使用される〔ルントベルクら（Ｌｕｎｄｂｅｒ
ｇ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．）、Ｇｅｎｅ １０８（１９
９１）１−６〕。Ｐｆｕポリメラーゼは、該ポリメラー
ゼの１サイクル変異率を１０分の１まで減少できる本来
の３, −（削除）エキソヌクレアーゼ活性（校正活性）
を付加的に有することにより区別される。しかし、５ｋ
ｂまでの短い配列を増幅するとき、校正ポリメラーゼは
すぐにその限界に達することを実験は示した。この事実
の改良は、バーネス〔（Ｗ．Ｂａｒｎｅｓ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（１９９
４）〕及びＷＯ ９４／２６７６６に記載されている。
バーネスの改良は、１つは校正活性を有し（Ｐｆｕな
ど）、他の過剰のＤＮＡポリメラーゼは校正活性を持た
ない（Ｔａｑなど）２つの異なるＤＮＡポリメラーゼよ
りなる混合物の使用を提案している。使用するプライマ
ー、サイクルの条件、サイクル数及び他の条件により、
この１０〜３６ｋｂのようなより長いＤＮＡ配列につい
てのこのＰＣＲ増幅法はより高い効率と収量を与える。
しかし、３ｋｂ以下のようなより短い核酸配列を処理す
るときは、収量と特異性に関して改良はみられないこと
を実験は示した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、従来技術の方法の欠点を除去する、短い核酸配列の
特異的増幅のための方法を提供することにある。
は、従来技術の方法の欠点を除去する、短い核酸配列の
特異的増幅のための方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、少なく
とも７０℃の伸長温度でのＰＣＲ法により、約５ｋｂ以
下の核酸配列を増幅するため、校正活性を有する好熱性
ＤＮＡポリメラーゼ及び校正活性を有しない好熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼよりなる混合物の使用により達成され
る。第２のＤＮＡポリメラーゼは、過剰に、好ましくは
第１の酵素濃度の８倍存在する。
とも７０℃の伸長温度でのＰＣＲ法により、約５ｋｂ以
下の核酸配列を増幅するため、校正活性を有する好熱性
ＤＮＡポリメラーゼ及び校正活性を有しない好熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼよりなる混合物の使用により達成され
る。第２のＤＮＡポリメラーゼは、過剰に、好ましくは
第１の酵素濃度の８倍存在する。
【０００６】即ち、本発明の要旨は、（１） 少なくと
も１つの好適のプライマー対、ｐＨを７．０〜９．５の
間に緩衝させる物質、ＤＮＡ鎖の伸長に必要なすべての
ヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）及び酵素混合物の存在下に
短い一本鎖又は二本鎖の核酸断片を特異的に増幅する方
法であって、酵素混合物が校正活性のある好熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ及び校正活性のない好熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼよりなり、及び、二本鎖ＤＮＡ断片を分離させる可
能性のある変性ステップの後に、５秒〜８分間の伸長ス
テップを少なくとも７０℃で行うことを特徴とする方
法、（２） 酵素混合物が校正活性のないＤＮＡポリメ
ラーゼを過剰量含むことを特徴とする前記（１）記載の
方法、（３） 酵素混合物がピロコックス・ウオエシイ
（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｉｉ）由来のＤＮＡ
ポリメラーゼ及びテルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラー
ゼを含みそして反応混合物（１０μｌ）中の全酵素濃度
が０．５〜５．０Ｕであることを特徴とする前記（１）
又は（２）記載の方法、（４） マグネシウムイオンが
０．５〜５．０ｍＭの濃度範囲で存在することを特徴と
する前記のいずれかに記載の方法、（５） マグネシウ
ムイオンが１．０〜３．０ｍＭの濃度範囲で存在し、及
び／又は個々のｄＮＴＰの濃度範囲が５０〜５００μＭ
であることを特徴とする前記のいずれかに記載の方法、
（６） 反応混合物中に１８〜３０ｍＭの硫酸アンモニ
ウム及び／又は３０〜５０ｍＭの塩化カリウムが８．８
〜９．０の初期ｐＨで存在することを特徴とする前記の
いずれかに記載の方法、（７） 伸長温度が７１〜７３
℃であることを特徴とする前記のいずれかに記載の方
法、（８） 逆転写酵素活性を有する酵素が存在するこ
とを特徴とする前記のいずれかに記載の方法、（９）
該酵素がＡＭＶ及び／又はＭｏＭｕＬＶ−ＲＴであるこ
とを特徴とする前記のいずれかに記載の方法、（１０）
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの１つが逆転写酵素活性を
示すことを特徴とする前記のいずれかに記載の方法、
（１１） ＲＴ反応を４５〜６０℃で行うことを特徴と
する前記（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法、
（１２） 校正活性のある好熱性ＤＮＡポリメラーゼ及
び校正活性のない好熱性ＤＮＡポリメラーゼを１：１０
の比率で含んでなる酵素混合物であって、酵素濃度が反
応混合物の容量（１０μｌ）当たり最終濃度が０．５〜
５．０Ｕになるように選ばれるものである酵素混合物、
（１３） ピロコックス・ウオエイシ（Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｗｏｅｓｉｉ）由来及びテルムス・アクアティ
クス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤ
ＮＡポリメラーゼ及び０．５〜５．０ｍＭのマグネシウ
ムイオンが存在することを特徴とする前記（１２）記載
の酵素混合物、（１４） 短いＤＮＡ断片の増幅を目的
とする前記（１２）又は（１３）記載の酵素混合物の使
用、（１５） ＤＮＡ断片が３ｋｂまでの長さを有する
ことを特徴とする前記（１４）記載の使用、（１６）
短いＤＮＡ断片の増幅及び／又は修飾ヌクレオチドによ
るＤＮＡ断片の標識を目的とする前記（１２）又は（１
３）記載の酵素混合物の使用、に関するものである。
も１つの好適のプライマー対、ｐＨを７．０〜９．５の
間に緩衝させる物質、ＤＮＡ鎖の伸長に必要なすべての
ヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）及び酵素混合物の存在下に
短い一本鎖又は二本鎖の核酸断片を特異的に増幅する方
法であって、酵素混合物が校正活性のある好熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ及び校正活性のない好熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼよりなり、及び、二本鎖ＤＮＡ断片を分離させる可
能性のある変性ステップの後に、５秒〜８分間の伸長ス
テップを少なくとも７０℃で行うことを特徴とする方
法、（２） 酵素混合物が校正活性のないＤＮＡポリメ
ラーゼを過剰量含むことを特徴とする前記（１）記載の
方法、（３） 酵素混合物がピロコックス・ウオエシイ
（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｉｉ）由来のＤＮＡ
ポリメラーゼ及びテルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラー
ゼを含みそして反応混合物（１０μｌ）中の全酵素濃度
が０．５〜５．０Ｕであることを特徴とする前記（１）
又は（２）記載の方法、（４） マグネシウムイオンが
０．５〜５．０ｍＭの濃度範囲で存在することを特徴と
する前記のいずれかに記載の方法、（５） マグネシウ
ムイオンが１．０〜３．０ｍＭの濃度範囲で存在し、及
び／又は個々のｄＮＴＰの濃度範囲が５０〜５００μＭ
であることを特徴とする前記のいずれかに記載の方法、
（６） 反応混合物中に１８〜３０ｍＭの硫酸アンモニ
ウム及び／又は３０〜５０ｍＭの塩化カリウムが８．８
〜９．０の初期ｐＨで存在することを特徴とする前記の
いずれかに記載の方法、（７） 伸長温度が７１〜７３
℃であることを特徴とする前記のいずれかに記載の方
法、（８） 逆転写酵素活性を有する酵素が存在するこ
とを特徴とする前記のいずれかに記載の方法、（９）
該酵素がＡＭＶ及び／又はＭｏＭｕＬＶ−ＲＴであるこ
とを特徴とする前記のいずれかに記載の方法、（１０）
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの１つが逆転写酵素活性を
示すことを特徴とする前記のいずれかに記載の方法、
（１１） ＲＴ反応を４５〜６０℃で行うことを特徴と
する前記（８）〜（１０）のいずれかに記載の方法、
（１２） 校正活性のある好熱性ＤＮＡポリメラーゼ及
び校正活性のない好熱性ＤＮＡポリメラーゼを１：１０
の比率で含んでなる酵素混合物であって、酵素濃度が反
応混合物の容量（１０μｌ）当たり最終濃度が０．５〜
５．０Ｕになるように選ばれるものである酵素混合物、
（１３） ピロコックス・ウオエイシ（Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｗｏｅｓｉｉ）由来及びテルムス・アクアティ
クス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤ
ＮＡポリメラーゼ及び０．５〜５．０ｍＭのマグネシウ
ムイオンが存在することを特徴とする前記（１２）記載
の酵素混合物、（１４） 短いＤＮＡ断片の増幅を目的
とする前記（１２）又は（１３）記載の酵素混合物の使
用、（１５） ＤＮＡ断片が３ｋｂまでの長さを有する
ことを特徴とする前記（１４）記載の使用、（１６）
短いＤＮＡ断片の増幅及び／又は修飾ヌクレオチドによ
るＤＮＡ断片の標識を目的とする前記（１２）又は（１
３）記載の酵素混合物の使用、に関するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】第１の酵素として可能なものは、
ピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆ
ｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）由来、ピロコックス種のテ
ルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉ
ｔｉｍａ）（Ｔｍａ）由来、ピロコックス・ウオエシイ
（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｉｉ）（Ｐｗｏ）由
来、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）由来又はスル
ホロブス・ソルファタリクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓ
ｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓｏ）由来のＤＮＡポリ
メラーゼである。校正活性のない好適な酵素は、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ又はＫｌｅｎｔａｑＩ（Ｎ末端を切
断した酵素）のようなその対応する類似物、Ｔ．アクア
ティクス（Ｔ．Ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリ
メラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片又はテルムス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ）種由来の他のポリメラーゼを含む。本発明は、Ｐ
ｗｏ及びＴａｑを１：１０の比率で含む混合物がより好
ましい。
ピロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆ
ｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）由来、ピロコックス種のテ
ルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉ
ｔｉｍａ）（Ｔｍａ）由来、ピロコックス・ウオエシイ
（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｉｉ）（Ｐｗｏ）由
来、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）由来又はスル
ホロブス・ソルファタリクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓ
ｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（Ｓｓｏ）由来のＤＮＡポリ
メラーゼである。校正活性のない好適な酵素は、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ又はＫｌｅｎｔａｑＩ（Ｎ末端を切
断した酵素）のようなその対応する類似物、Ｔ．アクア
ティクス（Ｔ．Ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリ
メラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片又はテルムス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ）種由来の他のポリメラーゼを含む。本発明は、Ｐ
ｗｏ及びＴａｑを１：１０の比率で含む混合物がより好
ましい。
【０００８】ＤＮＡ断片の増幅に加え、本発明の酵素混
合物は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ断片を増幅するために
も有用であることが判った。本発明の該酵素混合物は、
ＡＭＶ−ＲＴ（トリ骨髄芽球症ウイルス−ＲＴ）又はＭ
ｏＭｕＬＶ−ＲＴ（モロニーネズミ白血病ウイルス−Ｒ
Ｔ）のような逆転写酵素（ＲＴ）活性を有するＤＮＡポ
リメラーゼ活性をさらに含んでもよい。反応は、ＲＴ活
性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＡＭＶ
及びＭｏＭｕＬＶにも選択的に行うことができる。共役
されたＲＴ−ＰＣＲを使用するときは、ＡＭＶ−ＲＴの
使用及びＲＴ反応の温度が約４５〜約６０℃、より具体
的には４５〜６０℃であることが特に好ましい。例えば
ＡＭＶ由来のＲＴの濃度は、反応混合物容量（１０μ
ｌ）当たり、通常、０．５〜５．０Ｕの範囲であり、好
ましくは約１．０〜約３．０Ｕである。緩衝液及び塩濃
度などの他のすべての条件は、熟練者に公知である〔マ
レーら（Ｍａｌｌｅｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ）Ｂｉｏ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ １８（１９９５）６７８−６８
７）〕。
合物は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ断片を増幅するために
も有用であることが判った。本発明の該酵素混合物は、
ＡＭＶ−ＲＴ（トリ骨髄芽球症ウイルス−ＲＴ）又はＭ
ｏＭｕＬＶ−ＲＴ（モロニーネズミ白血病ウイルス−Ｒ
Ｔ）のような逆転写酵素（ＲＴ）活性を有するＤＮＡポ
リメラーゼ活性をさらに含んでもよい。反応は、ＲＴ活
性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＡＭＶ
及びＭｏＭｕＬＶにも選択的に行うことができる。共役
されたＲＴ−ＰＣＲを使用するときは、ＡＭＶ−ＲＴの
使用及びＲＴ反応の温度が約４５〜約６０℃、より具体
的には４５〜６０℃であることが特に好ましい。例えば
ＡＭＶ由来のＲＴの濃度は、反応混合物容量（１０μ
ｌ）当たり、通常、０．５〜５．０Ｕの範囲であり、好
ましくは約１．０〜約３．０Ｕである。緩衝液及び塩濃
度などの他のすべての条件は、熟練者に公知である〔マ
レーら（Ｍａｌｌｅｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ）Ｂｉｏ Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ １８（１９９５）６７８−６８
７）〕。
【０００９】さらに、インキュベーションの時間、温
度、緩衝条件、マグネシウム（Ｍｇ2+）濃度及び酵素混
合物濃度などの最適の反応条件は、使用する鋳型／プラ
イマー対に依存しており、個々に決定されるべきであ
る。当業者において、通常対応する予備試験で測定し使
用される。最適の酵素濃度は、０．５〜５．０Ｕ／試験
溶液、好ましくは２．５Ｕ／試験溶液である。ほとんど
の場合、最適のＭｇ2+の濃度は０．５〜５．０ｍＭの範
囲であり、好ましくは１．０〜３．０ｍＭ、さらに好ま
しくは約１．５〜約３．０ｍＭの範囲である。通常、Ｍ
ｇＣｌ2 が使用される。さらに、Ｔａｑポリメラーゼを
用いるＰＣＲ反応とは対照的に、短い断片を増幅させる
ための本発明の方法は、Ｍｇ2+の濃度の上昇に比較的低
い感度を有するという有利性をもたらすことがわかっ
た。
度、緩衝条件、マグネシウム（Ｍｇ2+）濃度及び酵素混
合物濃度などの最適の反応条件は、使用する鋳型／プラ
イマー対に依存しており、個々に決定されるべきであ
る。当業者において、通常対応する予備試験で測定し使
用される。最適の酵素濃度は、０．５〜５．０Ｕ／試験
溶液、好ましくは２．５Ｕ／試験溶液である。ほとんど
の場合、最適のＭｇ2+の濃度は０．５〜５．０ｍＭの範
囲であり、好ましくは１．０〜３．０ｍＭ、さらに好ま
しくは約１．５〜約３．０ｍＭの範囲である。通常、Ｍ
ｇＣｌ2 が使用される。さらに、Ｔａｑポリメラーゼを
用いるＰＣＲ反応とは対照的に、短い断片を増幅させる
ための本発明の方法は、Ｍｇ2+の濃度の上昇に比較的低
い感度を有するという有利性をもたらすことがわかっ
た。
【００１０】さらに、ｐＨ７．０〜９．５までの範囲に
反応を緩衝するヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、リン酸塩、トリ
シン（ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）又は
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの通常用いられる物質を使用する
ことが可能である。例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの緩衝液
の濃度は、５〜１００ｍＭの間、好ましくは５０ｍＭで
あること、及びある種の塩の存在が本発明にとって、好
都合であることがわかった。特に好ましい塩は、１８〜
３０ｍＭ、好ましくは２０〜２４ｍＭの硫酸アンモニウ
ム（ＡＳ）及び約３０〜約５０ｍＭの塩化カリウムであ
る。短い断片を増幅させるためには、約８．９のｐＨ
が、より具体的には８．８〜９．０のｐＨが特に好まし
いことがわかった。
反応を緩衝するヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、リン酸塩、トリ
シン（ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）又は
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの通常用いられる物質を使用する
ことが可能である。例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの緩衝液
の濃度は、５〜１００ｍＭの間、好ましくは５０ｍＭで
あること、及びある種の塩の存在が本発明にとって、好
都合であることがわかった。特に好ましい塩は、１８〜
３０ｍＭ、好ましくは２０〜２４ｍＭの硫酸アンモニウ
ム（ＡＳ）及び約３０〜約５０ｍＭの塩化カリウムであ
る。短い断片を増幅させるためには、約８．９のｐＨ
が、より具体的には８．８〜９．０のｐＨが特に好まし
いことがわかった。
【００１１】さらに、本発明のＰＣＲは、１００ｇ／ｍ
ｌまでの濃度のウシ血清アルブミンのような物質、通常
用いられる濃度のジチオトレイトールのようなＳＨ試
薬、又はＴｗｅｅｎR ２０、ＮｏｎｉｄｅｔR のような
洗浄剤、又はグリセリン、又はＤＭＳＯなどの付加的物
質を追加することにより、さらに改良することができ
る。約３ｋｂ以下の短い核酸の増幅のためには、少なく
とも７０℃、好ましくは約７０〜７５℃の伸長温度、特
に好ましくは７１〜７３℃、最も好ましくは７２℃が有
利であることがわかった。伸長時間は、約５秒〜８分、
好ましくは約３０秒〜４分の範囲にあり、増幅する断片
の長さに大きく依存する。１．０ｋｂまでのＤＮＡ断片
については、好ましい時間範囲は４５秒であり、約１．
５ｋｂまでのＤＮＡ断片については、好ましい時間範囲
は１分であり、及び３ｋｂまでのＤＮＡ断片において、
好ましい時間範囲は約２分である。
ｌまでの濃度のウシ血清アルブミンのような物質、通常
用いられる濃度のジチオトレイトールのようなＳＨ試
薬、又はＴｗｅｅｎR ２０、ＮｏｎｉｄｅｔR のような
洗浄剤、又はグリセリン、又はＤＭＳＯなどの付加的物
質を追加することにより、さらに改良することができ
る。約３ｋｂ以下の短い核酸の増幅のためには、少なく
とも７０℃、好ましくは約７０〜７５℃の伸長温度、特
に好ましくは７１〜７３℃、最も好ましくは７２℃が有
利であることがわかった。伸長時間は、約５秒〜８分、
好ましくは約３０秒〜４分の範囲にあり、増幅する断片
の長さに大きく依存する。１．０ｋｂまでのＤＮＡ断片
については、好ましい時間範囲は４５秒であり、約１．
５ｋｂまでのＤＮＡ断片については、好ましい時間範囲
は１分であり、及び３ｋｂまでのＤＮＡ断片において、
好ましい時間範囲は約２分である。
【００１２】核酸を有利に増幅するために使用される試
薬は、２つの異なる混合物を含む。第１の混合物は、ゲ
ノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのような鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡ
を混合物当たり約１〜５００ｎｇの濃度で含んでおり、
上流及び下流のプライマー（好ましくは各３００ｎＭ）
及びＤＮＡ鎖の伸長に必須のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰなどのすべてのヌクレオチドをも含む。
個々のヌクレオチドに適する濃度は、通常５０〜５００
μＭ、好ましくは１５０〜３００μＭである。しかし、
単離する場合には、個々のｄＮＴＰは、高濃度（個々の
ｄＮＴＰに対して約６００ｍＭまで）の方が優れている
ことがわかった。
薬は、２つの異なる混合物を含む。第１の混合物は、ゲ
ノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのような鋳型ＤＮＡ又はＲＮＡ
を混合物当たり約１〜５００ｎｇの濃度で含んでおり、
上流及び下流のプライマー（好ましくは各３００ｎＭ）
及びＤＮＡ鎖の伸長に必須のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰなどのすべてのヌクレオチドをも含む。
個々のヌクレオチドに適する濃度は、通常５０〜５００
μＭ、好ましくは１５０〜３００μＭである。しかし、
単離する場合には、個々のｄＮＴＰは、高濃度（個々の
ｄＮＴＰに対して約６００ｍＭまで）の方が優れている
ことがわかった。
【００１３】第２の混合物は、ＰＣＲに必要な緩衝液、
及び２つの混合物を混合後に前記の濃度が得られるよう
な高濃度の本発明の酵素混合物を必須に含んでいる。短
い断片を増幅するためには、１０〜１００μｌの反応混
合液が特に有利であることがわかった。個々の混合物を
混合後、試料を適当なサーモサイクラー中に置き、変性
させてＤＮＡ断片の二本鎖を分離する（９４℃、２
分）。続いて、個々のＰＣＲサイクルを行う。短いＤＮ
Ａ断片（３ｋｂまで）を使用するときは、７０〜７４℃
の温度が特に有利であることがわかった。
及び２つの混合物を混合後に前記の濃度が得られるよう
な高濃度の本発明の酵素混合物を必須に含んでいる。短
い断片を増幅するためには、１０〜１００μｌの反応混
合液が特に有利であることがわかった。個々の混合物を
混合後、試料を適当なサーモサイクラー中に置き、変性
させてＤＮＡ断片の二本鎖を分離する（９４℃、２
分）。続いて、個々のＰＣＲサイクルを行う。短いＤＮ
Ａ断片（３ｋｂまで）を使用するときは、７０〜７４℃
の温度が特に有利であることがわかった。
【００１４】本発明によれば、ＲＴ−ＰＣＲを１回の１
つの反応容器で行うとき、転写活性を有する酵素と組み
合わせて酵素混合物を使用することが特に有利であるこ
とがわかった。これは、従来技術の方法に比べて、ＲＴ
−ＰＣＲにおける効率、従って感度を上昇させることに
なる。ＡＭＶ及び／又はＭｏＭＵＬＶ−ＲＴのような中
温菌性ＲＴが特に有利であることがわかった。
つの反応容器で行うとき、転写活性を有する酵素と組み
合わせて酵素混合物を使用することが特に有利であるこ
とがわかった。これは、従来技術の方法に比べて、ＲＴ
−ＰＣＲにおける効率、従って感度を上昇させることに
なる。ＡＭＶ及び／又はＭｏＭＵＬＶ−ＲＴのような中
温菌性ＲＴが特に有利であることがわかった。
【００１５】さらに、本発明の方法は、短いＤＮＡ断片
を標識するために有利に使用できる。ＰＣＲ反応におけ
るＤＮＡ断片の標識方法の主要な手順は、熟練者に公知
である（例、ＥＰ０４２０２６０；ＷＯ９０／１１３７
３）。
を標識するために有利に使用できる。ＰＣＲ反応におけ
るＤＮＡ断片の標識方法の主要な手順は、熟練者に公知
である（例、ＥＰ０４２０２６０；ＷＯ９０／１１３７
３）。
【００１６】本発明の有利な点は、好ましくは１：１０
の比率のＰｗｏとＴａｑからなる、酵素混合物が、特別
な条件下で、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、ビオチン−ｄ
ＵＴＰ又はフルオレッセイン−ｄＵＴＰのような修飾ヌ
クレオチドを特に良く受け入れることを示すことであ
る。これらのヌクレオチドの最適濃度は、プローブをサ
ザンブロットで検出するのであれば、約６６μＭ及び１
３４μＭのｄＴＴＰ濃度である。ＥＬＩＳＡ分析には、
１０μＭの修飾ｄＵＴＰ及び対応する量のｄＴＴＰの濃
度が有利であることがわかった。修飾ヌクレオチドを使
用するなら、４ｍＭのＭｇＣｌ2 までのより高いマグネ
シウム濃度が特に有利であることがわかった。
の比率のＰｗｏとＴａｑからなる、酵素混合物が、特別
な条件下で、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、ビオチン−ｄ
ＵＴＰ又はフルオレッセイン−ｄＵＴＰのような修飾ヌ
クレオチドを特に良く受け入れることを示すことであ
る。これらのヌクレオチドの最適濃度は、プローブをサ
ザンブロットで検出するのであれば、約６６μＭ及び１
３４μＭのｄＴＴＰ濃度である。ＥＬＩＳＡ分析には、
１０μＭの修飾ｄＵＴＰ及び対応する量のｄＴＴＰの濃
度が有利であることがわかった。修飾ヌクレオチドを使
用するなら、４ｍＭのＭｇＣｌ2 までのより高いマグネ
シウム濃度が特に有利であることがわかった。
【００１７】本明細書中の略号について以下に示す。 Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ：ビオチン−１６−２’−デオキシウ
リジン−５’−三リン酸 ｂｐ：塩基対 Ｃ：摂氏の ＣＦ：嚢胞性繊維症 ｄＡＴＰ：２’−デオキシアデニン−５’−三リン酸 ｄＣＴＰ：２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸 ＤＩＧ−ｄＵＴＰ：ジゴキシゲニン−１１−２’−デオ
キシウリジン−５’−三リン酸 ｄＧＴＰ：２’−デオキシグアニン−５’−三リン酸 ｄＮＴＰ：２’−デオキシヌクレオシド−５’−三リン
酸 ＤＴＴ：ジチオトレイトール ｄＴＴＰ：２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジニトリロ四酢酸 ＨＣｌ：塩酸 ｋｂ：キロベース ＫＣｌ：塩化カリウム
リジン−５’−三リン酸 ｂｐ：塩基対 Ｃ：摂氏の ＣＦ：嚢胞性繊維症 ｄＡＴＰ：２’−デオキシアデニン−５’−三リン酸 ｄＣＴＰ：２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸 ＤＩＧ−ｄＵＴＰ：ジゴキシゲニン−１１−２’−デオ
キシウリジン−５’−三リン酸 ｄＧＴＰ：２’−デオキシグアニン−５’−三リン酸 ｄＮＴＰ：２’−デオキシヌクレオシド−５’−三リン
酸 ＤＴＴ：ジチオトレイトール ｄＴＴＰ：２’−デオキシチミジン−５’−三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジニトリロ四酢酸 ＨＣｌ：塩酸 ｋｂ：キロベース ＫＣｌ：塩化カリウム
【００１８】ｍｉｎ．：分 ｍＭ：ミリモーラー ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ μＭ：マイクロモーラー ｎｇ：ナノグラム （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ：硫酸アンモニウム ｐ５３：プロテイン５３ ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応 Ｐｗｏ：ピロコックス・ウオエシイ由来ＤＮＡポリメラ
ーゼ ＲＮＡ：リボ核酸 Ｓｅｃ．：秒 Ｔａｑ：テルムス・アクアチクス由来ＤＮＡポリメラー
ゼ Ｔｔｈ：テルムス・テルモフィルス由来ＤＮＡポリメラ
ーゼ ｔＰＡ：組織プラスミノーゲン活性化因子 Ｔｒｉｓ：２−アミノ−２（ヒドロキシメチル）−１，
３−プロパンジオール Ｕ：単位
ーゼ ＲＮＡ：リボ核酸 Ｓｅｃ．：秒 Ｔａｑ：テルムス・アクアチクス由来ＤＮＡポリメラー
ゼ Ｔｔｈ：テルムス・テルモフィルス由来ＤＮＡポリメラ
ーゼ ｔＰＡ：組織プラスミノーゲン活性化因子 Ｔｒｉｓ：２−アミノ−２（ヒドロキシメチル）−１，
３−プロパンジオール Ｕ：単位
【００１９】以下に、配列番号とプライマーの対応につ
いて示す。 配列番号：１ コラーゲンプライマー１：5'-TAAAGGGTCA CCGTGGCTTC-
3' 配列番号：２ コラーゲンプライマー２：5'-CGAACCACAT TGGCATCATC-
3' 配列番号：３ ｐ５３プライマー１：5'-TGGAAACTTT CCACTTGAT-3' 配列番号：４ ｐ５３プライマー２：5'-GTCCCAAGCA ATGGATCAT-3' 配列番号：５ ＦＫＢＰプライマー１：5'-GGAATTCTAT GGGAGTGCAG GTG
GAA-3' 配列番号：６ ＦＫＢＰプライマー２：5'-GCGGATCCAA GCTTTCATTC CAG
TTTTAGA AGCTC-3' 配列番号：７ ＣＦプライマー１：5'-GCTGCATCAT ATAAGTTGCC-3' 配列番号：８ ＣＦプライマー２：5'-AAGGCTACAC TGTTAATTTT-3' 配列番号：９ ｐ５３プライマー３：5'-GTCCCAAGCA ATGGATGAT-3' 配列番号：１０ ｐ５３プライマー４：5'-TGGAAACTTT CCACTTGAT-3'
いて示す。 配列番号：１ コラーゲンプライマー１：5'-TAAAGGGTCA CCGTGGCTTC-
3' 配列番号：２ コラーゲンプライマー２：5'-CGAACCACAT TGGCATCATC-
3' 配列番号：３ ｐ５３プライマー１：5'-TGGAAACTTT CCACTTGAT-3' 配列番号：４ ｐ５３プライマー２：5'-GTCCCAAGCA ATGGATCAT-3' 配列番号：５ ＦＫＢＰプライマー１：5'-GGAATTCTAT GGGAGTGCAG GTG
GAA-3' 配列番号：６ ＦＫＢＰプライマー２：5'-GCGGATCCAA GCTTTCATTC CAG
TTTTAGA AGCTC-3' 配列番号：７ ＣＦプライマー１：5'-GCTGCATCAT ATAAGTTGCC-3' 配列番号：８ ＣＦプライマー２：5'-AAGGCTACAC TGTTAATTTT-3' 配列番号：９ ｐ５３プライマー３：5'-GTCCCAAGCA ATGGATGAT-3' 配列番号：１０ ｐ５３プライマー４：5'-TGGAAACTTT CCACTTGAT-3'
【００２０】配列番号：１１ ｔＰＡプライマー７：5'-GGAAGTACAG CTCAGAGTTC TGCAG
CACCC CTGC-3' 配列番号：１２ ｔＰＡプライマー１０：5'-GATGCGAAAC TGAGGCTGGC TGT
ACTGTCT C-3' 配列番号：１３ ｔＰＡプライマー１３：5'-TGTCTCCAGC ACACAGCATG TTG
TCGGTGA C-3' 配列番号：１４ ｔＰＡプライマー１４：5'-CAAAGTCATG CGGCCATCGT TCA
GACACAC C-3' 配列番号：１５ ｔＰＡプライマー１：5'-AGACAGTACA GCCAGCCTCA-3' 配列番号：１６ ｔＰＡプライマー２：5'-GACTTCAAAT TTCTGCTCCT C-3' 配列番号：１７ コラーゲンプライマー３：5'-CCAAGAGGAA GGCCAAGTCG-
3' 配列番号：１８ コラーゲンプライマー４：5'-GGTGGTTTCT TGGTCGGTG-3' 配列番号：１９ ジストロフィープライマー１：5'-TAGAGTTTGC CCATGGAT
TG-3' 配列番号：２０ ジストロフィープライマー２：5'-GGGAAGTAGA GGACTGTT
AT GAAAGAGAAG-3' 配列番号：２１ Ｇ３ＰＤＨプライマー１：5'-TGAAGGTCGG AGTCAACGGA T
TTGGT-3' 配列番号：２２ Ｇ３ＰＤＨプライマー２：5'-CATGTGGGCC ATGAGGTCCA C
CAC-3'
CACCC CTGC-3' 配列番号：１２ ｔＰＡプライマー１０：5'-GATGCGAAAC TGAGGCTGGC TGT
ACTGTCT C-3' 配列番号：１３ ｔＰＡプライマー１３：5'-TGTCTCCAGC ACACAGCATG TTG
TCGGTGA C-3' 配列番号：１４ ｔＰＡプライマー１４：5'-CAAAGTCATG CGGCCATCGT TCA
GACACAC C-3' 配列番号：１５ ｔＰＡプライマー１：5'-AGACAGTACA GCCAGCCTCA-3' 配列番号：１６ ｔＰＡプライマー２：5'-GACTTCAAAT TTCTGCTCCT C-3' 配列番号：１７ コラーゲンプライマー３：5'-CCAAGAGGAA GGCCAAGTCG-
3' 配列番号：１８ コラーゲンプライマー４：5'-GGTGGTTTCT TGGTCGGTG-3' 配列番号：１９ ジストロフィープライマー１：5'-TAGAGTTTGC CCATGGAT
TG-3' 配列番号：２０ ジストロフィープライマー２：5'-GGGAAGTAGA GGACTGTT
AT GAAAGAGAAG-3' 配列番号：２１ Ｇ３ＰＤＨプライマー１：5'-TGAAGGTCGG AGTCAACGGA T
TTGGT-3' 配列番号：２２ Ｇ３ＰＤＨプライマー２：5'-CATGTGGGCC ATGAGGTCCA C
CAC-3'
【００２１】
【実施例】以下、本発明を実施例をもってさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定され
るものではない。
【００２２】実施例１ 実施例に示すように、テルムス・アクアティクス（Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）由来及び
ピロコックス・ウオエシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗ
ｏｅｓｉｉ）（Ｐｗｏ）由来の耐熱性ポリメラーゼがＴ
ａｑ／Ｐｗｏ酵素混合物として使用された。２つのポリ
メラーゼの混合比率は、活性（ユニット）で１０：１
（Ｔａｑ：Ｐｗｏ）であった。代表的な酵素混合物は、
μｌ当たり、３．１４ＵのＴａｑポリメラーゼと０．３
５ＵのＰｗｏポリメラーゼの混合物であった。酵素混合
物を貯蔵用緩衝液中〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．５（２０℃），１００ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのＤ
ＴＴ，０．１ｍＭのＥＤＴＡ，０．５％のＴｗｅｅｎ２
０，０．５％のＮｏｎｉｄｅｔＰ４０，５０％のグリセ
リン）〕、−２０℃で保存した。
ｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）由来及び
ピロコックス・ウオエシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗ
ｏｅｓｉｉ）（Ｐｗｏ）由来の耐熱性ポリメラーゼがＴ
ａｑ／Ｐｗｏ酵素混合物として使用された。２つのポリ
メラーゼの混合比率は、活性（ユニット）で１０：１
（Ｔａｑ：Ｐｗｏ）であった。代表的な酵素混合物は、
μｌ当たり、３．１４ＵのＴａｑポリメラーゼと０．３
５ＵのＰｗｏポリメラーゼの混合物であった。酵素混合
物を貯蔵用緩衝液中〔２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．５（２０℃），１００ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのＤ
ＴＴ，０．１ｍＭのＥＤＴＡ，０．５％のＴｗｅｅｎ２
０，０．５％のＮｏｎｉｄｅｔＰ４０，５０％のグリセ
リン）〕、−２０℃で保存した。
【００２３】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、１０
０μｌの容量で行った。酵素混合物に対する反応条件は
次の通りであった。 ＰＣＲ緩衝液 ２２ｍＭ（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 ；５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．９（２０
℃） ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ 酵素混合物 ２．６Ｕ ｄＮＴＰ ２００μＭ（各） コラーゲンプライマー１ ３００ｎＭ コラーゲンプライマー２ ３００ｎＭ ５個の異なった濃度（２５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎ
ｇ、１０ｎｇ及び１ｎｇ）のゲノムＤＮＡ（ヒト）を鋳
型として使用した。
０μｌの容量で行った。酵素混合物に対する反応条件は
次の通りであった。 ＰＣＲ緩衝液 ２２ｍＭ（ＮＨ4 ）2 Ｓ
Ｏ4 ；５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．９（２０
℃） ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ 酵素混合物 ２．６Ｕ ｄＮＴＰ ２００μＭ（各） コラーゲンプライマー１ ３００ｎＭ コラーゲンプライマー２ ３００ｎＭ ５個の異なった濃度（２５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎ
ｇ、１０ｎｇ及び１ｎｇ）のゲノムＤＮＡ（ヒト）を鋳
型として使用した。
【００２４】酵素混合物を用いる反応に対応して、ＰＣ
Ｒ反応をＴａｑポリメラーゼを用いても行った。前記記
載の混合物とのただ１つの違いは、ＰＣＲ緩衝液、すな
わち、Ｔａｑ緩衝液〔５０ｍＭのＫＣｌ，１０ｍＭのＴ
ｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．３（２０℃）〕であり、２．
５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼをここで使用した。
Ｒ反応をＴａｑポリメラーゼを用いても行った。前記記
載の混合物とのただ１つの違いは、ＰＣＲ緩衝液、すな
わち、Ｔａｑ緩衝液〔５０ｍＭのＫＣｌ，１０ｍＭのＴ
ｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．３（２０℃）〕であり、２．
５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼをここで使用した。
【００２５】増幅は、次のサイクルプログラムを使用し
て、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎＡｍｐ ９６０
０サーモサイクラー中で行った： １ｘ 変性、９４℃で２分間 １０ｘ 変性、９４℃で１５秒間 アニーリング、６０℃で３０秒間 伸長、７２℃で４５秒間 ２０ｘ 変性、９４℃で１５秒間 アニーリング、６０℃で３０秒間 伸長、７２℃で４５秒間＋各追加サイクルに２０秒間サ
イクル時間を延長 １ｘ ７２℃で７分間。
て、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎＡｍｐ ９６０
０サーモサイクラー中で行った： １ｘ 変性、９４℃で２分間 １０ｘ 変性、９４℃で１５秒間 アニーリング、６０℃で３０秒間 伸長、７２℃で４５秒間 ２０ｘ 変性、９４℃で１５秒間 アニーリング、６０℃で３０秒間 伸長、７２℃で４５秒間＋各追加サイクルに２０秒間サ
イクル時間を延長 １ｘ ７２℃で７分間。
【００２６】こうして得られたＰＣＲ生成物の２５μｌ
を、アガロースゲル（１％）で分析した。図１は、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ
ポリメラーゼ（本発明）を使用し、ヒトＤＮＡのコラー
ゲン遺伝子由来の１．１ｋｂ断片の鋳型の量に依存した
増幅を示す。使用した鋳型のそれぞれの濃度で、酵素混
合物は、有意により多くのＰＣＲ生成物を示し、１ｎｇ
でも十分に増幅されていた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
を使用したときは、検出感度は、出発ＤＮＡを１０ｎｇ
まで低下させ得るだけであった。このことは、本実施例
の酵素混合物を用いた増幅が、Ｔａｑポリメラーゼより
も５０倍以上効率がよいことを示す。
を、アガロースゲル（１％）で分析した。図１は、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ
ポリメラーゼ（本発明）を使用し、ヒトＤＮＡのコラー
ゲン遺伝子由来の１．１ｋｂ断片の鋳型の量に依存した
増幅を示す。使用した鋳型のそれぞれの濃度で、酵素混
合物は、有意により多くのＰＣＲ生成物を示し、１ｎｇ
でも十分に増幅されていた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
を使用したときは、検出感度は、出発ＤＮＡを１０ｎｇ
まで低下させ得るだけであった。このことは、本実施例
の酵素混合物を用いた増幅が、Ｔａｑポリメラーゼより
も５０倍以上効率がよいことを示す。
【００２７】実施例２ 下記の変更を除いて、実施例１に記載のように、両酵素
混合物及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅を行
った：鋳型ＤＮＡ（ヒトゲノムＤＮＡ）の量は２５０ｎ
ｇであった。使用したプライマーは、前向きのプライマ
ーとしてｐ５３プライマー１及び逆向きのプライマーと
してｐ５３プライマー２であった。次のマグネシウム濃
度を使用した：１．５ｍＭ、１．７５ｍＭ、２．０ｍ
Ｍ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ及び５．０ｍＭ。サイクル
プログラム及びＰＣＲの分析は、実施例１と同様であ
る。
混合物及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅を行
った：鋳型ＤＮＡ（ヒトゲノムＤＮＡ）の量は２５０ｎ
ｇであった。使用したプライマーは、前向きのプライマ
ーとしてｐ５３プライマー１及び逆向きのプライマーと
してｐ５３プライマー２であった。次のマグネシウム濃
度を使用した：１．５ｍＭ、１．７５ｍＭ、２．０ｍ
Ｍ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ及び５．０ｍＭ。サイクル
プログラム及びＰＣＲの分析は、実施例１と同様であ
る。
【００２８】図２は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来
技術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ混合物（本発明）を使用し、
ｐ５３遺伝子由来の３０７ｂｐ断片のマグネシウムイオ
ン濃度に依存した増幅を示す。すべてのマグネシウム濃
度で、酵素混合物は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼよりも
出発ＤＮＡの効率のよい増幅を示す；後者は、１．５ｍ
Ｍのマグネシウムの場合のみ明確に見える生成物を示
す。このことは、酵素混合物がＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼよりもＭｇの妨害に対してかなり感受性が低いことを
明らかにする。
技術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ混合物（本発明）を使用し、
ｐ５３遺伝子由来の３０７ｂｐ断片のマグネシウムイオ
ン濃度に依存した増幅を示す。すべてのマグネシウム濃
度で、酵素混合物は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼよりも
出発ＤＮＡの効率のよい増幅を示す；後者は、１．５ｍ
Ｍのマグネシウムの場合のみ明確に見える生成物を示
す。このことは、酵素混合物がＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼよりもＭｇの妨害に対してかなり感受性が低いことを
明らかにする。
【００２９】実施例３ ２５０ｎｇのゲノムＤＮＡで一連の異なるＰＣＲ断片を
増幅した。ＰＣＲ反応及びサイクルプログラムの条件
は、下記の変更を除いて、実施例１の記載と一致する：
下記のプライマー対及び条件を選択した： １．ＦＫＢＰプライマー１／ＦＫＢＰプライマー２（３
２４ｂｐ） ２．ＣＦプライマー１／ＣＦプライマー２（９５０ｂ
ｐ） ３．ｐ５３プライマー３／ｐ５３プライマー４（２．９
ｋｂ）；伸長時間２分 ４．ｔＰＡプライマー７／ｔＰＡプライマー１０（４．
８ｋｂ）；伸長時間４分 ５．ｔＰＡプライマー７／ｔＰＡプライマー１３（６．
５ｋｂ）；伸長時間５分 ６．ｔＰＡプライマー７／ｔＰＡプライマー１４（９．
３ｋｂ）；伸長時間８分 ５０μｌの反応混合物の量を４．〜６．に使用し、伸長
温度を６８℃にセットした。
増幅した。ＰＣＲ反応及びサイクルプログラムの条件
は、下記の変更を除いて、実施例１の記載と一致する：
下記のプライマー対及び条件を選択した： １．ＦＫＢＰプライマー１／ＦＫＢＰプライマー２（３
２４ｂｐ） ２．ＣＦプライマー１／ＣＦプライマー２（９５０ｂ
ｐ） ３．ｐ５３プライマー３／ｐ５３プライマー４（２．９
ｋｂ）；伸長時間２分 ４．ｔＰＡプライマー７／ｔＰＡプライマー１０（４．
８ｋｂ）；伸長時間４分 ５．ｔＰＡプライマー７／ｔＰＡプライマー１３（６．
５ｋｂ）；伸長時間５分 ６．ｔＰＡプライマー７／ｔＰＡプライマー１４（９．
３ｋｂ）；伸長時間８分 ５０μｌの反応混合物の量を４．〜６．に使用し、伸長
温度を６８℃にセットした。
【００３０】図３は、Ｔａｑ／Ｐｗｏ酵素混合物（本発
明）及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技術）を使用
し、ヒトゲノムＤＮＡ由来の３２４ｂｐ、９５０ｂｐ、
２．９ｋｂ、４．８ｋｂ、６．５ｋｂ及び９．３ｋｂ断
片の増幅を示す。酵素混合物を用いて、全範囲のＰＣＲ
生成物を得ることが可能であった。Ｔａｑポリメラーゼ
を使用した場合、３ｋｂまでのＰＣＲ生成物だけしか増
幅できなかった。酵素混合物は、すべてのケースで、Ｔ
ａｑポリメラーゼよりも有意に多くの生成物を示す。
明）及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技術）を使用
し、ヒトゲノムＤＮＡ由来の３２４ｂｐ、９５０ｂｐ、
２．９ｋｂ、４．８ｋｂ、６．５ｋｂ及び９．３ｋｂ断
片の増幅を示す。酵素混合物を用いて、全範囲のＰＣＲ
生成物を得ることが可能であった。Ｔａｑポリメラーゼ
を使用した場合、３ｋｂまでのＰＣＲ生成物だけしか増
幅できなかった。酵素混合物は、すべてのケースで、Ｔ
ａｑポリメラーゼよりも有意に多くの生成物を示す。
【００３１】実施例４ ＰＣＲ反応及びサイクルプログラムの条件は、下記の変
更を除いて、実施例１の記載と一致する：ｔＰＡプライ
マー１及びｔＰＡプライマー２を使用した。ヒトＤＮＡ
の量は１００ｎｇを使用した。Ｐｗｏに対し、下記のＰ
ＣＲ緩衝条件を使用した：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
ｐＨ８．８５；２５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ（ＮＨ4 ）2
ＳＯ4 。硫酸マグネシウム濃度は２．０ｍＭであった。
２．５ＵのＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを各反応に使用し
た。実験には次の部分のｄＮＴＰ混合物を使用した： １．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ ２．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；１００μＭ ｄＴＴＰ，１００μＭ ビオチン−
ｄＵＴＰ ３．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；１３４μＭ ｄＴＴＰ，６６μＭ ビオチン−ｄ
ＵＴＰ ４．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；１８０μＭ ｄＴＴＰ，２０μＭ ビオチン−ｄ
ＵＴＰ ５．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；１３４μＭ ｄＴＴＰ，６６μＭ ジゴキシゲニ
ン−ｄＵＴＰ ６．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；１９０μＭ ｄＴＴＰ，１０μＭ ジゴキシゲニ
ン−ｄＵＴＰ
更を除いて、実施例１の記載と一致する：ｔＰＡプライ
マー１及びｔＰＡプライマー２を使用した。ヒトＤＮＡ
の量は１００ｎｇを使用した。Ｐｗｏに対し、下記のＰ
ＣＲ緩衝条件を使用した：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
ｐＨ８．８５；２５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ（ＮＨ4 ）2
ＳＯ4 。硫酸マグネシウム濃度は２．０ｍＭであった。
２．５ＵのＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを各反応に使用し
た。実験には次の部分のｄＮＴＰ混合物を使用した： １．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ ２．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；１００μＭ ｄＴＴＰ，１００μＭ ビオチン−
ｄＵＴＰ ３．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；１３４μＭ ｄＴＴＰ，６６μＭ ビオチン−ｄ
ＵＴＰ ４．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；１８０μＭ ｄＴＴＰ，２０μＭ ビオチン−ｄ
ＵＴＰ ５．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；１３４μＭ ｄＴＴＰ，６６μＭ ジゴキシゲニ
ン−ｄＵＴＰ ６．２００μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ；１９０μＭ ｄＴＴＰ，１０μＭ ジゴキシゲニ
ン−ｄＵＴＰ
【００３２】図４は、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ及び酵素混合物を使用し、ヒトＤ
ＮＡのｔＰＡ遺伝子由来の３７５ｂｐ断片の修飾ヌクレ
オチドであるＤＩＧ−ｄＵＴＰ及びＢｉｏ−ｄＵＴＰの
異なる濃度に依存した増幅及び標識を示す。ジゴキシゲ
ニン−ｄＵＴＰ及びビオチン−ｄＵＴＰの両取り込み
は、修飾ヌクレオチドの濃度にかかわらず、酵素混合物
で最もよく行われている。このことは、効率（生成物の
収量）及び標識の密度（修飾ｄＵＴＰの取り込みの増加
に対応してＰＣＲ生成物が高分子量にシフト）の両方に
当てはまる。エチジウムブロミドゲルで、Ｐｗｏポリメ
ラーゼは、どんな特異的ＰＣＲ生成物も示さず、非特異
的なバックグランドだけである。ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼは、一部特異的な増幅を示し、非特異的な高いバッ
クグランドを示す。
ｑＤＮＡポリメラーゼ及び酵素混合物を使用し、ヒトＤ
ＮＡのｔＰＡ遺伝子由来の３７５ｂｐ断片の修飾ヌクレ
オチドであるＤＩＧ−ｄＵＴＰ及びＢｉｏ−ｄＵＴＰの
異なる濃度に依存した増幅及び標識を示す。ジゴキシゲ
ニン−ｄＵＴＰ及びビオチン−ｄＵＴＰの両取り込み
は、修飾ヌクレオチドの濃度にかかわらず、酵素混合物
で最もよく行われている。このことは、効率（生成物の
収量）及び標識の密度（修飾ｄＵＴＰの取り込みの増加
に対応してＰＣＲ生成物が高分子量にシフト）の両方に
当てはまる。エチジウムブロミドゲルで、Ｐｗｏポリメ
ラーゼは、どんな特異的ＰＣＲ生成物も示さず、非特異
的なバックグランドだけである。ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼは、一部特異的な増幅を示し、非特異的な高いバッ
クグランドを示す。
【００３３】実施例５ ＡＭＶ／Ｔａｑ−Ｐｗｏ混合物（本発明）に対する共役
ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、下記の通りである：５０μ
ｌの反応混合液は、５ＵのＡＭＶ；０．７５μｌの実施
例１記載の酵素混合物（Ｔａｑ／Ｐｗｏ）；２２ｍＭ
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ；５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ
８．９（２０℃）；１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 ；１ｍＭの
ＤＴＴ；２００μＭのｄＮＴＰ；３００ｎＭコラーゲン
プライマー３，３００ｎＭコラーゲンプライマー４を含
む。肝臓の全ＲＮＡ（ヒト）を、次の濃度で鋳型として
使用した：２５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎ
ｇ、５ｎｇ、１ｎｇ。酵素混合物を含む反応混合物の使
用に追加して、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを用いたＲＴ
−ＰＣＲも行った。５０μｌの混合液は、４ＵのＴｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼ、５０ｍＭビシン／ＫＯＨ，ｐＨ
８．２、１１５ｍＭのＫＡｃ、２ｍＭのＭｎ（ＯＡｃ）
2 、８％（ｖ／ｖ）グリセリン、２００μＭｄＮＴＰ、
３００ｎＭ配列特異的コラーゲン３前向きプライマー及
びコラーゲン４逆向きプライマー及び上記記載と同一の
濃度の鋳型ＲＮＡをそれぞれ含んでいた。
ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、下記の通りである：５０μ
ｌの反応混合液は、５ＵのＡＭＶ；０．７５μｌの実施
例１記載の酵素混合物（Ｔａｑ／Ｐｗｏ）；２２ｍＭ
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ；５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ
８．９（２０℃）；１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 ；１ｍＭの
ＤＴＴ；２００μＭのｄＮＴＰ；３００ｎＭコラーゲン
プライマー３，３００ｎＭコラーゲンプライマー４を含
む。肝臓の全ＲＮＡ（ヒト）を、次の濃度で鋳型として
使用した：２５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎ
ｇ、５ｎｇ、１ｎｇ。酵素混合物を含む反応混合物の使
用に追加して、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを用いたＲＴ
−ＰＣＲも行った。５０μｌの混合液は、４ＵのＴｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼ、５０ｍＭビシン／ＫＯＨ，ｐＨ
８．２、１１５ｍＭのＫＡｃ、２ｍＭのＭｎ（ＯＡｃ）
2 、８％（ｖ／ｖ）グリセリン、２００μＭｄＮＴＰ、
３００ｎＭ配列特異的コラーゲン３前向きプライマー及
びコラーゲン４逆向きプライマー及び上記記載と同一の
濃度の鋳型ＲＮＡをそれぞれ含んでいた。
【００３４】次のサイクルプログラムを使用して、Ｐｅ
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎＡｍｐ ９６００サーモ
サイクラー中でＲＴ−ＰＣＲを行った： １ｘ 逆転写反応、６０℃で３０分間 １ｘ 変性 ９４℃で２分間 １０ｘ 変性 ９４℃で１５秒間 アニーリング ６０℃で３０秒間 伸長 ７２℃４０秒間 ２５ｘ 変性 ９４℃で２０秒間 アニーリング ６０℃で３０秒間 伸長 ７２℃で４０秒間＋各追加サイクルに対してはサ
イクル時間を１０秒間延長 １ｘ ７２℃で７分間 こうして得られたＰＣＲ生成物の２０μｌを、アガロー
スゲル（１％）で分析した。
ｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎＡｍｐ ９６００サーモ
サイクラー中でＲＴ−ＰＣＲを行った： １ｘ 逆転写反応、６０℃で３０分間 １ｘ 変性 ９４℃で２分間 １０ｘ 変性 ９４℃で１５秒間 アニーリング ６０℃で３０秒間 伸長 ７２℃４０秒間 ２５ｘ 変性 ９４℃で２０秒間 アニーリング ６０℃で３０秒間 伸長 ７２℃で４０秒間＋各追加サイクルに対してはサ
イクル時間を１０秒間延長 １ｘ ７２℃で７分間 こうして得られたＰＣＲ生成物の２０μｌを、アガロー
スゲル（１％）で分析した。
【００３５】図５は、コラーゲンｍＲＮＡ由来の２５９
ｂｐ断片の増幅を示す。酵素混合物は、広範囲で、有意
に高い生成物収量を示す。Ｔｔｈポリメラーゼが非常に
弱いシグナルを生じるのに対し、酵素混合物は、５ｎｇ
の出発ＤＮＡでさえも明確なシグナルを示す。
ｂｐ断片の増幅を示す。酵素混合物は、広範囲で、有意
に高い生成物収量を示す。Ｔｔｈポリメラーゼが非常に
弱いシグナルを生じるのに対し、酵素混合物は、５ｎｇ
の出発ＤＮＡでさえも明確なシグナルを示す。
【００３６】実施例６ ＡＭＶ／Ｔａｑ−Ｐｗｏ混合物に対する共役ＲＴ−ＰＣ
Ｒの反応条件は、実施例５の通りであった。ＡＭＶ／Ｔ
ａｑ反応に対して、本発明の酵素混合物を２．５ＵのＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼと置換した。両反応共に、２０
０ｎＭの前向きと逆向きのＧ３ＰＤＨプライマーを使用
した。ヒト肝臓の全ＲＮＡを次の濃度で、鋳型として使
用した：２５０ｎｇ、１００ｎｇ及び１０ｎｇ。さら
に、５００μＭのｄＮＴＰ及び２．２５ｍＭのＭｇ2+イ
オンを用いた反応も行った。他のすべてのパラメーター
は同じにした。サーモサイクルの条件は、下記の点が実
施例５と異なる： −ＲＴ反応 ５５℃で３０分、 −プライマーのアニーリング温度は５５℃、 −伸長時間は１分。
Ｒの反応条件は、実施例５の通りであった。ＡＭＶ／Ｔ
ａｑ反応に対して、本発明の酵素混合物を２．５ＵのＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼと置換した。両反応共に、２０
０ｎＭの前向きと逆向きのＧ３ＰＤＨプライマーを使用
した。ヒト肝臓の全ＲＮＡを次の濃度で、鋳型として使
用した：２５０ｎｇ、１００ｎｇ及び１０ｎｇ。さら
に、５００μＭのｄＮＴＰ及び２．２５ｍＭのＭｇ2+イ
オンを用いた反応も行った。他のすべてのパラメーター
は同じにした。サーモサイクルの条件は、下記の点が実
施例５と異なる： −ＲＴ反応 ５５℃で３０分、 −プライマーのアニーリング温度は５５℃、 −伸長時間は１分。
【００３７】図６は、Ｇ３ＰＤＨ−ＲＮＡ由来の９８３
ｂｐ断片の増幅を示す。すべての条件下で、ＡＭＶ／酵
素混合物は、ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物よりも有意に高い収
量を示す。使用する系にかかわらず、ｄＮＴＰ／Ｍｇ2+
の濃度の上昇が、反応をさらに改良することもわかっ
た。
ｂｐ断片の増幅を示す。すべての条件下で、ＡＭＶ／酵
素混合物は、ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物よりも有意に高い収
量を示す。使用する系にかかわらず、ｄＮＴＰ／Ｍｇ2+
の濃度の上昇が、反応をさらに改良することもわかっ
た。
【００３８】実施例７ ＡＭＶ／Ｔａｑ−Ｐｗｏ混合物（ｂ）及びＡＭＶ／Ｔａ
ｑ（ｂ）に対する共役ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、実施
例６の通りである。両反応において、２００ｎＭの前向
きと逆向きのジストロフィンプライマーを使用した。ヒ
ト筋肉の全ＲＮＡを次の濃度で、鋳型として使用した：
１００ｎｇ、１０ｎｇ及び５ｎｇ。鋳型の濃度に加え、
硫酸アンモニウムの濃度も変化させた。硫酸塩は、下記
の濃度を使用した：１８ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２
４ｍＭ及び２６ｍＭ。 −ＲＴ反応 ５５℃で３０分、 −プライマーのアニーリング温度は５８℃、 −伸長時間は１．５分。
ｑ（ｂ）に対する共役ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、実施
例６の通りである。両反応において、２００ｎＭの前向
きと逆向きのジストロフィンプライマーを使用した。ヒ
ト筋肉の全ＲＮＡを次の濃度で、鋳型として使用した：
１００ｎｇ、１０ｎｇ及び５ｎｇ。鋳型の濃度に加え、
硫酸アンモニウムの濃度も変化させた。硫酸塩は、下記
の濃度を使用した：１８ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍＭ、２
４ｍＭ及び２６ｍＭ。 −ＲＴ反応 ５５℃で３０分、 −プライマーのアニーリング温度は５８℃、 −伸長時間は１．５分。
【００３９】図７は、ジストロフィー−ＲＮＡ由来の１
８５１ｂｐ断片の増幅を示す。すべての条件下で、ＡＭ
Ｖ／酵素混合物は、ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物よりも有意に
高い生成物収量を示す。硫酸アンモニウムの濃度を上げ
ると、シグナルが強くなる。
８５１ｂｐ断片の増幅を示す。すべての条件下で、ＡＭ
Ｖ／酵素混合物は、ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物よりも有意に
高い生成物収量を示す。硫酸アンモニウムの濃度を上げ
ると、シグナルが強くなる。
【００４０】
【発明の効果】本発明により、従来技術により増幅でき
なかった短い核酸配列を特異的に増幅するための方法が
提供される。
なかった短い核酸配列を特異的に増幅するための方法が
提供される。
【００４１】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： TAAAGGGTCA CCGTGGCTTC 20
【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： CGAACCACAT TGGCATCATC 20
【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： TGGAAACTTT CCACTTGAT 19
【００４４】配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： GTCCCAAGCA ATGGATCAT 19
【００４５】配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： GGAATTCTAT GGGAGTGCAG GTGGAA 26
【００４６】配列番号：６ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： GCGGATCCAA GCTTTCATTC CAGTTTTAGA AGCTC 35
【００４７】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： GCTGCATCAT ATAAGTTGCC 20
【００４８】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： AAGGCTACAC TGTTAATTTT 20
【００４９】配列番号：９ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： GTCCCAAGCA ATGGATGAT 19
【００５０】配列番号：１０ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： TGGAAACTTT CCACTTGAT 19
【００５１】配列番号：１１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： GGAAGTACAG CTCAGAGTTC TGCAGCACCC CTGC 34
【００５２】配列番号：１２ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： GATGCGAAAC TGAGGCTGGC TGTACTGTCT C 31
【００５３】配列番号：１３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： TGTCTCCAGC ACACAGCATG TTGTCGGTGA C 31
【００５４】配列番号：１４ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： CAAAGTCATG CGGCCATCGT TCAGACACAC C 31
【００５５】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： AGACAGTACA GCCAGCCTCA 20
【００５６】配列番号：１６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： GACTTCAAAT TTCTGCTCCT C 21
【００５７】配列番号：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： CCAAGAGGAA GGCCAAGTCG 20
【００５８】配列番号：１８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： GGTGGTTTCT TGGTCGGTG 19
【００５９】配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： TAGAGTTTGC CCATGGATTG 20
【００６０】配列番号：２０ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： GGGAAGTAGA GGACTGTTAT GAAAGAGAAG 30
【００６１】配列番号：２１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： TGAAGGTCGG AGTCAACGGA TTTGGT 26
【００６２】配列番号：２２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（プライマー） 配列： CATGTGGGCC ATGAGGTCCA CCAC 24
【図１】図１は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技
術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ混合物（本発明）を使用し、ヒ
トＤＮＡのコラーゲン遺伝子由来の１．１ｋｂ断片の鋳
型の量に依存した増幅を示す。使用した鋳型の量は、２
５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ及び１ｎｇ
のヒトゲノムＤＮＡである。使用した濃度のそれぞれ
で、酵素混合物は、有意に高いＰＣＲ生成物の収量を示
す。１ｎｇでも増幅し、十分な収量を与えた。ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼを使用したとき、検出感度は、１０ｎ
ｇの出発ＤＮＡまで低下するにすぎなかった。このこと
は、本実施例の酵素混合物を用いた増幅が、Ｔａｑポリ
メラーゼよりも５０倍以上効率がよいことを示す。
術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ混合物（本発明）を使用し、ヒ
トＤＮＡのコラーゲン遺伝子由来の１．１ｋｂ断片の鋳
型の量に依存した増幅を示す。使用した鋳型の量は、２
５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ及び１ｎｇ
のヒトゲノムＤＮＡである。使用した濃度のそれぞれ
で、酵素混合物は、有意に高いＰＣＲ生成物の収量を示
す。１ｎｇでも増幅し、十分な収量を与えた。ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼを使用したとき、検出感度は、１０ｎ
ｇの出発ＤＮＡまで低下するにすぎなかった。このこと
は、本実施例の酵素混合物を用いた増幅が、Ｔａｑポリ
メラーゼよりも５０倍以上効率がよいことを示す。
【図２】図２は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技
術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ混合物（本発明）を使用し、ｐ
５３遺伝子由来の３０７ｂｐ断片のマグネシウムイオン
濃度に依存した増幅を示す。次のマグネシウム濃度を使
用した：１．５ｍＭ、１．７５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．
５ｍＭ、３．０ｍＭ及び５．０ｍＭ。すべてのマグネシ
ウム濃度で、酵素混合物は、出発ＤＮＡの一層効率のよ
い増幅を示す。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用したと
き、１．５ｍＭのマグネシウムのみ明確に見える生成物
が得られる。このことは、酵素混合物がＭｇの妨害に対
してかなり感受性が低いことを示す。
術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ混合物（本発明）を使用し、ｐ
５３遺伝子由来の３０７ｂｐ断片のマグネシウムイオン
濃度に依存した増幅を示す。次のマグネシウム濃度を使
用した：１．５ｍＭ、１．７５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．
５ｍＭ、３．０ｍＭ及び５．０ｍＭ。すべてのマグネシ
ウム濃度で、酵素混合物は、出発ＤＮＡの一層効率のよ
い増幅を示す。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用したと
き、１．５ｍＭのマグネシウムのみ明確に見える生成物
が得られる。このことは、酵素混合物がＭｇの妨害に対
してかなり感受性が低いことを示す。
【図３】図３は、Ｔａｑ／Ｐｗｏ酵素混合物（本発明）
及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技術）を使用し、
ヒトゲノムＤＮＡ由来の３２４ｂｐ、９５０ｂｐ、２．
９ｋｂ、４．８ｋｂ、６．５ｋｂ及び９．３ｋｂ断片の
増幅を示す。酵素混合物を用いた場合、すべての濃度で
ＰＣＲ生成物を得られる。Ｔａｑポリメラーゼを使用し
た場合、３ｋｂまでしか増幅できない。すべてのケース
で、酵素混合物は、Ｔａｑポリメラーゼよりも有意に多
くの生成物を生ずる。
及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技術）を使用し、
ヒトゲノムＤＮＡ由来の３２４ｂｐ、９５０ｂｐ、２．
９ｋｂ、４．８ｋｂ、６．５ｋｂ及び９．３ｋｂ断片の
増幅を示す。酵素混合物を用いた場合、すべての濃度で
ＰＣＲ生成物を得られる。Ｔａｑポリメラーゼを使用し
た場合、３ｋｂまでしか増幅できない。すべてのケース
で、酵素混合物は、Ｔａｑポリメラーゼよりも有意に多
くの生成物を生ずる。
【図４】図４は、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ及び酵素混合物を使用し、ヒトＤＮＡ
のｔＰＡ遺伝子由来の３７５ｂｐ断片の修飾ヌクレオチ
ドであるＤＩＧ−ｄＵＴＰ及びＢｉｏ−ｄＵＴＰの異な
る濃度に依存した増幅及び標識を示す。ジゴキシゲニン
−ｄＵＴＰ及びビオチン−ｄＵＴＰの取り込みは、修飾
ヌクレオチドの濃度にかかわらず、酵素混合物で最もよ
く行われている。このことは、効率（生成物の収量）及
び標識の密度（標識ｄＵＴＰの取り込みの増加に対応し
てＰＣＲ生成物が高分子量にシフト）の両方に当てはま
る。エチジウムブロミドゲルで、Ｐｗｏポリメラーゼ
は、どんな特異的ＰＣＲ生成物も示さず、非特異的なバ
ックグランドだけである。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
は、一部特異的な増幅を示し、非特異的な高いバックグ
ランドを示す。
ＮＡポリメラーゼ及び酵素混合物を使用し、ヒトＤＮＡ
のｔＰＡ遺伝子由来の３７５ｂｐ断片の修飾ヌクレオチ
ドであるＤＩＧ−ｄＵＴＰ及びＢｉｏ−ｄＵＴＰの異な
る濃度に依存した増幅及び標識を示す。ジゴキシゲニン
−ｄＵＴＰ及びビオチン−ｄＵＴＰの取り込みは、修飾
ヌクレオチドの濃度にかかわらず、酵素混合物で最もよ
く行われている。このことは、効率（生成物の収量）及
び標識の密度（標識ｄＵＴＰの取り込みの増加に対応し
てＰＣＲ生成物が高分子量にシフト）の両方に当てはま
る。エチジウムブロミドゲルで、Ｐｗｏポリメラーゼ
は、どんな特異的ＰＣＲ生成物も示さず、非特異的なバ
ックグランドだけである。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
は、一部特異的な増幅を示し、非特異的な高いバックグ
ランドを示す。
【図５】図５は、共役逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ）を使用した、ヒト肝臓全ＲＮＡよりのコラ
ーゲンｍＲＮＡ由来の２５９ｂｐ断片の増幅を示す。Ｔ
ｔｈＤＮＡポリメラーゼ及びＡＭＶ／Ｔａｑ−Ｐｗｏ混
合物（本発明）を両方使用して、鋳型の量に依存した増
幅を行う。２５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎ
ｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの量の全ＲＮＡを使用した。酵素
混合物は、広範囲で、有意により高い収量を示す。Ｔｔ
ｈＤＮＡポリメラーゼが弱いシグナルしか生じないのに
対し、酵素混合物は、５ｎｇの出発ＲＮＡでさえも明確
なシグナルを示す。
Ｔ−ＰＣＲ）を使用した、ヒト肝臓全ＲＮＡよりのコラ
ーゲンｍＲＮＡ由来の２５９ｂｐ断片の増幅を示す。Ｔ
ｔｈＤＮＡポリメラーゼ及びＡＭＶ／Ｔａｑ−Ｐｗｏ混
合物（本発明）を両方使用して、鋳型の量に依存した増
幅を行う。２５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎ
ｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの量の全ＲＮＡを使用した。酵素
混合物は、広範囲で、有意により高い収量を示す。Ｔｔ
ｈＤＮＡポリメラーゼが弱いシグナルしか生じないのに
対し、酵素混合物は、５ｎｇの出発ＲＮＡでさえも明確
なシグナルを示す。
【図６】図６は、共役ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ヒト肝
臓全ＲＮＡよりのＧ３ＰＤＨｍＲＮＡ由来の９８３ｂｐ
断片の増幅を示す。ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物及びＡＭＶ／
酵素混合物（本発明）を両方使用して、鋳型の量及びｄ
ＮＴＰの濃度に依存した増幅を行う。２５０ｎｇ、１０
０ｎｇ及び１０ｎｇの鋳型を使用した。使用したｄＮＴ
Ｐの濃度は、２００μＭ（１．５ｍＭ Ｍｇイオン）又
は５００μＭ（２．２５ｍＭＭｇイオン）であった。す
べての条件で、ＡＭＶ／酵素混合物は、ＡＭＶ／Ｔａｑ
混合物よりも有意に高い収量を示す。使用する系にかか
わらず、ｄＮＴＰ／Ｍｇイオンの濃度の上昇が、反応を
さらに改良することもわかった。
臓全ＲＮＡよりのＧ３ＰＤＨｍＲＮＡ由来の９８３ｂｐ
断片の増幅を示す。ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物及びＡＭＶ／
酵素混合物（本発明）を両方使用して、鋳型の量及びｄ
ＮＴＰの濃度に依存した増幅を行う。２５０ｎｇ、１０
０ｎｇ及び１０ｎｇの鋳型を使用した。使用したｄＮＴ
Ｐの濃度は、２００μＭ（１．５ｍＭ Ｍｇイオン）又
は５００μＭ（２．２５ｍＭＭｇイオン）であった。す
べての条件で、ＡＭＶ／酵素混合物は、ＡＭＶ／Ｔａｑ
混合物よりも有意に高い収量を示す。使用する系にかか
わらず、ｄＮＴＰ／Ｍｇイオンの濃度の上昇が、反応を
さらに改良することもわかった。
【図７】図７は、ヒト筋肉の全ＲＮＡよりのジストロフ
ィンｍＲＮＡ由来の１８５１ｂｐ断片の増幅を示す。Ａ
ＭＶ／Ｔａｑ混合物（ｂ）及びＡＭＶ／酵素混合物
（ａ）を用いて、鋳型ＲＮＡの量及び硫酸アンモニウム
の濃度に依存した増幅を行った。使用した鋳型の量は、
１００ｎｇ、１０ｎｇ及び５ｎｇであった。使用した硫
酸アンモニウムの濃度は、１８ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍ
Ｍ、２４ｍＭ及び２６ｍＭであった。すべての条件で、
ＡＭＶ／酵素混合物は、ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物（ｂ）よ
りも有意に高い収量を示す。
ィンｍＲＮＡ由来の１８５１ｂｐ断片の増幅を示す。Ａ
ＭＶ／Ｔａｑ混合物（ｂ）及びＡＭＶ／酵素混合物
（ａ）を用いて、鋳型ＲＮＡの量及び硫酸アンモニウム
の濃度に依存した増幅を行った。使用した鋳型の量は、
１００ｎｇ、１０ｎｇ及び５ｎｇであった。使用した硫
酸アンモニウムの濃度は、１８ｍＭ、２０ｍＭ、２２ｍ
Ｍ、２４ｍＭ及び２６ｍＭであった。すべての条件で、
ＡＭＶ／酵素混合物は、ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物（ｂ）よ
りも有意に高い収量を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成８年７月２９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】図１は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技
術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ混合物（本発明）を使用し、ヒ
トＤＮＡのコラーゲン遺伝子由来の１．１ｋｂ断片の鋳
型の量に依存した増幅を示す電気泳動の写真である。使
用した鋳型の量は、２５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎ
ｇ、１０ｎｇ及び１ｎｇのヒトゲノムＤＮＡである。使
用した濃度のそれぞれで、酵素混合物は、有意に高いＰ
ＣＲ生成物の収量を示す。１ｎｇでも増幅し、十分な収
量を与えた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用したと
き、検出感度は、１０ｎｇの出発ＤＮＡまで低下するに
すぎなかった。このことは、本実施例の酵素混合物を用
いた増幅が、Ｔａｑポリメラーゼよりも５０倍以上効率
がよいことを示す。
術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ混合物（本発明）を使用し、ヒ
トＤＮＡのコラーゲン遺伝子由来の１．１ｋｂ断片の鋳
型の量に依存した増幅を示す電気泳動の写真である。使
用した鋳型の量は、２５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎ
ｇ、１０ｎｇ及び１ｎｇのヒトゲノムＤＮＡである。使
用した濃度のそれぞれで、酵素混合物は、有意に高いＰ
ＣＲ生成物の収量を示す。１ｎｇでも増幅し、十分な収
量を与えた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用したと
き、検出感度は、１０ｎｇの出発ＤＮＡまで低下するに
すぎなかった。このことは、本実施例の酵素混合物を用
いた増幅が、Ｔａｑポリメラーゼよりも５０倍以上効率
がよいことを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】図２は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技
術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ混合物（本発明）を使用し、ｐ
５３遺伝子由来の３０７ｂｐ断片のマグネシウムイオン
濃度に依存した増幅を示す電気泳動の写真である。次の
マグネシウム濃度を使用した：１．５ｍＭ、１．７５ｍ
Ｍ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ及び５．０ｍ
Ｍ。すべてのマグネシウム濃度で、酵素混合物は、出発
ＤＮＡの一層効率のよい増幅を示す。ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼを使用したとき、１．５ｍＭのマグネシウムの
み明確に見える生成物が得られる。このことは、酵素混
合物がＭｇの妨害に対してかなり感受性が低いことを示
す。
術）及びＴａｑ／Ｐｗｏ混合物（本発明）を使用し、ｐ
５３遺伝子由来の３０７ｂｐ断片のマグネシウムイオン
濃度に依存した増幅を示す電気泳動の写真である。次の
マグネシウム濃度を使用した：１．５ｍＭ、１．７５ｍ
Ｍ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ及び５．０ｍ
Ｍ。すべてのマグネシウム濃度で、酵素混合物は、出発
ＤＮＡの一層効率のよい増幅を示す。ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼを使用したとき、１．５ｍＭのマグネシウムの
み明確に見える生成物が得られる。このことは、酵素混
合物がＭｇの妨害に対してかなり感受性が低いことを示
す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】図３は、Ｔａｑ／Ｐｗｏ酵素混合物（本発明）
及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技術）を使用し、
ヒトゲノムＤＮＡ由来の３２４ｂｐ、９５０ｂｐ、２．
９ｋｂ、４．８ｋｂ、６．５ｋｂ及び９．３ｋｂ断片の
増幅を示す電気泳動の写真である。酵素混合物を用いた
場合、すべての濃度でＰＣＲ生成物を得られる。Ｔａｑ
ポリメラーゼを使用した場合、３ｋｂまでしか増幅でき
ない。すべてのケースで、酵素混合物は、Ｔａｑポリメ
ラーゼよりも、有意に多くの生成物を生ずる。
及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（従来技術）を使用し、
ヒトゲノムＤＮＡ由来の３２４ｂｐ、９５０ｂｐ、２．
９ｋｂ、４．８ｋｂ、６．５ｋｂ及び９．３ｋｂ断片の
増幅を示す電気泳動の写真である。酵素混合物を用いた
場合、すべての濃度でＰＣＲ生成物を得られる。Ｔａｑ
ポリメラーゼを使用した場合、３ｋｂまでしか増幅でき
ない。すべてのケースで、酵素混合物は、Ｔａｑポリメ
ラーゼよりも、有意に多くの生成物を生ずる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】図４は、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ及び酵素混合物を使用し、ヒトＤＮＡ
のｔＰＡ遺伝子由来の３７５ｂｐ断片の修飾ヌクレオチ
ドであるＤＩＧ−ｄＵＴＰ及びＢｉｏ−ｄＵＴＰの異な
る濃度に依存した増幅及び標識を示す電気泳動の写真で
ある。ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ及びビオチン−ｄＵＴ
Ｐの取り込みは、修飾ヌクレオチドの濃度にかかわら
ず、酵素混合物で最もよく行われている。このことは、
効率（生成物の収量）及び標識の密度（標識ｄＵＴＰの
取り込みの増加に対応してＰＣＲ生成物が高分子量にシ
フト）の両方に当てはまる。エチジウムブロミドゲル
で、Ｐｗｏポリメラーゼは、どんな特異的ＰＣＲ生成物
も示さず、非特異的なバックグランドだけである。Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼは、一部特異的な増幅を示し、非
特異的な高いバックグランドを示す。
ＮＡポリメラーゼ及び酵素混合物を使用し、ヒトＤＮＡ
のｔＰＡ遺伝子由来の３７５ｂｐ断片の修飾ヌクレオチ
ドであるＤＩＧ−ｄＵＴＰ及びＢｉｏ−ｄＵＴＰの異な
る濃度に依存した増幅及び標識を示す電気泳動の写真で
ある。ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ及びビオチン−ｄＵＴ
Ｐの取り込みは、修飾ヌクレオチドの濃度にかかわら
ず、酵素混合物で最もよく行われている。このことは、
効率（生成物の収量）及び標識の密度（標識ｄＵＴＰの
取り込みの増加に対応してＰＣＲ生成物が高分子量にシ
フト）の両方に当てはまる。エチジウムブロミドゲル
で、Ｐｗｏポリメラーゼは、どんな特異的ＰＣＲ生成物
も示さず、非特異的なバックグランドだけである。Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼは、一部特異的な増幅を示し、非
特異的な高いバックグランドを示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】図５は、共役逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ）を使用した、ヒト肝臓全ＲＮＡよりのコラ
ーゲンｍＲＮＡ由来の２５９ｂｐ断片の増幅を示す電気
泳動の写真である。ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ及びＡＭ
Ｖ／Ｔａｑ−Ｐｗｏ混合物（本発明）を両方使用して、
鋳型の量に依存した増幅を行う。２５０ｎｇ、１００ｎ
ｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの量の全Ｒ
ＮＡを使用した。酵素混合物は、広範囲で、有意により
高い収量を示す。ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼが弱いシグ
ナルしか生じないのに対し、酵素混合物は、５ｎｇの出
発ＲＮＡでさえも明確なシグナルを示す。
Ｔ−ＰＣＲ）を使用した、ヒト肝臓全ＲＮＡよりのコラ
ーゲンｍＲＮＡ由来の２５９ｂｐ断片の増幅を示す電気
泳動の写真である。ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ及びＡＭ
Ｖ／Ｔａｑ−Ｐｗｏ混合物（本発明）を両方使用して、
鋳型の量に依存した増幅を行う。２５０ｎｇ、１００ｎ
ｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの量の全Ｒ
ＮＡを使用した。酵素混合物は、広範囲で、有意により
高い収量を示す。ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼが弱いシグ
ナルしか生じないのに対し、酵素混合物は、５ｎｇの出
発ＲＮＡでさえも明確なシグナルを示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】図６は、共役ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ヒト肝
臓全ＲＮＡよりのＧ３ＰＤＨｍＲＮＡ由来の９８３ｂｐ
断片の増幅を示す電気泳動の写真である。ＡＭＶ／Ｔａ
ｑ混合物及びＡＭＶ／酵素混合物（本発明）を両方使用
して、鋳型の量及びｄＮＴＰの濃度に依存した増幅を行
う。２５０ｎｇ、１００ｎｇ及び１０ｎｇの鋳型を使用
した。使用したｄＮＴＰの濃度は、２００μＭ（１．５
ｍＭ Ｍｇイオン）又は５００μＭ（２．２５ｍＭＭｇ
イオン）であった。すべての条件で、ＡＭＶ／酵素混合
物は、ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物よりも有意に高い収量を示
す。使用する系にかかわらず、ｄＮＴＰ／Ｍｇイオンの
濃度の上昇が、反応をさらに改良することもわかった。
臓全ＲＮＡよりのＧ３ＰＤＨｍＲＮＡ由来の９８３ｂｐ
断片の増幅を示す電気泳動の写真である。ＡＭＶ／Ｔａ
ｑ混合物及びＡＭＶ／酵素混合物（本発明）を両方使用
して、鋳型の量及びｄＮＴＰの濃度に依存した増幅を行
う。２５０ｎｇ、１００ｎｇ及び１０ｎｇの鋳型を使用
した。使用したｄＮＴＰの濃度は、２００μＭ（１．５
ｍＭ Ｍｇイオン）又は５００μＭ（２．２５ｍＭＭｇ
イオン）であった。すべての条件で、ＡＭＶ／酵素混合
物は、ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物よりも有意に高い収量を示
す。使用する系にかかわらず、ｄＮＴＰ／Ｍｇイオンの
濃度の上昇が、反応をさらに改良することもわかった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】図７は、ヒト筋肉の全ＲＮＡよりのジストロフ
ィンｍＲＮＡ由来の１８５１ｂｐ断片の増幅を示す電気
泳動の写真である。ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物（ｂ）及びＡ
ＭＶ／酵素混合物（ａ）を用いて、鋳型ＲＮＡの量及び
硫酸アンモニウムの濃度に依存した増幅を行った。使用
した鋳型の量は、１００ｎｇ、１０ｎｇ及び５ｎｇであ
った。使用した硫酸アンモニウムの濃度は、１８ｍＭ、
２０ｍＭ、２２ｍＭ、２４ｍＭ及び２６ｍＭであった。
すべての条件で、ＡＭＶ／酵素混合物は、ＡＭＶ／Ｔａ
ｑ混合物（ｂ）よりも有意に高い収量を示す。
ィンｍＲＮＡ由来の１８５１ｂｐ断片の増幅を示す電気
泳動の写真である。ＡＭＶ／Ｔａｑ混合物（ｂ）及びＡ
ＭＶ／酵素混合物（ａ）を用いて、鋳型ＲＮＡの量及び
硫酸アンモニウムの濃度に依存した増幅を行った。使用
した鋳型の量は、１００ｎｇ、１０ｎｇ及び５ｎｇであ
った。使用した硫酸アンモニウムの濃度は、１８ｍＭ、
２０ｍＭ、２２ｍＭ、２４ｍＭ及び２６ｍＭであった。
すべての条件で、ＡＭＶ／酵素混合物は、ＡＭＶ／Ｔａ
ｑ混合物（ｂ）よりも有意に高い収量を示す。
Claims (8)
- 【請求項１】 少なくとも１つの好適のプライマー対、
ｐＨを７．０〜９．５の間に緩衝させる物質、ＤＮＡ鎖
の伸長に必要なすべてのヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）及
び酵素混合物の存在下に短い一本鎖又は二本鎖の核酸断
片を特異的に増幅する方法であって、酵素混合物が校正
活性のある好熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び校正活性のな
い好熱性ＤＮＡポリメラーゼよりなり、及び、二本鎖Ｄ
ＮＡ断片を分離させる可能性のある変性ステップの後
に、５秒〜８分間の伸長ステップを少なくとも７０℃で
行うことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 酵素混合物がピロコックス・ウオエシイ
（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｉｉ）由来のＤＮＡ
ポリメラーゼ及びテルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラー
ゼを含みそして反応混合物（１０μｌ）中の全酵素濃度
が０．５〜５．０Ｕであることを特徴とする請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 反応混合物中に１８〜３０ｍＭの硫酸ア
ンモニウム及び／又は３０〜５０ｍＭの塩化カリウムが
８．８〜９．０の初期ｐＨで存在することを特徴とする
請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 伸長温度が７１〜７３℃であることを特
徴とする請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 該酵素がＡＭＶ及び／又はＭｏＭｕＬＶ
−ＲＴであることを特徴とする請求項１〜４いずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項６】 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの１つが逆転
写酵素活性を示すことを特徴とする請求項１〜５いずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項７】 校正活性のある好熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ及び校正活性のない好熱性ＤＮＡポリメラーゼを１：
１０の比率で含んでなる酵素混合物であって、酵素濃度
が反応混合物の容量（１０μｌ）当たり最終濃度が０．
５〜５．０Ｕになるように選ばれるものである酵素混合
物。 - 【請求項８】 ３ｋｂまでの長さを有するＤＮＡ断片の
増幅を目的とする請求項７記載の酵素混合物の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE95105346.1 | 1995-04-08 | ||
| EP95105346A EP0736608A1 (de) | 1995-04-08 | 1995-04-08 | Verfahren zur spezifischen Vervielfältigung und zum Nachweis von DNA bzw. RNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0919299A true JPH0919299A (ja) | 1997-01-21 |
| JP2928992B2 JP2928992B2 (ja) | 1999-08-03 |
Family
ID=8219175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8111918A Expired - Fee Related JP2928992B2 (ja) | 1995-04-08 | 1996-04-08 | Ｄｎａ及び／又はｒｎａを特異的に増幅し検出する方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0736608A1 (ja) |
| JP (1) | JP2928992B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006129727A (ja) * | 2004-11-02 | 2006-05-25 | Asahi Kasei Corp | 酵素反応試薬 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19637339A1 (de) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren |
| AU7100198A (en) | 1997-04-03 | 1998-10-22 | Life Technologies, Inc. | Compositions and methods for reverse transcriptase-polymerase chain reaction (rt-pcr) |
| GB9929487D0 (en) * | 1999-12-15 | 2000-02-09 | Zeneca Ltd | Antisense oligonucleotides |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2065719A1 (en) * | 1991-04-30 | 1992-10-31 | John B. Findlay | Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle |
| US5436149A (en) * | 1993-02-19 | 1995-07-25 | Barnes; Wayne M. | Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension |
| US5556772A (en) * | 1993-12-08 | 1996-09-17 | Stratagene | Polymerase compositions and uses thereof |
-
1995
- 1995-04-08 EP EP95105346A patent/EP0736608A1/de not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-04-08 JP JP8111918A patent/JP2928992B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006129727A (ja) * | 2004-11-02 | 2006-05-25 | Asahi Kasei Corp | 酵素反応試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0736608A1 (de) | 1996-10-09 |
| JP2928992B2 (ja) | 1999-08-03 |
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