JPH08510930A

JPH08510930A - 生理活性物質を連続的に適用するための包帯

Info

Publication number: JPH08510930A
Application number: JP7501072A
Authority: JP
Inventors: エカート、リチャード・エル; スミス、ダニエル・ジェイ; シェイファー、アーウィン
Original assignee: ケイス・ウエスタン・リザーブ・ユニバーシティー; ザ・メトロヘルス・システム; ザ・ユニバーシティー・オブ・アクロン
Priority date: 1993-06-02
Filing date: 1994-06-02
Publication date: 1996-11-19
Also published as: AU679760B2; EP0755261A4; KR960702752A; AU7051694A; EP0755261A1; WO1994027633A1; CA2163264A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、成長因子のような創傷の治癒を促す生理活性細胞産生物分泌する細胞を封入したエンベロープを含んでなる生物学的包帯を提供する。このエンベロープは、さらに、細胞生産物の通過拡散する透過性底面膜と、上面膜とで構成される。好ましくは、包帯は上記２つの膜の間に挿入されたセパレーターを有する。本発明は創傷を治療する方法にも関する。包帯は新鮮で細胞生産物を連続的かつ均一に供給する。

Description

【発明の詳細な説明】生理活性物質を連続的に適用するための包帯関連出願の相互参照本願は１９９２年６月３日出願の米国特許出願番号第０７／８９３１６４号の部分継続出願である。発明の分野本発明は傷に治療用細胞生産物を連続的に供給する包帯に関する。より詳細には、本発明は、細胞と細胞培養液とを収容するためのチャンバーを有し、細胞生産物透過性膜を有する包帯、当該包帯に有用な遺伝子操作を加えた細胞、並びにかかる細胞を生産するための方法に関する。発明の背景哺乳類（動物及び人間）の傷の治療には、歴史的にみて、物理的保護を与えかつ感染をある程度軽減するような単純な受動的包帯が用いられてきた。治療はこのような単純な包帯からもっと積極的な治療へと進歩しつつある。特に火傷のような重度の傷には、皮膚移植や皮膚片が適用されてきた。皮膚の細胞は徐々に「生着」して傷口を埋める。各種の増殖因子を傷に直接投与することによって治癒を促進しようと試みられている。Brown G.L.，Curtsinger L.，Jurkiewicz M.J.，Nahi F.，Schultz G．（1991）“Stimulation of Healing of Wounds by Epidermal Growth Factor”P last．Reconstr．Surg．第88巻189-194頁；Brown G.L.，Nanney L.B.，Griffen J.，Cramer A.B.，Yancey J.M.，Curtsinger L.，Holtzin L.，Schultz G.，Jur kiewicz M.J.，Lynch J.B．（1989）“Enhancement of Wound Healing by Topic al Treatment with Epidermal Growth Factor”New England J．Med．第321巻76 -79頁；ten Dijke P.，Iwata K.K．“Growth Factors for Wound Healing”（19 89）Biotechnology第7巻793-798頁；Pierce G.F.，Mustoe T.A.，Altrock B.W. ，Deuel T.F.，Thomason A．（1991）“The Role of Platelet Derived Growth Factor in Wound Healing”Cellular Biochemistry 第45巻319-316頁；並びにSchultz，Rotatori，Clark，“EGF and PDGF-Alpha in Wound Healing and Repair”J．Cellular Biochemistry第45巻346-352頁（1991 ）を参照されたい。増殖因子は創傷及びその周辺部の組織中の細胞の増殖及び／又は分化を促進する。局所ゲルなどを傷の表面に貼付することによってこれらの増殖因子を傷に投与することが試みられている。しかし、このような増殖因子含有ゲルには幾つかの欠点がある。これらのゲルに含まれる増殖因子の量には限りがある。時間が経つと患者自身の組織から産生される酵素によってゲル及び／又は増殖因子が分解される可能性がある。さらに、増殖因子の単離及び精製はその生理活性を低下させることがある。増殖因子を傷に直接滴下する試みもなされている。しかし、この適用方法は連続的なものではなく、その傷の様々な箇所に増殖因子を一様な量で与えるものでもない。さらに、増殖因子は半減期の短いものが多く、そのため、傷に投与された増殖因子の量は時間経過とともに著しく減少する。最後になるが、単離・精製された増殖因子の価格は極めて高い。増殖因子を傷に添加すると傷の治癒が促進されることが判明しているにもかかわらず、傷の治療に増殖因子を応用することが広まっていないのは上記のような欠点があるためである。したがって、創傷組織に対して直接的に均一量の生理活性増殖因子を連続的に供給できるような包帯があれば望ましいであろう。発明の概要本発明の包帯は、一般に、エンベロープを含んでなるが、このエンベロープは上側の膜と、当該エンベロープ中に存在する栄養培地中に維持された細胞に由来する増殖因子やホルモンなどの生理活性物質に対して透過性をもつ下側の膜とによって画定されている。上記の生理活性物質は好ましくは増殖因子又は成長ホルモンである。上側の膜と下側の膜の間にセパレーターが置かれる場合もある。本発明は、このような包帯の製造方法並びに当該包帯の貼付によって創傷を治療する方法を提供する。本発明は、別の態様では、様々な増殖因子を産生するような遺伝子操作を加えた遺伝子、かかる遺伝子の作製方法、当該遺伝子によって形質転換された細胞、並びにかかる細胞の生産物（発現産物も含む）を提供する。図面の詳細な説明図１は、上記包帯の封入セパレーター型具体例の断面図である。図２は、上記包帯の外辺セパレーター型具体例の断面図である。図３は、追加の膜が複数のセパレーターの間に位置していてしかも包帯によって取り囲まれているような具体例の断面図である。図４は、ゲルと併用した状態での上記包帯の外辺セパレーター型具体例の断面図である。図５は、創傷部位の上に貼付した付着式セパレーター付包帯の部分断面図であり、ゲルの使用についても示してある。図６は、プラスミドｐＳＶ₂ＮＥＯの概略図である。図７は、プラスミドλＧＨ２の概略図である。図８は、プラスミドｐＮＥＯ-ｂＧＨの概略図である。図９は、プラスミドｐＮＥＯ-ＣＭＶ-ｂＧＨの概略図である。図１０は、プラスミドｐＥＣＥの概略図である。図１１は、プラスミドｐＵＣＤＳ３の概略図である。図１２は、プラスミドｐＵＣＤＳ３-ＳＡＬＩの概略図である。図１３は、プラスミドｐＥＣＥ-ＩｇＥＧＦの概略図である。図１４は、プラスミドｐＥＣＥ-ＩｇＥＧＦ-ＮＥＯの概略図である。図１５は、包帯内部に位置する細胞から放出されたウシ成長ホルモンのオートラジオグラフィーである。図１６は、上記包帯の別の具体例の断面図である。発明の詳細な説明本発明は、新鮮な生理活性分子（例えば増殖因子や成長ホルモンなど）を、持続的に放出されかつ連続的かつ均一な方式で、創傷に直接適用するための新規包帯を提供する。図１に示す通り、包帯１０は、上面膜１４と底面膜１５を有するエンベロープ１２；チャンバー５６；細胞生産物１７を産生する細胞１６；及び上記チャンバー内部５６に含まれる細胞栄養培地１８を含んでなる。新鮮な生理活性をもつ細胞生産物１７は底面膜１５を通って傷口に拡散する。細胞１６は細胞生産物を連続的に産生するので、傷は上記生産物を連続して受け取ることになる。包帯１０は、人間を含めた哺乳類の創傷の治癒速度を増大させることができる。包帯の使用創傷の治癒速度は、１種類の包帯から供給されるたった１種類の増殖因子によって高まる。したがって、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）又は上皮増殖因子（ＥＧＦ）のいずれか１種類での治療によって創傷の治癒速度が高まる。ただし、様々な増殖因子を創傷の治療に好ましくは逐次的に併用すると治癒速度はさらに高まる。好ましくは、例えば、３種類の異なる包帯の中の３種類の異なるタイプの細胞から産生された３種類の異なる増殖因子によって創傷を治療する。例えば、最初の包帯はＰＤＧＦ産生細胞を収容しているのが好ましく、そのＰＤＧＦが免疫反応の引き金となってマクロファージの浸出及び血管形成を促進する。その後、およそ２〜３日後に、最初の包帯を取り外して、ＴＧＦ-βを産生する細胞を収容した第二の包帯を付ける。ＴＧＦ-βは患者自身の繊維芽細胞（皮膚下層の組織の基盤となる細胞）の増殖及び／又は分化を誘起して、創傷部位におけるコラーゲン繊維の産生を増加させる。およそ２〜３日後に、第二の包帯を取り外して、上皮増殖因子を産生する細胞を収容した第三の包帯を貼付する。上皮増殖因子は患者自身の表皮細胞の増殖を促して傷口をふさぐ。別法として、１種類の包帯を使用することもでき、その場合、注射器を用いて包帯から細胞を取り除いて別の種類の細胞を注入するか、或いは複数の細胞生産物（増殖因子など）を同時に放出するように包帯を設計する。本発明の包帯は様々な創傷、例えば、褥瘡、火傷、擦過傷、さらにはもっと深い傷に使用される。さらに、この包帯は乾癬のような皮膚病の治療にも使用される。また、この包帯は皮膚移植の治癒を促したり、傷口に当てた培養角化細胞（ケラチノサイト）の「生着」を促したりするのにも使用される。この包帯は、生物への細胞生産物のデリバリーシステム（送達システム）を提供するためにも使用される。エンベロープ包帯のエンベロープ、すなわち包帯の外側部分は細胞１６及び栄養培地１８を取り囲んでそれらを封入する。エンベロープの大きさ（これによって包帯の大きさが決まる）は創傷の大きさによって決定される。エンベロープは場合によっては一枚の材料で作成することもできるが、好ましくはエンベロープは別個の上面膜１４と底面膜１５で構成される。上面膜上面膜１４は気体透過性の材料でできているのが好ましく、この材料は好ましくは疎水性であって、好ましくはウイルスや細菌などの生物の包帯への侵入を阻止する。上面膜は酸素や二酸化炭素のような気体に対して透過性であるべきであり、約０.５ミル〜約２０ミル、好ましくは約６ミルの厚さをもつ。好ましくは、上面膜１４はゲルマン・サイエンシズ社（Gelman Sciences Inc.）から「Ｚバインド（Z-Bind）」という商品名で入手可能な細孔径約０.２〜０．４ミクロンの修飾親水性ポリスルホンからなる。様々な高分子材料が上面膜用に使用され、例えばポリプロピレンやポリエチレンのような、液体不透過性で免疫反応や炎症を引き起こさないものを用いられる。或いは、上面膜は、ヘキスト・セラニーズ社（Hoechst Celanese Company）から「セルガード（Celgard）５５５０）」の商品名で入手可能なもののような材料でできていてもよい。セルガード５５５０は均一な不織ポリプロピレン繊維布とセルガード２５００（ポリエチレンフィルム）で構成されている。セルガード５５５０は細孔の大きさが０.０７５×０.２５ミクロン（直径）、多孔度４５％、水分透過速度が２４時間当り４６０ｇ/ｍ²のものである。或いは、ゲルマン・サイエンス社（Gelman Science Inc.，ミシガン州アナーバー）から入手可能な細孔径０.１ミクロンの疎水性膜である「メトリセル（Metricel，登録商標）ポリプロピレン」も適している。また、上面膜として好適な材料には、底面膜１５に好適な材料として後記で規定する材料も含まれる。上面膜の厚さは、包帯の内容物を収容するに足るものでなければならないが、患者が運動できるような柔軟性が担保されるものでなければならない。通常は約３ミルから７ミルの厚さで十分である。セルガード５５００の厚さは約３ミルであり、セルガード２５００の厚さは約１ミルである。細胞１６が「ＳＣＣ-１３」のような足場依存性の細胞である場合には、それらの細胞は増殖するための表面を必要とする。通常は、その表面は上面膜１４の内側表面１９又は底面膜１５の内側表面２０のいずれかである。膜１４及び膜１５双方の上で細胞を増殖させることも可能である。セルガードのような疎水性材料でできた上面膜１４の内側表面１９の上で細胞１６を増殖させる場合には、その表面は好ましくはプラズマ処理したものである。酸素又はアンモニアプラズマ処理のようなプラズマ処理は内側表面にアミノ基や水酸基などの親水基を与える。このような親水基が存在すると、その表面に細胞が付着し易くなる。プラズマ処理は、ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー（Becton Dickinson and Company，ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク）の一事業部であるベクトン・ディキンソン・リサーチ・センター（Becton Dickinson Resea rch Center）で行われる。プラズマ処理については、セルガードの製造業者であるヘキスト・セラニーズ社によって規定されている。メトリセル・ポリプロピレンを使用する場合には、その膜上で足場依存性細胞が増殖できるようにするために同様のプラズマ処理が必要とされるであろう。別法では、上面膜１４は疎水性フィルムとその内側表面に付着させた親水性フィルムで構成される。このような配置は、所要の疎水性を与えつつ、細胞の付着できる親水性表面が与えられる。包帯１０に剛性を与えるために、上面膜１４の外側表面２２に発泡体の層２１を付着させるのが好ましい。発泡体は従来の材料でできており、例えばセミックス・ライフ・サイエンス社（Semix Life Science Co.，ペンシルヴェニア州フラシエー）から入手可能な独立気泡ポリウレタンフィルムラミネートなどであって、好ましくは、例えばアヴェリー・スペシャルティ・テープ社（Avery Specialt y Tape Co．オハイオ州ペインスヴィル）から入手可能な「Ｍｅｄ１１８８ＴＴ」のような接着剤の塗布された或いはアヴェリー社から「５３２２Ｐ」の商品名で入手可能な淡褐色スパンレースド（spunlaced）ポリエステルフィルムの貼付されたものである。好ましくは、美的観点から発泡体２１は肌色に着色する。底面膜底面膜１５は、増殖因子や成長ホルモンのような所望の細胞生産物１７に対して透過性のものでなければならない。好ましくは、底面膜１５は、細胞培養液に感染する可能性のあるウイルス、細菌などの透過し得ないものである。底面膜１５には様々な材料を使用することができるが、セラニーズ社から「セルガード５５５０）」の商品名で入手可能なポリエチレンが好ましい。セルガードは、上面膜１４もセルガード５５００でできていて、さらに上面膜１４と底面膜１５の周辺部が融合してエンベロープ１２を形成しているような場合の具体例で好ましい。底面膜として使用する場合、セルガード５５００には、製造業者による「トゥイーン（Tween）８０」や「トゥイーン２０」のような界面活性剤で少なくともその細孔２４を「濡らす」ための特殊な処理によって透過性が付与される。膜１５の細孔２４に過剰の界面活性剤が存在すると、チャンバー５６内の細胞が若干死滅してしまうことがある。過剰の界面活性剤を除去するために、底面膜１５を１００％エタノール中に約１２時間浸漬した後、９０℃の脱イオン水中で約１０分間加熱する。底面膜１５の細孔径は、細胞生産物１７が底面膜１５を通って拡散できるような十分な大きさのものでなければならないが、一方では、それよりも大きな細菌などの物体の通過を阻止できる程度に小さくなくてはならない。細胞生産物１７がウシ成長ホルモンの場合には、細孔は約２２０００ダルトンの分子を通過させるものでなければならない。細胞生産物が上皮増殖因子の場合には、この膜は約６０００ダルトンの分子を通過させるものでなければならない。セルガード５５００膜の典型的なタンパク保持率は、アルブミン（分子量６７０００）に対しては２９％、γ-グロブリン（分子量１６００００）に対しては４０％、フィブリノーゲン（分子量３４００００）に対しては９８％である。通常は、増殖因子のような所望の細胞生産物は３００００未満の分子量を有しており、セルガード５５００膜の細孔内には保持されない。好ましくは、底面膜１５は、ゲルマン・サイエンシズ社から入手可能な細孔径約０.２〜約０.４μｍで細胞生産物１７の透過可能な「Ｚ-バインド（Z-Bind，登録商標）」という商品名の修飾親水性ポリスルホンで構成される。別の親水性ポリスルホン膜は、ミクロン・セパレーションズ社（Micron Separations Inc.）から「ウルトラセップ（UltraSep）」という商品名で入手できるものである。もう一つの好適な製品はゲルマン・サイエンスシズ社から「スポール（Supor）」という商品名で入手できるものである。スポールは約０.１〜約０.８ミクロンの細孔径を有する。スポールも親水性で、細胞生産物が拡散できる。或いは、底面膜はファルマシア・ミリポア社（Pharacia Millipore）から「ミリセル（Millic ell）」という商品名で入手可能な細胞外マトリックスタンパク質で表面を修飾したポリフッ素化ポリエチレン（テフロン（Teflon，登録商標））膜で構成される。或いは、底面膜は疎水性膜、例えばゲルマン・サイエンシズ社から入手可能な「メトリセル（登録商標）」、ミクロン・セパレーション社製の「ミクロクリアー（MicroClear）」のようなポリカーボネート膜、又はミクロン・セパレーションズ社製の「ポリピュアー（Polypure）ＰＶＣ」のようなポリ塩化ビニル膜など、で構成される。ミクロクリアーは約０.１μから約０.８μの細孔径を有しており、ポリピュアーは約０.８ミクロンの細孔径を有している。その他の親水性膜には、例えば、ゲルマン・サイエンシズ社から「ヴェルサポール（Versapor）」の商品名で入手可能な不織ナイロン上のアクリレート共重合体、並びに例えばミクロン・セパレーションズ社から「アセテートプラス（Acetate Plus）」の商品名で入手可能な膜のような酢酸セルロースが含まれる。ヴェルサポールは約０. ２〜３μの細孔径を有しており、アセテートプラスは約０.２２μ〜０.８μの細孔径を有している。疎水性膜は、その膜の細孔を細胞生産物が通過できるようにするために、最初に親水性としなければならない。これは、細孔を親水基で裏打ちするための真空下でのプラズマ処理、或いはハイポール（Hypol）のような創傷保護材（ドレッシング材）で膜を処理することによって達成される。その他の好適な膜には、ゲルマン・サイエンスシズ社（Gelman Sciences Inc. ，ミシガン州アナーバー）、ミリポア社及びアノテック社（Anotec，英国）から入手可能なガラスマトリックス膜が含まれる。底面膜１５の厚さは、包帯の内容物を収容するに足るものでなければならないが、細胞生産物１７が拡散できる程度の薄さのものでなければならない。通常、底面膜の厚さは０.５ミルから８ミルの範囲である。底面膜は、場合によっては、例えばナイロン布のような各種材料で補強される。このような補強材は薄い底面膜を支持して底面膜を壊れ難くする。任意選択要素好ましくはあるが任意選択的な事項として、コンヴァテック社（Convatec Com pany）から「デュオダーム（Duoderm）」の商品名で入手可能なハイドロコロイドフィルムや、或いはダブリュ・アール・グレース・アンド・カンパニー社（W. R．Grace and Company）製の生分解性２０００又は３０００系ポリウレタンプレポリマーでできている「ハイポールハイドロゲル（Hypol Hydrogel）」の商品名で入手可能な親水性ハイドロゲルのような、親水性の市販ゲル創傷保護材６０を、底面膜１５の底面５０に適用する。包帯を創傷に適用する前に、ハイポールハイドロゲルを水と反応させて、ゲルにする。包帯を創傷に適用すると、フィルムが創傷滲出液を吸収し、それによってフィルムが水和されてゲル６０を与える。このようなゲルは、創傷Ａと包帯１０の間の物理的クッションを与え、傷を水和し、傷からの滲出物で底面膜１５の細孔２４が閉塞するのを防止するのに役立ち、かつ疎水性の底面膜を親水性にするという幾つかの機能を果たす。細胞生産物１７はゲル６０を通して十分に拡散して傷に到達する。創傷保護材は、例えば、ナペラ社（Napera Inc.，米国ニューヨーク州ハリマン）製のハイドロゲル生体適合性接着剤創傷保護材のような、接着剤付フィルムとして入手可能であり、底面膜１５の底面５０に直接貼付することができる。別の好適な創傷保護材であるハイポールハイドロゲルは、１０％トルエン溶液に溶解してその溶液中にセルガード２５００のような底面膜１５を浸漬する。底面膜１５が飽和（約１０秒以内に起こる）したら、底面膜を取り出して乾燥する。次に、水を加えて底面膜１５の細孔内及び表面に存在するハイポールハイドロゲルと反応させて無色のハイドロゲルとする。底面膜１５はこのようにして親水性となり、細胞生産物１５が底面膜を通過できるようになる。他の好適なハイドロゲルには、例えば、バード・ホーム・ヘルス・ディヴィジョン（Bard Home Health Division）から入手可能な「ヴィジリオン（Vigilion ）」、スミス・アンド・ネフュー社（Smith and Nephew Company）から入手可能な「イントラジット・ゲル（Intrasite Gel）」、フーゲラ社（Fougera Company）から入手可能な「ゲリパーム（Geliperm）」、並びに、レクテック社（Lectech，ミネソタ州ミネトンカ）から入手可能なハイドロゲルが含まれる。好適なコロイドには、例えば、コンヴァテック社から入手可能な「デュオダーム」、ホリスター（ Hollister）社から入手可能な「リストアー（Restore）」、ケンダール（Kendal l）社から入手可能な「コンフィール（Comfeel）」が含まれる。上述の目的を達成できるものであればその他のハイドロゲル又はハイドロコロイドフィルムも適している。上記包帯の底面に付着させた創傷保護材の代りに又は追加として、創傷に創傷保護材を直接適用してその創傷保護材の上面に上記包帯をおく。市販の創傷保護材、例えばダウ・ヒッキム社（Dow Hickim Company）及びカルゴン社（Calgon C ompany）から入手可能な海藻由来の多糖類アルギン酸、アルギン酸カルシウムなどが、創傷に直接適用するのに適している。上面膜１４及び底面膜１５の縁部は漏れ止めシール２６で接合し、これらの２つの膜の間に空間すなわちチャンバー５６を与えるようにする。図１に示す封入セパレーター型具体例では、セパレーター３０は上面膜１４にも底面膜１５にも付着していない。その代わり、上面膜１４及び底面膜１５の縁部３２と３４をセパレーター３０の範囲よりも広くして、上面膜１４及び底面膜１５の縁部３２と３４を直接シールする。超音波溶接、ヒートシール、インパルス、接着剤などの慣用法を用いて漏れ止めシールを与える。ヒートシールが好ましい。上面膜１４及び底面膜１５が共にセルガードでできている場合には、これら２つの膜をヒートシールすると不透明のものが透明に変わるので、ヒートシールでもう一つの利点が得られる。セパレーター任意選択要素ではあるが、セパレーター３０を用いるのが好ましい。セパレーター３０は包帯１０に剛性と形状を与える。セパレーターは上面膜１４と底面膜１５を隔離する。セパレーター３０は、包帯１０が創傷の輪郭に適合できる程度の柔軟性をもつべきである。また、セパレーター３０は生体適合性のもので、しかも抽出物量の低いものであるべきである。セパレーター３０は、場合によっては、図１に示す通り、エンベロープ１２によって完全に取り囲まれている。これを「封入セパレーター」型具体例と呼ぶ。上面膜１４と底面膜１５の縁部３２と３４はセパレーター３０の範囲よりも広く、上面膜１４と底面膜１５が直接接合できて漏れ止めシールを与えるようにする。この具体例では、セパレーターはエンベロープ１２の中にフィットするような適当な大きさのものでなければならない。セパレーター３０は図１に示すようにエンベロープ１２内部で浮動状態におかれているか、或いは上面膜１４と底面膜１５の接合に用いられるような慣用法でエンベロープ１２に接合される。図２に示す「外辺セパレーター」型具体例では、セパレーター３０は通常は上面膜１４及び底面膜１５の縁部３２と３４の間に置かれる。次にセパレーター３０の上面３６及び底面３８の両面に接着剤を塗布し、次に上面膜１４をセパレーター３０の上面３６に接着し、底面膜１５をセパレーター３０の底面３８に接着する。ダウ・コーニング（Dow Corning，ミシガン州ミッドランド）社製の「シラスティック（Silastic）８９１-タイプＡ」という商品名のポリシロキサン系接着剤のような医用シリコーン接着剤を用いると、セパレーターと膜の間の良好な接着が得られた。セパレーター３０と膜１４及び１５が同じ材料でできている場合には、通常は膜１４及び１５とセパレーター３０をヒートシールで融着する。また、ダウ・コーニング社製の商品名「シラスティック-タイプ３５５」のような感圧性医用シリコーン接着剤も適している。医用アクリレート系接着剤も適している。外辺セパレーター型具体例では、セパレーター３０は包帯１０の外辺部４０にそって位置し、外界と接触している。セパレーター３０は場合によっては注射針を入れる部分として役立つ。例えば、完全に予備形成しておいたエンベロープ１２に細胞１６を注射することによって包帯１０を組立てるような場合、注射器をセパレーター３０を通して挿入し、細胞１６を注入し、注射器を取り外す。その後、セパレーター材は注射針によってできた穴の周りを封止する。このように、セパレーター３０を注射針を入れる部分として役立てる場合、セパレーター材は注射針を取り外した後の穴を封止できるような性質のものでなければならないが、このような材料はこの技術分野では周知であって、例えば、ポリエチレン、独立気泡ポリエチレン発泡体、ポリプロピレン、ポリウレタン、並びに好ましいものとして医用シリコーンゴムが含まれる。シリコーンゴムは、針の周りを密閉できるというその性能の面からだけでなく、その生体適合性の面からも好ましい。打抜き法（ダイスタンピングともいう）でセパレーターを作成するのに適した医用シリコーンゴムは、ヴァリシール社（Variseal Company，オハイオ州パークマン）から入手することができる。好適な独立気泡ポリエチレン発泡体は、アヴェリー社（Avery，オハイオ州ペインスヴィル）から「ＭＥＤ２１８Ａ」という商品名で市販されている。外辺セパレーター型具体例では、セパレーター３０の上面３６及び底面３８の幅は、上面膜１４及び底面膜１５との接着に適した表面積を与えるに足るものでなければならない。セパレーター３０の大きさは通常は包帯１０の大きさが増すにつれて大きくなるので、セパレーター３０の上面３６及び底面３８の幅は確定したものではない。直径４０〜５０ｍｍの包帯１０には、４ｍｍの上面３６及び底面３８が適している。セパレーター３０の高さは、少なくとも約２１ゲージの注射針が刺し通すことができるような外辺面４０を与えるに足るものであるべきである。セパレーター３０は約４ｍｍの高さを有するものが適している。上面膜１４及びセパレーター３０は、場合によっては、成形などによって、例えば、医用シリコン、ポリスルホン又はポリエチレンなどで構成された一体の連続構造体として形成される。図１６に示す別の具体例は、縁部７５を有する上面膜１４で構成されるが、これは好ましくは注型医用シリコーンゴムでできた一体部品である。好ましくは、セパレーター３０も、底面膜１５に結合した未重合医用シリコーンゴムでできている。例えば、未重合医用シリコーンゴム（重合したときにセパレーター３０を形成する）を下側の底面膜１５（好ましくはＺバインド）と共に環状型に注型する。未重合シリコーンが底面膜１５と接触するよう若干の圧力を加えることによって、医用グレードのシリコーンゴムは、重合すると、底面膜１５に結合する。セパレーター３０の縁部８５を次に縁部７５に接着するが、好ましくは縁部７５と縁部８５はシリコーンゴム接着剤で接着させる。図３に示す具体例では、セパレーター３０は２つの部材４２及び４４で構成され、その２つの部材の間にフィルム４６が挿入されている。この具体例は、細胞が足場依存性のものである場合に最も有用である。フィルム４６は細胞１１が付着及び増殖するのに適した表面を与える。細胞が足場依存性のものである場合、フィルム４６は親水性のものが好ましい。好適なフィルムには、前述の上面膜又は底面膜として使用される材料が含まれる。フィルムが栄養培地不透過性の材料でできている場合には、場合によっては、培地を循環させるためにフィルム４６に穴を開けるか、或いは培地がフィルムの周りを循環できるようにセパレーター部材４２及び４４の位置を設計する。足場依存性細胞の入った包帯に、足場依存性細胞の付着及び増殖に適した表面を与えるようなフィルムを使用する場合には、上面膜１４及び底面膜１５は細胞の付着及び増殖に適した材料でできている必要はない。その他の特色任意選択事項として、図５に示す通り、包帯１０は、底面膜１５の底面５０に付着した１つ又は複数のスペーサー４８を有する。スペーサーは創傷部から包帯を持ち上げて、包帯の底面と創傷の間に空間を与える。底面膜１５の底面５０と創傷の間の空間５２には、場合によっては、創傷保護材が充填される。細胞様々な天然の細胞又は遺伝子操作を加えた細胞系統を使用することができる。細胞は、表皮に由来する上皮細胞又は間葉細胞であるのが好ましい。このような上皮細胞又は間葉細胞が好ましいのは、これらを増殖因子遺伝子その他の遺伝子でトランスフェクションすると、所望の増殖因子以外の発現産物が創傷組織の細胞の発現産物に類似しているはずであるからである。実用的観点からは、無限増殖性（immortality）のものを選ぶのが望ましい。無限増殖性の細胞系統は、遺伝子操作面及び細胞ストックの維持の面で都合がよい。ハーバード大学医学部（Harvard Medical School）のジェイムス・ラインウォルド（James Rheinwald）博士から入手できる「ＳＳＣ-１３」と名付けられたヒト角化細胞由来の偏平上皮細胞がん腫を用いて、良好な結果が得られている。その他の「ＳＣＣ」細胞系統、例えば、ＳＣＣ-４（American Tissue Type受託番号ＣＲＬ１６２４）、ＳＣＣ-２５（American Tissue Type受託番号ＣＲＬ１６２８）及びＳＣＣ-９（American Tissue Type受託番号ＣＲＬ１６２９）なども使用することができる。その他の表層上皮細胞も使用することができる。細胞は遺伝子操作を加えて、例えば繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子-α（ＴＧＦ-α）、トランスフォーミング増殖因子-β（ＴＧＦ-β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン及びウシ成長ホルモンなど、様々な増殖因子又は成長ホルモンを産生するようにすることができる。細胞の遺伝子工学細胞に遺伝子操作を加える上でファージやウイルスのような従来のベクターが有用である。ただし、患者に腫瘍遺伝子やウイルスが放出される危険性を避けるために、ウイルス由来の腫瘍遺伝子配列もインタクト（intact）なウイルスも全く含んでいないプラスミドベクターが好ましい。本発明のこの態様に有用なプラスミドは、所望増殖因子の遺伝子が好適なプロモーター及びターミネーター信号と共に含まれるように合成される。プラスミドは、薬剤耐性を与える遺伝子（例えは抗生物質耐性付与遺伝子）などのマーカー遺伝子が含まれるように構築するのが好ましい。「Ｇ４１８」と呼ばれるネオマイシン類似物質に対する耐性を真核生物に与えるｎｅｏ^r遺伝子を用いて良好な結果が得られている。細胞は、上記プラスミドでトランスフェクションすることによって遺伝的に改変することができる。次に抗生物質に暴露して機能的にトランスフェクションされた細胞を選択する。選択細胞を増殖させて、さらに所望産物の産生レベルについて特性を調べる。最も高い増殖因子又は成長ホルモン産生レベルを示す細胞を標準的培養技術で培養を維持する。培養物から細胞の一部又はアリコートを取り出して包帯に使用する。約４０００細胞/ｃｍ²〜約７５０００細胞/ｃｍ²の濃度の生存可能な改変細胞が使用される。約２００００細胞/ｃｍ²の濃度が好ましい。膜の表面積が７ｃｍ²の包帯では、およそ０.５×１０⁶±０.１×１０⁶細胞/ｃｍ²の濃度が用いられる。改変細胞は、細胞を包帯に入れる前に照射してもよい。改変細胞は照射によって分裂能を失い、それ以降分裂／増殖しなくなる。包帯は、包帯から細胞が漏れることのないように設計されるが、包帯が偶発的に避けたり破れたりして改変細胞が漏れ出た場合でも、照射しておくことによって創傷部での改変細胞の増殖が防止できる。ただし、照射は、細胞による細胞生産物の産生を妨害しない。別法では、天然に存在し、遺伝子操作を加えていない細胞（特に、成長ホルモン又は増殖因子を産生する細胞）も使用される。培地改変細胞１６を包帯の耐用期間維持できるような細胞培養培地であればどのような市販培地も適しているが、好適な培地は、ギブコ（Bibco）社／ＢＲＬ社から市販され、カタログ９２（版権１９９１）に記載のダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco'ｓ Modified Eagle Medium）；ギブコ社から市販され、カタログ９２（版権１９９１）に記載のハム（Ham）のＦ-１２栄養培地；シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company）から市販されているケラチノサイト増殖培地（Keratinocyte Growth Media）；並びにこれらの混合液である。さらに好ましい培地はダルベッコ改変イーグル培地であり、それより好ましくないのはケラチノサイト増殖培地である。最も好ましい培地は、ダルベッコ改変イーグル培地とハムのＦ-１２栄養培地の３：１比の混合培地である。さらに、培地は培地のｐＨを維持するための緩衝剤を含んでいるべきである。多種多様な市販の緩衝剤を使用することができるが、ギブコ社から市販されているＨｅｐｅｓ緩衝剤が適している。その他の添加成分には、L-グルタミン（×１００），１０ｍｌ／ｌ培地；インシュリン（５ｍｇ/ｍｌ），１ｍｌ／ｌ培地；ヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）（１×１０^-5Ｍ），１ｍｌ／ｌ培地；ゲンタマイシン（１０００×），１ｍｌ／ｌ培地；ペニシリン／ストレプトマイシン（１００×），１０ｍｌ／ｌ培地；並びにＮＥ-ＡＡ類（１００×），１０ｍｌ／ｌ培地、が含まれる。通常、１ｌ培地当り１０ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝液を加える。また、包帯を人間に使用する場合には、培地はｐＨ変化を示すための呈色指示薬を含有しないのが好ましい。さらに、細胞培地には、細菌の増殖を抑制するためのペニシリン及び／又はストレプトマイシンのような抗生物質を加えてもよい。培地は液体培地として述べてきたが、本発明は固形及び／又はゲル化培地をも包含する。培地は、場合によっては、エンベロープ１２のチャンバー５６に入れたハイポールゲル（Hypolgel）のようなゲル化材によって維持されていてもよい。包帯の組立て包帯１０は、所望の具体的態様に応じて、様々な方法によって組立てられる。図２の外辺セパレーター具体例を組立てる方法の一つでは、上面膜１４の外辺の内側表面を、接着剤を塗布したセパレーター３０の上面にあてがう。セパレーターの表面を上向きに置いて、培地１８に懸濁した細胞１６を上面膜１４の中に入れる。約１×１０⁶個の細胞に対して、１０ｍｌの培地を加える。細胞１６を上面膜１４の内側表面１７に付着させた後、底面膜１５の縁部３４を、接着剤を塗布したセパレーター３０の底面３８に固着させる。通常、次に透過性底面膜１５が下になるように包帯１０をひっくり返して、培養皿に載せる。約６０分間平衡化させると、包帯１０はいつでも使用可能な状態となる。別の方法では、上述の外辺セパレーター具体例について述べた方法を、エンベロープ１２が完全に組立てられた後で細胞１６を包帯に入れるように変更して、包帯を組立てる。エンベロープ１２が完全に組立てられた後で、培地中に懸濁された細胞１６を注射器に入れ、注射針をセパレーター３０の側壁に刺し込む。その後、注射器の内容物を包帯１０の内部空間３０に注入する。包帯１０を患者に適用する前に、包帯１０はインキュベーターに入れて平衡化しておく。後者の組立て法は、改変細胞１６を注射器やバイアルのような包帯以外の容器に入れて医療機関に輸送する場合に適している。改変細胞１６は、必要とあれば融解した後に、包帯１０に注射すればよい。図１に示す封入セパレーター型具体例では、上面膜１４及び底面膜１５よりも少なくとも若干小さい直径又は外辺をもつセパレーター３０を上面膜１４の中に置く。次いで、適量の細胞１６を加える。細胞１６を入れた上面膜１４の上に底面膜１５を載せる。これら２つの膜１４及び１５の縁部を接合して漏れ止めシールを得る。各種の組立て方法に各種の変更を加えることができる。このような変更は、改変細胞１６の輸送上の問題やその保存寿命に起因することもある。例えば、改変細胞１６は封入凍結バイアルに入れて医療機関に送られる。融解後、所望量の改変細胞１６を取り出して包帯に注入する。或いは、改変細胞を注射器に入れて凍結し、必要なときに融解して包帯に注入してもよい。包帯の適用包帯１０を組立てて遺伝的改変細胞１６を適度に平衡化すれば、包帯１０を創傷に適用することができる。包帯１０をいったん適所に貼付すれば、包帯は約４〜５日までの予測有効耐用期間をもつ。それが経過した時点で、包帯１０を取り外すか、或いはその寿命を延ばすために包帯１０の中の培地１８を補充する。包帯１０は、セパレーター側壁３９に刺し込んだ注射針を通して使用済みの培地を吸引し、セパレーター側壁３９に刺し込んだ注射針を通して新鮮培地を注入して使用済み培地を置き換えることによって、補充することができる。ただし、上述の通り、創傷を治療する好ましい方法はひと続きの包帯を逐次適用することである。この好ましい方法では、包帯は治癒速度に応じて約３〜４日毎に取り替えられる。実施例１：ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）を産出する包帯包帯の機能を総括的に実証し、かつ１）包帯の中の生細胞によって改変細胞生産物が産生されて分泌されたこと並びに２）改変細胞生産物が包帯の細孔を通過して実際の創傷部位に到達できたことを具体的に示すためにウシ成長ホルモン細胞生産物を設計した。細胞正産物が創傷部位に拡散することを実証するのに創傷ラットを用いたので、ラット自身の細胞生産物と識別することのできるｂＧＨのような改変細胞正産物を手にすることが必要であった。ウシ成長ホルモンを産生する改変細胞を創製するために、ｐＮＥＯ-ＣＭＶ-ｂＧＨをケース・ウェスターン・リサーブ大学（Case Western Reserve Universit y）微生物分子遺伝学科（Department of Microbiology and Molecular Genetics ）のフリッツ・ロットマン（Fritz Rottman）博士から入手した。ウシ成長ホルモンをサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンターミネーターと共に保有するこのプラスミドは、以下に概略する通り合成した。ｐＮＥＯ-ｂＧＨの構築アンピシリン耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＳＶ２ＮＥＯは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシヨン（American Type Culture Collection，以下ＡＴＣＣと略す，メリーランド州ロックヴィル）から入手することができ、その受託番号は３７１４９である。ｐＳＶ２ＮＥＯを図６に示す。１００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＭｇＣｌ₂，１ｍＭ β-メルカプトエタノール及び１００μｇ/ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７.２）の標準制限酵素緩衝液中の各１０単位の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biol abs，マサチューセッツ州ベヴァリー）社から入手）で、３７℃で約２時間、プラスミドｐＳＶ２ＮＥＯを同時に消化した。１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動でプラスミドの主鎖を単離した。およそ３.５ｋｂのバンドを単離してエタノールで沈殿させた。ゲノムＤＮＡライブラリーからウシ成長ホルモンゲノムクローンλＧＨ２を単離する方法は、Woychik，Camper，Lyons，Horowitz，Goodwin & Rottmanの“Clo ning and Nucleotide Sequencing of the Bovine Growth Hormone Gene”，Nucl ．Acids Res．10：7179-7210（1982）に記載されている。約１.８キロ塩基対の全ｂＧＨ遺伝子ゲノムクローンを保有しているλＧＨ２を、３７℃の標準制限酵素緩衝液中で約２時間、約１０単位のＢａｍＨＩと約１０単位のＥｃｏＲＩで消化した。約１.８キロ塩基対（ｋｂ）のＢａｍＨＩ/ＥｃｏＲＩｂＧＨ遺伝子断片を１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動で単離して、エタノールで沈殿させた。次いで、約１.８ｋｂのＢａｍＨＩ/ＥｃｏＲＩｂＧＨ遺伝子断片とＢａｍＨＩ/ＥｃｏＲＩ消化ｐＳＶ２ＮＥＯとを１：１モル比で混合し、ニュー・イングランド・バイオラブズ社から入手したＴ４ＤＮＡリガーゼ約２単位を加えて１５℃で約２０時間かけて連結した。連結体を大腸菌ＮＭ５２２株（ＡＴＣＣから入手可能，受託番号４７０００）にトランスフェクションさせた。ただし、どんな大腸菌株を用いてもよかった。トランスフェクションは慣用法で実施し、菌体を０.１ＭＣａＣｌ₂にさらしてＯＤ₆₆₀が０.６となるまで増殖させた菌体を１００μｌ分取した。この菌体を上記連結体と４℃で３０分間インキュベートした後、３７℃に約２分間暖めた。この混合物を、次に５０μｇ/ｍｌアンピシリンを含有する寒天平板に移して、３７℃で一晩増殖させた。このプラスミドはアンピシリン耐性付与遺伝子を保有しているので、このプラスミドを取り込んだ大腸菌はアンピシリン存在下で生存してコロニーを形成する。しかる後に、コロニーを「ＬＢ培地」として知られる３ｍｌの増殖培地（その成分は、Maniatis，Fritsch，Sambrook著の“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”（1982）第440頁，コールドスプリングハーバープレス社（Cold Spring Harbor Press，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）発行，に記載）に移し、３７℃で６時間振盪培養した。細菌は集密になるまで増殖させた。上記１.８ｋｂのＢａｍＨＩ/ＥｃｏＲＩｂＧＨ遺伝子断片がプラスミドｐＳＶ２ＮＥＯのＢａｍＨＩ/ＥｃｏＲＩ部位に連結されていることを検証するために、プラスミドを単離して制限マッピングした。プラスミドの単離は、１.５ｍｌの培地を分取して、Eckertの“New Vectors for Rapid Sequencing of DNA Fr agments by Chemical Degradation”，Gene，Vol．51，247-254（1987）に記載の「ｍｉｎｉｐｒｅｐ」法を利用して行った。プラスミドを３７℃で２時間ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで同時に消化した。プラスミド断片を１％アガロースゲル上で電気泳動した。１.８ｋｂのｂＧＨ遺伝子断片及び約３.５ｋｂのプラスミド主鎖の存在から、プラスミドが適切に構築されていることが確認できた。プラスミドｐＮＥＯ-ｂＧＨを図８に示す。ｐＮＥＯ-ＣＭＶ-ｂＧＨの構築標準制限酵素緩衝液中においてプラスミドｐＮＥＯ-ｂＧＨを３７℃で約２時間約１０単位のＢａｍＨＩで消化した後、その混合液に約２単位のアルカリホスファターゼを加えてさらに２時間室温でインキュベートした。次いで、１％アガロースゲル上で電気泳動して５.３ｋｂのプラスミドを単離してエタノールで沈殿させた。別個の反応において、サイトメガロウイルスゲノムから、標準制限酵素緩衝液中にて３７℃で約２時間約１０単位の制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社から入手）で消化することによって、ＣＭＶプロモーターを保有する０.７５ｋｂ断片を単離した。その他の起源のＣＭＶプロモーターも使用することができる。１％アガロースゲル上での電気泳動によって約０.７５ｋｂのＣＭＶプロモーター断片を単離してエタノールで沈殿させた。このＣＭＶプロモーター断片を上記のＢａｍＨＩ消化して脱リン酸化しておいたｐＮＥＯ-ｂＧＨ断片と１：１のモル比で混ぜ合わせて、約２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で１５℃で約２０時間連結した。この連結体を、上記と同様に、大腸菌ＮＭ５２２株にトランスフェクションさせ、ＣＭＶプロモーター断片を保有するアンピシリン耐性クローンを単離した。このプラスミドをｐＮＥＯ-ＣＭＶ-ｂＧＨと名付けた。ＣＭＶ断片がプラスミドｐＮＥＯ-ｂＧＨに連結されていて、ＣＭＶプロモーター断片がｂＧＨ遺伝子に対して正しく配向していることを検証するために、上記と同様にプラスミドを単離した。プラスミドｐＮＥＯ-ＣＭＶ-ｂＧＨを制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで同時に消化し、プラスミド断片を１％アガロースゲル上で電気泳動した。約.５９ｋｂの断片と約.２９ｋｂの断片の存在から、プロモーターが正しく配向していることが確認できた。図９に示す通り、プラスミドｐＮＥＯ-ＣＭＶ-ｂＧＨは全ｂＧＨ遺伝子の上流にＣＭＶプロモーターを保有しており、ＣＭＶプロモーターによってｂＧＨ遺伝子の転写が調節される。ｐＮＥＯ-ＣＭＶ- ｂＧＨは、また、ＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０転写ターミネーターの調節下に置かれたネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする転写単位を別個に含んでいる。このプラスミドは（したがって、このプラスミドでトランスフェクションされた細胞も）、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びＳＶ４０ターミネーターの部分を除いてはウイルス由来配列を全く含んでいない。皮膚細胞のトランスフェクション包帯用のウシ成長ホルモン産生細胞系統を創製するために、ロットマン博士から入手したプラスミドｐＮＥＯ-ＣＭＶ-ｂＧＨを用いてＳＣＣ−１３細胞をトランスフェクションした。ＳＣＣ-１３細胞を２×１０⁵細胞/５０ｃｍ²の割合で平板に接種し、一晩かけて付着させた。翌日、細胞を１０μｇのｐＮＥＯ-ＣＭＶ- ｂＧＨプラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。細胞のトランスフェクションは、Chaney，Howard，Pollard，Salustio and Stanleyの“High Frequency Transfection of CHO Cells Using Polybrene”，Somat．Cell Mol．Genet．12 ：237-244（1986）に記載のポリブレン法という確立された方法を用いて行った。トランスフェクションして３日後に、細胞は集密に達するまで増殖した。細胞を収集して、それを１/４ずつ新しい培養皿に分けて、一晩かけて付着させた。次いで、ネオマイシンＧ４１８を２００μｇ/ｍｌの濃度で培地に加えた。Ｇ４１８を含有する新鮮培地を３日おきに培地に加えた。Ｇ４１８は真核生物細胞を死滅させる。しかし、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードしたプラスミドを取り込んだ細胞はＧ４１８に耐性となり、生存してコロニーを形成する。コロニーを６週間かけて拡張させ、しかる後にウシ成長ホルモンについての特性を調べた。遺伝的改変細胞の産生する成長ホルモンの検出は主にイムノブロット法という周知の抗体法によって行ったが、免疫組織学的方法や免疫沈降法を用いることもできる。成長ホルモン分泌皮膚細胞の特徴付け成長ホルモンを分泌する可能性があると見込まれる細胞を、成長ホルモンの分泌についてスクリーニングした。直径１０ｃｍの皿（５０ｃｍ²）の中の標準増殖培地中で細胞を集密に至るまで増殖させた。培地はダルベッコ改変イーグル培地とハムのＦ-１２栄養培地の３：１比の混合培地であり、上記の添加成分と８０ｍｌ/ｌのウシ胎児血清を含んでいた。次いで、細胞を無血清培地に移した。様々な時点（１〜２４時間）において培地を採取し、濃縮して１２％ポリアクリルアミドゲル上で分画した。分画したタンパク質をニトロセルロースにブロッティングし、抗ｂＧＨ一次抗体と共にインキュベートした後、¹²³Ｉで標識したプロテインＡ（アマシャム社（Amersham Inc.）から入手）と共に二度目のインキュベーションを行った。バンドはＸ線フィルムに露出して視認できるようにした（オートラジオグラフィー）。Ｘ線フィルムに露出した後、オートラジオグラフィー像をレーザーデンシトメーター法で定量した。試験開始後１時間という早い段階で、約０.１μｇというかなりの量の成長ホルモンが細胞から放出された。２４時間までには、１.０μｇを超えるｂＧＨが培地中に存在していた。これらの細胞の集密的培養皿１個におよそ２×１０⁶個の細胞が存在していたので、ホルモン産生レベルは極めて高い。これらの結果から、プラスミドｐＮＥＯ-ＣＭＶ-ｂＧＨという構築体が高レベルのホルモンを産生することが確認できる。包帯完成品からの遺伝子改変細胞生産物の放出封入又は外辺ガスケット型具体例にしたがって包帯を組立てた。しかる後に、細胞周囲の培地中及び包帯の外の媒質中に分泌された改変細胞生産物の量を測定することによって、包帯の効率を決定した。包帯の効率は、包帯をラットの創傷に貼付することによっても決定した。改変細胞を包帯の中に接種し、上面膜の内側表面に付着させて図２に示す包帯とした。包帯の内部には、改変細胞を維持するための無血清増殖培地が含まれていた。包帯は直径７ｃｍの円形であり、１×１０⁶個の細胞を含んでいた。包帯内の培地中及び包帯外の媒質中の成長ホルモンのレベルを１０日間にわたって毎日測定した。結果、細胞は最少培地中で１０日間は生存し続けること、並びに細胞が成長ホルモンを１日当り１.０μｇ／１×１０⁶細胞の定常速度で内部培地中及び外部媒質中に放出することを示していた。底面膜は、包帯又は細胞からの成長ホルモンの放出を妨害しなかった。包帯から媒質中への成長因子の放出を検出するために、改変細胞を無血清規定培地中に移して、１時間から１０日間インキュベートした。様々な時点で、培地を回収し、アミコン（Amicon）社のセントリコーン-１０フィルターで濃縮／脱塩した。このフィルターは分子量１０００ダルトン以上の分子を保持する。保持されたタンパク質を、０.１ｍＭＥＤＴＡを含有するＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７. ０）で洗浄して、電気泳動試料緩衝液中に溶解し、１０％アクリルアミドゲル上で電気泳動した。ｂＧＨ特異抗体によるイムノブロット法並びに放射性標識¹²⁵ ＩプロテインＡ（アマシャム社から入手）により、成長因子を免疫学的に検出した。図１５は、２４時間の間の包帯からのｂＧＨの放出を示すオートラジオグラフである。「ｓｔｄ」は０.５μｇのｂＧＨを含有する標準である。ラット創傷への適用麻酔をかけたラットの剃毛した皮膚に、医用シリコーンゴムでできた円形リングを接着した。リングの外壁は高さが０.４ｃｍで厚さが０.４ｃｍであった。リングの中央は４分の１の大きさの開口を有していて、そこが創傷の部位であった。このリングの目的は２つある。一つは創傷を準備しかつモニターすることのできる部屋を与えることであり、もう一つは創傷が収縮しないようにするためである。円形の平らな鉄片を熱湯中で７０℃に熱して皮膚の表面に３０秒間押し当てることによって創傷を作った。鉄は、創傷室の中にに容易に入れることができるように創傷室の直径よりも若干小さい直径を有していた。この装置及び方法でラットの皮膚の表面に均一な火傷を与えることができた。火傷の程度は、鉄片を押し当てる時間を変えるか或いは何度も押し当てることによって調節することができる。ラット創傷の上にゼラチン層を載せた。創傷室よりも若干小さい直径の包帯をゼラチン層の上に載せて創傷をカバーした。最後に、透明な創傷室カバーで創傷室を覆った。この創傷室カバーは、外辺部に接着剤が付いた生体適合性フィルムでできていて、この接着剤で創傷室が密封される。密封された創傷室を弾性バンドで包み、これを縫い合わせることによってその場所に保持してラットからの脱落及び包帯の損傷を防止した。この生物学的包帯の産する改変細胞生産物を、創傷室内で回収された液体中に存在する改変細胞生産物の量を測定することによって決定した。創傷領域に存在する改変細胞生産物の量はおよそ５０ｎｇであった。放出される改変細胞生産物の量は、包帯中に存在する改変細胞の濃度を増減することによって加減することができる。実施例２：ヒト上皮成長因子を産出する包帯ヒト上皮増殖因子遺伝子をコードする配列とネオマイシン耐性遺伝子を保有するプラスミドを以下の工程で作製した。プラスミド「ｐＥＣＥ」はカリフォルニア大学サンフランシスコ校（the University of Calfornia，San Francisco）のルター（Rutter）博士から入手したもので、Ellis L.，Clause E.，Morgan D.O. ，Edery M.，Roth R.A.，Rutter W.Y.の“Replacement of insulin receptor ty rosine residues 1162 and 1163 compromises insulin-stimulated kinase acti vity and uptake of 2-deoxyglucose”，Cell，45：721-732（1986）に記載の方法にしたがって合成されたものである。プラスミドｐＥＣＥを図１０に示す。次に、プラスミドｐＥＣＥを、ＳＶ４０プロモーターとＳＶ４０ターミネーターの間に位置するＳａｌＩ部位で消化した。この消化はニュー・イングランド・バイオラブズ社から入手したＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて行い、Ma niatis，Fritsch，Sambrook著の“Molecular Cloning：A Laboratory Manual” （1982）第104頁及び第405頁（コールドスプリングハーバープレス社，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー発行）に記載の方法にしたがって、標準制限酵素緩衝液中において３７℃で２時間行った。得られたＳａｌＩ末端を、次に、約２単位の仔ウシアルカリホスファターゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社から入手）と室温で３分間インキュベートして脱リン酸化した。このＳａｌＩ消化・脱リン酸化プラスミドを１％低融点アガロースゲル上での電気泳動によって精製した。ＳａｌＩ消化及びホスファターゼ処理されたｐＥＣＥプラスミドを含有する約２.９ｋｂバンドをゲルから単離し、エタノールで沈殿させた。ＥＧＦコード配列の調製図１１に示す通り、プラスミドｐＶＣＤＳ３は、ヒトＥＧＦコード配列に融合したＩｇシグナル配列（マウス免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドをコードする）を含んでいる。プラスミドｐＵＣＤＳ３は、ケース・ウェスターン・リサーブ大学微生物分子遺伝学科（オハイオ州クリーブランド）のクング（Ｋｕｎｇ）博士から入手した。このプラスミドの作製法はStern，Hare，Cecchini and Wein bergの“Construction ofａ Novel Oncogene Based on Synthetic Sequences En coding Epidermal Growth Factor”，Science 235：321-324（1987）に記載されている。プラスミドｐＵＣＤＳ３を最初に１０単位の制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社から入手）を用いて３７℃で２時間消化して、２単位のアルカリホスファターゼで３分間脱リン酸化した後、１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動で精製した。約３.０ｋｂのＸｂａＩ消化プラスミドを単離した。アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems Inc.，カリフォルニア州ヘイワード）から入手できる市販のＤＮＡ合成機を用いて、次に示す通り、内部ＳａｌＩ制限部位の両端に隣接したＸｂａＩ付着末端を有する二本鎖配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。ニュー・イングランド・バイオラブズ社から入手したポリヌクレオチドキナーゼを用いて上記オリゴヌクレオチドの５′末端をリン酸化した後、１００ｍＭＭｇＣｌ₂を含有する１００ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７）中で２５℃で２時間インキュベートしてアニーリングした。これらの工程は、上記Ｍａｎｉａｔｉｓ他の成書の第１２２-１２６頁及び第２４２頁に記載の標準法にしたがって行った。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを１：１のモル比で上記ＸｂａＩ消化ｐＵＣＤＳ３と混合して、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社から入手）を用いて１５℃で１５時間連結した。連結体を大腸菌ＮＭ５２２株にトランスフェクションした。ただし、どんな大腸菌株を用いても満足すべき結果が得られるはずである。アンピシリン耐性コロニーを選択した。ＸｂａＩ部位に新たにＳａｌＩ部位が挿入されたプラスミドを保有するクローンを単離した。このプラスミドを「ｐＵＣＤＳ３-ＳａｌＩ」と名付け、図１２に示す。このプラスミドは、２か所のＳａｌＩ部位の間にクローン化されたＩｇシグナル配列-ヒトＥＧＦ融合遺伝子を含んでいる。ＳａｌＩ消化・ホスファターゼ処理ｐＥＣＥへのＥＧＦコード配列の移入プラスミドｐＵＣＤＳ３−ＳａｌＩを３７℃で２時間ＳａｌＩで消化した。Ｉｇシグナル配列-ヒトＥＧＦ融合遺伝子を含有するインサートは約０.５ｋｂであった。これは１％低融点アガロースゲル上での電気泳動によって精製し、約０. ５ｋｂのバンドを単離してエタノールで沈殿させた。このインサートを、ＳａｌＩで消化しホスファターゼ処理しておいたｐＥＣＥと１：１のモル比で混合し、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で１５時間連結した。連結混液を大腸菌ＮＭ５２２株にトランスフェクションして、アンピシリン耐性コロニーを選択した。クローンを単離したところ、そのクローンは、ＳａｌＩ部位にクローン化されたＩｇシグナル配列-ヒトＥＧＦ融合遺伝子を含んでおり、その融合遺伝子はｐＥＣＥに存在するＳＶ４０プロモーターからの発現に対して正しく配向していた。このプラスミド「ｐＥＣＥ-ＩｇＥＧＦ」を図１３に示す。ｐＥＣＥ-ＩｇＥＧＦへのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の移入プラスミドｐＥＣＥ-ＩｇＥＧＦを標準条件下において３７℃で２時間ＢａｍＨＩ消化し、２単位のアルカリホスファターゼを標準条件下で用いて室温で３分間脱リン酸化した。このプラスミドをラウス肉種ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター及びＳＶ４０ターミネーターの調節下におかれたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有するＢａｍＨＩカセットと１：１モル比で連結した。「ＮＥＯ」と呼ばれるこのカセットの構築法は、Rorke and Eckertの“Stable exp ression of transfected human involucrin gene in various cell types；evid ence for in situ cross-linking by type I and type II transglutaminase” ，J．Invest．Dermatol．97：543-548（1991）に記載されている。上記の連結は連結緩衝液中で２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを標準条件下で１５℃で１５時間用いて行った。連結体を大腸菌ＮＭ５２２株にトランスフェクションし、アンピシリン耐性コロニーを選択した。ＢａｍＨＩカセットがｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦに連結していることを検証するために、特定のクローンを精製して、ＢａｍＨＩで消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動した。約３.２ｋｂのｐＥＣＥ−ＩｇＥＧＦ断片及び約９.０ｋｂのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子含有カセット（ＮＥＯ）の存在から、連結していることが確認できた。得られたプラスミドをｐＥＣＥ-ＩｇＥＧＦ-ＮＥＯと名付けた。ｐＥＣＥ-ＩｇＥＧＦ-ＮＥＯによるＳＣＣ-１３細胞のトランスフェクションヒトＥＧＦ産生皮膚細胞系統を創製するために、ＳＣＣ-１３ｂＧＨ細胞の創製するために用いた上述の方法と同じ方法で、プラスミドｐＥＣＥ-ＩｇＥＧＦ- ＮＥＯを用いてＳＣＣ-１３細胞をトランスフェクションした。２００μｇ/ｍｌのネオマイシンＧ４１８でネオマイシン耐性コロニーを選択した。得られたクローンを、ＥＧＦの産生及びＥＧＦの培地中への分泌について調べた。具体的には、バイオメディカル・テクノロジー社（Biomedical Technology In c.，マサチューセッツ州ストウム）から入手可能な、ヒト上皮増殖因子に対する抗体を含んだラジオイムノアッセイキットを用いて、培地中に存在するヒト増殖因子の量を求めた。２４時間後に１０⁶個の細胞からおよそ９４ｐｇが分泌された。上述の実施例では、増殖因子のような所望の細胞生産物を発現する遺伝子のプロモーターとして、ウイルス由来の高レベルの転写促進を構成する特定プロモーターを使用したが、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉種ウイルス（ＲＳＶ）及びモロニーマウス白血病ウイルスプロモーターのような他のウイルス由来プロモーターを使用することもできることを理解すべきである。例えば、重金属で誘導されるプロモーター（メタロチオネインプロモーターなど）や、ビタミンやホルモンに応答するプロモーター（レチノイン酸誘導性プロモーターなど）のような誘導プロモーターを使用することもできる。例えばアクチンのような細胞性遺伝子から単離された構成的活性プロモーターを使用することもできる。同様に、多種多様なターミネーターを使用することができ、例えば、細胞性遺伝子ターミネーター（ウシ成長ホルモンターミネーターやアクチン遺伝子ターミネーターなど）やウイルスプロモーター（ＳＶ４０ターミネーターなど）が使用できる。さらに、人工的に構築したＤＮＡ配列で全体的又は部分的に構成されるプロモーターを使用してもよい。本発明で用いたネオマイシン遺伝子マーカー以外にも、ピューロマイシンやハイグロマイシンなどの他のマーカーも使用できることも理解すべきである。遺伝子マーカーは、上記実施例で用いたものと異なるプロモーター及び／又はターミネーターと共に使用できる。好適なプロモーター及びターミネーターには、例えば、前段で述べたターミネーター及びプロモーターが含まれる。増殖因子のような改変細胞生産物を創傷に適用するための手段として包帯を説明してきたが、包帯はホルモンや抗生物質のような他の分子を産生する遺伝的改変細胞を含んでなるものであってもよい。また、包帯は、創傷の治療に有用なこのような他の分子を供給するために用いることもできるし、或いは病気及び損傷の体系的な治療のためにこのような分子を非創傷組織を通して患者に経皮的に供給するために用いることもできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ (71)出願人ザ・ユニバーシティー・オブ・アクロンアメリカ合衆国、オハイオ州 44325− 2102、アクロン、ザ・ポルスキー・ビルディング 286Ｂ (72)発明者エカート、リチャード・エルアメリカ合衆国、オハイオ州 44106、クリーブランド・ヘイツ、エヌ・エスティー・ジェームズ・パークウェイ 2225 (72)発明者スミス、ダニエル・ジェイアメリカ合衆国、オハイオ州 44224、ストゥ、ドレズラー・トレイル 4682 (72)発明者シェイファー、アーウィンアメリカ合衆国、オハイオ州 44108、ブレイトナル、コーニング・ドライブ 313

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ．細胞培養培地を収容するためのチャンバーを画定する第一の膜部材と第二の膜部材であって、ｂ．第一の膜部材と第二の膜部材の一方がその中の培養細胞の生産物に対して実質的に透過性であるもの、を含んでなる包帯。２．請求項１記載の包帯において、第一の膜部材と第二の膜部材の外辺部が接合されていることを特徴とする包帯。３．請求項２記載の包帯において、チャンバー内にセパレーターが設けられていて、当該セパレーターが第一の膜部材と第二の膜部材の接合部に隣接して位置していることを特徴とする包帯。４．請求項２記載の包帯において、第一の膜部材が上面膜であり、第二の膜部材が創傷の上に位置すべき底面膜であることを特徴とする包帯。５．請求項４記載の包帯にして、上面膜と底面膜の外辺部の接合部に隣接して、上記チャンバー内におかれたセパレーターをさらに含んでなることを特徴とする包帯。６．請求項４記載の包帯にして、上面膜及び底面膜の各々に接合したセパレーターをさらに含んでなることを特徴とする包帯。７．請求項４記載の包帯において、上面膜の外辺部をセパレーターの上面に接合し、かつ底面膜の外辺部をセパレーターの底面に接合することによって、上面膜と底面膜の外辺部が接合していることを特徴とする包帯。８．請求項４記載の包帯において、上面膜がポリエチレン又はポリプロピレンからなることを特徴とする包帯。９．請求項４記載の包帯において、上面膜がポリスルホンからなることを特徴とする包帯。１０．請求項４記載の包帯において、底面膜が不織ポリエチレン又はポリプロピレン繊維からなることを特徴とする包帯。１１．請求項４記載の包帯において、底面膜がポリスルホンからなることを特徴とする包帯。１２．請求項４記載の包帯において、底面膜がポリスルホンからなり、かつ上面膜がシリコーンゴムでできていることを特徴とする包帯。１３．請求項４記載の包帯にして、チャンバーを横断して張られていて上記セパレーターに結合したセパレーターであって、かつ細胞の付着を促す親水性表面をもつフィルムを含んでなるセパレーターをさらに含んでなることを特徴とする包帯。１４．請求項１又は請求項４記載の包帯にして、当該包帯と創傷との間に間隔をおくための手段をさらに含んでなることを特徴とする包帯。１５．請求項１又は請求項４記載の包帯にして、チャンバー内に収容された細胞培養培地をさらに含んでなることを特徴とする包帯。１６．請求項１又は請求項４記載の包帯において、細胞培養培地がチャンバー内のゲル化材に含まれていることを特徴とする包帯。１７．請求項１又は請求項４記載の包帯にして、チャンバー内に収容された細胞を含んだ細胞培養培地をさらに含んでなることを特徴とする包帯。１８．創傷を治療するための方法にして、当該創傷に請求項１７記載の包帯を適用することを特徴とする方法。１９．請求項１８記載の創傷を治療するための方法にして、創傷と包帯の間に創傷保護材を適用する段階をさらに含んでなることを特徴とする方法。２０．創傷に請求項１７記載の複数個の包帯を逐次適用することからなる、創傷を治療するための方法にして、当該包帯の少なくとも１つが他の少なくとも１つの包帯によって生産される創傷治癒因子とは異なる創傷治癒因子を生産することを特徴とする方法。２１．細胞を収容するための封入チャンバーを有するエンベロープを含んでなる包帯にして、当該エンベロープは第一の透過性部分と第二の透過性部分によって部分的に画定されており、第一の透過性部分は約５０００００ダルトン以下の分子量の分子に対して透過性であり、第二の透過性部分は酸素及び二酸化炭素に対して透過性であることを特徴とする包帯。２２．包帯にして、ａ．上面膜及び透過性底面膜及びそれらの間のチャンバーを含んでなるエンベロープであって、上面膜が底面膜と連結して漏れ止めシールを与えているエンベロープ、ｂ．細胞生産物を産生する細胞であって、チャンバー内に入っている細胞、及びｃ．細胞を維持するための培地であって、チャンバー内に入れられていて、細胞を取り囲む培地を含んでなる包帯。２３．請求項２２記載の発明において、上面膜と底面膜の間に挿入されたセパレーターをさらに含んでなることを特徴とする発明。２４．請求項２３記載の発明において、上記の両方の膜がさらに外辺部を含んでいて、セパレーターが上面膜の外辺部と底面膜の外辺部の間に挿入されていることを特徴とする発明。２５．請求項２２記載の発明にして、包帯と創傷との間に間隔をおくためのスペーサーをさらに含んでなることを特徴とする発明。２６．請求項２２記載の発明にして、上面膜の上に、包帯を支持及び保護するための可撓性材料の層をさらに含んでなることを特徴とする発明。２７．請求項２２記載の発明にして、底面膜の底面側に配置されたフィルムをさらに含んでなることを特徴とする発明。