JPH08510900A

JPH08510900A - Modified oligonucleotides with improved anti-influenza activity

Info

Publication number: JPH08510900A
Application number: JP6522317A
Authority: JP
Inventors: アグラワル、スディール; タン、ジン−ヤン; パドマプリヤ、アベイシンゲ
Original assignee: ハイブライドンインコーポレイテッド
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-30
Publication date: 1996-11-19
Also published as: CA2159350A1; EP0693123A1; CN1124980A; WO1994023028A2; WO1994023028A3; AU6527094A; NZ263985A

Abstract

(57)【要約】本発明は、これまでに明らかにされてきたオリゴヌクレオチドに比べて、インフルエンザウイルスの複製または増殖阻止能がいっそう大きい抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドを提供する。このより大きな効力は、キメラまたはハイブリッドのバックボーン、ヌクレアーゼ抵抗性をもたらす末端キャップ構造または自己相補的領域あるいはそれを組み合わせ構造特性からくる。 (57) [Summary] The present invention provides an anti-influenza modified oligonucleotide having a greater ability to inhibit the replication or growth of influenza virus than the previously disclosed oligonucleotides. This greater potency results from chimeric or hybrid backbones, end-cap structures or self-complementary regions that confer nuclease resistance or their combined structural properties.

Description

【発明の詳細な説明】改良された抗インフルエンザ活性を有する修飾オリゴヌクレオチド本願は、1992年７月２日出願の出願番号07/909,069の一部継続出願である。同時に1992年７月23日出願の出願番号07/918,239の一部継続出願でもある。また、 1991年５月10日出願の出願番号07/698,568の一部継続出願でもある。発明の背景産業上の利用分野本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明はインフルエンザウイルスの複製または増殖を阻害する能力のある修飾オリゴヌクレオチドに関する。関連技術の要約インフルエンザAウイルスは、RNAのマイナスストランドから成るセグメントゲノムを有する膜封入ウイルスである。A型およびB型では一本鎖RNAの８つのセグメントに、またC型では７つにセグメントに10個のインフルエンザウイルス遺伝子が存在する。セグメントの大きさは様々で（長さが890〜2341ヌクレオチド）、それぞれが異なるmRNA合成の鋳型となっている。インフルエンザウイルスビリオンには、これらの鋳型からmRNAを合成するのに必要なウイルス特異なRNAポリメラーゼがあり、この特異なポリメラーゼがないと、インフルエンザウイルス RNAのマイナスストランドは感染力を持たない。mRNAの転写は、インフルエンザウイルスmRNAポリメラーゼが細胞mRNAまたはmRNA前駆体の5'末端から12〜15ヌクレオチドを取ったときに始まり、借用したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する。一般に、このプロセスにより作られたmRNAは１つの蛋白しかコードしない。M RNAおよびNS RNAは、スプライシングされたmRNAもコードし、その結果これらの２つのセグメントのそれそれについて異なる２種類の蛋白が生成される。インフルエンザウイルスはヒトおよび動物（たとえばブタ、鳥類、ウマ）に感染し、急性呼吸器疾患の原因になる。インフルエンザウイルスに有効なワクチンを生み出そうとこれまで数多くの試みが成されてきた。しかし、特に長期的に見た場合には、完璧に成功した例はまったくない。これは、少なくとも一部はインフルエンザウイルスのゲノムがセグメントゲノムであるという特徴に起因し、この特徴のためにセグメントを再構築することによって、多数の形のウイルスが存在できる。たとえば、動物とヒトのインフルエンザウイルスの間でRNAセグメントが交換されうることが示唆されているが、これによって両集団に新たな抗原サブタイプが導入されることになる。したがって、長期にわたるワクチン接種の方法は、新しいサブタイプが発生する（抗原「シフト」が起こる）ために失敗している。さらに、ウイルスの表面蛋白の血球凝集素（ヘマグルチニン）およびノイラミニダーゼは、常に抗原がわずかずつ変化している（抗原「ドリフト」）。このようにきわめて多様であるという事実から、特定のインフルエンザウイルスに対して開発された特異的免疫が新しい変異株に対する保護に役立たない理由が説明できる。そこで、これに代わる抗ウイルス戦略が必要となる。B型およびC型のインフルエンザウイルスはA型に比べて臨床上の疾患をもたらすことは少ないが、化学的抗ウイルス剤はこれらのウイルスが原因で生じる感染を抑制するのに役立つはずである。したがって、インフルエンザウイルスの複製および増殖を阻止する能力のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発には大きな関心が寄せられる。このようなアンチセンスオリゴヌタレオチドは、インフルエンザウイルスの複数の株に存在するインフルエンザウイルスの保存領域にハイブリダイズするよう設計できるので、様々な株のインフルエンザに対する幅広い防御能を提供できるものとして有望である。アグラワルらによる米国特許第5,194,428号では、本明細書でも参考文献として引用しているが、インフルエンザPB1ポリメラーゼ遺伝子にハイブリダイズすることによりインフルエンザの複製を阻止する能力のある一定の修飾ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを開示している。カウサートら（WO92/03454（1992年））は、インフルエンザポリメラーゼ1、2、3、または血球凝集素、核蛋白、ノイラミニダーゼ、マトリックス蛋白、あるいは非構造的蛋白遺伝子に、もしくは様々なスプライシング結合部位やパッケージング配列にハイブリダイズすることによって、インフルエンザウイルスの増殖を阻止するアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。ペダーソンらによる米国特許第5,149,797号および第5,XXX，XXX号（出願番号0 7/839,472、1992年12月24日）は、本明細でも参考として引用するが、リボヌクレアーゼＨ不活性化セグメントに隣接してリボヌクレアーゼＨ活性化セグメントを有するキメラ混合リン酸バックボーンのオリゴヌクレオチドを開示している。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは抗インフルエンザ治療薬として有望と思われる。しかし、このような薬剤のいずれを使用する場合でも、インフルエンザウイルスの複製または増殖阻止効力がさらに大きい改良された薬剤が今後もなお必要とされる。このような改良されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、抗インフルエンザ治療薬として使用するだけでなく、インフルエンザウイルスゲノムのどの領域が幅広い交差株阻害のための最もよい候補となるかを調べるのにも有用であろう。発明の概要本発明は、これまでに知られているオリゴヌクレオチドに比べてインフルエンザウイルスの複製または増殖の阻止能がより大きな修飾オリゴヌクレオチドを提供する。これらの修飾オリゴヌクレオチドは、細胞内のインフルエンザウイルス核酸にハイブリダイズするためにそのようなインフルエンザウイルスの必須核酸に対して十分に相補的な核酸配列を有することを特徴とする。好ましい実施例では、必須の核酸はPB1、2、3のポリメラーゼ遺伝子、または血球凝集素、核蛋白、ノイラミニダーゼ、マトリックス蛋白、あるいはインフルエンザの非構造的蛋白遺伝子、もしくは様々なスプライシング結合部またはパッケージング配列の一部である。様々な実施例で、本発明による修飾オリゴヌクレオチドは１ないし複数のタイプの修飾ヌクレオチド間結合を有する。好ましい実施例では、修飾ヌクレオチド間結合の少なくとも一部は、ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合である。特定の好ましい実施例では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を、他の修飾結合、すなわちホスホジエステルでない結合を有する修飾オリゴヌクレオチド中に含んでいる。これらのその他の修飾ヌクレオチド間結合は、アルキルホスホネート結合またはアルキルホスホノチオエートであることが望ましい。これらの修飾ヌクレオチド間結合は、オリゴヌクレオチドの一端もしくは両端、あるいはその近傍に存在することが最も望ましい。本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドのさらに別の好ましい実施例では、１ないし複数の修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドに、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合が存在する。この修飾ヌクレオシドは2'−Ｏアルキルヌクレオシドであることが好ましい。修飾ヌクレオシドの少なくとも一部がオリゴヌクレオチドの一端もしくは両端、あるいはその近傍に存在するのが最も好ましい。本発明に基づくさらに別の好ましい実施例では、一端もしくは両端にエキソヌクレアーゼ抵抗性賦与キャップ構造を有するオリゴヌクレオチドに、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合が存在する。このキャップ構造は少なくとも分子の3'末端に存在するのが好ましい。このキャップ構造は、本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドのあらゆる実施例の一端もしくは両端にも存在することがあり、少なくともオリゴヌクレオチドの3'末端に存在するのが好ましい。本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドのさらに別の好ましい実施例では、一端もしくは両端あるいはその近傍にヌクレオチドによる自己相補的領域を含有する自己安定型のオリゴヌクレオチドで、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合が存在し、できれば少なくとも3'末端もしくはその近傍に存在するのが好ましく、それによりオリゴヌクレオチドはヘアピン状構造を形成する。本発明に基づくこれらの修飾オリゴヌクレオチドは、インフルエンザの複製または増殖を阻止するのに、既存のオリゴヌクレオチドまたは同一遺伝子にハイブリダイズする修飾オリゴヌクレオチドのいずれよりも大きな効力をもたらす。本発明に基づくこれらの修飾オリゴヌクレオチドは、いずれもオリゴヌクレオチドの糖または塩基に対する他の修飾も任意選択として含めることができ、また、やはり任意選択で、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエートの各結合以外の追加のヌクレオチド間結合を有するようにすることができる。図面の簡単な説明図１は、インフルエンザウイルス PB1（ポリメラーゼ1）のヌクレオチド配列を示し、この配列に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製できる。図２は、本発明に基づいた自己安定型抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドを示す。図３は、本発明に基づく自己安定型抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドの別の形式を示す。図４は、オリゴヌクレオチドにエキソヌクレアーゼ抵抗性をもたらす特定の好ましいキャップ構造を示す。図５は、5'-キャップ末端、3'-キャップ末端、あるいは末端がキャップされていないオリゴヌクレオチドに関するin vivoでの核酸減成（nucleolytic degradation）パターンを示す。図６は、自己安定型オリゴデオキシヌクレオチドホスホジエステルおよび非自己安定型オリゴデオキシヌクレオチドホスホジエステルについてのDNAポリメラーゼＩ 3'-エキソヌクレアーゼ減成（degradation）パターンを示す。図７は、自己安定型オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートおよび非自己安定型オリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートについてのDNAポリメラーゼＩ 3'-エキソヌクレアーゼ減成パターンを示す。好ましい実施例の詳細な説明本発明は、抗インフルエンザ活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。インフルエンザに対するin ｖivo活性を有する修飾オリゴヌクレオチドのことを、ここでは抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドという。本発明は、これまでに知られているオリゴヌクレオチドまたは同一遺伝子にハイブリダイズする修飾オリゴヌクレオチドに比べてインフルエンザウイルスの複製または増殖の阻止能がより大きな修飾オリゴヌクレオチドを提供する。本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドは、以下の好ましい実施例それぞれでさらに詳しく述べるような特異的な好ましい特徴を持っている。これらの特徴に加えて、本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドは、任意選択で追加のリボヌクレオチド、2'-置換リボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドモノマー、あるいはそのいずれも持つことができ、これらのいずれもこれまでの技術で知られているヌクレオチド間結合のいずれをも含むことができ、5'-3'結合を介して結合することができる。このような修飾オリゴヌクレオチドは、任意選択でホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、炭酸エステル、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホンヌクレオチド間結合のいずれかまたはすべてを有することが好ましい。当業者であれば、これらのヌクレオチド間結合のいずれかを有するオリゴヌクレオチドの合成はこの分野に精通した者はよく知っていることを認めるであろうし、これについてはウルマンとペイマンによるChemical Reviews 90巻543〜584頁（1990年）およびシュナイダーとバンナーによるTetrahedron Lett．31巻335頁（1990年）の文献に示されている。本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドは、全部で約６から約100のモノマーを含有することが望ましい。このような修飾オリゴヌクレオチドは、任意選択で修飾核酸塩基または糖、あるいはその両者を含有することができ、またジアミン、コレステリルまたはその他の親油性基などの追加置換基を持つことができる。本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドの様々な好ましい実施例を、以下の表Ｉに示す。これらの実施例はいずれもインフルエンザPB1ポリメラーゼ遺伝子の同一領域からのヌクレオチド配列を有するが、当業者であれば、インフルエンザウイルスの他の必須核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの抗インフルエンザ活性は、そのオリゴヌクレオチドに本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドの好ましい実施例の構造的特性を組み込むことによってさらに強化することも可能であることがわかるだろう。本発明の目的では、相補的とは、生理学的条件下で必須核酸配列にハイブリダイズする配列を有することを意味する。インフルエンザウイルスの必須核酸配列とは、インフルエンザウイルスの複製または増殖に必要な核酸配列のことをいう。このような必須核酸配列は、インフルエンザウイルスの既知のどの株からのものでもよい。たとえば、このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書でも参考として引用している米国特許第 5,194,428号の表Ｉに示されているように、インフルエンザPB1ポリメラーゼ遺伝子（ポリメラーゼ１）からの別の配列を有することもできる。実際、インフルエンザPB1（ポリメラーゼ１）遺伝子のどの配列［SEQ．ID No.1］でも（図１参照）、本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドの基礎となる。この代わりに、他のインフルエンザ配列または遺伝子からの配列を使用することもできる（表II参照）。実際的な問題としては、本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドの好ましい実施例の構造的特性は、細胞中でインフルエンザウイルスのいずれかの必須核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を有するどのアンチセンスオリゴヌクレオチドの抗インフルエンザ活性も増強するはずである。本発明に基づく修飾オリゴヌクレオチドの好ましい実施例それそれについて、以下に個別にさらに詳しく説明する。最初の好ましい実施例では、本発明に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドの領域（「ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート領域」）を１ないし複数有し、さらにアルキルホスホネートヌクレオチド間結合により結合されたヌクレオチドの領域（「アルキルホスホネート領域」）を１ないし複数有する混合バックボーンキメラオリゴヌクレオチドの形である。この実施例では、少なくとも１つのアルキルホスホネート領域は、オリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端、あるいはその両者、もしくはそれらの近傍でヌクレオチドを有していることが好ましい。本発明の目的では、「オリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端もしくはその近傍」というときには、オリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端から約５ヌクレオチド以内に少なくとも１個のヌクレオチドを有することをいう。アルキルホスホネート領域は、アルキルホスホネート結合により結合された約２から約１０の隣接するヌクレオチトから成るのが好ましい。ホスホロジオエートまたはホスホロジチオエート領域は、ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合によって連結される最低３から最高約１００までの隣接するヌクレオチドから成るのが好ましい。本発明のこの実施例に基づくこのインフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドの例を、表ＩにCMPD Aとして示す。本発明のこの実施例に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドは、固相法によって、あるいはその代わりにホスホロチオエート領域についてはＨ−ホスホネート化学品および硫黄酸化、アルキルホスホネート領域についてはアルキルホスホンアミデート化学品によって合成できる。好ましいＨ−ホスホネート法についてはアグラワルらが米国特許第5,149,798号で明らかにしており、この教示を参考として本明細書に引用する。アルキルホスホンアミダイト化学品は、アグラワルとグッドチャイルドによりTetrahedron Lett．28巻3539-3542頁（1987 年）に述べられているようによく知られた技術である。ホスホロジチオエート含有オリゴヌタレオチドの合成についても、本明細書でも引用する米国特許第5,15 1,510号に明らかにされているようによく知られた技術である（その他、たとえばマーシャルとカルサーズによるScience 259巻1564〜1570頁（1993年）およびそこでの引用文献などを参照のこと）。２番目の好ましい実施例では、本発明に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合によって結合されたヌクレオチドの領域（「ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート領域」）を１ないし複数有し、さらにアルキルホスホノチオエートまたはアリールホスホノチオエートのヌクレオチド間結合により結合されたヌクレオチドの領域（「アルキルホスホノチオエート領域」）を１ないし複数有する混合バックボーンキメラオリゴヌクレオチドの形である。この実施例では、少なくとも１つのアルキルホスホノチオエート領域は、オリゴヌクレオチドの 5'末端または3'末端、あるいはその両者、もしくはその近傍にヌクレオチドを有することが好ましい。アルキルホスホノチオエート領域は、アルキルホスホノチオエート結合により結合された約２から約１０の隣接するヌクレオチドから成るのが好ましい。ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート領域は、ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合によって接続される最低３から最高約１００までの隣接するヌクレオチドから成るのが好ましい。本発明のこの実施例に基づくこのインフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドの例を、表ＩにCMPD B、CMPD EおよびCMPD Fとして示す。本発明のこの実施例に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドは、固相法によって合成するか、あるいはその代わりに合成すべき領域それそれについての化学物質によって合成する。ホスホロチオエート領域またはホスホロジチオエート領域は、最初の実施例について述べたようにして合成する。アルキルホスホノチオエート領域は、２またはそれ以上のヌクレオシドをアルキルホスファイト結合によりカップリングさせてから、アルキルホスファイト結合を酸化的にチオレート化してアルキルホスホノチオエート結合をもたらすことにより合成する。この合成手順については、実験例１で詳しく述べる。３番目の好ましい実施例では、本発明に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドの領域（「デオキシリボヌクレオチド領域」）およびリボヌクレオチドまたは2'-置換リボヌクレオチドの領域（「リボヌクレオチド領域」）を有するハイブリッドオリゴヌクレオチドの形である。約１からおよそすべてにわたるヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合であることが好ましい。2'-置換リボヌクレオチドとして望ましいのは、ハロ、アミノ、アルキル、アリールまたはより低級のアルキル（1〜6炭素原子）で置換されたリボヌクレオチド、中でも2'-OMe-リボヌクレオチドである。できれば、リボヌクレオチド領域の少なくとも一部はオリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端、あるいはその両者もしくはその近傍に存在することが好ましい。さらに、リボヌクレオチド領域は、それそれ約２から、できれば約４から約１００までの隣接するリボヌクレオチドまたは2'-置換オリゴヌクレオチドあるいはその両者から成ることが最も好ましい。デオキシリボヌクレオチド領域は任意選択であり、また存在する場合には約１から約１００の隣接するデオキシリボヌクレオチドを有する事ができる。本発明のこの実施例に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドの例は、表ＩではCMPD C、CMPD D、CMPD G、CMPD H、CMPD K、CMPD MおよびCMPD Nとして示される。本発明のこの実施例に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドは、固相法によって合成されるのが標準的であり、できればデオキシリボヌクレオチド領域についてはデオキシヌクレオチドＨ−ホスホネートを使い、またリボヌクレオチド領域についてはリボヌクレオチドまたは2'-置換リボヌクレオチドＨ−ホスホネートを使ったＨ−ホスホネート法により合成するのが好ましい。４番目の好ましい実施例では、本発明に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドは、5'末端または3'末端あるいはその両者にオリゴヌクレオチドに対するエキソヌクレーゼ抵抗性を賦与するキャップ構造を有するオリゴヌクレオチドの形である。このような修飾オリゴヌクレオチドは、１からおよそすべてまでの修飾（非ホスホジエステル）ヌクレオチド間結合も有することが好ましい。好ましいキャップ構造としては、図４に示すようなものや、低級アルキル（C1〜C12）基またはアルコール基がある。好ましい修飾ヌクレオチド間結合としては、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、炭酸エステル、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、スルホン、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートの各結合がある。本発明のこの実施例に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドは、現在の技術でよく知られている手法に従って合成される（たとえば、ウルマンとペイマンによるChemical Review 90巻543〜584頁（1990年）；シュナイダーとバンナーによるTetrahedron Lett．31巻335頁（1990年）を参照）。3'末端にキャップ構造を有するオリゴヌクレオチドについては、キャップ構造を可逆的に固相担体に付着させてから、合成スキームにおける最初のヌクレオチドモノマーと連結させる。5'末端にキャップ構造を有するオリゴヌクレオチドについては、合成スキームの最後のヌクレオチドモノマーを付加した後でオリゴヌクレオチドの末端にキャップ構造を連結させる。５番目の実施例では、抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドと分子内でハイブリッドし、エキソヌクレアーゼ抵抗性のヘアピン状構造を形成するような自己相補的領域を持たせてることにより自己安定型状態にする。本発明のこの実施例に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドは、一般に、インフルエンザ・ハイブリダイジング領域と自己相補的領域との２つの領域を有することを特徴とする。インフルエンザ・ハイブリダイジング領域は、インフルエンザウイルスの必須核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を有している。この領域は、約６から約１００ヌクレオチドであるのが好ましい。本発明のこの実施例の１つの形を図２に示す。この形では、インフルエンザ・ハイブリダイジング領域は長方形がつながったもので示してあり、自己相補的領域は円がつながったもので示してある。標的インフルエンザのメッセンジャーRAN分子中の相補的核酸配列は、ダイヤ形をつなげたもので示してある。ヌクレオチド間の水素結合は点で表してある。オリゴヌクレオチドは安定状態にある。すなわち、標的ハイブリダイジング領域と自己相補的領域の間の塩基対によって、または自己相補的領域内の相補的配列の間の塩基対によって、あるいはこの両者によってエキソヌクレオチド減成に対する抵抗性が賦与されている。このオリゴヌクレオチドが相補的核酸配列を有するインフルエンザ核酸分子に出会うと、オリゴヌクレオチドのインフルエンザ・ハイブリダイジング領域とオリゴヌクレオチドの自己相補的領域との間の塩基対が切断され、オリゴヌクレオチドのインフルエンザ・ハイブリダイジング領域と核酸分子の相補的核酸配列との間の塩基対で置き換えられる。このように塩基対が切断され置換されるのは、標的核酸配列と標的ハイブリダイジング領域との間のハイブリッドによって形成された分子間塩基対構造のほうが、自己相補的オリゴヌクレオチドによって形成される分子内塩基対構造よりも熱力学的にさらに安定しているからである。本発明の本実施例に基づくオリゴヌクレオチドの第２の形は、第１の形と同じように働くが、自己相補的塩基対としては異なる構造を形成する。この代替形態は、図３に示すようなハンマー様構造を形作る。この形態では、自己相補的領域にはその自己相補的領域内の他のオリゴヌクレオチド配列と塩基対を作ることのできるオリゴヌクレオチド配列が入っている。自己相補的領域には、インフルエンザ・ハイブリダイジング領域に相補的なオリゴヌクレオチト配列もある。本発明に基づく自己安定型オリゴヌクレオチドの第２の重要な意味を持つ領域は、自己相補的領域である。自己相補的領域には、オリオヌクレオチド内の他のオリゴヌクレオチド配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列がある。これらの他のオリゴヌクレオチド配列は、インフルエンザ・ハイブリダイジング領域内または自己相補的領域内にあり、あるいは両領域にまたがることもある。相補的配列は塩基対を作り、図２に示すようなヘアピン構造、あるいは図３に示すようなハンマー様構造を形成する。ヘアピン構造またはハンマー様構造はいずれも、ヘアピン構造の場合には図２に示すように塩基対を作っていないヌクレオチドによるループを持つことができ、ハンマー様構造の場合には図３に示すようにそのようなループがまったくないこともある。自己相補的領域を含む分子内ハイブリダイゼーションにより形成される塩基対の数は様々であるが、3'末端にエンドヌクレアーゼが接近できないように二本鎖構造を維持するのに充分な数でなければならない。一般に、このような二本鎖構造を維持するには４対以上の塩基対が必要になる。好ましい実施例では、自己安定型オリゴヌクレオチドに約１０の分子内塩基対が形成されており、１０の塩基対は連続していて、3'-末端の大部分のヌクレオチドを含んでいる。もちろん分子内塩基対はオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドを含むほど広がることもできる。約５０以下のヌクレオチドから成る自己相補的領域を含むことが好ましい。本実施例に基づくオリゴヌクレオチドは、第４の実施例について述べるように、１からほとんどすべての修飾ヌクレオチド間結合を有することがある。できればインフルエンザ・ハイブリダイジング領域または自己相補的領域の少なくとも一方に、また最も好ましくはこの両方に、ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合あるいはその両者によって連鎖された約２からほぼすべてのヌクレオチドが入っていることが望ましい。本発明の本実施例に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドの例を、表ＩにCMPD Oとして示す。当業者であれば、上記の種々の好ましい実施例の特性を組み合わせて、よりいっそう大きな抗インフルエンザ能を有する追加の実施例を実現できることがわかるだろう。したがって、本発明は、キメラ特性、ハイブリッド特性、キャップ構造、自己安定特性といったいずれもここで述べた特性のあらゆる可能な組み合わせを使った抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドを考えている。本発明の好ましい実施例のいすれも、同一のインフルエンザmRNAにハイブリダイズする現在の技術におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドに比べてインフルエンザの複製または増殖を阻止する能力が大きい。たとえば、米国特許第5,194, 428号は、インフルエンザウイルスの複製を阻止する修飾オリゴヌクレオチドについて明らかにしている。その修飾オリゴヌクレオチドの中には、インフルエンザPB1（ポリメラーゼ1）遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドホスホロチオエートがある。本研究では、インフルエンザPB1ポリメラーゼ遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドホスホロチオエートのインフルエンザウイルス複製阻止能を、本発明の種々の好ましい実施例と比較して調べた。そこで調べた本発明の実施例のいずれでも、抗インフルエンザ活性の効力は驚くほど向上しており、これは同一遺伝子上の同一部位に結合するオリゴヌクレオチドホスホロチオエートと相関している。下記の表IIIに示すように、本発明に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドを用いた場合には、50％阻害濃度（IC₅₀）は２倍から１５倍近くになった。このようなオリゴヌクレオチドは、様々な目的に活用できる。まず第１に、どのインフルエンザ遺伝子のどの部位が、インフルエンザウイルスの複数の株に対して幅広い有効性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチヂの最もよい基盤となるかを調べる試験で利用できる。第２に、どの構造特性あるいはその組み合わせが、in v itroおよびin vivoでインフルエンザに対して最も大きな効果をもたらすかを明らかにするのに利用できる。さらに、このようなオリゴヌクレオチドはインフルエンザ感染の治療薬としても有用である。このような治療では、オリゴヌクレオチトは腹腔内投与、鼻腔内投与、経口投与または直腸投与ができる。このようなオリゴヌクレオチドは、できれば体重１kgあたり約１mgから約５０mgの濃度で投与するのが好ましい。以下に挙げる例は、本発明の好ましい実施例を個別にさらに詳しく示すためのもので、これらに限定しようとするものではない。実験例１メチルホスホネート領域およびホスホロチオエート領域を有するキメラオリゴヌクレオチドの合成メチルホスホネートおよびホスホロチオエート領域を有するキメラオリゴヌクレオチドを、メチルホスホネート領域についてはメチルホスホンアミダイトを、ホスホロチオエート領域についてはヌクレオシドＨ−ホスホネートを使って合成した。メチルホスホンアミダイトの台成は次のようにした。窒素下で１５℃エーテル中でメチルジクロロホスフィン（51ml）とジイソプロピルアミン（102mmol）を反応させて、メチルクロロ-N, N-ジイソプロピルアミノホスフィンを合成した。濾過して塩を除き、溶媒を蒸発させた後、¹Hおよび³¹P NMRで特徴づけられる油としてメチルクロロ-N,N-ジイソプロピルアミノホスフィン（48mmol、理論値の95％）を得、これは−20℃で８週間以上にわたって安定であった。この成生物をN,N-ジイソプロピルエチルアミンを含有するジクロロメタン中で通常の保護をしたヌクレオシドと室温で10〜20分間反応させた。水性の後処理をし、−30℃から−40℃でペンタンを使って酢酸エチルから沈殿させると、白色固体成生物が80〜90％の収率で得られた。この生成物は、CH₂Cl₂:EtOAc:Et₃N（9:9:2）でシリカの薄層クロマトグラフィー（ｔｌｃ）で精製し、¹Hおよび³¹P NMRで調べた。これらの成生物を、標準ホスホルアミダイト試薬に用いたのと同一の条件およびプログラムにより自動化されたDNA合成装置で使用した。ヌクレオチドを33mg/ mlの濃度でアセトニトリルに溶解し、テトラゾールで活性化した。カップリング時間を１分間として、あらかじめパックしたCPG担体で合成を行った。ジメトキシトリチル定量分析によってカップリング効率を追跡したところ、ホスホルアミダイトを使って並行実施していた対照合成と同じであることがわかった。カップリングの後、成生物を脱トリチル化し、室温で２時間かけてNH₄OHを使って担体から切り離し、エチレンジアミン：エタノール（1:1）を使って室温で４時間脱ブロックした。この塩基処理によって、HPLCで定量分析したモデル試験において、ヌクレオシド間ホスホネート基の約１％が減成した。Ｈ−ホスホネート合成は、本明細書でも参考として引用している米国特許第5, 149,798号に例示されている方法で行った。それからＨ−ホスホネートを二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン（9:9:1 vol/vol）中で0.2M硫黄で酸化してホスホロチオエートに変換した。実験例２メチルホスホノチオエート領域およびホスホロチオエート領域を有するキメラオリゴヌクレオチドの合成いずれかの末端に隣接する４つのヌクレオチドメチルホスホノチオエート領域を、また中央部には隣接する１２のオリゴヌクレオチドホスホロチオエート領域を有する修飾オリゴヌクレオチドを調製するにあたっては、８マイクロモル規模で以下の手順を用いた。第１モノマーは、制御細孔ガラス（CPG）固体担体にあらかじめ結合させておいた。第２のモノマーは、デオキシヌクレオチドメチルホスホンアミダイトであるが、標準的なアミダイトカップリングサイクルを使って第１モノマーとカップリングさせた（たとえば、アグラワルとグッドチャイルドによるTetrahedron Lett．28巻3539〜3542頁（1987年）を参照）。別々のサイクルで、さらに３つのデオキシヌクレオチドメチルホスホンアミダイトを次々とカップリングさせて鎖を延ばした。それから、アセトニトリル中の１％ボカージュ（Beaucage）試薬（3H-1,2-ベンゾジチオール-2-オン）を使って室温で５分間かけて酸化的チオレーションを行い、CPG-結合ペンタヌクレオチドメチルホスホノチオエートを生成させた。続く１２のモノマーは、本明細書で参考のため引用しているアグラワルとザメクニックによる米国特許第5,149,798号のＨ−ホスホネート法により順次追加した。それからＨ−ホスホネートを二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン（9:9:1 vol/vol）中で０．２Ｍの硫黄で酸化してホスホロチオエートに変換した。最後の４モノマーは、デオキシヌクレオチドメチルホスホノチオエートであるが、これは追加してから前記の方法で酸化的チオレーションを行った。こうしてできたオリゴヌクレオチドを、０．５ｍｌエチレンジアミン中で室温で３０分間、脱保護してから、時々撹拌しながら６時間室温で保存した。最後にこの混合液を濾過し、真空状態で蒸発させて固体塊を得て、この塊を水に溶解し、Sep Pak C₁₈で脱塩した。実験例３メチルホスホノチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドの核酸減成に対する抵抗性 3’末端に２〜４の隣接するデオキシヌクレオチドメチルホスホネートを有するか、さもなければデオキシヌクレオチドホスホジエステルをすべて有するオリゴヌクレオチドの3'エキソヌクレオチド減成に対する相対的抵抗性を、オリゴヌクレオチドホスホジエステルとの比較で調べた。オリゴヌクレオチドそれそれについて、０．４Ａ²⁶⁰単位のオリゴヌクレオチドを凍結乾燥させ、０．５ｍｌの緩衝液（10mM Tris、10mM MgCl₂、p H8.5）に溶解してから、５μｌ（1.5ミリ単位）のヘビ毒ホスホジエステラーゼと混和した。混合液を温度を調節したセルで37℃でインキュベートし、Ａ₂₆₀の経時変化をプロットした。濃色性の増大をオリゴヌクレオチド減成の指標とした。結果を下の表IVに示す。この結果から、3'末端近くにメチルホスホノチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、このような結合を持たないオリゴヌクレオチドに比べてはるかに安定していることがわかる。さらに、メチルホスホノチオエート結合の数が増えるほど、オリゴヌクレオチドの安定性は増大した（４結合＞＞３結合＞＞２結合）。実験例４デオキシリボヌクレオチド領域および2'-OMe-リボヌクレオチド領域を有するハイブリッドオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成ハイブリッドオリゴヌクレオチドホスホロチオエートを、本明細書でも参考として引用している米国特許第5, 149,798号で述べられているＨ−ホスホネート法を利用して、自動合成装置（870 0型、ミリポア社、マサチューセッツ州ミルフォード）を使い、CPG上で5〜6μモル規模で合成した。デオキシリボヌクレオシドＨ−ホスホネートは、ミリポア社から入手した。2' -OMeリボヌクレオチドＨ−ホスホネートは、標準的な手順で合成した。2'-OMeヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドのセグメントは、2'-OMeリボヌクレオシドＨ−ホスホネートを使って希望するサイクルだけ組み立てた。同様に、デオキシリボヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドのセグメントも、デオキシヌクレオシドＨ−ホスホネートを使って希望するサイクルだけ組み立てた。組立後、CPG結合オリゴヌクレオチドＨ−ホスホネートを例２で述べたように硫黄で酸化し、ホスホロチオエート結合を生成した。それからオリゴヌクレオチドを濃 NH₄OH中で40℃で48時間かけて脱保護した。粗オリゴヌクレオチド（約500A₂₆₀単位）をC₁₈逆相媒体上で逆相低圧クロマトグラフィーで分析した。80％酢酸水溶液で処理してDMT基を除いてから、オリゴヌクレオチドを蒸留水で透析し、凍結乾燥した。実験例５ハイブリッドオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの相対的ヌクレアーゼ抵抗性様々なハイブリッドオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの相対的ヌクレアーゼ抵抗性について調べるために、オリゴヌクレオチドをヘビ毒ホスホジエステラーゼ（SVPD）で処理した。2'-OMe-RNA領域を持たないオリゴ、または5'末端に３つの、3'末端に４つの隣接する2'-OMeリボヌクレオチドを有するオリゴ、あるいはすべてに2'-OMeヌクレオチドを有する約0.2A₂₆₀単位のオリゴを、500μｌの緩衝液（40mM NH₄CO₃、pH4.0＋20mM MgCl₂）に溶解し、0.1単位のSVPDと混和した。混合液を37℃で420分間インキュベートした。０分後、200分後、420分後に、165μｌを取り出してイオン交換HPLCを使って分析した。すべてに2'-OMe-リボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、SVPDに対する抵抗性がきわめて強かったのに対して、2'-OMe-リボヌクレオチドを持たないオリゴヌクレオチドはほぼ完全に消化されてしまし、また5'末端および3'末端に2'-OMe-RNA領域を有するオリゴヌクレオチドは50％消化された。オリゴヌクレオチドホスホジエステルは、10分の１の濃度のSVPDで１分間で約80％消化された。これらの結果から、オリゴヌタレオチドホスホロチオエートに2'-OMeリボヌクレオチドが存在すると、エキソヌクレオチド分解消化に対する抵抗性が増強されること、またこの抵抗性の増強は、2'-OMeリボヌクレオチドの使用比率が大きいほど高まることがわかる。リボヌクレオチド、他の2'-置換リボヌクレオチドおよび2'-OMeリボヌクレオチドの特徴および挙動は似ているので、これらの結果から、リボヌクレオチド、2'-置換リボヌクレオチド、あるいはリボヌクレオチドおよび2'-置換リボヌクレオチドを混ぜて有するハイブリッドオリゴヌクレオチドホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートあるいはその両者でも、同様にヌクレアーゼ抵抗性が増強されることがわかる。実験例６ 3'キャップ構造を有するオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成オリゴヌクレオシドホスホロチオエートは、制御細孔ガラス（CPG）上でＨ− ホスホネート化学品を用いて8700型自動合成装置（ミリゲン-バイオサーチ社、マサチューセッツ州バーリントン）で合成してから、二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン（9:9:1 vol/vol）中で０.２Ｍ硫黄で酸化した。合成は５〜１０マイクロモル規模で行った。オリゴヌクレオシドホスホロチオエートは、低圧イオン交換クロマトグラフィー（DEAE-セルロース、DE-50ワットマン）で精製してから、逆相クロマトグラフイー（C₁₈）および透析を行った。5'-キャップ構造オリゴヌクレオシドホスホロチオエートは、必要な配列を組立た後で、N-Fmoc-O'- DMTr-3-アミノ-1,2-プロパンジオール-H-ホスホネートで最後のカップリングを行って調製した。それから5'-キャップ構造オリゴヌクレオシドH-ホスホネートを硫黄で酸化した。3'-キャップ構造オリゴヌクレオシドホスホロチオエートはN-Fmoc-O'-DMTr-3-アミノ-1,2-プロパンジオール-CPG上に組立てられ、硫黄により酸化された。これらの手順を組み合わせて利用して、3',5'-キャップ構造オリゴヌクレオシドホスホロチオエートを調製した。この代わりに、他の3'または5'キャップ構造を持つオリゴヌクレオシド（たとえば図４を参照）を、キャップ調製手順で、N-Fmoc-O'-DMTr-3-アミノ-1,2-プロパンジオール-H-ホスホネートまたはCPGの代わりにホスホネートまたはCPGで誘導されたキャップ構造を用いることによって調製できる。同様に、オリゴヌクレオチドホスホロチオエート以外のキャップされた修飾オリゴヌクレオチドは、適当な合成手順にキャップ調製手順を付け加えることによって同じような方式で調製する。実験例７終末キャップ構造を有するオリゴヌクレオチドホスホロチオエートのin vivoでの安定性雄CDC2F1マウス（平均体重20g）に、放射標識したオリゴヌクレオチドを200マイクロリットルの生理食塩水に溶解したものを30mg/kgの用量で静注または腹腔内注した。キャップ構造のオリゴヌクレオチドおよびキャップ構造になっていないオリゴヌクレオチドをそれそれ３匹ずつのマウスに投与した。各動物から投与の24時間後まで個体別に尿を採取し、0.5%SDS溶液、10mM 20mM Tris Cl（pH7.6）、10mM EDTA中のプロテイナーゼＫ（2mg/ml、最終濃度）によって37℃で１時間抽出してから、フェノルクロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。回収したオリゴヌクレオチドをPAGE（20％ポリアクリルアミド／7M尿素）で分析してからオートラジオグラフィーを行った。ケージのすすぎ水からの放射性物質も測定して尿溢流について調べた。投与の24時間後に、キャップ構造のものもそうでないものも、オリゴヌクレオシドホスホロチオエートの約30％が排泄された。排泄されたキャップ構造ではないオリゴヌクレオシドホスホロチオエートおよび5'-キャップ構造オリゴヌクレオシドホスホロチオエートは、図５に示すようにかなり減成していた。排泄された3'-キャップ構造および3',5'-キャッップ構造のオリゴヌクレオシドホスホロチオエートは、これとは対照的に実質的にはまったく減成していなかった。このことから、尿中に排泄されたオリゴヌクレオシドホスホロチオエートのin vivo における減成は、オリゴヌクレオチドの3'ヒドロキシル基にキャップを付加することによって阻害される3'-エキソヌクレアーゼ活性によって媒介されることがわかる。実験例８自己安定型オリゴヌクレオチドホスホジエステルのヌクレアーゼ抵抗性本試験に使用した対照オリゴヌクレオチドは、自己相補的領域を持たないオリゴデオキシヌクレオチドホスホジエステルであった。被験化合物は、１０ヌクレオチドの3'自己相補的領域を有する点を除いてはこれとまったく同じであった。サイズの効果についてコントロールするために、3'末端に10のマッチしないヌクレオチド（Ｔ₁₀）を有する点を除いては最初の対照オリゴヌクレオチドとまったく同じであるさらに別の対照オリゴデオキシヌクレオチドホスホジエステルを使用した。オリゴヌクレオチドの3'エキソヌクレオチド減成に対する相対的抵抗性について調べた。オリゴヌクレオチドそれぞれについて、オリゴヌクレオチド0.4A₂₆₀ 単位を凍結乾燥し、0.5mlの緩衝液（10mM Tris、10mM MgCl₂、pH8.5）に溶解し、５μｌ（1.5ミリ単位）のヘビ毒ホスホジエステラーゼ（SVPD）と混和した。混合液を温度を調節したセルで37℃でインキュベートし、A₂₆₀の経時変化をプロットした。濃色性の増大をオリゴヌクレオチド変性の指標とした。これらの実験の結果を以下の表Ｖに示す。この結果から、本発明に基づく自己安定型オリゴヌクレオチドホスホジエステルは、オリゴヌクレオチドホスホジエステルと比べても、また非相補的テールを有するオリゴヌクレオチドホスホジエステルと比べても、3'エキソヌクレオチド減成に対してはるかに抵抗性が大きいことがわかる。前記の試験に加えて、オリゴヌクレオチドをDNAポリメラーゼＩ 3'-エキソヌクレアーゼで消化させることも行った。図６に示すように、非自己安定型オリゴヌクレオチドは、30分で完全に消化されたが、10のヌクレオチド自己相補的領域を有する自己安定型オリゴヌクレオチドは、30分たっても部分的にしか消化されていなかった。実験例９自己安定型オリゴヌクレオチドホスホロチオエートのヌクレアーゼ抵抗性自己安定型および非自己安定型のオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの相対的ヌクレアーゼ抵抗性を調べるために、DNAポリメラーゼＩ 3'-エキソヌクレアーゼ活性の定量分析を使用した。これは、SVPDによるオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの減成が緩慢なためである。オリゴヌクレオチドはすべて5-末端にγ-³²P-ATPおよびキナーゼで標識をした。5'-標識オリゴヌクレオチド40pmoleを20μｌの緩衝液（40mM Tris HCl、pH8.0 、10mM MgCl₂、5mM DTT、50mM KCl、50μg/ml BSA）に溶解した溶液に、DNAポリメラーゼＩ 5単位を加え、37℃でインキュベートした。０分後、30分後、60分後、120分後に４μｌをとり、停止溶液（98％ホルムアミド、10mM EDTA、0.1％キシレンシアノール、0.1％ブロモフェノールブルー）と混和した。この試料を1 5％アクリルアミドケル（尿素）で分析し、オートラジオグラフィーを行った。結果を図７に示す。自己相補的領域を持たないか、あるいは（オリゴヌクレオチドホスホジエステルについての実験例８で述べたように）3'末端にマッチしていないヌクレオチド（Ｔ₁₀）のみを有するオリゴヌクレオチドホスホロチオエートは、４時間以内にほぼ50％消化された。１０ヌクレオチド自己相補的領域を有するオリゴヌクレオチドホスホロチオェートは、４時間後にも減成していなかった。６または４ヌクレオチド自己相補的領域を有するオリゴヌクレオチドホスホロチオエートも、安定していることがわかった。これらの結果から、自己安定型オリゴヌクレオチドホスホロチオエートは、非自己安定型のオリゴヌクレオチドホスホロチオエートに比べて核酸減成に対する抵抗性がはるかに強いことがわかる。実験例10 修飾オリゴヌクレオチドの抗インフルエンザ活性 MDCKイヌ腎細胞を、非必須アミノ酸（GIBCO BRL、ニューヨーク州グランドアイランド）を含み、５％ウシ胎仔血清（ハイクロン・ラボラトリーズ社、ユタ州ロゲン）、0.1％ NaHCO₃を加えた最少必須培地（MEM）に、96ウェル組織培養プレート（コーニング社、ニューヨーク州コーニング）を用い４×10⁵細胞/mlの濃度で0.2ml/ウェルずつ播種した。細胞を１晩インキュベートして、細胞の単層ができるようにした。それから増殖培地を取り除き、あらかじめ決めておいた濃度のオリゴヌクレオチド0.1mlを、0.18％ NaHCO₃および50μg/mlのゲンタマイシンを含有する無血清MEMに入れた。各化合物のそれそれ４ウェルずつについてこれを実施した。そのうち１ウェルは毒性対照で、３ウェルは抗ウイルス試験用であった。３つの細胞対照ウェルおよび６つのウイルス対照ウェルに、0.18％ NaHCO₃ および50μg/mlのゲンタマイシンを含有する無血清MEM 0.1mlを加えた。オリゴヌクレオチド化合物を加えて10分以内に、インフルエンザA/NWS/33（H1N1）ウイルスを含む、0.18％ NaHCO₃、20μg/mlのトリプシン、２μg/mlのEDTAおよび50 μg/mlのゲンタマイシンを含有するMEM 0.1mlを試験ウェルおよびウイルス対照ウェルのそれぞれに加えた。細胞対照および毒性対照のウェルには、ウイルスの入っていないこれと同じ培地0.1mlを加えた。プレートを、５％CO₂、95％大気の加湿インキュベーターを用い37℃でインキュベートした。細胞を顕微鏡で観察し、ウイルス特異な細胞変性作用（CPE）の徴候がないか、また非感染毒性対照群に化合物の作用による形態学的変化がないかを調べた。ウイルスCPEは、95〜100％ CPEを４として０〜４の段階で評価した。ウイルス対照で見られたものの50％にあたるCPE評価得点に達する活性が認められた化合物の各濃度における平均CPE評価を回帰分析して、有効量、50％エンドポイント（ED₅₀）を算出した。毒性対照ウェル中の細胞の目に見える形態上の変化を、顕微鏡で観察して段階評価した。評価は、毒性がない（０％）から細胞が完全に破壊されている（100％）状態までを20％きざみの段階尺度で行った。細胞毒性用量である50％エンドポイント（CD₅₀）を、50％エンドポイントに達する毒性評価を回帰分析し、これらの毒性段階に使用した化合物の濃度と比較して算出した。各化合物について、式TI＝CD₅₀／ED₅₀を使って治療指数（TI）を算出した。これらの結果を下の表VIに示す。これらの結果から、本発明に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドの好ましい構造的特性のすべて、すなわちキメラ、ハイブリッド、キャップ構造、および自己安定性といった特性は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのインフルエンザウイルス複製または増殖阻害効果をさらに向上させることができることがわかる。これらの結果からさらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド内のこのような構造的特性の組み合わせは、さらにいっそうの効力を持つことが示唆される。実験例11 抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドによるインフルエンザウイルスの様々な株に対する阻害本発明に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドがインフルエンザウイルスの他の株を阻害できるかどうか調べるために、実験例10で述べた実験を、化合物Mを使って様々なインフルエンザ株に対して調べた。この試験で選んだインフルエンザ株は、HINI株のA/NWS/33およびA/PR/8/34、H3N2株のA/Washington/ 897/80、A/Victoria/3/75およびA/Port Chalmers/1/73、ならびにH2N2株のA2/Ja pan/305/57であった。実験例10で述べたようにして算出した結果を、下の表VII に示す。これらの結果から、化合物Mは調べたインフルエンザ株６種のうち３種の阻害に大きな有効性を示し、またもう１種の株に対してもある程度の有効性を示した。これらの結果から、本発明に基づく抗インフルエンザ修飾オリゴヌクレオチドは、インフルエンザウイルスの複数株に対して有効でありうることがわかる。株交差有効性を最大限に拡げるために、複数の異なるインフルエンザウイルスからの多様な遺伝子のヌクレオチド配列を比較し、最もよく保存されているヌクレオチド配列を使って阻害オリゴヌクレオチドを調製することができる。 Detailed Description of the Invention Modified oligonucleotides with improved anti-influenza activity This application is a continuation-in-part application of application number 07 / 909,069 of application on July 2, 1992. same It is also a partial continuation application of application number 07 / 918,239 filed on July 23, 1992. Also, It is also a partial continuation application of application number 07 / 698,568 filed on May 10, 1991. BACKGROUND OF THE INVENTIONIndustrial applications The present invention relates to antisense oligonucleotides. More specifically, Ming is a modified oligo capable of inhibiting the replication or growth of influenza virus. For nucleotides.Related technology summary Influenza A virus is a segmented gene consisting of negative strands of RNA. It is a membrane-encapsulated virus with a nom. Eight segments of single-stranded RNA in type A and type B Ment, and 10 in the 7-segment influenza virus in C There is a child. Segment sizes vary (890 to 2341 nucleotides in length) , Each of which serves as a template for different mRNA synthesis. Influenza virus The lion contains the virus-specific RNA ports required for the synthesis of mRNA from these templates. In the presence of limerase and without this unique polymerase, influenza virus The negative strand of RNA is not infectious. mRNA transcription of influenza Viral mRNA polymerase is 12 to 15 nucleotides from the 5'end of cellular mRNA or mRNA precursor. It started when the leotide was taken, and the borrowed oligonucleotide was used as a primer. To use. Generally, the mRNA produced by this process encodes only one protein do not do. M RNA and NS RNA also encode spliced mRNAs and their binding. The result is that two different proteins are produced about each of these two segments. It Influenza virus is sensitive to humans and animals (eg pigs, birds, horses) Stain and cause acute respiratory illness. Vaccine effective against influenza virus Many attempts have been made so far to produce. But especially in the long run If you do, there is no perfect success. This is at least partially Due to the fact that the fluenza virus genome is a segmented genome, By rebuilding the segment for the characteristics of Can be present. For example, RNA segmentation between animal and human influenza viruses It has been suggested that sites may be exchanged, but this may result in new antigenic support in both populations. Butype will be introduced. Therefore, those who are vaccinated for a long time The law is It fails because a new subtype develops (an antigen “shift” occurs). In addition, viral surface proteins hemagglutinin and neuramini Dases are always small changes in antigen (antigen “drift”). like this Against the particular influenza virus due to the fact that it is extremely diverse Explain why the developed specific immunity does not help protect against new variants It Therefore, an alternative antiviral strategy is needed. B and C type inflation Ruenza virus causes less clinical disease than type A, but chemical Antiviral agents help prevent infections caused by these viruses It is. Therefore, it is capable of blocking the replication and growth of influenza virus. There is great interest in developing antisense oligonucleotides. like this Antisense Oligonucleotides Exists in Multiple Strains of Influenza Virus Can be designed to hybridize to conserved regions of existing influenza viruses Therefore, it is possible to provide a wide range of protection against various strains of influenza. Promising. U.S. Pat.No. 5,194,428 by Aglawar et al. Is also incorporated herein by reference. , But hybridizes to the influenza PB1 polymerase gene. A modified nucleoti with the ability to block influenza replication by Open oligonucleotides with inter-nucleotide bonds Shows. Kausert et al. (WO92 / 03454 (1992)) is an influenza polymer Lase 1, 2, 3 or hemagglutinin, nucleoprotein, neuraminidase, matrix Proteins, or nonstructural protein genes, or various splicing binding sites Influenza virus by hybridizing to Disclosed are antisense oligonucleotides that prevent growth of Ruth. US Pat. Nos. 5,149,797 and 5, XXX, XXX by Pederson et al. 7 / 839,472, December 24, 1992), which is also incorporated herein by reference, Ribonuclease H activating segment adjacent to the Rase H inactivating segment Disclosed are chimeric mixed phosphate backbone oligonucleotides having Therefore, antisense oligonucleotides are not Seem promising. However, when using any of these drugs, the Improved drugs with even greater fluenza virus replication or growth-blocking potency It is still needed in the future. Such an improved antisense oligonucleoti In addition to being used as an anti-flu drug, Find out which region of the Rus genome is the best candidate for broad cross-strain inhibition Would be useful for Summary of the invention The present invention provides the influence of influenza compared to previously known oligonucleotides. Provide modified oligonucleotides that have a greater ability to block the replication or growth of the virus. To serve. These modified oligonucleotides are Essential nucleic acid of such influenza virus to hybridize to the nucleic acid Is characterized by having a nucleic acid sequence which is sufficiently complementary to. In the preferred embodiment , The essential nucleic acids are the PB1, 2, and 3 polymerase genes, or hemagglutinin and nucleoprotein. , Neuraminidase, matrix protein, or nonstructural proteins of influenza. White gene, or one of various splicing junctions or packaging sequences It is a department. In various embodiments, modified oligonucleotides according to the present invention may include one or more types of oligonucleotides. Have modified internucleotide linkages. In a preferred embodiment, modified nucleotides At least some of the inter-bonds are phosphorothioate bonds or phosphorodithioate bonds. To join. In certain preferred embodiments, phosphorothioate internucleotide The bond is modified with other modified bonds, that is, bonds that are not phosphodiester. Included in Gonucleotide. These other modified internucleotide linkages include Desirably an alkylphosphonate bond or an alkylphosphonothioate Good These modified internucleotide linkages may be at one end of the oligonucleotide or At both ends or in the vicinity Most preferably present. In a further preferred embodiment of the modified oligonucleotide according to the invention, 1 To an oligonucleotide having multiple modified nucleosides Or a phosphorodithioate internucleotide linkage is present. This modifier Preferably the nucleoside is a 2'-O alkyl nucleoside. Modified nucleo At least a part of the side is at one or both ends of the oligonucleotide, or Most preferably, it is in the vicinity. In yet another preferred embodiment according to the invention, exonu Oligonucleotides with a cap structure that imparts creatase resistance are There are oate or phosphorodithioate internucleotide linkages. This key The cap structure is preferably present at least at the 3'end of the molecule. This cap structure The construction may be at one end of any embodiment of the modified oligonucleotide according to the invention or May be present on both ends, at least at the 3'end of the oligonucleotide Preferably. In yet another preferred embodiment of the modified oligonucleotide according to the invention, one Contains self-complementary regions of nucleotides at or near the ends Self-stable oligonucleotides containing phosphorothioate or phosphoroditi There is an oate internucleotide linkage, preferably at least at the 3'end or its Is preferably present in the vicinity of the Form an pinned structure. These modified oligonucleotides according to the present invention can be used for influenza replication or replication. Or the existing gene or the same gene to prevent growth. It provides greater potency than any of the modified oligonucleotides that lyse. Book These modified oligonucleotides based on the invention are all oligonucleotides Other modifications to the sugars or bases of can also be optionally included, and Beams Optionally, phosphorothioates, phosphorodithioates, alkyl phosphos Nt or alkylphosphonothioate with additional internucleotides other than each bond It may have a bond. Brief description of the drawings Figure 1 shows the nucleotide sequence of influenza virus PB1 (polymerase 1). , An antisense oligonucleotide complementary to this sequence can be prepared. It FIG. 2 is a self-stable anti-influenza modified oligonucleotid according to the present invention. Indicates the code. FIG. 3 is a self-stable anti-influenza modified oligonucleotide according to the present invention. Shows another form of. FIG. 4 shows the specific preferences that confer oligonucleotide exonuclease resistance. A better cap structure is shown. Figure 5 shows 5'-cap ends, 3'-cap ends, or ends capped No oligonucleotide 2 shows an in vivo nucleic acid degradation pattern. FIG. 6 shows self-stable oligodeoxynucleotide phosphodiesters and non-self DNA Polymers for Self-Stable Oligodeoxynucleotide Phosphodiesters 1 shows the Iase 3'-exonuclease degradation pattern. FIG. 7 shows self-stable oligodeoxynucleotide phosphorothioates and non-stable DNA polysulfate for self-stable oligodeoxynucleotide phosphorothioates The merase I 3'-exonuclease degradation pattern is shown. Detailed Description of the Preferred Embodiment The present invention provides an antisense oligonucleotide having anti-influenza activity. Related. Modified oligonucleotide having in vivo activity against influenza This is referred to herein as an anti-influenza modified oligonucleotide. The present invention , Hybridize to previously known oligonucleotides or the same gene Replication or amplification of influenza virus compared to the modified oligonucleotide Provided are modified oligonucleotides having a greater ability to prevent reproduction. Modification based on the present invention Decorative oligonucleotides are described in further detail in each of the preferred examples below. It has such specific and desirable characteristics. In addition to these features, the present invention The modified oligonucleotide Optionally with additional ribonucleotides, 2'-substituted ribonucleotides, or deoxynucleotides It can have siribonucleotide monomers, or both, and these Both contain any of the internucleotide linkages known in the art. And can be linked via a 5'-3 'bond. Such modified oligonuclear Cleotide is optionally a phosphodiester, phosphotriester, phosphorua. Midate, siloxane, carbonic acid ester, carboxymethyl ester, acetami Date, carbamate, thioether, crosslinked phosphoramidate, crosslinked methylene Phosphonate, bridged phosphorothioate or sulfone No internucleotide linkage It is preferable to have offset or all. Those skilled in the art will appreciate these Familiarity in the art with the synthesis of oligonucleotides with either inter-octide linkages Will admit that they know well, and Ullman and Pay Manman, Chemical Reviews 90: 543-584 (1990) and with Schneider. Tetrahedron Lett by Bangna. Vol. 31, p. 335 (1990) . Modified oligonucleotides according to the present invention include a total of about 6 to about 100 monomers. It is desirable to contain Such modified oligonucleotides are optionally May contain modified nucleobases and / or sugars, and may also contain diamines , Can have additional substituents such as cholesteryl or other lipophilic groups. Various preferred examples of modified oligonucleotides according to the present invention are shown in the table below. Shown in I. In each of these examples, the influenza PB1 polymerase gene Although having a nucleotide sequence from the same region, one of ordinary skill in the art would An oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to other essential nucleic acid sequences of the virus. The anti-influenza activity of otide was modified according to the present invention by its oligonucleotide. By incorporating the structural properties of the preferred embodiment of the decorating oligonucleotide, It will be understood that it can be further strengthened. For the purposes of the present invention, complementary Means having a sequence that hybridizes to the essential nucleic acid sequence under physiological conditions. means. The essential nucleic acid sequence of influenza virus is influenza virus A nucleic acid sequence required for replication or growth of a cell. Such an essential nucleic acid sequence is , From any known strain of influenza virus. For example, this Such oligonucleotides are described in US Pat. As shown in Table I of 5,194,428, the influenza PB1 polymerase gene It can also have another sequence from the offspring (polymerase 1). In fact, the influence Which sequence of the PZB1 (polymerase 1) gene [SEQ. ID No. 1] also (see Figure 1 ), The basis for the modified oligonucleotides according to the invention. Instead of this, Influenza sequences or sequences from genes can also be used (see Table II). ). As a practical matter, the present invention The structural characteristics of the preferred embodiment of the modified oligonucleotide based on Nucleic acid sequence that hybridizes with any essential nucleic acid sequence of influenza virus Enhances the anti-influenza activity of any antisense oligonucleotide with Should be. Preferred Examples of Modified Oligonucleotides According to the Invention Each will be described in more detail below. In a first preferred embodiment, an anti-influenza modified oligonuc according to the invention is Leotide is a phosphorothioate or phosphorodithioate internucleotide A region of nucleotides bound by a bond ("phosphorothioate or phosphate 1) to a plurality of “holodithioate regions” and further includes an alkylphosphonate group. A region of nucleotides linked by inter-cleotide bonds (“alkylphosphone Mixed backbone chimeric oligonucleotides having one or more It is a shape. In this example, at least one alkylphosphonate region is The 5'end or 3'end of the lygonucleotide, or both, or their It is preferable to have nucleotides in the vicinity. For the purposes of the present invention, "oligo Nuku The term "5'-end or 3'-end of leotide or its vicinity" refers to an oligonucleotide. At least one nucleotide within about 5 nucleotides from the 5'or 3'end of leotide. Having cleotide. The alkyl phosphonate region is an alkyl phosphonate Consist of about 2 to about 10 adjacent nucleocytoses linked by nate linkages Is preferred. The phosphorodioate or phosphorodithioate region is a phosphoro From a minimum of 3 linked by thioate or phosphorodithioate bonds It preferably consists of up to about 100 contiguous nucleotides. This of this invention An example of this influenza modified oligonucleotide based on the examples is shown in Table I in CMPD. Shown as A. The anti-influenza modified oligonucleotide according to this example of the invention is By the phase method, or alternatively, H-phos is used for the phosphorothioate region. Alkynes for sulfonate chemicals and sulfur oxidation, alkylphosphonate domains It can be synthesized by lephosphonamidate chemicals. Preferred H-phosphonate method Is disclosed in U.S. Pat.No. 5,149,798 by Aglawar et al. The indications are incorporated herein by reference. Alkylphosphonamidite chemicals are Tetrahedron Lett. By Rawal and Goodchild. Volume 28 Pages 3539-3542 (1987 It is a well-known technique as described in (1). Phosphorodithioate included No. 5,15, which is also referred to herein, for the synthesis of oligonutareotide Clear on No. 1,510 It's a well-known technique, such as being compromised (others, such as Marshall And Calthers, Science 259, 1564-1570 (1993) and citations therein. Please refer to the literature). In a second preferred embodiment, the anti-influenza modified oligonuclears according to the invention are Cleotide is a phosphorothioate or phosphorodithioate nucleotide A region of nucleotides joined by inter-linkages (“phosphorothioate or Sulfodithioate region "), and further alkylphosphonothio Bound by an internucleotide linkage of an ate or aryl phosphonothioate 1 to more than one nucleotide region (“alkylphosphonothioate region”) Is a form of mixed backbone chimeric oligonucleotides having. In this example , At least one alkylphosphonothioate region of the oligonucleotide Have nucleotides at the 5'or 3'end, or both, or in the vicinity. Is preferred. The alkylphosphonothioate region is an alkylphosphonothioate Consist of about 2 to about 10 contiguous nucleotides joined by an oate bond Is preferred. The phosphorothioate or phosphorodithioate region is a phospho At least 3 connected by rothioate or phosphorodithioate bonds Preferably consisting of up to about 100 contiguous nucleotides. The present invention This influenza modified oligo based on the example of Examples of nucleotides are shown in Table I as CMPD B, CMPD E and CMPD F. The anti-influenza modified oligonucleotide according to this example of the invention is The regions to be synthesized by the phase method, or alternatively instead Synthesized by all chemicals. Phosphorothioate region or phosphorodithio The ate region is synthesized as described for the first embodiment. Alkylphos The phonothioate region has two or more nucleosides which are Coupling with an alkyl phosphite bond and then oxidatively thiolating the alkyl phosphite bond. Synthesized by oleating to give an alkylphosphonothioate bond . This synthetic procedure will be described in detail in Experimental Example 1. In a third preferred embodiment, the anti-influenza modified oligonuclears according to the invention are Cleotide is a region of deoxyribonucleotides (“deoxyribonucleotides”). Region ") and a region of ribonucleotides or 2'-substituted ribonucleotides (" A hybrid oligonucleotide having a "vonucleotide region"). Internucleotide linkages ranging from about 1 to about all are phosphorothioate linkages. Alternatively, it is preferably a phosphorodithioate bond. 2'-substituted ribonucleoti Preferred as halo, amino, alkyl, aryl or lower amide. Ribonucleotides substituted with rutile (1-6 carbon atoms), Among them, 2'-OMe-ribonucleotide. If possible, reduce the ribonucleotide region. At least some of the 5'or 3'ends of the oligonucleotide, or both It is preferable to exist in the vicinity. In addition, the ribonucleotide region From about 2, and preferably from about 4 to about 100 contiguous ribonucleotides Or most preferably consists of 2'-substituted oligonucleotides or both Yes. The deoxyribonucleotide region is optional and, if present, approximately It can have from 1 to about 100 contiguous deoxyribonucleotides. Departure Examples of anti-influenza modified oligonucleotides based on this example of the invention are listed in Table I. Indicated as CMPD C, CMPD D, CMPD G, CMPD H, CMPD K, CMPD M and CMPD N Be done. The anti-influenza modified oligonucleotide according to this example of the invention is Typically synthesized by the phase method, preferably deoxyribonucleotides For the region, deoxynucleotide H-phosphonate was used, and the ribonucleotide was used. For the otide region, a ribonucleotide or a 2'-substituted ribonucleotide H-pho It is preferably synthesized by the H-phosphonate method using suphonate. In a fourth preferred embodiment, the anti-influenza modified oligonuclears according to the invention are Cleotide is attached to the oligonucleotide at the 5'end, the 3'end, or both. With a cap structure that confers exonucleosease resistance It is the shape of a do. Such modified oligos Nucleotides contain from 1 to almost all modified (non-phosphodiester) nucleotides. It is also preferable to have an inter-Otide bond. A preferred cap structure is shown in FIG. There are those shown, as well as lower alkyl (C1-C12) groups or alcohol groups. Good Preferable modified internucleotide bonds include phosphotriester and phosphoramide. , Siloxane, carbonic acid ester, carboxymethyl ester, acetamide , Carbamate, thioether, crosslinked phosphoramidate, crosslinked methylenephos Phonates, bridged phosphorothioates, sulfones, phosphorothioates and phos There is each bond of holodithioate. Anti-influenza modified oligonucleotides based on this example of the invention are presently Synthesized according to techniques well known in the art (eg, Ullman and P. Iman, Chemical Review 90: 543-584 (1990); Schneider and Van Tetrahedron Lett. 31 p. 335 (1990)). At the 3'end For oligonucleotides that have a Attached to the body and then linked to the first nucleotide monomer in the synthetic scheme Let For oligonucleotides with a cap structure at the 5'end, synthetic The end of the oligonucleotide after adding the last nucleotide monomer of the chime Connect the cap structure to. In the fifth example, the anti-influenza modified oligonucleotide was used as an oligonucleotide. Intramolecular hybridization with cleotide Self-complementation to form exonuclease-resistant hairpin-like structures A self-stabilizing state is achieved by having a target area. Based on this embodiment of the invention Anti-influenza modified oligonucleotides based on Characterized by having two regions, an iridizing region and a self-complementary region It The influenza hybridizing region is essential for influenza viruses. It has a nucleotide sequence complementary to the nucleic acid sequence. This area is about 6 to about It is preferably 100 nucleotides. One form of this embodiment of the invention is shown in FIG. Shown in. In this form, the influenza hybridizing regions are connected by rectangles. It is shown as a curved line, and the self-complementary region is shown as a continuous circle. The complementary nucleic acid sequence in the messenger RAN molecule of the target influenza is diamond-shaped. It is shown by connecting. Hydrogen bonds between nucleotides are represented by dots. Oh Rigonucleotides are in a stable state. That is, the target hybridizing region By base pairs between the self-complementary regions or of complementary sequences within the self-complementary regions Against exonucleotide degradation by intervening base pairs or both Resistance is endowed. This oligonucleotide has a complementary nucleic acid sequence When encountering an influenza nucleic acid molecule, the oligonucleotide influenza virus The base pair between the bridging region and the self-complementary region of the oligonucleotide Cleaved oligonucleotide Between the influenza hybridizing region of Escherichia coli and the complementary nucleic acid sequence of the nucleic acid molecule Will be replaced by. In this way, the base pair is cleaved and replaced by the target Formed by a hybrid between the nucleic acid sequence and the target hybridizing region The intermolecular base pair structure formed by the self-complementary oligonucleotide It is thermodynamically more stable than the intramolecular base pair structure. The second form of the oligonucleotide according to this embodiment of the invention is the same as the first form. But they form different structures as self-complementary base pairs. This alternative Shape a hammer-like structure as shown in FIG. In this form, the self-complementary region Base pairing with other oligonucleotide sequences within its self-complementary region. Contains a possible oligonucleotide sequence. The self-complementary region contains the influence There is also an oligonucleotide sequence complementary to the N. hybridizing region. Second important region of self-stabilizing oligonucleotides according to the invention Is a self-complementary region. Self-complementary regions include other There is an oligonucleotide sequence that is complementary to the oligonucleotide sequence. These others The oligonucleotide sequence of is within the influenza hybridizing region May lie within the self-complementary region or may span both regions. Complementary sequence Form base pairs and form a hairpin structure as shown in Fig. 2 or as shown in Fig. 3. Form a tumbler-like structure To do. Both hairpin and hammer-like structures As shown in Fig. 2, it is possible to have a loop with nucleotides that are not base paired. In the case of a hammer-like structure, such a loop is completely Sometimes it doesn't. Shaped by intramolecular hybridization containing self-complementary regions Although the number of base pairs formed varies, endonucleases cannot access the 3'end. Must be sufficient to maintain a double-stranded structure. In general, this To maintain such a double-stranded structure, 4 or more base pairs are required. Preferred practice In the example, the self-stabilizing oligonucleotide has about 10 intramolecular base pairs formed. 10 base pairs are contiguous and contain most of the 3'-terminal nucleotides It Of course, intramolecular base pairs include all nucleotides in the oligonucleotide It can spread as much as you want. A self-complementary region consisting of about 50 or fewer nucleotides It is preferable to include. The oligonucleotides based on this example are as described for the fourth example. It may have from 1 to almost all modified internucleotide linkages. Done For example, at least the influenza hybridizing region or self-complementary region One, and most preferably both, phosphorothioate linkages or phosphos. About 2 to almost all chains linked by dithiothioate bonds or both It preferably contains nucleotides. Examples of anti-influenza modified oligonucleotides according to this example of the invention include: Shown in Table I as CMPD O. Those skilled in the art can combine the characteristics of the various preferred embodiments described above to We see that additional examples with even greater anti-influenza potential can be realized. Would. Therefore, the present invention provides chimera properties, hybrid properties, and cap structures. Any possible combination of the properties mentioned here, both built and self-stabilizing. We are considering an anti-influenza modified oligonucleotide using sesame. Any of the preferred embodiments of the present invention hybridizes to the same influenza mRNA. Fluency compared to antisense oligonucleotides in current technology Great ability to block Enza replication or proliferation. For example, U.S. Pat. No. 428 is a modified oligonucleotide that blocks influenza virus replication I made clear about it. Some of the modified oligonucleotides include influenza. An oligonucleotide phospho that hybridizes to the PB1 (polymerase 1) gene There is rothioate. In this study, we analyzed the influenza PB1 polymerase gene. Incubating oligonucleotide phosphorothioate influenza virus The ability to block loose replication was investigated in comparison with various preferred embodiments of the invention. There In all the examples of the present invention, the efficacy of anti-influenza activity was surprisingly improved. This is an oligonucleotide phospho that binds to the same site on the same gene. Rothioei Correlates with As shown in Table III below, the anti-influen according to the present invention When the modified oligonucleotide is used, 50% inhibitory concentration (IC₅₀) Is from 2 times It's almost 15 times. Such an oligonucleotide can be utilized for various purposes. First of all, Which part of the influenza gene of Then width Determine whether it will be the best basis for antisense oligonucleotides with broad efficacy It can be used in the test. Second, which structural property or combination of Determine whether it will have the greatest effect against influenza in itro and in vivo It can be used to soften. Moreover, such oligonucleotides are It is also useful as a remedy for Enza infection. Such treatments include oligonucleosides Cyto can be administered intraperitoneally, intranasally, orally or rectally. like this Oligonucleotides are preferably administered at a concentration of about 1 mg to about 50 mg per kg body weight. Preferably. The following examples are provided to further illustrate each of the preferred embodiments of the present invention in more detail. However, the present invention is not limited to these. Experimental example 1 Methylphosphonate region and phosphorothioate region Of chimeric oligonucleotides containing Chimeric oligonucleic acid with methylphosphonate and phosphorothioate regions Leotide, for the methylphosphonate region, methylphosphonamides, Synthesis of phosphorothioate domain using nucleoside H-phosphonate did. Methylphosphonamidites were constructed as follows. Methyldichlorophosphine in ether at 15 ° C under nitrogen (51 ml) and diisopropylamine (102 mmol) were reacted with methylchloro-N, N-diisopropylaminophosphine was synthesized. Filter to remove salts and evaporate solvent After letting¹H and³¹Methylchloro-N, N-diiso as an oil characterized by P NMR Propylaminophosphine (48 mmol, 95% of theory) was obtained, which was -20 ° C for 8 weeks. It was stable for more than a while. This adult organism was designated as N, N-diisopropylethylamine. 10-20 min at room temperature with a normally protected nucleoside in dichloromethane containing Reacted for a while. After aqueous work-up, use acetic acid with pentane at -30 ° C to -40 ° C. Precipitation from chill gave a white solid product in 80-90% yield. This generation Things are CH₂Cl₂: EtOAc: Et₃Thin layer chromatography of silica on N (9: 9: 2) (tlc )¹H and³¹It was examined by P NMR. These adults were subjected to the same conditions and conditions used for the standard phosphoramidite reagent. And a program automated DNA synthesizer. 33 mg / nucleotide It was dissolved in acetonitrile at a concentration of ml and activated with tetrazole. Coupling The synthesis was performed with a pre-packed CPG carrier for 1 minute. The coupling efficiency was followed by quantitative analysis of dimethoxytrityl, It was found to be the same as the control synthesis which was carried out in parallel using the spheramidite. It was After coupling, the adult product is detritylated and NH 2 is allowed to stand at room temperature for 2 hours._FourUse OH It is separated from the carrier, ethylene Deblock with diamine: ethanol (1: 1) for 4 hours at room temperature. This base In the model tests quantitatively analyzed by HPLC by treatment, the internucleoside phospho About 1% of the nate groups were degraded. H-phosphonate synthesis is described in US Pat. The method illustrated in No. 149,798 was used. Then disulfide the H-phosphonate Oxidized with 0.2M sulfur in carbon / pyridine / triethylamine (9: 9: 1 vol / vol) Converted to phosphorothioate. Experimental example 2 Methylphosphonothioate region and phosphorothio Synthesis of chimeric oligonucleotides containing ate region Four nucleotide methylphosphonothioate regions flanking either end With 12 adjacent phosphorothioate regions in the middle On the 8 micromolar scale for the preparation of modified oligonucleotides with The following procedure was used. The first monomer is on a controlled pore glass (CPG) solid support. I've been merging them together. The second monomer is deoxynucleotide methylphore. Suhon amidite, but using the standard amidite coupling cycle Coupling with the first monomer (eg Agrawal and Goodchild By Tetrahedron Lett. 28, 3539-3542 (1987)). Separate cyclists And three more deoxynu Cleotide methylphosphonamidites were coupled one after another to extend the chain . Then 1% Beaucage reagent (3H-1,2-beta) in acetonitrile. And oxidative thiolation for 5 minutes at room temperature. Was performed to generate CPG-linked pentanucleotide methylphosphonothioate. Continued The 12 monomers are the same as those of Aglawar and Zamekuni, which are incorporated herein by reference. S.K., US Pat. No. 5,149,798, by the H-phosphonate method. The H-phosphonate was then carbon disulfide / pyridine / triethylamine (9: 9: 1 (vol / vol) was converted to phosphorothioate by oxidation with 0.2 M sulfur. last 4 monomers of which are deoxynucleotide methylphosphonothioate, These were added and then oxidatively thiolated by the method described above. Thus made Deprotect the oligonucleotide in 0.5 ml ethylenediamine at room temperature for 30 minutes. After protection, it was stored at room temperature for 6 hours with occasional stirring. Finally filter this mixture And evaporated in vacuo to give a solid mass, which was dissolved in water and separated with Sep Pak C₁₈so Desalted. Experimental example 3 Has a methylphosphonothioate bond Resistance of oligonucleotides to nucleic acid degradation Have 2 to 4 adjacent deoxynucleotide methylphosphonates at the 3'end Ruka or deoxynucleus Oligonucleotide 3'exonucleosides with all octidophosphodiesters The relative resistance to tide degradation was compared to the ratio of oligonucleotide phosphodiester I checked by comparison. Oligonucleotide or about that, 0.4A²⁶⁰Unit oligo Lyophilize the nucleotides and add 0.5 ml of buffer (10 mM Tris, 10 mM MgCl 2₂, P 5 μl (1.5 mm units) of snake venom phosphodiesterase after dissolution in H8.5) Mixed with. Incubate the mixture in a temperature-controlled cell at 37 ° C to₂₆₀of The change over time was plotted. Increased darkness was used as an index for oligonucleotide degradation . The results are shown in Table IV below. From this result, it was confirmed that the oligonucleic acid having a methylphosphonothioate bond near the 3'end was Cleotide is much better than an oligonucleotide without such a bond. You can see that it is stable. In addition, the number of methylphosphonothioate bonds has increased The more the stability of the oligonucleotide increased (4 bond >> 3 bond >> 2 bond ). Experimental example 4 Deoxyribonucleotide region and 2'-OMe-ribo Hybrid with nucleotide region Synthesis of oligonucleotide phosphorothioates Hybrid oligonucleotide phosphorothioates are also referred to herein. US Patent No. 5, Utilizing the H-phosphonate method described in 149,798, an automatic synthesizer (870 Type 0, Millipore, Milford, Mass.) On a CPG with 5-6 μ Synthesized on a scale. Deoxyribonucleoside H-phosphonate was obtained from Millipore. 2 ' -OMe ribonucleotide H-phosphonate was synthesized by standard procedures. 2'-OMe Nu The segment of the nucleoside-containing oligonucleotide is a 2'-OMe ribonucleoside. Only the desired cycle was assembled using sid H-phosphonate. Similarly, Deo The segment of the oligonucleotide containing the xyribonucleoside is also deoxygenated. The desired cycle was assembled using nucleoside H-phosphonate. assembly Afterwards, the CPG-linked oligonucleotide H-phosphonate was treated with sulfur as described in Example 2. Oxidation produced a phosphorothioate bond. Then concentrate the oligonucleotide NH_FourDeprotected in OH at 40 ° C. for 48 hours. Crude oligonucleotide (about 500A₂₆₀Units) C₁₈Reversed-phase low-pressure chromatography on reversed-phase media It was analyzed by chromatography. After treating with 80% acetic acid aqueous solution to remove DMT group, oligo The nucleotide was dialyzed against distilled water and freeze-dried. Experimental example 5 Hybrid oligonucleotide phosphorothioate Relative nuclease resistance of Relative Nucleia of Various Hybrid Oligonucleotide Phosphorothioates In order to investigate the enzyme resistance, the oligonucleotide was treated with the snake venom phosphodiester. It was treated with Lase (SVPD). Oligos without 2'-OMe-RNA region or at 5'end 3 oligos with 4 adjacent 2'-OMe ribonucleotides at the 3'end, Or about 0.2A with all 2'-OMe nucleotides₂₆₀Unit of oligo, 500 μl Buffer solution (40mM NH_FourCO₃, PH4.0 + 20mM MgCl₂) And mixed with 0.1 units of SVPD It was The mixture was incubated at 37 ° C for 420 minutes. After 0 minutes, after 200 minutes, after 420 minutes , 165 μl were removed and analyzed using ion exchange HPLC. 2'-OMe-ribo to everything Oligonucleotides with nucleotides are extremely resistant to SVPD On the other hand, the oligonucleotide without 2'-OMe-ribonucleotide is It is almost completely digested and has a 2'-OMe-RNA region at the 5'and 3'ends. The resulting oligonucleotide was 50% digested. Oligonucleotide phosphodiester Was digested with SVPD at a concentration 1/10 that of 80% in 1 minute. From these results, it was confirmed that the oligonucleotide phosphorothioate had a 2'-OMe ribonucleotide. The presence of reotide enhances resistance to exonucleolytic digestion. This increase in resistance is also due to the large proportion of 2'-OMe ribonucleotides used You can see that it increases. Ribonucleotides, other 2'-substituted ribonucleotides and And 2'-OMe Ribonu Since the characteristics and behavior of cleotide are similar, these results indicate that ribonucleosides are Tide, 2'-substituted ribonucleotide, or ribonucleotide and 2'-substituted ribonucleotide Hybrid oligonucleotide phosphorothioate with mixed nucleotides And / or phosphorodithioate as well as nuclease resistance It can be seen that the sex is enhanced. Experimental example 6 Has 3'cap structure Synthesis of oligonucleotide phosphorothioates Oligonucleoside phosphorothioates are capable of reacting with H- on controlled pore glass (CPG). Model 8700 automatic synthesizer using phosphonate chemicals (Milligen-Biosearch, Synthesized in Burlington, Mass., And then carbon disulfide / pyridine / toluene Oxidized with 0.2M sulfur in riethylamine (9: 9: 1 vol / vol). 5-10 synthetic Performed on a micromolar scale. Oligonucleoside phosphorothioate is a low-pressure ester. Purified by on-exchange chromatography (DEAE-cellulose, DE-50 Whatman) From reverse phase chromatography (C₁₈) And dialysis. 5'-cap structure Ligonucleoside phosphorothioate can be isolated from N-Fmoc-O'- after assembly of the required sequence. DMTr-3-Amino-1,2-propanediol-H-phosphonate for final coupling Done and prepared. Then 5'-cap structure oligonucleoside H-ho Suphonate was oxidized with sulfur. 3'-cap structure oligonucleoside phosphoroti Oate assembled on N-Fmoc-O'-DMTr-3-amino-1,2-propanediol-CPG , Oxidized by sulfur. Use these steps in combination to create a 3 ', 5'-cap P-structured oligonucleoside phosphorothioates were prepared. Instead of this, other oligonucleosides with 3'or 5'cap structures ( (See, for example, FIG. 4), in the cap preparation procedure, N-Fmoc-O′-DMTr-3-amino-1,2-pro Induction with phosphonate or CPG instead of pandiol-H-phosphonate or CPG It can be prepared by using a guided cap structure. Similarly, oligonuclear Modified oligonucleotides with caps other than octidophosphorothioate are suitable. Prepared in a similar fashion by adding the cap preparation procedure to the relevant synthetic procedure. To make. Experimental example 7 Oligo with terminal cap structure In vivo stability of nucleotide phosphorothioates. Male CDC2F1 mice (average weight 20 g) were loaded with 200 ml of radiolabeled oligonucleotide. A solution of icroliter in physiological saline was administered intravenously or intraperitoneally at a dose of 30 mg / kg. In-contracted. Cap-structured oligonucleotides and cap-structured Each oligonucleotide was administered to 3 mice each. Administered from each animal Up to 24 hours after Urine was collected for each body, and was added to 0.5% SDS solution, 10 mM 20 mM Tris Cl (pH 7.6), 10 mM EDTA. Extract with proteinase K (2mg / ml, final concentration) for 1 hour at 37 ° C, then Ethanol chloroform extraction and ethanol precipitation were performed. Recovered oligonuclear Autoradio after analysis of octides by PAGE (20% polyacrylamide / 7M urea) I took a picture. Radioactive material from cage rinse water is also measured to prevent urine overflow. I looked up. Twenty-four hours after administration, oligonucleosides with and without cap structures About 30% of side phosphorothioate was excreted. Not the excreted cap structure Oligonucleoside phosphorothioate and 5'-cap structure oligonucleosides Oside phosphorothioate was significantly degraded as shown in FIG. Excreted 3'-cap structure and 3 ', 5'-cap structure oligonucleoside phosphoro Thioate, in contrast, had virtually no degradation at all. this Therefore, in vivo excretion of oligonucleoside phosphorothioate excreted in urine Degradation adds a cap to the 3'hydroxyl group of the oligonucleotide Can be mediated by a 3'-exonuclease activity that is inhibited by Recognize. Experimental example 8 Self-stabilizing oligonucleotide phosphodiester Nuclease resistance The control oligonucleotide used in this study was an oligonucleotide with no self-complementary region. It was a Godeoxynucleotide phosphodiester. The test compound is 10 It was exactly the same except that it had the 3'self-complementary region of Ochid. 10 unmatched Nukus at the 3'end to control for size effect Leotide (T_Ten) With the first control oligonucleotide except that Another control oligodeoxynucleotide phosphodiester that is identical to I used it. The relative resistance of oligonucleotides to 3'exonucleotide degradation I looked it up. For each oligonucleotide, oligonucleotide 0.4A₂₆₀ Lyophilize the unit and add 0.5 ml of buffer (10 mM Tris, 10 mM MgCl 2₂, PH8.5) Mixed with 5 μl (1.5 milliunits) of snake venom phosphodiesterase (SVPD). Incubate the mixture in a temperature-controlled cell at 37 ° C to₂₆₀Change over time I put it. The increase in darkness was used as an index of oligonucleotide denaturation. The results of these experiments are shown in Table V below. From this result, the self Stable oligonucleotide phosphodiesters are oligonucleotide phosphodiesters. Oligonucleotide phosphodiesters that also have non-complementary tails compared to stells Much more resistant to 3'exonucleotide degradation than steal I understand. In addition to the above tests, oligonucleotides were Digestion with the lase I 3'-exonuclease was also performed. As shown in Figure 6 In addition, non-self-stable oligonucleotides were completely digested in 30 minutes, but 10 Self-stabilizing oligonucleotides with a self-complementary region for leotide were Was only partially digested. Experimental Example 9 Self-stable oligonucleotide Nuclease resistance of phosphorothioates Phases of self-stable and non-self-stable oligonucleotide phosphorothioates DNA polymerase I 3'-exonuclear Quantitative analysis of ase activity was used. This is an oligonucleotide phosphat with SVPD. Because the degradation of holothioate is slow It All oligonucleotides have γ-³²Labeled with P-ATP and kinase . 5'-labeled oligonucleotide 40 pmole was added to 20 μl of buffer solution (40 mM Tris HCl, pH 8.0 , 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 50 mM KCl, 50 μg / ml BSA), 5 units of merase I were added and incubated at 37 ° C. 0 minutes, 30 minutes, 60 minutes After 120 minutes, 4 μl was taken and the stop solution (98% formamide, 10 mM EDTA, 0.1% Xylene cyanol, 0.1% bromophenol blue). This sample 1 Autoradiography was performed by analysis with 5% acryl amide (urea). The results are shown in Fig. 7. It has no self-complementary regions or (or oligonucleosides Matching the 3'end (as described in Example 8 for tide phosphodiester) Not nucleotide (T_Ten) Containing only phosphorothioate The gut was almost 50% digested within 4 hours. Has a 10 nucleotide self-complementary region Oligonucleotide phosphorothioate does not degrade after 4 hours It was Oligonucleotide phospho having 6 or 4 nucleotide self-complementary region Lothioate was also found to be stable. From these results, self-stable Oligonucleotide phosphorothioate is a non-self-stable oligonucleotide It is found that the resistance to nucleic acid degradation is much stronger than that of phosphorothioate It Experimental Example 10 Anti-influenza activity of modified oligonucleotides MDCK canine kidney cells were isolated from non-essential amino acids (GIBCO BRL, Grand A Iland) and 5% fetal bovine serum (Hycron Laboratories, Utah) Rogen), 0.1% NaHCO₃96-well tissue culture plate in minimal essential medium (MEM) 4 x 10 using rate (Corning, Corning, NY)^FiveConcentration of cells / ml 0.2 ml / well was seeded at each time. Incubate the cells overnight to ensure that the cell monolayer is I made it possible. Then remove the growth medium to obtain a predetermined concentration Oligonucleotide 0.1 ml, 0.18% NaHCO₃And 50 μg / ml gentamicin In serum-free MEM containing This for each compound or for each 4 wells Was carried out. 1 well for toxicity control and 3 for antiviral test It was. Three cell control wells and six virus control wells were treated with 0.18% NaHCO 3.₃ And 0.1 ml of serum-free MEM containing 50 μg / ml gentamicin was added. Oligo Within 10 minutes of adding the nucleotide compound, influenza A / NWS / 33 (H1N1) virus 0.18% NaHCO containing ruth₃20 μg / ml trypsin, 2 μg / ml EDTA and 50 Test wells and virus controls with 0.1 ml MEM containing μg / ml gentamicin Added to each of the wells. Cell and toxicity control wells contain viral 0.1 ml of the same medium without this was added. Plate 5% CO₂, 95% atmospheric humidification incubator And incubated at 37 ° C. The cells are observed under a microscope and There is no evidence of cytopathic effect (CPE) or the effect of the compound on the non-infectious toxicity control group. The morphological changes were investigated. Viral CPE is 95-100% CPE is 4 and 0 It was evaluated on a scale of ~ 4. 50% of the CPE evaluation obtained with the virus control Regression analysis was performed on the average CPE evaluation at each concentration of the compound that was found to reach the point , Effective dose, 50% endpoint (ED₅₀) Was calculated. Cells in toxicity control wells The visible morphological changes were evaluated by grading by observing with a microscope. The assessment is toxic 20% increments from none (0%) to completely destroyed cells (100%) It was performed on the scale of. 50% endpoint (CD₅₀), 50% Regression analysis of toxicity assessments reaching endpoints and analysis used for these toxicity stages It was calculated by comparing with the concentration of the compound. For each compound, the formula TI = CD₅₀/ ED₅₀Using The therapeutic index (TI) was calculated. The results are shown in Table VI below. From these results, the anti-influenza modified oligonucleotide according to the present invention All of the favorable structural properties of: chimeric, hybrid, cap structures , And self-stability are properties of the antisense oligonucleotide. Ability to further improve the Ruenza virus replication or growth inhibitory effect I understand. These results further indicate that this in the antisense oligonucleotide It is suggested that such combinations of structural properties have even greater potency. It Experimental Example 11 With anti-influenza modified oligonucleotide Inhibition of various strains of influenza virus The anti-influenza modified oligonucleotide according to the present invention is an influenza virus. In order to investigate whether it can inhibit other strains of Ils, the experiment described in Experimental Example 10 was performed. Compound M was used to probe against various influenza strains. I chose in this test The influenza strains are HINI strains A / NWS / 33 and A / PR / 8/34, and H3N2 strains A / Washington / 897/80, A / Victoria / 3/75 and A / Port Chalmers / 1/73, and H2 / N2 strain A2 / Ja It was pan / 305/57. The results calculated as described in Experimental Example 10 are shown in Table VII below. Shown in. From these results, compound M inhibits 3 out of 6 influenza strains examined. Was shown to be highly effective, and also to some extent against another strain . From these results, the anti-influenza modified oligonucleotide according to the present invention It can be seen that can be effective against multiple strains of influenza virus. stock From different influenza viruses to maximize cross-efficacy Compares the nucleotide sequences of various genes in the The tide sequence can be used to prepare inhibitory oligonucleotides.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者パドマプリヤ、アベイシンゲアメリカ合衆国 01545 マサチューセッツ州シュルーズベリーパルドライブ 23─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, G B, GE, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, LU , LV, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK, TT, U A, US, UZ, VN (72) Inventor Padmapriya, Abasinge United States 01545 Massachusetts Shrewsbury Pal Drive, Tutu twenty three

Claims

[Claims] 1. Contains a nucleotide sequence complementary to the essential nucleic acid sequence of influenza virus. Anti-influenza modified oligonucleotide, Otide is a phosphorothioate or phosphorodithioate region and an alkyl group. Mixed backbone chimeric oligonucleotides containing a phosphonate region Is an anti-influenza modified oligonucleotide. 2. The alkylphosphonate region is also at the 5'or 3'end of the oligonucleotide The oligonucleotide according to claim 1, which is located in the vicinity thereof. 3. Alkylphosphonate regions are linked by alkylphosphonate bonds The oligonucleotide of claim 1 comprising from about 2 to about 10 contiguous nucleotides. Cleotide. 4. Alkylphosphonate regions are linked by alkylphosphonate bonds An oligo according to claim 2 comprising from about 2 to about 10 contiguous nucleotides. nucleotide. 5. Phosphorothioate region or phosphorodithioate region is phosphorothioate About 3 to about 100 linked by ate or phosphorodithioate linkages The oligonucleotide of claim 1 comprising adjacent nucleotides of. 6. Phosphorothioate region or phosphorodithioate region is phosphorothioate About 3 to about 100 linked by ate or phosphorodithioate linkages The oligonucleotide of claim 2 comprising adjacent nucleotides of. 7. Phosphorothioate region or phosphorodithioate region is phosphorothioate About 3 to about 100 linked by ate or phosphorodithioate linkages 4. The oligonucleotide according to claim 3 which comprises adjacent nucleotides of. 8. Phosphorothioate region or phosphorodithioate region is phosphorothioate About 3 to about 100 linked by ate or phosphorodithioate linkages The oligonucleotide of claim 4 comprising adjacent nucleotides of. 9. Contains a nucleotide sequence complementary to the essential nucleic acid sequence of influenza virus. Anti-influenza modified oligonucleotide, Otide is a phosphorothioate or phosphorodithioate region and an alkyl group. Mixed backbone chimeric oligonucleosides containing a phosphonothioate region An anti-influenza modified oligonucleotide that is Otide. Ten. The alkylphosphonothioate region is at the 5'end or 3'of the oligonucleotide The oligonucleotide according to claim 9, which is at the terminal or in the vicinity thereof. 11. The alkylphosphonothioate region is linked by an alkylphosphonothioate bond. 10. The composition of claim 9 comprising about 2 to about 10 contiguous nucleotides linked together. Listed oligonucleotides. 12. The alkylphosphonothioate region is linked by an alkylphosphonothioate bond. 11. The method of claim 10 comprising about 2 to about 10 contiguous nucleotides linked together. Listed oligonucleotides. 13. Phosphorothioate region or phosphorodithioate region is phosphorothioate About 3 to about 100 linked by ate or phosphorodithioate linkages 10. The oligonucleotide of claim 9 which comprises adjacent nucleotides of. 14. Phosphorothioate region or phosphorodithioate region is phosphorothioate About 3 to about 100 linked by ate or phosphorodithioate linkages 11. The oligonucleotide according to claim 10 comprising adjacent nucleotides of. 15． Phosphorothioate region or phosphorodithioate region is phosphorothioate About 3 to about 100 linked by ate or phosphorodithioate linkages 12. The oligonucleotide of claim 11, which comprises adjacent nucleotides of. 16. Phosphorothioate region or phosphorodithioate region is phosphorothioate Ate bond or phosphoroditi Containing about 3 to about 100 contiguous nucleotides linked by an oate bond The oligonucleotide according to claim 12, wherein 17． Contains a nucleotide sequence complementary to the essential nucleic acid sequence of influenza virus. Anti-influenza modified oligonucleotide, Otide contains a deoxyribonucleotide region and a ribonucleotide region Anti-influenza modified oligonucleosides that are hybrid oligonucleotides Chid. 18. Further from about 1 to almost all phosphorothioates or phosphorodithioates. 18. The oligonucleotide according to claim 17, which has a nucleotide internucleotide bond. 19. The ribonucleotide region is either the 5'or 3'end of the oligonucleotide. The oligonucleotide according to claim 17, which is in the vicinity thereof. 20. The ribonucleotide region contains from about 2 to about 100 contiguous ribonucleotides. 18. The oligonucleotide according to claim 17, which comprises: twenty one. The ribonucleotide region contains from about 2 to about 100 contiguous ribonucleotides. 19. The oligonucleotide according to claim 18, which comprises: twenty two. The ribonucleotide region contains from about 2 to about 100 contiguous ribonucleotides. 20. The oligonucleotide according to claim 19, which comprises: twenty three. Deoxyribonucleotide region from about 0 to about 100 18. The oligonucleotide according to claim 17, which contains flanking deoxyribonucleotides. Ochid. twenty four. Deoxyribonucleotide regions of about 0 to about 100 adjacent deoxyribonucleotides 19. The oligonucleotide of claim 18 which comprises nucleotides. twenty five. Deoxyribonucleotide regions of about 0 to about 100 adjacent deoxyribonucleotides 20. The oligonucleotide of claim 19, which comprises nucleotides. 26. Deoxyribonucleotide regions of about 0 to about 100 adjacent deoxyribonucleotides 21. The oligonucleotide of claim 20, which comprises nucleotides. 27. Deoxyribonucleotide regions of about 0 to about 100 adjacent deoxyribonucleotides 22. The oligonucleotide of claim 21, which comprises nucleotides. 28. Deoxyribonucleotide regions of about 0 to about 100 adjacent deoxyribonucleotides 23. The oligonucleotide of claim 22, which comprises nucleotides. 29. Contains a nucleotide sequence complementary to the essential nucleic acid sequence of influenza virus. Anti-influenza modified oligonucleotide, The cap structure shown in FIG. 4 has an otide at its 5'end or 3'end or both. A lower alkyl group (C1-C12) or an alcohol group. It has a cap structure that imparts creatase resistance, and the oligonucleoti De is phosphotriester, phosphoramidate, Siloxane, carbonic acid ester, carboxymethyl ester, acetamidate, Lubamate, thioether, crosslinked phosphoramidate, crosslinked methylenephosphone , Bridged phosphorothioates, sulfones, phosphorothioates and phosphorodiates. 1 to almost all modified internucleotide linkages selected from the group consisting of thioates An anti-influenza modified oligonucleotide having the following: 30. Includes anti-influenza hybridizing region and self-complementary region Anti-influenza modified oligonucleotide. 31. Influenza hybridizing region 31. The method of claim 30 comprising about 6 to about 100 nucleotides complementary to the essential nucleic acid sequence. The described oligonutreotide. 32. The self-complementary region forms about 4 to about 50 nucleotides that form an intramolecular base pair. 31. The oligonucleotide according to claim 30, which comprises: 33. The self-complementary region is the 5'or 3'end of the oligonucleotide. 31. The oligonucleotide according to claim 30, which is in the vicinity thereof. 34. The self-complementary region is the 5'or 3'end of the oligonucleotide. 32. The oligonucleotide according to claim 31, which is in the vicinity thereof. 35. The self-complementary region is the 5'or 3'end of the oligonucleotide. Is in the vicinity thereof. Listed oligonucleotides. 36. About 2 to almost all nucleotides are phosphorothioate or phospho Contracts linked by internucleotide linkages of rodithioate or both The oligonucleotide according to claim 30. 37. About 2 to almost all nucleotides are phosphorothioate or phospho Contracts linked by internucleotide linkages of rodithioate or both The oligonucleotide according to claim 31. 38. About 2 to almost all nucleotides are phosphorothioate or phospho Contracts linked by internucleotide linkages of rodithioate or both The oligonucleotide according to claim 32. 39. About 2 to almost all nucleotides are phosphorothioate or phospho Contracts linked by internucleotide linkages of rodithioate or both The oligonucleotide according to claim 33. 40. About 2 to almost all nucleotides are phosphorothioate or phospho Contracts linked by internucleotide linkages of rodithioate or both The oligonucleotide according to claim 34. 41. About 2 to almost all nucleotides are phosphorothioate or phospho Contracts linked by internucleotide linkages of rodithioate or both The oligonucleotide according to claim 35. 42. Essential nucleic acid sequence is influenza polymerase 3 gene, influenza Polymerase 1 gene, influenza polymerase 2 gene, influenza Hemagglutinin gene, influenza nucleoprotein gene, influenza neuraminida Enzyme, influenza matrix protein gene, segment 7 or 8 Influenza left or right splicing junction, segment 8 influence The splicing branch and segments 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or An essential nucleic acid sequence selected from the group consisting of 8 influenza packaging sequences The oligonucleotide according to claim 1, which is 43. Essential nucleic acid sequence is influenza polymerase 3 gene, influenza Polymerase 1 gene, influenza polymerase 2 gene, influenza Hemagglutinin gene, influenza nucleoprotein gene, influenza neuraminida Enzyme, influenza matrix protein gene, segment 7 or 8 Influenza left or right splicing junction, segment 8 influence The splicing branch and segments 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or An essential nucleic acid sequence selected from the group consisting of 8 influenza packaging sequences The oligonucleotide according to claim 9, which is 44. Essential nucleic acid sequence is influenza polymerase 3 gene, influenza Polymerase 1 gene, influenza polymerase 2 gene, influenza Hemagglutination remnants Gene, influenza nucleoprotein gene, influenza neuraminidase gene, Influenza matrix protein gene, segment 7 or 8 influenza The left or right splicing junction, segment 8 influenza splicing Branching and flu of segment 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 An essential nucleic acid sequence selected from the group consisting of Enza packaging sequences. The oligonucleotide according to 17. 45. Essential nucleic acid sequence is influenza polymerase 3 gene, influenza Polymerase 1 gene, influenza polymerase 2 gene, influenza Hemagglutinin gene, influenza nucleoprotein gene, influenza neuraminida Enzyme, influenza matrix protein gene, segment 7 or 8 Influenza left or right splicing junction, segment 8 influence The splicing branch and segments 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or An essential nucleic acid sequence selected from the group consisting of 8 influenza packaging sequences 30. The oligonucleotide according to claim 29 which is 46. Essential nucleic acid sequence is influenza polymerase 3 gene, influenza Polymerase 1 gene, influenza polymerase 2 gene, influenza Hemagglutinin gene, influenza nucleoprotein gene, influenza neuraminida Enzyme, influenza matrix protein gene, segment 7 or 8 Flu left Or right splicing junction, influenza splicing segment 8 Influenza on branches and segments 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8 The essential nucleic acid sequence selected from the group consisting of packaging sequences according to claim 31. Listed oligonucleotides.