JPH09168391A - 排出機能を有するフラジェリンのｎ端側アミノ酸断片の用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は所望のペプチドを菌体外に排出させ
る技術に関する。 【解決手段】 フラジェリンのＮ端をコードするＤＮＡ
分子の直下流に所望の外来ペプチドをコ−ドする遺伝子
を接続し、適当な発現ベクタ−に挿入して、フラジェリ
ンと目的のペプチドからなる融合蛋白質を発現させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は排出機能を有するフ
ラジェリンの一部をコードするＤＮＡ分子を利用する所
望のペプチドを生産する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年の遺伝子工学の発展により、目的の
ペプチドをコードする遺伝子をベクターに組込み、大腸
菌などの細菌に導入して該ペプチドを大量に得ることは
容易な技術となりつつある。しかし一般に発現したペプ
チドは細胞内に蓄積されるため、生成された蛋白質が細
胞の成育増殖を阻害したり、過剰に生成されると負のフ
イードバツクによつて生産性が抑制されることがある。
また、目的の蛋白質を採集するためには、まず細胞を採
集破壊し、該細胞破壊物から目的の蛋白質を精製しなけ
ればならない。この細胞破壊物中には多くの不純物が含
まれ、その一部は人体に有害であり、そこから純粋な目
的の蛋白質を得ることは必ずしも容易なことではない。

【０００３】細胞膜を構成する蛋白質や分泌蛋白質など
は、その一端に細胞内外の膜を通過するために必要なア
ミノ酸配列シグナルペプチドを持つ前駆体ポリペプチド
として合成され、膜通過の際に膜に存在するペプチダー
ゼによりシグナルペプチド部分は切断され、本来の蛋白
質分子となりその活性および機能を発揮する。細胞内に
蓄積された目的のペプチドを精製する困難さを解決し、
目的の蛋白質の生産性を向上させるため、上記の生体の
分泌システムを利用して、目的のペプチドを細胞外に分
泌させようとする試みがなされてきた。例えば、バチル
ス・ズブチリスのα−アミラーゼプロモーターおよびシ
グナル配列を有する分泌ベクターによる、大腸菌β−ラ
クタマーゼの分泌（ザ・ジヤーナル・オブ・バイオケミ
ストリー(J.Biochem.) 95, 87-93 (1984))、同ベクター
システムによるマウス IFN-βの分泌（ジーン(Gene) 3
4, 1-8 (1985))、大腸菌のアルカリフオスフアターゼプ
ロモーターおよびシグナル配列を有する分泌ベクターに
よるヒトIFN-αの分泌生産（ザ・ジヤーナル・オブ・バ
イオケミストリー(J.Biochem.) 97, 1429-1436 (198
5)）、などが挙げられる。

【０００４】また、細胞内で合成された蛋白質が細胞外
に出るメカニズムとしては上記の分泌システムだけでな
く排出（excretion）システムが知られている。例え
ば、細菌の鞭毛を構成するフラジェリンなどがこの排出
システムによつて菌体外に排出される。排出システム
は、分泌と異なり、合成されたペプチドはシグナルペプ
チドを有さず、ペプチターゼによつて切断されることな
く、そのまま菌体外に排出されて機能を発揮する（ザ・
ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriol.)15
9,1056-1059 (1984))。大腸菌のフラジェリンをコード
する遺伝子はhag遺伝子と呼ばれ、既に pBR322やλ−フ
アージにクローニングされており（日本遺伝子学会第57
回大会プログラム・予稿集、p63(1985)、ザ・ジヤーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriol.) 130, 736-
745 (1977))、そのＤＮＡ配列の全部が明らかにされて
いる（ザ・ジヤーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bac
triol.) 168 3 1479-1483 (1986)）。

【０００５】本発明者らは先にhag 遺伝子を利用した排
出ベクターを構築した。即ち、hag遺伝子内の排出に必
要な構造を損なわない場所に適当な外来ＤＮＡ挿入の為
のリンカーを挿入した。この場合、外来ＤＮＡにコード
されるペプチドはフラジェリン蛋白質にサンドイツチに
された雑種蛋白質として菌体外に排出される。排出ベク
ター構築に際しては hag 遺伝子の全部を用いるだけで
なく、フラジェリン蛋白質の排出に不要な部分を欠損さ
せてその一部を用いる事ができ、その不要部分は hag
遺伝子の中央部分であると推定されていた（特開昭 63-
12286）。しかし、排出に際してのフラジェリン蛋白質
の必須部分についてはまだ不明であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来の分泌ベクターは
その種類によつて分泌されるペプチドは制限される。す
なわち、一定のプロモーターおよびシグナル配列に、い
かなる目的のペプチドをコードするＤＮＡを組み込んで
も分泌されるというものでなく、分泌されうるペプチド
は一定のものであり、分泌ベクターに組み込んでも分泌
されないペプチドは数多い。本発明者らは、大腸菌のフ
ラジェリンをコードする hag 遺伝子をクローニング
し、その全構造を明らかにした。さらに、その全構造を
もとにフラジェリンの排出機構が目的とする外来の蛋白
質の菌体外生産に利用可能である事も既に示した（特開
昭 63-12286）。この場合、排出ベクター構築に際して
は、フラジェリン蛋白質の排出に不要な部分を欠損さ
せ、その部分に外来のペプチドをコードするＤＮＡ部分
を挿入するリンカーＤＮＡを挿入し、最終的には外来の
ペプチドはフラジェリン蛋白質にサンドイツチされて雑
種蛋白質として菌体外に排出される。排出に際してのフ
ラジェリン分子の不要な部分については、分子中央部分
である事が示唆されているが、排出に必須な部分につい
ては不明である。

【０００７】フラジェリン蛋白質の排出に必要な部分が
明らかにされれば、その部分のペプチドをコードするＤ
ＮＡを排出させたい外来の蛋白質をコードするＤＮＡに
連結させる事により、目的とする外来の蛋白質をフラジ
ェリンの排出機構を利用して排出させる事が可能であ
る。また分泌ベクターによつて目的の蛋白質が培地中に
分泌されても培地からの精製はなお容易でないが、フラ
ジェリン蛋白質の一部ペプチドとの雑種蛋白質として排
出されれば、容易に作成できる抗フラジェリン抗体を利
用したアフイニイテイクロマトグラフイー技法で、雑種
蛋白質は簡単に培地から採集できる。以上の様に本発明
のフラジェリンの排出に必須な部分をコ−ドするＤＮＡ
は排出ベクターの構築を可能にする非常に有用な遺伝子
断片となる。

【０００８】

【課題解決手段】本発明者らは目的となる外来蛋白を菌
体外に産生させるシステムに関して、フラジェリンの排
出機構に着目し、フラジェリンの排出に必要な部分（ペ
プチド）を明らかにした。該ペプチドをコードするＤＮ
Ａを適当なベクターに挿入し、その直下流に排出させた
い外来蛋白をコードするＤＮＡを連結すれば、該蛋白質
が上記ペプチドとの雑種蛋白質として菌体外に排出され
蓄積する事が予測される。排出された雑種蛋白質は抗フ
ラジェリン抗体を利用したアフイニイテイカラムクロマ
トグラフイーで簡単に採集できる。得られた雑種蛋白質
は適当に切断してフラジェリン由来のペプチドを除去す
れば目的の蛋白質が得られる。また分泌システムによつ
ては菌体外に産生できなかつた外来のペプチドを排出で
きる可能性を有する。

【０００９】以下、プラスミドpFD201上のhag遺伝子を
例にあげて本発明の基本をなすフラジェリンの排出に必
要な部分（ペプチド）を発見した過程を説明する。また
本発明を追試する際にはプラスミドpBR322/hag9（微工
研条寄第１２３２号に含まれている）、宿主には大腸菌
K-12 JA11 （微工研条寄第１２３３号）を使用する事
ができる。本発明の実施例の一部においては宿主の大腸
菌としてC600r-m-hag::Tn10株を用いたが、本発明を追
試する際には、微工研に寄託されている K-12 JA11株を
用いるのが便利である。以下の実施例の一部に示すよう
に、本発明のベクターは K-12 JA11 株に於ても不都合
なく使用し得る。プラスミド pFD201 は特開昭 63-1228
6 の実施例に記載されている pFD202 と同時に得られた
ものであり、上記実施例５−(C)の項目において、実施
例５−(B)の反応物を大腸菌 K-12 株の C600r-m-hag::T
n10 に形質転換した際出現した形質転換体のうち、制限
酵素 Sma1 で切断されるプラスミドを持つ株の中から採
取される。

【００１０】即ち、上記実施例１で得られた pBR322/ha
g9 （微工研条寄第１２３２号に含まれている）をBamHI
で消化し、BamHI断片の一部を削除しT4DNAリガ−ゼで連
結して pBR322/hag93 を得る。これをDNaseIで処理して
切断しBal31で部分消化する。これをDNAポリメラ−ゼＩ
で修復し、HindIIIリンカ−を加えT4DNAリガ−ゼで連結
して、pFD1、pFD2およびpFD3を得た。そのうち、pFD2 を
HindIIIで切断し、Bal31で部分消化する。これにHindII
I-SmaI-BglIIリンカ−を加えT4DNAリガ−ゼで連結し
た。この反応物を C600r-m-hag::Tn10 株に導入して得
られた形質転換体のうち、遊走性を示し、その株が有す
るプラスミドが SmaI で切断される株を選択し、pFD202
を得た。この時、遊走性は示さないがSmaIで切断される
プラスミドを有する株が本発明の pFD201 を有している
ことを見出した。

【００１１】得られた上記 C600r-m-hag::Tn10 (pFD20
1) から常法に従ってプラスミド pFD201 を精製し、制
限酵素 SmaI によつて切断される近辺の塩基配列を決定
した。SmaI 切断点の上、下流それぞれ約２０塩基のシ
ーケンスを決定するだけで pFD201 が運搬する全変異ha
g遺伝子のシーケンスを推定できる（特開昭 63-12286号
明細実施例５−(c)に記載の pFD202 上の SmaI 切断点
近辺のＤＮＡシーケンスと同様に行なえばよい）。塩基
配列の決定は従来のマクサム・ギルバート法やジデオキ
シヌクレオチド鎖終止法に従えばよい。pFD201 が運搬
する変異 hag 遺伝子の全塩基配列は、配列番号：１に
示す通りである。724位にアミノ酸翻訳停止コドンの TA
A が存在し、この変異hag遺伝子はもはやフラジェリン
蛋白質を合成する事ができなくなつており、フラジェリ
ンのアミノ末端側239個のアミノ酸残基とリンカーDNAに
よりカルボキシル末端側に付加された２ケのアミノ酸残
基より成る都合241アミノ酸残基より成るペプチドを合
成する事が推定できる。

【００１２】実際にこの pFD201 を宿主大腸菌JAllに導
入したJAll(pFD201)株の培養液中にはアミノ末端側がNH
2-Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-Ile-
Thr-Gln-Asn-Asn-Ile-Asn-Lys-Asn-Gln-Ser-Ala-Leu-Se
r-である分子量約３万の蛋白質が蓄積している事を発見
した。この発見の経違について説明する。JAll(pFD201)
の培養後の遠心上清を膜濾過により濃縮を行ない、得ら
れた試料を常法の SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法
で分離すると分子量約３万の特異的な蛋白質が多量かつ
明瞭にバンドとして観察される。この蛋白質をゲルから
抽出し、高圧液体クロマトグラフイーで精製後、得られ
た蛋白標品について、アミノ基末端側のアミノ酸残基の
決定を行なつた。その結果、前記のアミノ酸残基の並び
が決定された。以上の様に JAll(pFD201)株のフラジェ
リンはアミノ末端側から241ケのアミノ酸残基より成る
ペプチドとして合成され菌体より排出されている（配列
番号：１参照）。

【００１３】本発明は配列番号：１の塩基配列中第１位
から第７２６位までの塩基配列に限定されるものでな
く、配列番号：１に示される第１位から第２４１位まで
のアミノ酸配列又は同等の排出機能を有するアミノ酸配
列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ分子を有するベ
クターを利用して所望のペプチドを生産する方法も本発
明の範囲内である。特に、２４０−２４１位のＡｌａＳ
ｅｒはリンカ−由来のアミノ酸配列であり、これは排出
に必須ではないと考えられるので、第１位から第２３９
位のアミノ酸配列をコ−ドする遺伝子を利用する方法は
本発明に含まれる。同様の理由により、配列番号：１の
塩基配列のうち第１位から第７１７位までの塩基配列か
らなるＤＮＡ分子を利用する方法も本発明に含まれ、さ
らに終止コドンもＴＡＡに限定されるものではないので
第１位から第７２３位の塩基配列からなるＤＮＡ分子を
利用する方法も本発明に含まれる。また、フラジェリン
のＮ末端のＭｅｔも排出に必須ではないと考えられるの
で、上記塩基配列から該Ｎ末端Ｍｅｔをコ−ドする塩基
配列を除いたものを利用する方法も本発明に含まれる。

【００１４】又pFD201上、変異hag遺伝子を得る工程
（特開昭 63-12286号実施例５−(A)参照）のDNAの切
断、および消化はランダムであり、同様の性質を有する
が塩基数従つてアミノ酸残基数が異なる位置でペプチド
鎖を終末させるコドン（TAAあるいはTGAあるいはTAG）
を挿入する事ができる事は当業者には容易に推定でき
る。従つて本発明は実施例に記載された241ケのアミノ
酸残基より成るペプチドをコ−ドするＤＮＡ分子を利用
する方法に限定されるものではなく、上記の工程によつ
て得られるＤＮＡ分子はもちろんの事、上記の性質を有
するhag遺伝子上の塩基配列からなるＤＮＡ分子を利用
する方法は全て本発明に含まれる。なお、配列番号：１
に記載したアミノ酸配列以外の変異型アミノ酸配列、即
ち大腸菌フラジェリンのうち排出機能を有するアミノ酸
配列に１個または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入お
よび付加の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有す
る変異型アミノ酸配列であってそのアミノ酸配列と同等
の排出機能を有するアミノ酸配列からなるペプチドをコ
ードするＤＮＡ分子は例えば、Nucleic Acids Res. Vo
l.10,6487-6500(1982)、Nucleic Acids Res.Symposium
Series No.16,287-290(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
Vol.82,488-492(1985)等に記載の手法によって調製す
ることができる。本発明を追試し本発明の塩基配列を得
る場合、上記の行程を追試する必要はなく、大腸菌Ｋ１
２ＪＡ１１（ｐＦＤ２０１）（微工研菌寄第９６７１
号）を使用すれば容易に該遺伝子を得ることができる。
なお、大腸菌Ｋ−１２ ＪＡ１１（ｐＦＤ２０１）は、
昭和６２年１０月２２日より微工研菌寄第９６７１号と
して茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番３号の微生物工
業技術研究所に寄託されている。

【００１５】

【実施例】

実施例１．プラスミドpFD201の構築と採取 プラスミドpFD201は、特開昭 63-12286の実施例に記載
のpFD202と同時に得られたものであり、pFD202と全く同
様にして構築採取できる。即ち、プラスミドpFD201は上
記実施例５−(c)において、実施例５−(B)の反応物を大
腸菌K-12株のC600r-m-hag::Tn10株に形質転換した際、
出現した形質転換体のうち、制限酵素SmaIで切断される
プラスミドを持つ株の中から採取された。即ち、上記実
施例１で得られた pBR322/hag9 （微工研条寄第１２３
２号に含まれている）をBamHIで消化し、BamHI断片の一
部を削除しT4DNAリガ−ゼで連結して pBR322/hag93 を
得る。これをDNaseIで処理して切断しBal31で部分消化
する。これをDNAポリメラ−ゼＩで修復し、HindIIIリン
カ−を加えT4DNAリガ−ゼで連結して、pFD1、pFD2および
pFD3を得た。そのうち、pFD2 をHindIIIで切断し、Bal3
1で部分消化する。これにHindIII-SmaI -BglII リンカ
−を加えT4DNAリガ−ゼで連結した。この反応物を C600
r-m-hag::Tn10 株に導入して得られた形質転換体のう
ち、遊走性を示し、その株が有するプラスミドが SmaI
で切断される株を選択し、pFD202を得た。この時、遊走
性は示さないがSmaIで切断されるプラスミドを有する株
が本発明の pFD201 を有していることを見出した。

【００１６】実施例２．JAll(pFD201)の確立 実施例１で得られたC600r-m-hag::Tn10(pFD201)株から
特開昭 63-12286の実施例(1)-(D)-(a)に記載の方法のう
ち、W3623Hfla-am76(pBR322/hag9)株をC600r-m-hag::Tn
10(pFD201)株に置き換える他は同様の操作を行ない、cc
-DNAのpFD201を調製する。次いで、特開昭 63-12286実
施例(1)-(C)に記載した方法のうち、W3623Hfla-am76株
をJA11株に、又、プラスミドDNAをpFD201cc-DNAに置き
換える他は同様の操作を行ない、JA11(pFD201)株を確立
した。

【００１７】実施例３．JA11(pFD201)の培養 JA11(pFD201)株をバクトトリプトン1%（デイフコ社）、
イ−ストエキストラクト0.5%、塩化ナトリウム0.5%、寒
天1.5%、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地(pH7.0
-7.2)に拡げ、37℃で1晩培養する。生じたコロニ−をLB
培地(上記LB寒天培地より寒天1.5%を省く組成）5mlに植
菌し、28℃で1晩振盪培養を行なう。培養液１mlを、上
記LB培地100mlに植菌し28℃で一晩振盪培養を行なう。

【００１８】実施例４．培養液からのフラジェリン断片
の精製 実施例３の培養液100mlをソーバル高速冷却遠心機、ロ
ーターGSAを用いて、4℃で5000回転10分間の遠心を行な
う。得られた上清に再度上記の遠心操作を行なう。その
結果上清95mlを得た。次にこの上清を限外濾過器(UHP-4
3、アドバンテツク・東洋社）を用い濃縮を行なう。上
記濾過器にフイルター(UK-10(43mmφ)、アドバンテツク
・東洋社）をセツトし、濾過器の試料室内に精製水を注
入し、窒素ガス（１kg／cm2圧）の圧力を利用してフィ
ルタ−を精製水で洗う。次いで培養上清を４５ml、試料
室内に注入し１kg／cm2圧の窒素ガスで濾過濃縮する。
試料が２０mlに濃縮されたら、更に培地上清を２５ml加
え、再び上記窒素ガス圧をかけ濃縮する。試料が２０ml
に濃縮された時、培地上清の残り２５mlを加え、再び濃
縮する。試料が２０mlに濃縮された点で、５０mMNaClを
含む１０mMリン酸ソ−ダ（pH７.２）緩衝液を２５ml加
え再び濃縮する。この操作を更に３回繰り返し、最終的
に２０mlの濃縮された試料を得る。

【００１９】実施例５．フラジェリン断片の精製 実施例４で得た試料をいわゆる Laemmli の方法を用い
て、ＳＤＳ-ポリアクリルアミド電気泳動法で精製す
る。濃縮ゲルにアクリルアミド５％、ビスアクリルアミ
ド０.１３％、１２５mMTris-HCl (pH６.８)、０.１％Ｓ
ＤＳを用い、分離ゲルにはアクリルアミド１５％、ビス
アクリルアミド０.４％、３７５mM Tris-HCl(pH8.8)、
０.１％ SDS を用いた。電気泳動用緩衝液としては、２
５mM Tris、０.１９２Ｍグリシン、０.１％ＳＤＳの１.
４Ｌを使用した。電気泳動槽はアト−SJ−1060 SD を用
い、ゲルの厚さは２mmを用いた。濃縮した試料１００μ
ｌに、試料用緩衝液（１２５mM Tris-HCl (pH6.8)、４
％ SDS 、５％２−メルカプトエタノ−ル、２０％グリ
セロ−ル、０.００５％ブロモフエノ−ルブル−５０μl
を加え、４.５mm巾の試料穴に注入する。試料穴はスラ
ブ１枚あたり９個作成する（９レ−ン）。８個を試料用
に、残り１個を分子量マ−カ−（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ス
タンダ−ド（Low）、バイオ・ラッド社）用に用いる。
分子量マ−カ−はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
(１mM)を含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH８.０）で５
０倍に希釈し、等容量の前記試料用緩衝液を加え、４０
μl試料孔に注入した。定電流６０mAで３時間電気泳動
を行なう。電気泳動後、試料の１レ−ン、分子量マ−カ
−のレ−ンの都合２レーンを切り取り、０.２５％クマ
シーブリリアントブルーR-250、５０％メタノール、１
０％酢酸に２時間浸し、染色する。４６％メタノール、
９％酢酸に浸し、分子量マーカーを電気泳動したものと
試料を電気泳動したものを較べて、分子量３万付近の試
料レーンに主バンドを認めた。未染色の７個の試料レー
ンから、主バンドを占めていると推測される位置から、
ゲルを切り出した。２枚のスラブについてこの電気泳動
を行ない、ゲル断片を都合２個得た。

【００２０】アトー社のマツクスイールドGp蛋白回収器
AE-3590型の試料カツプに透析膜（スペクトラム・メデ
イカル・インダストリーズ社、スペクトラ／ポアー６、
132580）をセツトし、上記のゲル断片２個を細かくきざ
み、試料カツプのゲル用ウエルに入れる。器具に SDS−
ポリアクリルアミド電気泳動用緩衝液（実施例本項のも
のより SDS を除いたもの）を満たし、アトー社添付の
器具説明書に従い、１０℃で定電圧３５０ボルトで２時
間電気抽出を行ない、試料カツプの回収用ウエルの溶液
を約２ml回収する。この回収液をセントリコン−１０
（アミコン社）を用いて遠心濃縮し、３２０μlの試料
溶液を得た。次に上記試料を高速液体カラムクロマトグ
ラフイー（HPLC）を用いて精製した。カラムにアキユア
ポアーRP-30、１０μm（ブラウン・リー・ラボラトリー
社）を用い、流速は１分間に１mlで行なつた。上記試料
溶液３２０μlのうち、１５０μlをカラムにチャ−ジし
て、０.１％トリフルオロ酢酸（TFA）で１０分間洗い流
した後、次の１０分間でフラクシヨンチユーブあたり
０．５分で分画しながら、０．１％ TFA の１００％→
０％、アセトニトリル（CH3CN）０％→１００％の同時
濃度勾配で溶出する。１２．６分の位置で２２０mμに
吸収を示す中心ピークが検出された。フラクシヨンチユ
ーブ２５、２６、２７、２８本目を集め、２mlの精製画
分を得た。

【００２１】次に上記の精製画分の５０μlを Laemmli
の方法（実施例本項目参照）で、SDS−ポリアクリルア
ミド電気泳動法で分析した。同時に１μgの野生型大腸
菌 K■12 株から精製したフラジェリン（特開昭 63-122
86の実施例(2)−(B)−(a)に明記されている）を電気泳
動し、両者の染色後のバンドの濃さをデンシトメーター
（ツアイネツク・ソフトレーザー・スキヤンニング・デ
ンシトメーター、バイオメツド・インストルメント社）
で比較したところ、目的の分子量約３万の蛋白が単一バ
ンドとして検出され、精製された量は、約６０μgであ
つた。

【００２２】実施例６．アミノ基末端側のアミノ酸シー
ケンスの分析 実施例５の試料の約１５μgを気相プロテインシーケン
サー４７０Ａ（アプライド・バイオシステム社）を用い
て、アミノ基末端側のアミノ酸シーケンス分析を行なつ
た。結果は 1 5 10 15 NH2-Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-Ile-Thr-Gln-Asn-Asn- 20 Ile-Asn-lys-Asn-Gln-Ser-Ala-Leu-x-と決定した。 このアミノ末端側アミノ酸シーケンスはhag遺伝子の DN
A 配列（配列番号：１参照）から推定できるアミノ末端
側第２位から第２５位までのアミノ酸シーケンスと一致
する。

【００２３】

【発明の効果】本発明の遺伝子の直下流に目的とする外
来のペプチドをコ−ドする遺伝子を接続し、適当な発現
ベクタ−に挿入して、フラジェリンと目的のペプチドか
らなる融合蛋白質を発現させれば、フラジェリンの排出
機能によって該融合蛋白質が排出される可能性がある。
該融合蛋白質が排出されれば抗フラジェリン抗体を用い
ることにより容易に精製することができる。

【００２４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：1476 配列の型：核酸 配列 ATGGCACAAGTCATTAATACCAACAGCCTCTCGCTGATCACTCAAAATAATATCAACAAG 60 MetAlaGlnValIleAsnThrAsnSerLeuSerLeuIleThrGlnAsnAsnIleAsnLys 1 5 10 15 20 AACCAGTCTGCGCTGTCGAGTTCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGCTTGCGTATTAACAGC 120 AsnGlnSerAlaLeuSerSerSerIleGluArgLeuSerSerGlyLeuArgIleAsnSer 25 30 35 40 GCGAAGGATGACGCAGCGGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTCACCTCTAACATTAAAGGC 180 AlaLysAspAspAlaAlaGlyGlnAlaIleAlaAsnArgPheThrSerAsnIleLysGly 45 50 55 60 CTGACTCAGGCGGCCCGTAACGCCAACGACGGTATCTCCGTTGCGCAGACCACCGAAGGC 240 LeuThrGlnAlaAlaArgAsnAlaAsnAspGlyIleSerValAlaGlnThrThrGluGly 65 70 75 80 GCGCTGTCCGAAATCAACAACAACTTACAGCGTGTGCGTGAACTGACGGTACAGGCCACT 300 AlaLeuSerGluIleAsnAsnAsnLeuGlnArgValArgGluLeuThrValGlnAlaThr 85 90 95 100 ACCGGTACTAACTCTGAGTCTGATCTGTCTTCTATCCAGGACGAAATTAAATCCCGTCTG 360 ThrGlyThrAsnSerGluSerAspLeuSerSerIleGlnAspGluIleLysSerArgLeu 105 110 115 120 GATGAAATTGACCGCGTATCTGGTCAGACCCAGTTCAACGGCGTGAACGTGCTGGCAAAA 420 AspGluIleAspArgValSerGlyGlnThrGlnPheAsnGlyValAsnValLeuAlaLys 125 130 135 140 AATGGCTCCATGAAAATCCAGGTTGGCGCAAATGATAACCAGACTATCACTATCGATCTG 480 AsnGlySerMetLysIleGlnValGlyAlaAsnAspAsnGlnThrIleThrIleAspLeu 145 150 155 160 AAGCAGATTGATGCTAAAACTCTTGGCCTTGATGGTTTTAGCGTTAAAAATAACGATACA 540 LysGlnIleAspAlaLysThrLeuGlyLeuAspGlyPheSerValLysAsnAsnAspThr 165 170 175 180 GTTACCACTAGTGCTCCAGTAACTGCTTTTGGTGCTACCACCACAAACAATATTAAACTT 600 ValThrThrSerAlaProValThrAlaPheGlyAlaThrThrThrAsnAsnIleLysLeu 185 190 195 200 ACTGGAATTACCCTTTCTACGGAAGCAGCCACTGATACTGGCGGAACTAACCCAGCTTCA 660 ThrGlyIleThrLeuSerThrGluAlaAlaThrAspThrGlyGlyThrAsnProAlaSer 205 210 215 220 ATTGAGGGTGTTTATACTGATAATGGTAATGATTACTATGCGAAAATCACCGGTGGTGCA 720 IleGluGlyValTyrThrAspAsnGlyAsnAspTyrTyrAlaLysIleThrGlyGlyAla 225 230 235 240 AGCTAAGCTTCCCGGGAGATCTTGGTGACAATGGCGACTGGAGCAACGGCAAATGCAACT 780 Ser*** GTAACTGATGCAAATACTACTAAAGCTACAACTATCACTTCAGGCGGTACACCTGTTCAG 840 ATTGATAATACTGCAGGTTCCGCAACTGCCAACCTTGGTGCTGTTAGCTTAGTAAAACTG 900 CAGGATTCCAAGGGTAATGATACCGATACATATGCGCTTAAAGATACAAATGGCAATCTT 960 TACGCTGCGGATGTGAATGAAACTACTGGTGCTGTTTCTGTTAAAACTATTACCTATACT 1020 GACTCTTCCGGTGCCGCCAGTTCTCCAACCGCGGTCAAACTGGGCGGAGATGATGGCAAA 1080 ACAGAAGTGGTCGATATTGATGGTAAAACATACGATTCTGCCGATTTAAATGGCGGTAAT 1140 CTGCAAACAGGTTTGACTGCTGGTGGTGAGGCTCTGACTGCTGTTGCAAATGGTAAAACC 1200 ACGGATCCGCTGAAAGCGCTGGACGATGCTATCGCATCTGTAGACAAATTCCGTTCTTCC 1260 CTCGGTGCGGTGCAAAACCGTCTGGATTCCGCGGTTACCAACCTGAACAACACCACTACC 1320 AACCTGTCTGAAGCGCAGTCCCGTATTCAGGACGCCGACTATGCGACCGAAGTGTCCAAT 1380 ATGTCGAAAGCGCAGATCATCCAGCAGGCCGGTAACTCCGTGTTGGCAAAAGCTAACCAG 1440 GTACCGCAGCAGGTTCTGTCTCTGCTGCAGGGTTAA

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大腸菌フラジェリンのうち排出機能を有
   する以下のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列に１
   個または数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および付加
   の中から選ばれる少なくとも１つの変異を有する変異型
   アミノ酸配列であってそのアミノ酸配列と同等の排出機
   能を有するアミノ酸配列からなるペプチドをコードする
   ＤＮＡ分子であって、その３’末端側に所望のペプチド
   をコードするＤＮＡ分子が付加されている該ＤＮＡ分子
   を有するベクターを利用して所望のペプチドを生産する
   方法： ＭｅｔＡｌａＧｌｎＶａｌＩｌｅＡｓｎＴｈｒＡｓｎＳｅｒＬｅｕ １ ５ １０ ＳｅｒＬｅｕＩｌｅＴｈｒＧｌｎＡｓｎＡｓｎＩｌｅＡｓｎＬｙｓ １５ ２０ ＡｓｎＧｌｎＳｅｒＡｌａＬｅｕＳｅｒＳｅｒＳｅｒＩｌｅＧｌｕ ２５ ３０ ＡｒｇＬｅｕＳｅｒＳｅｒＧｌｙＬｅｕＡｒｇＩｌｅＡｓｎＳｅｒ ３５ ４０ ＡｌａＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｌａＡｌａＧｌｙＧｌｎＡｌａＩｌｅ ４５ ５０ ＡｌａＡｓｎＡｒｇＰｈｅＴｈｒＳｅｒＡｓｎＩｌｅＬｙｓＧｌｙ ５５ ６０ ＬｅｕＴｈｒＧｌｎＡｌａＡｌａＡｒｇＡｓｎＡｌａＡｓｎＡｓｐ ６５ ７０ ＧｌｙＩｌｅＳｅｒＶａｌＡｌａＧｌｎＴｈｒＴｈｒＧｌｕＧｌｙ ７５ ８０ ＡｌａＬｅｕＳｅｒＧｌｕＩｌｅＡｓｎＡｓｎＡｓｎＬｅｕＧｌｎ ８５ ９０ ＡｒｇＶａｌＡｒｇＧｌｕＬｅｕＴｈｒＶａｌＧｌｎＡｌａＴｈｒ ９５ １００ ＴｈｒＧｌｙＴｈｒＡｓｎＳｅｒＧｌｕＳｅｒＡｓｐＬｅｕＳｅｒ １０５ １１０ ＳｅｒＩｌｅＧｌｎＡｓｐＧｌｕＩｌｅＬｙｓＳｅｒＡｒｇＬｅｕ １１５ １２０ ＡｓｐＧｌｕＩｌｅＡｓｐＡｒｇＶａｌＳｅｒＧｌｙＧｌｎＴｈｒ １２５ １３０ ＧｌｎＰｈｅＡｓｎＧｌｙＶａｌＡｓｎＶａｌＬｅｕＡｌａＬｙｓ １３５ １４０ ＡｓｎＧｌｙＳｅｒＭｅｔＬｙｓＩｌｅＧｌｎＶａｌＧｌｙＡｌａ １４５ １５０ ＡｓｎＡｓｐＡｓｎＧｌｎＴｈｒＩｌｅＴｈｒＩｌｅＡｓｐＬｅｕ １５５ １６０ ＬｙｓＧｌｎＩｌｅＡｓｐＡｌａＬｙｓＴｈｒＬｅｕＧｌｙＬｅｕ １６５ １７０ ＡｓｐＧｌｙＰｈｅＳｅｒＶａｌＬｙｓＡｓｎＡｓｎＡｓｐＴｈｒ １７５ １８０ ＶａｌＴｈｒＴｈｒＳｅｒＡｌａＰｒｏＶａｌＴｈｒＡｌａＰｈｅ １８５ １９０ ＧｌｙＡｌａＴｈｒＴｈｒＴｈｒＡｓｎＡｓｎＩｌｅＬｙｓＬｅｕ １９５ ２００ ＴｈｒＧｌｙＩｌｅＴｈｒＬｅｕＳｅｒＴｈｒＧｌｕＡｌａＡｌａ ２０５ ２１０ ＴｈｒＡｓｐＴｈｒＧｌｙＧｌｙＴｈｒＡｓｎＰｒｏＡｌａＳｅｒ ２１５ ２２０ ＩｌｅＧｌｕＧｌｙＶａｌＴｙｒＴｈｒＡｓｐＡｓｎＧｌｙＡｓｎ ２２５ ２３０ ＡｓｐＴｙｒＴｙｒＡｌａＬｙｓＩｌｅＴｈｒＧｌｙＧｌｙＡｌａ ２３５ ２４０ Ｓｅｒ。
2. 【請求項２】 該ペプチドが、上記アミノ酸配列におい
   てその第１位のＮｅｔ、および／または第２４０位のＡ
   ｌａおよび第２４１位のＳｅｒが欠失しているペプチド
   である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 以下の塩基配列からなるＤＮＡ分子を有
   するベクターを利用する請求項１記載の方法： ＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＣＡＡＣＡＧＣＣＴＣ ３０ ＴＣＧＣＴＧＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＡＧ ６０ ＡＡＣＣＡＧＴＣＴＧＣＧＣＴＧＴＣＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＧＡＧ ９０ ＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＧＣＧＴＡＴＴＡＡＣＡＧＣ １２０ ＧＣＧＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＡＧＧＣＧＡＴＴ １５０ ＧＣＴＡＡＣＣＧＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＡＡＣＡＴＴＡＡＡＧＧＣ １８０ ＣＴＧＡＣＴＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＣＧＡＣ ２１０ ＧＧＴＡＴＣＴＣＣＧＴＴＧＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣ ２４０ ＧＣＧＣＴＧＴＣＣＧＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＴＡＣＡＧ ２７０ ＣＧＴＧＴＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＣＣＡＣＴ ３００ ＡＣＣＧＧＴＡＣＴＡＡＣＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴ ３３０ ＴＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＣＧＡＡＡＴＴＡＡＡＴＣＣＣＧＴＣＴＧ ３６０ ＧＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＣＧＣＧＴＡＴＣＴＧＧＴＣＡＧＡＣＣ ３９０ ＣＡＧＴＴＣＡＡＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡ ４２０ ＡＡＴＧＧＣＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＡ ４５０ ＡＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＧＡＣＴＡＴＣＡＣＴＡＴＣＧＡＴＣＴＧ ４８０ ＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＡＴＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＴＴＧＧＣＣＴＴ ５１０ ＧＡＴＧＧＴＴＴＴＡＧＣＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＧＡＴＡＣＡ ５４０ ＧＴＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＴＣＣＡＧＴＡＡＣＴＧＣＴＴＴＴ ５７０ ＧＧＴＧＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＣＴＴ ６００ ＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＡＡＧＣＡＧＣＣ ６３０ ＡＣＴＧＡＴＡＣＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡ ６６０ ＡＴＴＧＡＧＧＧＴＧＴＴＴＡＴＡＣＴＧＡＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴ ６９０ ＧＡＴＴＡＣＴＡＴＧＣＧＡＡＡＡＴＣＡＣＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡ ７２０ ＡＧＣＴＡＡ。
4. 【請求項４】 第１位のＡから第３位のＴ、および／ま
   たは第７１８位のＧから７２６位のＡまたは第７２４位
   のＴから第７２６位のＡが欠失している請求項３記載の
   方法。