JPH08511195A - 水溶液からの金属除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 不溶性のリン酸塩を持つ標的金属（例えばアクチニド）の除去は、その溶液を下記のバイオリアクタを通過させることにより実施され得る：そしてそのバイオリアクタは、固定化された、リンの同化できる有機源を含有する培養媒体を使用して増殖されたホスファターゼ生産性微生物を含み；除去される元素とは異なる元素（プライミング元素）であって、微生物の細胞表面上にプライミング元素のリン酸塩を沈積させ得るような不溶性リン酸塩を持つ元素でプライミングされている。そのプライミング元素のリン酸塩は、標的金属リン酸塩の沈積を容易にする。

Description

【発明の詳細な説明】 水溶液からの金属除去 本発明は、水溶液から金属を除去する方法に関し、そして更に特定すると酵素 仲介金属沈澱（生物鉱石化）を含む方法に関する。そのような方法は下記の目的 の一つ以上のために使用できる： （a）水精製、 （b）洗浄又は他の工程例えば貴金属鉱石の処理に使用された水からの金属の回 収、 （c）重金属を含有している土壌から重金属を除去する目的のために土壌を処理 するのに使用された水からの重金属の蓄積、そして （d）例えば金属が有機錯塩、例えばクエン酸塩に結合しているかも知れない錯 塩化した金属廃棄物の清浄化。 以前、「水流からの重金属の除去のための固定化細胞バイオ工程（An immobil ized cell bioprocess for the removable of heavy metals from aqueous flow s），L.E.Macaskie,J．Chem．Technol.，49,357-379，1990」にCitrobacter sp ． を使用して重金属除去を実施することが提案されており、その方法では、バイ オマスは、金属除去のための正常な生理学的状態でバイオマスを製造するために グリセロール−２−リン酸を使用して培養されている。金属除去は、固定化細胞 による金属蓄積のためのリン酸ドナーとして５ｍＭまでの量のグリセロー ル−２−リン酸（Ｇ２Ｐ）との金属のコプレゼンテーションに依存している。Ｇ ２Ｐは酵素により分解してグリセリン（細胞のための潜在的なエネルギー源であ る。）と無機リン酸塩になり、そのリン酸塩の流出物は進入して来る金属を奪取 しそして結晶状重金属リン酸塩の沈澱になる。 本発明の目的は、水溶液から金属を除去するための効率を改善した方法を提供 するものである。 ここに、本発明に従って、水溶液から不溶性リン酸塩を持つ金属（以下、「標 的金属」という）を除去するための方法であって；同化できるリン有機源を含有 する増殖培地を使用して培養したホスファターゼ生産性微生物をバイオリアクタ 中に固定し；上記微生物を、標的金属以外の、不溶性リン酸塩を持つ元素（以下 、「プライミング（priming）元素」という）と接触させて、プライミング元素 のリン酸塩を上記微生物の細胞表面上に沈積させるようにし；次いで除去される 標的金属を含有する水溶液を、上記水溶液から標的金属を沈澱させるためにバイ オリアクタに通過させることからなる方法を提供する。 我々は、標的金属を含有する水溶液をバイオリアクタを通過させる前にプライ ミング元素と微生物を長期間にわたり接触させることが特に便利であることを見 出した。最も好ましくは、プライミング元素をバイオリアクタ中の微生物との接 触を維持させている液（通常は水性）媒体中に溶解又は分散する。好ましくは、 その液媒体を、 標的金属を含有する水溶液をバイオリアクタを通過させる前に、定常流の条件下 で少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも１６時間にわたり、微生物と接 触させる。接触段階は、プライミング元素を１番目の濃度で含有する液媒体との 微生物の１番目の接触、それに次ぐ、微生物が、上記の１番目の濃度より低い例 えば１００の係数により、より低い２番目の濃度のプライミング元素を含有する 液媒体との接触を維持される貯蔵段階により実施されてもよい。 別法としては、接触段階はプライミング元素がバイオリアクタからの流出液中 に存在するような方法で実施されてもよい。接触段階の間は、プライミング元素 がバイオリアクタからの流出液中に存在することを保証することにより、それに 次ぐ、水溶液からの標的金属の除去を最適化できる。プライミング元素がバイオ リアクタからの流出液中に存在することを保証することは、（a）バイオリアク タ中のホスファターゼ活性が比較的低いことを保証し、又は（b）バイオリアク タ中のホスファターゼ活性が比較的高いことを保証し、同時に接触段階の間バイ オリアクタを通過するプライミング元素の高流速を使用することにより実施され 得る。 これらの技術（a）又は（b）のいずれの使用も、標的金属除去を最適化すると は期待されないであろう。技術（a）の場合は、ホスファターゼ活性を最大にす ることは、微生物の細胞表面上へのその元素のリン酸塩の沈澱を最大にし、 それにより金属除去を潜在的に最大にするということが普通は期待されるだろう 。逆に、ホスファターゼ低活性のバイオリアクタの使用は金属除去を最小にする 。技術（b）の使用は驚嘆すべきものである；というのはホスファターゼ活性を 最大にすることは普通は上述のように望ましいと考えられるだろうが、バイオリ アクタを通過するプライミング元素の早い流速は、細胞表面上のプライミング元 素のリン酸塩の沈澱を促進する効果的な方法であるとは期待されないであろうか らである。ホスファターゼ活性が最大でありそしてプライミング元素が比較的低 い流速でバイオリアクタ中に導入されるようにして操作条件が選択されるならば 、微生物の細胞表面上のプライミング元素のリン酸塩の形成はバイオリアクタの 流入端の比較的狭い領域内でほぼ独占的に起こりそしてそれが溶液からのプライ ミング元素のほぼ完全な除去であるとして表現されると、信じられている。バイ オリアクタのあるものは、プライミング元素の実質的に全てが流入端領域で除去 されているので、機能的に余剰である。かくして、プライミング元素のリン酸塩 が次の標的金属の沈澱のための中心部位を提供するバイオリアクタの流入端領域 を越えて欠乏部位がある。プライミング元素がバイオリアクタからの流出液中に 存在するような方法で例えば早い速度でバイオリアクタを流通させることにより 、接触段階を実施することは、プライミング元素のリン酸塩がバイオリアクタの 全有効領域と全長を通じて沈積さ れることになり、かくしてそれに続く水溶液からの標的金属の除去を最適化する と信じられている。かくして、非効率的であると見える方法で接触段階を実施す ることは実際には、そうしないと標的金属除去が改善された効率を挙げると期待 される方法で接触段階が実施される場合と比較して、標的金属除去の効率を改善 する。 本発明は、アクチノイド、例えばアクチニド類、例えばウラニウム（ＵＯ₂ ²⁺ 型）、ネプツニウム及びアメリシウムの水溶液からの除去のために特に適してい る。本発明は、水溶液からカドミウム、鉛、銅、ニッケル、亜鉛、マンガン、コ バルト、ランタン、イットリウム、ユウロピウム及び銀を除去するのにも適して いると考えられる。しかし、本発明は、金属除去段階でバイオリアクタ中に存在 する条件下で適当に低い溶解度を持つリン酸塩を持つ金属又はメタロイドの水溶 液からの除去に広く適していると信じられている。本明細書で使用される術語「 標的金属」は、上記に従って構成される。 プライミング元素の選択に関しては、それが微生物の細胞表面に沈澱して止ま りそしてそれに続く標的金属の沈着のための適当な核化表面を提供するような溶 解度の生成物を持つ限りは、いずれの元素も使用できる。接触段階のために有用 であろう元素の例は、ランタンと他のランタニド、ウラニルイオン、鉄、鉛、カ ドミウムとマンガンを包含し、ランタンとウラニルイオンが好ましい；そして「 プライミング（priming）」沈澱物はＬａＰＯ₄ 又はＨＵＯ₂ＰＯ₄・ｎＨ₂Ｏの各々であると考えられている。 選択された微生物は、適当なホスファターゼを生産するものであって、好まし くは 例えばMacaskie（上述を参照）で使用されたCitrobacter sp．である。し かし他の微生物、例えば ＬａＰＯ₄を沈澱するProvidencia rettgeri ＮＣＩ ＭＢ １０４５７も使用されてもよい。 本発明を更に詳細に説明する。実施例１ １．細胞の増殖と固定化 細胞株 土壌試料から得られた株を起源とする既知のCitrobacter株N14（NCIMB No．40 259）を、オックスフォードのＩｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏからライセンシン グ契約の元で、この研究に使用した。その菌株を栄養寒天（Ｄｉｆｃｏ）平板上 で、約６カ月の間隔で継代培養をしながら４℃に維持した。増殖培地Ａ 細胞を、下記のようにして濃厚溶液として製造された合成最小培地中で、ルー チン的に増殖した： 水２５０ｍｌに溶解したＴＲＩＳ（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−プ ロパン−１，３−ジオール）１２０ｇの緩衝液に、４.４５Ｍ塩酸約２００ｍｌ を添加 して、ｐＨ約７.０の溶液を得た。これに下記の塩を添加した：硫酸アンモニウ ム９.６ｇ、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）０.６３ｇ、塩化カリウム ６.２ｇ、２−グリセロリン酸ナトリウム（５.５Ｈ₂Ｏ）６.７ｇ、硫酸鉄（Ｆｅ ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）０.０３２ｇの１０ｍｌ溶液の１ｍｌとグリセリン３０ｇ。最 終ｐＨを、必要な２ＭＨＣｌで７.０へ再調整した。容積を蒸留水で１１にし、 そして濃厚培地を４℃で貯蔵した。細胞の増殖のために、保存培地を１０倍に希 釈し、使用前にオートクレーブで滅菌した。細胞のバッチ培養 Citrobacter種菌は、保存平板からであり、それを滅菌した最小培地（増殖培 地Ａ）２０ｍｌを含有する１００ｍｌの三角フラスコ中で３０℃で震盪しながら 連続的に３回培養した（接種容積０.５−１.０ｍｌ）。３番目の継代培養物を種 菌として、滅菌最小培地３１を含有する５ｌ三角フラスコ中で実施した主バッチ 増殖のために使用した。エアレーションと混合は、空気が培地中に通過する、圧 縮空気供給器へ接続した３本の中空エアレーションの使用による。全てのバッチ を３０℃で実施した。 初期静止期（１６−２４時間）の細胞を、２５０又は５００ｍｌの遠心分離機 （各々、Ｍｉｓｔｒａｌ ６Ｌ又はＢｅｃｋｍａｎｎ Ｊ２−２１Ｍ／Ｅ遠心分 離機）中の５０００ｒｐｍでの１５分間にわたる遠心分離により採取した。細胞 を、試験管当たり４０ｍｌの等張食塩 水（８.５ｇ／ｌ）中に再懸濁しそして５０ｍｌの前秤量した遠心分離管へ移し た。遠心分離（Ｄｅｎｌｅｙ卓上遠心分離機、５０００ｒｐｍ、１５分間）によ るペレット化の後、細胞を試験管当たり４０ｍｌの生理食塩水で洗浄しそして再 びペレット化した。過剰の水を、１時間にわたり試験管を倒立することにより絞 りだし、その後試験管を再秤量して、前細胞の生重量を測定した。ホスファターゼの比活性の測定 ホスファターゼの比活性は、ｐ−ニトロフェニル＝ホスヘートからのｐ−ニト ロフェノール遊離により下記のように測定される：上述のようにしてペレット化 した細胞を生理食塩水中で２回洗浄しそして３ｍｌの等張食塩水中に再懸濁する 。細胞濃厚液を、０.３５ないし０.４のＯＤ₆₀₀（６００ｎｍに於ける光学濃度 ）を得るのに要求される１.８ｍｌの３０℃においてｐＨ７.０の２００ｍＭ Ｍ ＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパンスルホン酸）／ＮａＯＨに添加した 。最終容積は２ｍｌであり、差は水による。そして、反応をｐ−ニトロフェニル ＝ホスヘート１５.８ｍｇ／ｍｌの０.４ｍｌ（４６.５ｍＭ）の試験管への添加 により開始した。認識できる黄色が明白になった時に、これは通常３０秒ないし ２０分間であるが（培養物の活性に依存する）、反応を２００ｍＭ ＮａＯＨ５ ｍｌの添加により急中止した。黄色液の４１０ｎｍにおける吸光度（Ｖａｒｉａ ｎ分光光度計）を読み取り、較正値を参照して、遊離したｐ−ニトロフェ ノールのｎモル数に変換した。 基質を同じ試験管に入れる前にＮａＯＨを添加することにより得られる対照値 を差し引いて、δＡ（ホスファターゼによるｐ−ニトロフェノール遊離が原因と なる吸光度）を与える。試料中の細胞タンパク質は、細胞濃厚液及びＭＯＰＳ緩 衝液ブランクに対する１.８ｍｌの２００ｍＭ ＭＯＰＳ中の水と同格量のＯＤ_{6 00} を測定することにより推定され、そしてＬｏｗｒｙ法（Ｒ．Ｍ．Ｅｍｐｓｏｎ ，ＦＨＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ II Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏ ｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）により推定されたＯＤ₆₀₀単位当たりのタンパク 質の推定値である。タンパク質含量（ＯＤ₆₀₀単位当たりの検定のタンパク質（m g））は、０.５８０であった（Ｂ．Ｃ．Ｊｅｏｎｇ Ｄ．Ｐｈｉｌ Ｔｈｅｓｉ ｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ，１９９２）。 ホスファターゼの比活性（比活性）は下記の等式から決められる： 式中、 δＡ ＝遊離されたｐ−ニトロフェノールの Ａ₄₁₀による吸光係数（Ａ₄₁₀） 7.4/1000 ＝検定の希釈係数 ε₄₁₀ ＝検定条件下のＡ₄₁₀におけるｐ−ニトロ フェノールの吸光係数（平均値：18580） 0.580xOD₆₀₀ ＝基質又はＮａＯＨを入れてない複製試験 管を使用して決められた検定のタンパク 質mg数（上述を参照） t ＝検定時間（分） これを下記のように簡略化できる： この後記の式は、全ての比活性計算に使用された。固定化工程 ペレット化した細胞（生重量５ｇ）を、一方の端を密栓した５０ｍｌガラス試 験管中の約３５ｍｌ等張食塩水に再懸濁した。消泡剤（ポリプロピレングリコー ル）１滴、アクリルアミドモノマー５ｇそしてＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリル アミド０.５ｇを添加し、次にその試験管を酸素を含有しない窒素ガスで２−３ 分間通気した。２.５％（w/v）過硫酸ナトリウム水溶液５ｍｌと５％（v/v）の ３−ジメチルアミノプロピオニトリル水溶液５ｍｌを反応を開始するために添加 した；試験管を上部で密栓し、重合反応が開始するまで逆転により振り、少なく とも１時間にわたり４℃で重合させた。ゲルをステンレス製の網で細切断し、重 量により５０部分（一部分当たり 生細胞０.１ｇ）に分割した。各々の部分を生理食塩水で２回洗浄して重合しな かったゲル成分と固定されなかった細胞を除き、そして使用する前に少なくとも １週間４℃で貯蔵した。装置の製造 装置を添付した図１に示したように組み立てた；その装置は注入する溶液を含 有する容器１０、使い捨ての操作容積２ｍｌのプラスチック製カラム１２からな り；そしてそのカラムは上部が密栓した蓋１４で閉じられており、固定化細胞を 含有しそしてポリスチレン−フリット支持材１８上に支持されているポリアクリ ルアミドゲルのベッド１６（約１ｍｌ）を含む。生理食塩水中の細切断したポリ アクリルアミドゲルの一部分（生重量０.１ｇの細胞を含む）を、カラム１２（ Ｐｉｅｒｃｅ ａｎｄ Ｗａｒｒｉｎｅｒにより支給）中に充填して、ベッド１ ６を形成する。上記装置は更に綿毛（非吸収性）フィルタ２０（或る実験では、 使用されない。）、蠕動ポンプ２２とシンチレーションガラス容器２４を含む。 綿毛フィルタ２０は、下記のようにして製造される：短いガラス製パスツールピ ペットの先端部を切取り、その破損端を焔で溶融して滑らかにする。短いシリコ ーン管をその先端部に被せ、そしてこれを、胴部を蒸留水で充填する間、閉鎖す る。０.５ｇの非吸収性綿毛を秤量して蒸留水中に浸漬した。小さい房を、空気 泡を除くために絞りそして胴部中に充填し、殆ど上端まで満たした。実験の 間を通して室温（２０℃）に維持した。漏れを防ぐために、ポンプ２２をカラム １２の後に設置した。溶液を、カラム１２を通じて陰圧下ポンプ２２を介して吸 引し、密封が空気遮蔽になっていない場合に、溶液が装置中へ吸引されずそして 漏れが明瞭になるようにした。内側への空気漏れ又は外側への溶液漏れは、蓋１ ４の周囲の２種の密閉剤からなる封止の使用により防御した。ホワイトシール〔 Ｗｈｉｔｅｓｅａｌ（Ｂｏｓｔｉｋ Ｌｔｄ）〕を蓋１４の周辺上に塗り付けそ して２−３時間にわたり乾燥し、次いで流動性のシリコーンゴムコンパウンド（ ＲＳ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｌｔｄ）で被覆しそして硬化するために２４時間 放置した。２．ランタン流によるプライミング プライミング溶液 蒸留水中の１００ｍＭ硝酸ランタン、ｐＨ６.９の２００ｍＭのクエン酸三ナ トリウム塩／クエン酸の緩衝液、５００ｍＭの蒸留水中の２−グリセロールリン 酸ナトリウム塩及びｐＨ７.０の２００ｍＭのＭＯＰＳ／ＮａＯＨ緩衝液の貯蔵 液を製造しそして４℃で貯蔵した。プライミング溶液を、貯蔵液を蒸留水に希釈 して製造し、１ｍＭ硝酸ランタン，２ｍＭクエン酸塩緩衝液、５ｍＭ２−グリセ ロールリン酸ナトリウム塩及び５０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液からなる最終溶液を製造 した。ランタンとクエン酸塩の貯蔵液を、金属のヒドロキシル化がクエン酸塩の 錯体化により抑制されるのを保証するために、他の成分 を添加する前に混合させた。試験溶液 １０μＭランタンを含有する試験溶液は、上述の貯蔵溶液の希釈により製造し 、１０μＭ硝酸ランタン，０.５ｍＭクエン酸塩緩衝液、５ｍＭ２−グリセロー ルリン酸ナトリウム塩及びｐＨ７.０の５０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液を含有する溶液 を製造した。ランタンとクエン酸貯蔵液を、金属のヒドロキシル化がクエン酸塩 の錯体化により抑制されるのを保証するために、他の成分を添加する前に混合さ せた。ランタンのためのアルゼナゾIII検定 アルゼナゾIIIは、赤色／橙色ないし紫色の錯体形成により重金属の多数を検 出する非特異的な感度の高い試薬である。飽和溶液を下記のように製造する：ア ルゼナゾIII０.０３８ｇを蒸留水２５ｍｌに添加し、そして溶液を少なくとも１ 時間にわたり攪拌した。次いで、溶液をワットマンNo．１定性分析紙を通してろ 過し、未溶解の試薬を除去した。下記のプロトコールは、プライミング溶液中の ランタンの検出のために開発されたものである。（１ｍＭランタン溶液用）プラ イミング溶液を、２ｍＭクエン酸塩液ｐＨ６.９／５ｍＭ２−グリセロールリン 酸ナトリウム塩中で１０倍に希釈して全溶液容積２.０ｍｌ（即ち、ランタン溶 液０.２ｍｌ＋緩衝液１.８ｍｌ）にした。これに、０.７５Ｍ塩酸０.３ｍｌとア ルゼナゾIII試薬（上述のようにして製造した）０.１ｍｌを添加し た。その試験管を、「Ｗｈｉｒｌｉｍｉｘ」上で数秒間にわたり攪拌した。そし てその色を、２.０ｍｌの緩衝溶液で製造した試薬ブランクと対比して、６５２_{n m} における吸光度を読んだ。 ランタンを低濃度で含有する溶液（試験溶液中、１０μＭとして）の検定のた めに、希釈段階を実施しないで溶液を直接検定した。プライミング工程Ａ 上述のプライミング溶液２０ｍｌをカラム１２を６ｍｌ／ｈで通過させて、ラ ンタンを（アルゼナゾIII検定により測定して）１００％除去した。換言すれば 、カラム１２からの流出液中の残留ランタンは、検定の検出限界以下であった。 この後直ぐ試験溶液２５ｍｌを流して、依然としてホスファターゼ活性があるこ と換言すればプライミング金属の効率的な除去があることを確認する程に金属の 低濃度に対してカラムが活性であることを保証した。プライミング工程Ｂ 上述のプライミング溶液３０ｍｌをカラム１２を２種の流速（約２６と１５ｍ ｌ／ｈ）で通過させて、各々、８０−９０％、及び９５％のランタンを除去した 。この後２５ｍｌの試験溶液を流して、カラムが低濃度の金属に対して活性であ ることを保証した（１０μＭランタンの１００％除去）。３．アクチニド含有流体の試験 試験アメリシウム溶液 アメリシウムを含有する溶液を下記のようにして製造した：硝酸²⁴¹アメリシ ウム１００ｎＣｉをガラス製のシンチレーション容器に分配した。これに、記載 の順序で、ｐＨ６.９の５ｍＭクエン酸三ナトリウム塩／クエン酸緩衝液１ｍｌ 、ｐＨ７.０の２００ｍＭ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ緩衝液２.５ｍｌ、５００ｍＭ基 質（２−グリセロールリン酸ナトリウム塩）０.１ｍｌ及び蒸留水６.４ｍｌを添 加した。アメリシウムの最後の濃度は、１１ｎＭであった；活性は１０ｎＣｉ／ ｍｌであった。ネプツニウム試験溶液 ネプツニウムを含有する溶液を下記のようにして製造する：８Ｍ硝酸中²³⁷ネ プツニウムの１μＣｉ／ｍｌの溶液の市販品０.０５ｍｌを、ポリプロピレン製 シンチレーション容器に分配する。これに記載の順序で、ｐＨ６.９の５ｍＭク エン酸三ナトリウム塩／クエン酸緩衝液１ｍｌ、ｐＨ７.０の２００ｍＭ ＭＯ ＰＳ／ＮａＯＨ緩衝液２.５ｍｌ、５００ｍＭ基質（２−グリセロールリン酸ナ トリウム塩）０.１ｍｌ、蒸留水６.４ｍｌ及び４ＭＮａＯＨ ０.１ｍｌを添加 した。ＮａＯＨは、中にネプツニウムが入っている硝酸を中和するのに必要であ った；（ネプツニウムを含有していない同格の溶液中の）最後のｐＨは６.８で あった。最後のネプツニウム濃度は３０μＭであり、活性は５ｎＣｉ／ｍｌであ った。実験手順 実験を、ポンプ２２を最低の流速（約６ｍｌ／ｈ）に設定し、２０℃で実施し た。アクチニドを含有しない試験溶液１０ｍｌをカラム１２を通して流してカラ ムを平衡化し、その後直ぐアクチニド試験溶液１０ｍｌを流した。約２ｍｌづつ の流出液のフラクションを予め重量を測定したシンチレーション瓶２４に採集し た。流出液の正確な体積を、採集の前と後の瓶の重量から、１.０ｍｌ／ｇの変 換係数を使用して、計算した。アクチニド濃度の測定 ²⁴¹アメリシウムについては、試料を３５−８０ｋｅＶに設定したパッカード ・オートガンマ５０００シリーズ（Ｐａｃｋａｒｄ ａｕｔｏｇａｍｍａ ５０ ００ ｓｅｒｉｅｓ）液体ガンマ線計数管、又は沃化カリウム固形廃棄物ガンマ 線計数管（ｓｏｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ ｓｏｌｉｄ ｗａｓｔｅ ｇａｍｍａ ｃｏｕｎｔｅｒ）〔Ｎｕｃｌｅａｒ Ｓｉｌｉｃａ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉ ｔｈ Ｆａｂｃａｓｔ ｓｈｉｅｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｏｒｔｅｃ ａｎａｌｙ ｚｅｒ，ｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎａｔ ｉｏｎａｌ Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｏａｒｄ〕 （これは、カラムと配管の計数ができるので、活性バランスの計算ができる。） のいずれかの中でガンマ線計数をした。試料は各々１０分間にわたり計測され、 得られた分当たりの計数（ＣＰＭ ）は、分当たりの崩壊（ＤＰＭ）に、既知のＤＰＭ源から計算された変換計数の 使用により、変換された。バックグラウンドのＣＰＭは、各々の計数試料に添加 された水を含有する瓶から決められそして全てのＣＰＭ実験値から差し引かれた 。注入（インプット）された溶液からの０.２ｍｌの試料も計数された；これか ら各々の排出された（アウトプット）フラクションについての期待インプットＤ ＰＭが計算され、かくして、各々のフラクションから除去された活性のパーセン トが決められた。計数誤差は１％以下であったので、パーセント除去率は２％以 下であった。 ²³⁷ネプツニウム（と壊変生成物²³³プロタクチニウム）については、Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ ＨｉｓａｆｅII生分解性シンチレーション・カクテル１０ｍｌを各 々の２ｍｌのフラクションに添加した。シンチレーション容器（瓶）を、カクテ ルによる試料受容を保証するために静かに混合し、ＬＫＢ・１２１７・ラックベ ータシンチレーションカンタ上で、１００−２００のチャネルを使用して１０分 間にわたり計数した。バックグラウンド（ネプツニウムを含まない計数液剤と反 応混合物）は、各々の読みから差し引かれてＣＰＭを算出しそして注入（インプ ット）溶液の０.１ｍｌと０.２ｍｌの試料は、インプット計数を推定するのに使 用された。²⁹⁷Ｎｐと²³³Ｐａを合わせたものの除去率（パーセント）は、²⁴¹ア メリシウムについてのものとして決められる。結果 アメリシウムの除去のために実施された結果を、図２のグラフ中に示しそこに は、アメリシウムの除去率が、いろいろのカラム調製技術ＬないしＯについての アメリシウム液流のｍｌに対してプロットされている。 技術Ｌ（比較）では、カラム１２は、低いホスファターゼ活性細胞［ホスファ ターゼ欠損変異株Ｍ１（比活性１０単位）〔メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ） 変異原により産出された［Owen，S.，Jeong，B.C.，Poole，P.S．and Makaskie ，L.E.（1992）「Citrobacter sp．の固定化細胞によるリン酸トリブチルの分解 」Applied Biochemistry & Biotechnology 34/35，693-707］〕］と共に、フィ ルタ２０なしでそしてプライミング工程は全くなしで使用された。これは、約３ ５％だけの全除去量を与えた。 技術Ｍ（本発明）は、ホスファターゼ欠損変異株Ｍ１（比活性１０単位）の細 胞をカラム１２内に使用しそしてプライミングはないがフィルタ２０を使用する ことを包含していた。これはアメリシウムの初期の高い除去を示すが、その後除 去率は低下して全除去率は約５５％であったが、依然、技術Ｌよりは顕著に改善 された。 技術Ｎ（本発明）は、高ホスファターゼ活性細胞（比活性１９８０単位）をカ ラム１２内に使用しそしてプライミング工程Ａはするがフィルタ２０を使用しな いことを包含していた。これも、アメリシウムの初期の高い除 去を示すが、除去率は極めて急激に低下した。それにも係わらず全除去率は約６ ０％であった。 技術Ｏ（好ましい方法）は、高ホスファターゼ活性細胞（比活性１１６３単位 ）のカラム１２内の使用と共にフィルタ２０及び個別の試験で両方の流速を使用 するプライミング工程Ｂの使用を包含していた。図２に示したように技術Ｏにつ いてのデータを各々の場合について得た。図から明瞭なように、これはアメリシ ウムの約１００％の除去率を示している。 ネプチニウム（その壊変生成物²³³Ｐａを含む）の除去のために実施した結果 は、図３のグラフ中に示してあり、図３には、放射活性（放射能）の除去率（％ ）が、いろいろのカラム製造技術ＰないしＲについてのネプツニウム液流のｍｌ に対してプロットされている。 技術Ｐ（本発明）は、高ホスファターゼ活性（比活性１９８０単位）の細胞の カラム１２内の使用と共にプライミング工程Ａとフィルタ２０の使用を包含して いた。これはネプツニウムの初期の高い除去をしたが、放射活性除去率は液流７ ｍｌの後では大略１０％に低下した。 技術Ｑ（好ましい方法）は、高ホスファターゼ活性細胞（比活性１１６３単位 ）のカラム１２内の使用と共に同じ試験における両方の流速でのプライミング工 程Ｂとフィルタ２０の使用を包含していた。これは放射活性の全除去約８５％の 結果であった。 技術Ｒ（好ましい方法）は、同じ試験における両方の 流速でのプライミング工程Ｂとフィルタ２０と共に、高ホスファターゼ活性細胞 （比活性１１６３単位）のカラム１２内の使用を包含していた。図から見れるよ うに、これは放射活性の全除去約９０％の結果であった。 技術ＱとＲについて得られる結果における僅かな変化は、カラムを通過するネ プツニウム流速によるものである。技術Ｑでは、この流速は５.８ｍｌ／ｈであ ったが、技術Ｒではこの流速は７.３ｍｌ／ｈであった。実施例２ 下記の点以外は同じにして実施例１を繰り返した。 １． Ａｍと²³⁷Ｎｐと増殖培地Ａを使用する試験の代わりに、²³⁷Ｎｐ／²³⁹Ｎ ｐ（下記を参照）と増殖培地Ｂ〔増殖培地Ａと同じであるが、最終のグリセリン 濃度を２.５ｇ／ｌ（濃厚培地中２５ｇ／ｌ）にした。〕を使用して試験をした 。 ２． 下記の表に記載されたＬａ除去の効率範囲の結果になるようないろいろの 流速で、実施例１に記載したプライミング・ランタン溶液のいろいろの量をカラ ム１２に通過させることを包含するプライミング工程を使用した： この次に、１０μＭ Ｌａ試験溶液２５ｍｌ中でプライミング溶液と同じ速度で 洗浄し、そしてそのような試験溶液中で次の日又はより後の日に使用するまで貯 蔵した。 ３． ネプツニウム試験溶液は、（８ＭＨＮＯ₃中の²³⁷Ｎｐの１２５３Ｂｑ／ｍ ｌ溶液０.０５ｍｌ）＋〔約１２００カウント／ｓｅｃ／ｍｌ（８Ｍ ＨＮＯ₃中 ）の²³⁹Ｎｐ溶液０.０５ｍｌ〕を使用して製造された。 ６.３ｍｌと０.２ｍｌ各々の蒸留水と４ＭＮａＯＨが使用され、そして使用前 にｐＨを、ｐＨ６.５−７.２０であることを確認しそして必要な場合はｐＨを６ .５ないし７.２０にするために４ＭＮａＯＨの余分の１−２滴で調節する以外は 、実施例１と同じ追加が使用された。 ４． 試験的工程では、実施例１のネプツニウム溶液５ｍｌ（しかしネプツニウ ム又はＮａＯＨを含有しない）を６−９ｍｌ／ｈで、プライムしたカラム１２に そのカラムを平衡させるために通過させ、その直後上述の３．の試験ネプツニウ ム溶液１０ｍｌを同じ速度で通過させた。カラム１２からの排出物（アウトプッ ト）を大略２ｍｌのフラクションにして集めそしてフラクションの放射活性を計 数した。 ５． アクチニド濃度の測定では、²³⁸Ｎｐについては、 計数は核データ多チャネル分析計に接続したキャンベラ高分解能ゲルマニウム検 出器を使用して実施した。 本発明に従ったプライミング工程を利用することにより得られた予期できない 効果は、図４を考察すれば理解されることであり、図４では対照カラムは、ラン タンがプライミングの間に除去されずそして１０ｍｌ段階でＮｐが４０％だけ除 去された、細胞の無いカラムであった。試験ＡないしＤ（これは、各々、プライ ミングの間の１００％、７６.６％、１２％及び２１％のＬａ除去％数に相当す る）は、各々が、１０ｍｌ段階における注入（インプット）溶液の除去率数値、 ６７％、６６％、７４％と８９％を得た：換言すれば、最も良い結果を与えると 期待された２本のカラム（ＡとＢ）が、２個の最も悪い結果を与えそして逆転し ていた。 図５を参照すると、サイクル式に２個の液流通過バイオリアクタ１００と１０ ２を使用する準連続式基準の、溶液からの金属回収のためのスキームダイヤグラ ムが記載されている。バイオリアクタ１００が、流入ライン１０４、流入切換バ ルブ１０６、流出ライン１０８と流出切換バルブ１１０の使用を介してプライム されて（primed）いる間；その全長にわたってプライムされた（primed）他のバ イオリアクタ１０２は、流入ライン１１２、流入切換バルブ１１４、流出ライン １１６と流出切換バルブ１１８を使用して溶液から金属を除去するために使用さ れている。所望ならば、切換バルブ１０６、１１０、１１４と１１８は、バイオ リアクタ１０２がプライムされるようにしその間バイオリアクタは溶液から金属 を除去するために操業させられるように操作させることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 トッレイ，マーク，ロバート イギリス国，ケムブリッジ シービー２ アイキューティ，テニス コート ロー ド，インスティチュート オブ バイオテ クノロジー（番地表示なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．水溶液から不溶性リン酸塩を持つ金属（以下、「標的金属」という）を 除去するための方法であって； 同化できるリン有機源を含有する増殖培地を使用して培養したホスファターゼ 生産性微生物をバイオリアクタ中に固定し； 上記微生物を、標的金属以外の、不溶性リン酸塩を持つ元素（以下、「プライ ミング（priming）元素」という）と接触させて、プライミング元素のリン酸塩 を上記微生物の細胞表面上に沈積させるようにし； そして次に除去される標的金属を含有する水溶液を、上記水溶液から標的金属 を沈澱させるためにバイオリアクタに通過させる段階からなる方法。 ２．液媒体中に溶解又は分散したプライミング元素に、バイオリアクタ中に 固定された微生物との接触を維持させる請求項１記載の方法。 ３．プライミング元素を含有する液媒体に、バイオリアクタ中に固定された 微生物との定常流条件下での接触を維持させる請求項２記載の方法。 ４．定常流状態が少なくとも２時間にわたり維持される請求項３記載の方法 。 ５．プライミング元素がバイオリアクタからの流出液中に存在するようにし てバイオリアクタを通ってプライミング元素を通過させることにより、接触段階 が実施 される請求項１又は２記載の方法。 ６．標的金属がウラニウム、ネプツニウム、アメリシウム、カドミウム、鉛 、銅、ニッケル、亜鉛、マンガン、コバルト、ランタン、イットリウム、ユウロ ピウム又は銀である前出の請求項いずれかに記載の方法。 ７．プライミング元素がランタン又は他のランタニド、ウラニルイオン、鉄 、鉛、カドミウム又はマンガンである前出の請求項いずれかに記載の方法。 ８．プライミング元素がランタン又はウラニルイオンである請求項７記載の 方法。 ９．微生物が、Citrobacter株Ｎ１４（ＮＣＩＭＢ４０２５９）又はProvide ncia rettgeri （ＮＣＩＭＢ１０４５７）のホスファターゼ生産性と金属沈澱性 の性能を持つ前出の請求項いずれかに記載の方法。