JPH08510644A - グリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸ジアルキル混合物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、グリオキシレート及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物の製造、ならびに続く、グリホサートとしても既知のＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製造の方法を提供する。本方法は、アミノメチルホスホン酸ジアルキルならびにグリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼから成る触媒の存在下に、水溶液中でグリコール酸（グリコレート）及び酸素を酵素的に反応させることによりグリオキシレート及びアミノメチルホスホン酸ジアルキル（ＤＥＡＭＰＡ）の混合物をその場で製造することを含む。得られる混合物を水添し、次いで加水分解し、発芽後植物毒素及び除草剤であるＮ−（ホスホノメチル）グリシンを製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 グリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸ジアルキル混合物の製造法 発明の背景 発明の分野 本発明は、グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物の 製造法に関し、その方法では、グリコール酸及び酸素が、アミノメチルホスホン 酸ジアルキルならびにグリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−酸 オキシダーゼ、ＥＣ １．１．３．１５）及びカタラーゼ（ＥＣ １．１１．１ ．６）から成る触媒の存在下に、水溶液中で反応させられる。この方法で製造さ れ、得られるグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物は 、多様な植物の成長の抑制に有用な広範囲の発芽後植物毒素（post-emergent ph ytotoxicant）及び除草剤であるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製造におけ る有用な中間体である。 関連技術の説明 葉の茂った緑色植物及び哺乳類細胞に通常見いだされる酵素であるグリコレー トオキシダーゼは、グリコール酸からグリオキシル酸への酸化を触媒し、過酸化 水素を同時に生成する： ＨＯＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ ＋ Ｏ₂ −→ ＯＣＨＣＯ₂Ｈ ＋ Ｈ₂Ｏ₂ Ｎ．Ｅ．Ｔｏｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ． １８１，９０５−９１４（１９４９）は、グリコール酸からグリオキシル酸の中 間生成を介した蟻酸及びＣＯ₂への酸化を触媒する、タバコの葉から抽出された 酵素を最初に報告した。エチレンジアミンな どのある種の化合物を添加すると、中間グリオキシル酸がさらに酸化されるのが 制限された。酸化は約８のｐＨにおいて、典型的に約３〜４０ｍＭ（ミリモル） の濃度のグリコール酸を用いて行われた。グリコレート酸化のための最適ｐＨは 、８．９であると報告された。シュウ酸（１００ｍＭ）は、グリコレートオキシ ダーゼの触媒作用を阻害することが報告された。同様に、Ｋ．Ｅ．Ｒｉｃｈａｒ ｄｓｏｎ ａｎｄ Ｎ．Ｅ．Ｔｏｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．２３６，１２８０−１２８４（１９６１）は、トリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン（ＴＲＩＳ）を含む緩衝液が、グリコール酸のグリコレートオキシ ダーゼ触媒酸化においてシュウ酸の形成を阻害することを示した。Ｃ．Ｏ．Ｃｌ ａｇｅｔｔ，Ｎ．Ｅ．Ｔｏｌｂｅｒｔ ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｒｉｓ，Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ，Ｖｏｌ．１７８，９７７−９８７（１９４９）は、酸素を 用いたグリコール酸のグリコレートオキシダーゼ触媒酸化の最適ｐＨが約７．８ 〜８．６であり、最適温度が３５〜４０℃であると報告した。 Ｉ．Ｚｅｌｉｔｃｈ ａｎｄ Ｓ．Ｏｃｈｏａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２０１，７０７−７１８（１９５３）及びＪ．Ｃ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２３７，２００１−２００ ９（１９６２）は、グリコール酸のホウレンソウグリコレートオキシダーゼ−触 媒酸化における蟻酸及びＣＯ₂の形成が、Ｈ₂Ｏ₂及びグリオキシル酸の非−酵素 的反応から生ずることを報告した。彼らは、Ｈ₂Ｏ₂の分解を触媒する酵素である カタラーゼの添加が、蟻酸及びＣＯ₂の形成の抑制によりグリオキシル酸の収率 を非常に向上させることを観察した。ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）の添 加がグリコレートオキシダーゼの安定性を非常に増すことも見いだされた。 Ｎ．Ａ．Ｆｒｉｇｅｒｉｏ ａｎｄ Ｈ Ａ．Ｈａｒｂｕｒｙ， Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ． ，Ｖｏｌ．２３１，１３５−１５７（１９５８）は、ホウレンソ ウから単離されるグリコール酸オキシダーゼの調製及び性質につき報告した。精 製された酵素は、溶液中で非常に不安定であることが見いだされ；この不安定性 の原因は、酵素の活性部位へのフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の比較的弱 い結合、ならびに酵素的に活性な酵素のテトラマー及び／又はオクタマーの、酵 素的に不活性で不可逆的に凝集し、沈澱するモノマー及びダイマーへの解離に帰 せられた。酵素の溶液へのＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド）の添加は、酵素 の安定性を非常に増し、高いタンパク質濃度又は高いイオン強度は酵素をオクタ マー又はテトラマーとして保持した。 グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）の混合物の製造法は 、米国特許第５，１３５，８６０号に記載された。グリコール酸及び酸素が水溶 液中で、ならびにＡＭＰＡ及び２種の酵素触媒、グリコレートオキシダーゼ及び カタラーゼの存在下で反応させられた。この方法は、カタラーゼ（蟻酸の製造に 責任のある副生成物である過酸化水素の破壊のため）及び、グリオキシレートと 酸化−抵抗性Ｎ−置換ヘミアミナール及び／又はイミン錯体（さらなる酸化を制 限）を形成することができるアミン添加物としてのＡＭＰＡの両方を用いること の相乗効果を示した。９２％もの高いグリオキシル酸の収率が報告され、得られ るグリオキシル酸とＡＭＰＡの混合物は、発芽後植物毒素及び除草剤であるＮ− （ホスホノメチル）グリシンの製造に用いられた。 発明の概略 本発明は、水溶液中で、ならびにアミノメチルホスホン酸ジアルキル及び２種 の酵素触媒、グリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−酸オキシダ ーゼ、ＥＣ １．１．３．１５）及びカタラーゼ（ＥＣ １．１１．１．６）の 存在下において酸素を用いてグリコール酸を酸化することによるグリオキシル酸 とアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物の製造に関する。以前に用いられ たアミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）をアミノメチルホスホン酸ジアルキルに 置換すると、ＡＭＰＡがカタラーゼ活性を阻害する反応におけるグリオキシル酸 の収率の予期せぬ向上を生ずる。グリオキシル酸とアミノメチルホスホン酸ジア ルキルの混合物は、発芽後植物毒素及び除草剤であるＮ−（ホスホノメチル）グ リシンの製造のために有用である。 米国特許第５，１３５，８６０号は、触媒として可溶性ホウレンソウグリコレ ートオキシダーゼ及び可溶性カタラーゼ（例えばアスペルギルス・ニゲル（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）からの可溶性カタラーゼ）を用いたグリオキ シル酸とアミノメチルホスホン酸（ＡＭＰＡ）の混合物の製造法を記載している 。米国特許第５，１８０，８４６号は、これらの混合物を水添してＮ−（ホスホ ノメチル）グリシンを製造する方法を記載している。関連特許出願、Ｕ．Ｓ．Ｓ ．Ｎ．０７／９５１，４９７は、ホウレンソウからの酵素グリコレートオキシダ ーゼ及び内因性カタラーゼの両方を発現する遺伝子操作された微生物の形質転換 株を触媒として用いたグリオキシル酸／ＡＭＰＡ混合物の製造を記載している。 ＡＭＰＡは、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒ ｐｈａ）又はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ ｔｏｒｉｓ）形質転換株により生産された内因性カタラーゼが過酸化水素を水と 酸素に分解するのを可逆的に阻害し、有意な量のホルメート（過酸化水素による グリオキシレートの酸化の生成物）の製造を生ずることが観察された。反応混合 物にカタラーゼの第２の供給源（例えばアスペルギルス・ニゲルからの可溶性カ タラーゼ）を添加すると、Ｈ．ポリモルファ又はＰ．パストリス形質転換株触媒 のいずれを用いた場合も高収率のグリオキシル酸が製造された。 アスペルギルス・ニゲル、アスペルギルス・ニズランス、サッカロミセス・セ レビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンセヌ ラ・ポリモルファ、ピチア・パストリス及び牛肝臓からのカタラーゼが今回それ ぞれ、グリコレート／ＡＭＰＡ混合物の酸化の間に生成される過酸化水素の分解 のための触媒として調べられ、以前には報告されていなかった、Ｈ．ポリモルフ ァ、Ｐ．パストリス及び牛肝臓からのカタラーゼのＡＭＰＡによる可逆的な阻害 が発見された。この阻害は、可溶性カタラーゼ、固定化カタラーゼ又はカタラー ゼ−含有全細胞触媒のいずれが用いられるかにかかわらず起こった。触媒として ＡＭＰＡに阻害されるカタラーゼの供給源（例えばＨ．ポリモルファ又はＰ．パ ストリス形質転換株）を用いるグリコレート／ＡＭＰＡ反応物に追加の阻害−抵 抗性のカタラーゼの供給源を加える代わりとして、これらの同じ反応物における ＡＭＰＡの、アミノメチルホスホン酸ジアルキルへの置換は、アミン添加物とし てＡＭＰＡが用いられると通常起こるある種のカタラーゼの阻害を除去する、又 は有意に軽減する予期せぬ効果を有した。 触媒として可溶性グリコレートオキシダーゼ及びＡ．ニゲル可溶性カ タラーゼ（これはＡＭＰＡにより阻害されない）又はＨ．ポリモルファ可溶性カ タラーゼ（ＡＭＰＡにより阻害される）のいずれかを用いるグリコール酸の酸化 において、ＡＭＰＡ及びアミノメチルホスホン酸ジエチル（ＤＥＡＭＰＡ）をア ミン添加物として比較した；グリオキシル酸製造に最適の反応条件下（添付実施 例に記載の通り）で得られたグリオキシル酸及び蟻酸の収率を下表に挙げる。Ａ ．ニゲル又はＨ．ポリモルファ可溶性カタラーゼのいずれを用いた場合も、ＤＥ ＡＭＰＡを用いて製造されるグリオキシル酸の収率はＡＭＰＡを用いて得られる 収率より高かった。Ａ．ニゲルカタラーゼの比較的低濃度におけるグリオキシレ ートの収率の向上は、ＤＥＡＭＰＡプロトン化アミンのｐＫ_a（ｐＫ_a約６．４） がＡＭＰＡ（ＰＫ_a１０．８）より低いためであり得る；ＤＥＡＭＰＡの、より 低いＰＫ_aは、反応が行われたｐＨ（ｐＨ８．３〜８．５）における非プロトン 化ＤＥＡＭＰＡの、グリオキシル酸との酸化−抵抗性ヘミアミナール又はイミン 錯体の形成に有利である。 ＤＥＡＭＰＡ又はＡＭＰＡのいずれか、及びＨ．ポリモルファ可溶性 カタラーゼを用いた反応におけるグリオキシレートの収率及びホルメートの製造 の比較（上表を参照）は、アミン添加物としてＤＥＡＭＰＡを用いた場合の、予 期せぬグリオキシレートの収率の顕著な向上及びホルメートの製造の減少を示し ている。ＤＥＡＭＰＡを用い、有意に低濃度のＨ．ポリモルファ可溶性カタラー ゼを用いて高収率のグリオキシレートを得ることができた；ＡＭＰＡを用いた場 合にこの同じカタラーゼの濃度を増加させてもＤＥＡＭＰＡを用いて得た収率に 匹敵するグリオキシレートの収率を与えなかった。触媒としてＨ．ポリモルファ 又はＰ．パストリス形質転換株のいずれかを用い、ＡＭＰＡをＤＥＡＭＰＡに置 換した場合、類似のグリオキシレートの収率の向上及びホルメートの製造の減少 が得られた（添付実施例を参照）。 好ましい実施態様の説明 グリコール酸の触媒酸化は、グリオキシル酸を形成するグリコール酸とＯ₂の 反応を触媒する酵素触媒の存在下でグリコール酸及び酸素分子源を接触させるこ とにより簡便に行われる。１つのそのような触媒は、グリコール酸オキシダーゼ としても知られる酵素、グリコレートオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．１５） である。グリコレートオキシダーゼは、当該技術分野（同上）において周知の多 数の供給源から単離することができる。反応で用いられるグリコレートオキシダ ーゼは、有効な濃度で、通常約０．０１〜約１０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは約 ０．１〜約１０ＩＵ／ｍＬの濃度で存在しなければならない。ＩＵ（国際単位（ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｔ））は、１分当たりに１マイクロモルの 基質の変換を触媒する酵素の量として定義される。この酵素のアッセイのための 方法は、Ｉ．Ｚｅｌｉｔｃｈ ａｎｄ Ｓ．Ｏｃｈｏａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ，Ｖｏｌ．２０１，７０７−７１８（１９５３）に見 いだされる。この方法は、回収される、又は再循環されるグリコレートオキシダ ーゼのアッセイにも用いられる。 グリコール酸からグリオキシル酸への酸化的変換のための触媒としてのグリコ レートオキシダーゼの利用における最適の結果は、過酸化水素の分解のための触 媒を反応溶液中に挿入することにより得られる。１つのそのような、グリコレー トオキシダーゼとの組み合わせにおいて有効な過酸−破壊触媒は、酵素カタラー ゼ（Ｅ．Ｃ． １．１１．１．６）である。カタラーゼは、過酸化水素の水及び 酸素への分解を触媒し、本方法において、グリコール酸とＯ₂のグリコレートオ キシダーゼ触媒反応における副生成物として製造される過酸化水素の分解を促進 することにより、グリオキシル酸の収率を向上させると思われる。カタラーゼの 濃度は、５０〜５０，０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは２，０００〜１５，０００ ＩＵ／ｍＬでなければならない。カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼの濃 度を上記の範囲内で、カタラーゼ対グリコレートオキシダーゼの比率（各酵素に 関してＩＵで測定）が少なくとも約２５０：１であるように調節するのが好まし い。 触媒として可溶性酵素の使用に加え、グリコレートオキシダーゼ活性を内因性 カタラーゼ活性と共に発現する微生物形質転換株が製造され、本発明における微 生物触媒としてのそれらの利用が示された。本発明において用いられた微生物細 胞触媒は、ハンセヌラ・ポリモルファ（メチロトローフ酵母（ｍｅｔｈｙｌｏｔ ｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ））の形質転換株である。十分なグリコレートオキシ ダーゼ活性を有するＨ．ポリモルファの数種の形質転換株が、グリコレートオキ シダーゼに関する ＤＮＡをホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）プロモーターの制御下の発現ベ クター中に挿入することにより製造された。Ｈ．ポリモルファがこのベクターを 用いて形質転換され、多量のグリコレートオキシダーゼを生産する株が選択され 、Ｈ．ポリモルファＧＯ１と命名された。 典型的にＨ．ポリモルファ細胞触媒は、Ｈ．ポリモルファ形質転換株の接種材 料を最初に５００ｍＬのＹＰＤ（Ｄｉｆｃｏ）、ｐＨ４．４中で増殖することに より製造された。次いでこの培養物をｐＨ５．０において１０ＬのＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＹＮＢ、Ｄｉｆｃｏ）ｗ／ｏアミノ酸（１４ｇ） 、硫酸アンモニウム（５０ｇ）及びメタノール（１００ｇ）を含む発酵槽中に接 種した。発酵槽は３７℃、４００ｒｐｍの掻混ぜ（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）速度、 ５．０の一定のｐＨ、４０％溶解酸素（制御）及び１４ｐｓｉｇの空気において ４２．５時間運転した。発酵の完了時に１．０ｋｇのグリセロールを加え、遠心 により細胞を収穫し、液体窒素中において凍結し、−８０℃で保存した。 本発明で用いた第２の微生物細胞触媒は、ピチア・パストリス（メチロトロー フ酵母）の形質転換株であり、それはホウレンソウからのグリコレートオキシダ ーゼ酵素を内因性カタラーゼと共に発現する。ホウレンソウグリコレートオキシ ダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをＰ．パストリス発現ベクター（ｐＨＩ Ｌ−Ｄ４）中に、メタノール誘導性アルコールオキシダーゼＩプロモーターの制 御下となるように挿入し、プラスミドｐＭＰ１を生成することにより、十分なグ リコレートオキシダーゼ活性を有するＰ．パストリスの数種の形質転換株が製造 された。Ｐ．パストリス株ＧＴＳ１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）をプラス ミドｐＭＰ１により置換質転換し、線状プラスミドｐＭＰ１の染色体アルコ ールオキシダーゼＩ遺伝子座中への組み込み及びグリコレートオキシダーゼ遺伝 子によるアルコールオキシダーゼ遺伝子の置換に関して選択した。そのような形 質転換株のプールを次に、発現カセットの組み込みコピーの最大数に関して選択 した。Ｐ．パストリス株ＧＳ１１５−ＭＳＰ１０と命名された高いコピー数の形 質転換株を単離し、１９９２年９月２４日にＮＲＲＬ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉ ｎｏｉｓにおいてＮＲＲＬ Ｎｏ．Ｙ−２１００１として寄託した。 典型的にＰ．パストリス細胞は、１％のグリセロールを含む１００ｍＬのＹＮ Ｂにおいて接種材料を増殖することにより製造した。３０℃において４８時間増 殖させた後、酵母窒素ベース（ＹＮＢ）ｗ／ｏアミノ酸（１３４ｇ）、グリセロ ール（１００ｇ）及びビオチン（２０ｍｇ）を含む１０Ｌの培地を含む発酵槽中 に細胞を移した。発酵は、ｐＨ５．０（ＮＨ₄ＯＨを用いて制御）、３０℃、２ ００ｒｐｍの掻混ぜ速度、５ｓｌｐｍのエアレーション、５ｐｓｉｇの空気及び ５０％飽和以上に保持された溶解酸素において運転した。グリセロールが枯渇し たら、グリセロールをメタノール（５０ｇ）に置換する以外は同じ培地において 増殖させることにより、グリコレートオキシダーゼを発現するように細胞を誘導 した。誘導の間のグリコレートオキシダーゼ活性を酵素アッセイにより追跡した 。誘導の２４時間後、グリセロール（１ｋｇ）を用いた処理の後に細胞を収穫し た。収穫の後、細胞を液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。 Ｈ．ポリモルファ及びＰ．パストリス形質転換細胞は、グリコール酸からグリ オキシル酸への酸化のための触媒として用いる前に、浸透化（ｐｅｒｍｅａｂｉ ｌｉｚａｔｉｏｎ）を必要とする。浸透化の多様な既知 の方法が、十分なグリコレートオキシダーゼ活性を有する細胞の調製に有用であ った（Ｆｅｌｉｘ，Ｈ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１２０ ，２１１−２３４（１９８２）を参照）。典型的に、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒ ｉｔｏｎ Ｘ−１００／２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の１０重量％ の湿潤細胞の懸濁液を１５分間混合し、次いで液体窒素中で凍結し、解凍し、２ ０ｍＭリン酸塩／０．１ｍＭＦＭＮ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。浸透化の 第２の方法は、０．２％（ｗ／ｖ）ベンザルコニウムクロリド／２０ｍＭリン酸 塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の１０重量％の湿潤細胞の懸濁液を６０分間混合し、 次いで浸透化された細胞を２０ｍＭリン酸塩／０．１ｍＭ ＦＭＮ緩衝液（ｐＨ ７．０）で洗浄することにより行った。浸透化したら、反応混合物に加える全細 胞触媒の量を、対応する可溶性酵素に関して上記で記載したグリコレートオキシ ダーゼ及びカタラーゼ活性の必要な濃度を与えるように選択した。初期値の１０ ０％より高いグリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ活性の回復は、反応の経 過の間の全細胞触媒の浸透化の向上のためである。 約５〜１０ｍｇの湿潤細胞（濾紙上で過剰の水分を除去する）を磁気撹拌棒及 び、２，６−ジクロロフェノール−インドフェノール（ＤＣＩＰ）が０．１２ｍ Ｍであり、ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．３）が８０ｍＭである２．０ｍＬの溶液を 含む３−ｍＬの石英のキュベット中に正確に量り込むことにより微生物形質転換 細胞をグリコレートオキシダーゼ活性に関してアッセイした。キュベットにゴム 栓で蓋をし、窒素を５分間泡立てることにより溶液から酸素を除去した。次いで キュベットに４０μＬの１．０Ｍグリコール酸／１．０Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ８． ３）をシ リンジにより加え、６０５ｎｍ（ε＝２２，０００）において時間による吸収の 変化を測定しながら混合物を撹拌した。 約２〜５ｍｇの湿潤細胞（濾紙上で過剰の水分を除去する）を磁気撹拌棒及び ２．０ｍＬの蒸留水を含む３−ｍＬの石英のキュベットに正確に量り込み、次い で５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中の５９ｍＭの過酸化水素を１．０ ｍＬ加え、２４０ｎｍ（ε＝３９．４）において時間による吸収の変化を測定す ることによりカタラーゼ活性をアッセイした。種々の培地において培養されたＨ ．ポリモルファ及びＰ．パストリスの湿潤細胞（浸透化）のグリコレートオキシ ダーゼ及びカタラーゼ活性は、グリコレートオキシダーゼに関して湿潤細胞１グ ラム当たり２０〜１２０ＤＣＩＰ ＩＵであり、内因性カタラーゼに関して湿潤 細胞１グラム当たり３０，０００〜２０，０００ＩＵの範囲内であった。 反応混合物において任意であるが、多くの場合に有益な成分は、フラビンモノ ヌクレオチド（ＦＭＮ）であり、それは一般に最高約２．０ｍＭ、好ましくは約 ０．０１〜約０．２ｍＭの濃度で用いられる。ＦＭＮはグリコレートオキシダー ゼの生産性を向上させると思われ、生産性とは酵素の単位当たりにグリオキシル シ酸に変換されるグリコール酸の量を意味する。多くの場合にＦＭＮは、酵素の 製造の間にも酵素に加えられるので、ＦＭＮの添加濃度は、酵素と共に存在する ＦＭＮに加算される濃度と理解されるべきである。ＦＭＮの構造及びその分析法 は、Ｋ．Ｙａｇａｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａ ｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．Ｘ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６２，ｐ．３１９−３５５に見いだされ、その記載事項 は引用することにより本明細書の内容となる。 グリコール酸からグリオキシル酸への変換は、水性媒体中で簡便に行われ、そ れが好ましい。グリコール酸（２−ヒドロキシ酢酸）は商業的に入手可能であり 、本反応においてその初期濃度は０．１０Ｍ〜２．０Ｍ、好ましくは０．２５Ｍ 〜１．０Ｍの範囲内である。それはそのままで、あるいはそれらの適合性の塩、 すなわち水溶性であり、そのカチオンがグリコール酸からグリオキシル酸への所 望の変換又は、続くグリオキシル酸とアミノメチルホスホン酸ジアルキルとのＮ −（ホスホノメチル）グリシンを与える反応と抵触しない塩として用いることが できる。適した、及び適合性の塩−形成カチオン基は、試みることにより容易に 決定される。代表的なそのような塩類は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、ア ンモニウム、置換アンモニウム、ホスホニウム及び置換ホスホニウム塩類である 。 本発明のアミノメチルホスホン酸ジアルキルは、式 ［式中、Ｘ及びＹはそれぞれ個別にアルキル基、例えばメチル、エチル、プ ロピル、イソプロピルなどであり、得られるアミノメチルホスホン酸ジアルキル が部分的に、又は完全に水性反応混合物に可溶性となる］ を有する。アミノメチルホスホン酸ジアルキルは、アミノメチルホスホン酸ジア ルキル／グリコール酸（出発量）のモル比が０．０１〜３．０、好ましくは０． ２５〜１．０５の範囲内となるように加えられる。水溶液中でアミノメチルホス ホン酸ジアルキル及びグリコール酸を合わせた 後、得られる混合物のｐＨを６〜１０、好ましくは７．０〜９．０の値に調節す る。このｐＨ範囲内で、アルカリ金属水酸化物類、炭酸塩類、重炭酸塩類及びリ ン酸塩類を含むいずれの適合性及び非抵触性の塩基を用いても、正確な値を調節 し、所望のｐＨを得ることができる。反応混合物のｐＨは、反応が進行すると共 にわずかに低下し、従って最大酵素活性ｐＨ範囲の高端近く、約９．０〜８．５ で反応を開始し、反応の間に低下するのを許すのが多くの場合に有用である。酵 素活性はｐＨと共に変化するので、場合により非抵触性無機又は有機緩衝液を別 に加えることによりｐＨを維持することができる。 グリコール酸及びグリオキシル酸は水中で高度に解離しており、７〜１０のｐ Ｈにおいては、完全ではなくとも大部分がグリコレート及びグリオキシレートイ オンとして存在することが理解される。グリオキシル酸（及びその共役塩基、グ リオキシレートアニオン）は水和物、例えば（ＨＯ）₂ＣＨＣＯＯＨ及び／又は ヘミアセタール、ＨＯＯＣＣＨ（ＯＨ）ＯＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＨとしても存在す ることができ、それらの組成物及び対応するそれらのアニオンは、Ｎ−（ホスホ ノメチル）グリシン形成のための適した反応物であるという本目的に関し、グリ オキシル酸及びそのアニオンと同等であることも、当該技術分野における熟練者 に認識されるであろう。同様に、アミノメチルホスホン酸ジアルキルは部分的に 、又は完全にプロトン化アミンカチオンとして存在することができ、その対イオ ンは、反応混合物中に存在する利用できるアニオン種のいずれの１つ又はそれ以 上であることもできる。 グリコール酸からグリオキシル酸への変換の酸化剤である酸素（Ｏ₂）は、気 −液界面において液体を掻混ぜることにより、又は酸素に対して 浸透性の膜を介して気体として反応に加えることができる。ほとんどの条件下で 、反応速度は少なくとも部分的に、酸素が水性媒体中に溶解することができる速 度により制御されると思われる。かくして酸素を空気として反応に加えることが できるが、比較的純粋な形態の酸素を用い、高圧を用いるのさえ好ましい。酸素 圧の上限は知られていないが、最高５０気圧の酸素圧を用いることができ、１５ 気圧の上限が好ましい。高い酸素溶解（従って反応）速度を保持するために掻混 ぜは重要である。撹拌（stirring）などのいずれの簡便な形態の掻混ぜも有用で ある。他方、酵素の技術分野における熟練者に周知の通り、高剪断掻混ぜ又は泡 を発生する掻き混ぜは、可溶性酵素の活性を低下させ得、可溶性酵素触媒を用い る場合には避けなければならない。 反応温度は、反応速度及び酵素の安定性に影響を与える点で重要な変数である 。０℃〜４０℃の反応温度を用いることができるが、好ましい反応温度範囲は５ ℃〜１５℃である。好ましい温度範囲における運転は、反応の最後において回収 される酵素活性を最大にする。温度は水溶液が凍結し始める程低くてはならない 。温度は、通常の方法により、例えばこれらに限られるわけではないがジャケッ ト付き反応容器を用い、適した温度の液体をジャケットに通過させることにより 制御することができる。反応容器は、反応成分に不活性ないずれの材料から構築 されることもできる。 反応が完了したら、可溶性酵素は濾過又は遠心により取り出し、再利用するこ とができる。別の場合、例えば７０℃に５分間加熱することによりそれらを変性 し、沈澱させるか、及び／又は混合物のＮ−（ホスホノメチル）グリシンへの変 換、及び反応混合物からのＮ−（ホスホノメ チル）グリシンの回収という続く段階においてその存在が邪魔でなければ、反応 混合物中に残しておくこともできる。微生物形質転換細胞は、再循環のために濾 過又は遠心により回収することができる。反応溶液のＯ₂との接触を停止した後 、好ましくは可溶性酵素又は全細胞触媒の除去の後、溶液を活性炭と接触させる ことにより、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を場合により除去することが できる。 得られるグリオオキシル酸とアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物（対 応するヘミアミナール及びイミンと平衡状態にあると思われる）は、Ｎ−（ホス ホノメチル）グリシンの製造のための、当該技術分野において既知のいずれの方 法に従って処理することもできる。グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸 ジアルキルの混合物を接触水添し、続いて得られるＮ−（ジアルコキシホスフィ ニルメチル）グリシンを加水分解するのが、グリオキシル酸／アミノメチルホス ホン酸ジアルキル混合物からＮ−（ホスホノメチル）グリシンを製造するための 好ましい方法である。この目的に適した水添触媒には種々の白金属の金属、例え ばイリジウム、オスミウム、ロジウム、ルテニウム、白金及びパラジウム；又、 種々の他の遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル及び亜鉛が含まれる（がこ れらに限られるわけではない）。触媒は例えばラネイニッケル又は酸化白金のよ うに担持されていないことができ；あるいは例えばカーボン担持白金、アルミナ 担持パラジウム又はキーゼルグール担持ニッケルのように担持されていることが できる。カーボン担持パラジウム、キーゼルグール担持ニッケル及びラネイニッ ケルが好ましい。水添は、４〜１１、好ましくは５〜１０のｐＨにおいて行うこ とができる。水添及び及び圧力は広く変化させることができる。温度は一般に０ ℃〜 １５０℃、好ましくは２０℃〜９０℃の範囲であり、Ｈ₂圧は一般に大体大気圧 〜約１００気圧、好ましくは１〜１０気圧の範囲である。 グリオキシル酸／アミノメチルホスホン酸ジアルキル混合物の水添を介して製 造されるＮ−（ジアルコキシホスフィニル）グリシンを、水添段階からの混合生 成物水溶液に過剰の塩酸又は臭化水素酸を加え、加熱することにより加水分解し 、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを製造することができる。発芽後除草剤とし て有用なＮ−（ホスホノメチル）グリシンは、当該技術分野において既知のいず れの回収法を用いることによっても、得られる混合物から回収することができる 。 本発明をさらに例示するための以下の実施例において、グリオキシレート、ホ ルメート及びオキザレートの収率、ならびにグリコレートの回収収率は、反応の 開始時に存在するグリコール酸の合計量に基づくパーセンテージである。反応混 合物の分析は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＨＰＸ−８７Ｈ有機酸分析カラムを用いた高圧 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により行った。 実施例１ ３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｔｔｅｒガラスエアゾール反応容器中に、磁 気撹拌棒及び、ｐＨ８．５においてグリコール酸（０．２５Ｍ）、アミノメチル ホスホン酸（ＡＭＰＡ）０．２６３Ｍ）、ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）、プロピオン 酸（ＨＰＬＣ内部標準、０．１２５Ｍ）、ホウレンソウグリコレートオキシダー ゼ（１．０ＩＵ／ｍＬ）及び可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼ（１，４ ００ＩＵ／ｍＬ）を含む１０ｍＬの水溶液を入れた。反応容器を密封し、反応混 合物を１５℃に冷却し、次いで撹拌しながら５回、７０ｐｓｉｇに加圧し、大気 圧に排気す ることにより容器に酸素をフラッシした。次いで容器を７０ｐｓｉｇの酸素で加 圧し、混合物を１５℃で撹拌した。一定の間隔で、ＨＰＬＣによる分析のために 試料採取口を通してシリンジによりアリコート（０．１０ｍＬ）を取り出し（容 器中の圧力の損失なしで）、反応の進行を監視した。５時間後、グリオキシレー ト、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ７０．４％、１９ ．６％及び２．２％であり、５．３％のグリコレートが残った。グリコレートオ キシダーゼ及びカタラーゼの残留活性は、それらの初期値のそれぞれ２７％及び １００％であった。 実施例２ ｐＨ８．５及び５℃においてグリコール酸（０．５００Ｍ）、ＡＭＰＡ（０． ５００Ｍ）、ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）、イソ酪酸（ＨＰＬＣ内部標準、０．１０ ０Ｍ）、ホウレンソウグリコレートオキシダーゼ（１．０ＩＵ／ｍＬ）及び可溶 性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼ（１４，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む水溶液 を用い、実施例１に記載の方法を繰り返した。２１時間後、グリオキシレート、 ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ８５．２％、１．５％ 及び３．３％であり、５．５％のグリコレートが残った。グリコレートオキシダ ーゼ及びカタラーゼの残留活性は、それらの初期値のそれぞれ４９％及び９３％ であった。 実施例３ ｐＨ８．５及び５℃においてグリコール酸（０．５００Ｍ）、ＡＭＰＡ（０． ３７５Ｍ）、ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）、イソ酪酸（ＨＰＬＣ内部標準、０．１０ ０Ｍ）、ホウレンソウグリコレートオキシダーゼ（１． ０ＩＵ／ｍＬ）及び１４，０００ＩＵ／ｍＬのアスペルギルス・ニゲル、サッカ ロミセス・セレビシアエ、牛肝臓又はハンセヌラ・ポリモルファ可溶性カタラー ゼのいずれかを含む水溶液を用い、実施例１に記載の方法を繰り返した。反応時 間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収、ならびにグリオキシ ル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙げる： 実施例４ １４，０００ＩＵ／ｍＬのアスペルギルス・ニゲル又はハンセヌラ・ポリモル ファ可溶性カタラーゼのいずれかを用い、１５℃において実施例３における反応 を繰り返した。反応時間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収 、ならびにグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙 げる： 実施例５ ５，６００ＩＵ／ｍＬ又は５６，０００ＩＵ／ｍＬの可溶性ハンセヌラ・ポリ モルファカタラーゼを用い、実施例３における反応を繰り返し た。３種類すべての濃度のカタラーゼに関する反応時間、カタラーゼ及びグリコ レートオキシダーゼ活性の回収、ならびにグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及び グリコール酸の収率を下表に挙げる： 実施例６ ｐＨ８．３及び５℃においてグリコール酸（０．５００Ｍ）、アミノメチルホ スホン酸ジエチル（ＤＥＡＭＰＡ、０．３９８Ｍ）、ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）、 イソ酪酸（ＨＰＬＣ内部標準、０．１００Ｍ）、ホウレンソウグリコレートオキ シダーゼ（１．０ＩＵ／ｍＬ）及び可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼ（ １４，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む水溶液を用い、実施例１に記載の方法を繰り返 した。２０時間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ 収率は、それぞれ９７．４％、０．８％及び１．８％であり、グリコレートは残 らなかった。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留活性は、それらの 初期値のそれぞれ１０％及び９５％であった。 実施例７ ｐＨ８．３においてグリコール酸（０．５０Ｍ）、ＤＥＡＭＰＡ（０．５２５ Ｍ）、ＦＭＮ（０．０１ｍＭ）、イソ酪酸（ＨＰＬＣ内部標準、０．１００Ｍ） 、ホウレンソウグリコレートオキシダーゼ（１．０ＩＵ／ｍＬ）及び可溶性アス ペルギルス・ニゲルカタラーゼ（１，４００ＩＵ／ｍＬ）を含む水溶液を用い、 実施例６の反応を繰り返した。２３時 間後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それ ぞれ９５．３％、３．９％及び１．５％であり、グリコレートは残らなかった。 グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留活性は、それらの初期値のそれ ぞれ１２％及び１００％であった。 実施例８ １，４００ＩＵ／ｍＬ又は１４，０００ＩＵ／ｍＬの可溶性ハンセヌラ・ポリ モルファカタラーゼを用い、ＤＥＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）を用いた実施例７に おける反応を繰り返した。反応時間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ 活性の回収、ならびにグリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率 を下表に挙げる： 実施例９ ３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｔｔｅｒガラスエアゾール反応容器中に、磁 気撹拌棒及び、ｐＨ８．３（５０％のＮａＯＨで調節）においてグリコール酸（ ０．５００Ｍ）、アミノメチルホスホン酸（０．３７５Ｍ）、イソ酪酸（０．１ ００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）を 含む１０ｍＬの水溶液を入れ、溶液を５℃に冷却した。次いで容器に、０．１％ のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００／１凍結解凍を用いた処理により浸透化された０． ４７ｇのハンセヌラ・ポリモルファ形質転換株Ｇ０１（１０ＩＵグリコレートオ キシダーゼ及び２２，１００ＩＵカタラーゼ）を加え、次いで反応容器を密封し 、反応混合物を５℃に冷却した。撹拌しながら５回、７０ｐｓｉｇに加圧 し、大気圧に排気することにより容器に酸素をフラッシし、次いで容器を７０ｐ ｓｉｇの酸素で加圧し、混合物を５℃で撹拌した。一定の間隔で、ＨＰＬＣによ る分析のために試料採取口を通してシリンジによりアリコート（０．１０ｍＬ） を取り出し（容器中の圧力の損失なしで）、反応の進行を監視した。１６時間後 、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ ５７．６％、３２．５％及び２．６％であり、８．９％のグリコレートが残った 。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留浸透化細胞活性は、それらの 初期値のそれぞれ６０％及び３７８％であった。 実施例１０ １４，０００ＩＵ／ｍＬの可溶性アスペルギルス・ニゲルカタラーゼも反応混 合物に加えること以外は、実施例９の反応を繰り返した。１６時間後、グリオキ シレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ９０．１％ 、１．３％及び５．９％であり、３．０％のグリコレートが残った。グリコレー トオキシダーゼ及びカタラーゼの残留活性は、それらの初期値のそれぞれ８６％ 及び１３６％であった。 実施例１１ ハンセヌラ・ポリモルファ形質転換株を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ／１凍結解凍で処理することにより浸透化された０．７５ｇのピチア・パストリ ス形質転換株ＭＳＰ１０（１３．２ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び２１，２ ００ＩＵカタラーゼ）に置換し、実施例９の反応を繰り返した。１６時間後、グ リオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ３０ ．５％、５９．２％及び１０．７％であり、０．８％のグリコレートが残った。 実施例１２ ３オンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｔｔｅｒガラスエアゾール反応容器中に、磁 気撹拌棒及び、ｐＨ８．３（５０％のＮａＯＨで調節）においてグリコール酸（ ０．５００Ｍ）、ＤＥＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、Ｈ ＰＬＣ内部標準）及びフラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ）を含む１０ｍ Ｌの水溶液を入れ、溶液を５℃に冷却した。次いで容器に、０．１％のＴｒｉｔ ｏｎ Ｘ−１００／１凍結解凍を用いた処理により浸透化された１．５ｇのハン セヌラ・ポリモルファ形質転換株Ｇ０１（８．０ＩＵグリコレートオキシダーゼ 及び３８，０００ＩＵカタラーゼ）を加え、次いで反応容器を密封し、反応混合 物を５℃に冷却した。撹拌しながら５回、７０ｐｓｉｇに加圧し、大気圧に排気 することにより容器に酸素をフラッシし、次いで容器を７０ｐｓｉｇの酸素で加 圧し、混合物を５℃で撹拌した。一定の間隔で、ＨＰＬＣによる分析のために試 料採取口を通してシリンジによりアリコート（０．１０ｍＬ）を取り出し（容器 中の圧力の損失なしで）、反応の進行を監視した。９時間後、グリオキシレート 、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞれ９８．４％、０％及 び２．０％であり、グリコレートは残らなかった。グリコレートオキシダーゼ及 びカタラーゼの残留浸透化細胞活性は、それらの初期値のそれぞれ６３％及び２ ５０％であった。 実施例１３ ｐＨ８．３（５０％ＮａＯＨで調節）及び５℃においてグリコール酸（０．５ ００Ｍ）、ＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部 標準）、フラビンモノヌクレオチド（０．０１ｍＭ） 及び、０．２％ベンザルコニウムクロリド（Ｌｏｎｚａ Ｂａｒｑｕａｔ ＯＪ −５０）を用いた処理により浸透化された０．７２ｇのハンセヌラ・ポリモルフ ァ形質転換株Ｇ０１（４３．０ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び３９，８８０ ＩＵカタラーゼ）を含む混合物を用い、実施例１２の反応を繰り返した。１時間 後、グリオキシレート、ホルメート及びオキザレートのＨＰＬＣ収率は、それぞ れ５０．２％、４７．４％及び１．１％であり、２．２％のグリコレートが残っ た。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの残留浸透化細胞活性は、それら の初期値のそれぞれ９５％及び１０５％であった。 実施例１４ ＡＭＰＡ（０．３７５Ｍ）又はＤＥＡＭＰＡ（０．３７５Ｍ）のいずれかをア ミン添加物として用い、実施例１３の反応を繰り返した。反応時間、カタラーゼ 及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収、ならびにグリオキシル酸、蟻酸、シ ュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙げる： 実施例１５ ｐＨ８．３（５０％ ＮａＯＨを用いて調節）及び５℃においてグリコール酸 （０．５００Ｍ）、ＡＭＰＡ（０．３７５Ｍ）又はＤＥＡＭＰＡ（０．３７５Ｍ ）のいずれか、イソ酪酸（０．１００Ｍ、ＨＰＬＣ内部標準）、フラビンモノヌ クレオチド（０．０１ｍＭ）及び、０．２％のベンザルコニウムクロリド（Ｌｏ ｎｚａ Ｂａｒｑｕａｔ ＯＪ−５ ０）を用いた処理により浸透化された０．２３ｇのピチア・パストリス形質転換 株ＧＳ１１５−ＭＳＰ１０（１２．３ＩＵグリコレートオキシダーゼ及び３９， ４２０ＩＵカタラーゼ）を含む混合物を用い、実施例１２の反応を繰り返した。 反応時間、カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼ活性の回収、グリオキシル 酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコール酸の収率を下表に挙げる： 実施例１６ アミン添加物としてＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）又はＤＥＡＭＰＡ（０．５２５ Ｍ）を用いて実施例１５の反応を繰り返した。反応時間、カタラーゼ及びグリコ レートオキシダーゼ活性の回収、グリオキシル酸、蟻酸、シュウ酸及びグリコー ル酸の収率を下表に挙げる： る： 実施例１７ 実施例１２に記載の通りに微生物形質転換株触媒を用い、グリコール酸（０． ５０Ｍ）及びＤＥＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）の混合物から製造されたグリオキシ ル酸（０．４９Ｍ）及びＤＥＡＭＰＡ（０．５２５Ｍ）の混合物を、Ａｍｉｃｏ ｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ １０ 濃縮器（１ ０，０００分子量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性タンパク質を除去し、０ ．１０ｇの活性炭と混合してＦＭＮを除去し、濾液を、磁気撹拌棒を備えた３オ ンスのＦｉｓｃｈｅｒ−Ｐｏｔｔｅｒびんに入れる。次いでびんに０．１００ｇ の１０％Ｐｄ／Ｃを加え、びんを密封し、窒素ガスをフラッシし、次いで水素で ５０ｐｓｉｇに加圧し、２５℃で撹拌する。水素圧が下がった時に、追加の水素 を加えて圧力を５０ｐｓｉｇに保持する。水素圧力が一定のままとなったら、圧 力を排気し、窒素ガスをフラッシすることにより反応を停止させる。Ｎ−（ジエ トキシホスフィニルメチル）グリシンを含む得られる水溶液に過剰の濃塩酸を加 え、混合物を加熱して煮沸すると、ジアルキルホスホネートエステルの加水分解 が起こる。得られる混合物を濃縮し、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを結晶化 により単離する。 かくしてある程度特定的に記載し、例示したが、以下の請求の範囲はそのよう に制限されるべきではなく、請求の範囲の各要素の表現及びそれらの同等事項に 相応した範囲を与えられるべきであることが認識されなければならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミノメチルホスホン酸ジアルキルならびに酵素グリコレートオキシダー ゼ及びカタラーゼの存在下に、水溶液中で酸素を用い、グリコレートを酸化する 段階を含むグリオキシレート及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合物の 製造法。 ２．中間体がグリオキシレート及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混合 物を含み、方法がアミノメチルホスホン酸ジアルキルの存在下でグリコレートを グリオキシレートに酵素的に変換することを含む、Ｎ−（ホスホノメチル）グリ シンの製造のための中間体の製造法。 ３．（ａ）アミノメチルホスホン酸ジアルキルならびに酵素グリコレートオキ シダーゼ及びカタラーゼの存在下に、水溶液中で酸素を用い、グリコレートを酸 化することによりグリオキシレート及びアミノメチルホスホン酸ジアルキルの混 合物を製造し； （ｂ）段階（ａ）で製造された該混合物を還元し、かくしてＮ−（ジアル コキシホスフィニルメチル）グリシンを製造し； （ｃ）段階（ｂ）で製造された該Ｎ−（ジアルキルホスフィニルメチル） グリシンを加水分解し、かくしてＮ−（ホスホノメチル）グリシンを製造する 段階を含むＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製造法。 ４．該カタラーゼがアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ ｇｅｒ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌ ａｎｓ）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ ｒｅｖｉｓａｅ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙ ｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス （Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及び牛肝臓から成る群のメンバーから誘導 される請求の範囲第１項に記載の方法。 ５．グリコレートからグリオキシレートへの該酵素的変換を酵素グリコレート オキシダーゼ及びカタラーゼの存在下で行い、該カタラーゼがアスペルギルス・ ニゲル、アスペルギルス・ニズランス、サッカロミセス・セレビシアエ、ハンセ ヌラ・ポリモルファ、ピチア・パストリス及び牛肝臓から成る群のメンバーから 誘導される請求の範囲第２項に記載の方法。 ６．該カタラーゼがアスペルギルス・ニゲル、アスペルギルス・ニズランス、 サッカロミセス・セレビシアエ、ハンセヌラ・ポリモルファ、ピチア・パストリ ス及び牛肝臓から成る群のメンバーから誘導される請求の範囲第３項に記載の方 法。 ７．該カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼがハンセヌラ・ポリモルファ 及びピチア・パストリスから成る群より選ばれる全微生物細胞触媒の形態で用い られる請求の範囲第１項に記載の方法。 ８．グリコレートからグリオキシレートへの該酵素的変換を、ハンセヌラ・ポ リモルファ及びピチア・パストリスから成る群より選ばれる全微生物細胞触媒の 形態で用いられる酵素グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下で行う 請求の範囲第２項に記載の方法。 ９．該カタラーゼ及びグリコレートオキシダーゼがハンセヌラ・ポリモルファ 及びピチア・パストリスから成る群より選ばれる全微生物細胞触媒の形態で用い られる請求の範囲第３項に記載の方法。