JPH08510138A

JPH08510138A - ハロゲン化有機化合物の脱ハロゲン化のための化学的・生物学的方法

Info

Publication number: JPH08510138A
Application number: JP6524711A
Authority: JP
Inventors: オドム，ジエイムズ・マーテイン
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1993-05-19
Filing date: 1994-05-19
Publication date: 1996-10-29
Also published as: ATE149367T1; WO1995000208A2; DE69401935T2; DE69401935D1; EP0699096B1; WO1995000208A3; CA2162845A1; EP0699096A1; US5587317A

Abstract

(57)【要約】本発明は、土壌および地下水中に、汚染物質として普通に発見される有機ハロゲン化合物の脱ハロゲン化の方法に関する。本方法は、ハロゲン化有機物の還元的脱ハロゲン化を実施するために、テトラピロール触媒と共役された菌体外電子伝達タンパク質を含む嫌気性細菌を利用する。場合により、電子伝達仲介体が、脱ハロゲン化の速度を増進するために使用されてもよい。

Description

【発明の詳細な説明】ハロゲン化有機化合物の脱ハロゲン化のための化学的・生物学的方法発明の分野本発明は、土壌および地下水中に、汚染物質として普通に発見される有機ハロゲン化合物の脱ハロゲン化のための方法に関する。より具体的には、その方法は、ハロゲン化有機物の還元的脱ハロゲン化を実施するために、テトラピロール触媒と共役された菌体外電子伝達タンパク質を含む嫌気性細菌を利用する。背景ハロゲン化、特に塩素化溶剤による地下水汚染は、誤った取り扱いか、不適当な廃棄によって、これらの溶剤を土壌と接触させてきた産業用地に主として関連する世界的問題である。最も一般的な、問題となる化合物は、テトラ−、トリ− 、もしくはジ−クロロエチレンのような塩素化エチレンである。四塩化炭素、クロロホルムおよび塩化メチレンもまた、広く行きわたった汚染物質である。心配の理由は、三重にある。第１は、ほとんどのこれらの溶剤は、水に易溶であり、そして土壌粒子に吸着する傾向を有する。このことは、標準的汲み上げ・処理技術によっては、容易に除去することができない溶剤の頑固な地下の広がり（plum e）をもたらす（Biswas，N.，et al.，Water Environ．Res．64，170，10，1,（ 1992）；Hutter，G．M.，et al.，Water Environ．Res．64，69,（1992））。第２は、多くの塩素化溶剤の毒物学では、これらの化合物が、発癌性であり、そして肝臓や腎臓のような特定の器官を損傷する可能を示唆している（Price，P．S.，Memo of the U.S．Environmental Protection Agency，Of fice of Water，Washington，D.C．（1985）；Vogel，T．M.，Environ．Sci．Te chnol.，21，722,（1987））。最後に、多くの透水層（ａｑｕｉｆｅｒ）や地表下の環境で見られる条件下では、塩素化エチレンおよびメタンは、微生物学的に分解されるのは非常に遅い。これらのファクターの結果は、塩素化溶剤が、潜在的に長期間滞留する有害な地下水汚染物質であることを示している。近年、有機ハロゲン汚染物質をイン・サイチューで除去するための２つのアプローチがある。最初のアプローチは、水から汚濁物質を物理的に除去するために、地下水を、地表にポンプアップする標準的「汲み上げ・処理（ｐｕｍｐａｎｄｔｒｅａｔ）」法である。塩素化溶剤については、十分な時間（一般には数十年から数世紀）が与えられても、この方法は、ほとんどの汚染物質を捕捉するであろうけれども、これは、修復技術というよりも封じ込め方法である。その他のアプローチは、自然における生物学的なものであり、微生物を利用してハロゲン化有機物を酵素的に転換する。生物学的アプローチは、特定の場所に土着の微生物を利用してもよく、その場所での修復過程は、まず、望ましい微生物の増殖を促進するものを、汚染された場所に添加することからなる。あるいはまた、非土着の微生物が、増殖に必要な必須補正物（ａｍｅｎｄｍｅｎｔ）とともに汚染された場所に導入されてもよい。水を含んだ沈降物の濾過効果に因る導入された微生物の分散が、このアプローチへの主要な障害になると思われる。塩素化溶剤を脱ハロゲン化する非常に限定された数の純粋な細菌株が、報告されてきた。Colaruotoloら（米国特許第4,511,657号）は、特別に順応された微生物培養物を使用して、不浄な廃水、特にハロゲン化有機化学物廃水を処理することを特許請求している（米国特許第4，493,895号）。欧州特許第 461144号は、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）およびミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌株を使用して、汚染された土壌からクロロフェノール化合物を除去することを示しており、そして米国特許第5,009,999 号は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）の菌株を利用する、ポリ塩素化ビ−フェニル化合物の微生物分解法を開示している。さらに、クレブジーラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ）菌株は、液体培地中でクロロ安息香酸を分解し、そして単一炭素源としてモノおよびジ−クロロ安息香酸塩を使用することが示された（米国特許第4,761,376号）。粗嫌気性細菌共同体に関する研究は、塩素化エチレンもしくは塩素化メタンが、それぞれエチレンもしくはメタンに、完全に脱塩素化され得ることを、実験室とイン・サイチューの両方において証明した（Freedman，D．L.，et al.，App l．Environ．Microbiol.，55，2144,（1989））。この転換は、連続的還元段階において、より塩素化の低い中間体のシリーズを経て起きるが、しかし、その関与する細菌もしくは細菌類は、これらの共同体から容易には純化されなかった。ある種の嫌気性硫酸還元細菌とメタン生成細菌は、他の細菌と比較した場合、ハロゲン化溶剤を脱ハロゲン化する能力が増強されているように思われる。しかしながら、この特性は、これらの２群の中でさえ稀であると思われる。デスルホモニル・チエジェイ（Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎｉｌｅｔｉｅｄｊｅｉｉ）、唯一の分離株は、現在までに報告された最も活性な脱塩素化嫌気性菌の１菌株である（Mohn，W．W.，et al.，M icrobiological Reviews，56，482，（1992））。この微生物は、テトラクロロエチレンを脱塩素化することが分かっていたが、クロロ−芳香族化合物に対しては一層効果的である。デスルホバクター種（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｓｐ）、メタン生成菌およびアセトバクテリウム・ウッディイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｗｏｏｄｉｉ）のようなある種のアセトン生成菌もまた、非常に低い速度でクロロ−脂肪族化合物を脱塩素化することが知られている（Egli，C．S .，et al.，FEMS Microbiol．Lett.，68，207 （1990））。Egliらは、これらの細菌が、還元バッファーでの嫌気的条件下で培養される時には、各菌の懸濁液が、四塩化炭素を分解して、生成物として、より塩素化の低いメタンと二酸化炭素を形成することを示している。その微生物にとってのこの活性の生理的意味は、分かっておらず、単に、その微生物に対して、ほとんどエネルギー的もしくは栄養的結果を伴わない偶然の副反応であるかもしれない。塩素化溶剤の嫌気的脱ハロゲン化の微生物学は、やっと近年になって解決されつつあり、主として現象学的なものである。嫌気的脱ハロゲン化の生化学は、純粋培養により示された極端に低速の脱ハロゲン化という以外は、ほとんど分かっていない（Mohn，W．W.，e t al.，Microbiological Reviews，56，482（1992））。上記の方法は有用であり、そして微生物が、土壌と水の両環境からハロゲン化有機物を分解除去するのに使用できることを明らかに示している。しかしながら、既存技術において略述されたその方法には、いくつかの欠点がある。技術上示された例は、特定の自然界に存在するものもしくは遺伝子工学による細菌培養物を用いるか、または微生物による生物学的処理の前に毒性汚染物質を予めラフに化学的処理することよる環境の浄化を述べている。汚染領域の化学的処理は、多数の土着の微生物叢を殺し、その結果、バイオ修復（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）におけるいかなる努力をも妨げかねないということに注意すべきである。特定の有機汚染物質の分解のために特に選択された特定の微生物の単離もしくは改良、培養および接種は、激しい労力と時間の消費を要する。さらに、前述のように酸素の不在下では、塩素化炭化水素の分解は非常に遅い。コストのかかる地下水再循環の長い年月が、汚染物質を完全に無機物化するために、従来のバイオ修復には必要とされるであろう。バイオ修復は、脱塩素化に必要とされる分類上の微生物種という表現では、非常に理解されにくい。一つの汚染された場所で成功したバイオ修復戦略が、他の場所では通用しないであろうことは、普通に観察されることである。さらに、ある沈降物（ｓｅｄｉｍｅｎｔ）の微生物学が、いかなる条件下の汚染物質をも脱塩素化するように導入できるとは限らない。例えばパークロロエチレンのような、ある種の汚染物質は、元の親化合物よりも一層強い毒性のある塩化ビニルに、生物学的に転換されることもある。かくして、バイオ修復におけるすべての試みは、脱塩素化する微生物が存在するか否か、そしてもし存在するならば、これらの微生物の増殖を促進するのに、どんな栄養上の補足物をその沈降物に添加することが必要であるかを決定するために、コストのかかる実験室的小世界の研究とパイロット分野の研究を優先させねばならない。鉄−、ニッケル−もしくはコバルト−含有のテトラピロールによる塩素化炭化水素の非生物的嫌気的脱ハロゲン化が、数人の研究者によって報告されている。 Krone，U．E.ら（Biochemistry，28，4908（1989））は、電子供与体としてのクエン酸チタニウム（ＩＩＩ）もしくはジチオトレイトール（ＤＴＴ）のいずれかとの共役において、四塩化炭素の還元的脱ハロゲン化を触媒するコリノイドの使用を示している。この方法によって形成された分解生成物は、クロロホルム、塩化メチレン、クロロメタンおよびＣＨ₄を含み、このことは、完全な脱塩素化が可能なことを示唆する。さらに、Krone，U． E.ら（Biochemistry，28，10061（1989））は、また、四塩化炭素の脱塩素化を触媒するコリンおよびコリノイドが、メタン生成細菌で発見されたニッケル−含有ポルフィノイド、補酵素Ｆ４３０によって仲介され得ることを示した。Marks T.，et al.（WO 8910772）は、選択された金属中心のポルフィリン、コリンもしくはフタロシアニン複合体の存在で、有機ハロゲンを還元剤と反応させることによって、有機ハロゲン化合物の脱ハロゲン化する方法を述べている。Marksらの方法は、周期表の群２、５、６、８、９もしくは１０から選ばれる金属と組み合わせて、上記環構造を含む複合体の使用を包含する。 Gantzer，C．J.ら（Environ．Sci．Technol.，25，715（1991））は、細菌の遷移金属補酵素ビタミンＢ₁₂（コバルト含有）、補酵素Ｆ４３０（ニッケル含有）およびヘマチン（鉄含有）が、ポリ塩素化エチレンおよびベンゼンの還元的脱塩素化を触媒することを示した。Gantzerは、ビタミンＢ₁₂と補酵素Ｆ４３０に関して、異なる種類の過塩素化化合物の還元的脱塩素化速度が、次の順序：四塩化炭素＞テトラクロロエチレン＞ヘキサクロロベンゼンをもつことを示した。ヘマチンに関しては、還元的脱塩素化速度の順序は、四塩化炭素＞ヘキサクロロベンゼン＞テトラクロロエチレンであった。各種類の化合物の中で、脱塩素化の速度は、塩素含量の減少にしたがって減少した。トリクロロエチレンの還元的脱塩素化では、シス−１，２−ジクロロエチレンが、ビタミンＢ₁₂、補酵素Ｆ４３０およびヘマチンにより形成される顕著な生成物であった。ペンタクロロベンゼンとペンタクロロフェノールは、ビタミンＢ₁₂によって、おのおの脱塩素化されて、３種の可能性のあるテトラクロロベンゼン異性体からの２種を生じた。技術の開示されたテトラピロールを伴う非生物的方法は、有機溶剤の脱ハロゲン化に有用であるが、強力な還元体（ｒｅｄｕｃｔａｎｔ）の存在を必要とするため、必要な還元体の濃度と化学的性質が、法的および経済的両面の見通しから妨げとなるであろう地表下の応用において、それらの使用を制約する。かくして、テトラピロール触媒作用は、今日まで、単に、エキス・サイチュー（ｅｘｓｉｔｕ）の技術と考えられてきた。強力な還元体として潜在的に作用できるデスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）の代謝に必須な１つのファクターは、ペリプラズム（細胞膜の外部）の電子伝達体タンパク質、チトクロームｃ₃である。このタンパク質は、細胞の外面に局在し、外部電子伝達反応に関わることができる。デスルフォビブリオからの電子伝達タンパク質は、非常に多様であり、少なくとも４種の異なるｃ型チトクローム、すなわち、モノヘムチトクロームｃ５５３（Ｍｒ９０００）、テトラヘムチトクロームｃ₃（Ｍｒ１３０００）、オクタヘムチトクロームｃ₃（Ｍｒ２６０００）および１６個のヘムを含むＨｍｃと呼ばれる高分子量チトクローム（Ｍｒ６５０００）を含むと思われる（Haladijian，J.，et al.，Biochem ．Biophys．Res．Com.，179，605（1991））。チトクロームｃ₃スーパーファミリーの共通のパターンは、それらが、大体−１２０ないし −４００ｍＶの範囲内の低い酸化還元電位をもつｃ型ヘムを含有するということである。チトクロームｃ₃タンパク質は、細胞内で機能して、ヒドロゲナーゼとその他の電子伝達鎖の間で電子を運搬する。今日まで、ペリプラズムのチトクロームｃ₃の還元力は、化合物の脱ハロゲン化のいかなる方法にも共役されなかった。技術的には、生物学的システムにおいて、現在可能であるよりも以上の分解速度で、ハロゲン化有機汚染物質を、イン・サイチューで確実にそして再現性よく脱ハロゲン化する方法に対して、１つのニーズがあることは明らかである。本発明の目的は、ハロゲン化有機物の脱ハロゲン化をイン・サイチューで実施するために、テトラピロール触媒との組み合わせにおいて硫酸還元細菌の土着の集団を利用する方法を提供することによって、そのようなニーズに答えることである。本方法は、種々の塩素化溶剤の脱塩素化を触媒するために、テトラピロール（ビタミンＢ₁₂）に電子を供与する会合ｃ₃チトクロームをもった硫酸還元細菌を利用する。本発明は、数種の方法における技術上の改良である。本方法は、ほとんどの透水層系に土着の細菌を利用して、テトラピロール触媒作用を進めるべき強力な還元体を提供する。その場所は、脱塩素化する生物を含む必要がなく、硫酸還元細菌のみが必要とされる。第二に、この方法は、操作上、その場所の如何にはよらず同様であろう、すなわち、硫酸還元菌のための栄養条件を作り出すこと、そして一度そうなったら、その菌は、脱塩素化剤の添加を確立される。かくして、修復は、脱塩素化細菌の存在の有無を決定することを狙ったコストのかかるＲ＆Ｄ計画よりも、むしろ一つの工程に類似している。その上、本方法は、バイオ修復の速度、およびバイオ修復の実施の全般的信頼性と再現性において劇的な増加をもたらすであろう。本発明は、いかなる沈降物にもある固有の微生物叢が、硫酸還元細菌を含むことのみを要求する。多数の現場と実験室での研究が、これらの生物が、その生存を依存できるような沈降物や土壌に一般的に存在することを明らかにした（Vogel，T．M.，Environ ．Sci．Technol.，21，No．E，pp 77-81（1987）；Mohn，W．W.，et al.，Micro biological Reviews，56，482（1992）；Suflita，J．M.，et al.，J．Ind．Mic robiol.，3，179,（1988）。硫酸還元細菌の栄養特性は、この群の細菌を生育させる栄養戦略が簡単であるので、よく理解されている。土着の脱塩素化細菌は、必要ではないが、この方法によって阻害されないであろう。発明の概要本発明は、適切な還元体の存在下で、チトクロームｃ₃菌体外電子伝達タンパク質を含む硫酸還元菌細胞の培養物を生育させ；その細胞を、反応混合物を形成するために有機ハロゲン化合物とテトラピロール触媒を含む培地に接触させ；そして適切な嫌気的条件下で、該有機ハロゲンを脱ハロゲン化するのに十分な時間、その反応混合物をインキュベートすることを含んでなる有機ハロゲンの脱ハロゲン化方法を提供する。この好適な実施態様は、図１に示されるモデルによって具体的に説明される。図１は、典型的な硫酸還元細胞の電子伝達代謝を表す。硫酸還元菌は、有機物の還元か直接水素かのいずれかにより、遍在する発酵菌の代謝の副産物として供給できる電子を引き出すであろう。電子は、細菌のヒドロゲナーゼ（Ｈ₂アーゼ）によって受容され、ペリプラスムの電子伝達タンパク質、チトクロームｃ₃に往復される。有機ハロゲンの還元的脱ハロゲン化のために、電子は、リボフラビンのような電子伝達仲介体を通してチトクロームｃ₃から、還元状態で脱ハロゲン化反応を遂行できるテトラピロール触媒（ヘマチン）に、仲介される。さらに、本発明は、還元条件を提供する硫酸還元細菌、ならびに発酵細菌の増殖に適する炭素源の存在下で硫酸還元細菌によって使用できる適切な還元体を供給する発酵細菌を含んでなる細菌細胞の混合培養物を生育させ；その細菌細胞の混合培養物を、反応混合物を形成するために有機ハロゲン化合物とテトラピロール触媒を含む培地に接触させ；そして適切な嫌気的条件下で、該有機ハロゲンを脱ハロゲン化するのに十分な時間、その反応混合物をインキュベートすることを含んでなる有機ハロゲンの脱ハロゲン化方法を提供する。この方法において独特なことは発酵細菌が、脱ハロゲン化反応を引き出すために必要な還元体を、その代謝副産物として供給することである。さらに、タイプを決定するために、土着の細菌集団の増殖に影響する栄養素の濃度、汚染物質および条件について、そして土着の細菌の増殖を増進したり、硫酸還元条件を作り出すのに必要な補正物の濃度についてその場所を評価し；測定可能な量の硫化水素を生産させる硫酸還元条件を作り出すために、最初の補正物を用いてその場所を修正し；細菌増殖のレベルを決定し、硫酸還元条件を維持するための追加的な補正物の必要性を調査するために、最初の修正後の修正された場所の酸化還元電位と硫化物生産をモニターし；該硫酸還元条件を維持しながら、テトラピロール触媒を含む第二の補正物、最初の補正物に続くモニターにおいて得られた結果から決定された第二の補正物を用いて、その場所を修正し；そして最後に、有機ハロゲンの脱ハロゲン化に関して、その場所をモニターすることを含んでなる、土壌もしくは地下水の場所から有機ハロゲンをイン・サイチューで脱ハロゲン化する方法も、本発明の範囲内である。その上、電子伝達タンパク質からテトラピロール触媒への電子の伝達を容易にすることによって、有機ハロゲンの脱ハロゲン化速度を促進するのに役立つ電子伝達仲介体を用いて、上記方法のいずれかの反応混合物を補足することも、本発明の範囲内である。本方法によって脱ハロゲン化できる化学製品は、四塩化炭素、パークロロエチレン、クロロホルム、塩化メチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニル、およびクロロ芳香族化合物を含むが、それに限定されない種々の塩素化溶剤を包含する。図面の簡単な説明図１は、典型的な硫酸還元細胞内の還元体から、ペリプラズムチトクロームｃ₃ を通して、フラビン電子伝達タンパク質へ、そして最後にヘマチンテトラピロール触媒への電子伝達を図示したものである。図２は、Ｂ₁₂およびリボフラビンの存在下でＣＣｌ₄を脱塩素化するために、発酵細菌により生産される水素の硫酸還元菌による使用を示す図である。図３ａは、還元体および電子伝達仲介体の不在もしくは存在下で、テキサス州の工業地から得られた細菌培養物によるＣＣｌ₄からＣＣｌ₃への脱塩素化速度の測定値として、時間経過に伴うＨ₂発生量をプロットしたものである。図３ｂは、還元体および電子伝達仲介体の不在もしくは存在下で、テキサス州の工業地から得られた細菌培養物によるＣＣｌ₄からＣＣｌ₃への脱塩素化速度の測定値として、時間経過に伴うＣＣｌ₃発生量をプロットしたものである。図４ａは、還元体および電子伝達仲介体の不在もしくは存在下で、ニューヨーク州の工業地から得られた細菌培養物によるＣＣｌ₄からＣＣｌ₃への脱塩素化速度の測定値として、時間経過に伴うＨ₂発生量をプロットしたものである。図４ｂは、還元体および電子伝達仲介体の不在もしくは存在下で、ニューヨーク州の工業地から得られた細菌培養物によるＣＣｌ₄からＣＣｌ₃への脱塩素化速度の測定値として、時間経過に伴うＣＣｌ₃発生量をプロットしたものである。図５ａは、還元体および電子伝達仲介体の不在もしくは存在下で、ノースカロライナ州の工業地から得られた細菌培養物によるＣＣｌ₄からＣＣｌ₃への脱塩素化速度の測定値として、時間経過に伴うＨ₂発生量をプロットしたものである。図５ｂは、還元体および電子伝達仲介体の不在もしくは存在下で、ノースカロライナ州の工業地から得られた細菌培養物によるＣＣｌ₄からＣＣｌ₃への脱塩素化速度の測定値として、時間経過に伴うＣＣｌ₃発生量をプロットしたものである。発明の詳細な説明本発明は、チトクロームｃ₃を必要とする細胞の電子伝達経路を通してテトラピロール触媒への、生物学的に活性な還元体の共役を伴う有機ハロゲンの脱ハロゲン化方法を提供する。正常な細胞代謝の結果として、還元体からの電子伝達は、チトクロームｃ₃の還元と、続いて脱ハロゲン化反応を触媒するテトラピロールの還元を起こす。場合により、脱ハロゲン化の速度は、電子伝達タンパク質をテトラピロール触媒に一層効果的に共役させるのに役立つ電子伝達仲介体の添加によって増強されてもよい。本文に使用されるように、次の用語は、請求の範囲および明細書の解釈のために使用できる。用語「硫酸還元細菌」もしくは「硫酸還元菌」は、絶対嫌気性であり、有機化合物もしくは水素の酸化のために、電子受容体として硫酸塩を利用する細菌のいかなる種もしくは菌株をも指す。硫酸還元菌は、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、デスルホトマクルム（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ）、デスルホバクター（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ）、デスルホブルブス（Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ）、デスルホサルシナ（Ｄｅｓｕｌｆｏｓａｒｃｉｎａ）、およびデスルホネマ（Ｄｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ）を含む細菌の数種の属に属する。用語「発酵細菌」は、いかなる外因性電子受容体の不在下でも、有機基質の内部的酸化還元転位を実施できる生物を指す。一般に、発酵細菌は、絶対もしくは通性嫌気性菌であり、しばしば、水素の生産に関与できる。用語「硫酸還元条件」は、硫酸還元細菌が、硫酸塩の給源との組み合わせにおいて、硫化水素を生成するいかなる栄養素もしくは増殖条件をも指す。硫酸還元条件は、元来嫌気的であり、硫酸塩の給源の存在を必要とする。用語「嫌気的条件」は、酸素の存在を排除するいかなる増殖もしくは栄養素条件をも指す。用語「テトラピロール」は、４個のピロール環構造を含み、有機ハロゲンの還元的脱ハロゲン化を触媒できるいかなる化合物をも指す。テトラピロールは、金属イオンと複合体を形成されてもよいし、形成されなくてもよい。典型的なテトラピロールの例は、ヘマチンのようなポルフィリン、ビタミンＢ₁₂（シアノコバラミン）のようなコリン、フタロシアニン、ならびに種々の細菌性因子およびＦ４３０のような補酵素を含むが、それに限定されなくてもよい。用語「有機ハロゲン」は、フッ素、臭素、ヨウ素もしくは塩素からなるハロゲンの群の少なくとも１種を含むいかなる脂肪族もしくは芳香族化合物をも指す。本方法によって脱ハロゲン化される典型的な有機ハロゲンは、四塩化炭素、パークロロエチレン、クロロホルム、塩化メチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニルおよびクロロ芳香族化合物を含むが、それに限定されなくてもよい。用語「汚染培地」もしくは「培地」は、検出可能な有機ハロゲンを含むいかなる培地をも指す。そのような培地は、工業地からの汚染された土壌もしくは地下水、または実験室培養の培地を含んでもよい。用語「電子伝達仲介体」は、テトラピロールを還元する目的で細胞からテトラピロールへ電子を伝達でき、そしてイソアロオキサジン環構造を含むいかなる物質をも指す。典型的な電子伝達仲介体の例は、リボフラビン（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を含むフラビン類化合物のメンバーを含むが、それに限定されなくてもよい。用語「還元体」は、テトラピロールの還元を行うために、直接的（化学的）もしくは間接的（生物学的システムを通して）のいずれかでも、電子を供与できるいかなる物質をも指す。還元体は、無機物でも有機物でもよいと理解すべきである。本発明に好適な還元体の例は、水素ガス、クエン酸チタニウム、ジチオトレイトール、スクロース、乳酸塩もしくはピルビン酸塩を含むが、それに限定されなくてもよい。用語「電子伝達タンパク質」は、菌体外に位置するか、または−１００ないし −５００ｍＶの範囲内の酸化還元電位をもち、そして電子供与物質（通常には還元体）から電子受容物質（通常には触媒）へ電子を伝達する能力もつ微生物細胞膜のペリプラズム空間内に位置するタンパク質を指す。電子伝達タンパク質の典型的な例は、チトクロームｃ₃である。用語「チトクロームｃ₃」は、テトラヘム、硫酸還元細菌と会合されたペリプラズムタンパク質を指す。そのタンパク質は、−１２０ないし−４００ｍＶ間の中間点の酸化還元電位をもち、水素および硫酸還元細菌中の他の有機物からの多くの電子伝達に関与している。好適な細菌細胞は、好適なテトラピロール触媒もしくは電子伝達仲介体−触媒結合体に電子を伝達できる、外部から接近し得る電子伝達タンパク質を、唯一含有しなければならない。好適な細胞は、個々には、有機ハロゲンの酵素的脱ハロゲン化できる必要はなくて、必要な酸化還元活性の構成分が存在することのみを理解すべきである。場合により、本発明の細胞は、広範囲の環境に遍在し、そして有機ハロゲンで汚染された場所で見られるような悪条件下に耐えることが好ましい。本発明の目的のためには、硫酸還元細菌細胞が好適である。硫酸還元細菌は、種々の生態学的背景において発見されるが、海や河口の沈降物、ならびに塩水池の嫌気的環境をむしろ好む。これらの細菌の炭素源は、沈降物上に淀む水のカラムにおける従属栄養微生物の活動から引き出されるか、または直接の有機的影響、特に汚水流失のような二次的な栄養物付加によって汚染されるこれらの生育地から引き出される。（Gibson G．R.，J．Appl．Bacteriol. ，69，769（1990））。硫酸還元菌が見いだされる生育地の多様性が、それらをして本発明に対する主要な候補者とする。硫酸還元菌は、酸化的か発酵的かいずれかの反応経路において電子供与体として機能する種々の基質から代謝エネルギーを引き出す。硫酸還元に関する最も普通の還元体のあるものは、水素、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩および乳酸塩を含む（Gibson G．R.，J．Appl．Bacteriol.，69，769（1990））。硫酸還元細菌の場合に、低電位の電子は、通常は、水素もしくは有機酸の酸化の間に生じる。これらの電子への接近は、細胞外（ペリプラズム）酸化還元タンパク質チトクロームｃ₃を通して起きる。水素は、単純な糖類から複雑な多糖類までの広範囲の基質で生育する最も嫌気的な発酵細菌によって形成される非常に普遍的な発酵最終産物である。したがって、水素は、通常、多様な細菌の存在によって、沈降物中に発酵的に形成されるであろう（Odom J．M.，et al.,（ed）The Sulfate-Reducing Bacteria：Contem porary Perspectives．Publisher：Springer-Verlag，（1992））。次いで、そのように形成された水素は、種間水素伝達（Odom J．M.，et al.,（ed）The Sul fate-Reducing Bacteria：Contemporary Perspectives．Publisher：Springer-V erlag,（1992））として知られる周知の生態学的メカニズムにより、水素を消費する硫酸還元細菌によって利用されるであろう。水素に対するそれらのヒドロゲナーゼ酵素の極端に高い親和力により、硫酸還元菌は、水素ガスの特別な捕捉体となる（Odom J.M.，et al.，（ed）The Sulfate-Reducing Bacteria：Contempo rary Perspectives．Publisher：Springer-Verlag，（1992））。かくして、広範な有機物の発酵から生じる電子は、水素をへて、細菌ヒドロゲナーゼを通じて、チトクロームｃ₃に伝達され、続いて、電子は、硫酸還元を進めるためにそこで使用される（図１）。その細胞は、水素の非常に低い分圧においても、チトクロームｃ₃を還元状態に維持する。チトクロームｃ₃の還元状態での維持は、本発明におけるテトラピロール触媒の還元のための電子を供給する（図１）。糖のようなより複雑な還元体を利用する過程において、種間水素伝達および発酵細菌の役割が、以下に示される。段階１．発酵糖 →→ 有機酸＋水素＋ＣＯ₂ 段階２．発酵水素の利用による硫酸還元細菌の増殖水素＋硫酸塩 →→ 細菌集団＋Ｈ₂Ｓ（または有機酸）段階３．発酵により形成された水素を用いる硫酸還元細菌＋触媒による脱塩素化触媒水素＋Ｘ−Ｃｌ →→→→ Ｙ＋Ｃｌ− （または有機酸）また、本発明は、有機ハロゲンを還元的脱ハロゲン化できるテトラピロール触媒を提供する。好適なテトラピロールは、金属不含のポルフィリン、ヘマチンのようなメタロポルフィリン、ビタミンＢ₁₂（シアノコバラミン）のようなコリン、フタロシアニン、およびＦ４３０のような種々の細菌性因子を含むがそれに限定されず、その場合、シアノコバラミンおよびヘマチンがより好ましい。テトラピロールは、構造における類似性を共有し、それらは、すべて４個のピロール環を含む大環式金属キレートアミンである。ポルフィリンは、式Ｉに対応する環構造を含有する：式Ｉ多くのポルフィリン環システムは、自然界に存在し、例えばプロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、ウロポルフィリンおよびコプロポルフィリンを含む（ WO 8910772）。コリンは、ポルフィリンに類似するが、二重結合と単結合の位置で異なり、そして環システムにおいて１個少ない炭素をもつ環システムからなる。基本的コリン環構造は、式ＩＩに図示される：式ＩＩフタロシアニンは、ポルフィリン環システムとは、なお一層異なり、すべて式ＩＩＩで図示される構造を含む：式ＩＩＩポルフィリン、コリンおよびフタロシアニン環システムにおいては、１個以上の中心窒素原子が、１個以上の水素原子に結合されてもよいし、またはすべて４個が、１個以上の他の配位子とそれ自体付加的に複合される中心金属原子に配位結合されてもよい。ヘム、ヘマチンおよびヘミンは、すべて鉄を含むポルフィリンの例である。クロロフィルは、マグネシウムを中心にもつポルフィリンの例である。ビタミンＢ₁₂（シアノコバラミン）は、コバルトを中心にもつコリンの例である。他の既知のコバルト中心のコリンは、ジシアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、アデノシルコバラミンおよびコバロオキシムを含む（WO 8910772）。さらに、本発明は、有機ハロゲンの還元的脱ハロゲン化のために、チトクロームｃ₃還元体からテトラピロール触媒への電子伝達を助けることができる電子伝達仲介体を提供する。そのような伝達を助ける多くの物質が、自然界にも、そして技術上も知られている。フラビンタンパク質およびフラビンヌクレオチドを含むフラビンは、そのような種類の物質の１つである。フラビンは、電子伝達に関与するイソアロオキサジン環システムを共通に有し、そして式ＩＶに図示される：式ＩＶ自然界には、フラビンタンパク質は、ピルビン酸・脂肪酸・アミノ酸の酸化的分解において、そしてまた電子伝達の過程において機能している。フラビンタンパク質は、ヌクレオチドと複合されて、フラビンヌクレオチドを形成することもある。典型的なフラビンヌクレオチドの例は、リボフラビンとアデニン塩基の複合体であるフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、そしてＦＡＤの還元型を表すフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む。フラビンヌクレオチドは、触媒サイクルにおいてイソアロオキサジン環の可逆的還元を受けて、ＦＭＮＨ２およびＦＡＤＨ２で表される還元されたフラビンヌクレオチドになる。自然には、多くのデヒドロゲナーゼとオキシダーゼ酵素は、フラビンと複合されており、電子受容体と反応する力をイソアロオキサジン環に頼っている。いくつかのフラビンタンパク質は、同時に２個の電子伝達によって、完全酸化型と完全還元型の間を往復するけれども、その他は、それらの触媒サイクルにおいて１度に１個の電子のみを伝達するらしく、その結果電子対を裂くことができる。本発明の目的のために、適切な電子伝達仲介体は、フラビンタンパク質とフラビンヌクレオチドを含むフラビンを包含するが、リボフラビンが、最も好適である。電子伝達仲介体は、有機ハロゲンの脱ハロゲン化を促進するけれども、それが、電子伝達タンパク質をテトラピロール触媒に結合させるために絶対的に必要なものではないことに注意すべきである。本発明の好適な実施態様では、種々の塩素化溶剤の脱塩素化を実施するために、硫酸還元細菌細胞は、電子仲介体とテトラピロール触媒の存在下で培養される。適切な細胞は、デスルホビブリオ属の細胞を含み、そしてデスルホビブリオ・ギガス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｇｉｇａｓ）ＡＴＣＣ１９３６４、デスルホビブリオ・デスルフリカンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ２７７７４、デスルホビブリオ・デスルフリカンス・ノルウェー、デスルホビブリオ・デスルフリカンスＧ１００Ａおよびデスルホビブリオ・サレキシゲンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）ＡＴＣＣ１４８２２を含む。細胞の保存液は、炭素源として乳酸ナトリウムと電子受容体として硫酸ナトリウムを含む標準培地において、１０⁹細胞／ｍｌの濃度に達するまで３０℃で培養された。細胞は、蒸留水中で濃縮されて約１０¹⁰細胞／ｍｌの濃度にして、脱塩素化実験に使用された。保存液からの細胞は、リボフラビン（電子伝達仲介体）とシアノコバラミン（テトラピロール触媒）を含む溶液と混合され、そして四塩化炭素の添加前に、１００％水素ガスを用いて３０分間ガス通気された。四塩化炭素の最終濃度は、５μＭのオーダーであった。反応は、時間ないし日にちの期間でモニターされた。塩素化化合物の分析は、キャリヤーガスとしてヘリウムを用いるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０ガスクロマトグラフでの標準法によるガスクロマトグラフィーによって行われた。本発明のその他の好適な実施態様では、種々の塩素化溶剤の脱塩素化を実施するために、硫酸還元細菌細胞は、テトラピロール触媒のみの存在下で培養される。脱塩素化は、遅い速度で進行するけれども、本発明のこの全く予測されなかった態様は、脱塩素化が、電子伝達仲介体の不在下でも進行できることを例証する。この実施態様を具体的に説明するために、硫酸還元菌の培養物が増殖され、そしてテトラピロールヘマチンの存在下で、リボフラビンのある場合とない場合でインキュベートされた。すべての反応混合液は、１００％水素下で３０分間上記のようにインキュベートされ、次いで、その反応は、ＣＣｌ₄３ｕＬを添加して始められた。サンプルは、数時間にわたってガスクロマトグラフィー分析のために採取され、四塩化炭素（ＣＣｌ₄）のクロロホルム（ＣＨＣｌ₃）への転換を検討した。表ＩＶとＶ（実施例３）に示されたデータは、ヘマチン単独でも、脱塩素化反応を進めるのに十分であることを示唆している。本発明のその他の実施態様では、塩素化溶剤の脱塩素化は、細菌ヒドロゲナーゼ、精製チトクロームｃ₃、電子伝達仲介体およびテトラピロール触媒を含む反応混合液の混合インキュベーションによってイン・ビトロで行われてもよい。好適な実施態様では、電子伝達仲介体は、リボフラビンであり、そしてテトラピロールは、ヘマチンか、もしくはシアノコバラミンかのいずれかであった。イン・ビボの実施態様によるのと同様に、反応混合液は、四塩化炭素の添加前に３０分間、１００％水素によりガス通気された。脱塩素化の速度は、標準法を用いるガスクロマトグラフィー分析によって、四塩化炭素のクロロホルムへの転換に基づき決定された。インビトロの実施態様は、溶剤の脱塩素化について水素からＢ₁₂ への電子の伝達を可能にする。チトクロームｃ₃の精製方法は、技術上既知である。Eng L.，et al.，Arch Mi crobiol.，153，60（1992）は、唯一のクロマトグラフィー段階を伴う方法を詳述しているが、技術は、一般には、両疎水性交互作用、ゲル濾過およびイオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィー段階の組み合わせを含む（Moura I.，et al. ，Eur．J．Biochem，162，547（1987）；Ziomek，E.，et al.，Prep．Biochem.，14，75（1984））。Ｄ．ギガス由来のチトクロームｃ₃を電気泳動的均一性まで精製する好適な方法は、本質的には、引用によって本明細書中に組み入れられるVan der Westen，et al.，FEBS Lett. ，86，122（1978）によって記述されたものに従う。簡単には、細胞はホモジナイズされ、そして細胞抽出液は、６０％硫酸アンモニウムにされて、フェニルセファロースでのクロマトグラフィー、続いてＤＥ−５２セルロースイオン交換にかけられた。この方法により、いかなる脱塩素化活性をも欠き、イン・ビトロ実験の使用に適する、５５０ｎｍと２８０ｎｍにおける吸光度比に基づいて高純度の生産物を得た。硫酸還元細菌のヒドロゲナーゼ酵素は、硫酸還元のために水素の酸化に関与する。細菌ヒドロゲナーゼの精製法は、技術上既知であり、一般に、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティーもしくは疎水性交互作用クロマトグラフィーの組み合わせを必要とする（Doherty，G.，et al.，Biochem．Soc．Trans.，15，301（19 87）；Pusheva M．A.，et al.，Prikl．Biokhim．Mikrobiol.，23，185（1987））。硫酸アンモニウムもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる最初の分画を伴う方法は、また既知である（Arp．D.，et al.，Biochem．Biophys．A cta.，570，221（1979））。本発明の目的のために、引用によって本明細書中に組み入れられるVan der westen，et al.，FEBS Lett.，86，122（1978）によって記述されるように、ヒドロゲナーゼは、本質的には、トリス−ＥＤＴＡバッファーを用いて、Ｄ．ギガスの全細胞を洗浄することによって部分精製された。透析の後、そのタンパク質は、イオン交換カラム上への吸着によって部分精製され、１００ｍＭトリスバッファー中に溶出された。ヒドロゲナーゼは、亜二チオン酸塩還元されたサンプルの分光測光法分析によってチトクロームｃ₃を含まないことが決定された。これらのサンプルは、還元チトクロームｃ₃の存在の診断と見做される５５０ｎｍの吸収を欠くことが分かった。その他の実施態様では、本発明は、共存する発酵細菌種の代謝物の形で、還元体が、間接的に硫酸還元菌に供給される場合の塩素化溶剤の脱塩素化方法を提供する。絶対嫌気性菌（クロストリジア種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｓｐ．））と硫酸還元菌の混合培養は、単一炭素源としてグルコースの存在での嫌気的条件下で生育される。グルコースは、クロストリジアに対する共通の炭素源であるが、硫酸還元菌によっては利用できない。これらの条件下で、クロストリジアは、グルコースを利用し、副産物として水素を生産するのが見られる。発酵菌と硫酸還元細菌の代謝的共存は、種間水素伝達の過程として技術上周知であり、文献に詳細に記述されている（Odom J．M.，et al.，（ed）The Sulfate-Reducing Bacteria ：Contemporary Perspectives．Publisher：Springer-Verlag，（1992））。混合培養が、硫化物生産の証拠を明らかにした場合には、培養物からの細胞は、溶剤を脱塩素化する能力を試験された。混合培養からの細胞、テトラピロール（シアノコバラミン）および電子伝達仲介体（リボフラビン）を含む反応混合液が、調製された。この反応混合液が、ＣＣｌ₄の脱塩素化能について試験された。図２に示されたデータは、四塩化炭素が添加されるまで、水素がグルコースから発生し、その添加時点において、水素が取り込まれ、そしてデスルホビブリオ −テトラピロール複合体によって四塩化炭素をクロロホルムに還元するのに使用されることを示している。さらに、本発明は、有機ハロゲンで汚染された土壌と地下水をイン・サイチューで修復する方法を提供する。有機ハロゲンのような汚染物質によって汚染されてしまった地下水を管理する慣用の技術は、４部類：（１）物理的バリヤー（すなわち、スラリー遮断壁もしくはシート・パイル設置）または注入や汲み上げ井戸のシステムによって作られる水圧バリヤーのいずれかを用いる汚染物質の保持；（２）地上の処理工程までの汚染地下水の汲み上げ、続く処理水の廃棄もしくは再利用；（３）汚染土壌の除去、続いての土壌処理もしくは廃棄；そして（４）含水汚染物質のその場所での（ｉｎ−ｐｌａｃｅ）安定化、に分類できる。しばしば、実際には、これらの変法の１つ以上の組み合わせ、例えば、汚染地下水の汲み上げ・処理工程と組み合わせて、もっとも高度に汚染された土壌を発掘する方法が使用される。これらの数種の方法が、米国特許第5,057号に開示されている。一般に、慣用の汲み上げ・処理方法は、Jhaveri（米国特許第4,401,569号）において記述されたように、地上の処理施設との組み合わせにおいて、任意に、溝、注入井戸、モニター井戸および再循環井戸の複合システムに頼る。典型的には、種々の機能を果たす井戸が、汚染透水層中に掘られる。地下水中に栄養素を導入するための注入井戸は、汚染された広がり（ｐｌｕｍｅ）の上流に掘られ、一方、汚染物質と細菌代謝産物のレベルについて、透水層を分析するためのモニター井戸は、注入井戸の下流に置かれる。井戸の数と容積は場所に特異的であり、修復される領域の大きさ、透水層の流速および汚染のレベルを含む種々のファクターに依存する。一般に、その場所の深部の（ｉｎ−ｄｅｐｔｈ）調査は，修復が始められる前に解決されるべき問題を決定するのに必要である。汚染物質の濃度は、法規制と修復に許される時間の評価と同様に重要である。このことは、この方法における修復のコストとフィジビリティーを考慮する場合のファクターになる。修復に必要な他の物質の存在および増強された土着の微生物集団に対するそれらの影響、ならびに勧告されるヒトへの曝露レベル、およびそれらの存在と取り扱いに関連する環境上の危険もまた、考慮されるべきファクターである。現地の最初の調査には、汚染された培地の種々の物理的および化学的特性の評価が含まれねばならない。培地は、増強された微生物の生育を支えられねばならないし、またそうすることができるように作られねばならない。土壌と水の化学の種々の様相もまた、修復工程の実効性に影響するであろうし、そしてより好ましい条件が、土着の微生物の増殖速度と修復されるべき汚染物質の生物学的利用能の両方を最大のものにするであろう。一般に、土壌もしくは地下水のｐＨが、ｐＨ５〜ｐＨ８の範囲内である場合に好適である。リン酸塩は、ほとんどの微生物集団に対して必要である。土壌もしくは地下水は、定常状態の微生物増殖に匹敵するレベルにあるリン酸塩濃度を維持するように、補足されてもよい。しかしながら、リン酸塩の高レベルは、土壌の浸透性を減少させるような微生物の広がりを生み出すかも知れないので、リン酸塩の添加をモニターすることが必要である。バイオ修復の多くの標準的汲み上げ・処理法のいくつかの評論が、以下のものに記述されている：Site Characterization for subsurface remediation．EPA Seminar Pub1icat ion．EPA/625/4-91/026（November 1991）．U.S．EPA 0ffice of Research & De velopment Washington DC.， The Superfund InovativeTechno1ogy Program：Technology Profiles Fifth Edi tion．EPA/540/R-92/077（November 1992）．U.S．EPA Office of Solid Wastes and Emergency Responses．Washigton DC 20460；米国特許第4,832,122号；Mov ing Beyond Pump-and-Treat.，Ann Hasbach（1993）．Pollution Engineering． March 15，1993 and Remediation of Contaminated Sediments，EPA Handbook， EPA/625/6-91/028（April1991）. テトラピロールに触媒された還元的脱塩素化を通してのイン・サイチューでのバイオ修復は、２段階工程によって実施できることが考えられる。第１段階は、発酵性基質と少量のリン酸塩を沈降物に添加して、発酵細菌と硫酸還元細菌の集団を発生させることを含むであろう。これは、現在行われるほとんどのバイオ修復の努力において起きる自然的、自発的工程である。第２段階は、チトクロームＣ₃に直接共役するであろう沈降物に、テトラピロールと仲介体、テトラピロールー仲介体複合体、またはテトラピロールを添加して、還元的脱塩素化を実施することを含むであろう。嫌気的代謝の間に生成される低電位の電子が、テトラピロール触媒を利用できるようにすることが期待されるであろう。地表下の環境には、発酵細菌が遍在しており、この触媒に対して還元性の等価物を提供するであろう。硫酸還元細菌においては、水素酸化から生じる低電位電子は、細胞の代謝に中心的な重要性をもつ。硫酸還元菌は、その細胞表面での局在と中間点電位のために、テトラピロール触媒に共役するであろう菌体外の低電位（−３００ｍＶ）チトクロームｃ₃を含む。本発明は、化学触媒（テトラピロール）による還元的脱塩素化が、菌体外電子伝達を通じて、生きている微生物の電子伝達鎖に共役できるという新規な発見を教える。この発見の重要な点は、今や、脱塩素化できない嫌気性菌が、通常の代謝過程と触媒への菌体外電子伝達を通して、還元的脱塩素化に関与できるということである。硫酸還元細菌の場合には、低電位電子は、通常、水素もしくは有機酸の酸化の間に生成される。これらの電子への接近は、菌体外（ペリプラズム）の酸化還元タンパク質チトクロームｃ₃を通して起きる。強い還元体に対する化学触媒の要求は、地下水に高濃度の還元剤を添加せずに、環境上受容できる方法において、このスキムに適合される。ヘマチンとＢ₁₂が、天然に存在する化合物であることも、注目されるべきである。さらに、本方法は、デスルホビブリオの細胞、リボフラビン、およびコバルト含有（シアノコバラミン）か、鉄含有（ヘマチン）のいずれかのピロールが、電子の給源としての水素、ピルビン酸もしくは乳酸を用いて、脱塩素化するであろうことを開示する。水素は、発酵細菌の普通に生産される副産物であり、硫酸還元菌のためのすぐ使える基質として役立つことができる。水素に対する硫酸還元ヒドロゲナーゼ酵素の高い親和力が、水素の非常に低い分圧においてさえも、チトクロームｃ₃と脱塩素化触媒を活性な還元状態に維持することになる。その結果、低濃度の発酵性基質（すなわち、糖、酵母エキス、等）のみが、電子伝達過程を進めるために存在する必要がある。次の実施例は、本発明を具体的に説明するために用いられるべきであり、いかなる点においても、それを限定するものと解釈されてはならない。実施例一般的方法微生物の培養：炭素源として乳酸ナトリウムおよび電子受容体として硫酸ナトリウムを用いる増殖培地を、Odom et al，Appl．Environ．Microbiol.，57，727（1991）に記載のように硫酸還元細菌の増殖のために使用した。硫酸還元細菌デスルホビブリオ・ギガスＡＴＣＣ１９３６４、デスルホビブリオ・デスルフリカンスＡＴＣＣ２７７７４、デスルホビブリオ・デスルフリカンス・ノルウェー、デスルホビブリオ・デスルフリカンスＧ１００Ａおよびデスルホビブリオ・サレキシゲンスＡＴＣＣ１４８２２の菌株を、Dr．H．D．Peck，デパートメント・オブ・バイオケミストリー、ユニバーシチー・オブ・ジョージア、アテンス、ジー・エー 30601 （Department of Biochemistry，University of Georgia，Athens，GA 30601）から得た。ＡＴＣＣ名をもつ菌株は、ザ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、12301パークロー・ドライブ、ロックビル、エム・ディーユー・エス・エー20852（the American Type Culture Collection，12301 Parklaw Dri ve，Rockvi11e，MD USA 20852）に寄託されている。培養物を一夜増殖させ、そして細胞を、２０，０００ｘｇで２０分間遠心して集菌した。脱塩素化アッセイのために、細胞懸濁液を、遠心により少なくとも１０倍に濃縮し、次いで、少量の蒸留水に再懸濁した。精製タンパク質：ヒドロゲナーゼを、実際に、引用によって本明細書に組み入れられているVan der Westen et al.，FEBS Lett．86，122（1978）に記載のｐＨ９トリス−ＥＤＴＡバッファーを用いて、Ｄ．ギガスの全細胞を洗浄することによって部分精製した。そのｐＨ９トリス−ＥＤＴＡ細胞洗浄液を、蒸留水の２０倍希釈液に対して２回透析した。そのタンパク質を、１０ｍＭトリスｐＨ８で予め平衡化したＷｈａｔｍａｎＤＥ５２（４．５ｃｍｘ１０ｃｍ）カラム上に吸着させて、部分精製した。そのカラムを、１０ｍＭトリス、１００ｍＭトリスおよび５００ｍＭトリスにより連続して洗浄した。ヒドロゲナーゼは、１００ｍＭトリス画分に溶出し、亜二チオン酸塩還元されたサンプルの分光測光分析によってチトクロームｃ₃を含まないと決定された。チトクロームｃ₃を、引用によって本明細書に組み入れられているVander West en et al.，FEBS Lett．86，122（1978）に記載のｐＨ９トリス−ＥＤＴＡを用いて、全細胞ペースト２０ｇからチトクロームを最初に抽出することによって、Ｄ．ギガスから電気泳動的に均一なものに精製した。抽出されたチトクロームを、２５ｍＭＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７中で硫酸アンモニウムにより６０％飽和に調整し、フェニルセファロース・カラム（２．５ｃｍｘ１０ｃｍ）上に添加した。そのカラムを、１０％硫酸アンモニウムにおける２５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７で洗浄し、チトクロームを、２５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７で溶出した。次いで、チトクロームを、直接、２５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７で平衡化したＷｈａｔｍａｎＤＥ５２カラムに適用した。そのカラムを、平衡化バッファーで洗浄し、タンパク質を、２５ｍＭＨＥＰＥＳ１００ｍＭＮａＣｌを用いて溶出した。得られた生産物の分光測光分析を、引用によって本明細書に組み入れられているMoura，I. ，et al.，Eur．J．Biochem.，176，365（1988）に記載のプロトコールに従って行った。ガスクロマトグラフィー分析：四塩化炭素（Aldrich Chemical Co.）とクロロホルムの分析は、ＨＰ−５カラムと炎イオン化検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０ガスクロマトグラフで行った。分析方法は、３５℃から１５０℃までの１５ｄｅｇ／ｍｉｎ温度勾配、検出温度２００℃、注入温度１５０℃からなった。キャリヤーガスは、５０ｍｌ／ｍｉｎでのヘリウムであった。サンプルは、揮発性汚染物質を含む１００μｌまでのガスヘッドスペースからなった。水素生産の測定を、ＰｏｒａＰａｋＱカラムと熱検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８８８ガスクロマトグラフを用いて行った。分析方法は、キャリヤーガスをアルゴンとした８０℃から１５０℃までの１５ｄｅｇ／ｍｉｎ温度勾配からなった。実施例１精製タンパク質とシアノコバラミンを用いるＣＣｌ₄のイン・ビトロでの脱塩素化実施例１は、Ｄ．ギガスからの精製チトクロームｃ₃とヒドロゲナーゼの存在下で、電子伝達仲介体としてリボフラビンおよびテトラピロール触媒としてシアノコバラミンを用いて、ＣＣｌ₄のＣＨ₃Ｃｌ₃へのイン・ビトロ脱塩素化を例証する。ヒドロゲナーゼは、硫酸還元菌においてチトクロームｃ₃への天然の電子供与体であるので、精製ヒドロゲナーゼが、チトクロームを還元するのに使用された。ヒドロゲナーゼとチトクロームｃ₃は、上記のように精製された。ヒドロゲナーゼ５０μｌ；チトクロームｃ₃（１２ｎｍｏｌ／ｍｌ）１５０μｌ；リボフラビン（１ｍＭ）１００μｌ；そしてシアノコバラミンかヘマチンのいずれか（１ｍＭ）１００μｌのインキュベーション混合液を、ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．５で総容量２ｍｌに作製した。反応混合液を、３０分間、水素ガスで通気し、次いで、四塩化炭素３μｌをその反応の開始時に添加した。ガス通気後、その混合液を、弱い撹拌をしつつ２０．３時間３０℃でインキュベートした。ガス相のサンプルを、上記のように四塩化炭素（ＣＣｌ₄）とクロロホルム（ＣＨＣｌ₃）のガスクロマトグラフィー分析のために採取した。ＣＣｌ₄のＣＨ₃ Ｃｌ₃への脱塩素化を示すデータは、表Ｉに示される。表１に示されたデータは、リボフラビンとテトラピロール触媒の両方が、反応混合液に存在する場合に、ＣＣｌ₄のＣＨ₃Ｃｌ₃への脱塩素化が、非常に促進されることを示している。テトラピロール触媒は、コバルト含有（シアノコバラミン、Ｂ₁₂）でも鉄含有（ヘマチン）でもよい。リボフラビン、Ｂ₁₂もしくはヘマチン単独では、この実験の時間経過では低すぎて有意とは言えない生産レベルのクロロホルムを生じた。これらの触媒のみの効果は、さらに次の実験において検討されるであろう。低レベルのクロロホルムは、全ての反応混合液で検出されるけれども、ヒドロゲナーゼ＋ｃ₃よりも３０〜１００倍高いレベルでの脱塩素化は、リボフラビンとテトラピロール触媒の両方が存在する場合に観察された。これらの結果は、リボフラビンが、チトクロームｃ₃とテトラピロール間の電子伝達仲介体として働く場合の先に示した電子伝達シーケンスによってのみ説明することができる。水素ガスは、反応のための究極の還元体である。実施例２Ｄ．ギガス細菌細胞と還元体としての水素を用いる四塩化炭素の脱塩素化Ｄ．ギガス細胞数の影響実施例２は、単一の硫酸還元種、Ｄ．ギガスの全細胞を用いるＣＣｌ₄のＣＨＣｌ₃への脱塩素化を具体的に説明する。Ｄ．ギガスの培養は、上記のように行う。細胞濃度が１０⁹細胞／ｍｌに達した後、遠心によって集菌され、蒸留水中に大体１０¹⁰細胞／ｍｌの濃度で再懸濁されて、保存液として使用された。４種の反応混合液を、リボフラビン（１ｍＭ）１００μｌ；シアノコバラミン（１ｍＭ）１００μｌすべてを、ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．５中に含む混合液に、細胞保存液１０μｌ、５０μｌ、２００μｌもしくは１０００μｌのいずれかを添加することによって調製し、最終容量２ｍｌにした。実施例１のように、その混合液を、３０分間、水素ガスで通気し、次いで、反応を、四塩化炭素３μｌを添加して開始した。２２時間後、ガス相のサンプルを採取して、上記のように四塩化炭素（ＣＣｌ₄）とクロロホルム（ＣＨＣｌ₃）をガスクロマトグラフィーで分析した。種々の量のＤ．ギガス細胞を用いるＣＣｌ₄のＣＨ₃Ｃｌ₃への脱塩素化を示すデータは、表ＩＩに示される。表ＩＩに表された結果は、固定量のリボフラビンとシアノコバラミンの存在下で、形成される総生産物が、細胞数に依存することを示す。シアノコバラミン濃度の影響脱塩素化の速度へのテトラピロール触媒の影響を測定するために、Ｄ．ギガス細胞１０００μｌと１ｍＭリボフラビン１００μｌを含む反応混合液を、シアノコバラミンの濃度を変えて調製した。４種の反応混合液を、１ｍＭシアノコバラミンを０、２０μｌ、５０μｌ、１００μｌもしくは２００μｌのいずれかを含んで調製した。全反応混合液を、３０分間、１００％水素下で上記のようにインキュベートし、次いで、反応を、ＣＣｌ₄３μｌを添加して開始した。全反応を、インキュベーション５時間後に停止し、サンプルを、上記のように四塩化炭素（ＣＣｌ₄）とクロロホルム（ＣＨＣｌ₃）のガスクロマトグラフィーでの分析のために採取した。脱塩素化の速度に及ぼすシアノコバラミン濃度の影響を例証するデータは、表ＩＩＩに示される。表ＩＩＩに示されたデータは、リボフラビンが、細胞表面のチトクロームｃ₃ と触媒作用を行うシアノコバラミンの間の電子伝達を仲介しているというスキムを支持する。その上、表ＩＩＩに示されたデータは、シアノコバラミンが、ヘマチンのように、触媒機構の一活性部分であり得ることを説明している。実施例３電子伝達仲介体のある場合とない場合のＤ．ギガス細菌細胞を用いる四塩化炭素の脱塩素化実施例３は、脱塩素化が、遅い速度ではあるが、電子伝達仲介体の不在下で進行できることを例証する。Ｄ．ギガス細胞の培養は、上記のように行う。３種の反応混合液が、細胞液１ｍｌ、１００μＭヘマチン中細胞液１ｍｌ、または１００μＭヘマチンと１００ μＭリボフラビン添加された細胞液１ｍｌのいずれかを含んで調製された。全反応混合液を、３０分間、１００％水素下で上記のようにインキュベートし、次いで、反応を、ＣＣｌ₄３μｌを添加して開始した。サンプルを、０、１、２、３、４および７１時間目にガスクロマトグラフィーでの分析のために採取し、上記のように四塩化炭素（ＣＣｌ₄）とクロロホルム（ＣＨＣｌ₃）の検出に使用した。全時点における脱塩素化の速度を示すデータは、表ＩＶに示される。テトラピロール触媒のみの存在下でも、電子伝達仲介体を含まない場合に、ＣＣｌ₄のＣＨ₃Ｃｌ₃への有意な脱塩素化があることが、表ＩＶのデータから証明される。リボフラビンの添加は、脱塩素化の速度を約２５倍増進すると見られる。電子伝達仲介体の不在下での脱塩素化速度に及ぼすテトラピロール触媒の濃度の相対的影響を決定するために、Ｄ．ギガス細胞を上記のように増殖させ、反応混合液を、０、２５μＭヘマチン、１２５μＭヘマチン、２５０μＭヘマチン、および１００μＭリボフラビン添加の２５０μＭヘマチンのいずれかを含んで調製した。全反応混合液を、３０分間、１００％水素下で上記のようにインキュベートし、次いで、反応を、ＣＣｌ₄３μｌを添加して開始した。サンプルを、０、１、２、３．４、４．４、１８．９および９１時間目にガスクロマトグラフィーでの分析のために採取し、上記のように四塩化炭素（ＣＣｌ₄ ）とクロロホルム（ＣＨＣｌ₃）の検出に使用した。全時点における脱塩素化の速度を示すデータは、表Ｖに示される。表Ｖのデータで分かるように、１２５μＭ以上のヘマチン濃度は、脱塩素化速度にほとんど影響しない。表ＩＶおよびＶは、ヘマチンが、リボフラビン不在下で細胞に直接共役できることを示している。このことは、細胞からヘマチンへのいくらかの電子の流れがあり、そしてこの流れが、リボフラビンによって非常に促進されることを示す重要な観察である。ヘマチンのみでの促進は、大体２５〜１２５μＭヘマチンで飽和する。表Ｉ−Ｖからのデータは、脱塩素化に対するテトラピロール触媒、細胞およびリボフラビンの要求性を表している。実施例４電子供与体として種々の炭素源を用いるＤ．ギガスによるＣＣｌ₄の脱塩素化上記脱塩素化反応において、水素ガスが、イン・ビボかイン・ビトロのいずれかのヒドロゲナーゼ系の唯一の還元体として用いられた。水素は、発酵最終産物として普通に形成されるし、熱力学的にＥ’値−４００ｍＶであるので良好な基質である。有機酸もまた、Ｄ．ギガスの増殖に対する良好な電子供与体として役立つ。この実施例は、シアノコバラミンに触媒される脱塩素化の進行における乳酸ナトリウム（Ｅ’−１９０ｍＶ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｅ’−７００ｍＶ）および水素（Ｅ’−４００ｍＶ）の相対的能力を比較する。Ｄ．ギガス細胞保存液を、実施例２のように調製した。３種の反応混合液を、リボフラビン（１ｍＭ）１００μｌ；シアノコバラミン（１ｍＭ）１００μｌすべてを、ＨＥＰＥＳバッファ−ｐＨ７．５中に含む混合液に、細胞保存液１０００μｌを添加することによって調製し、最終容量２ｍｌにした。１つの反応混合液を、上記のように３０分間、１００％水素でガス通気した。第２および第３の反応混合液を、３０ｍＭ乳酸ナトリウムか３０ｍＭピルビン酸ナトリウムかいずれかにして、１００％アルゴン下で３０分間通気した。上記のように、ＣＣｌ₄３μｌを、各反応混合液に添加して、反応を開始した。２８時間後に、反応を停止し、ガス相のサンプルを採取して、上記のように四塩化炭素（ＣＣｌ₄）とクロロホルム（ＣＨＣｌ₃）のガスクロマトグラフィーで分析した。別の炭素源を用いるＣＣｌ₄のＣＨ₃Ｃｌ₃への脱塩素化を例証するデータは、表ＶＩに示される。表ＶＩに示された結果は、低電位酸化（水素およびピルビン酸）が、より高い電位の乳酸酸化よりも約４倍速い速度で脱塩素化を起こしたことを示す。この結果は、デスルホビブリオ−テトラピロール脱塩素化系を進めるための最良の基質は、低電位をもつものであろうことを示唆する。水素酸化は、−４００ｍＶで起きる。水素は、ほとんどの沈降物中の微生物の食物連鎖の中間体として生じる生態学的に重要な遍在する物質である。水素は、上記のように広い種類の細菌による発酵作用の結果として、広範な有機物から生じ得る。実施例５Ｃ．ベイジェリンキイ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）とデスルホビブリオ −テトラピロール複合体間の種間水素伝達による脱塩素化実施例５は、デスルホビブリオによって直接に利用されない有機物が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種のような非硫酸還元発酵細菌による主要な最終産物としての水素を用いて発酵できることを例証する。クロストリジウム菌は、ほとんどの透水層から培養できる遍在性の土壌微生物である。Ｄ．デスルリカンスＧ１００Ａとクロストリジウム・ベイジェリンキの両菌の培養物を、試験のために１０¹⁰細胞／ｍｌの濃度まで増殖させた。Ｄ．デスルリカンスＧ１００Ａを、Ｄ．ギガスについて先に略述したプロトコールに従って増殖させた。クロストリジウム・ベイジェリンキイ（起源、ＡＴＣＣ＃）は，硫酸ナトリウムか乳酸ナトリウムを欠き、５ｍＭグルコースを補足したＢＴＺ−３培地上で嫌気的に増殖させた。これらの増殖条件下で、微生物は、糖類を発酵して水素、二酸化炭素および有機酸にすることが知られている（Gibson G．R.，J．A ppl．Bacteriol.，69，769（1990））。Ｃ．ベイジェリンキイ４．０ｍｌ；Ｄ．デスルフリカンスＧ１００Ａ（硫酸還元菌）４．０ｍｌ；シアノコバラミン（１ｍＭ）４００μｌ；リボフラビン（１ｍＭ）８００μｌ；およびグルコース（１Ｍ）４６μｌを含む反応混合液を、調製した。反応混合液を、３０分間、１００％アルゴンをガス通気し、反応を、ＣＣｌ₄９μｌを添加して開始した。水素の発生と四塩化炭素添加と同時の再取り込み、およびクロロホルムの出現を示す結果を、図２に示す。図２は、四塩化炭素が添加されるまで、水素がグルコースから発生し、添加時点において水素は取り込まれ、デスルホビブリオ−テトラピロール複合体によって、四塩化炭素をクロロホルムヘ還元するために使用されることを示している。実施例６細菌源として含水沈降物を用いる種間水素伝達による脱塩素化実施例６は、塩素化溶媒で汚染された工業地からの沈降物サンプルから分離された自然に存在する細菌が、適当なテトラピロール触媒と電子伝達仲介体の添加により、これらの溶媒の脱塩素化を実施するために利用できることを例証する。ビクトリア、テキサス（Victoria，texas）；キンストン、エヌ・カロライナ（Kinston，N．Carolina）；およびナイアガラ、ニューヨーク（Niagara，New Y ork）の汚染された工業地からの沈降物サンプルを、２０ｍＭ硫酸ナトリウムの存在（硫酸還元条件）で、単一炭素源としてグルコースを用いる菌集積培養物（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のための種菌として使用した。含水沈降物サンプルは、すべて塩素化溶媒で汚染された地域から得られた。このような菌集積培養物が、グルコース発酵細菌と硫酸還元細菌の両方を含むことはよく知られている。沈降物サンプルを、５ｍＭグルコースと２０ｍＭ硫酸ナトリウムを補足されたＢＴＺ−３培地中に植菌し、アルゴン下で１週間３０℃で培養し、そして引用によって本明細書に組み入れられるSiegal，L．M.，Method in Enzymology，53d， 419（1979）に記載された方法によって、硫化物の生産をモニターした。硫化物生産を例証する培養物は、盛んに増殖する硫酸還元細菌を含んでいると考えられるが、硫酸還元菌はグルコースを利用できないので、それ故、硫化物生産は、発酵細菌によって作られた分解産物の硫酸還元代謝を通してのみ起きることができる。硫化物生産を例証する培養物を、脱塩素化実験のための反応混合液に使用した。反応混合液は、細胞（細胞密度は、約１０⁹細胞／ｍｌと評価された）１ｍｌ、１００ｕＭシアノコバラミン、１００ｕＭリボフラビン、５ｍＭグルコース、リン酸バッファーｐＨ７２５ｍＭからなった。反応を、四塩化炭素１．５μｌの添加で開始し、そしてサンプルを、０〜１２時間まで一定間隔で採取し、上記のようにクロロホルムと水素の形成について分析した。発酵細菌構成分からの水素生産の上昇に対応する硫酸還元菌によるＣＣｌ₄の脱塩素化を例証するデータを、図３，４および５に図示する。図３，４，５の各々に図示されるように、汚染透水層からの細菌の自然のままの菌集積培養物は、グルコース発酵によって急速に水素を生産することが分かった。四塩化炭素に依存する水素の取り込みは、リボフラビン−シアノコバラミン混合物の存在によって著しく増強されることが観察された。図３に見られるように、水素生産は、四塩化炭素不在でも継続するが、四塩化炭素存在下では、水素生産は、初期の突然の発生後はフラットになり、等しい生産と消費の速度を示していると思われる。四塩化炭素とリボフラビン−シアノコバラミン混合物の両方の存在では、急速な水素の再取り込みが、四塩化炭素の存在で見られた。同様な効果は、図４および５において具体的に説明される。全ての場合、四塩化炭素依存の水素の取り込みは、リボフラビン−シアノコバラミン混合物の存在によって著しく増強された。細菌の集積培養物それ自体は、時には、リボフラビン−シアノコバラミンの不在下で四塩化炭素を脱塩素化したが、これらの薬剤の添加は、クロロホルムの出現速度を著しく促進した。実施例７異種のデスルホビブリオに共役されたテトラピロールに触媒される脱塩素化実施例７は、脱塩素化反応を行うべき異種の硫酸還元細菌の相対的能力ならびに細胞膜の部分としてのチトクロームｃ₃電子伝達タンパク質の必要性を具体的に説明する。Ｄ．ギガス、Ｄ．デスルフリカンスＧ１００Ａ、Ｄ．サレキシゲンス、Ｄ．デスルフリカンス（ノルウェー）、ならびにチトクロームｃ₃を欠く２種のネガティブ対照の微生物、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）およびパラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）が，単一還元体としての水素を用いてリボフラビン−シアノコバラミン電子伝達複合体に共役するそれらの能力について試験された。保存液を、実施例２に記載のように、全ての細胞について調製した。全ての反応液は、リボフラビン（１ｍＭ）１００μｌおよびシアノコバラミン（１ｍＭ）１００μｌすべてを、ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．５中に含む混合液に、細胞懸濁液１ｍｌを含み、そして、最終容量２ｍｌにした。実施例２におけるように、混合液を、３０分間、水素でガス通気し、その反応を、四塩化炭素３μｌを添加して開始した。５時間後に、ガス相のサンプルを採取して、上記のように四塩化炭素（ＣＣｌ₄）とクロロホルム（ＣＨＣｌ₃）をガスクロマトグラフィーで分析した。異なる細胞種の細胞を用いるＣＣｌ₄のＣＨ₃Ｃｌ₃への脱塩素化を例証するデータは、表ＶＩＩに示される。結果は、相対的活性の評価を容易にするために、比活性（生産物ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）として表される。表ＶＩＩに示されたデータは、Ｄ．サレキシゲンスおよびＤ．ギガスが、Ｄ．デスルフリカンス株のいずれよりも約１２倍高い速度でＣＣｌ₄のＣＨＣｌ₃への脱塩素化を進めることを例証する。予側されたように、ペリプラズムのチトクロームｃ₃タンパク質を欠く細菌（Ｅ．コリおよびＰ．デニトリフィカンス）は、脱塩素化活性を示さなかった。実施例８Ｄ．ギガス／リボフラビン／シアノコバラミン系によるパークロロエチレンの脱塩素化実施例５は、パークロロエチレン（ＰＣＥ）をトリクロロエチレン（ＴＣＥ）に脱塩素化する本方法の能力を具体的に説明する。Ｄ．ギガスの細胞保存液を、上記のように調製した。反応混合液は、リボフラビン（１ｍＭ）１００μｌおよびシアノコバラミン（１ｍＭ）１００μｌすべてを、ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．５中に含む混合液に、細胞保存液１０００μ ｌを添加して調製し、そして、最終容量２ｍｌにした。全ての混合液を、３０分間、水素でガス通気し、その反応を、パークロロエチレン（ＰＣＥ）３μｌを添加して開始した。サンプルを、０ｈ，２１ｈ，４４ｈ，１２８ｈ，２６６ｈ，および３６８ｈに（０．５ｍｌ）採取して、上記のようにパークロロエチレン（ＰＣＥ）とトリクロロエチレン（ＴＣＥ）をガスクロマトグラフィーで分析した。経時的にＰＣＥのＴＣＥへの脱塩素化を例証するデータは、表ＶＩＩＩに示される。ＰＣＥの脱塩素化について観察された速度は、四塩化炭素について観察された速度よりもはるかに低かった。この観察は、この系に特有ではなく、一般に、テトラピロール触媒作用および細胞により触媒される反応について、同様に報告されている。そのデータは、また、本系が、長時間活性があることを示している。実施例９塩素化溶媒で汚染された透水層のイン・サイチューでテトラピロールで触媒される脱塩素化実施例９は、塩素化溶媒により汚染された透水層のイン・サイチューでのバイオ修復を具体的に説明する。溶媒で汚染された透水層のイン・サイチューでのバイオ修復は、２段階で達成されるであろう。第１は、発酵による水素生産細菌そしてまた硫酸還元細菌の増殖を誘導するであろう透水層への特定の栄養素の添加である。第２段階は、ヘマチン、もしくはリボフラビンとヘマチンの添加である。段階１．栄養素添加（第１の補正物）場所の調査：汚染物質のレベルと微生物細胞の増殖に影響するファクターについて汚染場所の最初の調査が、必要であろう。現地調査から収集されたデータの結果に基づき、土着の微生物の増殖を維持したり増強するのに必要な種々の補正物の濃度の計算が行われる。典型的なそのような補正物は、グルコースと硫酸塩の両方を含むであろう。場所の調査は、透水層中の塩素化溶媒の濃度が、１ｍＭ以下が良く、そしてより典型的には０．１ｍＭ以下であることを示すであろう。その場所が、パークロロエチレン０．１ｕｍｏｌ／ｍｌで汚染されている場合には、計算は、水素０．４ｕｍｏｌ／ｍｌか、グルコース０．２〜０．４ｕｍｏｌ／ｍｌが、透水層内の土着の細菌によって利用される水素発生発酵経路に依存している微生物の増殖を維持するために必要であることを示すであろう。計算は、全ての電子が、水素に由来すると仮定した場合、グルコース０．２〜０．４ｕｍｏｌ／ｍｌが、透水層内で脱塩素化を達成するために必要な最小の最終濃度であることを示すであろう。グルコースの代謝は、水素、有機酸および二酸化炭素の形成に至ることが理解される。透水層が、自然の地球化学的に硫酸塩を欠く場合には、硫酸塩が、グルコース濃度の少なくとも２倍濃度で存在するように硫酸塩の捕正が行われるであろう。これらの条件下では、有機酸と水素は、透水層に土着の硫酸還元細菌による硫酸還元のために、完全に利用されるであろう。その上、保存溶液グルコース−硫酸塩補正物の濃度は、透水層中に添加され、希釈された後に、最終グルコース濃度は、汚染物質の濃度を超えて少なくとも２倍モル過剰であり、最終硫酸塩濃度は、モルベースで少なくとも２の因数で、グルコース濃度より過剰になるようにされる。透水層に対する補正物の導入透水層中への最初の栄養的補正物の導入は、汚染の広がりと自然の透水層流の上流に置かれた一連の井戸を通して、透水層中へ栄養素をポンプ挿入することによって行われる。次いで、透水層のサンプルが、日常的に転換をモニターするために得られるように、一連のモニター用井戸が、注入井戸の下流に置かれる。処理された透水層の水は、最後に、汚染物質の広がりの末端の方のさらに下流に置かれた一連の抽出井戸によって、地表にもたらされる。次に、抽出された水は、注入井戸に再循環され、新たな栄養素とともに再導入されるであろう。この工程は、硫酸還元細菌とグルコース発酵における中間体としての水素を含む微生物集団を生じさせるであろう。微生物代謝のモニター透水層系内の酸化還元電位と硫化物生産をモニターすることは、透水層中の硫酸還元代謝の定常状態レベルの指示を与えるであろう。硫酸還元代謝の十分高いレベルが、これらのパラメーターに基づいて見られる時には、追加の補正物が、汚染溶媒の脱塩素化を実施させるために行われる。硫化物生産のレベルは、前述の方法を基に決定される。段階２．テトラピロールと電子伝達仲介体添加（第２の補正物）硫酸還元細菌の存在が、透水層系で確立された後に、テトラピロール触媒（ヘマチン、シアノコバラミン）もしくはリボフラビン−ヘマチン−シアノコバラミンが、透水層中に導入される。テトラピロール触媒もしくはテトラピロール−リボフラビンの濃度は、少なくとも２５ｕＭの濃度が、テトラピロール触媒について維持されるように、再循環水中でモニターされる。リボフラビンの濃度は、あまり厳密ではないが、約１〜５ｍＭ濃度で添加される。薬剤は、栄養素と同様の方法で注入井戸において導入されるであろう。次いで、汚染物質、テトラピロール触媒およびリボフラビンの濃度が、汚染物質の脱塩素化が完結するまで再循環水中で連続的にモニターされる。脱塩素化は、前述のガスクロマトグラフィー法によって測定される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月１４日【補正内容】請求の範囲１．（ｉ）還元体の存在下で、チトクロームｃ₃菌体外電子伝達タンパク質を含む硫酸還元細菌細胞の培養物を生育させること；（ｉｉ）該細胞を、反応混合物を形成するために有機ハロゲン化合物とテトラピロール触媒を含む培地と接触させること；そして（ｉｉｉ）適切な嫌気的条件下で、該有機ハロゲンを脱ハロゲン化するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートすること：を含んでなる有機ハロゲンの脱ハロゲン化方法。２．該反応混合物が、さらに、イソアロオキサジン環を含む電子伝達仲介体を含んでいて、該仲介体が、該電子伝達タンパク質から該テトラピロール触媒への電子伝達を促進する、請求の範囲１の方法。３．該還元体が、乳酸、プロピオン酸、ギ酸、酪酸、酢酸およびそれらの塩、水素、そして水素に発酵されるすべての有機物からなる群から選ばれる、請求の範囲１の方法。４．該細菌細胞が、硫酸還元細菌類の少なくとも１つの菌株を含む、請求の範囲１の方法。５．該菌体外電子伝達タンパク質が、チトクロームｃ₃である、請求の範囲１の方法。６．該電子伝達仲介体が、リボフラビンである、請求の範囲２の方法。７．該テトラピロール触媒が、金属不含のポルフィリン、メタロポルフィリン、フタロシアニンおよびコリンからなる群から選ばれる、請求の範囲１の方法。８．該テトラピロール触媒が、シアノコバラミンおよびヘマチンからなる群から選ばれる、請求の範囲１の方法。９．該有機ハロゲンが、四塩化炭素、パークロロエチレン、クロロホルム、塩化メチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニルおよびクロロ芳香族化合物からなる群から選ばれる、請求の範囲１の方法。１０．（ｉ）還元条件を提供する硫酸還元細菌、および該発酵細菌の増殖のための炭素源の存在下で該硫酸還元細菌によって使用できる還元体を供給する発酵細菌を含んでなる細菌細胞の混合培養物を生育させること；（ｉｉ）該細菌細胞の混合培養物を、反応混合物を形成するために有機ハロゲン化合物とテトラピロール触媒を含む培地と接触させること；そして（ｉｉｉ）適切な嫌気的条件下で、該有機ハロゲンを脱ハロゲン化するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートすること：を含んでなる有機ハロゲンの脱ハロゲン化方法。１１．該反応混合物が、さらに、イソアロオキサジン環を含む電子伝達仲介体を含んでいて、該仲介体が、該電子伝達タンパク質から該テトラピロール触媒への電子伝達を促進する、請求の範囲１０の方法。１２．該テトラピロール触媒が、金属不含のポルフィリン、メタロポルフィリン、フタロシアニンおよびコリンからなる群から選ばれる、請求の範囲１０の方法。１３．該有機ハロゲンが、四塩化炭素、パークロロエチレン、クロロホルム、塩化メチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニルおよびクロロ芳香族化合物からなる群から選ばれる、請求の範囲１０の方法。１４．該炭素源が、グルコースである、請求の範囲１０の方法。１５．（ｉ）土着の細菌の増殖を増進するであろう補正物のタイプを決定するため、そして硫酸還元条件を作り出すために、土着の細菌集団の増殖に影響する栄養素の濃度、汚染物質および条件について、該場所を評価すること；（ｉｉ）測定可能な量の硫化水素を生産させる硫酸還元条件を作り出すために、栄養素、塩類、リン酸塩および硫酸塩を含む最初の補正物を用いて、該場所を修正すること；（ｉｉｉ）細菌増殖のレベルを決定し、そして硫酸還元条件を維持するための追加的な補正物の必要性を調査するために、段階（ｉｉ）の後に、該場所の酸化還元電位と硫化物生産をモニターすること；（ｉｖ）該硫酸還元条件を維持しながら、テトラピロール触媒を含む第二の補正物、段階（ｉｉｉ）において得られた結果から決定された第二の補正物を用いて、該場所を修正すること；そして（ｖ）有機ハロゲンの脱ハロゲン化に関して、該場所をモニターすること：を含んでなる、土壌もしくは地下水の場所から有機ハロゲンをイン・サイチューで脱ハロゲン化する方法。１６．該第二の補正物が、さらに、イソアロオキサジン環を含む電子伝達仲介体を含んでいて、該仲介体が、該電子伝達タンパク質から該テトラピロール触媒への電子伝達を促進する、請求の範囲１５の方法。１７．該テトラピロール触媒が、金属不含のポルフィリン、メタロポルフィリン、フタロシアニンおよびコリンからなる群から選ばれる、請求の範囲１５の方法。１８．該有機ハロゲンが、四塩化炭素、パークロロエチレン、クロロホルム、塩化メチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニルおよびクロロ芳香族化合物からなる群から選ばれる、請求の範囲１５の方法。

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）適切な還元体の存在下で、チトクロームｃ₃菌体外電子伝達タンパク質を含む硫酸還元細菌細胞の培養物を生育させること；（ｉｉ）該細胞を、反応混合物を形成するために有機ハロゲン化合物とテトラピロール触媒を含む培地と接触させること；そして（ｉｉｉ）適切な嫌気的条件下で、該有機ハロゲンを脱ハロゲン化するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートすること：を含んでなる有機ハロゲンの脱ハロゲン化方法。２．該反応混合物が、さらに、イソアロオキサジン環を含む電子伝達仲介体を含んでいて、該仲介体が、該電子伝達タンパク質から該テトラピロール触媒への電子伝達を促進する、請求の範囲１の方法。３．該還元体が、乳酸、プロピオン酸、ギ酸、酪酸、酢酸およびそれらの塩、水素、そして水素に発酵され得るすべての有機物からなる群から選ばれる、請求の範囲１の方法。４．該細菌細胞が、硫酸還元細菌類の少なくとも１つの菌株を含む、請求の範囲１の方法。５．該菌体外電子伝達タンパク質が、チトクロームｃ₃である、請求の範囲１の方法。６．該電子伝達仲介体が、リボフラビンである、請求の範囲２の方法。７．該テトラピロール触媒が、金属不含のポルフィリン、メタロポルフィリン、フタロシアニンおよびコリンからなる群から選ばれる、請求の範囲１の方法。８．該テトラピロール触媒が、シアノコバラミンおよびヘマチンからなる群から選ばれる、請求の範囲１の方法。９．該有機ハロゲンが、四塩化炭素、パークロロエチレン、クロロホルム、塩化メチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニルおよびクロロ芳香族化合物からなる群から選ばれる、請求の範囲１の方法。１０．（ｉ）還元条件を提供する硫酸還元細菌、および該発酵細菌の増殖に適する炭素源の存在下で該硫酸還元細菌によって使用できる適切な¨還元体を供給する発酵細菌を含んでなる細菌細胞の混合培養物を生育させること；（ｉｉ）該細菌細胞の混合培養物を、反応混合物を形成するために有機ハロゲン化合物とテトラピロール触媒を含む培地と接触させること；そして（ｉｉｉ）適切な嫌気的条件下で、該有機ハロゲンを脱ハロゲン化するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートすること：を含んでなる有機ハロゲンの脱ハロゲン化方法。１１．該反応混合物が、さらに、イソアロオキサジン環を含む電子伝達仲介体を含んでいて、該仲介体が、該電子伝達タンパク質から該テトラピロール触媒への電子伝達を促進する、請求の範囲１０の方法。１２．該テトラピロール触媒が、金属不含のポルフィリン、メタロポルフィリン、フタロシアニンおよびコリンからなる群から選ばれる、請求の範囲１０の方法。１３．該有機ハロゲンが、四塩化炭素、パークロロエチレン、クロロホルム、塩化メチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニルおよびクロロ芳香族化合物からなる群から選ばれる、請求の範囲１０の方法。１４．該炭素源が、グルコースである、請求の範囲１０の方法。１５．（ｉ）タイプを決定するために、土着の細菌集団の増殖に影響する栄養素の濃度、汚染物質および条件について、そして土着の細菌の増殖を増進したり、硫酸還元条件を作り出すのに必要な補正物の濃度について、該場所を評価すること；（ｉｉ）測定可能な量の硫化水素を生産させる硫酸還元条件を作り出すために、栄養素、塩類、リン酸塩および硫酸塩を含む最初の補正物を用いて、該場所を修正すること；（ｉｉｉ）細菌増殖のレベルを決定し、そして硫酸還元条件を維持するための追加的な補正物の必要性を調査するために、段階（ｉｉ）の後に、該場所の酸化還元電位と硫化物生産をモニターすること；（ｉｖ）該硫酸還元条件を維持しながら、テトラピロール触媒を含む第二の補正物、段階（ｉｉｉ）において得られた結果から決定された第二の補正物を用いて、該場所を修正すること；そして（ｖ）有機ハロゲンの脱ハロゲン化に関して、該場所をモニターすること：を含んでなる、土壌もしくは地下水の場所から有機ハロゲンをイン・サイチューで脱ハロゲン化する方法。１６．該第二の補正物が、さらに、イソアロオキサジン環を含む電子伝達仲介体を含んでいて、該仲介体が、該電子伝達タンパク質から該テトラピロール触媒への電子伝達を促進する、請求の範囲１５の方法。１７．該テトラピロール触媒が、金属不含のポルフィリン、メタロポルフィリン、フタロシアニンおよびコリンからなる群から選ばれる、請求の範囲１５の方法。１８．該有機ハロゲンが、四塩化炭素、パークロロエチレン、クロロホルム、塩化メチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、塩化ビニルおよびクロロ芳香族化合物からなる群から選ばれる、請求の範囲１５の方法。