JPH08510051A - 保存対照細胞を蛍光および光散乱測定の校正において用いる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、種々に標識、再構成された保存細胞を複数色分析において対照細胞として用いる方法に関する。これらの細胞を用いて、光散乱および蛍光強度測定を校正する。上記対照細胞を用いることにより、重複波長領域に遭遇した結果、従来新鮮な細胞およびポリマービーズを複数色フローサイトメトリーアッセイに必要な補正調整を決定する際に対照として用いる際に遭遇していた保存および校正の困難が克服される。

Description

【発明の詳細な説明】 保存対照細胞を蛍光および光散乱測定の校正において用いる方法 技術分野 本発明は、標識した細胞を、フローサイトメトリーによる複数色生物学的分析 における標識として用いられる複数の蛍光物質の重複波長発光の補正調整を実施 するための対照としての標識した保存細胞の使用に関する。また、本発明は、現 在まで確認されていなかった安定性および保存寿命特性を有する保存標識細胞の 調製に関する。 背景技術 対照細胞は、臨床試験およびイムノアッセイの正確さおよび精密さのために必 須である。光散乱および蛍光標識を用いて細胞および／または細胞成分を確認す るアッセイにおいて、対照細胞を用いて蛍光重複の領域の補正調整を実施する基 準を形成する。対照細胞を用いることおよび補正調整を実施することは、試験装 置および方法の信頼性および正確さを確実にし、時間経過によるおよび実験室か ら実験室への再現性を確実にするために必要である。 光散乱および蛍光標識を用いるアッセイにおいて、細胞および／または細胞物 質は、蛍光体との直接相互作用あるいは生体物質、例えばモノクローナル抗体、 植物レクチンおよび細胞または細胞成分との反応に関連しうる他の物質への蛍光 体の結合による間接相互作用に基づいて測定される。アッセイにおいて１種の蛍 光体のみを用いる際には、すべての補正調整は実施するのが困難ではない。しか し、複数の蛍光標識を複数色分析において用いる際には、このような調整は極め て重要になり、一層困難になる。これらの分析において用いられる多くの標識が 重複する発光波長領域を有するため、問題が発生している。重複領域において生 じる蛍光は、各々の蛍光体の重複する波長により生じる光の合計である。問題は 、目的が、それぞれの蛍光色素に比例し、他の蛍光色素からの任意の寄与によっ ても不偏である信号を検出することにより別個の細胞成分を反映する少なくとも ２種の別個の蛍光色素で細胞を標識することであるフローサイトメトリーにおい て 特に重要である。調整が重複波長のために実施されるものではない場合には、不 正確な「正の」読みが発生しうる。１種の重複する蛍光色素の光を最適に透過し 、他の蛍光色素の光をすべて遮断する波長フィルターを選択し、これにより不正 確な陽性の読みを回避することは可能ではない。ほとんどの複数色分析システム は、不正確な陽性の読みを除去するための「補正」を提供する。 ここで用いる補正は、重複する蛍光信号を計算し、減じる電気的手段である。 即ち、第２の蛍光色素からの重複寄与を、分析されている細胞における第１の蛍 光標識の蛍光読みから減じる。第２の蛍光色素を有する細胞を分析する際には、 手順を逆にし、第１の蛍光色素からの重複寄与を第２の蛍光標識の蛍光読みから 減じる。適切な量の電気的補正を決定するために、大きすぎるかまたは小さすぎ る信号を特定の蛍光色素および目的細胞または細胞成分に対して減じる何らかの 決定方法がなければならない。 伝統的には、蛍光標識した新鮮な正常の血液試料またはラテックスビーズが、 光散乱分析において、所要の調整および適切な量の電気的補正を決定するための 対照として用いられている。しかし、新鮮な正常の血液試料は完全には十分でな い。その理由は、これらは、このような試料が貯蔵中に受ける劣化のために短時 間の間補正対照として用いることができるにすぎないからである。新たな正常の 血液試料を連続的に得なければならない。この結果、新鮮な血液試料は、安定性 が乏しいため商品化が可能でなく、さらに適時に分離された試料を比較する均一 な基準線を提供することもない。ラテックスビーズは、比較的良好な安定性およ び均一な基準線を提供するが、これらの光散乱特性は生体細胞または細胞成分の 光散乱特性と異なる。従って、ラテックスビーズを用いることによっては、現実 の細胞を用いて得られた補正値とは異なる補正値が得られる。 フローサイトメトリーにおける他の考慮事項は、標識した校正物質の大きさ、 形状および構造が、分析されている細胞または細胞成分の大きさ、形状および構 造と直接関連していることが重要であることである。例えば、大きい標識した球 形の校正または対照粒子は、小さい方形の粒子からなる未知試料と適切に整合し ない。このために、生体細胞は対照としてラテックスビーズよりも好ましい。 本発明は、保存標識生体試料を光散乱測定および蛍光校正用の対照細胞として 用いる方法を提供する。このような細胞を提供することにより、分析者は、補正 調整を実施するのに適切な細胞を選択することが可能になり、異なる時点におい て分析される試料の比較のための長期間用いることができる基準線を決定する可 能性が提供される。 本発明の開示 本発明は、標識した再構成した保存細胞を対照細胞として用いて、２種以上の 蛍光標識を用いる複数色アッセイにおいて光散乱および蛍光強度測定を校正し、 異なる蛍光体の重複波長により生じる不正確な陽性の読みを除去するこのような アッセイにおける補正調整を提供する方法に関する。調整において用いられる補 正因子を分析機器により電気的に決定する。補正因子により、アッセイ中の不正 確な陽性の読みの出現が防止される。 この方法を用いるアッセイは、生体細胞アッセイである。この方法は、新鮮な 細胞を必要とするかまたはポリマービーズを用いる従来の手法よりも優れている 。本発明に従って、標識した保存細胞を用いることにより、分析者は、異なる時 点において分析される試料の比較のための長期間用いることができる基準線を決 定することができる。本発明はまた、対照細胞として用いるのに好ましい標識し た保存細胞およびその調製方法に関する。 図面の簡単な説明 図１Ａは、前方光散乱（forward light scatter）（ＦＳ）およびログサイド 光散乱（log side light scatter）に基づく保存細胞の、補正調整をしていない ゲーティングを示す図である。 図１Ｂは、蛍光補正調整がないことによる第２象限における細胞の不正確な陽 性の蛍光染色を示す図である。 図１Ｃは、補正調整がないことによる第２象限における不正確な陽性の蛍光染 色を示す図である。 図１Ｄは、補正調整がない際にもＦＩＴＣおよびＥＣＤ蛍光発光に関して重複 領域がないことを示す図である。 図２Ａは、前方光散乱およびログサイド光散乱に基づく保存細胞の、補正調整 をしたゲーティングを示す図である。 図２Ｂは、重複蛍光発光に関して適切な補正を実施した後に得られた正確な蛍 光読みを示す図である。 図２Ｃは、重複発光波長に関して適切な蛍光補正を実施することにより、第１ および第２象限において不正確な陽性の読みがないことを示す図である。 図２Ｄは、適切な蛍光補正を実施することにより、第１および第２象限におい て不正確な陽性の読みがないことを示す図である。 本発明を実施する最良の形態 本発明は、保存細胞を用いて、複数色生物学的分析において標識として用いら れる複数の蛍光体の波長発光に関する光散乱および補正調整を決定する方法に関 する。一般に、確実な構造および抗原性を維持するすべての保存標識細胞を本発 明において用いることができる。例えば、対照細胞として凍結乾燥した標識細胞 を用いることにより本発明を実施することができる。凍結乾燥した細胞は、米国 特許第５，０５９，５１８号明細書、１９９１年１０月２９日発行、発明の名称 「STABILIZED LYOPHILIZED MAMMALIAN CELL AND METHOD OF MAKING SAME」に従 って調製することができる。米国特許第５，０５９，５１８号明細書の教示をこ こに参照として包含する。細胞、細菌および他の生体物質を保存する他の方法は 、米国特許第３，２６１，７６１号、同第４，８７４，６９０号、同第４，２０ ６，２００号および同第４，２４６，３４９号明細書；欧州特許出願公開第０ ２５９ ７３６号明細書、１９８８年３月１６日公開；並びに特許協力条約の下 でＷＯ ８６／０３９３８号（１９８６年７月１７日国際公開）、ＷＯ ８７／ ００１９６号（１９８７年１月１７日国際公開）およびＷＯ ８９／０６９７６ 号（１９９０年８月１０日国際公開）として国際公開された国際特許出願明細書 ；並びに特願昭５７−７４１９号、同５６−１２３１７号および同５８−１３１ ９１３号明細書中に見出される。本発明において用いられるすべての保存細胞の 選択基準は、このような細胞を用いるために再構成、洗浄するかまたは他の方法 で調製した場合に、これらが確実な構造および抗原性を維持すること、並びにこ れらの特性が対応する新鮮な細胞と同一であることである。このような保存細胞 は、本発明において用いるために再構成、洗浄または他の方法で調製した後に、 「再構成対照細胞」または単に「対照細胞」と定義する。 本発明において用いる標識は蛍光体である。標識付けは、標識と、生体細胞ま たは細胞成分との間の直接の反応により実施することができる。あるいはまた、 標識を、細胞または細胞成分に結合させる前に、（１）反応性生体物質、例えば モノクローナル抗体または（２）反応性非生物学的有機物質、例えばカルボン酸 塩化物に結合させることができる。例えば、蛍光標識を、選択性反応体物質、例 えばモノクローナル抗体に結合させ、次に標識したモノクローナル抗体を細胞に 結合させることができる。好ましい方法は、標識を選択的反応性物質に結合させ ることであり、最も好ましくは、モノクローナル抗体に結合させる。 蛍光標識を、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ ）、ローダミン、テトラメチレンローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ） スルホローダミン１０１酸塩化物（sulforhodamine 101 acid chloride）（テキ サスレッド（Texas red））、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン （allophycocyanin）、フィコエリトリン−テキサスレッド（ＰＥＴＲ）、４− メチルウンベリフェロンおよび生体物質の分析において既知であるかまたは有用 であることが見出されている他の蛍光体から選択することができる。標識のモノ クローナル抗体への結合は、任意の適切かつ既知の方法により実施することがで き、この方法には、モノクローナル抗体と標識とを直接反応させることまたは架 橋基を用いてモノクローナル抗体と標識とを結合させることが含まれる。 ここで対照細胞として用いられる標識した凍結乾燥細胞は、米国特許第５，０ ５９，５１８号明細書に従って凍結乾燥した細胞を再構成し、再構成した細胞を ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかと共にインキュベーシ ョンすることにより調製することができる。細胞上に存在する抗原部位に特異的 なモノクローナル抗体が好ましい。再構成した細胞と共にインキュベーションす る前に抗体を標識するかまたは抗体を再構成した細胞に結合した後に標識するこ とができる。前者が好ましい。次に、形成した標識細胞を本発明において用いる 。 あるいはまた，新鮮な細胞を、例えば、これを抗体と共にインキュベーション することにより標識することができる。抗体は、インキュベーションの前または 後に標識することができる。再び、前者が好ましい。標識後、細胞を、上記米国 特許第５，０５９，５１８号明細書に従って凍結乾燥する。上記特許明細書の方 法による保存によっては、他の保存方法を用いる際には発生することが知られて いるようには、蛍光色素の蛍光能力は失われず、低下しないことが確認された。 本発明においてこれらを対照細胞として用いる前に、凍結乾燥した標識細胞を再 構成する。 また、直接標識した細胞を用いることも本発明の範囲内である。直接標識した 細胞は、介在する抗体または他の物質を用いずに標識を細胞に結合させたもので ある。 本発明を実施する例 抗ＣＤ８モノクローナル抗体をフィコエリトリン（ＲＤＩ、アメリカ合衆国フ ロリダ州マイアミ所在のクールター コーポレーションから得られる）で標識し て、ＬＦＬ２として示される標識抗体を得た。抗ＣＤ４モノクローナル抗体をフ ルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）で標識して、ＬＦＬ１として示さ れる種を得た。最後に、負の対照抗体（ＩｇＧ₂ｂ）をＥＣＤ（エネルギー結合 色素（energy coupled dye）、アメリカ合衆国フロリダ州マイアミ所在のクール ター コーポレーション）で標識してＬＦＬ３として示される種を得た。（すべ ての抗体は、アメリカ合衆国フロリダ州マイアミ所在のクールター コーポレー ションから入手できる。）これらの３種の標識した抗体種を用いて、米国特許第 ５，０５９，５１８号明細書に記載された方法により保存されたリンパ球を標識 した。次に、この複数の標識を用いる細胞の３色（ＲＤ１、ＦＩＴＣ、ＥＤＣ） フローサイトメトリー分析を、図１に示すように補正を用いずに、および図２に 示すように補正を用いて実施した。ここで用いる「複数」の蛍光標識を用いるこ とは、２種以上の標識を用いることを示す。最大数は、アッセイにおいて用いら れる機器の性能のみに依存する。即ち、２、３、４種、またはそれ以上の標識と することができる。 図１Ａは、電子的ゲート（electronic gate）（１）中に含まれる前方光散乱 （ＦＳ）およびログサイド光散乱（ＬＳＳ）に基づく保存細胞のゲーティングを 示す。 図１Ｂ（ＬＦＬ２／ＬＦＬ１）は、蛍光補正がないことによる第２象限におけ る細胞の不正確な陽性の蛍光染色を示す。例えば、第１象限（ＬＦＬ２＋）には ＣＤ８−ＦＩＴＣ陽性細胞が見出され；第４象限（ＬＦＬ１＋）にはＣＤ４−Ｒ Ｄ１陽性細胞が見出され；第３象限にはＬＦＬ１（−）ＬＦＬ２（−）細胞が見 出され；第２象限にはＬＦＬ１（＋）ＬＦＬ２（＋）細胞が見出される。第２象 限に見られる二重陽性細胞は、ＬＦＬ２に重複する（ＦＩＴＣとＲＤ１発光との 間の重複）ＦＩＴＣ発光波長の結果である。第３象限におけるＬＦＬ２の平均チ ャネル（mean channnel）（Ｘ軸＝０．１４６）は、第１象限におけるＬＦＬ２ の平均チャネル（Ｘ軸＝０．２３３）と大きく異なり、第３象限におけるＬＦＬ １の平均チャネル（Ｙ軸＝０．１２８）は、第４象限におけるＬＦＬ１の平均チ ャネル（Ｙ軸＝０．２２２）と大きく異なることが注目される。 図１Ｃ（ＬＦＬ３／ＬＦＬ２）は、不正確な陽性の蛍光が、重複波長（図１Ｂ 参照）に関する蛍光補正がないためであることを示す。第２象限に見られる二重 陽性細胞は、ＬＦＬ３（ＥＣＤ発光）と重複するＬＦＬ２（ＲＤ１発光）からの 発光波長の結果である。 図１Ｄ（ＬＦＬ３／ＬＦＬ１）は、補正がない場合には、ＦＩＴＣとＥＣＤと の個別の発光が重複しないことを示す。従って、二重陽性細胞は示されていない 。 図２の結果は、重複波長に関する補正があった以外は図１において実現された ものと同様にして得られた。図２Ａは、電子的ゲート（１）中に含まれる前方光 散乱（ＦＳ）およびログサイド光散乱（ＬＳＳ）に基づく保存細胞のゲーティン グを示す。 図２Ｂ（ＬＦＬ２／ＬＦＬ１）は、対照細胞として抗原を用いて保存した細胞 を用いて重複蛍光発光に関して適切な補正を実施した後に得られた正確な蛍光の 読みを示す。第３象限におけるＬＦＬ２の平均チャネル（Ｘ軸＝０．１６９）と 、第１象限におけるＬＦＬ２の平均チャネル（Ｘ軸＝０．１５０）とが類似する ことが注目される。同様に、第３象限におけるＬＦＬ１の平均チャネル（Ｙ軸＝ ０，１４７）と、第４象限におけるＬＦＬ１の平均チャネル（Ｙ軸＝０．１４３ ）とが類似する。図１Ｂとは対照的に、不正確な陽性の読みはない。 図２Ｃ（ＬＦＬ３／ＬＦＬ２）は、適切な蛍光補正を実施した際には、第１お よび第２象限にはＬＦＬ３陽性細胞は示されないことを示す。 図２Ｄ（ＬＦＬ３／ＬＦＬ１）は、適切な蛍光補正を実施した際には、第１お よび第２象限にはＬＦＬ３陽性細胞は示されないことを示す。 図２Ａ〜２Ｄに示すように、保存細胞を用いて、機器の光散乱を、関連する保 存細胞集団、例えばリンパ球およびこの部分母集団を含むように調整することが できる。色補正が所与の信号に適切であることを証明するために、陽性集団の平 均チャネルと陰性集団の平均チャネルとが等しいかまたはほぼ等しくなければな らならない。これは、フィコエリトリン−ＲＤ１蛍光に関して、ＦＩＴＣで標識 した細胞の蛍光の平均チャネルが、フィコエリトリンＲＤ１で標識した陰性細胞 の平均チャネルに等しいかまたはほぼ等しくなければならならないことを意味す る。ＦＩＴＣ蛍光に関して、フィコエリトリン−ＲＤ１で標識した細胞の蛍光の 平均チャネルが、ＦＩＴＣで標識した陰性細胞の平均チャネルに等しいかまたは ほぼ等しくなければならならない。分析機器がこのように調整されている際には 、正確な重複波長補正が達成され、分析において用いられる。 この手順は、２種以上の蛍光標識と共に用いることができる。例に示したよう に、抗原を用いて保存された細胞を用いることにより、補正因子を長時間にわた り並びに異なる機器および異なる実験室間で再現可能にすることが可能になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グプタ ラヴィンダー ケイ アメリカ合衆国 フロリダ州 33024 ペ ンブルック パインズ エヌ ダブリュー ナインティーンス ストリート 9430 (72)発明者 ジョンソン マルシア アメリカ合衆国 フロリダ州 33026 ク ーパー シティー ヘレナ ドライブ 11059

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．各々のタイプの細胞が異なる蛍光色素で標識され、上記異なる色素が重複す る励起波長領域を有する少なくとも２種のタイプの細胞を含む試料の所定の複数 色アッセイにおいて用いるフローサイトメーター機器を校正するにあたり、上記 方法が： （a）対照細胞として、上記複数色アッセイを実施するのに適するように選 択された少なくとも２種のタイプの生物細胞を調製し、上記タイプの細胞のそれ ぞれに異なる蛍光標識を結合させ、上記標識した対照細胞は、異なるが重複する 励起波長領域を有し、上記細胞をフローサイトメーターにより処理した際に上記 アッセイおよび上記重複波長領域の測定に望ましい生物学的特性を有する再構成 した保存細胞を含み； （b）上記の標識した対照細胞を上記フローサイトメーターにより処理して 、重複励起波長領域を示す適切な測定を確実にし； （c）上記の適切な測定を用いて、上記フローサイトメーターによる選択さ れた生物細胞のアッセイの実施において用いるのに必要な補正調整を決定し；お よび （d）上記補正調整を実施する 手順を有することを特徴とするフローサイトメーターの校正方法。 ２．異なるが部分的に重複する発光波長領域を有する蛍光色素で標識した少なく とも２種の異なるタイプの生体細胞を含む試料の所定の複数色アッセイにおいて 用いるためのフローサイトメーターを校正するにあたり、上記方法が： （a）上記複数色アッセイを実施するのに適するように選択された少なくと も２種のタイプの対照細胞を含む試験試料を調製し、所与の試験試料内で１種の タイプの細胞のみに１種の上記蛍光色素のみが結合し、上記対照細胞が、上記所 定アッセイを実施するのに必要な所要の生物学的特性を有し、保存前または再構 成後に上記蛍光色素で標識された再構成した保存細胞から成り； （b）上記標識した対照細胞試料を上記サイトメーターにより連続的に処理 して、 発光範囲全体にわたりそれぞれの細胞に結合した色素に適する強度測定を決定し ；および （c）手順（b）の測定を用いて上記サイトメーターに必要な補正調整を実施 して、上記色素の発光範囲の重複する領域内で正確なアッセイを得； ここで上記方法が完了した際に、上記フローサイトメーターを校正して、同 一のタイプの細胞が上記蛍光色素で標識された試料内で細胞を正確にアッセイす る 手順を有することを特徴とするフローサイトメーターの校正方法。 ３．上記対照細胞を： （a）色素が細胞に直接結合した細胞および （b）色素が細胞に、上記色素と上記細胞との間の架橋基により結合した細 胞から選択することを特徴とする請求の範囲２記載の方法。 ４．上記架橋基が抗体であることを特徴とする請求の範囲３記載の方法。 ５．１つのタイプの細胞を、それぞれの蛍光標識が異なる抗体上に存在する少な くとも２種の選択された蛍光標識されたモノクローナル抗体で上記のタイプの細 胞を標識することによりサブセットに分類することを特徴とする請求の範囲３記 載の方法。 ６．上記対照細胞が標識し、再構成し、凍結乾燥した細胞であることを特徴とす る請求の範囲３記載の方法。 ７．少なくとも１種の付加的な色素で標識した対照細胞を、２種の色素で標識し た対照細胞を励起するのに用いられる励起波長において２種の色素で標識した対 照細胞の範囲内で重複しないアッセイに用いるために調製することを特徴とする 請求の範囲１記載の方法。 ８．上記対照細胞が標識し、再構成し、凍結乾燥した細胞であることを特徴とす る請求の範囲１記載の方法。 ９．上記対照細胞を： （a）色素が細胞に直接結合した細胞および （b）色素が細胞に、上記色素と上記細胞との間の架橋基により結合した細 胞から選択することを特徴とする請求の範囲８記載の方法。 １０．上記架橋基が抗体を含むことを特徴とする請求の範囲９記載の方法。 １１．少なくとも１種の付加的な色素で標識した対照細胞を、２種の色素で標識 した対照細胞を励起するのに用いられる励起波長において２種の色素で標識した 対照細胞のうちの１つの範囲内のみで重複するアッセイに用いるために調製する ことを特徴とする請求の範囲１記載の方法。