JPH08507208A

JPH08507208A - 腎臓ａｔｐ−依存性ナトリウムチャンネルをコードするヒトｄｎａ配列

Info

Publication number: JPH08507208A
Application number: JP6518999A
Authority: JP
Inventors: ビエンコウスキ，マイケル・ジェローム; グロッピ，ビンセント・エドワード，ジュニア
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1993-02-19
Filing date: 1994-02-15
Publication date: 1996-08-06
Also published as: WO1994019464A3; EP0684993A1; US5882873A; WO1994019464A2; AU6267194A

Abstract

(57)【要約】本発明は、膜またはレシピエント細胞系に対しカリウムチャンネル活性を与えるタンパク質をコードするヒトＤＮＡ組成物に関する。該ＤＮＡ組成物は、カリウムチャンネルタンパク質をコードする構造遺伝子、該構造遺伝子を含有する発現および複製のプラスミドまたはべクターならびにそれらの遺伝子を発現する宿主細胞を包含する。また、カリウムチャンネル調節活性につき化合物をスクリーニングする方法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】腎臓ＡＴＰ−依存性ナトリウムチャンネルをコードするヒトＤＮＡ配列発明の背景１．発明の分野本発明は、膜またはレシピエント細胞系に対しカリウムチャンネル活性を与えるタンパク質をコードするヒトＤＮＡ組成物に関する。該ＤＮＡ組成物は、カリウムチャンネルタンパク質をコードする構造遺伝子、該構造遺伝子を含有する発現および複製のプラスミドまたはベクターならびにそれらの遺伝子を発現する宿主細胞を包含する。また、カリウムチャンネル調節活性につき化合物をスクリーニングする方法も記載する。２．関連する技術の記載ホー，ケイ（Ｈｏ，Ｋ）らによる「クローニング・アンド・エクスプレッション・オブ・アン・インワードリー・レクティファイイング・エイティピイ・レギュレイティッド．ポタシウム・チャンネル（Ｃloning and expression of an in wardly rectifying ＡＴＰ-regulated potassium channel）」、ネイチャー（Ｎ ature）（１９９３年３月４日）、第３６２巻、３１−３８頁。そこでは、ラット腎臓の外部髄質の内部ストライプ（inner stripe）由来のＡＴＰ調節カリウムチャンネルタンパク質をコードする遺伝子について記載されている。チャンディー，ケイ（Chandy，Ｋ）らによる１９９２年２月２０日公開のＷＯ９２/０２６３４、ＰＣＴ/ＵＳ９１/０５１６８。そこでは、ＭＫ３として公知の遺伝子産物、Ｔリンパ球中に存在する電位依存性でｎ型のカリウムチャンネルタンパク質について記載されている。ハーポルド，エム（Ｈarpold，Ｍ）らによる１９９２年２月２０日公開のＷＯ９２/０２６３９、ＰＣＴ/ＵＳ９１/０５６２５。そこでは、細胞表面タンパク質の活性を調節する化合物を同定する転写アッセイについて記載されている。またレポーター遺伝子、転写調節エレメント、およびカリウムイオンチャンネルとなりうる外来性の細胞表面タンパク質をコードするＤＮＡを含有する細胞についても記載されている。ルツンスキー，エム（Luzdunski，Ｍ）による「カリウムチャンネル：構造− 機能の相関、多様性および薬理学（Potassium Channels:Structure-Function Re lationships,Diversity,and Pharmacology）」、カーディオバスキュラー・ドラッグズ・アンド・セラピー（Cardiovascular Drugs and Therapy）、（１９９２）、第６巻、３１２−３１９頁。ここでは、カリウムチャンネルに関する一般的な記載および情報が記載されている。３．背景細胞膜のイオンチャンネルは、イオン流動が起こる基本的な部位である。現代における薬物−チャンネル相互作用の研究は、プロカインおよびコカインにより引き起こされるイカ軸索のナトリウム（Ｎａ⁺）、およびカリウム（Ｋ⁺）チャンネルの遮断を証明するために電位差クランプ技術（voltage clamp technique）が用いられた時に開始された（ナカハシ（Nakahashi）、アナルス・オブ・ノイロロジー（Ann Neurology）、（１９８４）；１６（suppl）：Ｓ３９−Ｓ５１頁）。本発明はカリウムチャンネルに関する。薬理学的および物理化学的な研究により、数多くの哺乳動物細胞の形質膜においてカリウム選択性の孔を形成する複数サブタイプの膜イオンチャンネルが存在することが明らかとなった。これらカリウムチャンネルの薬理学的および電気生理学的な性質の比較からそれらの開閉特性におおいに基づく種々のサブタイプのグループ分けの操作上の定義が明らかにされてきた。電位差で開閉するカリウムチャンネルは膜ポテンシャルの変化を検知し、この細胞膜ポテンシャルの変化に反応してカリウムイオンを通過させる。リガンドにより開閉するカリウムチャンネルは、カルシウム、ナトリウム、ＡＴＰまたは脂肪酸（特にアラキドン酸）を包含する低分子量エフェクターによって調節される（ラツンスキー（Lazdunski）によるカーディオバスキュラー・ドラッグズ・アンド・セラピー（Cardiovascular Drugs and Therapy）、（１９９２）、第６巻、３１３−３１９頁）。これらのチャンネルタンパク質がカリウムイオンを選択的に移動させるという共通の性質を有するにもかかわらず、それらが異なった生物物理学的、生物化学的および薬理学的な性質を有することは、それらが異なった遺伝子によってコードされる異なった遺伝子産物であることを示唆している。ＡＴＰ−感受性、またはＡＴＰにより開閉するカリウムチャンネルは、細胞のその電気的な興奮に細胞の生物エネルギー状態がリンクしている重要なクラスのチャンネルである。該チャンネルは高い細胞内ＡＴＰ濃度によって遮断され、ＡＴＰが減少すると開孔する（ラツンスキー（Lazdunski）（１９９２））。元来ＡＴＰにより開閉するカリウムチャンネルは心臓組織に存在すると記載されていた（ノマ，エイ（Noma，Ａ）、ネイチャー（Nature）、第３０５巻、１４７−１４８頁）が、その後これらが膵臓β−細胞（クック（Cook）ら、ネイチャー（Na ture）、（１９８４）、第３１１巻、２７１−２７３頁）;血管平滑筋（vascula r smooth muscle）（ネルソン，エム・ティー（Nelson，Ｍ.Ｔ.）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Am.Ｊ.Physiol.）、（１９９０）、第２５９巻、Ｃ３−Ｃ１８頁）および腎臓の肥大上行性肢（thick ascending limb ）（ワン，ダブリュー（Wang，Ｗ）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Am.Ｊ.Physiol.）、（１９９０）、第２５８巻、Ｆ２４４−Ｆ２５３頁））に存在することが記載されている。カリウムチャンネルタンパク質についてのモレキュラークローニングの研究からいくつかの知見が得られているが、電位差により開閉するファミリーのカリウムチャンネルのメンバーに関してだけである。これらの電位差により開閉するファミリーのカリウムチャンネルタンパク質をコードする種々の遺伝子は、Shaker 、ShawおよびShab遺伝子座の全てから由来のショウジョウバエ遺伝子を用いてクローン化されている（ウェイ，エイ（Wei，Ａ）ら、サイエンス（Science）、（１９９０）、第２４８巻、５９９−６０３頁）。リガンドにより開閉するファミリーのカリウムチャンネルタンパク質のメンバーを、電位差により開閉するカリウムチャンネルの公知の配列に基づくプローブを用いてクローン化する全ての公知の試みは失敗している。これらのカリウムチャンネルの電気生理学的および薬理学的な特性を一緒にすると、これらの結果により、ＡＴＰにより開閉するカリウムチャンネルタンパク質が電位差により開閉するカリウムチャンネルをコードする遺伝子とは異なる遺伝子によってコードされることがさらに確認される。これらの結果は、電位差感受性のカリウムチャンネルと、ＡＴＰにより開閉するカリウムチャンネルをコードするそれぞれの遺伝子間で相同性がほとんどまたは全くないことを示している。ラット腎臓カリウムチャンネルをコードするｃＤＮＡが、ラット腎臓の肥大上行性肢からサイズ−分画したｍＲＮＡを用いた発現クローニングにより単離されている。卵母細胞で発現させると、この遺伝子によりコードされるタンパク質が、ＡＴＰにより開閉するカリウムチャンネルの顕著な特徴を全てではないが多く示す（ホー，ケイ（Ho，Ｋ）ら、ネイチャー（Nature）、第３６２巻、３１−３８頁（１９９３年３月４日））。本発明は、初めて成功したヒト腎臓ＡＴＰ開閉カリウムチャンネル遺伝子および関連するカリウムチャンネル遺伝子のクローン化を記載する。これらの重要な遺伝子のクローニングは、潜在的な薬物ターゲットの同定、特徴付けおよびクローニングを可能にする系への重要なチャンネルタンパク質の生産を可能とするであろう。本発明は、大容量の機械スクリーニングの開発を包含し、それにより生化学研究用の物質生産の適当な系を作ることが可能となるであろう。テトロドトキシンの高選択性およびナトリウムチャンネル遮断作用の発見により、イオンチャンネルの研究に、特定の化学物質をプローブとして用いる広範な興味が涌き起こされた（ナラハシ（Narahashi）（１９８４））。本発明は、他の重要な生理学的物質を発見させうる重要なカリウムチャンネルを提供する。発明の要約本発明は、ヒトカリウムＡＴＰ開閉チャンネルタンパク質をコードする機能性ｃＤＮＡクローンおよびその誘導体の最初の単離を特徴とする。本発明は、以下のことを記載している。図１〜５に示される配列を有するヒト腎臓ＡＴＰ開閉カリウムチャンネルおよび関連するカリウムチャンネルをコードする単離ＤＮＡおよびその選択された誘導体。図１〜５のＤＮＡ分子からなる種々のベクターおよびその選択された誘導体。図１〜５のＤＮＡ分子からなる種々のプラスミドおよびその選択された誘導体。細菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞の中での発現に適応するベクターおよびプラスミド。図１〜５のベクターおよびプラスミドまたはそれらの選択された誘導体を含有する細菌、酵母または哺乳動物細胞を用いて、ヒト腎臓ＡＴＰ開閉カリウムチャンネル活性および関連するカリウムチャンネル活性を調節する化合物をスクリーニングする方法。また本発明は、Ｋ−８、Ｋ−１１もしくはＫ−１２と命名されたクローンからの、またはその自明な変形から選択された誘導体からの図１、２、３、４または５で示した配列を有するか、Ｋ−８、Ｋ−１１またはＫ−１２と命名されたクローンまたはその明らかな種々の変形から選択される誘導体からの配列を有するか、表１に示されたＮ末端タンパク配列をコードするＤＮＡを有するか、あるいはＫ−２、Ｋ−６、Ｋ−８、Ｋ−１１もしくはＫ−２６と命名されたクローンからの配列および表１には示されていないが図１〜５に示されている残りのＤＮＡを有するか、あるいは図１〜５に示したＤＮＡによってコードされたタンパク質、または図６または表１に示されているタンパク質のいずれかの欠損を含めた約最初の２６個のＮ末端アミノ酸のいずれかをコードするＤＮＡを有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子、またはその前記ＤＮＡ分子のいずれかに９０％相同のＤＮＡ分子を提供する。また、本発明は、前記のごとき哺乳動物細胞を用いて、ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節する化合物をスクリーニングする方法をも請求する。該方法は以下の：ａ）クローン化Ｋ⁺チャンネルを発現する細胞を密集するまで増殖させ、ｂ）ａ）の細胞を平衡塩溶液で平衡化し、ｃ）平衡化細胞のベースライン測定を行い、ｄ）一のテスト化合物またはテスト化合物のカクテルを該細胞に添加して、膜ポテンシャルの変化を記録し、ｅ）野生型上にまたは偽トランスフェクトした対照株上にＫ⁺を発現する細胞を脱分極化させる化合物をテストして選択性を確立し、ｆ）選択的なＫ⁺遮断を示す化合物を選択する工程からなる。図面の簡単な説明図１．ｃＤＮＡクローンＫ２６によりコードされるオープン・リーディング・フレームの翻訳である。図２．ｃＤＮＡクローンＫ２６−プラスによりコードされるオープン・リーディング・フレームの翻訳である。図３．ｃＤＮＡクローンＫ１１によりコードされるオープン・リーディング・フレームの翻訳である。図４．ｃＤＮＡクローンＫ１１−プラスによりコードされるオープン・リーディング・フレームの翻訳である。図５．ｃＤＮＡクローンＫ−８によりコードされるオープン・リーディング・フレームの翻訳である。図６．ヒト腎臓Ｋ−ＡＴＰチャンネル蛋白質のアミノ酸配列図である。図７Ａ−７Ｆ．アフリカツメガエル（Xenopus oocytes）で発現されるＫ−８、Ｋ１１およびＫ２６チャンネルの全ての細胞の記録である。図８Ａ−８Ｆ．アフリカツメガエル（Xenopus oocytes）で発現されるＫ−８、Ｋ１１およびＫ２６チャンネルのカリウム選択性である。図９．ＡＣＡＳサイトメーター（cytometer）で分析されるＫ２６Ｋ^xチャンネルを一時的に発現しているＣＯＳ７細胞のＢａＣｌ₂誘導脱分極である。図１０．ＡＣＡＳサイトメーター（cytometer）で分析されるＫ２６Ｋ^xチャンネルで安定に発現しているヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞のＢａＣｌ₂ 誘導脱分極である。図１１．ＡＣＡＳサイトメーター（cytometer）で分析されるＲＯＭＫ１Ｋ^X チャンネルで一時的に発現しているＣＯＳ７細胞のＢａＣｌ₂誘導脱分極である。図１２．ＡＣＡＳサイトメーター（cytometer）で分析されるＲＯＭＫ１Ｋ^x チャンネルを安定に発現しているＣＯＳ７細胞のグリブリド（Ｇlyburide）誘導脱文極である。図１３Ａ−１３Ｃ．ＦＬＩＰＲで分析されたＡ１０細胞のＫＣｌ依存性脱分極である。好ましい具体例の記載本発明は、機能性カリウムＡＴＰ開閉チャンネルタンパク質をコードするヒトＤＮＡのクローニングおよび単離に関する。一の具体例において、本発明は、イオンチャンネル研究用の発現系としてのアフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵細胞を用いることにより立証されるごとくヒトカリウムＡＴＰ開閉チャンネルタンパク質をコードする機能性ｃＤＮＡクローンをまず単離することよりなる。細胞表面に機能性ヒトカリウムＡＴＰ開閉チャンネルを発現する哺乳動物および細菌細胞系を、薬理学的および生理学的な方法を用いることによって決定し記載する。かくして、このＡＴＰ開閉チャンネルタンパク質ファミリーの特殊なメンバーを研究する初めての明確な細胞系を確立した。もう１つの具体例において、これらのヒトカリウムＡＴＰ開閉チャンネルは、大容量スクリーニング操作するのを示す。定義．本明細書で用いる略語および語句は当業者によく知られたものであろう。いくつかの語句については、以下の節でさらに十分に記載する。Ｉ．機能性ヒトカリウムチャンネルＤＮＡクローンの単離１．ラット腎臓ｃＤＮＡＰvuII/ＢamＨＩ断片の単離（出典明示して本明細書の一部とみなす）ホー，ケイ（Ho，Ｋ）らの方法（「クローニング・アンド・エクスプレッション・オブ・アン・インワードリー・レクティファイング・エイティーピー−レギュレーティッド・ポタシウム・チャンネル（Cloning and expression of an inwardly rectifying ＡＴＰ-regulated potassium channel）」、ネイチャー（Nature）、第３６２巻、３１−３８頁（１９９３年３月４日））を用いて、プラスミドｐＳＰＯＲＴに組み込んだＲＯＭ −Ｋ１と命名したラット腎臓ＡＴＰ−カリウムチャネルｃＤＮＡを得る。プラスミドｐＳＰＯＲＴ由来のこのラット腎臓ＡＴＰ−カリウムチャンネルｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰvuIIおよびＢamＨＩで完全に消化する。ＲＯＭ−Ｋ１の完全なオープン・リーディング・フレームを含有する得られた１.３キロベースのインサートＤＮＡを、分取用アガロースゲル電気泳動により精製する。２．ラット断片の放射性同位元素標識単離したラット腎臓ｃＤＮＡＰvuII/ＢamＨＩ断片を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントの存在下にα−³²Ｐ−ｄＡＴＰおよびランダムヘキサマーを用いて放射性同位元素標識する。３．ヒトＫ−チャンネルｃＤＮＡを含有する組換えバクテリオファージの単離バクテリオファージ・ベクターラムダｇｔ１０中のヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーをイー・コリ（Ｅ.coli）Ｃ６００ｈｆ１^-株に感染させ、４００，０００の独立した組換え体を寒天板にプレートする。寒天板のレプリカをナイロン膜に調製し、変性ファージＤＮＡを焼付けによりフィルター上に固定化させる。該レプリカナイロンを緩衝液中でプレハイブリダイズさせて非特異的な結合サイトをブロックし、次いで、ＲＯＭ−Ｋ１の³²Ｐランダムプライマー標識ＰvuII/Ｂa mＨＩ断片とハイブリダイズさせる。次いで、６５℃にて該フィルターを０.３ＭＮａＣｌ/０.１％ＳＤＳで洗浄する。フィルター上の放射活性を、増感紙と一緒に−７０℃でオートラジオグラフィーに付して測定する。レプリカ上の陽性バクテリオファージを寒天板から単離し、前記のホー（Ho）によるネイチャー（Na ture）の文献に記載のごとく希釈平板および再スクリーニングによりクローン化する。４．クローン化ファージ保存株からのバクテリオファージＤＮＡの調製前記の工程３．からのハイブリダイセーション陽性クローンのクローン化バクテリオファージ保存株を用いて、イー・コリ（Ｅ.coli）に感染させ、次いでＤＮＡを単離することによって、バクテリオファージＤＮＡを調製する。イー・コリ（Ｅ.coli）培養をクローン化ファージで感染させ、バクテリオファージ粒子のポリエチレングリコール沈澱、続いてのバクテリオファージ外皮タンパク質の破壊を組み合わせて感染培養からバクテリオファージＤＮＡを単離する。この方法で調製したバクテリオファージＤＮＡをＥcoＲＩで消化してｃＤＮＡインサートを得る。遊離したインサートｃＤＮＡの大きさは、アガロースゲルでサイズ分画して測定する。次いで、分画したｃＤＮＡを毛管現象によってナイロン膜に移し、前記のごとき、ＲＯＭ−Ｋ１の³²Ｐ−ＰvuII/ＢamＨＩ断片へのハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィーにより相同配列を検出する。５．選択したバクテリオファージＤＮＡの配列決定異なったＥcoＲＩ制限酵素切断パターンを有するクローンから調製したバクテリオファージＤＮＡを選抜し、次いで、サイクル・ジデオキシ鎖停止反応により塩基配列を決定する。該ジデオキシ鎖停止法では、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルズ社（United States Biochemicals）（オハイオ州、クリーブランド（Cleveland，ＯＨ））から入手可能なシークエナーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（^TM））法および製品を用いることができる。その後に、反応生成物を変性ゲルで分離し、分画されたＤＮＡバンドをオートラジオグラフィーで検出し、ゲルをマニュアルで判読する。６．代替ヒトＫ−ＡＴＰチャンネルＤＮＡのクローニングＤＮＡ配列分析により、全ｃＤＮＡ中に含有され、代替５’配列に挟まれた共通のコア−エキソンが明らかにされた。さらに、これらの代替５’配列を、逆転写酵素/ポリメラーゼ鎖反応の（ＲＴ/ＰＣＲ）増幅およびｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）分析の組み合わせを用いて各々の転写産物につき転写開始部位をマッピングすることによって特徴付けた。分けられたコア・エキソン配列（ＨＲＯＭ４）に相補的な合成オリゴヌクレオチド・プライマーならびにＭＭＬＶ逆転写酵素を用いてヒト腎臓全ＲＮＡを逆転写させた。次いで、ｃＤＮＡ産物を、アンカー・プライマー（５’ＲＡＣＥ）またはＫ２６ｃＤＮＡの５’非翻訳配列に特異的なプライマー（ＨＲＯＭ−１０）の一方を用いてＰＣＲ増幅させた。これによりＫ−８、Ｋ１１、Ｋ１１⁺、Ｋ２６およびＫ２６⁺という５つの異なったｃＤＮＡを単離した。該ＰＣＲ産物をプラスミドベクターにサブクローニングし、前記のごとく両鎖の完全な塩基配列を決定した。バクテリオファージｃＤＮＡ配列ならびにＲＴ−ＰＣＲおよび５’ＲＡＣＥ産物の両配列の組合せを用いてＫ−８、Ｋ１１、Ｋ１１⁺、Ｋ２６およびＫ２６⁺ｃＤＮＡの完全な塩基配列を割り当てた（図１〜５）。７．クローンおよび該クローンの選択した誘導体の選択該Ｋ２６クローンのＤＮＡ配列は、３８９アミノ酸残基のタンパク質をコードする一本鎖オープン・リーディング・フレームを含有し、これは１つの重要な相違を有してラット腎臓ＲＯＭ−Ｋ１カリウムチャンネルに対しかなりの配列同一性を示す。Ｎ−末端ドメインに見い出される実際のアミノ酸残基、最初の２６アミノ酸、特に最初の１０アミノ酸は、ラット配列の分析から通常予測されるようなものとは驚くべきかつ予期せぬ相違を示す。タンパク質の形質膜への挿入の前に細胞内の空間に存在するＮ−末端アミノ酸残基は、ラットの配列から予想されるよりも大きなダイバージェンス、すなわち、同一および同様なチャンネルタンパク質で見い出される高い相同性を前提とすると、予想されていたよりもさらに高いダイバージェンスを示す。Ｋ−８ｃＤＮＡが、ラット腎臓ＲＯＭ−Ｋ１チャンネルと同じ長さであるヒト種の相同物をコードしていることに注意されたい。ＲＯＭ−Ｋ１をＫ−８と比較した場合、重要なアミノ酸の相違があり、それに相当するＤＮＡは異なるが、ラットおよびヒトの双方は同様な異なったアミノ酸末端を有する。意義深いことには、Ｋ１１、Ｋ−１１⁺、Ｋ２６、Ｋ２６⁺、および本発明者らがＫ２およびＫ− ６と呼ぶ他の２つのＫ⁺チャンネルタンパク質は、この重要な領域に異なった長さならびに異なった型のアミノ酸を有する。この相違は、ラットの配列のみを前提としても、予期されなかったものである。異なったヒトアミノ酸末端の配列を以下の表１に示す：かくして、Ｋ２は、ＲＯＭ−Ｋ１より８残基少ない配列を有し、一方Ｋ−６は、ＲＯＭ−Ｋ１より７残基多い配列を有する。これらの最初の２６または同様なＮ−末端アミノ酸は、タンパク質の最も重要な多様性領域であり、該タンパク質の残りの部分は高い相同性を有している。このＮ−末端領域における相違は、タンパク質の機能的な相違となりうることが研究から示されている。本明細書で開示したラットＲＯＭ−Ｋ１およびＫ８は、ほとんどもしくは全くＡＴＰ阻害を示さない。内因性のＫ⁺チャンネルは、ＡＴＰによって阻害される。従って、他の変異物のうちの１つがＡＴＰ阻害を示すということはありうる。Ｋ１１は腎臓の肥大上行性肢の中で最も豊富に存在するタンパク質のようである。腎臓では、機能的なＫ⁺チャンネルがＡＴＰにより阻害され、よってタンパク質変異物をＡＴＰによる阻害のテストにかけ、ＡＴＰにより阻害されるタンパク質をＫ⁺遮断剤のスクリーニングに用いることは論理的であろう。他の機能的な相違は、他のＮ− 末端配列と関連しうる。これらの全ヒトタンパク質配列、それらをコードするＤＮＡ、それらの自明な変異物、少なくとも９０％の相同性が期待される以外は保存的置換が可能なそれらの相同配列は、本明細書に記載した発明として包含される。最初の２６または同様なＮ−末端配列、もしくはそれらの不存在または欠損は非常に重要であるが、配列中のいずれの位置にも保存性の置換が予想され、これらの全ては本発明に包含される。 II．ヒトカリウムチャンネルＤＮＡを組み込む適当なベクターの調製１．ｐＧＥＭ７ベクターａ．クローン・コーディング配列の調製ラムダＤＮＡをＫpnＩ/ＡccI、Ｘho/ＡccIまたはＭunIで各々制限酵素消化してＫ−８、Ｋ１１およびＫ２６クローンのオープン・リーディング・フレームを得る。該ＤＮＡ断片を分取用アガロースゲル電気泳動で精製する。ｂ．クローンのプラスミドベクターへの導入該Ｋ−８、Ｋ１１およびＫ２６ｃＤＮＡ断片をｐＳＰ６４−ポリＡ（Ｋ−８およびＫ１１）またはｐＧＥＭ７（Ｋ２６）のどちらか一方のマルチ・クローニング・サイトにサブクローニングして、Ｋ−８/ｐＳＰ６４、Ｋ１１/ｐＳＰ６４またはｐＧＥＭ７/Ｋ２６をそれぞれ得る。２．ｐＳＶＬ/Ｋ２６ベクターａ．ｐＧＥＭ７/Ｋ２６プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＸhoＩおよびＢa mＨＩで二重消化し、得られた断片を分取用アガロースゲル電気泳動で精製する。ｂ．単離したＫ２６のＸhoI/ＢamＨＩ断片を一時的な発現ベクター（transien t expression vector）ｐＳＶＬにサブクローニングして発現プラスミドｐＳＶＬ/Ｋ２６を得る。３．ｐＣＥＰ４ベクターａ．Ｋ２６の全コーディング配列を含有するＸhoＩ/ＢamＨＩ断片を、発現ベクターｐＣＥＰ４にサブクローニングして発現ベクターｐＣＥＰ/Ｋ２６を得る。４．ｐＭＥＰベクターａ．Ｋ２６の全コーディング配列を含有するＸhoＩ/ＢamＨＩ断片を、発現ベクターｐＭＥＰにサブクローニングして発現ベクターｐＭＥＰ/Ｋ２６を得る。５．ｐＭＡＬ２ｃ/Ｋ２６ベクターａ．Ｋ２６の全コーディング配列を、適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に付し、発現に適用させる。ｂ．構築したＰvuII/ＢamＨＩＰＣＲ断片を細菌発現ベクターｐＭＡＬ２ｃにサブクローニングする。ｃ．該ＰＣＲ産物の一体化を、ジデオキシ鎖停止法を用いたＤＮＡ塩基配列決定により確認する。６．ｐＹＥＳＩベクターａ．Ｋ２６の全コーディング配列を、適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に付し、発現に適用させる。ｂ．構築したＮＯＴＩＰＣＲ断片を細菌発現ベクターｐＹＥＳＩにサブクローニングする。ｃ．該ＰＣＲ産物の一体化を、ジデオキシ鎖停止法を用いたＤＮＡ塩基配列決定により確認する。 III．ヒトカリウムチャンネルＤＮＡクローンによりコードされるタンパク質の発現１．ＣＯＳ７細胞におけるＫ２６クローンの一時的な発現ａ．ｐＳＶＬ/Ｋ２６発現プラスミドおよびカチオン性リポソームＤＯＴＡＰを用いてＣＯＳ７細胞をトランスフェクトする。このカチオン性リポソームは、ベーリンガー・マンハイム社（Boehringer Mannheim）（インディアナ州、インディアナポリス（Indianapolis，Indiana））から入手可能である。機能的な発現は、転写分析により確認し、機能的な発現は、トランスフェクトした細胞の静止状態の膜ポテンシャルに対するＢａ²⁺の効果を測定することにより光学的にモニターする。以下の「実施例」を参照せよ。２．卵母細胞におけるＫ２６クローンの一時的な発現ａ．Ｋ−８、Ｋ１１およびＫ２６クローンの卵母細胞発現ｉ．卵母細胞におけるｐＳＰ６４ポリＡ系１．ｐＳＰ６４ポリＡベクターをＥcoＲＩで完全に消化し、その産物をクレノー・ポリメラーゼを用いて満たす。満たすための反応による平滑末端産物をＮ otIリンカーと連結し、ＮotＩで消化してＮotＩサイトを生成させる。２．Ｋ−８、Ｋ１１およびＫ２６ｐＳＰ６４ポリＡプラスミドＤＮＡをＮo tＩで消化して直鎖化し、分取用ゲル電気泳動により精製する。３．ＢamＨＩ−消化ｐＧＥＭ７/Ｋ２６鋳型から、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてセンスｃＲＮＡを合成し、同反応において５’末端をキャップ化する。４．キャップ化ｃＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞にマイクロインジェクションし、７２時間発現させる。５．全細胞および脱着パッチ記録モード（detached patch recording mode ）での電気生理学的な測定によるマイクロインジェクションの７２時間後にカリウムチャンネル活性をモニターする。以下の「実施例」を参照せよ。３．哺乳動物細胞におけるＫ２６ＤＮＡクローンの安定した発現ａ．Ｋ２６の、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト胎児腎臓細胞およびマウスＬ−細胞での発現ｉ．ｐＣＥＰ/Ｋ２６およびｐＭＥＰ/Ｋ２６ベクター発現系１．ｐＭＥＰ/Ｋ２６およびｐＣＥＰ/Ｋ２６発現プラスミドならびにカチオン性リポソームＤＯＴＡＰを用いてチャイニーズハムスター卵巣、ＣＯＳ、ヒト胚児腎臓細胞およびマウスＬ−細胞をトランスフェクトする。２．ハイグロマイシンＢの存在下に該細胞を培養して安定したトランスフェクタントを選抜する。安定したクローン化細胞系を数回サブクローニングしてクローンの継代性を確実とする。トランスフェクトした細胞におけるＫ２６の発現は、Ｋ２６転写産物の分析（ノーザンブロッティング分析およびＲＴ−ＰＣＲ）および機能アッセイを用いて確認する。後者のアッセイは、Ｂａ²⁺添加後にレポーター染色剤ＤｉＢＡＣを用いて膜ポテンシャルの変化を光学的に測定して行う。また、Ｋ２６の発現も電気生理学的な方法により測定する。以下の「実施例」を参照せよ。４．細菌細胞におけるＫ２６ＤＮＡクローンの安定した発現ａ．ｐＭＡＬ２ｃ/Ｋ２６系ｉ．ＤＨ_5aを含有するｐＭＡＬ２ｃ/Ｋ２６プラスミドの発現の誘導は、対数増殖期の培養にＩＰＴＧを添加することにより誘導する。 ii．所望のタンパク質生成物の発現は、誘導した培養から単離した細菌細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認する。 iv．ヒトカリウムチャンネルＤＮＡクローンによりコードされるタンパク質に基づく発現系を用いたバイオアッセイこの節では、ヒト腎臓ＡＴＰ開閉カリウムチャンネルおよび関連のカリウムチャンネルを発現する細菌細胞、酵母細胞および/または哺乳動物細胞を用いて、ヒト腎臓ＡＴＰカリウムチャンネル活性を調節する化合物をスクリーニングする方法ならびに操作について記載する。Ｋ２６で安定してトランスフェクトした哺乳動物細胞をマルチウェル組織培養皿の中で増殖させる。選択する組織培養皿は、９６ウェルである。他の培養皿を用いることもできる。Ｋ２６を発現する哺乳動物細胞の膜ポテンシャルは、電位差感受性の蛍光色素を用いて光学的に測定する。選択する色素は、ビス（１，３ -ジブチルバルビツール酸）トリメチンオキソノール（ＤｉＢＡＣ₄（３））である。また、他の電位差感受性の色素を用いることもできる。膜ポテンシャルの変化は、高いバックグラウンドの非細胞性蛍光に対する細胞性蛍光の変化を測定することにより検知する。全ウェル蛍光ではなく、細胞に関連する蛍光を測定する。一時に全９６ウェルにおいて、高いバックグラウンドの非細胞性蛍光に対する細胞性蛍光の変化を測定することが可能な９６ウェルプレート・リーダーを用いるのがさらによい膜ポテンシャルの変化を測定する系である。ノベルテック社（Novel Tech）（ミシガン州、アン・アーバー（Ann Arbor,Michigan））で製造され、販売されているレーザーシステムＦＬＩＰＲもかかる系の一つである。スクリーニングは、Ｋ２６を発現する細胞に剤を添加することから構成される。Ｋ２６を遮断する剤は細胞を脱分極化させる。Ｋ２６を活性化させる剤は細胞を過分極化させる。特異性はいくつかの方法により決定する。特異性の最初のテストは、目的の剤が偽トランスフェクトした細胞の膜ポテンシャルを調節するか否かを確認することである。これらの細胞として、Ｋ２６をクローン化しているがＫ２６遺伝子産物を発現しないベクターが含有される。特異性の他のテストとして、目的の剤が他のＫ⁺チャンネル活性を調節するか否かを確認することが含まれる。本発明は、前記の記載から当業者に容易に評価され理解されよう。以下の「詳細な実施例」では、本発明実施の最良条件の詳細を提供し、さらに十分に完成発明を説明する。それらは、本発明を限定するものではない。詳細な実施例Ｉ．機能性ヒトカリウムチャンネルＤＮＡクローンの単離１．ラット腎臓ｃＤＮＡＰvuII/ＢamＨＩ断片の単離ホー，ケイ（Ho，Ｋ）らにより記載されている方法（「クローニング・アンド・エクスプレッション・オブ・アン・インワードリー・レクチファイイング・エイティーピー・レギュレイティド・ポタシウム・チャンネル（Cloning and expr ession of an inwardly rectifying ATP-regulated potassium channeｌ）」、ネイチャー（Nature）、第３６２巻、３１−３８頁（１９９３年３月４日））を用いて、ＲＯＭ−Ｋ１と命名したラット腎臓ＡＴＰ−カリウムチャンネルｃＤＮＡを得る。プラスミドベクターｐＳＰＯＲＴ中のＲＯＭ−Ｋ１ｃＤＮＡを、アンピシリン選抜下にイー・コリ（Ｅ.coli）ＤＨ_5a株にて継代する（マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー研究所（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９８２）。精製したプラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＰvuIIおよびＢamＨＩで二重消化し、得られたＲＯＭ−Ｋ１の全オープン・リーディング・フレームを含有する１.３キロベースの断片を、分取用アガロースゲル電気泳動およびその後の単離断片の電気溶出により精製した。２．ラット断片の放射性同位元素標識１.３キロベースの制限断片である、単離したラット腎臓ｃＤＮＡＰvuII/Ｂa mＨＩを、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントの存在下にα−³²Ｐ− ｄＡＴＰおよびランダムヘキサマーを用いて放射性同位元素で標識した（エイ・ピー、ファインバーグ（Ａ.Ｐ.Feinberg））およびビー、フォーゲルシュタイン（Ｂ.Vogelstein）、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）、第１３７巻、２６６頁（１９８４））。３．ヒト陽性バクテリオファージの調製クローンテック社（Clonetech）（カリフォルニア州、パロ・アルト（Palo Al to，California））から購入したバクテリオファージベクターラムダｇｔ１０の中のヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーをイー・コリ（Ｅ.coli）Ｃ６００ｈｆ１^- 株に感染させ、４００，０００の独立した組換え体を寒天板にプレートする。寒天板のレプリカをナイロン膜に調製し、焼付けによってファージＤＮＡをフィルター上に固定化させる。レプリカナイロンを緩衝液中でプレハイブリダイドさせて、非特異的な結合サイトをブロックし、次いで前記のごとく標識した³²Ｐ−標識ＰvuII/ＢamＨＩ断片とハイブリダイズさせる。次いで、該フィルターを６５ ℃にて０.３ＭＮａＣｌ/０.１％ＳＤＳで洗浄する。フィルター上の放射活性の座標は、増感紙を用いた−７０℃におけるオートラジオグラフィーにより検出する。一次スクリーニングから６２個のレプリカ陽性（replicate positive）を同定し、これら各々のレプリカ陽性を限界希釈、次いで寒天培地上での反復プレートならびに前記のごとき³²Ｐ−標識ＲＯＭ−Ｋ１プローブでの再スクリーニングおよびオートラジオグラフィーによりクローン化する。４．クローン化ファージ保存株からのバクテリオファージＤＮＡの調製バクテリオファージＤＮＡは、イー・コリ（Ｅ.coli）に感染させ、次いでＤＮＡを単離することによって、前記工程３からの陽性クローンのクローン化ファージ保存株から調製する。クローン化保存株からのバクテリオファージで感染したイー・コリ（Ｅ.coli）培養を用い、溶菌させ、次いでポリエチレングリコールで沈澱させ、バクテリオファージ外皮蛋白を破壊させることによりバクテリオファージＤＮＡを調製する（マニアティス（Maniatis）ら、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）、コールド・スプリング・ハーバー研究所（Col d Spring Harbor Laboratory）、１９８２）。精製したバクテリオファージラムダＤＮＡをＥcoＲＩで分解して分画化ｃＤＮＡを得る。アガロースゲル上でサイズ分画して、遊離したインサートｃＤＮＡの大きさを測定する。次いで、分画化ｃＤＮＡを毛管作用によりナイロン膜に移して、前記のごとき³²Ｐ−ＰvuII/Ｂa mＨＩ断片へのハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィーにより相同性配列を検出する（サザン，イー（Southern，Ｅ）、モレキュラー・バイオロジー（Mol.Biol.）、第９８巻、５０３頁（１９７５））。相同性ＤＮＡ配列は、ＲＯＭ−Ｋ１コーディング配列の種々の部分由来の³²Ｐ−標識ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせ、次いで前記のごとく軽く洗浄することにより検出する。次いで、単一のハイブリダイゼーションパターンを示すファージＤＮＡをＤＮＡ配列分析に付す。５．選抜したバクテリオファージＤＮＡの塩基配列決定異なったＥcoＲＩ制限酵素パターン（restriction pattern）を示すクローンからのバクテリオファージＤＮＡを選抜し、次いでサイクル・シークエンシングジデオキシ−鎖停止反応（パーキン・エルマー−セータス社（Perkin Elmer-Ｃe tus）（コネチカット州、ノーウォーク（Norwalk,Connecticut））製、アンプリタック・キット（AmpliTaq kit））を用いてバクテリオファージＤＮＡから直接各々のバクテリオファージのＤＮＡ配列を決定する。反応生成物を１メーターの変性ポリアクリルアミドゲル上で解像し、次いで分画化ＤＮＡをオートラジオグラフィーにより検出する。次いで、ＤＮＡ配列をマニュアルで判読する。６．ヒト腎臓転写物５’末端のマッピングヒトの腎臓のライブラリーから単離されたバクテリオファージのｃＤＮＡの塩基配列の分析により、種々の５’末端配列に融合した共通のコアエキソンが明らかにされた。これらのｃＤＮＡを生じさせる転写物を、さらにＫ−チャンネルの転写物のポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と結び付けた逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成によって解析した。第一鎖のｃＤＮＡ合成は、オリゴｄＴとＭＭＬＶ逆転写酵素（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ，ガイセルバーグ、メリーランド（Bethesda Research Laboratories，Gaitherburg，Maryland））を用いて起点としヒト腎臓全ＲＮＡ鋳型を用いてなされた。第一鎖ｃＤＮＡ産物の一部を、Ｋ−８またはＫ１１／Ｋ２６のｃＤＮＡのいずれかに特異的な５’末端のオリゴヌクレオチド・プライマーと組み合わせ、コアーエキソン（ＨＲＯＭ−４）に特異的な、共通の３’末端オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。これらのＰＣＲ増幅の反応物を、アガロースゲル電気泳動で、大きさにより分別し、電気溶出により回収した。おのおのの個々の断片を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントを用いて平滑末端化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、ＳｍａＩ消化したｐＵＣ１９にサブクローン化した。おのおののサブクローン化したＰＣＲ産物の塩基配列を、シーケナーゼ^TM（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ^TM）、（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルズ、クリーブランド、オハイオ州（United States Biochemicals，Cleveland，Ohi o））を用いてジデオキシ鎖停止法により決定した。合成ｃＤＮＡ配列をこのｃＤＮＡ配列とＲＴ−ＰＣＲ産物から得られた配列の組み合わせにより構築し、これは図２に示される。本発明者らの分析によりヒトの腎臓中の５個の別個の転写物が明らかとされた。７．クローンの選択．ヒト腎臓ＲＮＡから単離した５個の別個の転写物によってコードされるオープン・リーディング・フレームの翻訳により、これらは潜在的にヒト腎臓Ｋ_ATPチャンネルタンパク質の、三種のアミノ末端の変種をコードすることが示された。おのおのの転写物は二つの前述した膜貫通ドメイン、すなわちシェイカーＫ−チャンネルＨ５ドメイン（Shaker K-channel H5 domain）と、予測される一つのＡＴＰ結合部位に対し、注目すべき相同性を示す領域、の存在を含む、全てのＫ_AT _P チャンネルタンパク質であることの証明を備えた蛋白質をコードしていた。クローンＫ−８は、９２％以上がラット腎臓ＲＯＭ−Ｋ１に同一である３９１アミノ酸タンパク質をコードする１１７３塩基対のオープン・リーディング・フレームを含んでいた。クローンＫ２６は、アミノ末端（１０アミノ酸残基）が完全に別個である以外は、Ｋ−８に同一である３８９アミノ酸残基の蛋白質をコードする単一のオープンーリーディング・フレーム（１１６７塩基対）を含んでいた。最終的に、クローンＫ１１、Ｋ１１⁺およびＫ２６⁺のすべてが同じ３７２残基のチャンネルタンパク質をコードしており、これはそれぞれＫ−８およびＫ２６からの、アミノ末端の１９または１７残基を欠失したＫ−８またはＫ２６のアミノ末端の不完全な形であった。それそれのＤＮＡ配列を哺乳動物細胞での発現（ｐＣＥＰまたはｐＭＥＰ）、卵母細胞での発現（ｐＳＰ６４−ポリＡ）、細菌での発現（ｐＭＡＬ２ｃ）または酵母での発現（ｐＹＥＳ）のためのベクターで発現させるために開発し、それぞれの構築物を適当な宿主で、種々のヒト腎臓Ｋ_ATPチャンネルを発現するために用いた。８．クローンの精製．Ｋ２６ラムダＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＭｕｎＩで消化し、１．３キロベースの断片を分取用アガロースゲル電気泳動で精製した。 II．ヒトのカリウムチャンネルＤＮＡを組み込んだ適当なベクターの調製１．ｐＧＥＭ７ベクター．１.３キロベースのＭｕｎＩ制限酵素断片を、プラスミドベクターｐＧＥＭ７のＥｃｏＲＩサイトにサブクローンした。ｃＲＮＡキャッピング．ｐＧＥＭ７／Ｋ２６プラスミドをＢａｍＨＩで線状にした。線状にしたプラズミドを次いで転写し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、７ＭｅＧｐｐｐ５ ’Ｇでキャップした。２．ｐＳＶＬ／Ｋ２６ベクター．ｐＧＥＭ７／Ｋ２６プラスミドをＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで二重消化し、得られた断片をｐＳＶＬにサブクローンしてｐＳＶＬ／Ｋ２６を得た。３．ｐＣＥＰ４ベクター．Ｋ２６のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をプラスミドベクターｐＣＥＰにサブクローンして、ｐＣＥＰ／Ｋ２６を得る。４．ｐＭＥＰベクター．Ｋ２６のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をプラスミドベクターｐＭＥＰにサブクローンして、ｐＭＥＰ／Ｋ２６を得る。 II．ヒトのカリウムチャンネルＤＮＡクローンによりコードされる蛋白質の発現．１．ＣＯＳ７細胞におけるＫ２６クローンの一時的な発現．ｐＧＥＭ７／Ｋ２６プラスミドを、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで完全に消化し、Ｋ２６のコーディング配列を含む１．３ｋｂの断片を分取用アガロースゲル電気泳動で単離した。この断片をプラスミドベクターｐＳＶＬに連結し、連結による生成物をコンピテントなイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αの細胞を形質転換するのに用いた。ｐＳＶＬ／Ｋ２６発現プラスミドを適当なクローンから調製し、精製したｐＳＶＬ／Ｋ２６プラスミドＤＮＡを、カチオン性リポソーム・ＤＯＴＡＰ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、インディアナ（Boehringer Mannheim，Indianapolis，Indiana））を用いて、ＣＯＳ７細胞を形質転換するのに用いた。チャンネル活性をトランスフェクション後、４８〜７２時間検出した。２．哺乳動物細胞におけるＫ２６ＤＮＡクローンの安定な発現．ａ．Ｋ２６のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、アフリカミドリザルの腎臓の細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚児腎臓およびマウスＬ−細胞での発現。ｉ．ｐＣＥＰ／Ｋ２６またはｐＭＥＰ／Ｋ２６の発現プラスミドを、カチオン性リポソーム・ＤＯＴＡＰを用いて、ＣＯＳ７細胞あるいはヒト胚性腎臓細胞（２３９細胞）をトランスフェクトするのに用いた。トランスフェクト後２０時間で、細胞を、トランスフェクトされていない細胞を殺すために０．１５〜０．５ｍｇのハイグロマイシンＢで処理した。おのおののセルラインはシングル・セル・クローニングによって単離した。３．Ｋ−８、Ｋ１１およびＫ２６ｃＲＮＡの、アフリカツメガエル卵母細胞における機能的発現．われわれは、アフリカツメガエルの卵母細胞における発現によって、Ｋ−８，Ｋ１１およびＫ２６ポリペプチドの電気生理学的特性を実験した。ポリアデニル化したｃＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ溶液の４５ｎｌ）を卵母細胞に注入し、４８〜７２時間発現させた。Ｋ−８、Ｋ１１、またはＫ２６に注入後４８時間後に、卵母細胞はそれぞれ、−９０.０８±１.９０ｍＶ（ｎ＝９）、−９７.２±０ｍＶ（ｎ＝１）、および−８８.７５±０.４５ｍＶ（ｎ＝２）の静止膜電位を示し、これは比較的変化せず第三日には８７.８９±１.５７ｍＶ（ｎ＝７）および− ９３±０.７９ｍＶ（ｎ＝７）および−８８.４±２.１１ｍＶ（ｎ＝４）であった。水を注入した対照の卵母細胞は、約−４０ｍＶの平均静止膜電位を示した。ＲＯＭ−ＫｃＲＮＡを注入した卵母細胞の、かなりさらに負の電位は、これらのチャンネルの機能的発現によっており、これらの値は推量されるＫのグラジエント（２ｍＭ細胞外／１００ｍＭ細胞内）から計算したＫ平衡電位に近い。電流を、発現しているＫ−８，Ｋ１１およびＫ２６のｃＲＮＡを発現している卵母細胞を用いて、二つの微小電極による電気固定法の方法により記録し、結果を図７Ａ−Ｆに示す。図７Ａ，７Ｂおよび７Ｃには、それそれＫ−８，Ｋ１１およびＫ２６を注入した卵母細胞からの５０ｍＭ外部Ｋ⁺中で記録した典型的な電流の記録を示す。図７Ｄ，７Ｅおよび７Ｆにおいて、Ｙ軸はマイクロアンペアでの電流であり、Ｘ軸はミリボルトでの膜電位である。この対応するＩ−Ｖの関係を、図７Ｄ，７Ｅおよび７Ｆにおいて中抜き丸で示す。全ての場合において、保持電位−２０より正の電位での電流は外部へ向かっており、−２０ｍＶより負の電位での電流は内部に向かっていた。内部へ向かう電流の振幅は常に外部へ向かう電流の振幅より大きく、これは内方への整流を起こしていた。これらのクローン化したチャンネルの電流の活動のタイムコースは、二つの異なったフェーズで似ている：急速な、ほとんど瞬間的なフェーズと、それに続くゆっくりした、時間に依存したフェーズである。一度活性化されると、電流はどちらの方向でも衰退したり不活性化させたりしない。１ｍＭのＢａ²⁺は、選択的に、Ｋ−８で最も顕著な、時間と電圧に依存した方法で、内部電流を妨げる（図７Ｄ，７Ｅ，および７Ｆ、黒丸）。Ｂａ²⁺による阻害は、流出に次いで逆転する（図７Ｄ，７Ｅおよび７Ｆ、中抜き四角）。外方電流に対するＢａ²⁺の効果の欠失は、外部に移動する、競合するＫ⁺イオンによって、そのチャンネル結合部位からのＢａ²⁺の”ノック−オフ”効果を示唆するであろう。チャンネルのＫ⁺選択性を考察するために、外部のＫＣｌ濃度を５ｍＭから１００ｍＭに増加させ、コリンＣｌを、重量オスモル濃度を維持するために置換した。図８Ａ〜８Ｆに示される結果は、Ｋ−８，Ｋ１１およびＫ２６についての逆転電位（Ｅ_rev）と、外部Ｋ⁺濃度の間の関係を説明する（それぞれ図８Ａ，８Ｂおよび８Ｃ）。図８Ａ〜８Ｃにおいて、Ｙ軸はミリボルトでの逆転電位（Ｅ_re _v ）であり、Ｘ軸はミリモーラーでのカリウム濃度である。このデータはネルンストの関係に適合し、Ｋ−８に対しては５７.８７ｍＶ、Ｋ１１に対しては５７. ４５ｍＶ，Ｋ２６に対しては５３.５３ｍＶの、Ｋ⁺濃度の１０の位当たりの変化の傾きを生じ、この全てが室温におけるＫ⁺選択的電極に対する理論的な値である５８ｍＶの中にあった。内方に整流したカリウムチャンネル中の膜コンダクタンス、ｇ_kは、［Ｋ⁺］₀ が上昇するにつれて増加する。膜コンダクタンス、ｇ_kと、［Ｋ⁺］₀との間の関係は、ｇ_k＝Ｃ［Ｋ⁺］₀ ^z で表され、ここでＣは比例定数であり、［Ｋ⁺］₀はｍＭで表される外部のＫ⁺の濃度であり、Ｚはべき指数因子である。本発明者らは、これらのチャンネルの傾きのコンダクタンスを、５、１０、２５、５０および１００ＫＣｌ（ｍＭで）を含む溶液中で測定し、その結果を図８Ｄ，８Ｅ，および８Ｆに、それぞれＫ−８，Ｋ１１，Ｋ２６について示した。図８Ｄ，８Ｅ，および８Ｆにおいて、Ｙ軸はｇ／ｇ_maxであり、Ｘ軸は［Ｋ⁺］₀である。チャンネルコンダクタンスと外部［Ｋ⁺］との関係は、非線形であり、高［Ｋ⁺］では減少する。Ｋ−８，Ｋ１１，Ｋ２６のそれぞれに対するＺの値の平均値は、０.３９６±０.０５（ｎ＝５）、０.３８３±０.０９７（ｎ＝５）、および０.４８８±０．０１（ｎ＝４）である。これらの結果は、内方へ整流するチャンネルを通ってのＫ⁺イオンの浸透は、独立の法則から外れており、これはチャンネル内でのイオン−イオン相互作用が起こっていることを意味するという結論をさらに支持する。４．哺乳動物細胞における、チャンネル活性の光学上の測定．本発明者らは、また哺乳動物細胞における瞬間的な、また安定なトランスフェクションの双方におけるＫ２６の機能的発現を実験した。最初に、Ｋ２６のＫ⁺ チャンネルの発現の機能的発現を、電圧に感受性の染料と、細胞内の蛍光での変化を記録するための器械を用いて決定した。選択した染料はビス（１，３−ジブチルバルビツール酸）トリメンチンオキソノール）ＤｉＢＡＣ₄（３）である。他の、電圧に感受性の染料を用いることもできた。膜電位の変化を光学的に測定するために、細胞をカバーグラスのチャンバー上で継代培養し、密集するまで増殖させた。分析の直前に、細胞を２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ＥＢＳＳ−Ｈ）でｐＨ７.４に緩衝化したアールの平衡塩類溶液で数回洗浄し、次いで５μＭＤｉｂａｃ₄（３）を含む同緩衝液に入れた。膜電位の蛍光イメージングを、細胞を５μＭのＤｉｂａｃ₄（３）で３７℃において１５分間平衡化し、次いでレーザーを基礎とする、イメージング・サイトメーター（ＡＣＡＳ５７０，メリディアンインスツルメンツ（Meridian Instruments））の台に据え付けた３５ ℃に温度を制御したミニ−インキュベーターに入れた後に行った。ＡＣＡＳ５７０は、細胞をアルゴンイオンレーザーを用いて４８８ｎｍで励起するよう作られている。蛍光の放射を、５３５ｎｍにおいて、４９５ｎｍのＬＰジクロイックラーと、５２５ｎｍを中心とする１０ｎｍのバンドを通すフィルターを用いて集めた。全ての場合において、データをＡＣＡＳソフトウェアの内部にある動的プログラム（Kinetic program）を用いて少なくとも２５分間、毎６０秒ごとに集めた。蛍光の変化をアップジョン・ラボラトリーズ（Upjohn Laboratories）で開発した記号論理学のモデルを用いて計算した。対照の実験によって、ジメチルスルホキシドやエタノールのごとき溶媒の添加は０.８％（ｖ／ｖ）までの濃度では効果がないことが確認された。エップスら（Epps et．al.）による以前の研究（ケミストリー・アンド・フィジックス・オブ・リピッズ（Chemistry and Physics of Lipids）、出版中１９４４年）によって、光学的膜電位の分析が定量的であることを示している蛍光の変化と膜電位の変化の間の線形の関係を確認した。他のイメージング機器および／またはスペクトロフルオロメーターもまた、膜電位における変化を光学的に測定するのに使用できる。Ｋ２６の場合について、第三章（３）のデータは、異種発現させたＫ２６のＫ⁺ チャンネルは、開く確率が非常に高いことを示す。これらのデータにより、Ｋ２６のＫ⁺チャンネルを発現する細胞にもしＫ⁺チャンネル阻害剤を添加すると、チャンネルを発現する細胞の膜電位は、脱分極することが予測される。図９のデータによりこの予測が確認される。図９〜１２Ｂにおいて、ＲＦと示されるＹ軸は、相対蛍光であり、Ｔと示されるＸ軸は、分（ｍｉｎ）での時間である。グリブリドやグリピジド等の化合物（例えば図１２Ａや１２Ｂ）を細胞の溶液に添加する場合、当該添加は７分に等しい時間で行った。図９のデータは、１ｍＭのＢａ⁺⁺を、一時的にＫ２６Ｋ⁺チャンネルを発現している（中抜き三角；図９）ＣＯＳ７細胞に添加した時（矢印；図９）、膜電位は脱分極することを確実にした。ホー（Ho）らの以前の研究によって、内方に整流するＫ⁺チャンネルの、Ｋ２６クラスをＢａ⁺⁺が阻害することが確立されている。１ｍＭのＢａＣｌ₂を野生型のＣＯＳ７細胞に添加したとき（矢印；図９）、膜電位に対しほとんど効果がない（黒丸；図９）。これらのデータによって、野生型ＣＯＳ７細胞は、Ｂａ⁺⁺感受性のイオンチャンネルを発現せず、かくして、それらをＫ⁺チャンネル発現の研究のための優れた感受性のある細胞にすることが示される。Ｋ２６Ｋ⁺チャンネルはまた哺乳動物細胞でも安定に発現され得る。図１０でのデータに示されるように、３ｍＭＢａＣｌ₂（矢印；図１０）をＫ２６ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に添加したとき（中抜き三角；図１０）、膜電位は脱分極した。この実験で、Ｋ２６を発現しているＨＥＫ２９３細胞は、１６回継代し、これはＫ２６が安定に発現したことを示す。３ｍＭのＢａＣｌ₂（矢印；図１０）を野生型ＨＥＫ２９３細胞に添加したとき（黒丸；図１０）、膜電位に対し効果がなかった。電気生理学的研究により、光学的膜電位の分析からの結論が確認される。これらを一緒にすると、これらのデータは、哺乳動物細胞においてこのチャンネルを発現した時に、Ｋ２６Ｋ⁺チャンネル活性を阻害する新しい化学的実在を見い出すのに、光学的膜電位分析を用いることができることを示す。５．Ｋ２６Ｋ⁺チャンネル活性を阻害する薬剤についての、大量スクリーニングの開発本発明者らは、Ｋ２６Ｋ⁺チャンネル活性を阻害する新しい化学的実在を見い出すために、大量スクリーニングを開発してきた。このスクリーニングの鍵となる特徴は、Ｋ２６または関連したカリウムチャンネルタンパク質を発現しているＣＯＳ７またはＨＥＫ２９３細胞を脱分極する、新しい化学的実在を見い出すために、第三章（４）で述べた光学的膜電位の分析を用いることである。スクリーニングで用いる最も良いＫ⁺チャンネルタンパク質は、そのＡＴＰに対する感受性のために、Ｋ１１タンパク質であるであろうことに注意するべきである、［第一章、第七部の、実験の詳細の、クローンの選択と選択した誘導体を参照］。この開示されたクローンの全てと最初のほぼ３０あるいはアミノ酸の自明な変種とは、Ｋ⁺チャンネル阻害剤をスクリーニングするために用いられるであろうということが予想される。選択的にするためには、Ｋ２６（またはＫ１１等）Ｋ⁺チャンネルを発現している細胞を脱分極する薬剤は、野生型の細胞あるいは偽トランスフェクトした対照細胞に対してほとんどないしは全く効果を示してはならない。逆に、もし、Ｋ２６（またはＫ１１等）Ｋ⁺チャンネルを発現するか否かにかかわらず、ＣＯＳ７およびＨＥＫ２９３の両細胞を脱分極する新しい化学的実在が見い出されれば、この新しい化学的実在はＫ２６（あるいはＫ１１等）につき選択性を持たないと結論されるであろう。かくして、Ｋ⁺の阻害の選択性は、Ｋ２６（またはＫ１１等）を発現しているか、あるいはしていない同一細胞タイプの対の比較により判定されるであろう。この方法では、膜電位の変化の非特異的測定を用いて、選択的にＫ２６（またはＫ１１等）Ｋ⁺活性を阻害する新しい化学的実在を見い出すことができる。選択の操作。図１１に示されるデータは、ＲＯＭＫ１Ｋ⁺チャンネルを、一時的にＣＯＳ細胞で発現させた時（黒丸；図１１）、２ｍＭのＢａＣｌ₂の添加（矢印；図１１）は、膜電位の脱分極を引き起こすことを示す。２ｍＭのＢａＣｌ₂の添加（矢印；図１１）は、野生型ＣＯＳ７細胞にほとんど効果を示さなかった（中抜き丸；図１１）。これらのデータは、ＲＯＭＫ１およびＫ２６の両Ｋ⁺チャンネルが、Ｂａ⁺⁺に感受性であることを示す。さらに、本発明者らは、Ｋ_ATPチャンネルを阻害することが知られているスルホニル尿素である１００μＭのグリブリドの添加（矢印；図１２Ａ）が、ＲＯＭＫ１Ｋ⁺（中抜き三角；図１２Ａ）を安定に発現しているＣＯＳ７細胞の脱分極を引き起こすことを見い出した。１００μＭのグリブリドの野生型ＣＯＳ７への添加（黒丸；図１２Ａ）は、過分極を起こした。これらのデータは、グリブリドがＣＯＳ７細胞で発現しているＲＯＭＫ１チャンネルを阻害していることを示す。薬理学的選択性を決定するために、本発明者らはグリブリドに密に関連する他のスルホニル尿素の効果も実験した。図１２Ｂのデータは、１００μＭのグリピジドの添加（矢印；図１２Ｂ）は、ＲＯＭＫ１Ｋ⁺チャンネルを発現しているＣＯＳ７細胞の膜電位に対して全く効果も持たないことを示す（黒丸；図１２Ｂ）。それに加え、１００μＭのグリピジドの添加（矢印；図１２Ｂ）は、野生型ＣＯＳ７細胞の膜電位に全く効果も持たなかった（中抜き三角；図１２Ｂ）。これらのデータを合わると、光学的膜電位分析は、異種発現されたＫ⁺チャンネルと特異的に相互作用する化学的系列の中の化合物を見い出すことができることを例証している。Ｋ２６または（Ｋ１１）Ｋ⁺活性を選択的に阻害する新しい化学的実在を迅速にスクリーニングするために、本発明者らはＦＬＩＰＲ（ノーベルテック、アン・アーバー、ミシガン州（NovelTech，Ann Arbor，MI））と呼ばれる、新しく開発された９６ウェルの蛍光イメージング・プレート・リーダーを用いた。この機器は、おのおのの９６ウェルのマイクロテストプレートの各ウェル中の膜電位の変化を、同時に、光学的に測定できる［図１３Ａ参照］。溶媒の対照をＡ１０平滑筋細胞に添加したとき（７分；図１３Ａ）、膜電位にはほとんど効果を持たない（図１３Ａの全ての線）（Ａ１０平滑筋細胞はジ・アメリカン・タイプ・ティッシュー・コレクション（The American Type Tissue Collection ）、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４７６）から入手可能である）。図では示されていないが、図１３Ａ、１３Ｂおよび1３ＣのＹ軸は、最大の反応のパーセントを示し、Ｘ軸は時間（分）で表わされる時間（Ｔ）を示す。３ｍＭのＫＣｌを５ｍＭＫＣｌ中で増殖しているＡ１０平滑筋細胞に添加したとき（７分；図１３Ｂ）、膜電位での小さいが、統計上有意な変化があった（図１３Ｂの全ての線）。３０ｍＭのＫＣｌをＡ１０平滑筋細胞に添加したとき（７分；図１３Ｃ），膜電位に大きな変化があった（図１３Ｃの全ての線）。このデータは、光学的膜電位の分析が、細胞の膜電位を変える薬剤を検出するのに使用できることをはっきりと示している。光学的スクリーニングの方法は、光学的膜電位の分析とＦＬＩＰＲとを、ＣＯＳおよびＨＥＫ２９３で発現されたＫ２６（またはＫ１１）Ｋ⁺チャンネルの活性を阻害する新しい化学的実在を見い出すために用いることである。要約すると、このスクリーニングは以下の工程に従って操作できる：１）クローン化されたＫ２６（またはＫ１１）Ｋ⁺チャンネルを発現している細胞を、密集するまで９６ウェルのマイクロテストプレートで増殖させる。２）細胞を、２０ｍＭＨＥＰＥＳを含むアールの平衡塩類溶液中の５μＭＤｉＢＡＣ₄（３）で平衡化する。３）それぞれのウェルのベースラインの測定を記録する。４）一つの試験化合物あるいは試験化合物のカクテルをそれぞれのウェルに添加し、膜電位の変化を記録する。５）次いで、Ｋ２６を発現している細胞を脱分極する化合物を、野生型あるいは偽トランスフェクトした対照に対し試験して選択性を確立する。６）Ｋ２６を選択的に阻害することが示された化合物を動物モデルで利尿効果を試験することになる。このスクリーニングの方法で、１カ月あたり５０００以上の化合物を分析できる。配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人：ジ・アップジョン・カンパニー（The Up john Company）、マイク・ジェイ・ビエンコウスキ（Mike J．Bienkowski）、ビンス・イー・グロッピ，ジュニア（Vince E．Groppi，Jr.）（ii）発明の名称：腎臓ＡＴＰ−依存性ナトリウムチャンネルをコードするヒトＤＮＡ配列（iii）配列の数：５（iv）対応する住所：（Ａ）住所：アップジョン・コープラット・インタレクチュアル・プロパティー・ロー（Upjohn Corporate Intellectual Property Law）（1920-32-1）（Ｂ）通り：ヘンリエッタ・ストリート３０１番（301 Henrietta Street ）（Ｃ）市：カラマズー（Kalamazoo）（Ｄ）州：ミシガン（Michigan）（Ｅ）郵便番号：４９００１（ｖ）コンピュータ判読形態：（Ａ）ミディアム・タイプ：フロッピー・ディスク（Ｂ）コンピューター：アイビーエム・ピィシィ・カンパタブル（IBM PC Compatible）（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテンティン・リリース＃１.０（Patentin Release ＃1.0）、バージョン＃１.２５（Version ＃1.25）（vi）当該出願の情報：（Ａ）出願番号：ＵＳ（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）優先する出願のデータ：（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／０２１,６１６（Ｂ）出願日：１９９３年２月１９日（viii）代理人の情報：（Ａ）氏名：ウートン，トマス・エイ（Wootton，Thomas A）（Ｂ）登録数：３５,００４（Ｃ）リファランス／ドキット番号：４７５０.１ＣＰ（ix）電気通信情報：（Ａ）電話：６１６３８５−７９１４（Ｂ）テレファックス：６１６３８５−６８９７（Ｃ）テレックス：２２４４０１ＵＰＪＯＨＮ（２）配列番号：１（ｉ）配列特性：（Ａ）配列の長さ：１７４０塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iv）アンチセンス：Ｎｏ（ｖ）フラグメント型：Ｎ-末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（vii）直接の起源：（Ａ）ライブラリー名：ヒト腎臓ｃＤＮＡ（Ｂ）クローン名：Ｋ２６（viii）配列：配列番号１（３）配列番号：２（ｉ）配列特性：（Ａ）配列の長さ：１８３２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iv）アンチセンス：Ｎｏ（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（vii）直接の起源：（Ａ）ライブラリー名：ヒト腎臓ｃＤＮＡ（Ｂ）クローン名：Ｋ２６Ｐ（viii）配列：配列番号２：（４）配列番号：３の情報（ｉ）配列特性：（Ａ）配列の長さ：１６７１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iv）アンチセンス：Ｎｏ（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（vii）直接の起源：（Ａ）ライブラリー名：ヒト腎臓ｃＤＮＡ（Ｂ）クローン名：Ｋ１１（xi）配列：配列番号３：（４）配列番号：４の情報（ｉ）配列特性：（Ａ）配列の長さ：１７０３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iv）アンチセンス：Ｎｏ（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（vii）直接の起源：（Ａ）ライブラリー名：ヒト腎臓ｃＤＮＡ（Ｂ）クローン名：Ｋ１１Ｐ（xi）配列：配列番号４：（５）配列番号：５の情報（ｉ）配列特性：（Ａ）配列の長さ：１５９１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ（iii）ハイポセティカル配列：Ｎｏ（iv）アンチセンス：Ｎｏ（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（vii）直接の起源：（Ａ）ライブラリー名：ヒト腎臓ｃＤＮＡ（Ｂ）クローン名：Ｋ８（xi）配列：配列番号５：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 9452−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｋ−８、Ｋ−１１もしくはＫ−１２と命名されたクローンからの、またはその自明な変形から選択された誘導体からの図１、２、３、４または５で示した配列を有するか、Ｋ−８、Ｋ−１１またはＫ−１２と命名されたクローンまたはその明らかな種々の変形から選択される誘導体からの配列を有するか、表１に示されたＮ末端タンパク配列をコードするＤＮＡを有するか、あるいはＫ−２、Ｋ −６、Ｋ−８、Ｋ−１１もしくはＫ−２６と命名されたクローンからの配列および表１には示されていないが図１〜５に示されている残りのＤＮＡを有するか、あるいは図１〜５に示したＤＮＡによってコードされたタンパク質、または図６または表１に示されているタンパク質のいずれかの欠損を含めた約最初の２６個のＮ末端アミノ酸のいずれかをコードするＤＮＡを有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ分子、またはその前記ＤＮＡ分子のいずれかに９０％相同のＤＮＡ分子。２．クローンＫ２６を記載し、図１に示す配列、または図１とほぼ同一の配列、または図１からの自明な変形配列を有し、請求項１のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項１記載の単離したＤＮＡ分子、またはその９０％相同性ＤＮＡ分子。３．クローンＫ２６−プラスを記載し、図２に示す配列、または図２とほぼ同一の配列、または図２からの自明な変形配列を有し、請求項１のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項１記載の単離したＤＮＡ分子、またはその９０％相同性DＮＡ分子。４．クローンＫ１１を記載し、図３に示す配列、または図３とほぼ同一の配列、または図３からの自明な変形配列を有し、請求項１のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項１記載の単離したＤＮＡ分子、またはその９０％相同性ＤＮＡ分子。５．クローンＫ１１−プラスを記載し、図４に示す配列、または図４とほぼ同一の配列、または図４からの自明な変形配列を有し、請求項１のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項１記載の単離したＤＮＡ分子、またはその９０％相同性ＤＮＡ分子。６．クローンＫ−８を記載し、図５に示す配列、または図５とほぼ同一の配列、または図５からの自明な変形配列を有し、請求項１のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項１記載の単離したＤＮＡ分子、またはその相同性ＤＮＡ。７．クローンＫ−２を記載し、表１のタンパク質配列、または表１に示される配列とほぼ同一の配列、または表１に示されるＫ−２のタンパク質配列につきコードするＤＮＡの自明な変形、またはその配列に対し９０％相同のＤＮＡ分子を有し、かつ図１〜６で示される配列に９０％相同の残りの配列を有し、かつＲＯＭ−Ｋ１もしくはＫ８のＮ−末端配列からの、すなわちタンパク質配列ＭＦＫＨＬＲ等からの２０個のアミノ酸で始まる配列で開始する請求項１記載のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項１記載の単離されたＤＮＡ分子。８．クローンＫ−６を記載し、表１のタンパク質配列、または表１に示される配列とほぼ同一の配列、または表１に示されるＫ−２のタンパク質配列につきコードするＤＮＡの自明な変形、またはその配列に対し９０％相同のＤＮＡ分子を有し、かつ図１〜６で示される配列に９０％相同の残りの配列を有し、かつＲＯＭ−Ｋ１もしくはＫ８のＮ−末端配列からの、すなわちタンパク質配列ＭＦＫＨＬＲ等からの２０個のアミノ酸で始まる配列で開始する請求項１記載のヒト腎臓カリウムチャンネルをコードする請求項１記載の単離されたＤＮＡ分子。９．請求項１記載のＤＮＡ分子からなるベクター。１０．請求項１記載のＤＮＡ分子からなるプラスミド。１１．細菌細胞での発現に適合する請求項９記載のベクター。１２．哺乳動物細胞での発現に適合する請求項９記載のベクター。１３．酵母細胞での発現に適合する請求項９記載のベクター。１４．細菌細胞での発現に適合する請求項１０記載のプラスミド。１５．哺乳動物細胞での発現に適合する請求項１０記載のプラスミド。１６．酵母細胞での発現に適合する請求項１０記載のプラスミド。１７．請求項１４記載のプラスミドからなる細菌細胞。１８．請求項１５記載のプラスミドからなる単離哺乳動物細胞。１９．請求項１６記載のプラスミドからなる酵母細胞。２０．請求項１７記載の細菌細胞を用いて、ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節する化合物をスクリーニングする方法。２１．請求項１８記載の単離哺乳動物細胞を用いて、ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節する化合物をスクリーニングする方法。２２．以下の工程：ａ）クローン化Ｋ⁺チャンネルを発現する細胞を密集するまで増殖させ、ｂ）ａ）の細胞を平衡塩溶液で平衡化し、ｃ）該平衡化細胞のベースライン測定を行い、ｄ）一のテスト化合物またはテスト化合物のカクテルを該細胞に添加し、膜ポテンシャルの変化を記録し、ｅ）野生型または偽トランスフェクトした対照に対しＫ⁺を発現する細胞を脱分極化させる化合物をテストして、選択性を確立し、ｆ）選択的にＫ⁺をブロックすることが示される化合物を選択することを特徴とする請求項２１記載の方法。２３．以下の工程：ａ）９６穴マイクロプレートでクローン化Ｋ８、Ｋ１１、Ｋ２６または関連するＫ⁺チャンネルを発現する細胞を密集するまで増殖させ、ｂ）ａ）の細胞を、２０ｍＭＨＥＰＥＳを含有するアール（Earle）平衡塩液中の５μＭのＤｉＢＡＣ₄のごとき平衡塩溶液で平衡化し、ｃ）該平衡化細胞のベースライン測定を行い、ｄ）一のテスト化合物またはテスト化合物のカクテルを該細胞に添加し、膜ポテンシャルの変化を記録し、ｅ）野生型または偽トランスフェクトした対照に対しＫ⁺を発現する細胞を脱分極させる化合物をテストして、選択性を確立し、ｆ）選択的にＫ⁺をブロックすることが示される化合物を選択することを特徴とする請求項２１記載の方法。２４．請求項１９記載の酵母細胞を用いて、ヒト腎臓カリウムチャンネル活性を調節する化合物をスクリーニングする方法。２５．Ｋ−８、Ｋ−１１、もしくはＫ−１２と命名されたクローン、またはその自明な変形から選択された誘導体からの図１、２、３、４または５に示された配列を有するか、あるいはＫ−２、Ｋ−６、Ｋ−８、Ｋ−１１、またはＫ−２６と命名されたクローンからの表１から選択されるＮ−末端タンパク質配列からのタンパク質を有し、かつ、表１には示されていないが、図１〜５に示されている残りのアミノ酸を有するか、あるいは図１〜５に示されるＤＮＡによってコードされる約最初の２６個のＮ末端アミノ酸のアミノ酸、または図６または表１に示されたタンパク質、またはその前記ＤＮＡ分子いずれかに９０％相同のＤＮＡ分子からのタンパク質を有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質として哺乳動物細胞で機能する単離されたタンパク質。２６．Ｋ−８、Ｋ−１１もしくはＫ−１２と命名されたクローン、またはその自明な変形から選択された誘導体、またはその９０％相同配列からの図１、２、３、４、５に示された配列を有するヒト腎臓カリウムチャンネルタンパク質として哺乳動物細胞で機能する請求項２５記載の単離されたタンパク質。２７．Ｋ−２、Ｋ−６と命名されたクローンからの表１に示されたＮ-末端タンパク質配列についての該末端タンパク質配列を有し、かつ表１には示されていないが、図１〜５に示されている残りのアミノ酸を有する哺乳動物細胞で機能する請求項２５記載の単離されたタンパク質。２８．いずれの欠損も含めた、図１〜５に示されたＤＮＡによってコードされたタンパク質の約最初の２６個のＮ末端アミノ酸のいずれかのＮ−末端タンパク質配列についての該末端タンパク質、あるいは図６に示したタンパク質、あるいはその前記ＤＮＡ分子のいずれかに９０％相同のＤＮＡ分子からのタンパク質を有する哺乳動物細胞で機能する請求項２５記載のタンパク質。