JPH08508398A

JPH08508398A - プロホルモン転換酵素で形質転換された細胞およびポリペプチドの合成

Info

Publication number: JPH08508398A
Application number: JP6520124A
Authority: JP
Inventors: ゴーマン，コーネリア・エム; グロスクロイツ，デビラ・ジェイ
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1993-03-01
Filing date: 1994-03-01
Publication date: 1996-09-10
Also published as: DE69434519T2; EP0687301B1; US6348327B1; US20030031654A1; EP0687301A1; ATE307890T1; WO1994020624A1; DE69434519D1

Abstract

(57)【要約】プロホルモン前駆体の活性ホルモンへのプロセシングを促進するプロホルモン転換酵素を発現する哺乳類細胞の生産法を記載する。変異型のプロホルモン転換酵素およびプロホルモンも記載する。本発明の形質転換細胞は適切に処理したポリペプチドホルモンの合成において、また、細胞培養でホルモン添加および血清ポリペプチド因子要求性への依存を削減するために、使用しうる。

Description

【発明の詳細な説明】プロホルモン転換酵素で形質転換された細胞およびポリペプチドの合成発明の背景技術分野この発明はプロホルモン転換酵素一種またはそれ以上を発現する宿主細胞およびこれら細胞からの生理学的活性ポリペプチドの生産に関する。この発明はさらにこの宿主細胞によってプロセシングされるエンドプロテアーゼ切断部位を持つポリペプチド前駆体変異型にも関する。背景技術の記載蛋白質ホルモンは全てではなくても殆どが生理学的に不活性な比較的に大きい前駆体分子であるプロホルモンとして合成される（ＤｏｃｈｅｒｔｙおよびＳｔｅｉｎｅｒ、１９８２年；Ｌｏｈなど、１９８４年；Ｍａｉｎｓなど、１９９０年に綜説がある）。プロホルモンの活性型への成熟には多くは塩基性アミノ酸残基ペアまたは多重塩基性アミノ酸残基におけるエンドプロテオリティクな切断により前駆体分子の不活性部分から活性成分を遊離することがしばしば必要である。最近まで、このプロセシングの重要な段階の原因である蛋白質、すなわちプロホルモン転換（ＰＣ）酵素の同一性に関しては殆ど知られていなかった。全種の細胞がこれらの特異的切断によってプロホルモンをその活性成熟型に正確に転換する能力を持っているのではない。ある種のプロホルモンについては、このプロセシングは蛋白質分泌が構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）経路および制御された経路の双方の経路を含む細胞に明らかに限定されている（ＧｕｍｂｉｎｅｒおよびＫｅｌｌｙ、１９８２年）。構成的経路および制御された経路の両蛋白質分泌経路を含む細胞は殆ど排他的に内分泌および神経内分泌系の特異的ホルモン生産組織内に局在している。制御された分泌の間にプロセシングされる一群のホルモンの例はインシュリン族のホルモンである。この族にはインシュリン、インシュリン様成長因子ＩＧＦ −ＩおよびＩＧＦ−ＩＩおよびリラキシンを含む。自然環境のもとにあっては、この族に属するものは全て活性ホルモンを得るためにプロセシングが必要な前駆体分子として合成される。構成的蛋白質分泌経路のみを持つ細胞内で非相同的に発現される時は、ヒトプレプロインシュリンのようにホルモン前駆体は殆どがプロセシングされていないプロホルモン型で分泌される（ＧｕｍｂｉｎｅｒとＫｅｌｌｙ、１９８２年）。細胞の制御された分泌経路が阻害されたマウスＡｔＴ−２０細胞の実験的操作ではポリホルモン前駆体であるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）は構成的分泌経路に再送付されることが観察されている。この場合、ＰＯＭＣはもはやプロセシングの対象ではなく、無傷の前駆体として細胞から分泌されることが見いだされた（Ｍｏｏｒなど、１９８３年）。これらの観察は制御された蛋白質分泌経路にのみ機能する一群のプロセシング酵素が存在すること、およびこの経路がある高度に専門化した型の細胞に明らかに限定されていることを示唆する。ＰＯＭＣ蛋白質は分別プロセシングの対象となるプロホルモンの一つである。成熟ＰＯＭＣ誘導体の発現は高度に組織特異的である。同じプロホルモン前駆体の異なるプロセシング型が脳の種々の領域で生産されている（Ｄｏｕｇｌａｓｓなど、１９８４年）。この多様性作成に関与する酵素と制御機構は知られていない。このプロホルモン基質の独特なアミノ酸部位を認識する組織特異的酵素があるか、またはその代わりに酵素１種のみがエンドプロテオリティク切断に関与し、その酵素自体が特徴的細胞内環境を提供する各組織について特異的な残基ペアサブセットでの切断に関与する厳密な代謝的制御下にある可能性がある。最近まで知られていた唯一の真核細胞のプロホルモンプロセシング酵素はサッカロミセス・セレビシエ酵母のＫＥＸ２遺伝子の産物であった（Ｊｕｌｉｕｓなど、１９８３年および１９８４年；Ｆｕｌｌｅｒなど、１９８９年ａ）。ｋｅｘ２蛋白質はサブチリシン族酵素に関連あるセリンプロテアーゼの一種であって、自然のホルモン前駆体基質（プロ−ａ−ファクター・メーティング型［ｐｒｏ− ａ−ｆａｃｔｅｒ・ｍａｔｉｎｇ・ｔｙｐｅ］フェロモンおよびプロキラー［ｐｒｏ−ｋｉｌｌｅｒ］トキシン）の特定塩基性アミノ酸ペアへの優先性を持つ。Ｋｅｘ２は中性ｐＨに最大酵素活性を示し、カルシウムの存在に厳密な要求性を持つ（Ｊｕｌｉｕｓなど、１９８９年ｂ；Ｆｕｌｌｅｒなど、１９８９年）。これは膜結合しており、成熟活性型酵素は酵母細胞のポストゴルジコンパートメント（ｐｏｓｔ−Ｇｏｌｇｉ・ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に局在する（Ｆｕｌｌｅｒなど、１９８９年ｂ；Ｒｅｄｄｉｎｇなど、１９９１年）。それはそうでなければプロセシングの欠失していた細胞において非相同的に発現したある哺乳類プロホルモン［例えばＢＳＣ−４０細胞中の神経栄養因子、ｂＮＧＦ（Ｂｒｅｓｎａｈａｎなど、１９９０年）、幼若ハムスター腎臓ＢＨＫ細胞中のＣ蛋白質（Ｆｏｓｔｅｒなど、１９９１年）、ＢＳC細胞（Ｔｈｏｍａｓなど、１９８８年）またはＣＯＳ−１細胞中（Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒなど、１９９０年）のＰＯＭＣ］を正しくプロセシングするその証明された能力により、真正な哺乳類ＰＣ酵素の代替転換酵素として有効に役立つことができる。Ｋｅｘ２は試験管内で同一ではないとしても高度に類似した真正ヒトプロアルブミン転換酵素に対する基質特異性を持つことが立証されている（Ｂａｔｈｕｒｓｔなど、１９８６年；Ｂｒｅｎｎａｎなど、１９９０年）。哺乳類細胞内で非相同的に発現された時、ｋｅｘ２はポストゴルジコンパートメントに移行し、そこでは明らかに完全に活性である（Ｇｅｒｍａｉｎなど、１９９０年）。これらの観察からこの酵母蛋白質は機能的および構造的両面で真正の哺乳類転換酵素に類似しているにちがいないという推測が導かれる。構造的な相同性に基づいて把握しにくい哺乳類のｋｅｘ２対応物についての研究を開始した。ＫＥＸ２およびｆｕｒ疎水性アンカーＫｅｘ２エンドプロテアーゼはＮ端側とＣ端側に存在する疎水性領域２個を持つ。Ｃ端の疎水性膜貫通性アンカーには酵母細胞ゴルジ体にＫｅｘ２を固定する役目がある。このＣ端疎水性アンカーの除去はＫｅｘ２エンドプロテアーゼを可溶性にするが、まだ基質特異性を保持する（ＥＰＯ・公開第０３２７３７７）。遺伝子データベースの研究でｋｅｘ２の潜在的哺乳類同族体であり、ｋｅｘ２蛋白質の活性部位ドメインの特徴を多数共有するヒト肝臓ｆｕｒ遺伝子の産物、フーリン（ｆｕｒｉｎ）を確認した。続いてフーリンをクローンし、プロセシング欠損細胞での発現に成功した。すなわち、ＣＯＳ−１細胞でのプロフォンビルブラント因子との（ｖａｎ・ｄｅｎ・Ｖｅｎなど、１９９０年；Ｗｉｓｅなど、１９９０年）およびアフリカミドリザル腎臓上皮ＢＳＣ−４０細胞での（Ｂｒｅｓｎａｈａｎなど、１９９０年）プロ−ｂＮＧＢとのフーリンの共移入で前駆体基質の正確なプロセシングを示した。しかしながら、フーリンとプロホルモンであるプロレニンとを哺乳類細胞内で共発現した時にはプロセシングは観察されていない（Ｈａｔｓｕｚａｗａなど、Ｔｈｅ・Ｊｏｕｒｎａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５巻［１９９０年］）。フーリンはカルシウムイオン要求性が共通で、中性ｐＨで最大活性を示し、ｋｅｘ２同様ポストゴルジコンパートメントでは膜固定蛋白質であることが証明されている（Ｂｒｅｓｎａｈａｎなど、１９９０年）。しかしながら、フーリンはプロレニンのようなある種のホルモン前駆体を効率的にプロセシングできないと思われ、またそのｍＲＮＡメッセージは全部ではないとしても殆どの哺乳類細胞内で発現されるので（Ｈａｔｓｕｚａｗａなど、１９９０年）、フーリンプロテアーゼは細胞の構成的分泌経路で起きる多くの塩基性アミノ酸部位切断の原因にちがいない点で、必須な「ハウスキーピング」機能を果たしているのであろう。これらの機能は一般的であるかまたはｂＮＧＦのような成長因子の構成的経路依存性プロセシングを持つ特定的細胞型に限定されている。フーリンは内分泌様組織内プロホルモンのエンドプロテオリティクなプロセシングに直接関与するとは思えないので、真正のプロホルモン転換酵素として作用するフーリンと酵母ｋｅｘ２とに機能的および構造的両側面で類似している他の哺乳類蛋白質、すなわち、活性部位で明確な相同性を共有するＰＣ蛋白質があるに違いない。この構造的相同性研究により最近ＰＣ蛋白質が多数発見された。「混合オリゴヌクレオチド開始ｃＤＮＡ増幅」の技術（ＭＯＰＡＣ、Ｉｎｎｉｓ、１９９０年）を用いて、ＳｍｅｅｋｅｎｓとＳｔｅｉｎｅｒ（１９９０年）は細菌性スブチリシンと酵母のｋｅｘ２プロテアーゼとの活性部位周辺アミノ酸配列の保存を用いるヒトインスリノーマの推定上のプロホルモン転換酵素ｃＤＮＡを増幅することができた。このｍＰＣ２と命名されたＰＣ・ｃＤＮＡは、酵母ｋｅｘ２プロテアーゼに驚異的な相同性を示した。同様な実験で、Ｓｅｉｄａｈと協力者はｍＰＣ１と命名された別のスブティリシン族プロテアーゼを確認した（Ｓｅｉｄａｈなど、１９９１年）。ＰＣ１およびＰＣ２の分布は今までのところ神経内分泌由来組織に限定されることが観察されており（Ｓｅｉｄａｈなど、１９９０年；Ｓｅｉｄａｈなど、１９９１年；Ｓｍｅｅｋｅｎｓなど、１９９１年）、これらの蛋白質はこれら組織の制御された分泌経路に存在する真正な転換酵素の候補かもしれないことを示唆している。プロホルモン切断部位における特定二塩基性アミノ酸ペアでのＰＣ１とＰＣ２との基質特異性は同一であるようには見えない（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔなど、１９９１年；Ｔｈｏｍａｓなど、１９９１年）し、また脳内組織分布パターンも共通であるようには見えない（Ｓｅｉｄａｈなど、１９９１年）。これはプロホルモンの種々の群がそれぞれ独特なＰＣ酵素を要求することおよびＰＣ１もＰＣ２も生物体内で必要な多様なホルモンを作成するために内分泌系が採用する特定プロセシング酵素の一族に属するものに違いないことを暗示している。前駆体プロセシング生合成工程は粗面小胞体（ＲＥＲ）上での前駆体（プレプロペプチド）合成から始まる。シグナルペプチド（プレー部分）はプロプロテインがＲＥＲの嚢に移送され、蛋白質の折りたたみ、ジスルフィド結合形成およびアスパラギンに結合するグリコシル化が起きると離脱する（図１）。前駆体は次にゴルジ装置に移動し、そこでもっと複雑なグリコシル化と燐酸化が起きる。ある細胞のゴルジでは蛋白質は未知の機構で２群に選別される。一方は構成的に分泌され、他方は制御された分泌を受ける。構成的に分泌された蛋白質は小胞に入り、特別な剌激の必要なしに継続的に標的へ移送される。制御された分泌を受ける蛋白質は分泌小胞に移送されて適当な刺激を受けた時にだけ放出される。分泌小胞内では大きく不活性な蛋白質前駆体からバイオ活性ペプチドの切断が起きる。この過程に含まれる二つの工程は通常ペアになっている塩基性アミノ酸（たとえば、ｌｙｓ−ａｒｇ、ａｒｇ−ａｒｇ）のカルボキシル側でのエンドプロテオリティクな切断およびカルボキシル−および／またはアミノペプチダーゼ（Ｍａｉｎｓなどの総説、１９９０年）によるフランキング塩基性アミノ酸のエキソプロテオリティクな切断である。ＮＧＦ（ＢｅｒｇｅｒとＳｈｏｏｔｅｒ、１９７７年）を含む蛋白質多数はまず大きい前駆体蛋白質として合成される。前駆体の機能はまだよく理解されていない。前駆体のありうる役目の一つは蛋白質折畳みに役立つこと（Ｓｔｅｉｎｅｒ、１９８２年；Ｓｅｌｂｙなど、１９８７年；Ｗｉｓｅなど、１９８８年）である。またＳｅｖａｒｉｎｏと協力者（１９８９年）が示唆したように前駆体は細胞内の適切な場所または経路に蛋白質を送付するかもしれないが、インシュリンの結合ペプチドの場合はこれに該当しない（Ｐｏｗｅｌｌなど、１９８８年；Ｇｒｏｓｓなど、１９９０年）。加えるに、前駆体はグルタミン酸残基のガンマ −カルボキシル化（ＰａｎとＰｒｉｃｅ、１９８５年；ＦｕｒｉｅとＦｕｒｉｅ、１９８８年）およびＰＯＭＣのような単一前駆体ポリペプチドから多重成熟ペプチドの同調的合成の制御に役割があることも証明されている（Ｄｏｕｇｌａｓｓなど、１９８４年の総説参照）。リラキシン本発明においてはプロリラキシンを典型的なホルモン前駆体として使用する。リラキシンはプレプロホルモン前駆体として最初に合成され、二鎖の、ジスルフィド結合した成熟した活性リラキシンを形成するために特異的なプロセシングを起こす。このプロセシングの主要部分では塩基性アミノ酸残基の特異的ペアでのエンドプロテオリティク切断を必要とする。この特異的プロセシングは構成的蛋白質分泌経路のみを持つ細胞内で前駆体が非相同的に発現されるときには起きない。成熟ヒトリラキシンは分子量約６０００ダルトンの分娩前に生殖腺を整備する役目を果たして出産過程を促進するものとして知られる卵巣のホルモン性ペプチドである。Ｈｉｓａｗ，Ｆ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２３巻：６６１〜６６３頁（１９２６年）。Ｓｃｈｗａｂｅ，Ｃ．など、Ｂｉｏｃｈeｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、７５巻：５０３〜５７０頁（１９７７年）。Ｊａｍｅｓ，Ｒ．など、Ｎａｔｕｒｅ、２６７巻：５４４〜５４６頁（１９７７年）。この蛋白質は標的器官の結合組織の再構成を調節して妊娠と分娩期間の器官構造に必要な変化を起こすと思われる。妊娠ホルモンとしてのリラキシンの重要な役割には未熟分娩の阻止と出産時の頸部成熟とが含まれる。主として妊娠のホルモンであるが、リラキシンは非妊娠女性ならびに男性にも検出されている。Ｂｒｙａｎｔ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｇ．Ｄ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ・Ｒｅｖｉｅｗｓ、３巻：６２〜９０頁（１９８２年）およびＷｅｉｓｓ，Ｇ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、４６巻：４３〜５２頁（１９８４年）。リラキシンはＡおよびＢと呼ばれるポリペプチド鎖２個からなり、ジサルファイド結合によって結合しており、インシュリンのそれと同様にＡ鎖内には鎖内ジサルファイドループを持っている。ヒトリラキシンについてのヒト遺伝子２個（Ｈ１とＨ２）が確認されており、卵巣ではＨ２のみが発現される。ブタリラキシンも配列決定され、頸部成熟と分娩導入のためにヒトで臨床試験が行われている。ＭａｃＬｅｎｎａｎなど、Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ・＆・Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、６８巻：５９８頁（１９８６年）。１９８３年８月２４日公開の欧州特許公開第８６６４９号はブタプレプロリラキシン、ブタプロリラキシンおよびブタリラキシンの製法を開示している。１９８７年８月２６日発行の豪州特許第５６１６７０号、１９８３年１月５日公開の欧州特許公開第６８３７５号およびＨａｌｅｙなど、ＤＮＡ、１巻：１５５〜１６２頁（１９８２年）はブタリラキシンの製法を開示する。１９８４年２月２２日公開の欧州特許公開第１０１３０９号と１９８４年６月２７日公開の欧州特許公開第１１２１４９号とは各々ヒトリラキシンおよびヒトＨ２−リラキシンとその同族体をコードする遺伝子配列の分子クローニングと特性とを開示している。１９８１年５月１２日発行の米国特許第４２６７１０１号は胎児膜からヒトリラキシンを得る方法を開示している。神経成長因子交感神経系および感覚系のニューロン生存に必須の神経成長因子（ＮＧＦ）は（Ｌｅｖｉ−ＭｏｎｔａｌｃｉｎｉとＢｏｏｋｅｒ、１９６０年；ＧｏｒｉｎとＪｏｈｏｎｓｏｎ、１９７９年）部分的には雄性マウスの顎下腺内に例外的高濃度で合成されるので、最もよく解明された神経栄養因子である。ＮＧＦを精製して（Ｃｏｈｅｎ、１９６０年）、アミノ酸配列を完全に決定した（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ、１９７３年）のはこの起源のものである。この情報を用いてＳｃｏｔｔと協力者はマウスの顎下腺のｃＤＮＡライブラリーをＮＧＦ配列に含まれる最小縮重コドンに基づくヘキサペプチドのために構築したプローブを用いてスクリーニングすることによってマウスＮＧＦ遺伝子を確認し、クローンした。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉなど、１９８５年；Ｍｕｌｌｉｓなど、１９８６年）を用いる分子クローニングで、ＮＧＦは神経栄養因子族に属するものであって、これにはＢＤＮＦ（Ｌｅｉｂｒｏｃｋなど、１９８９年）やＮＴ−３（Ｈｏｈｎなど、１９９０年；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌなど、１９９０年；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅなど、１９９０年ａ；Ｅｒｎｆｏｒｓなど、１９９０年；ＪｏｎｅｓとＲｅｉｃｈａｒｄｔ、１９９０年）も含むことが最近判明した。ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３はすべてプレプロ蛋白質と解釈され、活性になるためにはエンドプロテオリティクな切断を要する。ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ３の成熟部分の間にはかなりの相同性（＞５０％）がある。しかしながら、前駆体部分の相同性はずっと低い（〜２０％）。この神経栄養因子三種の不活性プロ型から活性因子へのプロセシング効率は細胞型によりかなり変化がある。インシュリンインシュリンは脊椎動物全ての膵臓内にあるランゲルハンス小島のベータ細胞内に生産されるポリペプチドホルモンである。インシュリンは血流内に直接分泌され、そこで炭水化物代謝を制御し、蛋白質とＲＮＡとの合成と中性脂肪の形成と貯蔵とに影響を与える。Ｔｈｅ・Ｍｅｒｃｋ・Ｉｎｄｅｘ、１０版、１９８３年。インシュリンは筋肉、肝臓および脂肪組織における同化過程を促進し、異化過程を阻止する。ヒトインシュリンの構造はＮａｔｕｒｅ、１８７４８３（１９６０年）に開示されている。組み換えＤＮＡ技術の発見前には、ヒトでの消費に用いるインシュリンの主原料は屠殺した動物の膵臓であった。ヒトインシュリンは組換え技術により製造された最初の商業的健康管理製品の中の一つであった。ヒトインシュリンの研究、開発および組み換え生産の総説はＳｃｉｅｎｃｅ、２１９巻：６３２〜６３７頁（１９８３年）にある。インシュリン応答性のグルコース制御循環インシュリン濃度はグルコース、アミノ酸、脂肪酸やある種の薬理学的作用を示す薬剤を含む低分子数種によって制御されている（Ｓｅｌｄｅｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２５〜５２８頁［１９８６年］）。膵臓小島のａおよびｂ細胞によって通常のグルコースが検出されると、それらは肝臓からのグルコース放出を促進するグルカゴンを分泌するか、あるいは肝臓中のグルコース貯蔵を誘導し、筋肉とアジポサイトとによるグルコース取り込みを促進するインシュリンを分泌する（Ｔｈｏｒｅｎｓなど、Ｄｉａｂｅｔｅｓ・Ｃａｒｅ、１３巻：３号、２０９〜２１８頁［１９９０年］）。グルコースは転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳および蛋白質プロセシングそれぞれの増加によって新たなインシュリン生合成を促進する。グルコースはまた前に貯蔵してあったインシュリンの放出も迅速に促進する。グルコースと非グルコース分泌促進剤とは究極的には同一経路を経て作用するかもしれないが、インシュリン分泌を特に賦活する濃度変化が誘導する生化学的現象は最初は多様である。グルコースの場合、ｂ−細胞への輸送と代謝はインシュリン分泌のためには絶対的要件てある（１９９２年１２月１０日公表、ＷＯ９２／２１７５６）。グルコースの細胞内取り込みはこれに結合して二層のリピドを通して輸送する膜関連キャリア−蛋白質によって行われる。哺乳類細胞ではグルコース運搬体は２群、すなわちＮａ⁺-グルコース−共輸送体および促進的グルコース輸送体（ＧＬＵＴ）が確認されている。ＧＬＵＴ族に属するものには５種が確認されている。赤血球内で発現されるＧＬＵＴ１、肝臓内で発現されるＧＬＵＴ２、脳内で発現されるＧＬＵＴ３、筋肉内と肥満細胞内とで発現されるＧＬＵＴ４、および小腸内で発現されるＧＬＵＴ５である（Ｂｅｌｌなど、Ｄｉａｂｅｔｅｓ・Ｃａｒｅ、１３巻、３号、１９８〜２０８頁［１９９０年］）。グルコース輸送体族に属する５種の中でＧＬＵＴ２はグルコースに対するＫｍとＶｍａｘとが大きい点で独特である。（１９９２年１２月１０日公表、ＷＯ９２／２１７５６号）。ＧＬＵＴ２および燐酸化酵素であるグルコキナーゼは小島ｂ細胞内のグルコース代謝を制御すると示唆されている。グルコキナーゼはＧＬＵＴ２に対応する高Ｋｍかつ高Ｖｍａｘなヘキソキナーゼ族の一員である。ＧＬＵＴ２とグルコキナーゼとは糖分解代謝速度を制御することによって循環グルコース濃度の変化に応じてインシュリン分泌を調整するグルコース感知装置であると仮定されている。（１９９２年１２月１０日公表、ＷＯ９２／２１７５６）。ヘキソキナーゼはグルコキナーゼと同一の機能（グルコース燐酸化）を果たすが、低グルコース濃度で行う（グルコースに対するヘキソキナーゼのＫｍ約０．０５ｍＭに対してグルコキナーゼは約８ｍＭ）。Ｃｕｉｆなど（Ｍｏｌ．・Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、１２巻：１１号、４８５２〜６１［１９９２年］）はトランスジェニックマウスでＬ型ピルビン酸を酵素のグルコース応答エレメントとして確認したと報告した。Ｃｕｉｆなど（前出）は −１８３と＋１１ｂｐとの間の先端領域が組織特異性をもたらし、生体内Ｌ−ＰＫ遺伝子発現の摂食的およびホルモン的制御に必要な全ての情報を含むこと、および組織特異的様式で転写活性を調整する末端配列を確認したと指摘した。生体内における役割に加えて、インシュリンは組み換え細胞の培養にも有用である。インシュリンは哺乳類細胞培養で増殖と同化のために重要なポリペプチド因子の一例である。ある細胞培養物は内在性インシュリンを製造するが、他は製造しない。添加インシュリン依存性細胞培養はインシュリンが培養物内で不安定なために問題がある。１９８９年３月３日に公開された欧州公開第０３０７２４７号（Ａ２）は外来性インシュリンを添加する必要性を排除するためにインシュリンをコードする核酸の哺乳類宿主細胞への導入を記載している。インシュリンは大きな前駆体蛋白質プロインシュリンとして合成される。プロインシュリンは成熟インシュリンにはない約３０残基の配列を含む単一ポリペプチド鎖である。プロインシュリンはプロリラキシンのようにＢ−Ｃ−Ａ鎖構造を持つ。Ｃペプチドまたは結合ペプチドはＢ鎖カルボキシ端末と将来のインシュリン分子のＡ鎖アミノ端末とに結合する。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３版、９９５頁（１９８８年）。成熟インシュリンは二塩基性残基Ａｒｇ（３１）−Ａｒｇ（３２）およびＬｙｓ（６４）−Ａｒｇ（６５）におけるＣペプチドの切断により作成される。プロインシュリンの各二塩基性切断部位に特異的な異なるプロセシング酵素２種が確認されている。Ｉ型はＢＣ結合部位に対して基質特異的であるが、一方、１１型はＣＡ結合部位に対して特異的である（ＷｅｉｓｓＮＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：１９９０年）。天然に起きるヒトインシュリン遺伝子の変異がＳｔｅｉｎｅｒなど（Ｄｉａｂｅｔｅｓ・Ｃａｒｅ、１３巻・６号、６００〜６０９頁［１９９０年］）によって報告されている。プロインシュリン過剰血症を持つ家族ではインシュリンＢ鎖第１０残基ヒスチジンがアスパラギン酸に置換されて、非細胞選別反応が変化すると報告されているプロインシュリンをもたらす。プロインシュリン過剰血症の患者では新しい合成されたＡｓｐ１０プロインシュリンのかなりの比率がプロセシングされていない型で非制御または構成的蛋白質分泌経路を経て小島から分泌される（Ｓｔｅｉｎｅｒなど、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、８５巻：８９４３〜８９４７頁［１９８８年］）および（Ｑｕｉｎｎなど、Ｔｈｅ・Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、１１３巻、９８７〜９９６頁［１９９１年］）。他の報告はこのＢ１０Ｈ＞Ｄ変異を含むインシュリンはインシュリン受容体との結合力が増し、さらに活性型インシュリンを与えることを証明した（Ｓｃｈｗａｒｔｚなど、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、８４巻：６４０８〜６４１１頁［１９８７年］；Ｂｒａｎｇｅなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３３巻：６７９〜６８２頁［１９８８年］；Ｓｈｏｅｌｓｏｎなど、ｖｏｌ．Ｂｉｏｃｈeｍ．、３１巻、１７５７〜１７６７頁［１９９２年］）。Ｂｒｅｍｓなど（Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、５巻：６号、５１９〜５２５頁［１９９２年］）はＢ鎖第１０残基ヒスチジンのアスパラギン酸による置換はインシュリン安定性を増加すると報告した。野生型ヒトインシュリンはサブユニット相互作用で二量体を形成する。二量体インシュリンはＺｎ²⁺と結合すると六量体を形成する。インシュリンＢ１０位にあるヒスチジン残基は亜鉛イオンとの配位に関与し、Ｑｕｉｎｎなど（前出）はＢ１０ヒスチジンからアスパラギン酸へのヒトインシュリン変異体はヒトプロインシュリンニ量体を形成するが六量体は形成しないと報告している。インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）インシュリン様成長因子即ちＩＧＦ類は、定義によればインシュリン様の構造的および生物学的性質とを持ち、抗インシュリン抗体過剰の存在によって中和されないポリペプチドである（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ・ａｎｄ・Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、２版［１９８７年］）。ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩとの完全アミノ酸配列は決定済である（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｅｔなど、Ｊｏｕｒｎａｌ・ｏｆ・Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｃｈｅｍiｓｔｒｙ、２５３巻、２７６９頁［１９７８年］。Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｅｔなど、ＦＥＢＳ・Ｌｅｔｔｅｒｓ、８９巻、２８３頁［１９７８年］）。双方は単一鎖ポリペプチドでジスルフィド橋３個を持ち、ヒトインシュリンＡおよびＢ鎖に対して各々４９％および４７％の配列相同性を持つ。結合ペプチドまたはＣ領域はプロインシュリンのものよりかなり短く、有意な相同性は示さない。ＩＧＦ−ＩのＣペプチドは成熟分子へのプロセシングの間には切断を受けない。加えて、ＩＧＦ−ＩはＤ領域と命名されたアミノ酸８個の短いカルボキシ端末延長ペプチドを含み、これに対する相同的領域はインシュリンには存在しない（Ｆｏｙｔ，Ｈ．Ｌ．、Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ・Ｇｒｏｗｔｈ・Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・ａｎｄ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ・Ａｓｐｅｃｔｓ［１９９１年］）。ＩＧＦ−ＩもＩＧＦ−ＩＩも各前駆体からプロテオリティクプロセシングによって誘導される（Ｊａｎｓｅｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３０６巻、６０９頁［１９８４年］；Ｂｅｌｌなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１０巻、７７５頁［１９８４年］；Ｊａｎｓｅｎなど、ＦＥＢＳ・Ｌｅｔｔｅｒｓ、１７９巻、２４３頁［１９８５年］）。細胞培養ではポリペプチド前駆体からポリペプチドを製造する方法が必要である。そこで本発明の目的の一つはポリペプチド前駆体を切断してポリペプチドにする活性プロホルモン転換酵素を発現する宿主細胞を提供することである。所期ポリペプチドの正常なプロセシングとグリコシル化とを与えるような方法で細胞培養内で所期ポリペプチドを生産する方法を提供することも本発明の別の目的である。本発明の関連目的の一つはインシュリン、リラキシンおよびＩＧＦ−Ｉのようなポリペプチドホルモンの生産である。本発明の他の目的は宿主細胞がプロセシングするためのプロホルモン転換酵素切断部位を持つポリペプチド前駆体変異体の提供に関する。組換え宿主細胞の維持と成長とのために必要なポリペプチド因子（たとえば、インシュリンまたはトランスフェリン）の供給に関する問題点を除去する必要も存在する。この必要は医薬品のような商業的ポリペプチドの生産における哺乳類細胞培養の使用に際して殊に明白になる。それ故、本発明の目的の一つは哺乳類細胞培養物の増殖および同化のために必要なポリペプチド因子前駆体のポリペプチド因子へのプロセシングを可能にするプロホルモン転換酵素を発現する哺乳類細胞培養物を提供することである。プロホルモン転換酵素を発現する宿主細胞を用いてポリペプチド因子を生産することは本発明の目的の一つである。本発明の前記および他の目的は本明細書全体を考慮すれば当業者には明かである。発明の要約本発明はプロホルモン転換酵素を発現する宿主細胞内で所期ポリペプチドを生産する方法を記載する。一つの態様は所期ポリペプチドは活性ホルモンにプロセシングされるプロホルモンである。別の態様では所期ポリペプチドは細胞成長または同化に必要なポリペプチド因子である。ある態様では本発明はプロホルモン転換酵素のような宿主細胞酵素により認識される切断部位を含む変異ポリペプチド因子を提供する。好適な態様では宿主細胞内でプロホルモン転換酵素前駆体を活性酵素までプロセシングするような宿主細胞切断部位を持つように修飾されたプロホルモン転換酵素前駆体を提供する。一つの態様では、宿主細胞がプロホルモン転換酵素を構成的に発現する。別の態様では、宿主細胞をプロホルモン転換酵素で安定的に形質転換する。本発明の一態様ではポリペプチド因子依存性宿主細胞内でのインシュリンまたはトランスフェリンのような非相同的ポリペプチド因子の生産をａ）宿主細胞の酵素が認識できる切断部位を含み、該宿主細胞がポリペプチド因子前駆体の切断産物に依存性である非相同的ポリペプチド因子前駆体をコードする核酸をポリペプチド因子依存性宿主細胞に導入すること、およびｂ）ポリペプチド因子前駆体が該切断部位で宿主細胞酵素により切断されて該ポリペプチド因子を生産するような条件下に該宿主細胞を培養すること、によって達成する。本発明の別の態様ではプロホルモン転換酵素を発現する宿主細胞内での所期ポリペプチドの生産をａ）所期ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入すること、およびｂ）所期ポリペプチドが発現される条件下に宿主細胞を培養すること、によって達成する。好ましくは、所期ポリペプチドはポリペプチドホルモンであり、いかなるポリペプチドホルモンでもよい。好ましくは、ポリペプチド鎖２個またはそれ以上を含むいかなるポリペプチドホルモンでもよい。好適な２鎖ホルモンの中にはインシュリン、リラキシン、およびインシュリン様成長因子ＩまたはＩＩがある。好適なプロホルモンの中にはプロインシュリン、プロリラキシンおよびインシュリン様成長因子ＩまたはＩＩの前駆体がある。プロホルモンはプロホルモン転換酵素切断部位１個またはそれ以上を含むように修飾されたプロホルモン変異体でもありうる。プロホルモンまたはプロホルモン変異体は生体内または試験管内の様式でプロホルモン転換酵素によりプロセシングされるものであってもよい。ポリペプチドホルモンを生産する方法はさらにプロホルモン転換酵素によるプロセシングを促進するプロホルモン転換酵素切断部位をプロホルモンに挿入することによっても達成されうる。好適なホルモンは、例えばインシュリン、リラキシン、インシュリン様成長因子Ｉまたはインシュリン様成長因子ＩＩのような、ポリペプチド鎖２個またはそれ以上を含む哺乳類ポリペプチドホルモンである。他の態様では、本方法はｋｅｘ２またはフーリンからのもののような疎水性膜貫通ゴルジアンカーに融合したプロホルモン転換酵素を含むように形質転換された細胞を用いて実行する。本発明は（ａ）ネズミのプロホルモン転換酵素１および２をコードするもの、（ｂ）挿入した転換酵素切断部位を含むプロホルモン転換酵素の変異体、および（ｃ）疎水性アンカードメインまたは他のプロセシングされたポリペプチドからの非相同的プレおよびプレプロ配列を含むプロホルモン転換酵素の変異体、の核酸を開示する。そのような核酸を含むベクターおよびそのような核酸を発現する細胞も開示する。形質転換を行う方法および形質転換された哺乳類細胞を提供する方法も開示する。図面の簡単な説明図１：ＡｔＴ２０ネズミプロホルモン転換酵素１のｃＤＮＡ（配列番号１）図２：ＡｔＴ２０ネズミプロホルモン転換酵素２のｃＤＮＡ（配列番号２）図３：ネズミＰＣ１アミノ酸（配列番号３）図４：ネズミＰＣ２アミノ酸（配列番号４）図５：リラキシン二塩基性切断部位変異体好適な態様についての記載定義用語「所期ポリペプチド」は、宿主細胞内で生産しようとする意図のあるすべてのポリペプチドであって、宿主細胞は正常には生産しないか、少量生産するものであって、細胞の継続的存在のためには通常は必要ではないものを示す。所期ポリペプチドにはアミノ酸残基最低約５個までを持つようなポリペプチドならびに第ＶＩＩＩ因子（アミノ酸残基２３３２個）のようなずっと大きい蛋白質を含む。所期ポリペプチドにはプレまたはプレプロアミノ酸配列ならびに所期蛋白質と共通の生物学的活性を示すことのできるアミノ酸残基またはグリコシル化変異型（天然対立遺伝子を含む）を持つ分子も含む。好ましくはポリペプチドはそれが造られる宿主細胞に対して非相同的であり、ヒトのポリペプチドである。好適なポリペプチドはヒト成長ホルモン、デス−Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、および牛成長ホルモンを含む成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；サイロキシン；インシュリン；黄体刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩ因子；ボンベシン；第ＩＸ因子；トロンビン；造血系成長因子；癌壊死因子−アルファおよび−ベータ；リラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；組織因子蛋白質；インヒビン；アクチビン；血管内成長因子；トロンボポイエチン；リューマチ因子；ＮＧＦ−ｂのような神経成長因子；血小板由来成長因子、；ＦＧＦやｂＦＧＦのようなフィブロブラスト成長因子；表皮成長因子；ＴＧＦ−アルファやＴＧＦ−ベータのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子−ＩとＩＩ；エリスロポイエチン；骨誘導因子；インターフェロンーアルファ、−ベータと−ガンマ；神経成長因子（ＮＧＦ）、ＢＮＤＦおよびＮＴ−３；たとえば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦやＧ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４などのインターロイキン；崩壊促進因子；動脈ナトリウム尿ペプチドＡ、Ｂ、Ｃ；およびすべての前掲ポリペプチドの断片ような医薬用途を持つものである。加えるに、このポリペプチド内の決められたアミノ酸残基１個またはそれ以上が、例えば改良された生物学的性質を持つ生産物を生産するためあるいは宿主細胞による切断を受ける二塩基性アミノ酸残基の部位を追加するか除去するかのようにして発現水準を変化させるために、置換され、挿入され、または除去されていてもよい。この本発明内に含まれる所期ポリペプチドのいくつかは、要すれば天然物分子の特性にグリコシル化修飾のような共有結合または非共有結合による修飾を持っていてもよい。「所期ポリペプチド前駆体変異体」は非天然起源酵素切願部位を含む所期ポリペプチド前駆体ならびに最終構成物が所期活性を持つ限り、要すればある別の場所にアミノ酸残基の置換、削除および／または挿入を持つ所期ポリペプチド前駆体の変異体を示す。本発明の所期ポリペプチド前駆体変異体には最終変異構築物が所期作用を持つ限り、グリコシル化または天然起源分子の他の特性部分が共有結合的または非共有結合的に修飾された変異体も含む。ここで用いる「ポリペプチド因子」は培養物中の宿主細胞の生存または成長に必要な蛋白質すべてを示す。ポリペプチド因子はホルモン、成長因子、ペプチドホルモン、オートクライン因子、輸送蛋白質、腫瘍遺伝子／プロト腫瘍遺伝子その他であってもよい。ホルモンであるポリペプチド因子の例は、例えばインシュリン、黄体剌激ホルモン（ＦＳＨ）、カルシトニン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、グルカゴン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、甲状腺剌激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）および成長ホルモンなどである。ポリペプチド因子の別の例はトランスフェリンのような輸送プロテイン、血清アルブミン、セルロプラスム、低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）および高密度リポプロテイン（ＨＤＬ）である。ポリペプチド因子のいくつかはこれらを分泌する細胞が分泌された因子に反応することができる例があるのでオートクラインと記載されることがあり、このような因子の例にはインターロイキン−２、表皮成長因子（ＥＧＦ）、フィブロブラスト成長因子（ＦＧＦ）、トロンビン、神経成長因子、造血系成長因子およびグラニュロサイト−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）がある。ポリペプチド因子のさらに別の例はある種の腫瘍遺伝子／プロト腫瘍遺伝子の発現から得られるペプチドである。本発明のポリペプチド因子に含まれるこれらのプロト腫瘍遺伝子によりコードされる蛋白質は成長因子、形質導入蛋白質および膜受容体である。成長因子の例はｓｉｓ−オンコジーンによりコードされるＰＤＧＦ（サブユニットｂ）である。末梢膜蛋白質の例はｅｒｂ−ＢによりコードされるＥＧＦのための端を切取った細胞表面受容体、ｆｍｓによりコードされるＭ−ＣＳＦ／ＣＳＦ−１のための細胞表面受容体およびｎｅｕとｒｏｓによりコードされる受容体である。形質導入蛋白質の例はａｂｌによりコードされる血漿−膜の内表面にあるチロシンキナーゼである。これらのポリペプチド因子は普通は培養培地には添加されないが、他のポリペプチド因子に代替しうる。ポリペプチド因子の定義にはポリペプチド因子の機能的特性を保持しているアミノ酸変異体を含む。これらの変異体は全配列中にアミノ酸の相違１個またはそれ以上を含んでもよく、全配列内のアミノ酸１個またはそれ以上の除去、置換および／または挿入により製造しうる。組み換えＤＮＡ技術を使用すればポリペプチド因子変異体は基礎となるＤＮＡを変化させることにより製造しうる。ポリペプチド因子変異体の構造における変化ないし変更は機能的活性が維持される限りはすべてこの発明の範囲内に含まれる。「ポリペプチド因子前駆体の変異体」は非天然起源酵素切断部位を含むポリペプチド因子前駆体を示す。「ポリペプチド因子依存性宿主細胞」は培養培地内での成長または生存のためにポリペプチド因子１種またはそれ以上を要求する宿主細胞を示す。特定の宿主細胞のためのポリペプチド因子は当業者公知の一般法を用いて決定される。培地からポリペプチド因子を除去すると細胞の死滅か成長阻害をもたらす。「非相同的ポリペプチド因子」はその宿主細胞には天然に存在しないポリペプチド因子として定義される。「非相同的」エレメントはここでは細胞にとって異物であるか、または（特に指摘しない限り）細胞にとって体内物であっても、そのエレメントが通常は宿主細胞内のその場所でない位置にある筈のものを意味するものと定義する。「内因性」エレメントはここでは細胞内に天然に存在するものを意味すると定義する。「内因性宿主細胞酵素」は細胞にとって内因性である酵素を意味するものと定義する。「プロホルモン」はホルモンの前駆体を示す。「プロホルモン転換酵素」は特定のプロテイナーゼであって、基質特異性があり、塩基性残基の一定の組合せ、好ましくはＬｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｌｙｓだけを切断する保存活性ドメインを持つものである。この型のプロテイナーゼはプロリラキシンのような大きな前駆体蛋白質をプロセシングして生物学的に活性な型にする役目を果たす。本発明ではプロホルモン転換酵素は哺乳類ＰＣ１、ＰＣ２、フーリンを示すために用い、前記のように哺乳類の、酵母のまたは生物学的に活性ないずれのプロホルモン転換酵素をも含む。酵母の酵素Ｋｅｘ２はプロホルモン転換酵素の定義から特定的に除外するものである。本発明において「プロホルモン転換酵素切断部位」はプロホルモン転換酵素により認識される切断部位を示す。「塩基性残基」はｐＨ７．０でＲ基が全体としてプラス電荷を持つアミノ酸、例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン、を示す。「二塩基性切断部位」は側鎖に塩基性電荷を持つアミノ酸２個を含み、プロホルモン転換酵素により特異的に切断される。好適なアミノ酸はＬｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｌｙｓである。「Ｋｅｘ２」はサッカロミセスに属する酵母のエンドプロテアーゼであって、メイティング型因子とキラー因子とを特異的にプロセシングするものを示す。Ｋｅｘ２はアミノ端末触媒ドメイン、続いてシステイン豊富領域、膜貫通ドメインおよび短い細胞質領域を含む。「フーリン」は遺伝子ｆｕｒでコードされる蛋白質を示し、Ｋｅｘ２蛋白質に相同性を持ち、蛋白質前駆体のプロセシングに関与している。フーリンはＣＨＯ、ＨｅｐＧ２、ＰＣ１２、ＢＨＫを含む殆どの型の細胞内および殆どの組織内で構成的に発現される。フーリンはゴルジ内で起きる塩基性切断を仲介し、Ｌｙｓ −Ａｒｇ残基の切断を優先する。Ｋｅｘ２のようにヒトのフーリンはアミノ端末触媒ドメインに続いてシステイン豊富領域、膜貫通ドメインおよび短い細胞質領域を含む。「哺乳類のＰＣ１（ｍＰＣ１）」は図４に記載した配列を示し、図４の配列に９５％またはそれ以上の相同性を持つ哺乳類プロホルモン転換酵素の全てをも示す。「哺乳類のＰＣ２（ｍＰＣ２）」は図５に記載した配列を示し、図５の配列に９５％またはそれ以上の相同性を持つ哺乳類プロホルモン転換酵素の全てをも示す。「宿主細胞酵素により認識される切断部位」は宿主細胞内に天然に存在する酵素の切断部位を示す。本発明の好適な天然起源酵素はプロホルモン転換酵素である。「プロホルモン転換酵素前駆体変異体」は非天然起源酵素切断部位ならびに最終構築物が所期活性を持つ限りにおいて、要すれば、置換、除去および／または挿入をどこかの位置に持つ、所期ポリペプチド前駆体変異体を含むプロホルモン転換酵素前駆体を示す。「前駆体」はプロセシングにより所期蛋白質に変換しうる蛋白質の一形態を意味する。これは天然のプロ型またはプレプロ型または合成のプロ型蛋白質でありうる。後者では所期蛋白質をコードする遺伝子には非相同的シグナルまたはリーダー配列および試験管内で通常に製造される構築物が先行する。「分離された」ポリペプチドとは天然環境の成分から分離および／または回収して確認されているポリペプチドを意味する。天然環境の夾雑成分はポリペプチドの診断的または治療的使用を阻害するもので、蛋白質、ホルモンおよび他の物質を含む。一部の態様において、ポリペプチドを精製して（１）ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法で測定して９５重量％以上、最も好ましくは９９重量％以上までとするか、（２）スピニングカップ配列決定装置を用いてＮ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るに十分な段階までとするか、または（３）クーマジーブルーまたは、さらに好ましくは銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性が得られるまでとする。この定義には特に天然型の宿主細胞には含まないものである宿主細胞内に存在するポリペプチドを含む。しかしながら、通常は分離されたポリペプチドは少なくとも一段階の精製により製造される。好適な態様では、分離したプロホルモン転換酵素を利用する。「核酸」はＲＮＡまたはＤＮＡ配列のどちらでもよく、５’から３’への燐酸ジエステル結合をしている一連の核酸を含むヌクレオチド配列を示す。もしＤＮＡであれば、ヌクレオチド配列は一本鎖または二本鎖である。ポリペプチドをコードする核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであって、生物学的または抗原的に活性なポリペプチドをコードするか、そのようなポリペプチドをコードする核酸配列に相補的であるか、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリド化して、それに厳密条件下に安定に結合している。プロホルモン転換酵素および／または所期蛋白質をコードする核酸は遺伝子発現および／または遺伝子生産物の機能を調節する目的、すなわち遺伝子治療の目的で宿主動物細胞、組織、器官、生物または病理学的障害に導入する。例えば、プロホルモン転換酵素および／または所期蛋白質をコードする核酸は動物生殖細胞系ならびに動物体細胞細胞系に導入しうる。宿主動物に導入された核酸はメチル化されていても、されていなくてもよい。核酸のメチル化のために適当な技術の選択は当業者の範囲内にあると見做される（Ｋｅｓｓｌｅｒなど、Ｇｅｎｅ）９２巻：１〜２４８頁［１９９０年］）および（Ｄｏｅｆｌｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、３７２１巻：８号、５５７〜５６４頁［１９９１年］）。「分離された」ポリペプチド核酸は核酸天然源に通常夾雑する核酸少なくとも一つから分離されて確認された核酸である。分離した核酸は天然に見出される型またはセットとは異なる。それ故、分離されたプロホルモン転換酵素核酸は天然細胞内に存在するままのプロホルモン転換酵素核酸とは区別される。しかしながら、分離されたプロホルモン転換酵素核酸は核酸が、例えば天然細胞のそれとは異なる染色体内の位置にあるような通常のプロホルモン転換酵素発現細胞内でのプロホルモン転換酵素をも含む。「疎水性膜貫通アンカー」はゴルジ、ＲＥＲまたは別の細胞の膜内に局在する酵素の疎水領域であり、酵素の特定部位への局在化を促進し、細胞からの酵素の損失を削減しており、特に代表的なアンカーは、ｋｅｘ２およびフーリン膜貫通アンカーである。用語「変異体」はここではアミノ酸配列、グリコシル化または天然起源分子の他の特徴が共有結合または非共有結合的に修飾されている分子として定義され、変異型も含むものと意図されている。この発明に含まれる変異型のいくつかは、最終構築物が所期の活性を有する限り、アミノ酸置換または宿主細胞酵素切断部位の付加および、要すれば、別の位置における置換、除去および／または挿入を有するものとする。用語「宿主細胞」は培養液内で成長でき、プロホルモン転換酵素および／または所期蛋白質および／またはポリペプチド因子を発現できる細胞を示す。この開示に示す宿主細胞は試験管内培養の細胞ならびに宿主動物内にある細胞を示す。この発明の試験管内培養における好ましい宿主細胞は哺乳類細胞であるが、他の細胞も使用できる。この発明の態様には前駆体から活性型へのプロセシングを要求する宿主細胞酵素の使用を含む。宿主細胞酵素を処理するために必要な酵素を持たない細菌または酵母のような宿主細胞では、この発明方法の実施を促進するために宿主細胞にその酵素を導入しうる。動物内にある宿主細胞は動物に導入されたか、またはその動物にとって内因性であり、プロホルモン転換酵素および／または所期蛋白質を発現できる宿主細胞を示す。本発明において、所望の蛋白質をコードする核酸の宿主動物への導入のために使用する細胞は、宿主動物から誘導された宿主オートロガス細胞であるかまたはその宿主動物から誘導されたものではない非宿主オートロガス細胞でありうる。この発明のある態様において、動物へ核酸を導入するために使用する細胞は非宿主オートロガスであり、非宿主オートロガス細胞は宿主動物に対して非免疫源性で無毒性であるのが好ましい。本発明において、グルコースに反応してインシュリンを分泌することのできる変異プロインシュリンをコードする核酸を含む宿主細胞が提供される。グルコースに対して過剰な感受性を示す宿主細胞は高レベルのヘキソキナーゼ活性を発現するので、これらの細胞は組み換え核酸技術により修飾して１９９２年１２月１０日公表のＷＯ９２／２１７５６に記載のようにしてヘキソキナーゼ活性を除去または減少させることが必要であろう。このようなヘキソキナーゼ活性の監視および修飾はこの発明の関与分野では常法である。本発明の宿主細胞には天然起源または非天然起源宿主細胞プロセシング酵素によってプロセシングするためのプロホルモン転換酵素切断部位を持つポリペプチド前駆体変異型をコードする核酸を含みうる。ここで使用する用語「組み換え」細胞は変異プロインシュリンをコードする核酸のような所期核酸が導入された細胞を示すことを意図している。組み換え細胞は導入された核酸を含まない天然起源細胞とは区別される。本発明の核酸は天然原料から得た、化学的に合成された、または組み換え技術によって製造した核酸を含む。本発明の組み換え蛋白質をコードする組み換え細胞は分泌顆粒を形成する能力を欠いている細胞から誘導されうる。分泌顆粒を形成する能力を欠き、構成的蛋白質分泌経路を有する細胞型の実例には、フィブロブラスト、マクロファージ、上皮細胞およびリンパ球がある。核酸を動物宿主細胞に導入するために利用できる技術には次のものを含む。複製欠損ウイルス、殊にレトロウイルスベクターのような目的とする蛋白質をコードする核酸を含むウイルスによる宿主細胞の感染（例えば、１９９１年８月２２日公開のＷＯ９１／１２３２９参照）。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの型での核酸をリポソームまたはリポソーム複合体と合し、動物宿主細胞内に直接に注射する直接注射技術の使用（Ｆｅｌｇｎｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、３４９巻、３５１〜３５２頁［１９９１年］）。相同的組み換え技術により宿主動物ゲノムに導入した核酸の安定な組込み（Ｗａｌｄｍａｎ）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ／Ｈｅｍａｔ．、１２巻４９〜６４頁［１９９２年］）。電気穿孔法による宿主動物細胞への核酸の導入（Ｒｅｉｄなど、電気穿孔法および電気融合への指針（Ｇｕｉｄｅ・ｔｏ・Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ・ａｎｄ・Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）、Ｃｈａｎｇなど編、Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓs刊、２０９〜２２５頁［１９９２年］）および（Ｃｈａｎｇなど、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ・ｅｔ・Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ・Ａｃｔａ、１０９２巻：２号、１５３〜１６０頁［１９９１年］）。遺伝子の発現および／または遺伝子生産物の機能を調節するように修飾できる適当なウイルスの代表例は次のものを含む：ハーベイザルコマウイルス、ルースザルコマウイルス、ＭＰＳＶ、モロニーネズミ白血病ウイルスおよびアデノウイルスのような核酸ウイルス。適当なウイルスのベクターを採用するに当り、ウイルス複製の機会を除去および／または削減するための段階を経る必要がある。当業界では本質的にウイルスの複製がないウイルスベクター粒子を生産するヘルパー細胞を提供するための種々の技術が公知である。複製欠陥ウイルスは複製遺伝子、ｇａｇ（群特異性抗原）、ｐｏｌ（ポリメラーゼ）またはｅｎｖ（外皮）蛋白質コード遺伝子の１種またはそれ以上を欠落したものである。（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚなど、Ｊｏｕｒｎａｌ・ｏｆ−Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６２巻：４号、１１２０〜１１２４頁［１９８８年］。Ｗａｔａｎａｂｅなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・ａｎｄ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、３巻：１２号、２２４１〜２２４９頁［１９８３年］。Ｄａｎｏｓなど、ＰＮＡＳ、８５巻：６４６０〜６４６４頁［１９８８年］。Ｂｏｓｓｅｌｍａｎなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・ａｎｄ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、７巻：５号、１７９７〜１８０６頁［１９８７年］）。宿主細胞への核酸導入のための適当な技術の選択は本開示から当業者にとっては常套手段であると見做される。目的とする蛋白質を生産する宿主細胞または組み換え細胞の選択は当業者の範囲内にあると見做される方法によるもので、例えば抗生物質のようなマーカー遺伝子の使用、組み換え技術の方法により導入した核酸の検出（Ｓａｎｂｒｏｏｋなど、分子クローニング−実験指針（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）、２版、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ刊、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ［１９８９年］）、所期蛋白質生産を検出するための抗生物質の使用（Ｓａｎｂｒｏｏｋなど、前出）、および動物モデル系で目的蛋白質をコードする核酸を含む組み換え細胞の検査（Ｂａｒｒなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５４巻：１５０７〜１５０９頁［１９９１年］）を含む。本発明の宿主細胞は好ましくは分泌顆粒を形成する能力を欠き、構成的蛋白質分泌経路を持つものである。本発明の実施に当り、選択する宿主細胞は促進的なグルコース輸送体（ＧＬＵＴ）および宿主細胞に天然に存在するグルコキナーゼまたは宿主細胞には天然には存在しない、すなわち当業界で公知の組み換え技術により細胞に導入したグルコキナーゼをコードする核酸を含みうる。本発明の宿主細胞はプロホルモン転換酵素および／または所期蛋白質を発現する能力を持つものである。本発明の実施に当り、プロホルモン転換酵素をコードする核酸は細胞内に天然に存在するか、天然には存在しない、すなわち当業界で公知の組み換え技術により細胞に導入したものである。「細胞」および「細胞培養物」の表現は互換的に使われ、これらの名称はすべて子孫と祖先とを含む。また、すべての子孫は意図的または偶然の変異のためにＤＮＡ組成の点で正確には同一でないかもしれないことも理解される。細胞内で選択された同一機能または生物学的活性を持つ変異子孫をも含めるものとする。明確な指摘を求めるならば文脈から明らかになろう。「移入」はコードした配列が実際に発現するかどうかに拘らず宿主細胞による発現ベクターの取込みを示す。移入方法は、例えばＣａＰＯ₄および電気穿孔法のように、当業者には多数が公知である。移入の成功は一般に宿主細胞内にこのベクターの作用指標がある時に認識される。「形質転換」はＤＮＡを複製できるように染色体外エレメントとしてまたは挿入染色体によりＤＮＡを生物に導入することを意味する。形質転換は用いる宿主細胞に依存して、その細胞に適当な標準的技術を用いて行われる。Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、前出の１．８２章に記載されている塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は一般に原核生物または実質的細胞壁関門を含む他の細胞で使用される。Ｓｈａｗなど、Ｇｅｎｅ、２３巻：３１５頁（１９８３年）および１９８９年６月２９日に公表されたＷＯ８９／０５８５９に記載のようにしてアグロバクテリウム・ツメファシエンスによる感染を用いてある種の植物細胞を形質転換した。細胞壁のない哺乳類細胞ではＳａｍｂｒｏｏｋなど、前出の１６．３０〜１６．３７章に記載されている燐酸カルシウム沈殿法が好適である。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的側面は１９８３年８月１６日に発行された米国特許４３９９２１６にＡｘｅｌが記載した。酵母への形質転換は典型的にはＶａｎ・Ｓｏｌｉｎｇｅｎなど、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１３０巻：９４６頁（１９７７年）およびＨｓｉａｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７６巻：３８２９頁（１９７９年）の方法に従って実施する。しかしながら、核注射、電気穿孔法または原形質融合による細胞への他のＤＮＡ導入法も使用しうる。「安定的に形質転換した宿主細胞」は挿入された核酸が宿主細胞に組込まれたか染色体外に存在し、また細胞に核酸挿入後２週間にわたり連続的に挿入した核酸を生産する細胞を示す。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的側面は１９８３年８月１６日に発行された米国特許４３９９２１６にＡｘｅｌが記載している。用語「培地」は哺乳類細胞が培養で生育する水性環境を示す。この培地は生理化学的、栄養学的およびホルモン的環境を含む。慣習的には培地は成長または生存のために必要な栄養的および成長因子の添加によって形成される。「血清不含培地」は血清を含まない培地を示す。培養物内で特定の細胞が生存または成長するために必要で血清内に典型的に見出されるホルモン、成長因子、輸送蛋白質、ペプチドホルモン、その他を血清不含培地への追加物として典型的に添加する。「特定培地」は培養物内の細胞の生存および成長のために必要な栄養的およびホルモン性要求物を含む培地成分が知られている培地を示す。本発明方法で提供される特定培地は培地の一般的環境とは異なる特定宿主細胞用の環境を確立する。血清不含培地内の細胞は一般に至適成長のためにインシュリンおよびトランスフェリンを要求する。細胞がいかなる因子を要求するか決定する時にはまずこの２因子を検査すべきてある。殆どの細胞系は成長因子１種またはそれ以上を要求する。これらは皮下成長因子（ＥＧＦ）、フィブロブラスト成長因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）、神経成長因子（ＮＧＦ）などを含む。必要かもしれない因子の別群は次を含む。輸送および結合蛋白質（たとえば、セルロプラスミン、高および低密度リポ蛋白質［ＨＤＬ、ＬＤＬ］、アルブミン）、およびホルモン類。「厳密条件」は次のハイブリッド化条件である。（１）洗浄に低イオン強度と高温、例えば０．０１５Ｍ−ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ−クエン酸ナトリウム／０／１％ＮａＤｏｄＳＯ₄を５０℃、を採用する。（２）ハイブリド化の間にホルムアミドのような変性剤、例えば５０％（容／容）ホルムアミドを０．１％ウシ血清アルブミン／０／１％ファイコル／０／１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ−ＮａＣｌ、７５ｍＭ−クエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭ −燐酸ナトリウム緩衝液を４２℃で採用する。（３）５０％ホルムアミド、５× ＳＳＣ（０．７５Ｍ−ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ−クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ−燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストランを４２℃で採用し、４２℃の０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄する。所定ＤＮＡ断片の制限消化物からの「回収」または「分離」は消化物のポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上の電気泳動による分離、既知分子量マーカーＤＮＡ断片と移動度を比較する目的断片の確認、所望断片を含むゲル部分の取出、ＤＮＡからゲルの分離を意味する。この操作は一般に公知である。例えば、Ｌａｗｎなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄ・Ｒｅｓ．、９巻：６１０３〜６１１４頁（１９８１年）およびＧｏｅｄｄｅｌなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄ・Ｒｅｓ．、８巻：４０５７頁（１９８０年）参照。ここで用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は一般的にＲＮＡおよび／またはＤＮＡ核酸の特定部分の微量を１９８７年７月２８日発行の米国特許４６８３１９５に記載のようにして増幅する操作を示す。一般にオリゴヌクレオチドプライマーを設計できるような目的領域の両端からの配列情報またはそれを越える配列情報が必要であるが、これらプライマーは増幅すべき鋳型とは逆の鎖と配列が同一または類似している。プライマー２個の５’−端末ヌクレオチドは増幅された物質の端末と一致していてもよい。ＰＣＲは特定ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定ＤＮＡ配列、全細胞ＲＮＡから転写したｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列その他を増幅するために使用することができる。一般的にはＭｕｌｌｉｓなど、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１巻：２６３頁（１９８７年）、Ｅｒｌｉｃｈ編、「ＰＣＲ技術（ＰＣＲ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」Ｓｔｏｃｋｔｏｎ・Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９年参照。ここではＰＣＲは既知核酸のプライマーとしての使用および特定の断片を増幅または作成のための核酸ポリメラーゼの使用を含む検体核酸を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一例ではあるが、唯一の方法ではないと考えられる。「オリゴヌクレオチド仲介変異誘発」はプロホルモン転換酵素１または２をコードするＤＮＡの置換、除去および挿入変異体を生産する方法を示す。この技術は当業界でよく公知であり、Ａｄｅｌｍａｎなど、ＤＮＡ、２巻：１８３頁（１９８３年）に記載がある。要約的には、プロホルモン転換酵素１または２のＤＮＡをＤＮＡ鋳型への所期変異をコードするオリゴヌクレオチドのハイブリド化によって変更する。ここに、鋳型はプロホルモン転換酵素１または２の不変または自然のＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはバクテリオファージの単鎖型である。ハイブリド化後ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の第二の相補鎖全体を合成し、これでオリゴヌクレオチドプライマーが導入され、プロホルモン転換酵素１または２における選択した変化をコードする。一般に、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが使用される。至適オリゴヌクレオチドは１２から１５ヌクレオチドを持ち、変異をコードするヌクレオチドの一端で鋳型に完全に相補的である。これでオリゴヌクレオチドが単鎖ＤＮＡ鋳型分子に正常にハイブリド化することが保証される。オリゴヌクレオチドはＣｒｅａなど（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５巻：５７６５頁［１９７８年］）が記載しているような当業界で公知の技術を用いて容易に合成される。「グリコシル化」はグリコプロテインを生産するために蛋白質に一連の糖残基を添加する翻訳後修飾工程を示す。グリコシル化は哺乳類細胞のシトソール、小胞体またはゴルジ装置内で行われる。「ｐＲＫ５」および「ｐＲＫ７」は哺乳類細胞を形質転換するために使用する発現ベクターである。発現ベクターｐＲＫ５の構造は１９８９年３月１５日公開の欧州特許出願０３０７２４７Ａ２に記載がある。ｐＲＫ７ベクターは１９８８年８月１７日公開の欧州特許出願２７８７７６に記載がある。「制御された蛋白質分泌経路」は開口分泌のための細胞内経路を示す。これは環状ＡＭＰのような生理学的刺激により短時間制御される。この経路は細胞の生活のためには必要ではなく、内分泌細胞および外分泌細胞のような専門化された分泌細胞内にのみ存在する。「構成的蛋白質分泌経路」はマクロファージおよびフィブロブラストのような細胞内に見出される制御されていない細胞内経路を示す。「ヒトインシュリン」は天然起源ヒトインシュリンと共通の生物学的作用を示す蛋白質を示す。ヒトインシュリンの生物学的作用にはグルコース利用、蛋白質合成および中性脂質の形成と貯蔵との促進を含む。「ヒトプロインシュリン」はＢ、ＣおよびＡ鎖アミノ酸配列を含む分子と定義され、前記インシュリン機能の特性を保持するアミノ酸変異型も含む。これらの変異型は全配列中にアミノ酸の違い１個またはそれ以上を含んでいてもよく、また全配列内のアミノ酸残基１個またはそれ以上の除去、置換および／または挿入により製造しうる。この分野での常法技術の使用により、蛋白質自体または蛋白質をコードする核酸を変更することによって変異ヒトプロインシュリンを生産しうる。プロインシュリンの機能的活性が維持されている限り、ヒトプロインシュリン変異型をもたらすヒトプロインシュリン構造の変種または変更はすべてこの発明の範囲内に含まれる。「ヒトリラキシン」は生物学的活性を示すことのできる機能的蛋白質を示す。ヒトリラキシンの生物学的活性は（１）ヒトリラキシンのエピトープ少なくとも一つとの免疫学的交差反応性または（２）ヒトリラキシンと共通するホルモン的機能少なくとも一つの保有のどちらかであると定義する。「ヒトプロリラキシン」はアミノ酸配列Ｂ、ＣおよびＡ鎖を含む分子と定義され、前記機能的特性を保持しているアミノ酸変異型も含む。これらの変異型は配列全体にアミノ酸の違い１個またはそれ以上を含みうるし、配列全体中のアミノ酸残基１個またはそれ以上の除去、置換および／または挿入によって製造しうる。組み換えＤＮＡ技術を使用して、変異ヒトプロリラキシンは基盤となるＤＮＡを変更することによって製造しうる。機能的な活性が保持される限り、変異ヒトプロホルモンリラキシンをもたらすヒトプロリラキシン構造におけるこれらの変種または変更はこの発明の範囲内に含まれる。ここで用いる「ＩＧＦ−Ｉ」はウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび好ましくはヒトを含むいずれかの種からの天然起源配列または変異型のまたは天然、合成または組み換えいずれかの起源からのＩＧＦ−Ｉを示す。変異型は配列全体にアミノ酸の違い１個またはそれ以上を含みうるし、また、配列全体内のアミノ酸１個またはそれ以上の除去、置換および／または挿入により製造しうる。機能的な活性が保持される限り、ヒトプロリラキシン変異型をもたらすＩＧＦ−Ｉの構造における変異型または変化はすべてこの発明の範囲内に含まれる。インシュリン応答性疾患はインシュリン単独またはインシュリンと他の治療薬との組合せで予防または処置することのできる症状により特徴付けられるすべての疾患であると定義する。変異型プロインシュリン細胞プロセシング酵素、所期ポリペプチドをコードする核酸配列、その他のこの発明の目的遺伝子は宿主細胞に１コピー以上導入するのが望ましい。核酸を約５から１０μｇＤＮＡ／細胞の割合で導入する。けれどもこの核酸の量は、例えば前記量の１０倍または２０倍に、または所期結果を得るに十分な量に増加することができる。この発明には試験管内、生体内または生体外で動物の細胞または組織に核酸を導入することも含む。ある例では、核酸に機能欠損内因性遺伝子の代替（またはの代わりに作用する）をさせることまたは宿主にインシュリンのような治療的ポリペプチドを生産する能力を与えることを意図した。そのような細胞または組織に核酸を導入する方法には裸のＤＮＡまたはＲＮＡの挿入のような試験管内核酸導入法（組織への核酸の注射のような）、生体外で転写して非相同的または変異型核酸を発現するように修飾した細胞の組織への再導入、リポソームまたは他の担体内への核酸の移入、ウイルス、レトロウイルス、ファージ、プラスミドなどのようなベクターまたは電気穿孔のような技術の使用を含む。試験管内での電気穿孔法はＢａｒｓｏｕｍ、ＤＮＡ・ａｎｄ・Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、９巻：４号、２９３〜３００頁（１９９０年）に開示されている。電気穿孔法は、例えば所期核酸を組織内に注射し、次に電極または他の適当な装置により電流を標的組織に加えるようにして、生体内または生体外でも使用しうる。細胞または組織に核酸を導入する他の既知方法はこの発明の実施のために適当である。非相同的核酸を転写して発現するトランスジェニック動物はこの発明に含まれる。この動物は生殖細胞、体細胞または胚に非相同的核酸をこの発明の方法に従って移入して生産されている。この発明の方法には相同的組み換えおよび非相同的配列の導入のための内因性配列を用いることも含む。修飾された細胞／胚は適当に移植して、非相同的ＤＮＡを含む成熟した動物に成長させるかまたは安定に組込ませた。再現性ある百分率のこの動物は非相同的に核酸を蛋白質に転写し、発現する。この蛋白質は血液または血清を含む組織内で確認することができる。トランスジェニック動物の製法は米国特許４３９６６０１に記載がある。試験管内使用の製剤と投与方法は前記の実験的評価により決定される。培養物または点滴基剤と配合できる水性製剤が通常使用されよう。生体内または生体外で組織または細胞へ導入するための核酸および非経口投与のために修飾細胞／組織は注射用単位用量型（溶液、懸濁液、乳液）に医薬的に許容しうる非経口担体とともに製剤化されうる。この担体は本質的に非毒性で、非治療的である。このような担体の例は水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンである。不揮発油およびオレイン酸エチルのような非水担体も使用できる。リポソームも担体として使用しうる。担体は、たとえば緩衝液および保存剤など、等張性および化学的安定性を強化する物質のような少量の添加物を含みうる。治療に使用するこの発明の細胞または組織は処置すべき疾患、各患者の容体、細胞または組織の放出部位、投与方法および実施者が知っている他の因子を考慮に入れて良好な医学的慣例に合致する様式で用量が確立され、製剤化される。投与のための細胞または組織は前記のように製造される。組み換え宿主細胞または組み換え生産物を生産するプラスミドの治療的有効量は宿主細胞またはプラスミドが疾病の症状を予防または処置するためまたは病理生理学的状況に応答するために有効な量である。本発明の一態様では疾患は宿主動物を組み換えプロインシュリンをコードする核酸の導入により処置し、予防できるインシュリン応答性疾患でありうる。対象に投与さるべき宿主細胞の量は所期蛋白質の生産量に依存するであろう。好適な態様では１×１０⁶から１×１０¹⁰細胞を毎日投与するが、各細胞は好ましくは１０⁶細胞当り所期蛋白質５００から５０００ｎｇを各日投与する。対象への投与のための目的組み換え生産物を製造するプラスミドの治療的用量はプラスミドによる組み換え生産物の発現水準に依存する。殆どの目的ではプラスミドＤＮＡの範囲は１ｍｇから発現水準が組み換え生産物をコードするＤＮＡ１ｕｇにつき組み換え生産物５００ｎｇの範囲にあるプラスミドＤＮＡ１ｍｇまでである。本発明による組み換え蛋白質をコードするＤＮＡを含む宿主細胞またはプラスミドの投与経路はこの開示に例示され、適当なウイルス、レトロウイルス、ファージなどによるウイルス感染はこの発明の宿主細胞またはプラスミドのＷａｎｇなど、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、８４巻：７８５１〜７８５５頁［１９８７年］、Ｋａｎｅｄａなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３巻：３７５〜３７８頁［１９８９年］、Ｏｎｏなど、Ｎｕｃｌｅｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、１１７巻：２５９〜２６３頁［１９９０年］が記載するような適当な担体中での標的細胞または組織への直接注射、１９９２年１２月１０日公表のＷＯ９２／２１７５６のような組み換え細胞の移植（典型的には腹腔内または皮下）、Ｗａｌｄｍａｎなど、前出、が記載した相同的組み換え、およびＲｅｉｄなど、前出、またはＢａｒｓｏｕｍ、ＤＮＡ・ａｎｄ−Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、９巻：４号、２９３〜３００頁（１９９０年）が記載の電気穿孔によるものを含む。哺乳類細胞培養物内プロホルモン転換酵素の使用本発明において、細胞成長および同化のために必要なポリペプチド因子を発現するためにプロホルモン転換酵素を発現する宿主細胞を使用しうる。哺乳類細胞は次の群からのホルモン１種またはそれ以上を要求するものが多い：ステロイド、プロスタグランジン、成長因子、脳下垂体ホルモンおよびポリペプチドホルモン。殆どの細胞型は血清不含培地内で生存するためにはインシュリンを要求する。（Ｓａｔｏ，Ｇ．Ｈ．など、「ホルモン規定培地内での細胞成長（Ｇｒｏｗｔｈ・ｏｆ・Ｃｅｌｌｓ・ｉｎ・Ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ・Ｄｅｆｉｎｅｄ・Ｍｅｄｉａ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８２年］）。ホルモンに加え、細胞はトランスフェリン（血漿鉄輸送蛋白質）、セルロプラスミン（銅輸送蛋白質）および高密度リポプロテイン（脂質輸送体）のような輸送蛋白質を細胞培地に添加することを要求することがありうる。至適なホルモンまたは輸送蛋白質の組合せは各細胞型で相違する。これらのホルモンまたは輸送蛋白質は殆どが外来的に添加されているが、または稀には特別の因子を要求しない変異細胞系も見出されている。細胞増殖研究で休止期の成長停止から増殖への細胞の寄与を導くのに必要な出来事を解明した。種々のポリペプチド因子がこの形質転換に関与していることが発見されている。これらの形質転換細胞は培養物内でペプチド成長因子を生産することが発見されている。（Ｋａｐｌａｎ，Ｐ．Ｌ．など、ＰＮＡＳ、７９巻：４８５〜４８９［１９８２年］）。細胞が応答できる因子が同じ細胞から分泌されることは「オートクライン」系と呼ばれる。多数の因子がオートクラインとして記載されている。ボンベシン、インターロイキン−２（Ｄｕｐｒｅｚ，Ｖ．など、ＰＮＡＳ、８２巻：６９３２頁［１９８５年］）、インシュリン（Ｓｅｒｒｅｒｏ，Ｇ．、Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ・＆・Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２１巻、９号：５３７頁［１９８５年］）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ −β）（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．＆・Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ、３１３巻：７４５頁［１９８５年］）、ザルコマ成長因子（ＳＧＦ）（Ａｎｚａｎｏ，Ｍ．Ａ．など、ＰＮＡＳ、８０巻：６２６４頁［１９８３年］）および造血成長因子、顆粒粒−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｌａｎｇ，Ｒ．Ａ．など、Ｃｅｌｌ、４３巻：５３１頁［１９８５年］）。本発明の方法はプロホルモン転換酵素１種またはそれ以上を発現するのに適当であり、さらに増殖または完全な細胞の維持のために必要なポリペプチド因子をコードする核酸を含む。本発明において好適なポリペプチド因子はインシュリンである。本発明において、プロホルモン転換酵素を発現する宿主細胞を用いて前駆体型からのプロセシングを要求する所期ポリペプチドを発現しうる。本発明の細胞は細胞培養物内で用いればプロホルモン転換酵素によるプロセシングを要求しない目的ポリペプチドも生産しうる。本発明では、所期ポリペプチドまたはポリペプチド因子をコードする核酸の導入前にプロホルモン転換酵素をコードする核酸を導入しうる。本発明において、プロホルモン転換酵素をコードする核酸は所期ポリペプチドまたはポリペプチド因子をコードする核酸と同時に導入しうるが、この核酸は同一または別のベクター上に存在しうる。ここに十分に記載するように、本発明は（イ）ポリペプチド因子前駆体の切断生産物に依存性であるポリペプチド因子依存性宿主細胞に宿主細胞酵素により認識できる切断部位を含む非相同的ポリペプチド因子前駆体をコードする核酸を導入すること、および（ロ）宿主細胞酵素によりポリペプチド因子前駆体が該切断部位で切断される条件下に該宿主細胞を培養し、そこでポリペプチド因子を生産すること、を含むポリペプチド因子依存性宿主細胞内で非相同的ポリペプチド因子の生産法を記載する。要すれば、ポリペプチド因子は回収される。本発明はさらに（イ）所期ポリペプチドをコードする該プロホルモン転換酵素核酸を発現する宿主細胞に導入すること、および（ロ）該所期ポリペプチドを発現する条件下に宿主細胞を培養すること、を含むプロホルモン転換酵素を発現する宿主細胞内で所期ポリペプチドの生産法を記載する。要すれば所期ポリペプチドは回収される。ここに記載した切断の仕事のいずれのためにも、所望に従って宿主細胞酵素または非相同的酵素を宿主細胞に追加する。本発明はプロホルモン転換酵素切断部位を含むポリペプチド因子前駆体変異体をコードする核酸を開示する。本発明の別の側面は疎水性膜貫通アンカーをコードする核酸に結合しているプロホルモン転換酵素をコードする核酸である。この結合核酸はポリペプチド融合生産物の合成を目指す。この融合生産物では触媒的に活性なプロホルモン転換酵素は疎水性膜貫通アンカーに共有結合的に接着している。好適な疎水性膜貫通アンカーにはＫＥＸ２疎水性膜貫通アンカーおよびフーリン疎水性膜貫通アンカーがある。本発明はプロホルモン転換酵素切断部位をコードする核酸を持つプロホルモン転換酵素前駆体変異体も提供する。本発明はさらにプロホルモン転換酵素切断部位を含むポリペプチド因子前駆体変異体をコードする核酸を持つ宿主細胞も提供する。ここに開示する核酸および方法は広範な宿主細胞系での発現に使用するために適当である。哺乳類細胞はプロホルモン転換酵素を発現するために好適な宿主細胞である。本発明の宿主細胞は通常はプロホルモン転換酵素の検出可能量を発現しない哺乳類細胞でありうる。加えるに、本発明の哺乳類細胞は所期ポリペプチド前駆体を所期ポリペプチドにプロセシングするには不十分なプロホルモン転換酵素濃度を生産する哺乳類細胞でありうる。プロホルモン転換酵素をコードする核酸によるこの細胞の形質転換は所期ポリペプチド前駆体をポリペプチドにプロセシングするに十分なプロホルモン転換酵素の増加をもたらす。核酸の分離目的とするプロホルモン、転換酵素または他のポリペプチドをコードする核酸はポリペプチドｍＲＮＡを持ち、検出できる濃度で発現すると信じられる組織または細胞から製造したｃＤＮＡライブラリーから得られうる。所期遺伝子もゲノムのライブラリーから得られうる。目的遺伝子またはそれでコードされる蛋白質を確認するために設計したプローブでライブラリーを検索する。ｃＤＮＡ発現ライブラリーに適当なプローブは、所期ポリペプチドを認識し、特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、同一または異なる種からの目的ポリペプチドｃＤＮＡの公知または推定上の部分をコードする約２０〜８０塩基長のオリゴヌクレオチドおよび／または相補的または相同的ｃＤＮＡまたは同一または類似遺伝子をコードする断片を含む。ゲノムＤＮＡライブラリーの探索に適当なプローブは、これに限られるものではないが、オリゴヌクレオチド、同一または類似遺伝子をコードするｃＤＮＡまたはその断片および／または相同的ゲノムＤＮＡまたはその断片を含む。選択したプローブによるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー探索はＳａｍｂｒｏｏｋなど、前出、の１０〜１２章に記載されている標準操作を用いて行いうる。目的ポリペプチドをコードする遺伝子を分離する別の方法はＳａｍｂｒｏｏｋなど、前出、１４章に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用するものである。この方法は目的遺伝子にハイブリド化するオリゴヌクレオチドプローブの使用を要求する。オリゴヌクレオチド選択方策は以下に記載する。目的遺伝子を得るための別法はＥｎｇｅｌｓなど（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２８巻：７１６〜７３４頁［１９８９年］）に記載されている方法の一つを使用して化学合成することである。これらの方法はトリエステル、ホスファイト、ホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネート法、ＰＣＲその他のオートプライマー法、および固体担体上のオリゴヌクレオチド合成を含む。これらの方法はもし遺伝子の全核酸配列が公知であるか、またはコードする鎖に相補的な核酸配列を入手できれば使用しうるし、また、もし標的アミノ酸配列が公知であれば、各アミノ酸残基のための基を好適にコードする公知の残基を使用して可能な核酸配列を推測しうる。この発明を実施する好適な方法は目的遺伝子またはポリペプチドの原料に依存して、種々の組織からｃＤＮＡライブラリーを探索するために注意深く選択したオリゴヌクレオチド配列を使用することである。プローブとして選択するオリゴヌクレオチド配列は偽陽性を減らすために十分な長さであり、十分に明確でなければならない。通常、実際のヌクレオチド配列は保存されたまたは高度に相同的なヌクレオチド配列または目的ポリペプチドに相同的な他のポリペプチド領域に基づく。オリゴヌクレオチドは位置１個またはそれ以上で縮重していてもよい。その種における優先的コドン使用が未知である種からライブラリーが探索される時は縮重オリゴヌクレオチドの使用は殊に重要である。オリゴヌクレオチドは探索すべきライブラリー中のＤＮＡへのハイブリド化後に検出することができるように標識しなければならない。標識の好適な方法は、当業界でよく公知であるように３２−Ｐ標識ＡＴＰをポリヌクレオチドキナーゼと用いてオリゴヌクレオチドを放射能標識するものである。しかしながらオリゴヌクレオチドを標識するために、これに限るものではないが、ビオチン化または酵素標識を含む別法を使用しうる。殊に興味深いのは、全長ポリペプチドをコードするプロホルモン転換酵素核酸である。ある好適な態様において、核酸配列はプロホルモン転換酵素のシグナル配列を含む。蛋白質コード配列全体を持つ核酸は選択したｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの探索によって得られ、そして、要すればＳａｍｂｒｏｏｋなど、前出、の７．７９章に記載されているような通常のプライマー延長操作を用い、ｃＤＮＡに逆転写されないかもしれない前駆体およびｍＲＮＡのプロセシング中間体を検出する。本発明の好適な態様においては、ＤＮＡハイブリド化プローブを用いて制御された分泌経路を含む細胞系における新規プロホルモン転換酵素候補酵素メッセージを確認する。ネズミ脳下垂体腫瘍細胞系ＡｔＴ−２０は神経内分泌由来であってＡＣＴＨを分泌するので適当である。それ故、プロホルモン基質内の塩基性アミノ酸の特定ペアでの切断を要求するＡＣＴＨに成熟するプロホルモンであるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）前駆体の転換の過程に関与するプロセシング酵素を含むことが期待される。ＡｔＴ−２０細胞内で発現するｃＤＮＡ候補はＭＯＰＡＣ操作（Ｉｎｎｉｓ、１９９０年）によりＳｍｅｅｋｅｎｓとＳｔｅｉｎｅｒ（１９９０年）の記載に基づく縮重プライマー配列を用いて増幅しうる。殊に好適な態様では、ＡｔＴ− ２０細胞からＰＣ様ｃＤＮＡ２種を増幅し、クローンする：ｍＰＣ２（ＳｍｅｅｋｅｎｓとＳｔｅｉｎｅｒのヒトＰＣ２に９５％より大きい相同性）およびｍＰＣ１と呼ばれるｍＰＣ２に類似の第二の配列。ポリペプチド変異体の構築プロホルモン転換酵素、ポリペプチド因子、所期ポリペプチドまたは他の目的ポリペプチドのアミノ酸配列変異型はコードするＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、または所期ポリペプチドの試験管内合成により製造される。この変異型は、例えば目的ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの削除または挿入または置換を含む。削除、挿入および置換の組合せは、最終構築物が所期性質を保有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。アミノ酸変化もグリコシル化数と部位の変化、膜固定の特性の変化および／またはポリペプチドの細胞内部位の変化のようなポリペプチドの翻訳後過程が挿入、除去、でなければ目的天然起源ポリペプチドのリーダー配列への影響により変化をしうる。ポリペプチドのアミノ酸配列変異型、変異部位の位置および変異の性質の設計においては、当業界でよく公知のように、標識法では３２−Ｐ標識ＡＴＰをポリヌクレオチドキナーゼとともに用いてオリゴヌクレオチドを放射標識する。しかしながら、これに限られるものではないが、ビオチン化または酵素標識を含む他の方法もオリゴヌクレオチドを標識するために使用しうる。すなわちまず選択した保持アミノ酸を置換し、次に達成した結果に応じてさらに残基を選択するか、（２）標的残基を削除するか、（３）その部位に隣接して同一または相違する群の残基を挿入するか、または選択１〜３の組合せ、変異型アミノ酸配列構築の主要な変種には変異部位の位置と変異の性質の２種ある。一般に、選択した変異の位置と性質は修飾さるべき性質に依存する。アミノ酸配列での除去は一般に約１から３０残基にわたり、好ましくは約１から１０残基、典型的には隣接的である。除去は目的ポリペプチドと他のポリペプチドとの間の低相同性領域に導入して目的ポリペプチドの活性を修飾しうる。他のポリペプチドにかなりの相同性のある領域での目的ポリペプチドからの削除は目的ポリペプチドの生物学的活性をさらに著名に修飾しうる。順次削除の数は影響されるドメイン、たとえばベタープリーツシートまたはアルファヘリックスにおける目的ポリペプチドの三次元構造を保持するように選択する。アミノ酸配列への挿入は１残基から１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチド長に及ぶアミノ−および／またはカルボキシ−端末融合ならびに単一または多重アミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入（すなわち、目的ポリペプチドの配列内挿入）は一般に約１から１０残基、さらに好ましくは１から５、最も好ましくは１から３残基である。端末挿入の一例はＮ−端末メチオニル残基であり、細菌組み換え細胞培養におけるポリペプチドの直接発現の人工物である。目的ポリペプチドの他の挿入変異型は、免疫原的ポリペプチド、たとえばベータラクタメースまたは大腸菌ｔｒｐ遺伝子座がコードする酵素のような細菌性ポリペプチド、または酵母蛋白質のようなポリペプチドのＮ−またはＣ−端末への融合およびイムノグロブリンコンスタント領域（または他のイムノグロブリン領域）、アルブミンまたはフェリチンのような半減期の長い蛋白質とのＣ端末融合を含むことは１９８９年４月６日公表のＷＯ８９／０２９２２号に記載がある。変異型の他の群はアミノ酸置換変異型である。これらの変異型は目的ポリペプチド内のアミノ酸残基少なくとも１個を除去し、その場所に異なる残基が挿入したものである。置換変異誘発の最大目的部位は目的ポリペプチドの活性部位として確認される部位および種々の種からの相同的ポリペプチド内にあるアミノ酸が側鎖の嵩、電荷および／または親水性の点で実質的に相違する部位を含む。ベータ−８−インテグリンサブユニットのアミノ酸配列変異型をコードするＤＮＡは当業界で知られている種々の方法により製造される。これらの方法は、これに限定するものではないが、天然起源からの分離（天然起源アミノ酸配列変異型の場合）またはオリゴヌクレオチド仲介（または部位指向性）変異誘発による製造、ＰＣＲ変異誘発、および以前に製造した変異型のカセット式変異誘発またはベータ−８インテグリンサブユニットの非変異型版を含む。これらの技術にはベータ−８インテグリンサブユニット核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはベータ −８インテグリンサブユニット核酸に相補的な核酸を利用しうる。本発明では、Ｋｕｎｋｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ．ｏｆ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４巻：３６７〜３８３頁（１９８７年）の部位指向性変異誘発法は殊に好適である。この発明のプロホルモン転換酵素変異体を製造する別法の一つは好ましくは自然のプロホルモン転換酵素をコードする核酸配列を変異することによって構築される。一般に、核酸の特殊な領域または部位は変異誘発の標的になり、これを達成するために用いる一般的方策は部位指向性変異誘発と命名される。本発明で好適な部位指向性変異誘発方法はＫｕｎｋｅｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｏｆ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４巻：３６７〜３８３頁［１９８７年］）の方法である。この発明の変異体を製造する別法はオリゴ−仲介変異誘発によるものである。オリゴヌクレオチド仲介変異誘発はプロホルモン転換酵素１または２をコードするＤＮＡの置換、削除および挿入変異体の製造のために好適な方法である。この技術はＡｄｅｌｍａｎなど、ＤＮＡ、２巻：１８３頁（１９８３年）に記載のように当業界でよく知られている。要するに、プロホルモン転換酵素１または２のＤＮＡはＤＮＡ鋳型に所期変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリド化することによって変更させる。このテンプレートはプロホルモン転換酵素１または２の不変または天然起源ＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはバクテリオファージの単一鎖型である。ハイブリド化の後、ＤＮＡポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、プロホルモン転換酵素１または２の中の選択した変化をコードする鋳型の第二の相補鎖全体を合成する。一般に、少なくとも長さ２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用する。至適オリゴヌクレオチドは１２から１５ヌクレオチドを持ち、変異をコードするヌクレオチドのどちらかの端の鋳型に完全に相補的である。これはオリゴヌクレオチドが単一鎖ＤＮＡ鋳型分子に正常にハイブリド化することを保証する。オリゴヌクレオチドはＣｒｅａなど（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５巻：５７６５頁［１９７８年］）によって記載されているように当業界で公知の技術を用いて容易に合成される。ＰＣＲ変異誘発もアミノ酸変異体を造るのに適当である。ここに記載する以下の論議はＤＮＡに関するが、一方その技術はＲＮＡに適用できる。ＰＣＲ技術はＡｒｎｈｅｉｍ（Ｇｅｎｅｔｉｃ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１２巻：１１５〜１３７頁［１９９０年］），Ｇｉｂｂｓ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ・Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６２巻：１２０２〜１２１４頁［１９９０年］）およびＧｅｌｆａｎｄ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻：１６４３〜１６５１頁［１９９１年］）に概説される操作を示す。ポリペプチド前駆体プロセシングに影響する変異体本発明の一つの側面はプロホルモン転換酵素による前駆体プロセシングを至適化するプレプロ−またはプロ配列をコードする核酸内に修飾を含むポリペプチド因子前駆体変異体である。細胞によってそのプロセシング能、従って細胞から最終的に分泌されるプロホルモン成熟生成物が広範に変化する。このポリペプチド因子前駆体変異体プロセシングの相違点は次のようないくつかの因子の結果かもしれない：（イ）前駆体配列自体がプロホルモン転換酵素の切断部位への接近能に影響する、（ロ）各々の特定パターンは明らかに異なったプロセシング酵素を表す、（ハ）プロホルモン転換酵素の数は限られており、その細胞内の局在（微細環境）または相対的な量による特異性を示す、（ニ）種々の細胞型内では類似の前駆体が修飾され、プロホルモン転換酵素への接近に影響している。本発明において、好適なポリペプチド因子前駆体変異体の一つはプロホルモン転換酵素切断部位を持ち、その切断部位が宿主細胞の構成的経路でプロセシングされるヒトプロインシュリン変異体である。好適なプロインシュリン変異型は以下に概説するような天然起源残基Ｉ型および／またはＩＩ型切断部位の残基置換を含むものである：プロインシュリンのＬｙｓ２９残基をＡｒｇ、ＨｉＳ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、最も好ましくはＡｒｇ、からなる群から選択した残基のいずれかと置換したもの。プロインシュリンのＡｒｇ３１残基をＬｙｓ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、最も好ましくはＬｙｓ、からなる群から選択した残基のいずれかと置換したもの。プロインシュリンのＬｅｕ６２残基をＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＰｒＯ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ，Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、最も好ましくはＬｙｓまたはＡｒｇ、からなる群から選択した残基のいずれかと置換したもの。Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ、１９８７年）の方法による部位指向性変異誘発はポリペプチド前駆体の置換、除去および挿入変異型を作製するための好適な方法である。好適な哺乳類プロホルモン転換酵素１（ｍＰＣ１）前駆体変異体は以下に概説する前駆体のプロホルモン転換酵素切断部位内の天然起源残基に対する残基置換を含む：ｍＰＣ１前駆体のＬｙｓ８０残基をＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、最も好ましくはＡｒｇからなる群から選択した残基のいずれかと置換したもの。好適な哺乳類プロホルモン転換酵素２（ｍＰＣ２）前駆体変異体は以下に説明する前駆体のプロホルモン転換酵素切断部位内の天然起源残基に対する残基置換を含む：ｍＰＣ２前駆体のＬｙｓ７７残基をＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＡＳｎ、最も好ましくはＡｒｇからなる群から選択した残基のいずれかと置換したもの。ｍＰＣ２前駆体のＡｒｇ７８残基をＬｙｓ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、最も好ましくはＡｌａからなる群から選択した残基のいずれかと置換したもの：ｍＰＣ２前駆体のＡｒｇ７９残基をＬｙｓ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、最も好ましくはＬｙｓからなる群から選択した残基のいずれかと置換したもの。クローニングビークルへのＤＮＡ挿入ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを複製可能なベクター内にさらなるクローニング（ＤＮＡ増幅）または発現のために挿入する。所期コードと制御配列を含む適当なベクターの構築には標準的組み換え技術を採用する。分離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、仕立て（ｔａｉｌｏｒｅｄ）、再連結して所期プラスミドを形成する。多数のベクターが入手できるが適当なベクターの選択は次に依存する：（１）それをＤＮＡ増幅に使うかＤＮＡ発現に使うか、（２）ベクターに導入すべきＤＮＡの大きさ、（３）そのベクターで形質転換される宿主細胞。各ベクターはその機能（ＤＮＡ増幅かＤＮＡ発現か）および適用できる宿主細胞に従って種々の成分を含む。ベクター成分は一般に、これに限定するものではないが、次のもの１個またはそれ以上を含む：シグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子１個またはそれ以上、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終止配列。好適な複製可能なベクターはｐＲＫ５またはｐＲＫ７である。シグナル配列成分一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるが、ベクターに挿入されるプロホルモン転換酵素ＤＮＡの一部でもよい。例えば、自然のプロホルモン転換酵素ＤＮＡはポリペプチドのアミノ端末（ＤＮＡの５’一端）にシグナル配列をコードし、このポリペプチドは成熟プロホルモン転換酵素ポリペプチドを形成するためにポリペプチドの翻訳後プロセシングの間に切断される。この発明の範囲には自然のシグナル配列が除去されて、非相同的シグナル配列が置換したポリペプチドを含む。選択すべき非相同的シグナル配列は宿主細胞により認識されて、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。哺乳類細胞の発現では自然のシグナル配列で一般には十分であるが、他の哺乳類シグナル配列も適当でありうる。複製開始点成分発現ベクターは殆ど「シャトル」ベクターである、すなわちそれらは少なくとも一群の生物内で複製できるが、別の生物に移入されて発現することもできる。例えば、ベクターを大腸菌内にクローンし、次に宿主細胞染色体と独立には複製できないのだが、同じベクターを酵母または哺乳類細胞に発現のために移入できる。ＤＮＡは宿主ゲノムへの挿入により増幅しうる。これはバチルス種を宿主として用いて、例えば、ベクター内にバチルスゲノムＤＮＡ内にある配列に相補的ＤＮＡ配列を移入することによって、容易に達成される。このベクターによるバチルスへの移入はゲノムと相同性組み換えおよびプロホルモン転換酵素サブユニットＤＮＡの挿入をもたらす。選択遺伝子成分発現およびクローニングのベクターは選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子も含まねばならい。この遺伝子は形質転換宿主細胞が選択培養培地内で生存または成長するために必要な蛋白質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は培養培地内で生存できない。典型的な選択遺伝子は：（イ）抗生物質または他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンへの抵抗性を与える、（ロ）栄養素要求性の欠陥を補充する、または（ハ）培養培地からは得られない臨界的栄養源を供給する、蛋白質をコードする。選択方式の一例は宿主細胞の成長を停止させるために医薬品を利用する。非相同的遺伝子による形質転換に成功したこれらの細胞は医薬品耐性をもたらす蛋白質を発現し、選択体制下で生存する。有力な選択の例では医薬であるネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎなど、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，、１巻：３２７頁［１９８２年］）、マイコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９巻：１４２２頁［１９８０年］）またはヒグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：４１０〜４１３頁［１９８５年］）を使用する。前記３例は真核細胞制御下に各々適当な医薬品、Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）またはヒグロマイシンに対する耐性を与える細菌遺伝子を採用する。哺乳類細胞に対して選択しうる適当なマーカーの一例はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼのようなプロホルモン転換酵素核酸を取入れる能力のある細胞の確認を可能にするものである。哺乳類細胞形質転換体を選択圧下に置くと、形質転換体のみが独特にマーカーを取入れることによって適応して生存する。選択圧は選択遺伝子と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ双方の増幅が得られるように培地内選択剤濃度が十分に変化する条件下に形質転換体を培養することによって加えられる。増幅は成長に必須な蛋白質の生産に必要な遺伝子が組換え細胞継続的発生の染色体縦列内で反復する過程である。目的ポリペプチドの増加量は増幅されたＤＮＡから合成される。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞はまずＤＨＦＲの競合的拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培養培地内で形質転換体全てを培養して確認する。野生型ＤＨＦＲを採用する時、適当な宿主細胞はＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃi．，ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁［１９８０年］に記載されたように製造し、培養されたＤＨＦＲ活性を欠損するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。形質転換細胞を次に高濃度のメトトレキセートに接触させる。これでＤＨＦＲ遺伝子の多重コピーが合成され、同時に、プロホルモン転換酵素をコードするＤＮＡのような発現ベクターを含む別のＤＮＡの多重コピーも得られる。この増幅技術はそれがなければ適当な筈の、たとえば２９３またはＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１・ＣＨＯ−Ｋ１のような宿主についても、もし、例えばＭｔｘに高度に耐性な変異ＤＨＦＲ遺伝子が採用されれば（欧州特許第１１７０６０号）、内因性ＤＨＦＲが存在しても利用することができる。あるいは、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ蛋白質およびアミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような他の選択しうるマーカーで形質転換または共形質転換した宿主細胞（ことに内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、たとえばカナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８などのアミノグリコシド抗生物質のような選択マーカーのための選択剤を含む培地での細胞成長により選択することができる。米国特許４９６５１９９参照。プロモーター成分発現およびクローニングベクターは通常宿主細胞により認識され、目的ポリペプチドをコードする核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。プロモーターは構造遺伝子にある出発コドンの上流（５’）に（一般に約１００から１０００ｂｐ以内）存在し、それが作用可能的に結合しているプロホルモン転換酵素のような特定の核酸配列の転写と翻訳を制御する非翻訳配列である。このプロモーターは典型的には誘導的（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）と構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）との２種類に分類される。誘導的プロモーターは、たとえば栄養の存否または温度変化のような、培養条件の変化に応答して支配下のＤＮＡからの転写水準の増加を開始するプロモーターである。今日、種々の潜在的な宿主細胞により認識されるプロモーター多数がよく知られている。これらプロモーターを制限酵素消化により原料ＤＮＡからプロモーターを取り出し、分離したプロモーター配列をベクターに挿入することにより目的ポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能的に結合させる。目的ポリペプチドの増幅および／または発現を指向するために自然のプロモーター配列と多数の非相同的プロモーターの双方が用いられうる。しかしながら、一般には自然のプロホルモン転換酵素プロモーターに比べて目的ポリペプチドの転写率が大きく高収率な非相同的プロモーターが好適である。プロモーター配列は真核細胞については公知である。殆ど全ての真核細胞遺伝子は転写が開始する部位から約２５から３０塩基上流に存在するＡＴ豊富領域を持つ。多数の遺伝子の転写開始から７０から８０塩基上流に見られる別の配列はＣＸＣＡＡＴ領域であって、ここにＸはいかなるヌクレオチドでもよい。殆どの真核細胞遺伝子の３’−端末にはコード配列の３’−端末へのポリＡ尾部付加シグナルでありうるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て哺乳類発現ベクターに好都合に挿入される。哺乳類宿主細胞内ベクターからのポリペプチドの転写は、そのプロモーターが宿主細胞系に適合性がある限り、ポリオウイルス、鶏痘ウイルス（英国特許２２１１５０４）、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシパピローマウイルス、ニワトリザルコマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、たとえばアクチンプロモーターまたはイムノグロブリンプロモーターのような非相同的哺乳類プロモーターから、熱ショックプロモーターから、および目的ポリペプチドに常時関与しているプロモーターから、取得されるプロモーターにより制御される。ＳＶ４０ウイルスの早期および後期プロモーターはＳＶ４０ウイルスの複写開始点も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。Ｆｉｅｒｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、２７３巻：１１３頁（１９７８年）、ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９巻：１４２２〜１４２７頁（１９８０）、Ｐａｖｌａｋｉｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８巻：７３９８〜７４０２頁（１９８１年）。ヒトサイトメガロウイルスの即時型早期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として好都合に得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙなど、Ｇｅｎｅ、１８巻：３５５〜３６０頁（１９８２年）。哺乳類宿主内でベクターとしてウシパピローマウイルスを使用してＤＮＡを発現する系は米国特許４４１９４４６に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１９７８号に記載がある。サル細胞内で免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡの発現についてＧｒａｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９５巻：５０３〜５０８頁（１９８２年）、ヘルペスシンプレックスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーター制御下にあるマウス細胞内でのヒトインターフェロンｃＤＮＡの発現についてＲｅｙｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：５９８〜６０１頁（１９８２年）、マウスおよびウサギ培養細胞内でのヒトインターフェロン１遺伝子の発現についてＣａｎａａｎｉとＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻：５１６６〜５１７０頁（１９８２年）およびルースザルコーマウイルスの長末端リピートをプロモーターとして用いるＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚フィブロブラスト、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞内でのバクテリアＣＡＴ配列の発現についてＧｏｒｍａｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻：６７７７〜６７８１頁（１９８２年）も参照。エンハンサーエレメント成分高級真核細胞によるこの発明の目的ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写はベクターにエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増加する。エンハンサーは通常約１０〜３００ｂｐで、転写を増加するプロモーターに作用するＤＮＡのｃｉｓ−作用エレメントである。エンハンサーは相対的に方向および位置に依存性がなく、転写単位から５’（Ｌａｉｍｉｎｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８巻：９９３頁［１９８１年］）および３’（Ｌｕｓｋｙなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、３巻：１１０８頁［１９８３年］）、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉなど、Ｃｅｌｌ、３３巻：７２９頁［１９８３年］）ならびにコード配列それ自体の中（Ｏｓｂｏｒｎｅなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、４巻：１２９３頁［１９８４年］）に見られる。哺乳類遺伝子からはエンハンサー配列多数が知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかしながら、典型的には真核細胞ウイルスからのエンハンサーを用いる。例としては、複製開始点後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製開始点後期側のポリオエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核細胞プロモーターの活性化用エンハンサーエレメントについてＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照。エンハンサーは所期ＤＮＡの５’か３’位でベクターにスプライシングしうるが、プロモーターから５’部位に存在するのが好ましい。転写終止成分真核細胞宿主細胞（昆虫、植物、動物、ヒトまたは哺乳類細胞）内で使用される発現ベクターには転写の終止のためおよびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列も含める。この配列は通常は真核細胞またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および、時には３’非翻訳領域から得られる。これら領域はプロホルモン転換酵素をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチド分節を含む。３’非翻訳領域は転写終止部位も含む。前記成分１種またはそれ以上を含み、および所期コードおよび制御配列を含む適当なベクターの構築には標準的連結反応技術を採用する。分離したプラスミドまたは核酸断片を切断し、仕立て、所期の型に再連結して必要なプラスミドを形成する。哺乳類細胞内で目的ポリペプチドをコードするＤＮＡの一時的発現をする発現ベクターはこの発明の実施に殊に重要である。一般に、一時的発現は宿主細胞が発現ベクターのコピー多数を蓄積するように宿主細胞内で効率的に複写でき、それで、発現ベクターにコードされている所期ポリペプチドを高水準で合成するような発現ベクターの使用を包含する。適当な発現ベクターと宿主細胞とからなる一時的発現系にはクローンしたＤＮＡがコードするポリペプチドの便利でポジティブな確認ならびに該ポリペプチドの持つ所期生物学的または生理学的性質の迅速な検索を考慮に入れる。このように一時的発現系は本発明で所期作用を持つポリペプチド類似体および変異型を確認する目的のためには殊に有用である。組み換え哺乳類細胞培養物内でこの発明のプロホルモン転換酵素および他のポリペプチドの合成に適応させるために適当な他の方法、ベクターおよび宿主細胞はＧｅｔｈｉｎｇなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９３巻：６２０〜６２５頁［１９８１年］、Ｍａｎｔｅｉなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８１巻：４０〜４６頁［１９７９年］、Ｌｅｖｉｎｓｏｎなど、欧州特許第１１７０６０号および欧州特許第１１７０５８号に記載がある。プロホルモン転換酵素サブユニットの哺乳類細胞培養発現のために殊に有用なプラスミドはｐＲＫ５（欧州特許公開３０７２４７）またはｐＳＶＩ６Ｂである。宿主細胞の選択と形質転換本発明のベクターのクローニングと発現とのために適当な宿主細胞は前記のように高級真核細胞である。グリコシル化ポリペプチドの発現のために適当な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。この宿主細胞は複雑なプロセシングとグリコシル化作用が可能である。原理的に、脊椎動物または無脊椎動物からでも高級真核細胞培養は実施可能である。無脊椎動物の例は植物および昆虫細胞である。しかしながら、もっとも注目すべきは脊椎動物細胞であり、培養物内での脊椎動物細胞の増殖（組織培養）は最近では通常の操作になっている［組織培養（Ｔｉｓｓｕｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ、Ｋｒｕｓｅ・ａｎｄ・Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３年）］。有用な哺乳類宿主細胞の例はＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１６５１）で形質転換したサル腎臓ＣＶ１系、ヒト胚腎臓系（懸濁培養中での成長のためにクローニングした２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍなど、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁［１９７７年］）、幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁［１９８０年］）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１［１９８０年］）、サル腎臓細胞（ＣＶｌ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ−１５８７）、ヒト脳腫瘍細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺臓細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ・Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒなど、Ａｎａｌｓ−Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３巻：４４〜６８頁［１９８２年］）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞およびヒトヘパトマ細胞系（Ｈｅｐ・Ｇ２）である。好適な宿主細胞はヒト胚腎臓２９３およびチャイニーズハムスター卵巣細胞である。宿主細胞は移入され、好ましくは前記の発現またはこの発明のクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを導入するために適当に修正した通常の栄養培地内で培養し、形質転換体を選択するか所期配列をコードする遺伝子を増幅する。この発明の目的のポリペプチドをコードする核酸を含む細胞は相同的組み換えまたは当業界で現在使用されているようにして目的ポリペプチドをコードする核酸をすでに含む細胞内に導入された制御エレメントを利用する組み換え生産法により生産される。例えば、強力なプロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサーまたは外因性転写調節エレメントを意図する宿主細胞のゲノム内に所期プロホルモン転換酵素をコードする核酸の転写に影響を与えるに十分な近さと方向とで挿入する。制御エレメントはこの発明のプロホルモン転換酵素をコードするものではないが宿主細胞ゲノム内に存在するプロホルモン転換酵素の核酸に影響する。次にこの発明のプロホルモン転換酵素を生産する細胞または所望なら増加または減少した発現を目指してスクリーニングする。特定の細胞型を形質転換することが知られている許容できるベクターを用いて哺乳類細胞を安定的に形質転換しうる。本発明で２９３ヒト腎臓細胞とともに使用する好適なベクターはｐＲＫ５である。例えば哺乳類細胞をプロホルモン転換酵素を生産するように形質転換し、これらの細胞を次にプロホルモンを発現するように形質転換することによって正常にプロセシングしたホルモンを生産するために使用する。好適なプロホルモンの中にはプロセシングした時にポリペプチド鎖２個またはそれ以上を含むホルモンをもたらすものがある。好適な２鎖ホルモンはリラキシンとインシュリンである。宿主細胞の培養この発明のポリペプチドを生産するために使用する原核細胞はＳａｍｂｒｏｏｋなど、前出、が一般的に記載したようにして適当な培地中で培養する。この発明のポリペプチドを生産するために使用する哺乳類宿主細胞は種々の培地内で培養しうる。商業的に入手しうるＨａｍ’ｓＦ１０（シグマ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）およびダルベッコの修正イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、シグマ）のような培地は宿主細胞を培養するために適当である。加えるに、ＨａｍとＷａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、５８巻：４４頁（１９７９年）、ＢａｒｎｅｓとＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４７６７７０４号、同４６５７８６６号、同４９２７７６２号、同４５６０６５５号、国際公開９０／０３４３０号、同８７／００１９５号、米国特許Ｒｅ３０９８５号、１９９２年６月１６日発行の米国特許第５１２２４６９号に記載された培地はどれも宿主細胞のための培養培地として使用しうる。これら培地はどれも、要すればホルモンおよび／または他の成長因子（インシュリン、トランスフェリンまたは皮下成長因子のような）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよび燐酸塩のような）、緩衝液（ＨＥＰＥＳのような）、ヌクレオシド（アデノシンやチミジンのような）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）医薬のような）、痕跡エレメント（最終濃度が通常マイクロモルの範囲にある無機化合物として定義される）およびグルコースまたは均等なエネルギー源を添加しうる。当業者に公知の必要な他の添加剤も適当な濃度で含めてもよい。温度、ｐＨなどのような培養条件は発現用に選択した宿主細胞で以前に使用されたものであって、当業者には明白であろう。前記明細書の記載は当業者が本発明を実施することを可能にするために十分であると考える。ここに明示し、記載したものに加えて、本発明の種々の修飾は当業者には先行記載から明白であり、添付請求項の範囲内にある。以下の実施例は本発明実施のために現在知られている最良の態様を例示することを意図するが、本発明がこれら実施例に限定されると考えるべきではない。実施例１ネズミプロホルモン転換酵素１型（ｍＰＣ１）と２型（ｍＰＣ２）のクローニングマウス脳下垂体腫瘍細胞系、ＡｔＴ２０、をプロホルモン転換酵素ｍＲＮＡ源候補として使用した。ＡｔＴ２０細胞系はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。細胞を１０％ウシ胎仔血清添加ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。全ＲＮＡを全面細胞から調製し（Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８３年）、全ＲＮＡ５ｕｇをモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）４００Ｕ、ＧｅｎｅＡｍｐ１０×反応緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）２．５ｍｇ、ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０Ｕ、ｄＮＴＰ４００ｍＭ、オリゴｄＴ（Ｕｎｉｔｅｄ・Ｓｔａｔｅｓ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）０．５ｍｇ、１．４ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ−ＤＴＴと全容２５ｕＬで３７ ℃で１時間インキュベーションしてｃＤＮＡを調製した。候補プロホルモン転換酵素標的の縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる増幅を１０Ｘ反応緩衝液７．５ｍＬプラスＴａｑＤＮＡポリメラーゼ５Ｕを含む前進および逆行ＭＯＰＡＣ・ＰＣＲプライマー各５０ｐＭ、０．０２ｍＭ−ｄＮＴＰの添加により同一の反応チューブ内で実施した。プライマー配列はＳｍｅｅｋｅｎｓなど（Ｔｈｅ・Ｊｏｕｒｎａｌ・ｏｆ・Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５巻：２９９７〜３０００頁［１９９０年］）が記載したようにＫＥＸ２の保存アスパラギン酸およびセリン触媒残基、ＰＣ２、プロプロテアーゼＢおよびサブチリシンＢＰＮに基づく。使用した前進プライマーは（配列番号５）であり、逆行プライマーは（配列番号６）であった。デナチュレーション（１分間、９４℃）、プライマーアニーリング（最初の５サイクルは２分間、４８℃、その後２分間５５℃）、およびプライマー延長（３分間、７２℃）から各々構成される縮重ＰＣＲ３０サイクルを行った。ＰＣＲ反応からの生産物を２．５％ＮｕＳｉｅｖｅ−ＧＴＧ低温融解アガロースゲル（ＦＭＣ）中で電気泳動した。約６００ｂｐの分離したバンドを検査し、ｐＵＣ１１８にサブクローニングしてＤＮＡ配列分析を行った。部分的ｍＰＣ１とｍＰＣ２配列がこの操作で得られた。ｃＤＮＡプールを候補ＰＣ酵素全長配列の鋳型源として調製した（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９８８年；Ｉｎｎｉｓ、１９９０年）。マウスＡｔＴ２０全ＲＮＡ（５ｍｇ）を６５℃に３分間加熱し、直ちに氷冷した。変性ＲＮＡを逆転写酵素２００Ｕとともに５ＸＨ−ＲＴ緩衝液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）４ｍＬ、ＤＴＴ１０ｍＭ、ｄＮＴＰ１０ｍＭ、ＲＮａｓｉｎ２０Ｕ、Ｒ₀Ｒ₁−ｄ（Ｔ）₁₇アダプタープライマー（配列番号７）２．５ｐＭを含む第一鎖ｃＤＮＡ合成反応に添加して全容２０ｕＬとした。混合物を３７℃で１時間インキュベーションし、トリス／ＥＤＴＡで１ｍＬまで希釈した。ｃＤＮＡプール適量（５〜１０ｕＬ）を遺伝子−特異性ＰＣＲプライマーの組合せ（ｍＰＣ１について、それらは３’ＲＡＣＥプライマー（配列番号８）および５’ＲＡＣＥプライマー（配列番号９）および内部アダプターＲ₁ＰＣＲプライマー（配列番号１０）である）を用いるＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ端末迅速増幅、Ｆｒｏｈｍａｎ、１９８８年；Ｉｎｎｉｓ、１９９０年）による未知な３’および５’領域の増幅に使用した。ｍＰＣ１およびｍＰＣ２ｃＤＮＡの最終全長構築は組み換えＰＣＲ（Ｉｎｎｉｓ、１９９０年）の技術によって行った。ＰＣＲクローニング反応は全てＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ・Ｅｎｇｌａｎｄ・Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて実施して鋳型増幅の間のミスマッチ塩基導入を削減した。全ｍＰＣクローンはＳｅｑｕｅｎａｓｅ２．０キット（ＵＳＢ）により配列決定し、ＰＵＣ１１８（Ｖｉｅｉｒａなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３頁［１９８７年］）にクローンした。実施例２移入細胞内でのリラキシン生産リラキシンおよびプロホルモン転換酵素発現ベクターの構築プレプロリラキシン遺伝子ｐＣＩＳ．ＲｘのｃＤＮＡクローンはヒトプレプロリラキシンをコードする配列を提供した。ｐＣＩＳ哺乳類発現ベクターはＧｏｒｍａｎ、ＤＮＡ・Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ、２巻：３〜１０頁（１９９０年）に記載がある。Ｈ２プレプロリラキシンをコードするｃＤＮＡはＨｕｄｓｏｎ，Ｐ．など、Ｔｈｅ−ＥＭＢＯ・Ｊｏｕｒｎａｌ、３巻：２３３３〜２３３９頁（１９８４年）に記載されているように完全Ｈｅｐａ・ＩＩ消化に続いてＨｉｎｆ・Ｉ部分消化を用いてクローニングベクターから得た。ｐＣＩＳ．Ｒｘを制限エンドヌクレアーゼＸＢＡ・ＩおよびＥＣＯ・ＲＩで消化してプレプロリラキシンをコードする領域を得た。ｐＲＫ７を制限エンドヌクレアーゼＸＢＡ・ＩとＥＣＯ・ＲＩとで消化した。得られたＸＢＡ・Ｉ／ＥＣＯ−ＲＩヒトプレプロリラキシンをコードする領域をＸＢＡ・Ｉ／ＥＣＯ・ＲＩで消化したｐＲＫ７と連結して最終プレプロリラキシン哺乳類発現ベクター、ｐＲＫ．Ｒｘを得た。ｍＰＣ１遺伝子のｃＤＮＡクローン、実施例１のＰＵＣ１１８．ｍＰＣ１、はプラスミド構築のためのｍＰＣ１をコードする配列を与え、移入哺乳類細胞内のｍＰＣ１発現を指向した。ＰＵＣ１１８．ｍＰＣ１を制限エンドヌクレアーゼＳＡＣ・ＩとＥＣＯ・ＲＩとで消化した。ｐＲＫ７を制限エンドヌクレアーゼＳＡＣ・ＩとＥＣＯ・ＲＩとで消化した。得られたＳＡＣ・Ｉ／ＥＣＯ・ＲＩｍＰＣ１をコードする領域をＳＡＣ・Ｉ／ＥＣＯ・ＲＩ消化ｐＲＫ７に連結して最終ｍＰＣ１哺乳類発現ベクター、ｐＲＫ．ｍＰＣ１を得た。ｍＰＣ２遺伝子のｃＤＮＡクローン、実施例１のＰＵＣ１１８．ｍＰＣ２、はプラスミド構築のためのｍＰＣ２をコードする配列を与え、移入哺乳類細胞内のｍＰＣ２発現を指向した。ＰＵＣ１１８．ｍＰＣ２を制限エンドヌクレアーゼＸＢＡ・ＩとＥＣＯ・ＲＩとで消化した。ｐＲＫ７を制限エンドヌクレアーゼＸＢＡ・ＩとＥＣＯ・ＲＩとで消化した。得られたＸＢＡ・Ｉ／ＥＣＯ・ＲＩｍＰＣ２をコードする領域をＸＢＡ・Ｉ／ＥＣＯ・ＲＩ消化ｐＲＫ７に連結して最終ｍＰＣ２哺乳類発現ベクター、ｐＲＫ．ｍＰＣ２を得た。ＫＥＸ２遺伝子のｃＤＮＡクローン、ｐＹＥｐ２４．ｐＪ２８（Ｊｕｌｉｕｓなど、Ｃｅｌｌｓ、３７巻：１０７５頁［１９８４年］）が最終ＫＥＸ２哺乳類発現プラスミドを構築するためのＫＥＸ２遺伝子をコードする配列を提供した。ベクターｐＹＥｐ２４．ｐＪ２８を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ・ＲＩで消化し、アガロースゲル上で泳動させた。コード領域を含む３．３ｋｂ断片を分離した。ｐＲＫ５を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ・ＲＩで消化し、次に細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理した。Ｅｃｏ・ＲＩ消化ＢＡＰ処理ｐＲＫ５をアガロースゲル上で泳動させ、４．７ｋｂ断片を分離した。ｐＹＥｐ２４．ｐＪ２８の３．３ｋｂ断片をｐＲＫ５の４．７ｋｂ断片に連結してベクターｐＲＫ．ＫＥＸ．ＲＩを形成した。ｐＲＫ．ＫＥＸ．ＲＩを制限ヌクレアーゼＤｄｅ・Ｉで消化し、次にＫｌｅｎｏｗで処理し、さらに制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ・ＩＩＩで消化した。Ｄｄｅ・Ｉ／Ｈｉｎｄ・ＩＩＩ処理ｐＲＫ．ＫＥＸ．ＲＩをポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、４２５ｂｐ断片を分離した。ｐＲＫ５を制限エンドヌクレアーゼＳｍａ・Ｉ／Ｈｉｎｄ・ＩＩＩで消化し、次にＢＡＰで処理し、アガロースゲル上で泳動させ、４．７ｋｂ断片を分離した。ｐＲＫ５の４．７ｋｂ断片をｐＲＫ．ＫＥＸ．ＲＩの４２５ｂｐ断片に連結してベクターｐＲＫ５．５’ＫＥＸを形成した。ｐＲＫ５．５’ＫＥＸをＨｉｎｄ・ＩＩＩで消化し、ＢＡＰで処理した。ＫＥＸ２の３’端末をコードする２ｋｂのＨｉｎｄ・ＩＩＩ断片はｐＹＥｐ２４．ｐＪ２８に由来するが、これをＨｉｎｄ・１１１／ＢＡＰ処理ベクターｐＲＫ５．５’ＫＥＸに連結して最終ＫＥＸ哺乳類発現ベクターｐＲＫ．ＫＥＸ２を形成し、これは移入哺乳類細胞内のＫＥＸ２の発現を指向する。ヒト腎臓２９３細胞内リラキシンの一時的移入ヒト腎臓２９３細胞にＧｏｒｍａｎの方法（Ｇｏｒｍａｎ）ＤＮＡ・Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ．、２巻：３〜１０頁［１９９０年］）による一時的移入を行った。プロリラキシンｃＤＮＡを含む発現ベクター、ｐＲＫ．Ｒｘ（１０ｕｇ）を２９３細胞のみ（１００ｍｍシャーレ）、またはｍＰＣ１（ｐＲＫ．ｍＰＣ１）、ｍＰＣ２（ｐＲＫ．ｍＰＣ２）またはｋｅｘ２（ｐＲＫ．ｋｅｘ２）ｃＤＮＡのための発現ベクター等量とともに移入した。ヒト腎臓２９３細胞への安定なリラキシン移入哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的側面はＡｘｅｌによって１９８３年８月１６日発行の米国特許４３９９２１６に開示されている。本発明の哺乳類細胞の安定な形質転換のための好適な方法はＳａｍｂｒｏｏｋなど（前出）１６．３０〜１６．３７章に記載の燐酸カルシウム沈殿法である。好適な宿主細胞はヒト胚腎臓系（２９３）またはチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）である。好適な培地は抗生物質ネオマイシンまたはゲネティシンを含む。プロセシングしたリラキシンの特性免疫親和性精製移入後、培養培地を去り、３５Ｓ−システインと３５Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）各２００ｕＣｉを含むＤＭＥＭ（システインとメチオニン不含）２ｍＬで置換した。３時間インキュベーション後、上清液を集め、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞を溶菌緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、５０ｍＭ−トリス−塩酸、ｐＨ８．０）で溶菌した。上清液と全細胞溶菌液の両方を免疫沈降法により分析した。移入操作からの上清液（５００ｕＬ）と全細胞溶菌液（２５０ｕＬ）とを抗リラキシンモノクローナル抗体（ＭＡｂＲｌｘ６）５ｍｇと混合し、４℃で穏やかに動揺させながら一夜インキュベーションした。抗体−抗原複合体をプロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）上に４℃で１時間吸着させた。ビーズを簡単に遠心分離し、溶菌緩衝液で３回穏やかに洗浄した。液体を吸引除去し、ビーズに２Ｘトリシン／ＳＤＳサンプル緩衝液（２５％グリセリン、８％ＳＤＳ、１．５％サーバブルーＧ、０．９Ｍ−トリス・塩酸、ｐＨ８．４５）５０ｍＬを添加した。サンプルを８５℃に１０分間加熱し、１０ｕＬ量をプレーキャストトリシン／ＳＤＳ１０〜２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）につけた。電気泳動後、ゲルを固定し、Ａｍｐｌｉｇｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に浸漬し、乾燥し、−８０℃でＸ線フィルムに露光した。プロリラキシン発現プラスミド、ｐＲＫ．Ｒｘ、の２９３細胞への移入に続いて、細胞溶菌物または細胞上清液から前駆体プロリラキシンのみが免疫沈降された。プロリラキシンは１０〜２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル上で約６．０ＫＤにバンドを示した。２９３細胞にプロリラキシン発現プラスミド、ｐＲＫ．ＲｘおよびマウスｍＰＣ２ｃＤＮＡの発現を指向するｐＲＫ．ｍＰＣ２とを共移入すると前駆体プロリラキシンのみが得られ、ｍＰＣ２はこの系における自然のプロリラキシンのプロセシングには含まれないことを指摘する。プロリラキシンとｍＰＣ１ｃＤＮＡまたはプロリラキシンとＫＥＸ２との共発現では１０〜２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル上に約３．０ＫＤのバンドを示す真正な成熟リラキシンを与えた。逆相ＨＰＬＣと質量スペクトル分析細胞が分泌する蛋白質の分取分析のために１０ｃｍシャーレ３個上の融合細胞を基質、プロＨ２リラキシン単独、またはプロＨ２リラキシン（野生型または変異体）とプロセシング酵素ｃＤＮＡとの組合せで移入した。上清液全部で３０ｕＬを各移入物から集め、免疫親和的精製のためにセファロース−ＣＬ４Ｂに結合させた抗リラキシンモノクローナル抗体の小カラム（３００ｕＬ）上に２回通した。カラムをＰＢＳで洗浄し、非特異的に吸着した物質を１Ｍ−ＮａＣｌ／ＰＢＳ洗浄液、続いて２Ｍ−グアニジン−塩酸の１０ｍＭ−トリス塩酸ｐＨ７．５溶液で除去した。抗体結合蛋白質を４Ｍ−グアニジン−塩酸／トリス−塩酸少量で溶出させた。免疫親和的カラムの溶出液をさらに精製することなしに２×１００ｍｍＲＰ− Ｃ₄逆相ＨＰＬＣカラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ）に付した。０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル２０％（０〜５分）から６０％（５〜４５分）の直線勾配を適用して物質を溶出した。流速は０．５ｍＬ／分に維持し、カラム溶出口で２１４ｎｍの吸光度を監視した。吸光度の主ピークからの溶出液を集めて質量スペクトルによる分析を行った（図８）。無傷のプロリラキシンとプロセシングされたリラキシンとの分子量をエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析により測定した。１％酢酸含有アセトニトリル水（５０／５０、ｖ／ｖ）中の蛋白質マイクロモル溶液（１〜１０ｐｍｏ１／ｕＬ）を１．５ｍＬ／分でＳＣＩＥＸ・ＡＰＩ・ＩＩＩ質量スペクトロメーターに注入した。四重極質量スペクトロメーターはイオンスプレー結合噴霧器（ＳＣＩＥＸ、Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ、Ｃａｎａｄａ）を４６００Ｖ、インターフェース板６００Ｖ、電圧１００〜１２０Ｖで運転した。データは３２秒間に６００〜２２００ｕを走査する四重極で０．１Ｖ毎に集めた。各々ＡおよびＢ鎖の分子量は高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量スペクトル術により、Ｓｔｕｌｔｓなど（Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍａｓｓ−Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１９巻：６５５〜６６４頁［１９９１年］）が記載したオンプローブレダクション（ｏｎ・ｐｒｏｂｅ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）法に従って測定した。ｐＲＫ．Ｒｘ単独の移入は主産物としてプロリラキシンの分泌をもたらした。これはＨＰＬＣ溶出時間２９分を示した。ｐＲＫ．ＲｘとｐＲＫ．ｍＰＣ１またはｐＲＫ．ＫＥＸ２との共移入はＨＰＬＣ保持時間１７分の主産物を作成した。この保持時間はヒト黄体から精製した標準成熟リラキシンで観察されたものと極めて類似していた。カラムから溶出した共移入の主ピークを集めて質量スペクトル分析を行った。エレクトロスプレー測定は標準成熟リラキシンと一致する質量値を与えた。これはさらに還元された５９６３Ｄａ種の高速原子衝撃分析により確認された。還元リラキシンのＡおよびＢ鎖の各予想値に正確に対応する２６５７と３３１３質量単位のピーク２個が得られた。５９６３Ｄａリラキシンからの物質を気相セクエンサーにより数回Ｎ−端ペプチド配列決定した。そのＮ−端末を閉鎖するピログルタミル残基のために予期されたようにＡ鎖からは配列が得られなかった。Ｂ鎖からは全てのアミノ酸が検出され、ペプチド配列はＢ鎖に先行する２４アミノ酸シグナル配列の正確な除去に一致していた。加えるに、成熟Ｂ鎖はＣ端末セリン残基で終止しており、２９３細胞に存在するカルボキシペプチダーゼ活性がＢ鎖／Ｃペプチド結合部位での切断後に残存する塩基性残基、ＫＲ、を除去していたことを示唆している。実施例３ヒトリラキシン変異体およびＰＣ特異性プロホルモン転換酵素の基質特異性をヒトプロリラキシン変異体のプロセシングにより例示する。プロセシングに必要であると推定された塩基性残基をアラニンに置換した一連の変異プロリラキシンｃＤＮＡを製造した。二塩基性残基ＫＲはＢ鎖／Ｃ−ペプチド結合部位に存在し、いずれもプロセシングに必要である。これら塩基性アミノ酸のいずれかをアラニンで置換する時、プロセシングされていないプロリラキシンが２９３細胞から分泌される。Ｃ−ペプチド／Ａ鎖結合部位での部分的切断からもたらされたであろう部分的にプロセシングされた前駆体を示唆する中間体蛋白質の指標は存在しない。プロリラキシンの部位指向性変異誘発部位指向性変異誘発をリラキシン哺乳類発現ベクター、ｐＲＫ．Ｒｘ、について少し修正したＫｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ、１９８７年）の方法により実行した。形質転換受容能のある（ＣａＣｌ₂）大腸菌ＣＪ２３６株をウラシル含有鋳型ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ＤＮＡおよびＴ₄酵素合成のために細菌性宿主として使用した。オリコヌクレオチド延長反応を１０ｕＬ容中、１５分間の初期時間帯では室温で、続いて３７℃で７５分間のインキュベーションを実行した。反応をトリス／ＥＤＴＡ緩衝液を最終容積５０ｕＬまで添加して停止した。１０ｕＬづつを使用して大腸菌ＭＭ２９９のｕｎｇ⁺株を形質転換してウラシル含有野生型鋳型ＤＮＡについて選択した。この株は鎖成長停止法（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ・ｋｉｔ、Ｕｎｉｔｅｄ・Ｓｔａｔｅｓ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）による配列分析に使用するために単鎖ＤＮＡの生産にも使用した。プロホルモン転換酵素基質特異性の確認塩基性残基ＫおよびＲのアラニン変異プロリラキシンを構築してネズミプロホルモン転換酵素１の特異性を確認した。図１１。変異体：１．４、２．４、３．２、４．３、７．２および８．６についてネズミプロホルモン転換酵素１の基質特異性を検査した。変異リラキシン（Ｒｘ）はプロホルモン転換酵素切断部位で次の配列を持つ。Ｃ−鎖／Ａ−鎖結合部位変異体自然ＲｘＲｘ１．４Ｒｘ２．４Ｒｘ３．２Ｒｘ４．３Ｂ−鎖／Ｃ−鎖結合部位変異体自然ＲｘＲｘ７．２Ｒｘ８．６図９はこれら変異体のネズミプロホルモン転換酵素１プロセシングを図示する。変異体１．４および２．４は野生型と同じにプロセッシングされ、変異体３．２は部分的にプロセッシングされる。変異体４．３はプロセッシングされているとは見えず、変異体７．２と８．６はプロセッシングされていない。変異体７．２と８．６が変異を受けている位置のどちらかでＢ−Ｃ鎖結合部位が阻害されるとプロリラキシン切断は阻止される。Ｃ−Ａ鎖は多分Ｂ−Ｃ結合部位が切断されるまではネズミプロホルモン転換酵素１による切断を受けない。この結果はこの上流部位の切断が最初に来る順次切断機構を支持する。Ｂ−Ｃ鎖部位は両塩基性残基を要求する。変異体３．２および４．３は、塩基性残基は必要であるが（７．２および８．６に見られるように）、それでは十分ではないことを指摘する。変異体３．２および４．３はともに無傷のＫＲ部位を持っており、変異体３．２は切断されず、ならびに野生型および変異体４．３もネズミプロホルモン転換酵素１では切断されない。ネズミプロホルモン転換酵素２は野生型プロリラキシンを切断しない。ネズミプロホルモン転換酵素２は例外的にいくらかプロセッシングする４．３を除き、いずれのプロリラキシン変異体も切断しない。これはネズミプロホルモン転換酵素１とネズミプロホルモン転換酵素２との切断特異性には二塩基性残基以外の配列で規定される差があることを示唆する。非基質蛋白質は適当な変異誘発により基質にすることができる。変異体７．２はネズミプロホルモン転換酵素２では切断されない。プロリラキシンにおける上流部位の変異は下流の切断を阻止するのでプロリラキシンに順次進行性切断があることを例示する。実施例４プロインシュリン変異体の構築および移入２９３細胞内でのインシュリン発現ヒトプレプロインシュリン遺伝子のｃＤＮＡクローンであるｐＳＶＥＨＩＧＤＨＦＲは１９９２年２月１８日に発行された豪州特許６１６２０１に記載されており、最終哺乳類発現ベクターのためのヒトプレプロインスリン遺伝子のコード配列を与えた。５〜１０ｕＬ量のｐＳＶＥＨＩＧＤＨＦＲを遺伝子特異性ＰＣＲプライマーの組合せ：すなわち５’−端末には（配列番号１８、５’から３’への配列）と３’−端末には（配列番号１９、５’から３’への配列）とを用いるＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ端末の迅速増幅、Ｆｒｏｈｍａｎ、１９８８年；Ｉｎｎｉｓ、１９９０年）によるコード領域の増幅に使用した。すべてのＰＣＲクローニング反応は鋳型増幅の間にミスマッチ塩基の導入を減少するためＶｅｎｔ・ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ・Ｅｎｇｌａｎｄ・Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して実施した。プロインスリンクローンをＵＳＢ製Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ・２．０キットで配列決定し、制限消化ｐＲＫ５にクローンした。最終プレプロインスリン哺乳類ベクターはｐＲＫ．ｐｒｏｉｎｓである。非天然起源プロホルモン転換酵素切断部位を持つヒトプロインスリン変異体をヒトプロインスリンｃＤＮＡ、ｐＲＫ．ｐｒｏｉｎｓで天然起源のＢ鎖／Ｃ−ペプチド結合部位（ＫＴＲＲ）（配列番号２０）および／またはＡ−鎖／Ｃ−ペプチド結合部位（ＬＱＫＲ）（配列番号２１）にある塩基性切断部位を部位指向性変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、１９８７年）によって変異させることにより構築する。次のプロインスリン変異型を構築した：ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ（配列番号２２）、ｐｒｏｉｎｓ．ＲＱＫＲ．ＩＩｐ（配列番号２３）、ｐｒｏｉｎｓ．ＫＴＫＲ．Ｉｐ（配列番号２４）。下記の二重変異型プロインシュリンを構築した：ｐｒｏｉｎｓ．ＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ（配列番号２３）およびｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ（配列番号２２）／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ（配列番号２３）。ＩｐはＩ型酵素の切断部位であり、ＩＩｐはＩＩ型酵素の切断部位である。プロインシュリン変異体構築に使用したプライマーは次の通りであった。ＰＲＯＩＮＳ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ（配列番号２５）ＰＲＯＩＮＳ．ＲＱＫＲ．ＩＩｐ（配列番号２６）ＰＲＯＩＮＳ．ＫＴＫＲ．Ｉｐ（配列番号２７）これらの配列は５’→３’の方向で記載してある。二重変異体プロインシュリンｐｒｏｉｎｓ．ＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ（配列番号２３）は自然のヒトプロインシュリンＩ型酵素切断部位にある残基Ａｒｇ３１をＬｙｓ３１に変更し、プロインシュリンのＩＩ型酵素切断部位にある残基Ｌｅｕ６２をＡｒｇ６２に変更している。二重体変異プロインシュリンｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ（配列番号２２）／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ（配列番号２３）は自然のヒトプロインシュリンＩ型酵素切断部位にあるＬｙｓ２９をＡｒｇ２９に、Ｉ型酵素切断部位にある残基Ａｒｇ３１をＬｙｓ３１に、そしてＩＩ型酵素切断部位にあるプロインスリン残基Ｌｅｕ６２をＡｒｇ６２に変更している。変異体はすべてＵＳＢ製Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２．０キットでプライマー領域を通してスクリーニングした。全プロインスリン変異体および天然起源プロインシュリンからのＤＮＡをＣｓＣｌで発色し、Ｇｏｒｍａｎ（Ｇｏｒｍａｎ、ＤＮＡ・Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ、２巻：３〜１０［１９９０年］）の方法で２９３細胞に一時的移入した。翌日、細胞を³⁵Ｓ−Ｍｅｔと³⁵Ｓ−Ｃｙｓ（２００ｕＣｉ／ｍＬ）とで４〜６時間かけて標識した。免疫親和性精製移入からの上清液（５００ｕＬ）または全細胞溶菌液（５００ｕＬ）を４ｕＬのＢｉｏｍｅｄｉａ製Ｃｏｎｃ．Ｇｕｉｎｅａ−Ｐｉｇ抗ヒトインシュリンロット１０１と混合し、穏やかに揺り混ぜつつ４℃で一夜インキュベーションした。Ｐｒｏｔｅｉｎ・Ａ・Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＣＬ４Ｂ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、１７−０９６３−０３）５ｍＬをＮＰ４０溶菌緩衝液５ｍＬで洗浄することによってＰｒｏｔｅｉｎ・Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを調製した。洗浄操作は４回反復した。最終洗浄液を吸引後、緩衝液十分量を添加して２５％ｖ／ｖＰｒｏｔｅｉｎ・Ａ・Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−Ｃ１４Ｂスラリーを得た。２５％プロテインＡスラリー１００ｕＬをＢｉｏｍｅｄｉａ製Ｃｏｎｃ．Ｇｕｉｎｅａ・Ｐｉｇ抗ヒトインシュリンロット１０１を含む一夜処理サンプル各々に添加した。揺り動かしながら４℃で１時間インキュベーションする。１５分間遠心分離し、上清液を吸引除去し、ＮＰ４０溶菌緩衝液で３回洗浄する。緩衝液を吸引する。２Ｘトリシン −ＳＤＳ標本緩衝液３０ｕＬを各サンプルチューブに加える。１０分間１００℃ に加熱し、プレキャスト・トリシン／ＳＤＳ１６％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）に１０ｕＬ量をつける。電気泳動に続いて、ゲルを固定し、Ａｍｐｌｉｇｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に浸漬し、乾燥し、−８０℃でＸ線フィルムを露光した。ゲルの解析結果自然のヒトプロインシュリンＤＮＡを用いる移入は目立つ蛋白質バンドを６．５ＫＤおよび淡いバンドを３．４ＫＤにもたらした。プロインシュリン変異型ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ（配列番号２２）／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ（配列番号２３）のＤＮＡを用いる移入は蛋白質バンドを３．４ＫＤおよび２．３５ＫＤにもたらしたが、標準インシュリンＢおよびＡ鎖は各々１６％トリシン／ＳＤＳポリアクリルアミド勾配ゲル（ＮＯＶＥＸ）上ではここに泳動する。プロインスリン変異体ｐｒｏｉｎｓ．ＲＱＫＲ．ＩＩｐ（配列番号２３）または二重変異体ｐｒｏｉｎｓ．ＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ（配列番号２３）のＤＮＡを用いた移入はＢ鎖／Ｃ−ペプチド中間体バンドを表す約６．０ＫＤのバンド１個とインシュリンＡ鎖を表す２．３５ＫＤのバンド１個との計２個のバンドをもたらした。プロインスリン変異型ｐｒｏｉｎｓ．Ｉｐ（配列番号２２）のＤＮＡを用いた移入はＢ鎖／Ｃ−ペプチド中間体バンドより少し短距離移動するＣ−ペプチド／Ａ鎖中間体バンドを表すバンド１個およびインシュリンＢ鎖を表す３．４ＫＤのバンド１個のバンド２個をもたらした。プロインスリン変異体ｐｒｏｉｎｓ．ＫＴＫＲ．Ｉｐ（配列番号２４）のＤＮＡを用いた移入は６．５ＫＤに目立つバンドおよび３．４ＫＤに淡いバンドをもたらした。実施例５プロホルモン転換酵素変異体の構築前駆体型プロホルモン転換酵素から生物活性型プロホルモン転換酵素へのプロセシングに関与するプロホルモン転換酵素前駆体残基をプロホルモン転換酵素前駆体がヒト腎臓２９３細胞内に天然に存在するプロホルモン転換酵素によりプロセシングされるように変異させた。哺乳類発現ベクターｐＲＫ．ｍＰＣ１または哺乳類発現ベクターｐＲＫ．ｍＰＣ２の部位指向性変異誘発はＫｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ、１９８７年）の方法によるものである。次のプライマーをプロホルモン転換酵素前駆体変異体の構築に使用した。ｍＰＣ１プライマー（配列番号２８）ｍＰＣ２プライマー（配列番号２９）ここにプライマーは５’から３’の方向に記載してある。ＰＣ１プライマーはＡＲＧ８０がＬＹＳ８０に変異した自然の残基を所有する哺乳類プロホルモン転換酵素１変異体をもたらす。ＰＣ２プライマーは自然の哺乳類プロホルモン転換酵素残基ＬＹＳ７７・ＡＲＧ７８・ＡＲＧ７９がＡＲＧ７７・ＡＬＡ７８・ＬＹＳ７９に変異した哺乳類プロホルモン転換酵素変異体をもたらす。変異体は全てＵＳＢ製Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ・２．０キットでプライマー領域をスクリーニングした。実施例６ＮＧＦ、ＢＮＤＦおよびＮＴ−３変異体のｍＰＣ１および２によるプロセシング神経栄養因子のプロセシングにおける前駆体の役割を解明するために、キメラ体ｐＲＫ５発現ベクターをＢＤＮＦの成熟部分に結合するＮＧＦまたはＮＴ−３前駆体の成熟部分に結合したＮＧＦ、ＮＴ−３またはＢＤＮＦの前駆体を含めるように構築した。ＮＧＦ成熟配列を含む各キメラのＰＣＲ増幅された全領域は、例外としてｐＲＫ５．ＢＤＮＦＮＧＦ内のコドン＃４０３中のサイレントポイントの変異を除き、各前駆体部分および成熟ＮＧＦについて報告されている配列と同一であることが見出された。すべての構築においてはプラスミドベクターｐＲＫ５を使用した。神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ−３）または脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ−３）または脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）のｃＤＮＡをｐＲＫ５のクローニングリンカーに挿入して、ｐＲＫ５．ＮＧＦ、ｐＲＫ５．ＮＴ−３およびｐＲＫ５．ＢＮＤＦを製造させた。プラスミドＤＮＡを大腸菌２９４細胞内に形質転換し、スーパーブロス（１２％トリプトン水、２４％酵母抽出物水、０．５％グリセリン、７０ｍＭ−Ｋ₂ＨＰＯ₄、２５ｍＭ−ＫＨ₂ＰＯ₄）１Ｌ中で飽和まで培養した。プラスミドＤＮＡをアルカリ性溶菌によって分離し、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど（１９８９年）の操作に従った塩化セシウム二重バンディングにより精製した。ｐＲＫ．ＮＴ３ＮＧＦプラスミドの構築プレプロＮＴ−３をコードするＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉなど、１９８５年；Ｍｕｌｌｉｓなど、１９８６年）を用いてＮＧＦの成熟部分をコードするＤＮＡにスプライスした。ｐＲＫ．ＮＴ３およびｐＲＫ．ＮＧＦ各０．５μｇをＨｉｎｄＩＩＩでリネアライズした。表１に示すようにＮＴ３の前駆体部分をプライマーａおよびｂを用いて増幅し、一方ＮＧＦの成熟部分はｃおよびｄプライマーを用いて増幅した。各プラスミド内のプライミングの位置ならびにストランドを表示した（「Ｓ」はセンスプライマーを示し、「ＡＳ」はアンチセンスプライマーを示す）。Ｔｈｅｒｍａｌ・Ｃｙｃｌｅｒ４６０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）で次の条件でＰＣＲを行った。反応容積１００ｍＬ、５０ｐＭプライマー、２００μＭ−ｄＮＴＰ、１０ｍＭ−ｂ−メルカプトエタノール、１６．６ｍＭ− （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、６７ｎＭ−トリス塩酸ｐＨ８．８、６．７ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、６．７ｍＭ−ＥＤＴＡおよび０．１５ｍｇ／ｍＬ−ＢＳＡ。反応サイクルは９４ ℃で１分間のデナチュレーション、５５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃ で３分間の延長反応から構成した。３５サイクル後、ＰＣＲ反応物１および２の適量を８％アクリルアミドゲル上で精製した。ＮＴ３前駆体では１１９塩基ペアのバンド、ＮＧＦ成熟ＮＧＦでは４１４塩基ペアのバンドを切り出し、前記（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、１９８２年）のようにしてＤＮＡをエレクトロエルーションによって回収した。反応１および２からの精製生産物をともにＰＣＲ反応３で同一増幅条件下にプライマーａおよびｂを使用してスプライスした（ａおよびｂプライマーとも、ｐＲＫベクター内にクローニングで戻すために使用される制限部位を含む）。最終ＰＣＲ反応生産物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿し、Ｓｓｔ・ＩＩおよびＨｉｎｄ・ＩＩＩで消化を完了した。消化生産物を１％ＮｕＳｉｅｖｅゲル上で電気泳動した。５３３塩基ペア断片をゲルから切り出し、下記連結化で使用してｐＲＫ５．ＮＴ３ＮＧＦ融合プラスミドを作成した。プラスミドｐＲＫ５．ＮＴ３は１回の反応でＨｉｎｄ・ＩＩＩとＥｃｏ・ＲＩで、２回目の反応でＥｃｏ・ＲＩとＳｓｔ・ＩＩとで完全消化した。反応生産物を１％ＮｕＳｉｅｖｅゲル上で電気泳動した。４６８１および３３７塩基ペアバンドをゲルから切り出し、溶融し、溶融した前記５３３塩基ペア融合生産物とともに標準プロトコール（Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９年）に従って連結した。連結産物を６５℃で５分間融解し、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ₂１００μＬで希釈し、大腸菌２９９細胞中に形質転換した。コロニーを釣り上げて制限エンドヌクレアーゼ消化によりスクリーニングした後に、単一鎖ＤＮＡを製造し、前記のようにして全ＰＣＲ融合領域にわたって配列決定した。ｐＲＫ５．ＢＤＮＦＮＧＦプラスミドの構築ＢＤＮＦ前駆体を成熟ＮＧＦに融合領域を、ＰＣＲ反応１回だけで形成した点を除いて、前記同様にして融合した。Ｈｉｎｄ・ＩＩＩ０．５ｍｇでリネアライズしたｐＲＫ５．ＢＤＮＦおよびｐＲＫ５．ＮＧＦのＤＮＡをプライマー全４個、ａ、ｂ、ｃおよびｄ（表２）を含む１回の反応で増幅した。他の増幅条件は全て前記の通りであった。ＰＣＲ産物はフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿し、Ｂｓｔ・ＢＩとＨｉｎｄ・ＩＩＩとで完全消化した。消化産物を１％ＮｕＳｉｅｖｅゲル上で電気泳動し、６５０塩基ペア融合バンドを切り出し、下記連結のために保管した。ｐＲＫ５．ＢＤＮＦＮＧＦ構築のために使用したプライマーを次に示す。各プラスミド内のプライミングの位置ならびにストランドを表示した（「Ｓ」はセンスプライマーを示し、「ＡＳ」はアンチセンスプライマーを示す）。ｐＲＫ５．ＢＤＮＦＮＧＦプラスミドはｐＲＫ５．ＢＤＮＦをＨｉｎｄ・ＩＩＩとＢｓｔ・ＢＩとで完全消化して構築した。生産物を１％ＮｕＳｉｅｖｅゲル上で電気泳動した。５１８１塩基ペアバンドを切り出し、溶融し、溶融しだ６５０ｂｐＰＣＲ融合バンドに連結した。連結産物を形質転換し、スクリーニングして前記のようにしてＰＣＲ領域を配列決定した。前記構築物全てのＤＮＡは前記のような塩化セシウムバンディングにより製造した。ｐＲＫ５．ＮＴ３ＢＤＮＦプラスミドの構築プラスミドｐＲＫ５．ＮＴ３およびｐＲＫ５．ＢＤＮＦをＥｓｐ・ＩとＫｐｎ・Ｉとで完全消化した。消化産物を１％ＮｕＳｉｅｖｅゲルで電気泳動した。４８１０および９４４塩基ペア断片をゲルから切り出して互いに連結した。ＮＴ− ３前駆体の３’−端末および成熟ＢＤＮＦの５’−端末を含む失われた１２６塩基ペア領域は合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して製造した。オーバーラップするプライマー６個（センスおよびアンチセンス、表３）をともに１反応で標準プロトコールに従って連結した。連結産物を次にＥｓｐ・Ｉで消化して１２６塩基ペア融合断片を作成した。プラスミドｐＲＫ５．ＮＴＢＤをＥｓｐ・Ｉで完全消化し、１２６塩基ペア断片に連結した。スクリーニング後、ｐＲＫ５．ＮＴ３ＢＤＮＦを全１２６塩基ペア融合領域にわたって配列決定した。ＮＴ３ＢＤＮＦ合成融合領域に使用したプライマーを次に表示する。各プラスミド番号の次の「ｓ」はセンスストランドプラスミドを示し、「ａ」はアンチセンスストランドを示す。プライマーは互いに融合した時には互いにオーバーラップするように構築される。Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発ベクター内各遺伝子の５’位での変異を制御し、神経栄養ｍＲＮＡの翻訳条件を最適化するため、「ＡＣＣ」翻訳共通配列をｃＤＮＡ挿入物の５’端末に追加し、最初にｐＲＫ５．ＢＤＮＦ（ＡＴＧ部位２個を含む）およびｐＲＫ５．ＮＧＦにクローンした５’配列の追加塩基ペアを除去した。プラスミドｐＲＫ５．ＮＧＦ、ｐＲＫ５．ＮＴ３、ｐＲＫ５．ＢＤＮＦ、ｐＲＫ５．ＮＴ３ＢＤＮＦおよびｐＲＫ５．ＢＤＮＦＮＧＦについてＫｕｎｋｅｌ変異誘発を行った。プラスミドＤＮＡ２μｇをＣａＣｌ₂受容能のある大腸菌ＣＪ２３６株に形質転換した。ＰＥＧ沈殿後、ペレットをＴＥ１００μＬに再懸濁し、フェノール／クロロホルム（１：１）で１回とクロロホルム５００μＬで２回抽出した以外はＳａｍｂｒｏｏｋなど（１９８９年）に従って単一鎖ウラシル含有鋳型ＤＮＡを調製した。エタノール沈殿後、ペレットをｄＨ₂Ｏ４５μＬに再懸濁し、セファロースＣＬ −６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）カラムを通してスパン透析した。５’ＡＣＣ（表４）を含む合成オリゴヌクレオチドプライマー１００ピコモルをＴ４ヌクレオチドキナーゼで燐酸化した。製造元の指示に従って、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅファゲミド試験管内変異誘発キット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて変異誘発を実施した。産物を大腸菌２９９細胞内に形質転換し、得られたコロニーを釣り上げてスクリーニングした。単一鎖ＤＮＡを製造し、次の修正を施して配列決定した（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、１９８９年）。フェゲミド粒子の沈殿は４℃で行い、続いて０．３Ｍ−ＮａＯＡｃ／１ｍＭ−ＥＤＴＡに再懸濁した。ＤＮＡを２Ｘ容のフェノール／クロロホルムで抽出した。最終ペレットはｄＨ₂Ｏ５０μＬに再懸濁した。単一鎖プラスミドＤＮＡを製造元の指示に従って、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ・２．０配列決定キット（ＵＳＢ）でプライム領域全体について配列決定した。スクリーニングの目的で変更した制限部位には下線を施してある。細胞培養−ＥＬＩＳＡ塩化セシウム二重バンディングにより移入したプラスミドを調製した。原プラスミドと５’一端末変異誘発プラスミドｐＲＫ５．ＮＧＦ、ｐＲＫ５．ＮＴ３ＮＧＦおよびｐＲＫ５．ＢＤＮＦＮＧＦをｈＧＨ制御プラスミドとともにヒト腎臓細胞系（２９３）に燐酸カルシウム沈殿法（Ｇｏｒｍａｎなど、１９９０年）を利用して移入した。移入３６時間後、上清液のＮＧＦとｈＧＨ（対照として）との発現を酵素関連免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で検定した。ＥＬＩＳＡはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社の免疫検定サービスで行った。構築移入上清液は全て後根神経節および交感神経ニューロンへの効果により生物活性を持つことが確認された。細胞培養−放射活性蛋白質標識プラスミドｐＲＫ５．ＮＧＦ、ｐＲＫ５．ＮＴ−３、ｐＲＫ５．ＢＤＮＦ、ｐＲＫ５．ＮＴ３ＮＧＦ、ｐＲＫ５．ＢＤＮＦＮＧＦおよびｐＲＫ５．ＮＴ３ＢＤＮＦをヒト腎臓細胞系（２９３）に移入した。移入２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、システン／メチオニン不含ＤＭＥＭ培地内で、［³⁵Ｓ］−メチオニンと［³⁵Ｓ］−システイン２００μＣｉ／ｍＬで１２〜１４時間標識した。細胞プレートは各々［³⁵Ｓ］−システインのみまたは［³⁵Ｓ］−メチオニンのみで、システイン不含ＤＭＥＭ培地またはメチオニン不含培地中で標識した。放射活性上清を集め、製造元の指示に従ってＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）内で５〜１０倍に濃縮するか、下記のように細胞溶菌物とともに免疫沈降した。各濃縮サンプルの５分の１をプレキャスト１６％トリスグリシン、ＳＤＳ−ＰＡＧＥデナチュリング還元ミニプロテインゲル（１．５ｍｍ）につけ、製造元（Ｎｏｖｅｘ）の指示に従って電気泳動した。ゲルを指示書に示唆してあるようにしてＡｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で固定した。固定した乾燥ゲルで−７０℃でフィルムを８から２４時間露光した。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリトン溶菌緩衝液（１％トリトン、５ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）で溶解することによって細胞溶菌物を集めた。細胞の砕片を遠心分離により除去した。溶解物と上清液を下記のように免疫沈降した。ウサギ抗−ＮＧＦおよびヒツジ抗−ｈＧＨ抗体は免疫検定サービス、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社から供給を受けた。上清液と溶解物との半分をウサギ抗−ＮＧＦ抗体のみで免疫沈降した。他の半分は、移入対照として使用するため、ウサギ抗− ＮＧＦとヒツジ抗−ｈＧＨ抗体とで免疫沈降した。［³⁵Ｓ］−標識上清液と溶菌物を燐酸緩衝液食塩水（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中で１０％パンソルビン細胞（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ・ａｕｒｅｕｓ）１００μＬと回転しながら４℃で３０〜６０分間プレインキュベーションした。細胞を遠心分離して除き、上清液を前記のように飽和濃度のウサギ抗−ＮＧＦ抗体またはウサギ抗−ＮＧＦ抗体とヒツジ抗−ｈＧＨ抗体とともにインキュベーションした。１０％パンソルビン細胞１２０μＬを混合物に加え、４℃で回転しながら１時間インキュベーションした。各チューブをマイクロ遠心器で２分間遠心分離した。上清液を除き、ペレットを緩衝液＃１（１Ｍ−ＮａＣｌ、０．０５Ｍ −トリス、ｐＨ６．８水）で１回、緩衝液＃２（１Ｍ−トリス、ｐＨ８．８、０．２Ｍ−ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、０．３％ＳＤＳ）で２回および冷ｄＨ₂Ｏで１回洗浄した。洗浄したペレットを２ＸトリスーグリシンＳＤＳ負荷緩衝液４０ μＬに再懸濁した。２０μＬをプレキャスト１６％トリスグリシンＳＤＳ還元ミニプロテインゲル（１．５ｍｍ）につけ、製造元（Ｎｏｖｅｘ）の指示に従って電気泳動した。ゲルの割れを予防するために最終水洗液が５％グリセリンを含む点を除いてゲルを指示に従ってＥｎ³Ｈａｎｃｅ（ＤｕＰｏｎｔ）で固定した。固定し、乾燥したゲルでフィルムを−７０℃で９〜６６時間露光した。ＮＧＦ発現への前駆体効果分泌したＮＧＦ濃度への５’−変異の効果を二度実施したｈＧＨ制御下の実験３種により測定した。これらの実験で、ｈＧＨは移入効率に起因する可能性がある相違を制御した。例えばどの実験ででも、ＮＧＦとｈＧＨとの発現はプレート毎に違っていた。各ＮＧＦ発現値は同一プレートのｈＧＨ発現のみと比較したので、相対的比較をすることができた。５’変更プラスミドｐＲＫ５．ＮＧＦ５’ＡＣＣ、ｐＲＫ５．ＮＴ３ＮＧＦ５ ’ＡＣＣおよびｐＲＫ５．ＢＤＮＦＮＧＦ５’ＡＣＣの結果を表５に要約する。キメラ蛋白質を野生型ＮＧＦの発現水準を１００％として比較した。ｐＲＫ５．ＮＧＦとｐＲＫ５．ＮＴ３ＮＧＦとのＮＧＦ生産水準には約２倍の差があるように見えるが、ｐＲＫ５．ＢＤＮＦＮＧＦの生産水準は約５０倍低下している。ｐＲＫ５．ＮＧＦ５’ＡＣＣは通常型（野生型）なので、値を１００％とした。最右列でこの値との百分率でキメラ２種を比較した。ＮＧＦ、ＮＴ−３およびＢＤＮＦのアミノ酸配列には類似点と相違点がある。特に各プレプロプロテインの前駆体部分（〜２０％）に比較すると、成熟蛋白質因子は全く相同的（＞５０％）であることが明らかである。前駆体３種を比較するといくつかの主な相違点が観察される。第一に、ＮＧＦとＮＴ−３は一次プロセシング部位に二塩基性ペアＬｙｓ−Ａｒｇを含むが、ＢＤＮＦはＡｒｇ−Ａｒｇペアを含む。第二に、ＮＧＦとＮＴ３のみが上流の二塩基性部位（Ａｒｇ−Ａｒｇ）を含む。ＮＧＦは部位２個を持つが、ＮＴ−３は部位１個のみでＢＤＮＦは一つも持たない。プロテアーゼＫｅｘ２、ｍＰＢ１およびｍＰＢ２との細胞培養プレート（１００ｍｍ）当り発現プラスミドｐＲＫ．Ｋｅｘ２、ｐＲＫ．ｍＰＣ１またはｐＲＫ．ｍＰＣ２ＤＮＡ各３μｇを移入混合物に追加した点を除き、前記と同様にしてプラスミドｐＲＫ５．ＢＤＮＦおよびｐＲＫ５．ＮＴ−３を移入した。各前駆体の二塩基性切断パターンの相違があるので、酵素Ｋｅｘ２、ｍＰＣｌおよびｍＰＣ２のＮＴ−３とＢＤＮＦとに対する効果を検討した。Ｋｅｘ２はＮＴ−３の上流Ａｒｇ−Ａｒｇ部位を切断したが、このような基がないＢＤＮＦの上流領域は処理できなかった。ｍＰＣ１およびｍＰＣ２はこれ以外に２９３細胞中のＮＴ−３またはＢＤＮＦのプロセシングに対する効果を持たない。実施例７プロインシュリンＢ１０ヒスチジンからアスパラギン酸変異体の構築および移入２９３細胞中のインシュリン発現ヒトプレプロインシュリン遺伝子ｐＳＶＥＨＩＧＤＨＦＲのｃＤＮＡクローンは１９９２年２月１８日発行の豪州特許第６１６２０１号に記載のある最終哺乳類発現ベクターのためのヒトプレプロインスリン遺伝子のコード配列を提供した。ヒトプレプロインスリン遺伝子ｐＨ１３（Ｓｕｒｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０８巻５７〜５９頁［１９８０年］）の第二起源もヒトプロインスリンのコード配列を与える実験に使用された。適量（５〜１０μＬ）のｐＳＶＥＨＩＧＤＨＦＲは遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの組合せを用いるＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ端末の迅速増幅、Ｆｒｏｈｍａｎ、１９８８年；Ｉｎｎｉｓ、１９９０年）によるコーディング領域の増幅に利用された。このＰＣＲプライマーは５’端末にはＣＡＴ・ＡＡＧ・ＣＴＴ・ＡＣＣ・ＡＴＧ・ＧＣＣ・ＣＴＧ・ＴＧＧ・ＡＴＧ・ＣＧＣ（５’から３’への配列）および３’端末にはＣＡＴ・ＴＣＴ・ＡＧＡ・ＣＴＡ・ＧＴＴ・ＧＣＡ・ＧＴＡ・ＧＴＴ・ＣＴＣ・ＣＡＧ（５’から３’への配列）である。ＰＣＲクローニング反応は鋳型増幅の間のミスマッチ塩基導入を減少するためにすべてＶｅｎｔ・ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ・Ｅｎｇｌａｎｄ・Ｂｉｏｌａｂｓ）で行った。プロインスリンクローンは全てＵＳＢ製Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ・２．０キットで配列決定し、ｐＲＫ５制限消化物にクローンした。最終プレプロインスリン哺乳類ベクターはｐＲＫ７．ｐｒｏｉｎｓである。非天然起源プロホルモン転換酵素切断部位を持つヒトプロインスリン変異体はヒトプロインシュリンｃＤＮＡで、Ｂ鎖／Ｃ−ペプチド結合部位（ＫＴＲＲ）およびＡ鎖／Ｃ−ペプチド結合部位（ＬＱＫＲ）での天然起源塩基性切断部位をコードするｐＲＫ．ｐｒｏｉｎｓを部位指向性変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、前出）により変異させて構築した。二重変異型プロインシュリンであるＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐを構築した。ＩｐはＩ型酵素切断部位であり、ＩＩｐはＩＩ型酵素切断部位である。プロインシュリン変異体の構築に使用するプライマーであるｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐは実施例４に記載した。二重変異プロインシュリンであるｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐではＩ型酵素切断部位にある自然のヒトプロインシュリン残基Ｌｙｓ２９をＡｒｇ２９に、Ｉ型酵素切断部位にある残基Ａｒｇ３１をＬｙｓ３１に、そしてＩＩ型酵素切断部位にあるプロインシュリン残基Ｌｅｕ６２がＡｒｇ６２に変化している。他のプロインシュリン変異体であるｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ、ｐｒｏｉｎｓ．ＲＱＫＲ．ＩＩｐ、ｐｒｏｉｎｓ．ＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐおよびｐｒｏｉｎｓ．ＫＴＫＲ．Ｉｐは実施例４のようにして構築した。変異体は全てプライマー領域をＵＳＢ製Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ・２．０キットでスクリーニングした。プロインシュリンであるｐＲＫ７．ｐｒｏｉｎｓおよびプロインシュリン変異体であるｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐはＫｕｎｋｅｌなど（Ｍｅｔｈｏｄｓ・Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４巻、３６７〜３８２頁［１９８７年］）を部位指向性変異誘発によって変異誘発してｐＲＫ７．ｐｒｏｉｎｓ．Ｂ１０Ｈ＞ＤすなはちＢ鎖の１０位のヒスチジンの代わりにアスパラギン酸を持つプロインシュリンおよびｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞ＤすなはちＢ鎖の１０位のヒスチジンの代わりにアスパラギン酸を持つプロインシュリン変異体を得た。Ｋｕｎｋｅｌなど、前出、の方法に用いたプライマーは５’から３’の方向にＧＣ・ＴＴＣ・ＣＡＣ・ＣＡＧ・ＧＴＣ・ＧＧＡ・ＴＣＣ・ＧＣＡ・ＣＡＧ・ＧＴＧであった。変異体は全てプライマー領域をＵＳＢ製Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ・２．０キットでスクリーニングした。プロインシュリン変異体ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ、ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞Ｄ、ｐＲＫ７．ｐｒｏｉｎｓ．Ｂ１０Ｈ＞ＤおよびプロインシュリンｐＲＫ７．ｐｒｏｉｎｓ．からのＤＮＡをＣｓＣ１でバンドし、ヒト胚腎臓細胞系２９３（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１５７３）にＧｏｒｍａｎの方法（Ｇｏｒｍａｎ、ＤＮＡＰｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ．、２巻：３〜１０頁、１９９０年）によって一時的移入した。細胞をＧｏｒｍａｎ、前出、に記載されたように標識し、細胞と溶解物をインシュリン様蛋白質について分析した。ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅの方法（「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊、１１章、４２１〜４７０頁［１９８８年］から）によって蛋白質Ａのセファロース免疫沈降を上清液と溶解物サンプルの双方について濃縮モルモット抗ヒトインスリン抗体（Ｂｉｏｍｅｄａ・１０１）を用いて行った。免疫沈降生産物を２Ｘトリスーグリシンサンプル緩衝液（Ｎｏｖｅｘより）／８Ｍ−尿素プラスｂ−メルカプトエタノールまたは２Ｘトリシン緩衝液プラスｂ−メルカプトエタノールに再懸濁し、１００℃で５分間加熱して簡単にスパンし、各々１８％トリスグリシンＳＤＳまたは１６％トリシンゲル上で製造元（Ｎｏｖｅｘ）の指示に従って還元した。ゲルを固定（１０％酢酸、２５％イソプロパノール、６５％水）し、指示に従ってＡｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に浸漬した。固定し、乾燥したゲルをフィルムに−７０℃で１から４日間露光した。プロインシュリン変異体からのＤＮＡを用いてＧｏｒｍａｎ、前出、の方法によって一時的移入をし、移入１２から１６時間後に移入培地を血清不含培地に置換し、分泌産物を３６〜５６時間集めた。プロセシングされたインシュリンをＢｉｎａｘ社のＥｑｕａｔｅ（商標）ＲＩＡ・ＩＮＳＵＬＩＮキットを製造元の指示に従って利用する放射免疫検定（ＲＩＡ）により集めた上清液中で測定した。プロインシュリンまたは変異プロインシュリンの生物活性と比活性とを検出するため、２９３細胞のインシュリン受容体のベータ鎖にあるチロシン燐酸化増加分を定量して分泌産物を測定した。血清（１０％）（５００００細胞／穴）添加Ｆ１２−ＤＭＥＭ培地中の２９３細胞を２４穴Ｃｏｓｔａｒプレートに入れて一夜付着させた。細胞を血清不含培地に８〜１６時間移した。血清不含培地を吸引し、種々の濃度の野生型ウシインシュリン（Ｎｏｖｏ・Ｉｎｄｕｓｒｉ・Ａ／Ｓ）または条件を整えた上清液からの変異インシュリン１ｍＬで細胞を刺激した。３７℃で１０〜１５分インキュベーション後、反応を２Ｘトリス−グリシンサンプル緩衝液（Ｎｏｖｅｘから）１００ｕＬプラスｂ−メルカプトエタノール（５０μＬ／ｍＬサンプル緩衝液）を添加して停止した。サンプルを激しく混合し、１００℃で５分間加熱し、２０μＬを８％トリス−グリシンＳＤＳゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動した。電気泳動後、インシュリン受容体のｂ鎖チロシン燐酸化を検出して抗ホスホチロシン抗体での免疫吸収転移により定量し、続いてＨｏｌｍｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻１２０５〜１２１０頁［１９９２年］が記載した走査濃度測定を行った。ヒトインシュリン受容体を過剰に発現するＮＩＨ・３Ｔ３・ＨＩＲ３．５細胞（Ｗｈｉｔａｋｅｒなど、ＰＮＡＳ・ＵＳＡ、８４巻：５２３７〜５２４９頁［１９８７年］）を血清不含培地中に種々の濃度の無標識野生型インシュリンまたはインシュリン変異体および一定量の¹²⁵１−標識インシュリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに４℃で１６時間インキュベーションした。非結合リガンドを除き、細胞を氷冷培地で洗浄した。細胞をＳＤＳ（０．１％）を含む０．１Ｎ−ＮａＯＨで溶解後に放射活性結合物を定量した。野生型インシュリンおよびインシュリン変異体の相対的結合を非線形回帰プログラムを用いて測定した。インシュリン受容体結合の測定は次の方法で行った。ヒト腎臓細胞（２９３）またはヒトインシュリン受容体を過剰発現する３Ｔ３細胞、Ｗｈｉｔａｋｅｒなど、前出、をウエルディッシュ当り約１０００００細胞でプレートに散布した。散布後１から２日に細胞をＰＢＳで洗浄し、８〜１６時間結合緩衝液（Ｆ１２／ＤＭＥＭ（５０／５０）、２ｍＭ−Ｇｌｎ、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、ペニシリンおよびストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ・６００−５１４０・Ａｇ１００単位／ｍＬ）中に置いた。細胞を氷上に置き、冷結合緩衝液で２回洗浄した。各ウエルに三重に非放射性インシュリンリガンド（変異体または標準品）４８０μＬ、続いて¹²⁵１−標識インシュリン（チロシン−Ａ１４）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）２０μＬ（５００００〜１０００００ｃｐｍ／ウエル）を入れた。細胞を穏やかに揺らしつつ４℃で１４〜１６時間インキュベーションした。培地を除き、細胞を冷結合緩衝液で２回洗浄した。ＳＤＳ（０．１％）を含む０．１Ｎ−ＮａＯＨで細胞を溶解後、結合した放射活性の量を測定した。標準曲線を０〜１０００ｎＭ−ヒトインシュリン標準品（ＵＳＰ）またはウシ標準（Ｎｏｖｏ・Ｉｎｄｕｓｔｒｉ・Ａ／Ｓ）を利用して作成した。インシュリン変異体の相対的結合は非線形結合回帰プログラムを利用して測定した。プロインシュリンの発現野生型のプロインシュリンｃＤＮＡを持つ発現ベクターで移入すると、２９３ＨＥＫ細胞は分子量６．５ＫＤの非切断プロインシュリンを合成し、分泌する。プロセシングされない［³⁵Ｓ］−標識プロインシュリンを細胞溶解物とインシュリン特異性抗体を用いた培地から免疫沈降した。プロセシングされない物質は分子量マーカー６．５ＫＤと一緒に移動した。蛋白質分子量標準のバンド２個と比較すると、成熟インシュリンは還元された時には２．３５および３．４ＫＤのＡおよびＢ鎖と同様に移動する。プロインシュリン変異体の発現ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐをインシュリンのＡおよびＢ鎖ならびにプロセシング中間体と共に移動する産物にまでプロセシングした。Ｂ／Ｃ鎖結合部位またはＡ／Ｃ鎖結合部位にある各変異体の切断部位を代表するｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐまたはｐｒｏｉｎｓ．ＲＱＫＲ．ＩＩｐを移入した時は、成熟鎖の一つのみが複数の中間体と共に検出された。変異体切断部位がＡ／Ｃ鎖結合部位にある時にはＢ−Ｃ中間体と一致する遅く移動するバンドと共にＡ鎖が検出される。変異体切断部位がＢ／Ｃ鎖結合部位にある時にはＡ−Ｃ中間体に一致する速く移動するバンドと共にＢ鎖が検出される。変異体切断部位を認識する２９３相同性細胞酵素の量が２９３相同性細胞酵素を発現する発現ベクターとの共移入によって増加した時には中間体は消失する。ｐｒｏｉｎｓ．ＫＴＫＲ．Ｉｐは２９３細胞の酵素による切断に抵抗性である。生物活性の検出成熟した活性インシュリンが細胞外にあるインシュリン受容体のＡ鎖に結合する時は、インシュリン受容体のＢ鎖チロシン残基が自動燐酸化を受ける（Ｋａｓｕｇａなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１５巻：１８５〜１８６頁［１９８２年］）。それ故、インシュリン受容体がＢ鎖で自動燐酸化される能力を測定することによってインシュリン生物活性を検定した。Ｂ鎖の燐酸化は免疫ブロットで可視的に観察することができる。ウシインシュリンの濃度を徐々に増加する刺激により、Ｂ鎖は抗ホスホチロシン抗体でのプローブによる９６ＫＤ質量が徐々に増加することで観察される。Ｂ鎖燐酸化の同様な増加は種々の濃度のインシュリン変異体ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐおよびｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞Ｄによる刺激によって検出される。相対的比活性およびインシュリン結合の研究各インシュリン変異体により刺激された燐酸化の量を標準インシュリンと比較して定量化することによって相対的比活性を測定した。実験誤差の範囲内でｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐとｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ｐｒｏｉｎｓ．ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞Ｄとはともにウシ標準インシュリンと同様な活性を持つ。インシュリン受容体結合研究でｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐとｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞Ｄ変異体とは野生型標準インシュリンと同様な結合親和性を示した。Ｂ１０Ｈ＞Ｄインシュリン変異体ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞Ｄから検出される分泌生産物の相対的な量はＢ１０ＨｉｓからＡｓｐへの変化を欠くｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐに比較すると非常に多い。ＲＩＡで定量すると、プロセシングされたインシュリンの量は増加して、移入効率にもよるが１０〜４０倍の範囲になる。ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞Ｄによる活性インシュリンの蓄積増加に加えて、Ｂ１０Ｈ＞Ｄ変異体では野生型プロインシュリンを背景の上にプロセシング中間値の蓄積増加がある。野生型プロインスリン移入ではインシュリンＡおよびＢ鎖は得られない。しかしながら、ｐｒｏｉｎｓ．Ｂ１０Ｈ＞Ｄでの移入はたしかに検出可能なインシュリンＡおよびＢ鎖が得られる。ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞Ｄおよびｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐはＢ−鎖燐酸化で測定した同一の比活性および同一のインシュリン受容体結合能を持つ。Ｂ１０Ｈ＞Ｄ変異は、この変異が野生型プロインシュリンに起きたか、またはｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ変異で起きたかに関わらず同様に、細胞内プロテアーゼに対してより抵抗性であると見られる。実施例８以下の実施例はプロインシュリン変異体をコードし、遺伝子治療におけるグルコース応答エレメントを含むＤＮＡを有する宿主細胞であるマウス筋原細胞の使用を例示する。遺伝子治療における筋肉筋原細胞の使用は１９９０年１２月２７日に公表されたＷＯ９０／１５８６３に記載がある。レトロウイルスベクターの構築プラスミド構築およびＤＮＡ製造の一般操作はＭａｎｉａｔｉｓなど、「分子クローニング：実験室指針（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ［１９８２年］）に記載がある。グルコースに反応してプロインスリンを生産するマウス筋原細胞を遺伝子的に処理するために使用するレトロウイルスベクターを構築するために、ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐまたはｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞ＤおよびＬ型ピルベートキナーゼのグルコース応答エレメント（−２０８０と−３２００の間）の活性化配列（Ｃｕｉｆなど、前出およびＴａｎｉなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４３巻、４３１〜４３８頁［１９８７年］）をコードするＤＮＡをｐＢ２レトロウイルスベクター（ＮＩＨ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙの研究所）に入れた。ｐＢ２ウイスルベクターの構築は１９９０年６月２８日発行のＰＣＴ／ＵＳ８９／０５５７５の９〜１０頁に記載されている。得られたレトロウイルスベクターであるｐＲＶ．ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐまたはｐＲＶ．ｐｒｏｉｎｓ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞Ｄはさらに選択のためにＳＶ４０−ネオマイシン耐性断片を含んでいる。ｐＢ２ベクターへのＳＶ４０−ネオマイシン耐性断片の連結は１９９０年６月２８日公表のＰＣＴ／ＵＳ８９／０５５７５に記載されている。官能性促通グルコース輸送体（ＧＬＵＴ）およびグルコキナーゼをコードする天然起源核酸を含まない本発明の宿主細胞はさらにＧＬＵＴ、好ましくはＧＬＵＴ２またはＧＬＵＴ４、およびグルコキナーゼをコードする非天然起源の核酸を含む。宿主細胞はさらに宿主細胞のプロセシング酵素をコードする非天然起源核酸を含みうる。組み換えレトロウイルスベクターｐＲＶ．ｐｒｏｉｎ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐまたはｐＲＶ．ｐｒｏｉｎ．ＲＴＫＲ．Ｉｐ／ＲＱＫＲ．ＩＩｐ．Ｂ１０Ｈ＞Ｄは各々別々にレトロウイルスベクター充填細胞系、両種性細胞系ＰＡ１２（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２５巻：６３０頁［１９８４年］）、ＰＡ３１７系（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６巻：２８９５頁［１９８６年］）または両種性宿主で複製非受容性ウイルスを生産する^j−ＣＲＩＰ充填細胞系に移入し、組み換えに抵抗性のあるマウスおよびヒトの細胞（Ｄｈａｗａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻：１５０９〜１５１２頁［１９９１年］）に感染させる。レトロウイルス生産細胞からの上清液を集め、濾過し、遠心分離で濃縮する。Ｃ２Ｃ１２マウスの筋原系細胞（Ｙａｆｆｅなど、Ｎａｔｕｒｅ、２７０巻：７２５頁［１９７７年］およびＢｌａｕなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：７５８頁［１９８５年］）をレトロウイルスプロインシュリン構築物で感染させる。生産性最高のプロインスリン筋原細胞を選択してインシュリン依存性糖尿病モデル（Ｓｔｅｗａｒｔなど、「サイトカイン相互作用およびその管理：第一回ジェンナーシンポジウムの抄録集（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ・Ｉｎｔｅｒａｃｉｏｎｓ・ａｎｄ・Ｔｈｅｉｒ・Ｃｏｎｔｒｏｌ・Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ・ｏｆ・ｔｈｅ・Ｆｉｒｓｔ・Ｊｅｎｎｅｒ・Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ」、Ｂａｘｔｅｒ編、Ｊｏｈｎ・Ｗｉｅｌｙ−ａｎｄ−Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ、９３〜１０４頁［１９９１年］トランスジェニックマウスの後肢に注射する。参考文献Ｂａｒｒ，ＰＪ、「哺乳類サブチリシン類：長期間探されてきた二塩基性プロセシングエンドプロテアーゼ」、Ｃｅｌｌ、６６巻：１〜３頁（１９９１年）。Ｂａｒｒ，ＰＪ、Ｍａｎｓｏｎ，ＯＢ、Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ，ＫＥ、Ｗｏｎｇ，ＰＡ、Ｋｉｅｆｅｒ，ＭＣ、Ｂｒａｋｅ，ＡＪ、「ペア塩基性アミノ酸残基に開裂特異性を持つヒトサブチリシン様プロテアーゼのｃＤＮＡと遺伝子構造」、ＤＮＡ・Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、１０巻：３１９〜３２８頁（１９９１年）。Ｂａｔｈｕｒｓｔ，ＩＣ、Ｂｒｅｎｎａｎ，ＳＯ、Ｃｏｕｓｅｎｓ，ＬＳ，Ｂｒａｋｅ，ＡＪ、Ｂａｒｒ，ＰＪ、「酵母ＫＥＸ２プロテアーゼはヒトプロアルブミン転換酵素の性質を持つ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５巻：３４８〜３５０頁（１９８６年）。Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ，Ｓ、Ｒｏｎｄｅａｕ，Ｎ、Ｄａｙ，Ｒ、Ｃｈｒｅｔｉｅｎ，Ｍ、Ｓｅｉｄａｈ，ＮＧ、「ＰＣ１およびＰＣ２はプロオピオメラノコルチンを塩基性残基の複数の異なるペアで開裂することのできるプロプロテイン転換酵素である」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：３５６４〜３５６８頁（１９９１年）。Ｂｒｅｎｎａｎ，ＳＯ、Ｐｅａｃｈ，ＲＪ，Ｂａｔｈｕｒｓｔ，ＩＣ、「酵母ｋｅｘ２プロテアーゼの変異ヒトプロアルブミンに対する特異性は肝臓プロアルブミン転換酵素の生体内特異性と同一である」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻：２１４９４〜２１４９７頁（１９９０年）。Ｂｒｅｓｎａｈａｎ，ＰＡ、Ｌｅｄｕｃ，Ｒ、Ｔｈｏｍａｓ，Ｌ、Ｔｈｏｒｎｅｒ，Ｊ、Ｇｉｂｓｏｎ，ＨＬ、Ｂｒａｋｅ，ＡＪ、Ｂａｒｒ，ＰＪ、Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ、「ヒトｆｕｒ遺伝子は生体内でプロ−ｂ−ＮＧＦを開裂する酵母ｋｅｘ２様エンドプロテアーゼをコードする」、Ｊ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ、１１１巻：２８５１〜２８５９頁（１９９０年）。Ｃｈｕｎｇ，Ｋ−Ｎ、Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ、Ａｐｏｎｔｅ，ＧＷ、Ｍｏｏｒｅ，Ｈ−ＰＨ、「分泌経路に於ける分子選別」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３巻：１９２〜１９７頁（１９８９年）。Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＨＷ、Ｒｈｏｄｅｓ，ＣＪ、Ｈｕｔｔｏｎ，ＪＣ、「小器官内カルシウムおよびｐＨは異なる部位特異性エンドペプチダーゼ２種による膵臓ｂ細胞内でのプロインシュリン開裂を制御している」、Ｎａｔｕｒｅ、３３３巻：９３〜９６頁（１９８８年）。Ｄｏｃｈｅｒｔｙ，Ｋ、Ｓｔｅｉｎｅｒ，ＤＦ、「ポリペプチドホルモン生合成における翻訳後蛋白質分解」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、４４巻：６２５〜６３８頁（１９８２年）。Ｄｏｕｇｌａｓｓ，Ｊ、Ｃｉｖｅｌｌｉ，Ｏ、Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｅ、「ポリプロテイン遺伝子の発現：神経内分泌ペプチドの多様性作成」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３巻：６６５〜７１５頁（１９８４年）。Ｆｏｓｔｅｒ，ＤＣ、Ｈｏｌｌｙ，ＲＤ、Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，ＣＡ、Ｗａｌｋｅｒ，ＫＭ、Ｋｕｍａｒ，ＡＡ、「哺乳類細胞内共発現下の酵母ｋｅｘ２エンドペプチダーゼによるヒトＣ蛋白質前駆体のエンドプロテオリティクなプロセシング」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：３６７〜３７２頁（１９９１年）。Ｆｒｉｃｋｅｒ，ＬＤ、Ｄａｓ，Ｂ、Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，ＲＨ、「カルボキシペプチダーゼＥのｐＨ依存性膜アンカーの確認」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻：２４７６〜２４８２頁（１９９０年）。Ｆｒｏｈｍａｎ，ＭＡ、Ｄｉｓｈ，ＭＫ、Ｍａｒｔｉｎ，ＧＲ、「僅少転写物からの全長ｃＤＮＡの迅速生産：単一遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの増幅」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻：８９９８〜９００２頁（１９８８年）。Ｆｕｌｌｅｒ，ＲＳ、Ｂｒａｋｅ，Ａ、Ｔｈｏｒｎｅr，Ｊ、「酵母プロホルモンプロセシング酵素（ＫＥＸ２遺伝子産物）はＣａ²⁺依存性セリンプロテアーゼである」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻：１４３４〜１４３８頁（１９８９年）。Ｆｕｌｌｅｒ，ＲＳ、Ｂｒａｋｅ，ＡＪ、Ｔｈｏｒｎｅｒ，Ｊ、「プロホルモンプロセシングエンドプロテアーゼの細胞内標的化および構造的保存」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻：４８２〜４８６頁（１９８９年）。Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｄ、Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｌ、Ｒａｃｉｎｅ，Ｃ、Ｇｏｓｓａｒｄ，Ｆ、Ｄｉｇｎａｒｄ．Ｄ、Ｔｈｏｍａｓ，ＤＹ、Ｃｒｉｎｅ，Ｐ、Ｂｏｉｌｅａｕ，Ｇ、「酵母ｋｅｘ２−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（iv）連絡先：（Ａ）名宛人：ジェネンテク・インコーポレイテッド（Ｂ）通り：ポイント・サン・ブルーノ・ブールバード４６０番（Ｃ）市：サウス・サン・フランシスコ（Ｄ）州：カリフォルニア（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）ＺＩＰ：９４０８０（v）コンピューター解読書式（Ａ）媒体型：５．２５インチ、３６０Kbフロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエア：パティン（ジェネンテク）（vi）本出願のデータ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）優先出願のデータ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（viii）弁理士／代理人情報（Ａ）氏名：ラブ，リチャード・ビー（Ｂ）登録番号：３４，６５９（Ｃ）参照／整理番号：７４８Ｐ３ＰＣＴ（ix）電話連絡先情報：（Ａ）電話番号：４１５／２２５−５５３０（Ｂ）テレファックス番号：４１５／９５２−９８８１（Ｃ）テレックス番号：９１０／３７１−７１６８（２）配列番号１の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２３５５塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１：（２）配列番号２の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２０１２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２：（２）配列番号３の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：７５３アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３：（２）配列番号４の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：６３７アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４：（２）配列番号５の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号５：（２）配列番号６の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号６：（２）配列番号７の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号７：（２）配列番号８の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３３塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号８：（２）配列番号９の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号９：（２）配列番号１０の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１０：（２）配列番号１１の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１１：（２）配列番号１２の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１２：（２）配列番号１３の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１３：（２）配列番号１４の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１４：（２）配列番号１５の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１５：（２）配列番号１６の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１６：（２）配列番号１７の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１７：（２）配列番号１８の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１８：（２）配列番号１９の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１９：（２）配列番号２０の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２０：（２）配列番号２１の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２１：（２）配列番号２２の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２２：（２）配列番号２３の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２３：（２）配列番号２４の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２４：（２）配列番号２５の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２５：（２）配列番号２６の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２２塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２６：（２）配列番号２７の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２７：（２）配列番号２８の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３６塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２８：（２）配列番号２９の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３９塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２９：（２）配列番号３０の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３０：（２）配列番号３１の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３８塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３１：（２）配列番号３２の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：３８塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３２：（２）配列番号３３の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２８塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３３：（２）配列番号３４の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４０塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３４：（２）配列番号３５の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３５：（２）配列番号３６の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３６：（２）配列番号３７の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２８塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３７：（２）配列番号３８の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：５１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３８：（２）配列番号３９の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：５１塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３９：（２）配列番号４０の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４８塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４０：（２）配列番号４１の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４８塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４１：（２）配列番号４２の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２６塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４２：（２）配列番号４３の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：２７塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４３：（２）配列番号４４の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：５４塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４４：（２）配列番号４５の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：４８塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４５：（２）配列番号４６の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：５３塩基（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４６：（２）配列番号４７の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：７アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４７：（２）配列番号４８の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：７アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４８：（２）配列番号４９の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：７アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４９：（２）配列番号５０の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：７アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号５０：（２）配列番号５１の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：７アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号５１：（２）配列番号５２の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：７アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号５２：（２）配列番号５３の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：７アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号５３：（２）配列番号５４の情報：（i）配列の特徴（Ａ）長さ：７アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号５４：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．（a）変異型プロインシュリンをコードする核酸を、構成的蛋白質分泌経路を有する宿主細胞に導入して組み換え宿主細胞を作成すること（該変異型のプロインシュリンは非天然起源の切断部位を有し、該切断部位は宿主細胞のプロセシング酵素によって認識可能であり、かつ該組み換え宿主細胞はグルコースに応答してインシュリンを生産できる。）、および（b）哺乳類に該組み換え宿主細胞の治療的有効量を投与することを含む哺乳類のインシュリン応答性疾患の治療方法。２．該核酸がグルコース輸送体蛋白質およびグルコキナーゼをさらにコードする請求項１に記載の方法。３．該核酸がグルコース応答エレメントをさらにコードする請求項１に記載の方法。４．該核酸がウイルス感染により該宿主細胞に導入される請求項１に記載の方法。５．該宿主細胞が筋肉筋原細胞である請求項１に記載の方法。６．該組み換え宿主細胞を医薬的に許容される担体の中に入れて投与する請求項１に記載の方法。７．該組み換え宿主細胞を該哺乳類の腹腔内または皮下に導入する請求項６に記載の方法。８．該非天然起源の切断部位がプロホルモン転換酵素部位である請求項１に記載の方法。９．該プロホルモン転換酵素部位がＺＸＺＲであって、ＺはＬＹＳまたはＡＲＧであり、Ｘはいずれかのアミノ酸であり、ＲはＡＲＧである請求項８に記載の方法。１０．該非天然起源の切断部位がプロインシュリンのＢ／Ｃ鎖結合部位、Ａ／Ｃ鎖結合部位およびＢ／Ｃ鎖結合部位とＡ／Ｃ鎖結合部位よりなる群から選択される位置にある請求項１に記載の方法。１１．該変異型プロインシュリンがＢ鎖第１０残基にアスパラギン酸をさらに含む請求項１に記載の方法。１２．該導入された核酸が宿主細胞のプロセシング酵素をコードする核酸をさらに含む請求項１に記載の方法。１３．該宿主細胞のプロセシング酵素がフーリン（ｆｕｒｉｎ）である請求項１２に記載の方法。１４．該哺乳類が糖尿病に罹患しているか、罹患の恐れがある請求項１に記載の方法。１５．該グルコース輸送遺伝子がＧＬＵＴ−２である請求項２に記載の方法。１６．（a）変異型プロインシュリンをコードする核酸をプラスミドに導入してプロインシュリン生産性プラスミドを作成すること（該変異型プロインシュリンは非天然起源の切断部位を有し、該切断部位は構成的蛋白質分泌経路を有する哺乳類宿主細胞のプロセシング酵素によって認識可能である。）、および（b）該哺乳類に治療的有効量の該プロインシュリン生産プラスミドを投与することを含む哺乳類におけるインシュリン応答性疾患の治療方法。１７．該プラスミドがリポソームとして投与される請求項１６に記載の方法。１８．該プロインシュリンが該哺乳類により製造され、該哺乳類宿主細胞の該プロセシング酵素により切断されてグルコースに応答してインシュリンを生産する請求項１６に記載の方法。１９．グルコース応答エレメントをコードする核酸をさらに含む請求項１６に記載の方法。２０．該変異型プロインシュリンをコードする該核酸がメチル化されている請求項１６に記載の方法。２１．グルコース応答エレメントをコードする核酸および変異型プロインシュリンをコードする核酸を含む組み換え宿主細胞であって、該変異型プロインシュリンは非天然起源の切断部位を有し、該切断部位は組み換え宿主細胞のプロセシング酵素により認識可能である組み換え宿主細胞。２２．該組み換え宿主細胞のプロセシング酵素がフーリンである請求項２１に記載の組み換え宿主細胞。２３．該核酸がグルコース輸送体蛋白質およびグルコキナーゼをコードする核酸をさらに含む請求項２１に記載の組み換え宿主細胞。２４．該組み換え宿主細胞のプロセシング酵素が該組み換え宿主細胞内では天然起源でない請求項２１に記載の組み換え宿主細胞。２５．該組み換え宿主細胞内では天然起源ではない組み換え宿主細胞のプロセシング酵素をコードする核酸を有する請求項２４に記載の組み換え宿主細胞。２６．該宿主細胞が筋肉筋原細胞である請求項２１に記載の組み換え宿主細胞。２７．該変異型プロインシュリンをコードする該核酸がメチル化されている請求項２１に記載の組み換え宿主細胞。２８．変異型プロインシュリンからインシュリンを製造できる宿主細胞を生産する方法であって、該方法は、非天然起源の切断部位を有する変異型プロインシュリンをコードする核酸を天然には分泌顆粒を形成できない宿主細胞に導入することを含んでなり、該切断部位は宿主細胞のプロセシング酵素によって認識可能である方法。２９．（a）構成的蛋白質分泌経路を有する宿主細胞を取得すること、（b）所望のポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入して組み換え宿主細胞を作成すること（所望のポリペプチドは非天然起源の切断部位を有し、該切断部位は組み換え宿主細胞のプロセシング酵素により認識される。）、および（C）哺乳類に該組み換え宿主細胞の治療的有効量を投与することを含む哺乳類患者を治療する方法。３０．組み換え宿主細胞によりインシュリンにプロセシングされることのできる変異型プロインシュリンをコードする核酸を該組み換え宿主細胞に導入することをさらに含む請求項２９に記載の方法。３１．ＧＬＵＴ蛋白質およびグルコキナーゼをコードする核酸を該組み換え宿主細胞に導入することをさらに含む請求項３３に記載の方法。３２．哺乳類のインシュリン応答性疾患を治療するための医薬の製造における組み換え宿主細胞の使用であって、宿主細胞は、変異型プロインシュリンをコードする核酸を構成的蛋白質分泌経路を有する宿主細胞に導入し、組み換え宿主細胞を作成することを含む方法により得られ、該変異型プロインシュリンは非天然起源の切断部位を有し、該切断部位は宿主細胞のプロセシング酵素により認識可能であり、そして該組み換え宿主細胞はグルコースに応答してインシュリンを生産することができる、組み換え宿主細胞の使用。３３．該核酸がグルコース輸送体蛋白質とグルコキナーゼとをさらにコードする請求項３２に記載の使用。３４．該核酸がグルコース応答エレメントをさらにコードする請求項３２に記載の使用。３５．該核酸が該細胞にウイルス感染により導入される請求項３２に記載の使用。３６．該宿主細胞が筋肉筋原細胞である請求項３２に記載の使用。３７．該医薬が医薬的に許容できる担体を含む請求項３２に記載の使用。３８．該医薬が腹腔内または皮下注射用液剤である請求項３２に記載の使用。３９．該非天然起源の切断部位がプロホルモン転換酵素部位である請求項３２に記載の使用。４０．該プロホルモン転換酵素部位がＺＸＺＲであり、ＺはＬＹＳまたはＡＲＧであり、Ｘはいずれかのアミノ酸であり、ＲはＡＲＧである請求項３９に記載の使用。４１．該非天然起源の切断部位がプロインシュリンＢ／Ｃ鎖結合部位、Ａ／Ｃ鎖結合部位、およびＢ／Ｃ鎖結合部位とＡ／Ｃ鎖結合部位よりなる群から選択した位置にある請求項３２に記載の使用。４２．該変異型プロインシュリンがＢ鎖第１０残基にアスパラギン酸をさらに含む請求項３２に記載の使用。４３．該導入された核酸が該宿主細胞のプロセシング酵素をコードする核酸をさらに含む請求項３２に記載の使用。４４．該宿主細胞のプロセシング酵素がフーリンである請求項４３に記載の使用。４５．該哺乳類が糖尿病に罹患しているか、罹患の恐れがある請求項３２に記載の使用。４６．該グルコース輸送体遺伝子がＧＬＵＴ−２である請求項３３に記載の使用。４７．哺乳類のインシュリン応答性疾患の治療のための医薬の製造におけるプロインシュリン生産性プラスミドの使用であって、該プロインシュリン生産性プラスミドは、非天然起源の切断部位を有する変異型プロインシュリンをコードする核酸を導入することを含む方法により得られ、該切断部位は構成的蛋白質分泌経路を有する哺乳類宿主細胞のプロセシング酵素により認識可能である使用。４８．該プロインシュリン生産性プラスミドがリポソームに封入されている請求項４７に記載の使用。４９．該プロインシュリンが該哺乳類により生産され、かつ、該哺乳類宿主細胞の該プロセシング酵素により切断されて、グルコースに応答してインシュリンを生産することのできる請求項４７に記載の使用。５０．該核酸がグルコース応答エレメントをコードする核酸をさらに含む請求項４７に記載の使用。５１．該変異型プロインシュリンをコードする該核酸がメチル化されている請求項４７に記載の使用。５２．（a）構成的蛋白質分泌経路を有する宿主細胞を取得すること、および（b）所望のポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入して組み換え宿主細胞を作成すること（所望のポリペプチドは非天然起源の切断部位を有し、該切断部位は組み換え宿主細胞のプロセシング酵素により認識される。）を含む方法により組み換え宿主細胞が得られる哺乳類の治療のための医薬の製造における組み換え宿主細胞の使用。５３．該組み換え宿主細胞によってインシュリンまでプロセシングされることのできる変異型プロインシュリンをコードする核酸を該組み換え宿主細胞に導入することをさらに含む請求項５２に記載の使用。５４．該組み換え宿主細胞にＧＬＵＴ蛋白質とグルコキナーゼとをコードする核酸を導入することをさらに含む請求項５３に記載の方法。