JPH08506010A - 安定性と活性を高めたサブチリンの変異形 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 天然の配列のＧｌｕ４をイソロイシンで置換したサブチリン変異体は、安定性において５７倍の改善を示し、５位のデヒドロアラニン残基の修飾に耐性を示す。この安定な変異体は、細菌の胞子の発生において、天然のバクテリオシンの３-４倍の特定の活性を示す。結果として生じる変異遺伝子、プラスミドおよび形質転換体に加えて、部位特異的変異誘発の方法についても同様に記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 安定性と活性を高めたサブチリンの変異形 本出願は、米国特許出願第０７／２１４９５９号の一部継続出願であり、その 内容の全体を参照としてここに取り込むものである。技術分野 本発明は、非バクテリオシン発現型（non-bacteriocin expressing）バシラス 株のバクテリオシン発現型バシラス株への転換方法と、この方法によって生産さ れたサブチリンの変異形に関するものである。特に、その遺伝子および遺伝子の 発現手段と共に、安定性と活性とが高められたサブチリンの形態に関する。背景技術 親出願第０７／２１４９５９号において、完全なサブチリンとニシン（nisin ）の発現のポリペプチド前駆体と、これに対応する遺伝子配列とを開示した。こ の親出願に述べられているように、これらのバクテリオシンは、おそらくリボソ ーム上で、細胞内に含有される特異的酵素機構により、核酸の翻訳に伴って導入 された普通でないアミノ酸を含有することが特に興味深い。しかして、この親出 願は、翻訳後の修飾を受けて完全なバクテリオシンの発現を引き起こすポリペプ チド前駆体の発現に必要な遺伝子とアミノ酸リーダー配列とを同定するものであ る。 上記二つの抗生物質は、顕著な構造の相同性を有しているものの、親出願でも 記述されているように、ある化学的な性質において全く別個のものである。特に 重要なことは、サブチリンがニシンよりかなり迅速に自発的な不活性化を受ける 傾向を示すことである。ｐＨ６．８の水溶液における自発的な不活性化は、一次 反応速度（kinetic first-order）ｔ_1/2が０．８日の、完全なバクテリオシンの ５位のデヒドロアラニンの化学修飾を伴う。４位のアミノ酸、Ｇｌｕが、Ｒ基を そのカルボキシル基の一部に露出させ、これが隣接したアミノ酸残基の化学修飾 に 関与することは注目される。 しかして、低いｐＨと高温における不活性化に耐性を示すニシン（Hurst，Adv anced Application of Microbiology，volume 27，85-123頁（1981））は、食品 の防腐剤として（Hurst，上掲、およびJay，Food Microbiology，vol.8，117-14 3頁（1983））、また細菌の感染のための処置に（Searsら、Journal of Diary S cience 74，203頁（1991））広く用いられている。これと対照的に、作用範囲が 広いにも関わらず、サブチリンは不安定であるために、実用的な価値がほとんど ない。（Jay，上掲）。 不活性化に対する耐性を有し、相応の活性を示すサブチリンの完全な形態を得 て、ニシンの潜在的な利用性を持つ抗生物質を提供することは明らかに当業者が 所望するところである。実在する抗生物質の広範な使用による、微生物の個体群 に見られた抗生物質耐性の増加を考慮すると、これは特に重要なことである。収 率を改善し、開発の利益を得るためには、バシラス宿主からサブチリンの形態を 生産することがさらに望ましい。発明の開示 高い安定性と高い特定の活性とを有する変異したサブチリンは、その４位にお いて、本来の、天然に見いだされるサブチリンのグルタミン酸に代えてイソロイ シンで置換された点を除けば、天然の完全なサブチリンのアミノ酸配列を備えて いる。この置換により、特定の活性が３-４倍増加するだけでなく、化学的かつ 生物学的な安定性が５７倍増加する。明らかに、グルタミン酸のカルボキシル基 の一部は、５位のデヒドロアラニンの化学的修飾に関与するが、イソロイシンは そのような修飾を引き起こさないので、５位のデヒドロアラニンの一部の安定性 が増加する。３〜４倍の増加は全く予期せぬものである。発明の簡単な説明 図１は、バクテリオシン、サブチリンおよびニシンのアミノ酸配列を示す図で ある。星印は、α炭素におけるＤ型の立体配置を有するアミノ酸を示している。 図２Ａおよび２Ｂは、天然のサブチリンとＥ４Ｉ-サブチリン（変異体である 請求した発明）のプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを比較したものであ る。 図３のグラフは、天然のサブチリンとＥ４Ｉ-サブチリン変異体のＤＨＩの消 滅、共鳴のピークおよびプロトンＮＭＲスペクトルを比較したものである。 図４は、天然のサブチリンのＧｌｕ₄のカルボキシル基の一部によって促進さ れる、サブチリンのＤＨＡ₅残基の修飾に関わる仮説に基づいた機構を図示した ものである。 図５は、変異誘発と、染色体サブチリン遺伝子の変異サブチリン遺伝子との置 換に用いられた宿主ベクターの組み合わせにおけるｓｐａオペロンを図示したも のである。 図６は、請求された発明で用いられたBstEII-XbaI制限断片の変異誘発を図示 したものである。野生型の配列は、サブチリンの構造遺伝子を含有している。結 果の制限部位名と共に配列の上方に示された核酸の変形は、遺伝子の翻訳産物を 変化させないサイレントコドン（silent codons）からなる。 図７は、サブチリンとＥ４Ｉ-サブチリン変異体との両方を生産するコロニー の代表的なハロ分析（halo assay）を示したものである。本発明を実施する最良の形態 天然のサブチリンは、５位にデヒドロアラニン部分を提示している（ＤＨＡ₅ ）。化学的または生物学的環境によって誘発されるサブチリンの不活性化は、一 次反応速度Ｐ_1/2が０．８日の、ＤＨＡ₅部分の修飾を伴い、この修飾は、サブチ リンの活性の減少に対応すると思われる。図４に示されているように、ＤＨＡ₅ のこの化学的修飾は、４位のＧｌｕ₄のアミノ酸残基のカルボキソル基によって 促進されていると思われる。 ＤＨＡ₅が化学的な不活性化を受けやすいという点に関わらず、ＤＨＡ₅を相当 するアミノ酸、すなわちアラニン（二重結合は破壊してしまうものの、天然の残 基の疎水性を維持している）で置換した結果、細菌の胞子発生に対する活性が完 全に消失した。しかして、ＤＨＡ₅部分の維持は、活性を維持することに不可欠 である。 アミノ酸残基４のグルタミン酸が、天然のサブチリンの不活性化に寄与してい ると疑われるため、部位特異的変異誘発によって、この部分がイソロイシンに転 換された。Ｅ４Ｉ-サブチリンに示されたこの変異したサブチリンのＤＨＡ₅は、 ｔ_1/2が４８日の、化学修飾を受けたが、これは天然のサブチリンより５７倍も 遅い。図３に示されているように、生物学的活性の消失速度は、同じ量だけ下が った。 全く予期せぬことに、Ｅ４Ｉ-サブチリンの特定の活性は、天然のサブチリン より３-４倍高かった。 天然のサブチリンをＥ４Ｉサブチリンに転換するのに必要な部位特異的変異誘 発、この単離、ＤＨＩ₅の有用性の監視および生物学的安定性の測定の全てを、 以下の特定の実施例において詳説する。菌株、クローニングベクターおよび培養条件 大腸菌におけるクローニングを標準的な方法で行った（Maniatisら、Molecula r Cloning：A Laboratory Manual（1982））。適切な枯草菌の形質転換を、記述 された通りに行った（Wilsonら、J．Bacteriol.，94，562-570 95，1439-1449（ 1967および1968）；Youngら、Handbook of Genetics，Vol．1，69-114頁（1974 ））。ＰＡＢ媒体は、Antibiotic Medium 3（Difco）であり、かつＴＢＡＢ媒体 は、Tryptose Blood Agar Base（Difco）であって、０．８％の寒天を含有した プレートである。クロラムフェニコールおよびエリスロマイシン（Sicjma）は、 ｍＬ当たり１０μｇとして用いられた。天然のサブチリンおよび変異サブチリンの単離 天然のサブチリンを、以前に公表された方法（JenzenとHirschman，Arch．Bio chem.，4，197-309（1944））を変形したものにより枯草菌ATCC 6633培養株から 単離した。細胞を１０％のスクロースを含有する媒体Ａ（BannerjeeとHansen，J ．Biol．Chem.，263，9508-9514（1988））で生育させ、３５℃で３０−３５時 間良好な通気を行ってインキュベートした。この培養株をリン酸を用いてｐＨ２ ．８まで酸性化し、１２１℃で３分間オートクレーブ内で加熱してプロテアーゼ を不活 性化し、室温まで冷却した。１／２容量のｎ-ブタノールを添加し、４℃で２時 間攪拌し、さらに４℃で２時間放置し、遠心分離した。上清に２．５分量のアセ トンを添加し、−２０℃で少なくとも２時間放置し、遠心分離した。ほとんどの ペレットはサブチリンであり、９５％のエタノールで洗浄し、簡単に凍結乾燥さ せ、０．１％のトリフルオロ酢酸に溶解した。これを、トリフルオロ酢酸-水-ア セトニトリルの勾配をかける、以前にニシン（20）について記載されたようにＲ Ｐ-ＨＰＬＣによって直ちに精製した。サブチリンは、この勾配によりニシンよ りわずかに遅く溶出した。ピーク部を回収し、凍結乾燥し，−８０℃で保存した 。プロトンＮＭＲスペクトル分析にかけるサブチリンを、重水素化した水（９９ ．９６原子％Ｄ、Aldrich Chemical Co.社）に溶解し、プロトンを交換するため に凍結乾燥した（二回繰り返した）。細胞を２％のスクロースを含有する媒体Ａ に載せること以外は前記と同一の方法によってＥ４Ｉ-サブチリン変異体を単離 し、Ｅ４Ｉ-サブチリンは、前記のＨＰＬＣ勾配で天然のサブチリンより幾分遅 く溶出したが、これはＥ４Ｉ-サブチリンが、サブチリンよりわずかに疎水性が 強いことを反映している。サブチリンが光感受性であることが報告されており（ 1）、このためサブチリンとＥ４Ｉ-サブチリンのサンプルを慣例的に遮光した。 Ｅ４Ｉ-サブチリンが光感受性を有しているか否かは、決定できなかった。 アミノ酸組成分析を、ＨＣＩ加水分解の後にHewlett Packard社（Fort Collin s，CO）のAminoQuantアミノ酸分析器を用いて行った。Ｎ末端配列分析は、Appli ed Biosystems社（Foster City，CA）のModel 477Aペプチドシークエンサーおよ びModel 120A分析器を用いて行った。核酸は、Biosearch Model 8500オリゴヌク レオチドシンセサイザーを用いて合成した。ＤＨＡ₅の化学的安定性の測定 ニシンおよびサブチリンのデヒドロ残基は、プロトンＮＭＲスペクトルでよく 分離した共鳴を与えるビニルプロトンを備えている（LiuとHansen，Appl．Envir on．Microbial.，56，251-2558（1990））。ＮＭＲスペクトルでのビニルプロト ンピークの面積を測定し、ゼロ時の時と比較した経時的なＤＨＡ₅の化学修飾を 、サブチリンおよびＥ４Ｉ-サブチリンにおけるＤＨＡ₅ビニルプロトンのピーク 面積の減少としてとらえた。プロトンＮＭＲスペクトルは、Bruker AMX-500 Ｎ ＭＲスペクトロメーターを用いて得られた。スペクトルは、２９５Ｋの一定温度 で、選択的な溶媒抑制を使用して得られた。サブチリンの生物学的安定性の測定 生物学的活性を、以前に記載されたように（Morrisら、J．Biol．Chem.，259 ，13590-13594（1984）およびAppl．Environ．Microbial.，42，958-962（1981 ））、様々な濃度のサブチリンを１５ｍｌのポリプロピレン管内のBacillus cer eus Ｔ胞子の懸濁液に添加し、液体分析によって測定し、阻害効果を位相差顕微 鏡（phase-contrast microscopy）法により評価した。３時間の分析期間内にお ける胞子の発生を阻害するのに必要とされるサブチリンの量が、抗菌活性の尺度 として用いられた。サブチリンの相対量を、精製中にＣ-１８分析ＨＰＬＣカラ ムから溶出したサブチリンピーク（２５４ｎｍで測定）の面積から概算した。こ の量を、サブチリンのピーク面積と既知のモル数のニシンスタンダード（21）の ピーク面積とを比較することにより、サブチリンのモル数に変換した。以上のこ とを導くために、２５４ｎｍにおけるニシンとサブチリンの吸光係数は同じであ り、この波長における吸収が、主に双方のペプチドに存在する同一の３つのデヒ ドロ基によるものと仮定した。Ｅ４Ｉ-サブチリン変異体の生物学的活性は、天 然のサブチリンと同一の方法で決定された。天然のサブチリンの化学的かつ生物学的安定性 サブチリンの自然界の生産者は、枯草菌（B.subtilis）ATCC 6633である。サ ブチリンを、上述したようにこの生物体の培養液の上清から単離および精製した 。この精製したサブチリンを二つのサンプルに分注し、その一方をｐＨ６．８の Ｄ₂Ｏに溶解し、プロトンＮＭＲ分光法にかけ、他方をｐＨ６．８の５０ｍＭの ＮａＰｉに溶解して一部分を生物学的活性の分析に当てた。上記の溶解したサン プルを室温でインキュベートし、時々一方のサンプルのＮＭＲスペクトルと他方 のサンプルの生物学的活性とを決定した。インキュベーションの間に変化したＮ ＭＲスペクトルの唯一のビニルプロトンピークが、ＤＨＡ₅に相当するものであ り 、経時的に面積が減少している（図２）。図３は、ＤＨＡ₅の消滅速度が、ｔ_1/2 が０．８日である一次機構に従うことを示している。また、図３は、これとほぼ 同一の速度で生物学的活性が下がることも示している。 その反応性に影響を与えるＤＨＡ₅の化学的環境は、ペプチド内のあらゆると ころから発揮されるものであるが、ＤＨＡ₅のすぐ隣の残基が特に重要らしい。 このことは、異なるＤＨＡ₅の近くの３つの残基に注意を集中する。さらに絞り こんで、ＤＨＡ₅にすぐ隣接する４位のグルタミン酸が、ＤＨＡ₅の修飾に関わり 得る機構が存在するという点で特に疑わしい。一つの可能性は、グルタミン酸の カルボキシル基が、ＤＨＡ₅の二重結合に直接結合することである。他の、おそ らくより適切とされる機構は、グルタミン酸のカルボキシル基が図４に示すよう に潜在的な求核（nucleopphileby）脱プロトン化を活性化する一般的な塩基とし て作用することである。例えば、球核体（nucleophile）が、水分子の脱プロト ン化によって誘導されたヒドロキシルイオンであれば、ＤＨＡ₅の一次修飾速度 を、実際に観察されたようなものと考えるであろう。サブチリン潰伝子の変異のための宿主-ベクターシステム サブチリン遺伝子の変異は、宿主-ベクターシステムの開発を必要とした。サ ブチリンペプチドをコードする遺伝子（ｓｐａＳ）は、枯草菌の染色体のｓｐａ オペロンの一部である（図５）。これは、配列を図６に示した天然のBstEII-Xba I制限断片に存在する。プレペプチド（prepeptide）遺伝子は、あまりに小さい ために有用な制限部位を多くは備えていないので、新規の制限部位を翻訳の産物 を変化させることなく導入する変化をサイレント部位に施した配列とした。設計 された配列および導入された制限部位を図６に示す。これらの新規な制限部位の 付加により、サブチリン遺伝子に変異を起こすカートリッジ変異誘発が可能とな る。 枯草菌でマルチコピープラスミドからサブチリンプレペプチドを発現させる以 前の試みは失敗し、サブチリン遺伝子の変異体は、染色体の天然の遺伝子の部位 に配置させて発現させるべきであるとの結論に至った。これが変異体のコピーで 天然の遺伝子を置換する前に、天然の遺伝子を除いて成されたならば、同一の細 胞内に天然のコピーと変異体のコピーとを同時に発現してしまう曖昧さに関する 不安を除くことができる。直線状プラスミドと染色体配列との間の二重交差（do uble-crossover）により、枯草菌に染色体遺伝子を置換する方法は充分に確立さ れており、適切な染色体の相同性が側面に位置する適切な選択的標識をプラスミ ドが含有することのみを必要とする。これを達成するために、エリスロマイシン 耐性（ｅｒｍ）遺伝子を用いて、染色体サブチリン遺伝子を第一に置換し、従っ て除去した。次に、ｅｒｍ遺伝子を、図５に示すように、選択的標識として側面 に位置するクロラムフェニコール耐性（ｃａｔ）遺伝子を用いたサブチリン遺伝 子の変異体コピーで置換した。サブチリン遺伝子の代わりにｅｒｍ遺伝子を含有 する枯草菌宿主細胞（LHerm△S）も図５に示されている。このLHerm△S-pSMcat 宿主-ベクターの組み合わせは、非常に用途が広く、種々の部位直接的および任 意の手法によるサブチリン遺伝子の変異誘発に使用される。 サブチリンの変異体を作成する前に、このソステムを徹底的に調べた。天然の サブチリン遺伝子をerm遺伝子で置換したLHerm△S宿主を注意深く調べ、エリス ロマイシン耐性を備え、サブチリン遺伝子を欠き、しかもハロ分析（図７）によ って確証されるようにサブチリンを生産することができないことを証明した。pS Mcatプラスミドの設計された配列を、ＤＮＡ配列分析で確認し、直線状にして、 二重交差（ダブルクロスオーバー）によってLHerm△S宿主の染色体に組み込んだ ところ、そこで宿主はエリスロマイシン感受性およびクロラムフェニコール耐性 になり、ex-m遺伝子がSMcat配列で置換されたことを示している。これらの細胞 は通常量のサブチリン活性を表し（図７）、新規の制限部位を与えるために配列 内に導入されたサイレント変異が確かに沈黙したもの（サイレント）であり、遺 伝子の転写-翻訳が正常に起こることを示している。サザンハイブリダイゼーシ ョン分析により、遺伝子が染色体の適切な位置に組み込まれたことが示された。Ｅ４Ｉ-サブチリンの作成 次いで、BstBI-SmaI断片の切り出しおよびこの断片とBstBI-SmaI変異誘発断片 とを置換することにより、Ｅ４Ｉ変異をpSMcatプラスミドに導入し、Ｇｌｕ₄コ ドンがＩｌｅコドンで置換されたプラスミドpE4IScatを与えた。断片の置換を、 pE4IScat中の挿入物をＤＮＡ配列分析することによって確認した。次いで変異誘 発された配列を、pE4IScatを直線状にし、これを宿主に形質転換し、さらにクロ ラムフェニコール−ＰＡＢプレート上で二重交差置換体を選択することによって 、LHerm△S宿主染色体に導入した。クロラムフェニコール耐性およびエリスロマ イシン感受性コロニーが見られ、ｅｒｍ遺伝子が変異体サブチリン遺伝子で置換 されたことを示している。いくつかのクロラムフェニコール耐性コロニーを選択 し、サザンハイブリダイゼーション分析にかけたところ、変異体サブチリン遺伝 子がLHerm△S宿主に組み込まれたことを示した。これらのコロニーの一つで、LH E4IScatと呼ばれるものを、図７に示すように、ハロ分析でサブチリン様の活性 について分析した。LHE4IScatコロニーはハロ（halo）を作成し、生産したE4I- サブチリンが抗菌活性を有することが分かった。このコロニーを培養液で生育さ せ、これから推定されるE4I-サブチリンを単離し、次いでＨＰＬＣクロマトグラ フィーで精製した。E4I-サブチリンは、高濃度のアセトニトリルで、天然のサブ チリンより勾配において遅く溶出しており、この変異体が予想通りより疎水性で あることに一致している。E4I-サブチリンを、アミノ酸組成およびＮ末端配列の 分析にかけた。組成は、予想通り天然のサブチリンよりＩｌｅが一つ多く、Ｇｌ ｕ（Ｇｌｘとして決定された）が一つ少ないことを示したが、その他は予想通り 天然のサブチリンと同じであった。Ｎ末端配列は、Ｔｒｐ-Ｌｙｓ-（空白）-Ｉ ｌｅ（以下配列空白）であり、Ｔｒｐ-Lｙｓ-（空白）-Ｇｌｕ（以下配列空白） を与える天然のサブチリンと比較される。３位の残基における空白は、チオエー テル基にアラニンが鎖でつながれており、放出されない（Kellnerら、Eur．J．B iochem.，177，53-59（1988）、およびAgnew，Chem．Int．Ed．Eng1.，28，616- 619（1988））ことによるものと予想され、さらにエドマン分解は、デヒドロ残 基を処理することができないことから５位の残基で停止した（LiuとHansen，J． Bacteriol.，173，7387-7390（1991））。しかして、組成分析およびＮ末端配列 は、E4I-サブチリンプレペプチドが、全てのセリンおよび全てのトレオニンの脱 水、構造の領域内におけるチオエーテルの架橋構造の形成、およびリーダーペプ チドの適切な除去を含む翻訳後修飾を十分に受けたことを示している。もし、い くつかの脱水または架橋の一つが起こらなかったら、あるいはもしリーダー配列 が不正 確に切断されたなら、異常なアミノ酸組成、または異常なＮ末端配列、あるいは これら両方として反映されるであろう。E4I-サブチリンは高い特定の活性を有する E4I-サブチリンの特定の活性を、胞子発生分析を用いて測定し、天然のサブチ リンと比較した。E4I-サブチリンは、１ｍｌ当たりほぼ0.3μｇ（80nM）で阻害 が見られたのに対して、通常のサブチリンは、１ｍｌ当たりほぼ１μｇ（280nM ）で阻害を示した。従って、変異体サブチリンは、この特定の生物学的分析で天 然のサブチリンより３−４倍優れた効能があった。注目に値することは、天然の サブチリン、そして特に変異体のサブチリンは、アンピシリンやクロラムフェニ コール等の他の通常の抗生物質よりかなり低い（大きさの順）モル濃度で効果的 であることである。E4I-サブチリンは高い化学的および生物学的安定性を有する 安定な変異体サブチリンを作成する中心となる設計策は、サブチリンの化学的 および生物学的安定性がＤＨＡ₅の化学的反応性によって決定され、天然のサブ チリンのＤＨＡ₅は、Ｇｌｕ₄カルボキシル基がその化学的修飾に関与しているた めに（図４）不安定であるという考えに基づいている。この考えは、カルボキシ ル基がＤＨＡ₅の修飾に関与する可能性が除去されることから、Ｇｌｕ₄のＩｌｅ への変異がサブチリンの化学的および生物学的安定性を高めるであろうという予 想に至る。従って、E4I-サブチリンのＤＨＡ₅の化学的安定性は、天然のサブチ リンで行ったようなＮＭＲスペクトルにおけるＤＨＡ₅ビニルプロトン共鳴ピー クの経時的消滅を観察することによって評価される。図３は、ＤＨＡ₅の消滅速 度がｔ_1/2が４８日である一次の速度行程に従うことを示している。これは、ｔ_{1 /2} がわずか０．８日である天然のサブチリンと比較して、E4I-サブチリンの安定 性において劇的な５７倍の増加である。生物学的安定性は、胞子発生分析を用い た同じ時間経過の後の抗菌活性を測定することによって決定された。図３は、変 異体サブチリンの抗菌活性が４８日のインキュベーション期間の間にほとんど下 がらないことを示しており、生物学的安定性が、天然のサブチリンと比較して劇 的に増加したことを示している。Ｇｌｕ₄からＩｌｅへの変異が、ＤＨＡ₅残基の 化学的安定性と生物学的活性との両方に関連する、サブチリン分子の一般的な安 定性の劇的な増加を引き起こすと結論づけた。ＤＨＡ₅がＡｌａに変異したE4I-サブチリンは胞子発生に対する活性を全く有し ていない もし、ＤＨＡ₅がサブチリンの抗菌活性において重要な役割を演じるならば、 それが他の残基に変異すると、細菌の胞子分析において全く活性を持たない分子 になるであろう。E4I-サブチリンのＤＨＡ₅残基をＡｌａに変異させる実験が適 切であると決断した。Ａｌａは、二重結合を破壊するが、ＤＨＡ₅の親水性を維 持するために選択された。優れた固有の安定性のために、E4I-サブチリンをサブ チリンの代わりに選択した。E4I/DHA5A-サブチリンを、図６に示された変異オリ ゴヌクレオチドを用いて作成した。変異体を、サブチリンとE4I-サブチリンと同 じ方法で単離し、アミノ酸組成分析、Ｎ末端配列分析およびＮＭＲスペクトル分 析からなる、正しい翻訳後プロセシングの完全な試験にかけた。結果は、全ての 翻訳後の段階が正確に起きたことを立証した。次いで、E4I/DHA5A変異体サブチ リンの生物学的活性を、細菌の胞子発生分析で決定した。E4I-サブチリンは、胞 子の発生を０．３μｇ／ｍｌの濃度で阻害したが、E4I/DHA5Aサブチリンは、E4I -サブチリンが阻害する濃度より１５０倍も高濃度である５０μｇ／ｍｌの濃度 においてさえ、胞子の発生に対する阻害活性に欠けていた。さらに高濃度につい ては調べなかった。従って、完全なＤＨＡ₅は、胞子の発生を阻害するために重 要であると結論づけられる。 従って、請求された発明のE4I-サブチリン（４位において本来存在するグルタ ミン酸残基の代わりにイソロイシン残基で置換したことを除いては天然のサブチ リンと同一）は、特定の活性において天然に発現した抗生物質の３−４倍の増加 を伴い、天然の形態より５７倍も安定した抗生物質を得る。５位の活性に重要な デヒドロアラニンの不活性化を行うことがなく、しかも独立に抗生物質の作用に 悪影響をもたらすことのない他の残基を、類似した結果を与えるために用いるこ とができる。このような類似体の調製は、上述したプロトコールによって行われ る経験的な研究事項である。 明らかに、本発明の多数の変更および変形が、上記の教示を考慮すれば可能で ある。それゆえ、付加した請求の範囲の範囲内で、本発明はここに特に記載され たものとは異なった形で実施されてもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:125）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然の配列の４位が、イソロイシンで置換されたことを除いては、天然のサ ブチリンのアミノ酸配列を備えている抗生物質。 ２．天然のサブチリンより少なくとも１０倍優れた安定性と３倍優れた活性を示 し、４位を除いては天然のサブチリンのアミノ酸配列と実質的な相同性を有する 抗生物質。 ３．枯草菌で発現させた際に、請求項１記載の抗生物質に転換されるポリペプチ ドをコードする遺伝子。 ４．請求項３記載の遺伝子を含有するプラスミド。 ５．請求項３記載の遺伝子を発現する形質転換体微生物。 ６．変異バクテリオシンの発現を欠いたバシラス株から調製された形質転換体微 生物において、前記形質転換体は前記微生物による翻訳の後に前記変異バクテリ オシンに変形されるプレペプチドを発現する遺伝子を含有し、前記遺伝子は、天 然のバクテリオシンを発現する前記株の遺伝子を削除するとともに、正しい読み 枠内であって天然のＤＮＡの前記遺伝子が占めていた箇所に相当する部位に前記 遺伝子を挿入する宿主-ベクターの組み合わせによって、前記株のＤＮＡに挿入 されたことを特徴とする形質転換体微生物。 ７．変異バクテリオシンプレペプチドの発現のためにＤＮＡの挿入により宿主バ シラス株を形質転換する方法において、 前記宿主株から前記バクテリオシンの天然の形態を発現する遺伝子を削除し、 該遺伝子を識別可能な表現型を発生させる標識遺伝子で置換し、正しい読み枠内 であって削除された前記遺伝子が占めていた前記宿主ＤＮＡの位置に前記変異バ クテリオシンプレペプチドをコードする遺伝子で前記標識遺伝子を置換すること を特徴とする形質転換方法。