JPH08506244A

JPH08506244A - Novel polypeptides having serotonin-like receptor activity, nucleic acids encoding these polypeptides, and uses

Info

Publication number: JPH08506244A
Application number: JP6517723A
Authority: JP
Inventors: アンレキ，ヌルデイヌ; ボシエルト，ウルズラ; グライユ，レジ; アン，ルネ; マテス，ハンス; プラサ，ジヤン−リユク
Original assignee: アンステイテユ・ナシヨナル・ド・ラ・サンテ・エ・ド・ラ・ルシエルシユ・メデイカル
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-07
Publication date: 1996-07-09
Also published as: CA2153162A1; WO1994018319A1; EP0683817A1; FR2701265A1; FR2701265B1

Abstract

(57)【要約】セロトニン様レセプター活性を有する新規な５ＨＴ５ｂポリペプチド、それを発現する遺伝物質、前記ポリペプチドを発現するいずれかの組換え細胞、およびその使用。 (57) [Summary] Novel 5HT5b polypeptides having serotonin-like receptor activity, genetic material expressing them, any recombinant cells expressing said polypeptides, and uses thereof.

Description

【発明の詳細な説明】セロトニン様レセプター活性を有する新規のポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、および使用本発明は、新規のポリペプチドおよびそれらの発現を可能にする遺伝物質に関する。より具体的には本発明はセロトニン様レセプター活性を有する新規のポリペプチドに関する。セロトニンは、睡眠、食欲、運動、性的活動、および血管収縮のような多種多様の行動機能を誘導および調節することが可能なニューロモジュレーターである。セロトニン活性は、セロトニン様レセプターもしくは５−ＨＴ（５−ヒドロキシトリプタミンとして）レセプターと表示されるレセプターとの相互作用により媒介されることが認められている。分子生物学的研究ならびに薬理学的研究により５−ＨＴレセプターの多大な数のサブタイプの存在が明らかにされている。今日までに記載されている５−ＨＴレセプターは、イオンチャネルに関連するレセプターの一族（５−ＨＴ３レセプター）か、あるいはＧ蛋白質と相互作用しそして７回貫通膜ドメインを保持するレセプターの一族のいずれかに属する。その上アミノ酸配列の分析により、Ｇ蛋白質と相互作用する５−ＨＴレセプターは２つの明瞭な群に再分割することができることが示されており、それらは、哺乳類のサブタイプ５ＨＴ１Ａ、５ＨＴ１Ｂ、および５ＨＴ１Ｄを含む５ＨＴ１レセプター類ならびに３つのドロソフィラの５ＨＴレセプター類と、そしてサブタイプ５ＨＴ２および５ＨＴ１Ｃを含む５ＨＴ２レセプター類との２つである。これらのレセプターばかりが現存する５ＨＴレセプターであることは恐らくありえず、それは、薬理学的研究により５ＨＴ４レセプター類、ならびにサブタイプ５ＨＴ１に関連する幾つかのレセプター類（「５ＨＴ１−様」レセプター類）のような他のサブタイプが明らかにされているためである。その上、追加的な分子生物学的研究によってはサブタイプ５ＨＴ１Ｂ／ＩＤ内の不均質性も証明されている。本発明は、セロトニン様レセプター活性を有する新規のポリペプチドの成果を開示するもである。Ｇ蛋白質と相互作用するレセプターの一族に属しながらも、これらの新規のポリペプチドは構造的見地および薬理学的見地の両方から既述のセロトニン様レセプター（５ＨＴ１、５ＨＴ２、５ＨＴ３、および５ＨＴ４）とは異なる。より具体的には本発明は、５ＨＴ５ｂと表示されるこれらの新規のポリペプチド、および更にそれらの発現もしくは同定を可能にする遺伝物質の単離および特性決定の成果である。従って本発明の第一主題は、配列番号２のペプチド配列もしくは後者の誘導体の全てもしくは一部分を含むポリペプチド類である。本発明の目的のためには、用語「誘導体」は、配列番号２のペプチド配列の遺伝的および／または化学的特性の修飾により取得されるいずれかの分子を意味する。遺伝的および／または化学的特性の修飾は、一つもしくは複数の残基のいずれかの突然変異、置換、欠失、添加、および／または修飾を意味することが理解される。このような誘導体を、具体的には、リガンド（一つもしくは複数）に対するペプチドの親和性を増加させる、産生レベルを改善する、プロテアーゼに対する耐性を増加させる、活性を増加および／または改変する、もしくはそれに新規の薬物動態学的および／または生物学的特性を付与する目的のような様々な目的のために作成することができる。添加により得られる誘導体の内では、一つの末端に連結される追加的異型部分を有するキメラポリペプチドを例として挙げることができる。用語「誘導体」は更に、他の細胞源、そして具体的にはヒト起源もしくは他の生物体の細胞を基にし、かつ同じ種類の活性を保持する配列番号２のポリペプチドと相同なポリペプチドも含む。このような相同ポリペプチドは、実施例に記載されるハイブリッド形成実験により取得することができる。本発明のポリペプチドはセロトニンに結合する能力を保持するポリペプチドであることが好ましい。それらがセロトニン様レセプター活性を有するポリペプチドであることが更により好ましい。好ましい態様に従うと、本発明のポリペプチドは更に配列番号２の全ペプチド配列を認識する抗体により認識されることが可能である。本発明の具体的な態様は、配列番号２の全ペプチド配列を含むポリペプチド５ＨＴ５ｂにより表される。実施例に示されるように、このポリペプチドを機能的なセロトニン様レセプターを形成するための様々な種類の細胞において発現することができる。本発明のポリペプチドは後述するような細胞宿主によるヌクレオチド配列の発現によるか、当業者に知られる技術を使用する配列番号２に基づく化学的合成によるか、あるいはこれらの技術の組み合わせにより取得することができる。今後、先に特定される本発明のポリペプチドを５ＨＴ５ｂポリペプチドと表示する。本発明の主題は更に、５ＨＴ５ｂポリペプチドをコードするいずれのヌクレオチド配列でもある。より好ましくはこのような配列は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列もしくはその相補鎖の全てもしくは一部分、（ｂ）配列（ａ）とハイブリダイズし、かつ先に特定されるポリペプチドをコードするいずれかの配列、ならびに（ｃ）遺伝子コードの縮重の結果として配列（ａ）および（ｂ）から取得される配列、から選択される。本発明の様々なヌクレオチド配列は人工起源もしくはそうではないものであることができる。それらは、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくはＲＮＡ配列、ハイブリッド配列、あるいは合成もしくは半合成配列であることができる。これらの配列は、例えば配列番号１の配列を基にして得られるプローブによりＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー）をスクリーニングすることにより取得することができる。このようなライブラリーは、当業者に知られる分子生物学の標準技術により様々な起源の細胞から調製することができる。本発明のヌクレオチド配列はまた、具体的にはホスホルアミダイト法に従う化学合成によるか、あるいは別法ではライブラリーをスクリーニングすることにより取得される配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む混合法により調製することもできる。本発明のヌクレオチド配列を、既述の５ＨＴ５ｂポリペプチドの産生用に使用することができる。この場合、前記ポリペプチドをコードする部分は、一般的には細胞宿主内でのその発現を可能にするシグナルの調節下に置かれる。これらのシグナル（プロモーターおよびターミネーターなど）の選択は、用いられる細胞宿主に従って変えることができる。この目的のためには、本発明のヌクレオチド配列は、自律複製ベクターもしくは組込みベクターであることができるベクターの一部分を形成することができる。より具体的には、自律複製ベクターは選択される宿主内で自律的に複製する配列を用いて調製することができる。組込みベクターに関しては、これらは、例えば相同組換えによりそのベクターの組込みを可能にする宿主ゲノムの所定の領域と相同な配列を用いて調製することができる。組換え法による本発明の５ＨＴ５ｂポリペプチドの産生に利用可能な細胞宿主は、真核生物もしくは原核生物のいずれかの宿主である。適切な真核生物宿主の中では、動物細胞、イースト、もしくは真菌類を挙げることができる。具体的には、イーストに関しては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、もしくはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属のイーストを挙げることができる。動物細胞に関しては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７、およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞などを挙げることができる。真菌類の中では、アスペルギルスエスエスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｓｐ．）、もしくはトリコデルマエスエスピー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｓｐ．）をより具体的に挙げることができる。原核生物宿主としては、以下に示す細菌、すなわち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、もしくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を使用することが好ましい。本発明のヌクレオチド配列はまた、遺伝子療法という状況で用いることができるアンチセンス配列の産生か、あるいは生物学的試料中のセロトニン様レセプターの発現のハイブリッド形成実験による検出ならびに遺伝子異常（多型性、突然変異）もしくは異常発現の証明を可能にするプローブの産生のいずれかのために、薬剤学的分野において利用可能でもある。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる所定の遺伝子の発現の阻害は、遺伝子の活性を調節する有望な手法であることが判明している。アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡに相補的であり、そしてそのため後者と特異的にハイブリッド形成して蛋白質への翻訳を阻害することが可能な小オリゴヌクレオチドである。従って本発明の主題は、先に特定される５ＨＴ５ｂポリペプチドの産生を少なくとも部分的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明はまた、５ＨＴ５ｂポリペプチドの産生を少なくとも部分的に阻害することが可能なアンチセンス配列にも関する。これらのアンチセンス配列は、細胞性ｍＲＮＡに相補的な標的細胞転写物中に産生される。このようなオリゴヌクレオチドもしくは配列は、先に特定されるヌクレオチド配列の全てもしくは一部分からなることができる。これらは一般的には本発明のペプチドをコードする配列に相補的な配列もしくは配列断片である。このようなオリゴヌクレオチドは、フラグメント化もしくは化学合成などにより配列番号１の配列から取得することができる。先に記載するように、本発明はまた、本発明の５ＨＴ５ｂポリペプチドをコードする先に特定されるヌクレオチド配列もしくは対応するｍＲＮＡとハイブリッド形成することが可能な、合成もしくはそうではないヌクレオチドプローブを産生することを可能にもする。このようなプローブは、５ＨＴ５ｂセロトニン様レセプターの発現を検出するためか、あるいは別法では遺伝子異常（間違ったスプライシング、多型性、および点突然変異など）を証明するための診断用の道具としてインビトロで用いることができる。セロトニンの多大な活性を考慮すると、本発明のプローブはそのため神経学的、心臓血管学的、もしくは精神医学的疾患を５ＨＴ５ｂレセプターに関連するものとして同定することが可能である。これらのプローブはまた、他の細胞源、および好ましくはヒト起源の細胞から、先に特定される５ＨＴ５ｂポリペプチドをコードする相同核酸配列を証明および単離するのに用いることもできる。本発明のプローブは一般的には少なくとも１０の塩基を含み、そしてそれらは配列番号１もしくはその相補鎖の全配列と同程度の塩基を含むことができる。これらのプローブはそれらの使用前にラベル化することが好ましい。この目的のためには当業者に知られる様々な技術を利用することができる（放射能ラベル化もしくは酵素的ラベル化など）。これらのプローブを用いることができるハイブリッド形成条件は以下の一般的なクローニング技術ならびに実施例において記載される。本発明の他の主題は、先に特定される５ＨＴ５ｂポリペプチドを表面に発現することが可能な組換え細胞に関する。これらの細胞は、本発明のポリペプチドをコードする先に特定されるヌクレオチド配列を組み込ませ、そしてその後に前記細胞を前記配列の発現のための条件下で培養することにより取得することができる。本発明に従う組換え細胞は、真核生物もしくは原核生物細胞のいずれかであることができる。適切な真核生物細胞の中では、動物細胞、イースト、もしくは真菌類を挙げることができる。具体的には、イーストに関しては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、もしくはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属のイーストを挙げることができる。動物細胞に関しては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７、およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞などを挙げることができる。真菌類の中では、アスペルギルスエスエスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｓｐ．）、もしくはトリコデルマエスエスピー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｓｐ．）をより具体的に挙げることができる。原核生物宿主としては、以下に示す細菌、すなわち大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、もしくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を使用することが好ましい。このようにして取得される細胞を使用して、リガンドもしくは本発明のポリペプチドの活性のモジュレーターとして振る舞う様々な分子の能力を測定することができる。従ってより具体的にはこれらを、リガンドもしくは本発明のポリペプチドの活性のモジュレーターを、そしてより具体的にはセロトニン作用薬もしくは拮抗薬を証明および単離するための方法に用いることができる。従って本発明の他の主題は、本発明の５ＨＴ５ｂポリペプチドのリガンドの証明および／または単離のための方法に関し、この方法に従うと以下に示される段階が実施されるが、それらは、 − 恐らく未同定である、ある分子もしくは様々な分子を含む混合物を、本発明のポリペプチドをその表面で発現する既述の組換え細胞と、前記本発明のポリペプチドと前記分子との間の相互作用（後者は前記ポリペプチドに対する親和性を保持する場合には）を可能にする条件下で接触させる段階、および − 前記本発明のポリペプチドに結合した分子を検出および／または単離する段階、である。ある特別な態様においては、本発明のこの方法は、５ＨＴ５ｂポリペプチドについてのセロトニン作用薬および拮抗薬を証明および／または単離するのに適する。本発明の他の主題は、本発明の５ＨＴ５ｂポリペプチドのモジュレーターを証明および／または単離するための方法に関し、この方法に従うと以下に示される段階が実施されるが、それらは、 − 恐らく未同定である、ある分子もしくは様々な分子を含む混合物を、本発明のポリペプチドをその表面に発現する既述の組換え細胞と、５ＨＴの存在下、前記本発明のポリペプチドと５ＨＴとの間の相互作用を可能にする条件下で接触させる段階、および − 前記本発明のポリペプチドに関して５ＨＴの活性をモジュレートすることが可能な分子を検出および／または単離する段階、である。本発明の他の主題は、医療用産物として既述の方法に従って同定および／または取得されるリガンドもしくはモジュレーターの使用に関する。このようなリガンドもしくはモジュレーターは実際のところ、５ＨＴ５ｂレセプターに関連する所定の神経学的、心臓血管学的、もしくは精神医学的疾患を治療することを可能にすることができる。本発明はまた、本発明の５ＨＴ５ｂポリペプチドに作用する少なくとも一つの分子を活性成分として含むいずれの医療用産物にも関する。この分子は、既述の方法に従って同定および／または単離されるリガンドもしくはモジュレーターであることが好ましい。本発明の他の利点は、以下に示され、そして説明的かつ非制限的であるとして見なすべき実施例を読む際に明白になるであろう。図面の説明文表１：５ＨＴ５ｂレセプターの薬理学的特性。この結果は、５ＨＴ５ｂレセプターを発現するＣｏｓ−７細胞の膜に対する［¹²⁵Ｉ］ＬＳＤの結合についての競合実験を表す。ＩＣ₅₀値（結合した［¹²⁵Ｉ］ＬＳＤの５０％を置換するのに必要なリガンド濃度に相当する）を実験的に算出し、そして以下に示す式：Ｋｉ＝ＩＣ₅₀／（１＋Ｃ／Ｋｄ）［式中、Ｃは［¹²⁵Ｉ］ＬＳＤの濃度（１５０ｐＭ）であり、そしてＫｄは［¹²⁵Ｉ］ＬＳＤの解離定数である］に従ってＫｉに変換した。括弧内の数値は実施した個々の実験数に相当し、各点は三重反復試験で実施した。表２：５ＨＴ５ｂレセプター（配列番号２）とＧ蛋白質に結合するレセプターの一族の内の他のレセプターとの間のペプチド配列の相同性のパーセンテージ。相同性は保存配列、すなわち貫膜領域およびそれに連結するループについて算出した。図１：５ＨＴ５ｂレセプターを発現するＣｏｓ−７細胞の膜上の［¹²⁵Ｉ］ＬＳＤの飽和曲線。この膜を５０ｐＭ−１．２５ｎＭの範囲にわたるリガンド濃度を用い、１０μＭの５ＨＴと共に、もしくはそれを伴わない状態でインキュベートした。特異的結合が示される。挿入図はその結果のスキャチャード分析を表す。一般的なクローニング技術プラスミドＤＮＡの精製的抽出、塩化セシウム濃度勾配液中でのプラスミドＤＮＡの遠心、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＡＮ断片の精製、フェノールもしくはフェノール／クロロホルムでの蛋白質抽出、塩溶媒中でのＤＮＡのエタノールもしくはイソプロパノール沈殿、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中での形質転換などのような分子生物学において通常用いられる方法は当業者に良く知られておりかつ刊行物中に詳細に記載されている［ＭａｎｉａｔｉｓＴ．ｅｔａｌ．、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；ＡｕｓｕｂｅｌＦ．Ｍ．ｅｔａｌ．（ｅｄｓ）、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ１９８７］。制限酵素類は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社（ＢｉｏＩａｇｓ）、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ＢＲＬ）、もしくはＡｍｅｒｓｈａｍ社から供給され、そしてその供給社の推奨に従って用いる。連結反応のためには、ＤＮＡ断片をアガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに従って分離し、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてその後に供給社の推奨に従ってファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢｉｏＩａｂｓ社）の存在下でインキュベートする。５’突出端の充填（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）は、供給社の推奨に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）のクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いて実施する。３’突出端の破壊は、製造元の推奨に従って用いられるファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ社）の存在下で実施する。５’突出端の破壊は、Ｓ１ヌクレアーゼでの制御下処理により実施する。合成オリゴデオキシヌクレオチドによりインビトロで誘導される突然変異誘発は、Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて実施する。いわゆるＰＣＲ［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ、ＳａｉｋｉＲ．Ｋ．ｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；ＭｕｌｌｉｓＫ．Ｂ．ａｎｄＦａｌｏｏｎａＦ．Ａ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］技術によるＤＮＡ断片の酵素的増幅を、”ＤＮＡサーマルサイクラー（ＤＮＡｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ）” （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社）を製造元の説明書に従って用いて実施する。ヌクレオチド配列の検証はＳａｎｇｅｒｅｔａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配布されるキットを用いて実施する。ハイブリッド形成実験用には、緊縮性の通常条件は一般的には以下に示すものであり、すなわち、ハイブリッド形成：６５℃下、５×デンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）の存在下、３×ＳＣＣ；洗浄：６５℃ 下、０．５×ＳＳＣ、である。１．５ＨＴ５ｂレセプターの単離様々な既知のセロトニン様レセプターとの間の配列比較により、具体的には第ＩＩＩおよび第ＶＩドメインのような所定の可能な貫膜領域内に幾分かの保存が示される。新規のレセプターを証明および単離する目的で、これらの２つの領域に相当する３つの縮重オリゴヌクレオチドを調製し、そしてその後にマウス脳のＲＮＡ調製の際の一連のＰＣＲ反応に用いた。縮重オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。オリゴヌクレオチド（ｉ）オリゴヌクレオチド（ｉｉ）オリゴヌクレオチド（ｉｉｉ）ＰＣＲ反応は以下に示す様式で実施し、すなわち、５μｇの成体マウス脳のＲＮＡを５００ｎｇのオリゴヌクレオチド（ｉ）および２００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ社）の存在下での逆転写反応に供した。その後にこの反応の産物の半分を５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ社）、ならびに１μｇのオリゴヌクレオチド（ｉ）およびオリゴヌクレオチド（ｉｉ）の存在下で３０回の増幅周期に供した。その後にこの反応の産物の１／２０をオリゴヌクレオチド（ｉ）および（ｉｉｉ）の存在下で３０回の追加的増幅周期に供した。このようにして得られる産物を酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の対応部位０内に挿入し、そして配列決定を行った。このようにして得られ、かつセロトニン様レセプターとの幾分かの相同性を有する断片の内の一つをランダムプライミング（ＦｅｉｎｂｅｒｇａｎｄＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３２（１９８４）６）によりラベル化し、そしてそれをブローブとして用いてＵｎｉＺａｐファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内に構築されたマウス脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。得られた陽性ファージ中では、それらの内の一つでλＮＳと称され、かつプラスミドｐＮＳにより保持されるものは２．１ｋｂの挿入断片を含んでいた。このファージを単離し、そしてその後にその挿入断片をプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内に導入した。この断片の配列を、合成オリゴヌクレオチドによるジデオキシヌクレオチド技術を用いて２本の鎖について決定した。このようにして得られた配列は配列番号１の配列に相当する。このことにより、単離されたｃＤＮＡは３７０アミノ酸の読み枠を保持することが示される。その上、疎水性の分析により、この蛋白質がＧ蛋白質に結合するレセプターの一族の一員に生じる特性である７つの疎水性ドメインを保持することが明らかにされた。しかもＮ−末端は１つのＮ−グリコシル化部位を含み、そしてその推定される細胞質ドメインはＣおよびＡ蛋白質キナーゼによるリン酸化用の共通部位を含む。５ＨＴ５ｂレセプターをコードするゲノムクローンも、プローブとしての配列番号１の配列によりゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより単離した。このライブラリーは、マウス胎仔の幹細胞のゲノムＤＮＡの部分的Ｓａｕ３Ａ消化、およびその後のファージラムダーＥＭＢＬ３内への挿入により予め取得してあった。得られる断片をプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローン化し、そして部分的配列決定を行った。これらの配列の分析により、第３細胞質ループの中央に位置するイントロンの存在が明らかにされた。２．配列相同性の検討先に単離された５ＨＴ５ｂレセプターの配列を、Ｇ蛋白質と結合する以下のレセプター：５ＨＴ１Ｂ、５ＨＴ１Ｄ、５ＨＴ５Ａ、５ＨＴ１Ａ、５ＨＴ−ｄｒｏ２Ａ、５ＨＴ−ｄｒｏｌ、α２、Ｄ２、β１、Ｄ１、Ｈ２、５ＨＴ１Ｃ、および５ＨＴ２の配列と比較した。これらの実験により、有望な貫膜ドメインおよび所定のループ内の所定の相同性が明らかになったが、末端領域もしくは第三細胞質ループ内には相同性が全く存在しなかった。表２は、保存領域内の％相同性値を示す。３．Ｃｏｓ−７細胞内での５ＨＴ５ｂレセプターの発現および薬理学的特性決定実施例１において単離されたｃＤＮＡ断片を真核生物発現ベクター内に挿入し、これを使用してＣｏｓ−７細胞をトランスフェクトした。その後には、得られたトランスフェクト化細胞の膜を調製し、そして所定のラベル化セロトニン様リガンドに結合する能力についてのテストを行った。５ＨＴ５ｂレセプターをコードする２．１ｋｂのｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩの形態でプラスミドｐＮＳから単離し、そしてその後にベクターｐ５１３の対応部位に挿入した。このベクターｐ５１３はベクタ−ｐＳＧ５［Ｇｒｅｅｎｅｔａｌ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６（１９８８）３６９］から、多重クローニング部位の添加により取得される。このようにして取得され、かつｐ５１３ＮＳと表示される組換えベクターをその後に用いて（１０ｃｍのデッシュ当たり２０μｇ）、リン酸カルシウムの存在下でＣｏｓ−７細胞をトランスフェクトした。トランスフェクト後４８時間目にその組換え細胞を回収し、そしてその膜をＡｍｌａｉｋｙおよびＣａｒｏｎ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１９８５）１９８３］により記載される技術に従って調製する。その後に飽和結合および競合実験を、様々な放射ラベル化リガンドの存在下でこれらの膜について実施した（表１を参照せよ）。このためには膜試料（１０−２０μｇの蛋白質）を１０分間、３７℃で、最終容量２５０μｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中でリガンドの存在下でインキュベートした。その後にこの反応を、ホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）のＧＦ／Ｃガラス繊維濾紙上での吸引濾過により停止させ、そして４ｍｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で４回すすいだ。非特異的結合を１０μＭの５ＨＴの存在下で決定した。放射活性をγ 計測器で測定した。得られる結果により、［¹²⁵Ｉ］ＬＳＤは、Ｋｄ＝４７０ｐＭおよびＢ_max＝１７０ｆモル／ｍｇ膜蛋白質の飽和結合部位を有することが示される（図１）。その上、対照実験においては、［¹²⁵Ｉ］ＬＳＤはプラスミドｐ５１３でトランスフェクトさせたＣｏｓ−７細胞とは結合しなかったことが示される。このレセプターの薬理学的特性を決定するために、膜に結合した［¹²⁵Ｉ］ＬＳＤを様々なセロトニン様薬物（表１）の存在下で置換した。これらの様々な薬物により、以下に示す順序の置換効率が示され、それは、エルゴタミン＞５−ＣＴ＞メチセルギド＞５ＨＴ＞ＲＵ２４９６９＞８−ＯＨ− ＤＰＡＴ＞ヨヒンビン＞ブフォテニン（表１）である。ケタンセリン、（−）プロパノロール、スマトリプタン、ドパミン、およびノルエピネフリンは不活性である。４．他の組織における相同配列の調査その後に配列番号１のヌクレオチド配列を用いて、インサイチューハイブリッド形成により他の組織における相同配列を証明した。インサイチューハイブリッド形成実験は、Ｈａｆｅｎｅｔａｌ．［ＥＭＢＯＪ．２（１９８３）６１７］により記載される技術に従って、クリオスタット処理に供した成体（約８週令）マウス脳の切片について実施した。これらの実験に用いたプローブは、Ｔ３ポリメラーゼ、［³⁵Ｓ］ＣＴＰの存在下で、Ｘｈｏ１により直線化したプラスミドｐＮＳを鋳型として用いて転写させることにより取得した一本鎖ＲＮＡである。この研究により、海馬（ＣＡＩ領域）、手綱体、および背側縫線において本発明に従う相同配列を検出することが可能となった。５．ヒトレセプターの単離ヒトの５ＨＴ５ｂレセプターを、先の４．に記載される方法に従ってクローン化した。このためには、ヒトのゲノムＤＮＡライブラリーを胎盤から、酵素Ｍｂｏ１での部分的消化、塩濃度勾配液上での分離、およびＢａｍＨＩで直線化したベクターラムダーＧＥＭ１２内へのサブクローン化により調製した（宿主細菌：ＴＡＰ９０）。このようにして得られたライブラリーをその後に配列番号１の配列によりスクリーニングした。このプローブとハイブリッド形成するＤＮＡ断片を単離し、プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローン化し、増幅し、そしてその後にジデオキシヌクレオチド技術に従って両方向の配列決定を行った。得られた配列を配列番号３の配列に示す。同じ実験を他の組織、そして特にヒト起源の組織、他のプローブ、および他の技術（ＰＣＲ、ノザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ）ハイブリッド形成）を用いて繰り返すことができる。その上これらの実験の際に検出される相同配列は、その後に通常の分子生物学的技術により単離および／または増幅できることは明白である。配列表（１）一般情報：（ｉ）出願者：（Ａ）氏名：ＩＮＳＥＲＭ（Ｂ）街路名：１０１ｒｕｅｄｅＴｏｌｂｉａｃ（Ｃ）市：ＰＡＲＩＳ（Ｅ）国：Ｆｒａｎｃｅ（Ｆ）郵便コード：７５６５４（ｉｉ）発明の名称：セロトニン様レセプター活性を有する新規のポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、および利用法（ｉｉｉ）配列数：３（ｉｖ）コンピューター解読形態：（Ａ）メディウムの種類：テープ（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：ＰａｔｅｎｔｌｎＲｅｌｅａｓｅ＃１．０、Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５（ＥＰＯ）（２）配列番号１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０３６（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：ＮＯ（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ（ｖｉ）起源（Ａ）生物名：マウス（ｉｘ）配列の特徴（Ａ）名称／記号：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：３１２．．１４２４（ｘｉ）配列（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３７０（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白質（ｘｉ）配列（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ゲノムＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：ＮＯ（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ（ｖｉ）起源（Ａ）生物名：ホモサピエンス（ｘｉ）配列 Detailed Description of the Invention Novel polypeptides having serotonin-like receptor activity, these polypeptides Nucleic acid encoding a protein and use The present invention relates to novel polypeptides and the genetic material that enables their expression. To do. More specifically, the present invention relates to a novel polysporin having serotonin-like receptor activity. Regarding peptides. Serotonin is a wide variety of compounds such as sleep, appetite, exercise, sexual activity, and vasoconstriction. Is a neuromodulator capable of inducing and regulating such behavioral functions . Serotonin activity is measured by serotonin-like receptors or 5-HT (5-hydroxyl). By the interaction of the receptor with the receptor displayed (as citriptamine) It is allowed to be transmitted. Molecular biology and pharmacological studies The existence of a large number of subtypes of the 5-HT receptor has been demonstrated. now The 5-HT receptor described to date is a receptor associated with ion channels. And interacts with the Pter family (5-HT3 receptor) or G protein Belong to one of a family of receptors that retain the 7-pass transmembrane domain. Moreover Analysis of the amino acid sequence reveals that there are two 5-HT receptors that interact with G proteins. Have been shown to be subdivided into distinct groups of 5HT1 receptors including subtypes 5HT1A, 5HT1B, and 5HT1D -And 5 drosophila 5HT receptors, and subtype 5 Two of the 5HT2 receptors, including HT2 and 5HT1C. Perhaps these receptors are the only existing 5HT receptors. However, it was confirmed by pharmacological studies that 5HT4 receptors and subtypes Some receptors related to p5HT1 (“5HT1-like” receptors) This is because other subtypes such as are revealed. Besides, additional minutes Biological studies have also demonstrated heterogeneity within subtype 5HT1B / ID ing. The present invention provides the results of a novel polypeptide having serotonin-like receptor activity. It is also disclosed. While belonging to a family of receptors that interact with G proteins, These novel polypeptides are described above from both structural and pharmacological aspects. With serotonin-like receptors (5HT1, 5HT2, 5HT3, and 5HT4) Is different. More specifically, the present invention relates to these novel ports labeled 5HT5b. Isolation of Lipids and Genetic Material Which Allows Their Expression or Identification And the result of characterization. The first subject of the invention is therefore the peptide sequence SEQ ID NO: 2 or a derivative of the latter. Polypeptides containing all or part of For the purposes of the present invention, the term “derivative” refers to the peptide sequence SEQ ID NO: 2. Means any molecule obtained by modification of transmissive and / or chemical properties It Modification of genetic and / or chemical properties may be the modification of one or more residues. Understand to mean any mutation, substitution, deletion, addition, and / or modification To be done. Such a derivative may be specifically linked to the ligand (s). Increase the affinity of the peptide, improve the production level, Increase resistance, increase and / or modify activity, or Rule drug For various purposes, such as the purpose of imparting kinetic and / or biological properties Can be created. Of the derivatives obtained by addition, one end is linked. A chimeric polypeptide having additional heterotypic moieties attached can be mentioned as an example. Wear. The term "derivative" also refers to other cell sources, and in particular of human origin or The polypeptide of SEQ ID NO: 2 which is based on cells of other organisms and retains the same type of activity Also included are polypeptides homologous to peptides. Such homologous polypeptides are described in the examples. It can be obtained by the hybridization experiments described. The polypeptide of the present invention is a polypeptide that retains the ability to bind serotonin. Preferably there is. Polypeptides in which they have serotonin-like receptor activity Even more preferably, According to a preferred embodiment, the polypeptide of the invention Can be further recognized by an antibody that recognizes the entire peptide sequence of SEQ ID NO: 2. Noh. A particular embodiment of the present invention is a polypeptide 5 comprising the entire peptide sequence of SEQ ID NO: 2. Represented by HT5b. As shown in the examples, this polypeptide is functional Expressed in various cell types to form a novel serotonin-like receptor be able to. The polypeptide of the present invention is capable of generating a nucleotide sequence by a cell host as described below. Presently or by chemical synthesis based on SEQ ID NO: 2 using techniques known to those skilled in the art. It can be obtained by a combination of these techniques. Hereinafter, the polypeptide of the present invention specified above will be referred to as 5HT5b polypeptide. To do. The subject matter of the present invention is also any of the 5HT5b polypeptides encoding. It is also a nucleotide sequence. More preferably such a sequence is (A) All or part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary strand Minutes, (B) a polypeptide which hybridizes with the sequence (a) and which is identified above is Any array that (C) obtained from sequences (a) and (b) as a result of the degeneracy of the genetic code Array, Selected from. Various nucleotide sequences of the present invention are of artificial origin or not be able to. They can be genomic, cDNA, or RNA sequences, hybrid The sequences can be synthetic or semi-synthetic. These arrays are , A DNA library using a probe obtained based on the sequence of SEQ ID NO: 1, for example Screen (cDNA library, genomic DNA library) It can be obtained. Such libraries are known to those of skill in the art. It can be prepared from cells of various origins by standard techniques of molecular biology. Book The nucleotide sequences of the invention may also specifically be synthesized according to the phosphoramidite method. Synthesis or, alternatively, by screening the library. It can also be prepared by a mixing method involving chemical or enzymatic modification of the resulting sequence. Wear. Use of the Nucleotide Sequence of the Invention for the Production of the 5HT5b Polypeptides Described above can do. In this case, the portion encoding the polypeptide will generally be Is placed under the control of signals that allow its expression in the cellular host. these Signals (promoter and terminator , Etc.) can be varied according to the cell host used. This purpose In order for the nucleotide sequence of the invention to be incorporated into an autonomously replicating vector or integrating vector. Can form part of a vector that can be a vector. More concrete In general, autonomously replicating vectors use sequences that replicate autonomously in the host of choice. It can be prepared. For integrative vectors, these include, for example, homologous recombination. The homologous region of the host genome that allows integration of the vector. Can be prepared using rows. 5HT5b Polypep of the Invention by Recombinant Method Cellular hosts available for the production of tide are either eukaryotic or prokaryotic. Is the main. Among suitable eukaryotic hosts are animal cells, yeast, or fungi. Can be mentioned. Specifically, for yeast, Saccharomyces (S accharomyces ), Kluyveromyces (Kluyveromyces ), Pichia (Pichia), Schwanniomyces (Schwanniomyce s ), Or Hansenula (Hansenula) To name a genus yeast it can. For animal cells, COS, CHO, C127, and NIH-3T 3 cells etc. can be mentioned. Among the fungi, Aspergillus SS Pee (Aspergillus ssp. ), Or Trichoderma SS Pee (Trichoderma ssp. ) Can be mentioned more specifically . Prokaryotic hosts include the following bacteria: E. coli (E. FIG. coli), Bacillus (Bacillus), Or Streptomyces (Streptom yces ) Is preferably used. The nucleotide sequences of the invention can also be used in the context of gene therapy. Production of antisense sequences, or cello in biological samples. Detection of Tonin-like Receptor Expression by Hybridization Experiment and Gene Difference Of the production of probes that allow the demonstration of normal (polymorphism, mutation) or aberrant expression It is also available in the pharmaceutical field for either. Inhibition of expression of a given gene by antisense oligonucleotides It has been found to be a promising method of regulating the activity of. Antisense oligonu The cleotide is complementary to the mRNA and therefore hybridizes specifically with the latter. It is a small oligonucleotide that can bind to a protein and inhibit its translation into a protein. It Accordingly, the present subject matter reduces the production of the 5HT5b polypeptides identified above. It is an antisense oligonucleotide that can partially inhibit if not . The present invention also at least partially inhibits production of 5HT5b polypeptide It also relates to possible antisense sequences. These antisense sequences are Produced in a target cell transcript that is complementary to the sex mRNA. Such an oligo The nucleotide or sequence is all or part of the nucleotide sequence specified above. Can consist of These are generally sequences encoding the peptides of the invention. Is a sequence or sequence fragment complementary to. Such oligonucleotides are It can be obtained from the sequence of SEQ ID NO: 1 by means of fragmentation or chemical synthesis. it can. As described above, the present invention also encodes the 5HT5b polypeptides of the present invention. Hybridized to the nucleotide sequence specified above or the corresponding mRNA. To produce synthetic or otherwise nucleotide probes that can It also makes it possible to live. Such a probe is a 5HT5b serotonin-like receptor. To detect the expression of scepters, Alternatively, genetic abnormalities (wrong splicing, polymorphisms, and point mutations) Can be used in vitro as a diagnostic tool to prove mutations etc.) It Given the large activity of serotonin, the probes of the present invention are therefore neurological Associated 5HT5b receptors with inflammatory, cardiovascular, or psychiatric disorders Can be identified as one. These probes are also used in other cell sources, And preferably from a cell of human origin, a 5HT5b polypeptide as specified above It can also be used to verify and isolate homologous nucleic acid sequences encoding Departure Bright probes generally contain at least 10 bases, and they have sequence numbers No. 1 or the complementary sequence thereof may contain almost the same bases. these The probes are preferably labeled prior to their use. For this purpose Various techniques known to those of skill in the art can be utilized (radioactive labeling or Such as enzymatic labeling). Hybrid type that can use these probes The conditions of growth are described in the general cloning techniques below as well as in the examples. Another subject of the invention is the surface expression of a 5HT5b polypeptide as specified above. Recombinant cell capable of These cells are loaded with the polypeptide of the invention. Incorporating the previously specified nucleotide sequence that encodes Can be obtained by culturing cells under conditions for expression of the sequences It Recombinant cells according to the invention are either eukaryotic or prokaryotic cells be able to. Among the suitable eukaryotic cells are animal cells, yeast, or eukaryotic cells. Fungi can be mentioned. Specifically, for yeast, Saccharomyces (Saccharomyces), Kluybe ROMICES (Kluyveromyces), Pichia (Pichia), Schwanni Omises (Schwanniomyces), Or Hansenula (Hanse nula ) The yeasts of the genus can be mentioned. For animal cells, COS, Examples include CHO, C127, and NIH-3T3 cells. fungus Aspergillus SSP (Aspergillus ssp ． ), Or Trichoderma SSP (Trichoderma ssp ． ) Can be mentioned more specifically. Prokaryotic hosts include the following Fungus, namely E. coli (E. FIG. coli), Bacillus (Bacillus),if Kuha Streptomyces (Streptomyces) Is preferably used . The cells thus obtained are used to bind the ligand or the polypeptide of the invention. To measure the ability of various molecules to act as modulators of peptide activity Can be. Therefore, more specifically, these are used as the ligand or the polypeptide of the present invention. Modulators of tide activity, and more specifically serotonin agonists or Can be used in methods to prove and isolate antagonists. Accordingly, another subject of the invention is the identification of ligands for the 5HT5b polypeptides of the invention. A method for light and / or isolation, the steps indicated below according to this method The floors are implemented, but they are -A mixture of molecules, possibly unidentified, containing a molecule or various molecules, A recombinant polypeptide as described above which expresses a light polypeptide on its surface, Interaction between the peptide and the molecule (the latter having an affinity for the polypeptide Contacting under conditions that allow)), and -Detecting and / or isolating molecules bound to said polypeptide of the invention Stages, Is. In one particular embodiment, the method of the invention provides for a 5HT5b polypeptide. Suitable for demonstrating and / or isolating serotonergic agonists and antagonists It Another subject of the invention is to demonstrate modulators of the 5HT5b polypeptides of the invention. A method for clarification and / or isolation, which is shown below according to this method The steps are carried out, but they are -A mixture of molecules, possibly unidentified, containing a molecule or various molecules, In the presence of 5HT in the presence of a recombinant cell as described above, which expresses the light polypeptide on its surface, Contacting under conditions that allow the interaction between said polypeptide of the invention and 5HT Letting, and -Modulating the activity of 5HT with respect to said polypeptide of the invention Detecting and / or isolating a molecule capable of Is. Another subject of the invention is the identification and / or also according to the method described above as a medical product. Relates to the use of the obtained ligand or modulator. Riga like this And modulators are actually related to the 5HT5b receptor Can treat certain neurological, cardiovascular, or psychiatric disorders Can be The present invention also relates to at least one of the 5HT5b polypeptides of the invention which acts. It relates to any medicinal product containing a molecule as an active ingredient. This molecule is Ligands identified and / or isolated according to methods Alternatively, it is preferably a modulator. Other advantages of the invention are set out below and as being illustrative and non-limiting. It will be apparent when reading the examples to be considered.Description of the drawing Table 1 : Pharmacological properties of 5HT5b receptor. The result is a 5HT5b receptor For the membrane of Cos-7 cells expressing¹²⁵I] Competition for LSD binding Represents a joint experiment. IC₅₀Value (combined [¹²⁵I] Necessary to replace 50% of LSD (Corresponding to the required ligand concentration) was calculated empirically and the formula shown below: Ki = IC₅₀/ (1 + C / Kd) [where C is [¹²⁵I] LSD concentration (150 pM) And Kd is [¹²⁵I] is the dissociation constant of LSD] did. The numbers in parentheses correspond to the number of individual experiments performed, and each point is based on a triple replicate. gave.Table 2 : 5HT5b receptor (SEQ ID NO: 2) and G protein-coupled receptor Percentage of peptide sequence homology with other receptors within the family. phase Homogeneity is calculated for conserved sequences, namely the transmembrane region and the loops connecting it. It wasFigure 1 : On the membrane of Cos-7 cells expressing the 5HT5b receptor [¹²⁵I] LS Saturation curve of D. The membrane was loaded with ligands over a range of 50 pM-1.25 nM. Incubate with or without 10 μM 5HT did. Specific binding is indicated. The inset represents the Scatchard analysis of the results.Common cloning techniques Purified extraction of plasmid DNA, plating in cesium chloride gradient Smid DNA centrifugation, agarose or acrylamide gel electrophoresis, electrolysis Purification of the DAN fragment by extraction with phenol or phenol / chloroform Protein extraction, ethanol or isopropanol precipitation of DNA in salt solvent, And E. coli (Escherichia coli) Like transformation in Methods commonly used in molecular biology are well known and published in the art. Described in detail in [Maniatis T. et al. et al. , "Mol Equal Cloning, a Laboratory Manual ”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold S pring Harbor, N.M. Y. , 1982; Ausubel F .; M. e t al. (Eds), "Current Protocols in Mol "Ecological Biology", John Wiley & Sons, Ne w York 1987]. Restriction enzymes are available from New England Biolabs (BioIags). ), Bethesda Research Laboratories (BR L), or supplied by Amersham, and according to the supplier's recommendations. Used. For the ligation reaction, the DNA fragment was subjected to agarose or acrylamide gel electrophoresis. Separation according to size by electrophoresis, phenol or phenol / chlorophore Extracted with rum mixture, precipitated with ethanol, and then according to supplier's recommendations. Incubate in the presence of phage T4 DNA ligase (BioIabs) To start. Filling in the 5'protruding ends was done according to the supplier's recommendations. (E. FIG. coli) DNA polymerase I (Biolabs) Klenow fragment of the same company. Destruction of the 3'protruding end is Phage T4 DNA polymerase (Biol used according to manufacturer's recommendations) abs company). Destruction of the 5'overhang is controlled by S1 nuclease. It is carried out by the lower treatment. In vitro induced mutagenesis by synthetic oligodeoxynucleotides. Are described by Taylor et al. [Nucleic Acids Res.13 (1985) 8749-8764], according to the method developed by Amersh. It is carried out using a kit distributed by Am. So-called PCR [Polymase-catalyzedChainR action, Saiki R. et al. K. et al. , Science23 0 (1985) 1350-1354; Mullis K .; B. and Falo ona F. A. Meth. Enzym.155(1987) 335-350. ] Enzymatic amplification of DNA fragments by the technique "DNA thermal cycler (DN A thermal cycler) "(Perkin Elmer Cet us) according to the manufacturer's instructions. Nucleotide sequence validation is described by Sanger et al. [Proc. Natl ． Acad. Sci. USA,74(1977) 5463-5467]. Performed using the kit distributed by Amersham, according to the published method To do. For hybridization experiments, the usual conditions for stringency are generally those shown below. That is, hybridization: 65 ° C., 5 × Denhardt's solution (Den 3 × SCC in the presence of hart's); wash: 65 ° C. Below, 0.5 × SSC. 1.Isolation of the 5HT5b receptor Sequence comparisons between various known serotonin-like receptors show that There is some conservation within certain possible transmembrane regions such as III and VI domains. Is shown. For the purpose of demonstrating and isolating novel receptors, these two regions Of three degenerate oligonucleotides corresponding to It was used in a series of PCR reactions for RNA preparation. The sequence of the degenerate oligonucleotide It is shown below. Oligonucleotide (i) Oligonucleotide (ii) Oligonucleotide (iii) The PCR reaction was performed in the following manner: 5 μg of adult mouse brain R NA with 500 ng of oligonucleotide (i) and 200 units of MMLV reversal It was subjected to a reverse transcription reaction in the presence of a transcriptase (BRL). Then the product of this reaction 5 units of Taq polymerase (Cetus) and 1 μg of 30 times increase in the presence of gonucleotide (i) and oligonucleotide (ii) It was subjected to a width cycle. Then 1/20 of the product of this reaction was ) And (iii) Was subjected to 30 additional amplification cycles in the presence of The product thus obtained is fermented ElementaryBam HI andHind Digested with III and plasmid Bluescri pt (Stratagene) at the corresponding site 0 and sequenced. It was. Thus obtained and some homology with serotonin-like receptors Random priming (Feinberg and Vogelstein, Analytical Biochemistry1 32 (1984) 6), and using it as a probe, U Mouse brain cDNA constructed in niZap phage (Stratagene) The A library was screened. In the obtained positive phage, those One of these is called λNS and is carried by the plasmid pNS. It contained a 1 kb insert. The phage was isolated and then inserted The insert fragment was introduced into the plasmid Bluescript. The sequence of this fragment is Two strands were made using the dideoxynucleotide technology with synthetic oligonucleotides. I decided. The sequence thus obtained corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1. By this The isolated cDNA is shown to retain an open reading frame of 370 amino acids. So On top of that, by analysis of hydrophobicity, a family of receptors in which this protein binds to G protein Has been shown to retain seven hydrophobic domains, a characteristic that occurs in members of It was Moreover, the N-terminus contains one N-glycosylation site, and its putative The cytoplasmic domain contains a common site for phosphorylation by C and A protein kinases. Mu. A genomic clone encoding the 5HT5b receptor also has a sequence as a probe. Screen genomic library with sequence number 1 Isolated. This library contains genomic DNA of mouse fetal stem cells. Partial ofSau 3A digestion and then into the phage lambda EMBL3 It was acquired in advance by inserting. The resulting fragment was subcloned into the plasmid Bluescript and Partial sequencing was performed. Analysis of these sequences reveals that in the third cytoplasmic loop The existence of an intron located in the center was revealed. 2.Examination of sequence homology The sequence of the previously isolated 5HT5b receptor is linked to the G protein as follows. Scepter: 5HT1B, 5HT1D, 5HT5A, 5HT1A, 5HT-dro 2A, 5HT-drol, α2, D2, β1, D1, H2, 5HT1C, and The sequence was compared with that of 5HT2. These experiments show that promising transmembrane domains and locations A certain homology within a defined loop was revealed, but in the terminal region or the third cytoplasm There was no homology within the loop. Table 2 shows the% homology values within the storage area. Show. 3.Expression and pharmacological characterization of 5HT5b receptor in Cos-7 cells Fixed Inserting the cDNA fragment isolated in Example 1 into a eukaryotic expression vector , Which was used to transfect Cos-7 cells. Then you get The membrane of the transfected cells was prepared and labeled with serotonin-like protein. Tested for ability to bind to Gand. A 2.1 kb cDNA encoding the 5HT5b receptorEcoRI-Xh o Isolated from plasmid pNS in the form of I and subsequently vector p513 Was inserted at the corresponding site. This vector p513 is Kuta-pSG5 [Green et al. , Nucl. Acids Res. 16(1988) 369] by the addition of multiple cloning sites. It The recombinant vector obtained in this way and designated p513NS Subsequent use (20 μg per 10 cm dish), the presence of calcium phosphate Cos-7 cells were transfected in situ. The recombinant cells were harvested 48 hours after transfection and the membrane was mlaiki and Caron [J. Biol. Chem.260(1985) 1983]. Followed by saturated binding and competition Combined experiments were performed on these membranes in the presence of various radiolabeled ligands. (See Table 1). For this, a membrane sample (10-20 μg of protein) was added for 10 minutes. At 37 ° C. for a final volume of 250 μl of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7 ． Incubated in 4) in the presence of ligand. After this reaction, Stopped by suction filtration on Whatman GF / C glass fiber filter paper Stop and 4 times with 4 ml of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4. Rinsed. Non-specific binding was determined in the presence of 10 μM 5HT. Radioactivity is γ It was measured with a measuring instrument. Depending on the results obtained, [¹²⁵I] LSD has Kd = 470 pM and B_max= 1 It is shown to have a saturation binding site of 70 fmol / mg membrane protein (Figure 1). So In the control experiment, [¹²⁵I] LSD is transduced with plasmid p513 It is shown that it did not bind to the transfected Cos-7 cells. Membrane-bound to determine the pharmacological properties of this receptor [¹²⁵I] LSD was replaced in the presence of various serotonin-like drugs (Table 1). this These various drugs show substitution efficiencies in the order shown below, which Ergotamine> 5-CT> Methysergide> 5HT> RU24969> 8-OH- DPAT> Yohimbine> Bufotenin (Table 1) Is. Ketanserin, (−) propanolol, sumatriptan, dopamine, And norepinephrine are inactive. 4.Investigation of homologous sequences in other tissues After that, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is used to hybridize in situ. Homologous sequences in other tissues were proved by the formation of DNA. In situ hybridization experiments were performed according to Hafen et al. [EMB OJ.2(1983) 617] by the cryostat. The treatment was carried out on a section of an adult (about 8 weeks old) mouse brain subjected to the treatment. These fruits The probe used in the test was T3 polymerase, [³⁵In the presence of S] CTP,Xho By transcribing using the plasmid pNS linearized by 1 as a template It is a single-stranded RNA obtained by This study revealed that the hippocampus (CAI region), reins, and dorsal raphe It became possible to detect homologous sequences according to the light. 5.Human receptor isolation The human 5HT5b receptor was identified in 4. Clone according to the method described in Turned into To this end, a human genomic DNA library was prepared from placentaMbo 1 Partial digestion, separation on a salt gradient, andBam H Prepared by subcloning into the vector Lambda GEM 12 linearized with I. Manufactured (host bacterium: TAP90). The library thus obtained is then screened by the sequence SEQ ID NO: 1. I learned. A DNA fragment that hybridizes to this probe is isolated and Subcloned into Rasmid Bluescript, amplified, and then Bidirectional sequencing was performed according to the dideoxynucleotide technique. The obtained sequence is shown in the sequence of SEQ ID NO: 3. The same experiment was performed on other tissues, and especially tissues of human origin, other probes, and other Technology (PCR, Northern blot hybrid type Can be repeated. Moreover, the homology detected during these experiments The sequence can then be isolated and / or amplified by conventional molecular biology techniques. That is clear. Sequence listing (1) General information: (I) Applicant: (A) Name: INSERM (B) Street name: 101 rue de Tolbiac (C) City: PARIS (E) Country: France (F) Postal code: 75654 (Ii) Title of the invention: Novel polypeptide having serotonin-like receptor activity , Nucleic acids encoding these polypeptides, and uses (Iii) Number of sequences: 3 (Iv) Computer decoding form: (A) Medium type: tape (B) Computer: IBM PC compatible (C) Operating system: PC-DOS / MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1.0, V version # 1.25 (EPO) (2) Information about SEQ ID NO: 1: (I) Sequence features: (A) Sequence length: 2036 (B) Sequence type: nucleic acid (C) Number of chains: double-stranded (D) Topology: linear (Ii) Sequence type: cDNA (Iii) Hypothetical array: NO (Iii) Antisense: NO (Vi) Origin (A) Organism name: mouse (Ix) Sequence features (A) Name / Symbol: CDS (B) Location: 312. ． 1424 (Xi) array (2) Information about SEQ ID NO: 2: (I) Sequence features: (A) Sequence length: 370 (B) Sequence type: amino acid (D) Topology: linear (Ii) Sequence type: protein (Xi) array (2) Information about SEQ ID NO: 3: (I) Sequence features: (B) Sequence type: nucleic acid (C) Number of chains: double-stranded (D) Topology: linear (Ii) Sequence type: genomic DNA (Iii) Hypothetical array: NO (Iii) Antisense: NO (Vi) Origin (A) Organism name: Homo sapiens (Xi) array

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１月１１日【補正内容】請求の範囲１．配列番号２のぺプチド配列の全てもしくは一部または配列番号３のぺプチド配列の全てもしくは一部分を含むポリペプチド。２．セロトニンに結合する能力を保持することを特徴とする、請求の範囲１に記載のポリペプチド。３．セロトニン様レセプター活性を保持することを特徴とする、請求の範囲２に記載のポリペプチド。４．配列番号２の完全なポリペプチド配列を認識する抗体により認識されることが可能であることを特徴とする、請求の範囲１〜３の内の一つに記載のポリペプチド。５．配列番号２の全ペプチド配列を含むことを特徴とする、請求の範囲１〜４の内の一つに記載のポリペプチド。６．請求の範囲１〜５の内の一つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。７．（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列の全てもしくは一部分またはその相補鎖の全てもしくは一部分、（ｂ）配列（ａ）とハイブリダイズし、かつ請求の範囲１〜５の内の一つに記載のポリペプチドをコードするいずれかの配列、ならびに（ｃ）遺伝子コードの縮重の結果として配列（ａ）および（ｂ）から取得される配列、から選択されることを特徴とする、請求の範囲６に記載の配列。８．ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくはＲＮＡ配列、ハイブリッド配列、あるいは合成もしくは半合成配列から選択されることを特徴とする、請求の範囲７に記載の配列。９．前記ポリペプチドをコードする一部分が細胞宿主内でのその発現を可能にするシグナルの調節下に置かれることを特徴どする、請求の範囲６〜８の内の一つに記載の配列。１０．請求の範囲１〜５の内の一つに記載のポリペプチドの産生を少なくとも部分的に阻害することが可能なアンチセンス配列。１１．請求の範囲７に記載のヌクレオチド配列の全てもしくは一部分からなることを特徴とする、請求の範囲１０に記載の配列。１２．請求の範囲６に記載の配列もしくはそれに対応するｍＲＮＡとハイブリッド形成することが可能なヌクレオチドプローブ。１３．少なくとも１０の塩基を含むことを特徴とする、請求の範囲１２に記載のプローブ。１４．配列番号１もしくはその相補鎖の全てを含むことを特徴とする、請求の範囲１３に記載のプローブ。１５．５ＨＴ５ｂセロトニン様レセプターの発現を検出するため、あるいは遺伝子異常（間違ったスプライシング、多型性、および点突然変異など）を証明するため、あるいは神経学的、心臓血管学的、もしくは精神医学的疾患を５ＨＴ５ｂレセプターに関連するものとして同定するため、あるいは別法では５ＨＴ５ｂポリペプチドをコードする相同核酸配列を証明および単離するための、請求の範囲１２もしくは１３の内の一つに記載のプローブの使用。１６．請求の範囲１〜５の内の一つに記載のポリペプチドをその表面に発現することが可能な組換え細胞。１７．真核生物細胞もしくは原核生物細胞から選択されることを特徴とする、請求の範囲１６に記載の細胞。１８．以下に記載する、 − 恐らく未同定である、ある分子もしくは様々な分子を含む混合物を、請求の範囲１〜５に特定されるポリペプチドをその表面に発現する請求の範囲１６に記載の組換え細胞と、後者は前記ポリペプチドに対する親和性を保持する場合には前記ポリペプチドと前記分子との間の相互作用を可能にする条件下で接触させる段階、および − 前記ポリペプチドに結合した分子を検出および／または単離する段階、を実施することを特徴とする、請求の範囲１〜５に特定されるポリペプチドのリガンドを証明および／または単離するための方法。１９．セロトニン作用薬もしくは拮抗薬を証明および／または単離するための、請求の範囲１８に記載の方法。２０． − 恐らく未同定であるある分子もしくは様々な分子を含む混合物を、請求の範囲１−５に特定されるポリペプチドを表面に発現する請求の範囲１６に記載される組換え細胞と、５ＨＴの存在下、前記ポリペプチドと５ＨＴとの間の相互作用を可能にする条件下で接触させる段階、および − 前記ポリペプチドに関して５ＨＴの活性をモジュレートすることが可能な分子を検出および／または同定する段階、を実施することを特徴とする、請求の範囲１〜５に特定されるポリペプチドのモジュレーターを証明および／または単離するための方法。２１．５ＨＴ５ｂレセプターに関連する神経学的、心臓血管学的、もしくは精神医学的疾患の治療が意図される医療用産物の調製のための、請求の範囲１８〜２０の方法に従って同定および／または取得されるリガンドもしくはモジュレーターの使用。２２．請求の範囲１８〜２０の方法に従って同定および／または単離される少なくとも一つのリガンドもしくは一つのモジュレーターを活性成分として含む医療用産物。[Procedure Amendment] Patent Act Article 184-8 [Submission date] January 11, 1995 [Correction content] The scope of the claims 1. All or part of the peptide sequence of SEQ ID NO: 2 or the peptide of SEQ ID NO: 3 A polypeptide comprising all or part of a tide sequence. 2. Claim 1 characterized in that it retains the ability to bind serotonin. The polypeptide according to. 3. Claim, characterized in that it retains serotonin-like receptor activity. 2. The polypeptide according to 2. 4. Recognized by an antibody that recognizes the complete polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2 The poly according to one of claims 1 to 3, characterized in that peptide. 5. Claims 1 to 1, characterized in that it comprises the entire peptide sequence SEQ ID NO: 2. The polypeptide according to one of 4. 6. Nucleus encoding the polypeptide according to one of claims 1 to 5. Ochid arrangement. 7. (A) All or part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or All or part of the complementary strand, (B) hybridizes to the sequence (a) and is described in one of claims 1 to 5. Any of the sequences encoding the above polypeptides, and (C) obtained from sequences (a) and (b) as a result of the degeneracy of the genetic code Array, Sequence according to claim 6, characterized in that it is selected from 8. Genomic, cDNA, or RNA sequence, hybrid sequence, or The method according to claim 7, characterized in that it is selected from synthetic or semi-synthetic sequences. An array of. 9. Portion encoding said polypeptide allows its expression in a cellular host Within the scope of claims 6-8, characterized in that it is placed under the control of the signal Sequence described in one. 10. At least producing a polypeptide according to one of claims 1 to 5 An antisense sequence capable of partially inhibiting. 11. Consists of all or part of the nucleotide sequence according to claim 7. The sequence according to claim 10, characterized in that 12. A hybrid with the sequence according to claim 6 or mRNA corresponding thereto. A nucleotide probe capable of forming a probe. 13. 13. The method according to claim 12, characterized in that it comprises at least 10 bases. Probe. 14. Claims characterized in that they include all of SEQ ID NO: 1 or its complementary strand. The probe according to range 13. 15. To detect the expression of 5HT5b serotonin-like receptor, or Demonstrate gene abnormalities (wrong splicing, polymorphisms, and point mutations, etc.) For 5HT5 for neurological, cardiovascular, or psychiatric disorders 5HT5b to identify as being associated with the b receptor, or alternatively 5HT5b Claims for demonstrating and isolating homologous nucleic acid sequences encoding a polypeptide Use of the probe according to one of boxes 12 or 13. 16. Expressing the polypeptide according to any one of claims 1 to 5 on its surface A recombinant cell capable of 17． Characterized in that it is selected from eukaryotic cells or prokaryotic cells, The cell according to claim 16. 18. Described below, -Claim a mixture, possibly unidentified, of a molecule or of various molecules. The polypeptide specified in the range 1 to 5 is expressed on the surface thereof. The recombinant cells described, and the latter if they retain their affinity for the polypeptide Are contacted under conditions that allow the interaction between the polypeptide and the molecule. Stage, and -Detecting and / or isolating a molecule bound to said polypeptide, A polypeptide of the invention as defined in claims 1 to 5, characterized in that A method for demonstrating and / or isolating Gand. 19. For demonstrating and / or isolating serotonin agonists or antagonists The method according to claim 18. 20. -Probably an unidentified molecule or a mixture containing various molecules, A polypeptide according to claim 1 which expresses the polypeptide specified in claims 1-5 on its surface. Between the described recombinant cells and 5HT in the presence of 5HT Contacting under conditions that allow interaction, and It is possible to modulate the activity of 5HT with respect to said polypeptide Detecting and / or identifying a molecule, Of the polypeptide specified in claims 1 to 5, characterized in that A method for demonstrating and / or isolating a dulator. 21. Neurological, cardiovascular, or sperm associated with the 5HT5b receptor Claims 18-for the preparation of a medicinal product intended for the treatment of theological disorders 20 identified and / or acquired according to the method of 20. Use of Gand or modulator. 22. A minor identified and / or isolated according to the method of claims 18-20. A medicine containing at least one ligand or one modulator as an active ingredient. Medical products.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/575 8318−4ＨＣ１２Ｎ 1/15 8828−4Ｂ 1/19 8828−4Ｂ 1/21 8828−4Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＣ１２Ｑ 1/02 6807−4Ｂ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｒ 1:91） 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＥＮ //(Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者グライユ，レジフランス国エフ―67000ストラスブール・リユブールツビラー10 (72)発明者アン，ルネフランス国エフ―67000ストラスブール・リユカジユネク３ (72)発明者マテス，ハンスフランス国エフ―67000ストラスブール・リユロツペンハイム４ (72)発明者プラサ，ジヤン−リユクフランス国エフ―67000ストラスブール・ルートドロピタル62─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI C07K 14/575 8318-4H C12N 1/15 8828-4B 1/19 8828-4B 1/21 8828-4B 5 / 10 C12P 21/02 C 9282-4B C12Q 1/02 6807-4B 1/68 A 9453-4B // (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/02 C C12R 1:91) 9455-4C A61K 37/02 AEN // (C12N 5/00 B C12R 1:91) (72) Inventor Grail, Regi France F-67000 Strasbourg-Rieubourg Zbiler 10 (72) Inventor Anne, Rene F-67000 France Strasbourg Riyu Kazynek 3 (72) Inventor Mates, Hans Ef-67000 France France Strasbourg Riyu Rotupenheim 4 (72) Inventor Prasa, Jean-Liu France F -67000 Strasbourg route de Ropitaru 62

Claims

[Claims] 1. Of all or part of the peptide sequence SEQ ID NO: 2 or a derivative of the latter A polypeptide comprising all or part. 2. Claim 1 characterized in that it retains the ability to bind serotonin. The polypeptide according to. 3. Claim, characterized in that it retains serotonin-like receptor activity. 2. The polypeptide according to 2. 4. Recognized by an antibody that recognizes the complete polypeptide sequence of SEQ ID NO: 2 The polypeptide according to any one of claims 1 to 3, which is characterized in that 5. Characterized in that it comprises the entire peptide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 The polypeptide according to any one of claims 1 to 4, which is 6. Nucleus encoding the polypeptide according to one of claims 1 to 5. Ochid arrangement. 7. (A) All or part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or All or part of the complementary strand, (B) hybridizes to the sequence (a) and is described in one of claims 1 to 5. Any of the sequences encoding the above polypeptides, and (C) obtained from sequences (a) and (b) as a result of the degeneracy of the genetic code Array, Sequence according to claim 6, characterized in that it is selected from 8. Genomic, cDNA, or RNA sequence, hybrid sequence, or The method according to claim 7, characterized in that it is selected from synthetic or semi-synthetic sequences. An array of. 9. The portion encoding the polypeptide allows for its expression in a cellular host. One of claims 6 to 8, characterized in that it is placed under the control of a signal Sequence described in one. 10. At least producing a polypeptide according to one of claims 1 to 5 An antisense sequence capable of partially inhibiting. 11. Consists of all or part of the nucleotide sequence according to claim 7. The sequence according to claim 10, characterized in that 12. A hybrid with the sequence according to claim 6 or mRNA corresponding thereto. A nucleotide probe capable of forming a probe. 13. 13. The method according to claim 12, characterized in that it comprises at least 10 bases. Probe. 14. Characterized in that it comprises all of the sequence of SEQ ID NO: 1 or all of its complement The probe according to claim 13, which is: 15. To detect the expression of 5HT5b serotonin-like receptor, or Demonstrate gene abnormalities (wrong splicing, polymorphisms, and point mutations, etc.) For 5HT5 for neurological, cardiovascular, or psychiatric disorders 5HT5b to identify as being associated with the b receptor, or alternatively 5HT5b Claims for demonstrating and isolating homologous nucleic acid sequences encoding a polypeptide Use of the probe according to one of boxes 12 or 13. 16. Expressing the polypeptide according to one of claims 1 to 5 on its surface A recombinant cell capable of 17． Characterized in that it is selected from eukaryotic cells or prokaryotic cells, The cell according to claim 16. 18. Described below, -Claim a mixture, possibly unidentified, of a molecule or of various molecules. The polypeptide specified in the range 1-5 is expressed on the surface thereof. The recombinant cells described, and wherein the latter retains affinity for said polypeptide Are contacted under conditions that allow the interaction between the polypeptide and the molecule. Stage, and -Detecting and / or isolating a molecule bound to said polypeptide, A polypeptide of the invention as defined in claims 1 to 5, characterized in that A method for demonstrating and / or isolating Gand. 19. For demonstrating and / or isolating serotonin agonists or antagonists The method according to claim 18. 20. Described below, -Claim a mixture, possibly unidentified, of a molecule or of various molecules. The polypeptide specified in the range 1 to 5 is expressed on the surface thereof. Between the described recombinant cells and 5HT in the presence of 5HT Contacting under conditions that allow interaction, and It is possible to modulate the activity of 5HT with respect to said polypeptide Detecting and / or isolating the molecule, Of the polypeptide specified in claims 1 to 5, characterized in that A method of certifying and / or isolating a dulator. 21. Claim scope, obtainable according to the method of claims 18-20 Ligands or modules of the polypeptides identified in Boxes 1-5 Rater. 22. Neurological, cardiovascular, or sperm associated with the 5HT5b receptor Claims 18-for the preparation of a medicinal product intended for the treatment of theological disorders 20. Ligands or modules identified and / or obtained according to 20 methods Use of the tar. 23. At least acting on a polypeptide according to one of claims 1-5 A medical product containing one molecule as an active ingredient. 24. The molecule is identified and / or identified according to the method of claims 18-20. Claims, characterized in that it is an isolated ligand or modulator. The medical product according to box 23.