JPH08506010A - 安定性と活性を高めたサブチリンの変異形 - Google Patents
安定性と活性を高めたサブチリンの変異形Info
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Abstract
(57)【要約】
天然の配列のGlu4をイソロイシンで置換したサブチリン変異体は、安定性において57倍の改善を示し、5位のデヒドロアラニン残基の修飾に耐性を示す。この安定な変異体は、細菌の胞子の発生において、天然のバクテリオシンの3-4倍の特定の活性を示す。結果として生じる変異遺伝子、プラスミドおよび形質転換体に加えて、部位特異的変異誘発の方法についても同様に記載されている。
Description
【発明の詳細な説明】
安定性と活性を高めたサブチリンの変異形
本出願は、米国特許出願第07/214959号の一部継続出願であり、その
内容の全体を参照としてここに取り込むものである。技術分野
本発明は、非バクテリオシン発現型(non-bacteriocin expressing)バシラス
株のバクテリオシン発現型バシラス株への転換方法と、この方法によって生産さ
れたサブチリンの変異形に関するものである。特に、その遺伝子および遺伝子の
発現手段と共に、安定性と活性とが高められたサブチリンの形態に関する。背景技術
親出願第07/214959号において、完全なサブチリンとニシン(nisin
)の発現のポリペプチド前駆体と、これに対応する遺伝子配列とを開示した。こ
の親出願に述べられているように、これらのバクテリオシンは、おそらくリボソ
ーム上で、細胞内に含有される特異的酵素機構により、核酸の翻訳に伴って導入
された普通でないアミノ酸を含有することが特に興味深い。しかして、この親出
願は、翻訳後の修飾を受けて完全なバクテリオシンの発現を引き起こすポリペプ
チド前駆体の発現に必要な遺伝子とアミノ酸リーダー配列とを同定するものであ
る。
上記二つの抗生物質は、顕著な構造の相同性を有しているものの、親出願でも
記述されているように、ある化学的な性質において全く別個のものである。特に
重要なことは、サブチリンがニシンよりかなり迅速に自発的な不活性化を受ける
傾向を示すことである。pH6.8の水溶液における自発的な不活性化は、一次
反応速度(kinetic first-order)t1/2が0.8日の、完全なバクテリオシンの
5位のデヒドロアラニンの化学修飾を伴う。4位のアミノ酸、Gluが、R基を
そのカルボキシル基の一部に露出させ、これが隣接したアミノ酸残基の化学修飾
に
関与することは注目される。
しかして、低いpHと高温における不活性化に耐性を示すニシン(Hurst,Adv
anced Application of Microbiology,volume 27,85-123頁(1981))は、食品
の防腐剤として(Hurst,上掲、およびJay,Food Microbiology,vol.8,117-14
3頁(1983))、また細菌の感染のための処置に(Searsら、Journal of Diary S
cience 74,203頁(1991))広く用いられている。これと対照的に、作用範囲が
広いにも関わらず、サブチリンは不安定であるために、実用的な価値がほとんど
ない。(Jay,上掲)。
不活性化に対する耐性を有し、相応の活性を示すサブチリンの完全な形態を得
て、ニシンの潜在的な利用性を持つ抗生物質を提供することは明らかに当業者が
所望するところである。実在する抗生物質の広範な使用による、微生物の個体群
に見られた抗生物質耐性の増加を考慮すると、これは特に重要なことである。収
率を改善し、開発の利益を得るためには、バシラス宿主からサブチリンの形態を
生産することがさらに望ましい。発明の開示
高い安定性と高い特定の活性とを有する変異したサブチリンは、その4位にお
いて、本来の、天然に見いだされるサブチリンのグルタミン酸に代えてイソロイ
シンで置換された点を除けば、天然の完全なサブチリンのアミノ酸配列を備えて
いる。この置換により、特定の活性が3-4倍増加するだけでなく、化学的かつ
生物学的な安定性が57倍増加する。明らかに、グルタミン酸のカルボキシル基
の一部は、5位のデヒドロアラニンの化学的修飾に関与するが、イソロイシンは
そのような修飾を引き起こさないので、5位のデヒドロアラニンの一部の安定性
が増加する。3〜4倍の増加は全く予期せぬものである。発明の簡単な説明
図1は、バクテリオシン、サブチリンおよびニシンのアミノ酸配列を示す図で
ある。星印は、α炭素におけるD型の立体配置を有するアミノ酸を示している。
図2Aおよび2Bは、天然のサブチリンとE4I-サブチリン(変異体である
請求した発明)のプロトン核磁気共鳴(NMR)スペクトルを比較したものであ
る。
図3のグラフは、天然のサブチリンとE4I-サブチリン変異体のDHIの消
滅、共鳴のピークおよびプロトンNMRスペクトルを比較したものである。
図4は、天然のサブチリンのGlu4のカルボキシル基の一部によって促進さ
れる、サブチリンのDHA5残基の修飾に関わる仮説に基づいた機構を図示した
ものである。
図5は、変異誘発と、染色体サブチリン遺伝子の変異サブチリン遺伝子との置
換に用いられた宿主ベクターの組み合わせにおけるspaオペロンを図示したも
のである。
図6は、請求された発明で用いられたBstEII-XbaI制限断片の変異誘発を図示
したものである。野生型の配列は、サブチリンの構造遺伝子を含有している。結
果の制限部位名と共に配列の上方に示された核酸の変形は、遺伝子の翻訳産物を
変化させないサイレントコドン(silent codons)からなる。
図7は、サブチリンとE4I-サブチリン変異体との両方を生産するコロニー
の代表的なハロ分析(halo assay)を示したものである。本発明を実施する最良の形態
天然のサブチリンは、5位にデヒドロアラニン部分を提示している(DHA5
)。化学的または生物学的環境によって誘発されるサブチリンの不活性化は、一
次反応速度P1/2が0.8日の、DHA5部分の修飾を伴い、この修飾は、サブチ
リンの活性の減少に対応すると思われる。図4に示されているように、DHA5
のこの化学的修飾は、4位のGlu4のアミノ酸残基のカルボキソル基によって
促進されていると思われる。
DHA5が化学的な不活性化を受けやすいという点に関わらず、DHA5を相当
するアミノ酸、すなわちアラニン(二重結合は破壊してしまうものの、天然の残
基の疎水性を維持している)で置換した結果、細菌の胞子発生に対する活性が完
全に消失した。しかして、DHA5部分の維持は、活性を維持することに不可欠
である。
アミノ酸残基4のグルタミン酸が、天然のサブチリンの不活性化に寄与してい
ると疑われるため、部位特異的変異誘発によって、この部分がイソロイシンに転
換された。E4I-サブチリンに示されたこの変異したサブチリンのDHA5は、
t1/2が48日の、化学修飾を受けたが、これは天然のサブチリンより57倍も
遅い。図3に示されているように、生物学的活性の消失速度は、同じ量だけ下が
った。
全く予期せぬことに、E4I-サブチリンの特定の活性は、天然のサブチリン
より3-4倍高かった。
天然のサブチリンをE4Iサブチリンに転換するのに必要な部位特異的変異誘
発、この単離、DHI5の有用性の監視および生物学的安定性の測定の全てを、
以下の特定の実施例において詳説する。菌株、クローニングベクターおよび培養条件
大腸菌におけるクローニングを標準的な方法で行った(Maniatisら、Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual(1982))。適切な枯草菌の形質転換を、記述
された通りに行った(Wilsonら、J.Bacteriol.,94,562-570 95,1439-1449(
1967および1968);Youngら、Handbook of Genetics,Vol.1,69-114頁(1974
))。PAB媒体は、Antibiotic Medium 3(Difco)であり、かつTBAB媒体
は、Tryptose Blood Agar Base(Difco)であって、0.8%の寒天を含有した
プレートである。クロラムフェニコールおよびエリスロマイシン(Sicjma)は、
mL当たり10μgとして用いられた。天然のサブチリンおよび変異サブチリンの単離
天然のサブチリンを、以前に公表された方法(JenzenとHirschman,Arch.Bio
chem.,4,197-309(1944))を変形したものにより枯草菌ATCC 6633培養株から
単離した。細胞を10%のスクロースを含有する媒体A(BannerjeeとHansen,J
.Biol.Chem.,263,9508-9514(1988))で生育させ、35℃で30−35時
間良好な通気を行ってインキュベートした。この培養株をリン酸を用いてpH2
.8まで酸性化し、121℃で3分間オートクレーブ内で加熱してプロテアーゼ
を不活
性化し、室温まで冷却した。1/2容量のn-ブタノールを添加し、4℃で2時
間攪拌し、さらに4℃で2時間放置し、遠心分離した。上清に2.5分量のアセ
トンを添加し、−20℃で少なくとも2時間放置し、遠心分離した。ほとんどの
ペレットはサブチリンであり、95%のエタノールで洗浄し、簡単に凍結乾燥さ
せ、0.1%のトリフルオロ酢酸に溶解した。これを、トリフルオロ酢酸-水-ア
セトニトリルの勾配をかける、以前にニシン(20)について記載されたようにR
P-HPLCによって直ちに精製した。サブチリンは、この勾配によりニシンよ
りわずかに遅く溶出した。ピーク部を回収し、凍結乾燥し,−80℃で保存した
。プロトンNMRスペクトル分析にかけるサブチリンを、重水素化した水(99
.96原子%D、Aldrich Chemical Co.社)に溶解し、プロトンを交換するため
に凍結乾燥した(二回繰り返した)。細胞を2%のスクロースを含有する媒体A
に載せること以外は前記と同一の方法によってE4I-サブチリン変異体を単離
し、E4I-サブチリンは、前記のHPLC勾配で天然のサブチリンより幾分遅
く溶出したが、これはE4I-サブチリンが、サブチリンよりわずかに疎水性が
強いことを反映している。サブチリンが光感受性であることが報告されており(
1)、このためサブチリンとE4I-サブチリンのサンプルを慣例的に遮光した。
E4I-サブチリンが光感受性を有しているか否かは、決定できなかった。
アミノ酸組成分析を、HCI加水分解の後にHewlett Packard社(Fort Collin
s,CO)のAminoQuantアミノ酸分析器を用いて行った。N末端配列分析は、Appli
ed Biosystems社(Foster City,CA)のModel 477Aペプチドシークエンサーおよ
びModel 120A分析器を用いて行った。核酸は、Biosearch Model 8500オリゴヌク
レオチドシンセサイザーを用いて合成した。DHA5の化学的安定性の測定
ニシンおよびサブチリンのデヒドロ残基は、プロトンNMRスペクトルでよく
分離した共鳴を与えるビニルプロトンを備えている(LiuとHansen,Appl.Envir
on.Microbial.,56,251-2558(1990))。NMRスペクトルでのビニルプロト
ンピークの面積を測定し、ゼロ時の時と比較した経時的なDHA5の化学修飾を
、サブチリンおよびE4I-サブチリンにおけるDHA5ビニルプロトンのピーク
面積の減少としてとらえた。プロトンNMRスペクトルは、Bruker AMX-500 N
MRスペクトロメーターを用いて得られた。スペクトルは、295Kの一定温度
で、選択的な溶媒抑制を使用して得られた。サブチリンの生物学的安定性の測定
生物学的活性を、以前に記載されたように(Morrisら、J.Biol.Chem.,259
,13590-13594(1984)およびAppl.Environ.Microbial.,42,958-962(1981
))、様々な濃度のサブチリンを15mlのポリプロピレン管内のBacillus cer
eus T胞子の懸濁液に添加し、液体分析によって測定し、阻害効果を位相差顕微
鏡(phase-contrast microscopy)法により評価した。3時間の分析期間内にお
ける胞子の発生を阻害するのに必要とされるサブチリンの量が、抗菌活性の尺度
として用いられた。サブチリンの相対量を、精製中にC-18分析HPLCカラ
ムから溶出したサブチリンピーク(254nmで測定)の面積から概算した。こ
の量を、サブチリンのピーク面積と既知のモル数のニシンスタンダード(21)の
ピーク面積とを比較することにより、サブチリンのモル数に変換した。以上のこ
とを導くために、254nmにおけるニシンとサブチリンの吸光係数は同じであ
り、この波長における吸収が、主に双方のペプチドに存在する同一の3つのデヒ
ドロ基によるものと仮定した。E4I-サブチリン変異体の生物学的活性は、天
然のサブチリンと同一の方法で決定された。天然のサブチリンの化学的かつ生物学的安定性
サブチリンの自然界の生産者は、枯草菌(B.subtilis)ATCC 6633である。サ
ブチリンを、上述したようにこの生物体の培養液の上清から単離および精製した
。この精製したサブチリンを二つのサンプルに分注し、その一方をpH6.8の
D2Oに溶解し、プロトンNMR分光法にかけ、他方をpH6.8の50mMの
NaPiに溶解して一部分を生物学的活性の分析に当てた。上記の溶解したサン
プルを室温でインキュベートし、時々一方のサンプルのNMRスペクトルと他方
のサンプルの生物学的活性とを決定した。インキュベーションの間に変化したN
MRスペクトルの唯一のビニルプロトンピークが、DHA5に相当するものであ
り
、経時的に面積が減少している(図2)。図3は、DHA5の消滅速度が、t1/2
が0.8日である一次機構に従うことを示している。また、図3は、これとほぼ
同一の速度で生物学的活性が下がることも示している。
その反応性に影響を与えるDHA5の化学的環境は、ペプチド内のあらゆると
ころから発揮されるものであるが、DHA5のすぐ隣の残基が特に重要らしい。
このことは、異なるDHA5の近くの3つの残基に注意を集中する。さらに絞り
こんで、DHA5にすぐ隣接する4位のグルタミン酸が、DHA5の修飾に関わり
得る機構が存在するという点で特に疑わしい。一つの可能性は、グルタミン酸の
カルボキシル基が、DHA5の二重結合に直接結合することである。他の、おそ
らくより適切とされる機構は、グルタミン酸のカルボキシル基が図4に示すよう
に潜在的な求核(nucleopphileby)脱プロトン化を活性化する一般的な塩基とし
て作用することである。例えば、球核体(nucleophile)が、水分子の脱プロト
ン化によって誘導されたヒドロキシルイオンであれば、DHA5の一次修飾速度
を、実際に観察されたようなものと考えるであろう。サブチリン潰伝子の変異のための宿主-ベクターシステム
サブチリン遺伝子の変異は、宿主-ベクターシステムの開発を必要とした。サ
ブチリンペプチドをコードする遺伝子(spaS)は、枯草菌の染色体のspa
オペロンの一部である(図5)。これは、配列を図6に示した天然のBstEII-Xba
I制限断片に存在する。プレペプチド(prepeptide)遺伝子は、あまりに小さい
ために有用な制限部位を多くは備えていないので、新規の制限部位を翻訳の産物
を変化させることなく導入する変化をサイレント部位に施した配列とした。設計
された配列および導入された制限部位を図6に示す。これらの新規な制限部位の
付加により、サブチリン遺伝子に変異を起こすカートリッジ変異誘発が可能とな
る。
枯草菌でマルチコピープラスミドからサブチリンプレペプチドを発現させる以
前の試みは失敗し、サブチリン遺伝子の変異体は、染色体の天然の遺伝子の部位
に配置させて発現させるべきであるとの結論に至った。これが変異体のコピーで
天然の遺伝子を置換する前に、天然の遺伝子を除いて成されたならば、同一の細
胞内に天然のコピーと変異体のコピーとを同時に発現してしまう曖昧さに関する
不安を除くことができる。直線状プラスミドと染色体配列との間の二重交差(do
uble-crossover)により、枯草菌に染色体遺伝子を置換する方法は充分に確立さ
れており、適切な染色体の相同性が側面に位置する適切な選択的標識をプラスミ
ドが含有することのみを必要とする。これを達成するために、エリスロマイシン
耐性(erm)遺伝子を用いて、染色体サブチリン遺伝子を第一に置換し、従っ
て除去した。次に、erm遺伝子を、図5に示すように、選択的標識として側面
に位置するクロラムフェニコール耐性(cat)遺伝子を用いたサブチリン遺伝
子の変異体コピーで置換した。サブチリン遺伝子の代わりにerm遺伝子を含有
する枯草菌宿主細胞(LHerm△S)も図5に示されている。このLHerm△S-pSMcat
宿主-ベクターの組み合わせは、非常に用途が広く、種々の部位直接的および任
意の手法によるサブチリン遺伝子の変異誘発に使用される。
サブチリンの変異体を作成する前に、このソステムを徹底的に調べた。天然の
サブチリン遺伝子をerm遺伝子で置換したLHerm△S宿主を注意深く調べ、エリス
ロマイシン耐性を備え、サブチリン遺伝子を欠き、しかもハロ分析(図7)によ
って確証されるようにサブチリンを生産することができないことを証明した。pS
Mcatプラスミドの設計された配列を、DNA配列分析で確認し、直線状にして、
二重交差(ダブルクロスオーバー)によってLHerm△S宿主の染色体に組み込んだ
ところ、そこで宿主はエリスロマイシン感受性およびクロラムフェニコール耐性
になり、ex-m遺伝子がSMcat配列で置換されたことを示している。これらの細胞
は通常量のサブチリン活性を表し(図7)、新規の制限部位を与えるために配列
内に導入されたサイレント変異が確かに沈黙したもの(サイレント)であり、遺
伝子の転写-翻訳が正常に起こることを示している。サザンハイブリダイゼーシ
ョン分析により、遺伝子が染色体の適切な位置に組み込まれたことが示された。E4I-サブチリンの作成
次いで、BstBI-SmaI断片の切り出しおよびこの断片とBstBI-SmaI変異誘発断片
とを置換することにより、E4I変異をpSMcatプラスミドに導入し、Glu4コ
ドンがIleコドンで置換されたプラスミドpE4IScatを与えた。断片の置換を、
pE4IScat中の挿入物をDNA配列分析することによって確認した。次いで変異誘
発された配列を、pE4IScatを直線状にし、これを宿主に形質転換し、さらにクロ
ラムフェニコール−PABプレート上で二重交差置換体を選択することによって
、LHerm△S宿主染色体に導入した。クロラムフェニコール耐性およびエリスロマ
イシン感受性コロニーが見られ、erm遺伝子が変異体サブチリン遺伝子で置換
されたことを示している。いくつかのクロラムフェニコール耐性コロニーを選択
し、サザンハイブリダイゼーション分析にかけたところ、変異体サブチリン遺伝
子がLHerm△S宿主に組み込まれたことを示した。これらのコロニーの一つで、LH
E4IScatと呼ばれるものを、図7に示すように、ハロ分析でサブチリン様の活性
について分析した。LHE4IScatコロニーはハロ(halo)を作成し、生産したE4I-
サブチリンが抗菌活性を有することが分かった。このコロニーを培養液で生育さ
せ、これから推定されるE4I-サブチリンを単離し、次いでHPLCクロマトグラ
フィーで精製した。E4I-サブチリンは、高濃度のアセトニトリルで、天然のサブ
チリンより勾配において遅く溶出しており、この変異体が予想通りより疎水性で
あることに一致している。E4I-サブチリンを、アミノ酸組成およびN末端配列の
分析にかけた。組成は、予想通り天然のサブチリンよりIleが一つ多く、Gl
u(Glxとして決定された)が一つ少ないことを示したが、その他は予想通り
天然のサブチリンと同じであった。N末端配列は、Trp-Lys-(空白)-I
le(以下配列空白)であり、Trp-Lys-(空白)-Glu(以下配列空白)
を与える天然のサブチリンと比較される。3位の残基における空白は、チオエー
テル基にアラニンが鎖でつながれており、放出されない(Kellnerら、Eur.J.B
iochem.,177,53-59(1988)、およびAgnew,Chem.Int.Ed.Eng1.,28,616-
619(1988))ことによるものと予想され、さらにエドマン分解は、デヒドロ残
基を処理することができないことから5位の残基で停止した(LiuとHansen,J.
Bacteriol.,173,7387-7390(1991))。しかして、組成分析およびN末端配列
は、E4I-サブチリンプレペプチドが、全てのセリンおよび全てのトレオニンの脱
水、構造の領域内におけるチオエーテルの架橋構造の形成、およびリーダーペプ
チドの適切な除去を含む翻訳後修飾を十分に受けたことを示している。もし、い
くつかの脱水または架橋の一つが起こらなかったら、あるいはもしリーダー配列
が不正
確に切断されたなら、異常なアミノ酸組成、または異常なN末端配列、あるいは
これら両方として反映されるであろう。E4I-サブチリンは高い特定の活性を有する
E4I-サブチリンの特定の活性を、胞子発生分析を用いて測定し、天然のサブチ
リンと比較した。E4I-サブチリンは、1ml当たりほぼ0.3μg(80nM)で阻害
が見られたのに対して、通常のサブチリンは、1ml当たりほぼ1μg(280nM
)で阻害を示した。従って、変異体サブチリンは、この特定の生物学的分析で天
然のサブチリンより3−4倍優れた効能があった。注目に値することは、天然の
サブチリン、そして特に変異体のサブチリンは、アンピシリンやクロラムフェニ
コール等の他の通常の抗生物質よりかなり低い(大きさの順)モル濃度で効果的
であることである。E4I-サブチリンは高い化学的および生物学的安定性を有する
安定な変異体サブチリンを作成する中心となる設計策は、サブチリンの化学的
および生物学的安定性がDHA5の化学的反応性によって決定され、天然のサブ
チリンのDHA5は、Glu4カルボキシル基がその化学的修飾に関与しているた
めに(図4)不安定であるという考えに基づいている。この考えは、カルボキシ
ル基がDHA5の修飾に関与する可能性が除去されることから、Glu4のIle
への変異がサブチリンの化学的および生物学的安定性を高めるであろうという予
想に至る。従って、E4I-サブチリンのDHA5の化学的安定性は、天然のサブチ
リンで行ったようなNMRスペクトルにおけるDHA5ビニルプロトン共鳴ピー
クの経時的消滅を観察することによって評価される。図3は、DHA5の消滅速
度がt1/2が48日である一次の速度行程に従うことを示している。これは、t1 /2
がわずか0.8日である天然のサブチリンと比較して、E4I-サブチリンの安定
性において劇的な57倍の増加である。生物学的安定性は、胞子発生分析を用い
た同じ時間経過の後の抗菌活性を測定することによって決定された。図3は、変
異体サブチリンの抗菌活性が48日のインキュベーション期間の間にほとんど下
がらないことを示しており、生物学的安定性が、天然のサブチリンと比較して劇
的に増加したことを示している。Glu4からIleへの変異が、DHA5残基の
化学的安定性と生物学的活性との両方に関連する、サブチリン分子の一般的な安
定性の劇的な増加を引き起こすと結論づけた。DHA5がAlaに変異したE4I-サブチリンは胞子発生に対する活性を全く有し ていない
もし、DHA5がサブチリンの抗菌活性において重要な役割を演じるならば、
それが他の残基に変異すると、細菌の胞子分析において全く活性を持たない分子
になるであろう。E4I-サブチリンのDHA5残基をAlaに変異させる実験が適
切であると決断した。Alaは、二重結合を破壊するが、DHA5の親水性を維
持するために選択された。優れた固有の安定性のために、E4I-サブチリンをサブ
チリンの代わりに選択した。E4I/DHA5A-サブチリンを、図6に示された変異オリ
ゴヌクレオチドを用いて作成した。変異体を、サブチリンとE4I-サブチリンと同
じ方法で単離し、アミノ酸組成分析、N末端配列分析およびNMRスペクトル分
析からなる、正しい翻訳後プロセシングの完全な試験にかけた。結果は、全ての
翻訳後の段階が正確に起きたことを立証した。次いで、E4I/DHA5A変異体サブチ
リンの生物学的活性を、細菌の胞子発生分析で決定した。E4I-サブチリンは、胞
子の発生を0.3μg/mlの濃度で阻害したが、E4I/DHA5Aサブチリンは、E4I
-サブチリンが阻害する濃度より150倍も高濃度である50μg/mlの濃度
においてさえ、胞子の発生に対する阻害活性に欠けていた。さらに高濃度につい
ては調べなかった。従って、完全なDHA5は、胞子の発生を阻害するために重
要であると結論づけられる。
従って、請求された発明のE4I-サブチリン(4位において本来存在するグルタ
ミン酸残基の代わりにイソロイシン残基で置換したことを除いては天然のサブチ
リンと同一)は、特定の活性において天然に発現した抗生物質の3−4倍の増加
を伴い、天然の形態より57倍も安定した抗生物質を得る。5位の活性に重要な
デヒドロアラニンの不活性化を行うことがなく、しかも独立に抗生物質の作用に
悪影響をもたらすことのない他の残基を、類似した結果を与えるために用いるこ
とができる。このような類似体の調製は、上述したプロトコールによって行われ
る経験的な研究事項である。
明らかに、本発明の多数の変更および変形が、上記の教示を考慮すれば可能で
ある。それゆえ、付加した請求の範囲の範囲内で、本発明はここに特に記載され
たものとは異なった形で実施されてもよい。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
C12N 1/21 8828−4B
C12P 21/02 C 9282−4B
// A61K 38/00 ADZ
(C12N 15/09 ZNA
C12R 1:125)
(C12N 1/21
C12R 1:07)
(C12N 15/00 ZNA A
C12R 1:125)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.天然の配列の4位が、イソロイシンで置換されたことを除いては、天然のサ ブチリンのアミノ酸配列を備えている抗生物質。 2.天然のサブチリンより少なくとも10倍優れた安定性と3倍優れた活性を示 し、4位を除いては天然のサブチリンのアミノ酸配列と実質的な相同性を有する 抗生物質。 3.枯草菌で発現させた際に、請求項1記載の抗生物質に転換されるポリペプチ ドをコードする遺伝子。 4.請求項3記載の遺伝子を含有するプラスミド。 5.請求項3記載の遺伝子を発現する形質転換体微生物。 6.変異バクテリオシンの発現を欠いたバシラス株から調製された形質転換体微 生物において、前記形質転換体は前記微生物による翻訳の後に前記変異バクテリ オシンに変形されるプレペプチドを発現する遺伝子を含有し、前記遺伝子は、天 然のバクテリオシンを発現する前記株の遺伝子を削除するとともに、正しい読み 枠内であって天然のDNAの前記遺伝子が占めていた箇所に相当する部位に前記 遺伝子を挿入する宿主-ベクターの組み合わせによって、前記株のDNAに挿入 されたことを特徴とする形質転換体微生物。 7.変異バクテリオシンプレペプチドの発現のためにDNAの挿入により宿主バ シラス株を形質転換する方法において、 前記宿主株から前記バクテリオシンの天然の形態を発現する遺伝子を削除し、 該遺伝子を識別可能な表現型を発生させる標識遺伝子で置換し、正しい読み枠内 であって削除された前記遺伝子が占めていた前記宿主DNAの位置に前記変異バ クテリオシンプレペプチドをコードする遺伝子で前記標識遺伝子を置換すること を特徴とする形質転換方法。
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