JPH09107993A - ２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素の活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は、操作が簡便な血中２’−５’オリゴ
アデニル酸合成酵素（２−５ＡＳ）活性の測定技術を提
供することである。 【構成】本発明は、水溶性のdsＲＮＡの存在下でＡＴＰ
を２−５ＡＳと反応させる２−５ＡＳの活性測定方法で
ある。また本発明は、水溶性dsＲＮＡを活性化剤ととし
て利用する２−５ＡＳ活性の測定試薬を提供する。dsＲ
ＮＡにはpoly(I)poly(C)等が利用できる。 【効果】本発明は、２−５ＡＳ活性測定において遠心分
離など付加的な操作を不要とし、簡便な操作と高い再現
性を実現する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は２’−５’オリゴアデニ
ル酸合成酵素（ＥＣ２．７．７．−、以下「２−５Ａ
Ｓ」と省略する）の活性を測定する新規な方法に関する
ものである。２−５ＡＳは、リンパ球等においてインタ
ーフェロンに誘導される酵素である。この２−５ＡＳ
は、２本鎖ＲＮＡ（以下dsＲＮＡと省略する）の存在下
でアデノシン３リン酸（以下ＡＴＰと省略する）を基質
としてアデニル酸を（２’−５’）ホスホジエステル結
合で重合し、２’−５’オリゴアデニル酸（以下２−５
Ａと省略する）を産生する活性を持っている。

【０００２】２−５ＡＳに合成された２−５Ａの役割
は、ウィルスのｍＲＮＡのキャップ形成の阻止、細胞制
御、細胞の分化などに関係があり、２−５Ａが細胞内に
誘導された場合には、タンパク質合成やウィルスの複製
が阻止される。以上の生体防御の機序を利用し、２−５
ＡＳ活性値を各種微生物（ウィルス、細菌、マイコプラ
ズマ等）の感染やインターフェロン治療効果の指標とで
きることが確認された。現在では既に放射免疫測定法
（以下ＲＩＡと省略する）を利用した２−５ＡＳ活性の
測定用キットも市販されている。

【０００３】

【従来技術の問題点】現在商品化されている血中２−５
ＡＳの活性測定方法は、次のような原理に基づいてい
る。まず血中の２−５ＡＳをpoly(I)poly(C)−アガロー
スで吸着し、更に洗浄することによって血清成分から分
離するのと並行して酵素の活性化を行う。次いでＡＴＰ
を基質として加え、２−５Ａを産生させる。最終的に酵
素反応によって生成する２−５Ａの量を¹²⁵Ｉ標識２−
５Ａを使ったＲＩＡ法によって測定し、酵素活性を決定
するというものである。このような測定法の提供によっ
て、リンパ球の培養や取り扱いにくいトリチウム標識Ａ
ＴＰを組み合わせたそれ以前の測定技術に比べて簡便な
測定が可能となった。

【０００４】しかし簡便になったとはいえ、それでもな
おpoly(I)poly(C)−アガロースの遠心洗浄等の付加的な
操作が求められるので全体としては複雑な操作となって
いる。また操作ステップが多いために、測定精度を高く
維持するには注意深い作業が要求される。加えてpoly
(I)poly(C)−アガロースといった固体状の試薬を利用し
ているため、試薬キットの製造時には分注作業を行いに
くい等の問題点が生じる。したがって試薬の商業的な供
給の面でも問題を残していたということができる。この
ような問題点の原因となっているpoly(I)poly(C)−アガ
ロースによる２−５ＡＳの吸着操作は、血中には微量に
しか存在しない２−５ＡＳ活性を必要な感度で測定する
ために欠かせない操作と考えられていた。

【０００５】以上のような血中２−５ＡＳの活性測定方
法に対して、リンパ球やリンパ系の培養細胞株試料につ
いて２−５ＡＳ活性を測定した報告も多い。細胞を溶解
し２−５ＡＳをpoly(I)poly(C)−アガロース等に吸着さ
せ、³²Ｐ標識ＡＴＰを基質として与えて生成する２−５
Ａをクロマトグラフィーによって分離し、その放射活性
から２−５ＡＳ活性を決定する方法等[1]が知られてい
る。あるいはpoly(I)poly(C)と³²Ｐ標識ＡＴＰの添加に
よって生成する２−５Ａを電気泳動によって分離し、そ
の放射活性を測定する方法も知られている[2]。更に、
ＡＴＰを発光標識することにより、放射性物質を使わな
いで２−５ＡＳ活性を測定する試みもある[3]。 [1] Cancer Res.43,2683-2687,1983 [2] J.Biol.Chem.,262-8,3852-3857,1987 [3] 特開昭６２−９２９９

【０００６】これらの方法に共通しているのは、全て培
養細胞やその培養上清を試料としている点である。２−
５ＡＳはもともと細胞で産生されているので、一般に培
養細胞の細胞質には高い２−５ＡＳ活性が存在する。し
たがって血中の酵素活性を測定するのに比べれば、感度
の点で測定の容易な試料と言うことができる。またクロ
マトグラフィーや電気泳動による分離操作が要求される
測定技術は、迅速性と簡便性が求められる日常的な検査
施設には不向きである。他方、発光物質を利用した方法
においては、繁雑な分離操作からは開放される。しかし
発光物質による２−５ＡＳの活性測定方法では、標識基
質の重合に基づく発光信号の変調という原理に基づいて
いるためにシグナルの測定時に他の成分の影響を受けや
すく高い感度の達成は困難と考えられる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、培養細胞な
どに比べて低い活性しか期待できない血中２−５ＡＳ活
性測定の操作性を改善する新しい測定技術を提供するこ
とである。本発明者らは、従来の２−５ＡＳの活性測定
方法において吸着剤や酵素の活性化剤として一般的に使
われているpoly(I)poly(C)−アガロースが遠心や洗浄の
ような簡便性を損なう操作の原因となっていることに着
目した。このpoly(I)poly(C)−アガロースを使わず、か
つ精度や感度を損なうことのない新たな血中２−５ＡＳ
の活性測定方法を提供することが、本発明の課題であ
る。

【０００８】

【問題を解決するための手段】本発明の課題は、次の工
程ａ）−ｃ）で構成される血中２−５ＡＳの活性測定方
法において、酵素の活性化剤として水溶性のdsＲＮＡを
用いる血中２−５ＡＳの活性測定方法によって解決され
る。 ａ）２−５ＡＳ活性を含む試料を活性化剤とＡＴＰまた
はその誘導体と混合する工程 ｂ）２−５ＡＳにより２−５Ａまたはその誘導体を生成
させる工程 ｃ）工程ｂ）において生成する２−５Ａ、その誘導体、
またはピロリン酸、あるいは消費されるＡＴＰまたはそ
の誘導体を測定することにより２−５ＡＳの活性を決定
する工程 本発明の２−５ＡＳの活性測定方法を構成する反応ステ
ップについて具体的に説明する。

【０００９】工程ａ）２−５ＡＳ活性を含む試料を活性
化剤とＡＴＰまたはその誘導体と混合する工程 血中２−５ＡＳを水溶性のdsＲＮＡおよび基質と混合す
るステップである。水溶性のdsＲＮＡとは、ＲＮＡが塩
基対結合によって二重らせん構造をとっているものと定
義できる。もちろん本発明のdsＲＮＡは水溶性でなけれ
ばならないのでアガロースやセファロース等の固相と結
合したものであってはならない。本発明のdsＲＮＡを構
成する塩基の種類は限定されない。したがってＡ（アデ
ニン）−Ｕ（ウラシル）、Ｃ（シトシン）−Ｇ（グアニ
ン）あるいはＩ（イノシン酸）という塩基種から任意の
組み合わせを選ぶことができる。化学的に合成するには
同じ塩基種で構成されたポリマー状の１本鎖ＲＮＡを塩
基対結合によって２本鎖とするのが容易である。このよ
うなdsＲＮＡとして、Ｉを重合したポリＩとＣを重合し
たポリＣとからなるdsＲＮＡ、すなわちpoly(I)poly(C)
は市販品として入手できる一般的なものである。この他
にＡとＵが交互に配列したＲＮＡどうしを２本鎖とした
poly(rA-rU)(rA-rU)が市販されているが、一般には高価
なものとされている。本発明に用いる水溶性のdsＲＮＡ
は、構成塩基数で６０bp以上のものが２−５ＡＳの活性
化能に優れているため好ましい。特に好ましい塩基数
は、１００−１０００bp、中でも２００−５００bpであ
る。

【００１０】本発明のdsＲＮＡは、２−５ＡＳを含む試
料を血清として１μlに対し、およそ０．１〜１μg添加
すると十分な活性化を期待できる。この使用量は血清と
して１μlに対するものであるから、血清の他に全血を
試料とする時には血清換算で１μlとして必要なdsＲＮ
Ａ量を算出する。もちろん全血に占める血清分画の割合
は血液試料によって大きく変動するので、この変動幅を
考慮してdsＲＮＡが不足しないように設定するべきであ
る。２−５ＡＳの活性中心にはdsＲＮＡと結合する部分
があり、この部分が２−５ＡＳに結合することによっ
て、活性化酵素になると推測されている。酵素反応の速
度論的にも活性化剤と酵素の量的関係が、非常に重要な
部分である。そのため高い活性値を示す検体には十分量
のdsＲＮＡが必要となる。このようにdsＲＮＡは２−５
ＡＳの量に応じて必要となるため、２−５ＡＳ活性が非
常に大きくなると予想される場合にdsＲＮＡが不十分で
あれば、実際の値よりも小さい値となる可能性がある。
したがってdsＲＮＡは、あらかじめ予想される２−５Ａ
Ｓ活性に対して過剰量で用いるのが好ましい。dsＲＮＡ
を過剰量で添加するには、できるだけ溶解性に優れるも
のを選択するのが有利である。たとえばＳＩＧＭＡ社が
販売しているpoly(I)poly(C)は溶解性に優れており、本
発明において好ましいdsＲＮＡとして挙げられる。

【００１１】一方本発明の工程ａ）における基質とは、
ＡＴＰやその誘導体である。本発明の基質は、dsＲＮＡ
の存在下２−５ＡＳの作用によって２−５Ａ、またはそ
の誘導体を合成することができるものを指す。ＡＴＰの
誘導体とは、ＡＴＰを放射性同位元素（以下ＲＩと省略
する）のような標識成分で標識したもの等が含まれる。
標識成分にはＲＩ以外に蛍光物質、発光物質、あるいは
酵素のような成分が知られている。

【００１２】基質は、ＡＴＰにしろ、あるいはその誘導
体にしろ、一般的な血液材料を試料とするのであれば血
清１μlに対して０．１−１０．０μg、好ましくは０．
２−１．０μgという範囲で用いるのが有利である。こ
れら基質の必要量は、予想される２−５ＡＳ活性によっ
て消費されてしまわないように過剰となるように設定す
る。本発明においては先に述べたように酵素の活性が反
応生成物の生成量に反映されなければならない。基質で
あるＡＴＰやその誘導体が少量となれば、特に２−５Ａ
Ｓ活性が大きな場合には基質が消費されてしまって測定
が成立しなくなってしまう。他方、不必要に高濃度の基
質は特に反応生成物を免疫学的な手法によって測定する
場合に問題となることが有るので注意しなければならな
い。すなわち、反応生成物である２−５Ａを免疫学的な
手法によって測定する時に必要な２−５Ａを認識する抗
体には、ＡＴＰと交差反応を示すものがある。このよう
な抗体を高濃度のＡＴＰの存在下で用いれば、ＡＴＰが
交差反応によって目的である２−５Ａとの反応に影響を
与えてしまう可能性がある。更に一般的には酵素反応に
おける不必要に高濃度な基質の存在が、酵素反応に対し
てマイナスの影響を与えることが公知である。

【００１３】更に工程ａ）における血中２−５ＡＳと
は、全血、血清、血漿、そしてこれら血液分画を更に分
画したもの等に含まれる２−５ＡＳを意味する。これま
での報告では血清や血漿を試料として利用することが多
かった。しかし必ずしもこれらの試料に限定する必要は
ない。たとえば全血を試料として用いることも可能であ
る。全血を試料とする時には、抗凝固対策を行うととも
にリンパ球を破壊して試料とすると良い。リンパ球は溶
血処理によって破壊することができる。溶血処理によっ
て２−５ＡＳを多く含むリンパ球を含む血球成分が破壊
され、感度的にはより有利な条件で測定を行えることに
なる。また血清のような血球成分と分離した試料では、
分離作業中のリンパ球の破壊が２−５ＡＳ活性の上昇の
原因になる。また血球成分から血清を分取する時にも、
赤血球と血清の境界に沈殿するリンパ球分画周辺では上
清中に比べて２−５ＡＳ活性が比較的高いという試料の
均一性の問題も有り、試料の取り扱いには注意が必要で
ある。これに対して全血を試料とする時には、試料中の
リンパ球を破壊して測定する限りこのような注意をする
必要は無くなる。

【００１４】リンパ球の破壊方法としては、全血：イー
グルＭＥＭ培地＝１：９（１０倍希釈）となるように混
合し、これをくり返し凍結−溶解する方法を示すことが
できる。この方法によればリンパ球を簡単に、そして完
全に破壊することができるので高い感度と精度を期待で
きる。また凍結状態で試料を輸送すれば、２−５ＡＳの
保存の面でも有利と言える。なおこの操作によって赤血
球も破壊されるが、最終的な酵素反応生成物の測定に着
色やヘモグロビンによる酵素的な触媒活性による影響の
無い限り問題となることはない。

【００１５】血清にしろ全血にしろ、これら血液試料に
含まれる２−５ＡＳ活性は、細胞溶解成分等に比べて一
般に極めて小さなものである。たとえばＦＬ細胞（ヒト
羊膜細胞株）は、培養液中に各種インターフェロンを添
加して一定時間培養を行うと細胞中に２−５ＡＳを誘導
することができる。ただしＦＬ細胞の場合は、このとき
培養上清中には酵素活性は見いだせない。培養後の細胞
を破壊して得た細胞抽出液の２−５ＡＳ活性を市販の２
−５ＡＳ活性測定キットで測定した場合、酵素反応の生
成物である２−５Ａ濃度で１００００pmol/dl以上のき
わめて高い酵素活性を有する。また誘導条件が至適だと
３００００pmol/dlまで上昇するケースも観察される。
他方、血中の２−５ＡＳ活性は、正常者で５０−１００
pmol/dl、高値検体でも１０００pmol/dl前後である。な
お市販のキットの標準は８１０pmol/dlが上限となって
いる。このように血中の２−５ＡＳ活性は培養細胞に比
べて微量にしか存在せず、高い感度を要求されることが
多い。

【００１６】なお工程ａ）において、試料、活性化剤で
あるdsＲＮＡ、そして基質であるＡＴＰ（またはその誘
導体）の三者は、どのような順序で混合しても良い。た
だ２−５ＡＳを活性化してから測定を行うという原理を
考慮すれば、試料にdsＲＮＡとＡＴＰを順次添加するの
が好ましい順序と言える。しかし２−５ＡＳのdsＲＮＡ
による活性化は速やかに進行するので、反応成分の添加
順序は基本的には結果に大きな影響は与えない。

【００１７】工程ｂ）２−５ＡＳにより２−５Ａまたは
その誘導体を生成させる工程 この工程では、工程ａ）で混合した反応液中で２−５Ａ
Ｓによる酵素反応を行わせて２−５Ａ（またはその誘導
体）を生成させる。つまりＡＴＰからは２−５Ａが、Ａ
ＴＰの誘導体により２−５Ａ誘導体が生成する。工程
ｂ）は２−５ＡＳの酵素反応に好適な環境のもとで行
う。酵素反応に影響する条件として、次のような因子が
知られている。２−５ＡＳの酵素反応に関する一般的な
諸条件については、先行技術文献[4][5]を参考にすると
良い。 [4]J.Biol Chem.,254,p12034-12037,1979 [5]「蛋白質・核酸・酵素」の別冊「生命科学を推進す
る分子ウィルス学」1992

【００１８】・ｐＨ：ヒトの２−５ＡＳは、ｐＨ７．０
−８．０、好ましくはｐＨ７．５−７．８で最大の活性
を示すとされているので、酵素反応にはこの範囲のｐＨ
を与える緩衝液が用いられる。具体的には、１０−２０
mMのＨＥＰＥＳ緩衝液等を示すことができる。ただし２
−５ＡＳのサブタイプによっては、異なる至適ｐＨを持
つものも有るので、このようなサブタイプを測定の対象
とする時には適当なｐＨを選択する方が好ましい場合も
有る。たとえば分子量６５kDを持つ２−５ＡＳのサブタ
イプでは至適ｐＨが６．５であることが知られており、
１００kDのサブタイプとは異なっている。

【００１９】・補欠因子：２−５ＡＳは酵素活性の発現
に当たってＭｇ²⁺のような２価の金属イオンを要求す
る。したがって工程ｄ）を行うためには、２−５ＡＳの
活性を十分に維持するためにこれら２価の金属イオンを
供給しておく必要がある。Ｍｇ²⁺は酢酸マグネシウムの
ような塩として添加すると良い。またその使用濃度は、
０．５−５０mM、好ましくは３−１０mM程度を例示する
ことができる。

【００２０】・温度等の諸条件：工程ｂ）を構成する２
−５ＡＳによる酵素反応は、２０−５０℃の温和な温度
条件の基で行うこのが好ましい。特に好ましい温度は３
０−４０℃である。また２−５ＡＳはＳＨ酵素であるた
め、βメルカプトエタノールやジチオスレイトールのよ
うなＳＨ保護剤の共存下で反応を行うと良い。これらの
保護剤によって、酵素活性を高度に維持することができ
る。また酵素活性を高度に維持するために２０%程度の
グリセロールの添加が有効であることが知られているま
た２−５ＡＳの酵素活性を十分に発現させるために適当
な塩濃度を与えるのが好ましい。たとえば塩としてＫや
Ｎａを用いる場合、３０−６０mMの塩濃度が好適であ
る。

【００２１】工程ｃ）工程ｂ）において生成する２−５
Ａ、その誘導体、またはピロリン酸、あるいは消費され
るＡＴＰ、またはその誘導体を測定することにより２−
５ＡＳの活性を決定する工程 工程ｂ）で２−５ＡＳの酵素反応に必要な条件を与えれ
ば、２−５ＡＳに触媒される反応は酵素活性に律速さ
れ、その反応生成物の量は酵素活性に左右される。この
ような好適な条件を与えれば反応生成物（または消費さ
れる物質）の量を指標として酵素活性を決定することが
できる。試料の体積を一定とした場合、これらの反応生
成物の量や濃度はそのまま酵素活性の指標とする事がで
きる。また予め２−５ＡＳ酵素の蛋白量と酵素反応生成
物の生成速度について検定した標準を用いれば、この標
準を基に酵素活性単位として捉えることも可能である。
酵素活性の指標となる反応生成物としては、２−５Ａ、
２−５Ａ誘導体、そしてピロリン酸を挙げることができ
る。ここで言う２−５Ａ誘導体とは、先に述べたとおり
ＡＴＰ誘導体を基質として生成される物質である。一方
酵素反応によって消費される物質とは、基質であるＡＴ
Ｐやその誘導体を挙げられる。各生成物の測定方法を以
下に具体的に述べる。

【００２２】２−５Ａの測定法：２−５Ａは、酵素、発
光物質、蛍光物質、ＲＩといった公知の標識技術を利用
した免疫測定法によって測定することができる。特に
¹²⁵Ｉ標識を用いたＲＩＡ法[6]は高い感度を簡単な操作
で達成することができるので、本発明における好ましい
態様として挙げられる。この他に³²Ｐによる標識抗原を
用いる方法[7][8]も公知であるが、感度や半減期を考慮
すると¹²⁵Ｉの方が有利である。 [6]Progress in clinical and biological research. V
ol.202,1985,"The 2-5ASystem - Molecular and clinic
al aspects of the interferon-regulated pathway -"
p97-104 [7] Nature 288(13),189-192,1982 [8] J. Biol.Chem.,259(3),1727-1730,1984

【００２３】２−５Ａ誘導体の測定法：２−５Ａ誘導体
の場合には、化合物自身が測定可能な標識を備えている
ために、これを抗体のような特異的な結合成分で捕捉し
てＡＴＰ誘導体と分離すれば測定可能である。分子量の
違いに基づく分離も可能であるが、そのためには電気泳
動やクロマトグラフィーに頼ることになるので、本発明
の目的の一つである簡便性を損なうおそれが有る。また
２−５ＡＳはサブタイプによって生成する２−５Ａの分
子量に違いの有ることが知られている。したがって分子
量に基づく分離操作を必要とする測定系では、サブタイ
プが混在する時に高い精度を期待できない可能性が有
る。

【００２４】ピロリン酸の測定法：ＡＴＰを重合して２
−５Ａとする時に副産物として生成するのがピロリン酸
である。したがってピロリン酸は定量的に生成し、酵素
活性の指標とすることが可能である。ピロリン酸の測定
にはさまざまな方法が知られているが、高い感度の期待
できる生物発光反応に基づく測定法が有利である。この
ような測定法として、細胞培養物の２−５Ａ活性をピロ
リン酸の酵素的な測定系の応用により、吸光度測定した
報告が有る[9]。反応原理は次の反応式によって示すと
おりである。なお以下の反応式においてピロリン酸はＰ
Ｐｉと表した。

【００２５】

【化１】 このような酵素的な反応をピロリン酸の測定法として本
発明に応用することができる。酵素的な反応ではＲＩ標
識物質を使わないで測定系を構成できるので、設備面で
は有利であるが、ＲＩＡに匹敵する感度を達成するには
発光増強剤などとの組み合わせが必要な場合も有る。 [9]Anal.Biochem.207,90-93,1992

【００２６】ＡＴＰの測定法：ＡＴＰは２−５Ａの合成
に伴って定量的に消費される物質である。したがって２
−５ＡＳによる酵素反応の前後でＡＴＰ濃度を測定して
差を求めれば、原理的には２−５ＡＳ活性の指標とする
ことができる。ＡＴＰは生物発光反応によって測定でき
ることから、ある程度の感度は期待できる。

【００２７】以上のような２−５ＡＳの活性測定に必要
な次の成分は、反応に必要な量を予め別々に組み合せ
て、あるいは混合して試薬とすることができる。 ・水溶性のdsＲＮＡ ・ＡＴＰまたはその誘導体 試薬は２−５ＡＳの酵素反応に好適な環境を与える緩衝
液に溶解させておいても良いし、あるいは保存性の向上
や運搬を容易にするために乾燥した状態とすることもで
きる。乾燥させる時には、保護作用と同時に溶解性の向
上や賦形剤としての機能を期待してショ糖や乳糖などの
糖類や、ウシ血清アルブミンのような不活性蛋白質を加
えるのが好ましい。

【００２８】本発明の試薬に加えて、更に前記工程ｃ）
に必要な測定系を構成する成分を組み合せれば２−５Ａ
Ｓの活性測定用キットを構成することができる。このキ
ットには試料の測定に必要な試薬類の他に、２−５ＡＳ
活性について検定した標準試料や、２−５ＡＳ活性を取
り除いた陰性対象等を組み合せておくと便利である。

【００２９】本発明は、血中２−５ＡＳを水溶性dsＲＮ
Ａと接触させることによる活性化方法をも提供する。全
血、血清、および血漿のような血液試料、あるいはその
分画や希釈したものに、先に述べたような水溶性のdsＲ
ＮＡを混合することにより、本発明の活性化は達成され
る。

【００３０】更に、本発明は２−５ＡＳの活性測定に当
たって、水溶性の２本鎖ＲＮＡを活性化剤として添加す
ることにより再現性を向上させる方法を提供する。血中
に存在する２−５ＡＳのように小さな酵素活性を測定す
る時に必要とされていたpoly(I)poly(C)−アガロース等
の不溶性の試薬の使用は、操作ステップや試薬の製造工
程を複雑にする原因となり、結果として再現性の低下に
つながりやすい。本発明はこのような不溶性試薬を使わ
ず、水溶性の試薬を利用することによって再現性を向上
させるものである。

【００３１】

【作用】本発明における水溶性のdsＲＮＡは、２−５Ａ
Ｓの活性化剤として用いる。従来の２−５ＡＳ活性化剤
としてはアガロースやセファロースのような固相に結合
した不溶性のdsＲＮＡが用いられることが多かった。特
に血中の２−５ＡＳのように微量の活性を測定するとき
には、いったん固相上のdsＲＮＡに２−５ＡＳを捕捉、
そして洗浄することによって血清成分から分離されてい
た。本発明は、高い感度の達成には必要と思われていた
分離ステップを水溶性のdsＲＮＡの利用によって省略で
きることを見いだしたものである。先に述べたように血
中２−５ＡＳ活性のレベルは培養細胞などにおける活性
の数１０−数１００分の１にすぎず、血中における２−
５ＡＳ活性を分離操作抜きで測定することが困難なこと
は明らかである。

【００３２】また本発明の好ましい態様において２−５
ＡＳ活性測定に応用される２−５ＡのＲＩＡは、poly
(I)poly(C)−アガロースを使わないことによる感度面で
の不利益を補うものである。ただしＲＩＡとの組合せは
あくまでも好ましい態様である。このほかにも２ー５Ａ
Ｓ活性の指標とすることができる反応系の存在すること
は先に述べたとおりである。

【００３３】

【発明の効果】本発明は、不溶性の試薬を使わない２−
５ＡＳの活性測定を可能とする。不溶性の試薬を使わな
いので、酵素の活性化において従来の測定では必須であ
った遠心分離のような付加的な操作を不要とし、結果と
して簡便な操作と高い再現性を実現する。

【００３４】

【実施例】

本発明による２−５ＡＳ活性の測定 水溶性のdsＲＮＡとしてpoly(I)poly(C)を用い、血清を
試料として２−５ＡＳ活性を測定した。２−５ＡＳ活性
は、最終的に生成される２−５ＡをＲＩＡによって定量
することによって決定する方法を採用した。操作は次の
とおりである。合わせて操作フローを図１に示した。同
時にpoly(I)poly(C)−アガロースを利用した従来の方法
によって同じ試料を測定し、再現性や感度等を比較し
た。

【００３５】血清（あるいは２−５ＡＳフリー血清、２
−５ＡＳ活性既知のコントロール血清）５０μlに、水
溶性のdsＲＮＡとして５０μg/mlのpoly(I)poly(C)（Ｓ
ＩＧＭＡ製）溶液を２００μlと９０μg/mlのＡＴＰ溶
液２００μlを加え、よく混和して３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。反応後¹²⁵Ｉ標識した２−５Ａ（１
５００００cpm/ml）と、抗ウサギ抗体抗血清＋抗２−５
Ａウサギ血清とを含む抗体懸濁液２００μlを加え、よ
く混和して３７℃で１時間インキュベートした。反応
後、３０００rpmで３０分間遠心分離し沈殿分画の放射
活性をウエル型シンチレーションカウンターによって測
定した。一方、従来の測定方法としてはpoly(I)poly(C)
−アガロースを用いた市販のキット「２−５Ａ栄研」
（栄研化学製、商品名）を添付文書にしたがって用い
た。従来法の操作フローは図２に示した。検体として
は、正常者の血清２０検体、患者血清５検体を用いた。
また再現性を確認するために、正常者の検体５検体を１
０回くり返し測定した。再現性については、１０連で測
定して測定内再現性を、また１０回の測定で測定間再現
性を観察した。

【００３６】２−５ＡＳフリーの標準血清を試料とし、
２−５Ａ標準（０、１０、３０、９０、２７０、および
８１０pmol/dlの２−５Ａを含有）の添加によって得ら
れた標準曲線を図３に示した。この標準曲線をもとに、
２−５ＡＳ活性既知の標準血清の２−５Ａ測定値と各試
料から得られた２−５Ａ測定値をあてはめて２−５ＡＳ
活性値を算出することができる。こうして求めた２つの
測定方法による２−５ＡＳ活性測定値を表１に示す。表
中gelで示したのが従来法、solutionで示したのが本発
明による測定値である。またこの測定値をグラフにスポ
ットしたのが図４である。両者の間には高い相関が得ら
れた。

【００３７】

【表１】

【００３８】最後に本発明による測定結果と従来法の測
定結果の再現性を比較した結果を表２（測定内再現
性）、表３（測定間再現性）に示した。同じ検体につい
て１０回の測定を繰り返した結果、水溶性のpoly(I)pol
y(C)を用いた本発明の方法が再現性に優れていることが
確認できた。特に測定内再現性（表１）では、従来法に
比べて再現性が大きく改善されていることが明らかであ
る。

【００３９】

【表２】

【００４０】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による２−５ＡＳ活性の測定フロー。

【図２】従来法による２−５ＡＳ活性の測定フロー。

【図３】本発明と従来の方法によって得られた標準曲
線。縦軸はＢ／Ｂ０（％）、横軸は２−５Ａ濃度（pmol
/dl）を示す。

【図４】本発明と従来の方法によって得られた２−５Ａ
Ｓ活性値の相関図。縦軸は本発明による測定値(pmol/d
l)、横軸は従来法の測定値(pmol/dl)である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の工程ａ）−ｃ）で構成される血中２’
   −５’オリゴアデニル酸合成酵素の活性測定方法におい
   て、酵素の活性化剤として水溶性の２本鎖ＲＮＡを用い
   る血中２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素の活性測定
   方法 ａ）２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素活性を含む試
   料を活性化剤とアデノシン３リン酸またはその誘導体と
   混合する工程 ｂ）２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素により２’−
   ５’オリゴアデニル酸またはその誘導体を生成させる工
   程 ｃ）工程ｂ）において生成する２’−５’オリゴアデニ
   ル酸、その誘導体、またはピロリン酸、あるいは消費さ
   れるアデノシン３リン酸またはその誘導体を測定するこ
   とにより２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素の活性を
   決定する工程
2. 【請求項２】水溶性の２本鎖ＲＮＡが、ポリイノシン酸
   ・ポリシチジル酸である請求項１の血中２’−５’オリ
   ゴアデニル酸合成酵素の活性測定方法
3. 【請求項３】水溶性の２本鎖ＲＮＡが、鎖長６０bp以上
   である請求項１または２の血中２’−５’オリゴアデニ
   ル酸合成酵素の活性測定方法
4. 【請求項４】２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素を含
   む試料を血清として１μlに対し、０．１〜１μgの水溶
   性の２本鎖ＲＮＡを用いる請求項１〜３のいずれかの血
   中２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素の活性測定方法
5. 【請求項５】工程ｂ）において生成する２’−５’オリ
   ゴアデニル酸を、¹²⁵Ｉ標識２’−５’オリゴアデニル
   酸によるラジオイムノアッセイによって測定する請求項
   １の血中２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素の活性測
   定方法
6. 【請求項６】２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素活性
   を含む試料が、血液、血清、および血漿からなる群から
   選択される請求項１の血中２’−５’オリゴアデニル酸
   合成酵素の活性測定方法
7. 【請求項７】２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素活性
   を含む試料が、血液であり、この血液が溶血処理によっ
   てリンパ球を破壊したものである請求項６の血中２’−
   ５’オリゴアデニル酸合成酵素の活性測定方法
8. 【請求項８】次の成分で構成される血中２’−５’オリ
   ゴアデニル酸合成酵素活性の測定試薬 ａ）アデノシン３リン酸、またはその誘導体 ｂ）水溶性の２本鎖ＲＮＡ
9. 【請求項９】次の成分で構成される血中２’−５’オリ
   ゴアデニル酸合成酵素活性の測定キット ａ）アデノシン３リン酸、またはその誘導体 ｂ）水溶性の２本鎖ＲＮＡ ｃ）２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素により生成す
   る２’−５’オリゴアデニル酸、その誘導体、またはピ
   ロリン酸、あるいは消費されるアデノシン３リン酸また
   はその誘導体を測定するための手段
10. 【請求項１０】血中２’−５’オリゴアデニル酸合成酵
    素の測定に当たって、水溶性の２本鎖ＲＮＡを添加する
    ことにより２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素を活性
    化する方法
11. 【請求項１１】２’−５’オリゴアデニル酸合成酵素の
    活性測定に当たって、水溶性の２本鎖ＲＮＡを活性化剤
    として添加することにより再現性を向上させる方法