JPH08504948A - 巨大分子のための泳動及び移動のための多重電気泳動方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 複数本の平行な細長い電極（１４）と、容器（１０）内で電極（１４）の列間に垂直に配置された薄膜（２２）と、液体の形態で容器内に注入され、続いて電気泳動方を実行するために固化される電気泳動ゲルと、を有する容器内で巨大分子を泳動させ、移動させるための多重電気泳動方法及びその装置。前記電気泳動が終了した時、前記ゲルが、液化、溶解又は分解され、巨大分子の移動が行われた薄膜が、前記容器から引き出される。

Description

【発明の詳細な説明】 巨大分子のための泳動及び移動のための多重電気泳動方法及び装置 本発明は、蛋白質や核酸のような巨大分子（macromole-cules）を泳動及び移 動させる多重電気泳動（multiple el-ectrophoresis）のための方法及び装置に 関する。 電界の作用下でゲルのプレートを通して巨大分子の試料を泳動させる電気泳動 方法により前記試料を分離することがよく知られている。この巨大分子の試料は 、該分子の質量の関数である距離を前記ゲル内で移動する。第１電界及び前記ゲ ルプレートと垂直な第２電界の作用下で、前記巨大分子は、ゲルプレートと並存 する微小多孔性薄膜に移動させることができる。 当初、時間がかかり、実施困難であったこの技術は、少しづつ改良され、簡略 化された結果、今では、前記巨大分子の泳動と移動との間に多重ゲルプレート又 は前記多孔性薄膜を操作することを必要とせすとも、巨大分子を泳動及び分離さ せ、移動させることの全てが、同じ容器内で同じ電極回路網を使用して可能とな っている。 特に、本出願人がした国際出願第ＷＯ ９０／０２６０１号は、自動又は半自 動で巨大分子の泳動及び移動を実行するために、多孔性薄膜と共に比較的多数の ゲルプレート を配置することができる多重電気泳動容器を記述している。加えて、本出願人の したフランス特許出願第９１ ０８５７８号は、多孔性薄膜と並存するゲルプレ ートを作って操作するためのカセットであって、上述した国際出願に記述された 電気泳動容器内での使用に適したカセットが記述されている。 前記公知の方法は、非常に顕著な効果を達成することができるが、各々がゲル プレートと多孔性薄膜を合わせ持ったユニットを完成することが比較的困難なま まであり、ゲルプレートが一様となり空気の泡を含まないようにすることを確実 に行うこと及びゲルプレートと並存する前記多孔性薄膜が完全に平らであって該 多孔性薄膜の全作用領域に亘ってゲルプレートに付着することを確実に行うこと には、特別の注意が必要とされる。また、前記ゲルは、特にアガロースの場合、 すぐに古くなって極めて不完全となるため、多孔性薄膜を備えた多量のゲルプレ ートを前もって長時間用意しておくこと及び代用のために貯蔵しておくことが不 可能である。 本発明の特別の目的は、前記問題に対して、簡単で、効果的で、しかも安価な 解決手段を提供することにある。 本発明は、予め構成されたゲル−多孔性薄膜ユニットを 用いることなく、ゲル内での巨大分子の分離と、多孔性薄膜上への移動のための 多重電気泳動方法及び装置を提供する。 従って本発明は、複数の平行に延びる細長い電極を有し、巨大分子泳動のため の第１電界、次いで薄膜に前記巨大分子を移動させるための第１電界に垂直な第 ２電界を、電極間に連続的に発生させるように電極に電位を付与する手段を備え る容器内で、巨大分子の泳動及び薄膜への移動を制御下に行うための多重電気泳 動法において、容器内に互いに平行であって、前記電極に対しても平行である薄 膜を該電極間に配置し、容器内に液相状態の電気泳動ゲルを充填し、該充填は、 前記容器内に前記薄膜が配置される前又は後で行われ、次いで前記ゲルは固化し 、次いで前記薄膜の一端縁に沿って前記ゲル内に形成された窪みに巨大分子の試 料を載置し、最初に前記ゲル内で巨大分子を泳動させ、次いで前記巨大分子を薄 膜に移動させるために電極に電位を与え、しかる後、前記ゲルを液化、溶解又は 分解し、前記容器から前記薄膜を取り出すことを特徴とする多重電気泳動方法を 提供する。 本発明は、このように電気泳動を実行する前にゲルプレートの組立を不要とす ることを可能とし、これにより、時 間、手段及び努力をかなり省くことができる。 本発明は、また、ゲルプレートを支持するカセットが全く無いために、より一 様な媒体中で電気泳動が行われるという点で、得られた結果の質を改善し、これ により、巨大分子の分離及び移動の信頼性及び再現性が増す。 本発明の第１実施例において、容器に載置されるべき前記薄膜は支持及び操作 目的でフレームに装着され必要に応じてフレーム上に軽く張られる。 前記フレームは、前記薄膜を支持し張りを持たせることだけのために提供され 、フレームがゲルプレートを構成して支持するために用いられた従来技術のもの よりもずっと簡単でコンパクトである。 加えて、これらの使用は、薄膜操作を容易にする。 本発明の他の実施例においては、容器内に配置されるべき前記薄膜は、平行に 並んだ複数のローラを通るジグザグ経路に沿って案内される連続した帯状体を形 成する。 これは、さらに電気泳動の前又は後の両方において薄膜の操作を減らすととも に簡略化する。 本発明に使用されるゲルは、温度及び／又は濃度を変えることによって固化・ 液化され得るゲル（その典型としてアガロース）である。 本発明はまた、巨大分子の制御された泳動及び薄膜への移動のための多重電気 泳動装置であって、複数の平行に延びる細長い電極を有し、巨大分子泳動及び分 離のための第１電界、次いで前記巨大分子を薄膜に移動するための前記第１電界 に垂直な第２電界を前記電極間に連続して発生させるように前記電極に電位を与 えるための手段を有した容器を備える装置において、前記容器内で互いに平行で あり、且つ前記電極に平行とされた前記薄膜を案内又は支持する手段と、前記容 器を液相状態の電気泳動ゲルで満たす手段と、容器内で前記ゲルを固化するため の手段と、前記容器内で前記ゲルを液化、溶解又は分解するための手段とを有す ることを特徴とする装置を提供する。 ゲルを液化させるための前記手段は、容器を加熱することによって、及び／又 は電極を加熱することによって、及び／又は熱い液体を前記電極を収容する微小 多孔性管内で循環させることにより温度上昇させるタイプのものである。 ゲルを溶解又は分解するための前記手段は、例えば、圧力下で液体を注入する タイプのもの、又は吸引タイプのもの、その他超音波発生タイプのものである。 この装置の第１実施例においては前記薄膜は、必要に応じて該薄膜に張りを与 えるための手段を有する支持フレー ム上にその両端縁によって固定される。 前記装置の変更態様において前記薄膜は、前記電極に実質的に平行なローラ群 を通るジグザグ経路に沿って案内される連続した帯状体を形成する。 好適には前記帯状体を案内するためのローラ群は、共通の支持体によって支持 されており、前記容器内に挿脱自在な移動式単一組立体を形成している。 添付の図面を参照しつつ例示する以下の記述を読めば、本発明はより良く理解 され、他の特徴、詳細、及び利点もより明確になるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、本発明に係る電気泳動装置の概略的な縦断面図である。 図２は、図１のＩＩ−ＩＩ線に沿う水平断面の一部を示す概略図である。 図３，４及び５は各々、薄膜、支持フレーム及び窪み形成用櫛を示す概略図で ある。 図６は、本発明に係る装置の他の実施例の概略的な垂直断面図である。 図７は、図６の装置に利用することのできる薄膜支持及び案内用組立体の概略 的な側面図である。 図８は、図７の部品の一部の概略的な平面図である。 先ず、本発明に係る装置の第１実施例を図示する図１〜図５を参照する。 図１は、実質的に矩形の平行管の形状をしており、ジャケット１２に囲まれて いる電気泳動容器１０を示したものであり、該ジャケット１２を通して、容器１ ０を加熱及び冷却するために、熱媒体の液が循環しており、該液の温度は調節可 能となっている。 本願出願人の国際出願W0 90/0261に示すように、容器は、好ましくは、水平で 互いに平行な複数の細長い電極１４を備え、該電極はいくつもの行及び列をなし て方形の格子状の配列を形成するように組み合わされている。電極は導電性金属 線によって形成され、その終端において、電圧を供給する手段１６に接続され（ 図２）、電極の行配置の間または列配置の間で垂直又は水平に延びる電界が形成 される。 図１に示す実施例において、電極１４は、気泡の捕捉手段を形成し適切な電解 質を循環するために用いられる微孔性材料の小管１８に収納されている。 容器１０は、図においてそれぞれがソレノイドバルブの様な開閉手段を備える ２つのダクト２０として表される電 解質の充填及び循環のための手段を備え、１つは、容器１０の底、又は底付近に 設けられ、他は容器の上部に設けられている。 本発明によれば、これらのダクト２０は容器を、例えば約５０度から６０度程 度のアガロース溶液のような液体状電解質ゲルで充填するために使用される。容 器１０がアガロース溶液で満たされると、周囲温度に温度低下することによって 、又は冷却液がジャケット１２を循環するため若しくは電極１４を取り囲む管１ ８の中を冷えた電解質が循環するため又は電極１４の終端を冷却源に接触させる がために（電極１４は普通は熱伝導性のよいプラチナで形成される）起こる冷却 の加速によって、ゲルは凝固する。 変更態様として、容器１０に充填される溶液中のアガロースの濃度を増加させ ることもできる。 こうして容器１０は巨大分子のイオン移動及び分離に使用され得る大きなゲル のブロックを備えたものとなり、巨大分子のサンプルはゲルのブロックの上部に 設けられた凹所(well)の中におかれる。 当然に、ゲルの凝固が進行する前に電極の列の間に従来のタイプの膜を置く必 要がある。 最も簡単な方法は、明らかに、容器中の電極の並びの間 に垂直の膜２２を置くことであり、例えば膜２２は上部の水平縁部を支持部２４ に固定され、底部の水平縁部は自重で垂下される。その後、容器１０は底部から 若しくは上部から、膜をできる限り垂直に保つために渦の発生を避けてゆっくり 充填され、その後ゲルは凝固させられる。 膜の操作を簡単にするため及び液体相のゲルが膜に浸漬しても膜が平らである ことを保証するために、実質的には本出願人の出願W0 90/02601に記載され図３ 及び４に示された方法により、膜を堅固な支持枠に取り付けることが望ましい。 このような状況下においては、まず２つの伸張性のストリップ２６が膜２２の２ つの長手方向の端に差し込まれ若しくは溶接される。該ストリップは、フレーム ３２の長手方向の端に沿って矢印で示される方向に動きを案内されるペグ３０上 に固定するための孔若しくは穴２８を備える。ペグは膜２２を適切な張りに保つ ためにバネによってフレームに関し外側に向けての弾力を生み出す。この張りに よって、膜２２が平坦になることが保証され、液体ゲルの注入による膜の伸びを 吸収する。 ストリップ３４はその一つの縁に沿って櫛３６を備え、フレーム３２と嵌合し て、櫛３６は実質的に膜２２の上部水平端に沿って伸び、後に巨大分子のサンプ ルを受け取る ための部分となる孔を、ゲルの中に形成する。 本発明に係る装置は以下のように使用される。 まず、膜はその両側縁に沿って伸張性のストリップ２６を固定され、次にその 膜２２をフレーム上に取付け、最後に櫛３６を備えたストリップ３４を取り付け る。 その後、膜３２及び櫛３６と一体になったフレーム３２は、図１に示すように 容器の中に配置されるとともに、容器はフレーム３２及び膜２２を取り付ける前 又は取り付けた後に液相のゲルで満たされ、その後に冷却及び／又は凝固作用因 子の濃度の増加によってゲルは凝固させられる。 一度ゲルが凝固すると、櫛３６を支持するストリップ３４は取り外され、巨大 分子のサンプルが、膜の上部水平縁に沿ってゲルの中に形成された孔の並びに置 かれる。そして、異なる電位が、電極の間で垂直な電界を発生させるために電極 の並びに対して印加され、上述の孔の中にある巨大分子がゲルを通して容器１０ の底に向かって移動する。 ある程度時間の間に巨大分子が分子の質量の関数として与えられる距離をゲル 中で移動し、その間に電極１４の電位分布が変えられ電極の列配置は異なる電位 となり、それらの間に、水平で膜に垂直な電界が形成される。これらの電界の影 響下で、巨大分子はゲルを通して水平に移動し、 膜に固定される。 その後、ゲルは液化、溶解又は分解される。 これは、ゲルの温度を上げることによって、若しくは熱水を容器１０を取り囲 むジャケット１２に流すことによって行える。また熱い電解質を電極１４を含む 管１８に沿って流すことによっても行える。また、熱い液体を圧力のもとに容器 １０内に注入してゲルを分解することや、適当な酵素液の溶液（例えばアガロー スゲルにはアガロース溶液）を注入することにより溶解することもできる。 変更態様として、漏れないように容器１０を閉ざしその中に真空部分を作り、 ゲルから水を蒸発させてゲルを分解することもできる。 また、機械的振動若しくは超音波振動を利用してゲルを膜から分離すること及 び／又はゲルを多かれ少なかれ完全に分解することもできる。 一度ゲルが液化、溶解、若しくは分解され、または単に膜からはがされると、 フレーム３２は容器から抜き取られ、膜２２が取り外され、その後従来の方法に よって処理される。 その後、容器を完全に空にして、新たな電気泳動操作をするために液体層の新 しいゲルを充填する前に容器を洗わ なければならない。 図６乃至８に示される他の実施例に於いて、膜は連続的ストリップ４０を形成 し、該連続的ストリップ４０は、容器の電極１４に対して平行で水平な軸を中心 として、自由に回転できるように取り付けられている上部及び底部の水平ローラ ー４２及び４４に支持される。上部ローラー４２は電極１４及び容器内のゲルの 最大の高さよりも上に配置され、底部ローラー４４は好ましくは電極１４の底部 の行配置の下に配置される。膜を形成するストリップ４０は交互に上部ローラー ４２、次に底部ローラー４４、その次に別の上部ローラー４２というように通過 し、電極１４の列配置の間で膜の垂直方向に延びる部分を形成する。 ローラー４２及び４４は好ましくは共通の支持部、例えばローラー４２の軸を 支持する上部フレーム４６と、上部フレーム４６に取り付けられ底部ローラー４ ４の軸を支持する垂直な脚部４８とを備えたような、支持部に支持される。この 共通支持部は、有利には、ローラー４２及び４４上に膜の連続的ストリップ４０ を配置するために容器１０から抜き取ることができ、電気泳動のために容器１０ の中に下げられるように、移動可能である。上部ローラー４２の少なくともいく つかの軸は、図７に示されるように戻り バネ５０と連結され、ローラー４４は容器に沈められるストリップ４０にわずか な張力を持たせるため連続的に上方へ引っ張られる。 他の部分については、この装置は図１乃至５を参照しつつ説明したものと同じ ものとすることができる。 装置は、以下のように使用される。 ローラー４２及び４４を容器から引き離し、まずストリップ４０がローラーに 取り付けられる。 同時に、容器１０は液状のゲルで満たされ、その後ローラー支持部はゆっくり 容器の中に下げられる。逆に、液状のゲルをゆっくり容器に充填する前に支持部 を容器の中に配置しておくことも可能である。 一度、膜の全長が完全にゲルの中に沈められてしまえば、櫛３４、３６が図６ に示すように上部ローラー４２の間に配置される。ローラー４２及び４４のよう に、櫛は共通の支持部によって支持される。 その後、上述の方法を使用してゲルは凝固させられる。 そして、櫛は取り除かれ、巨大分子のサンプルが、櫛の歯によってゲルの中に 形成された孔に置かれる。その後、第１に巨大分子を移動させて垂直方向下方へ 移動させることにより分離させ、第２に膜の垂直方向の全長にわたって 水平方向に巨大分子を移動させるために、異なる所望の電位を電極１４に印加す れば十分である。 その後、ゲルは上述の方法と同様の方法を使用して液化、溶解、若しくは分解 される。 そして、ローラー４２及び４４のための支持部は容器から取り外され、牽引が ストリップの一端に適用されることができ、巨大分子が移動した膜の全長を回復 することができる。 同時に、次の電気泳動操作に使用するための新たな膜部分がローラー４２及び ４４に間に配置される。 この間、容器１０は空にされ、清掃され、新たな電気泳動操作のために準備さ れる。 異なる実施例として（図には示していない）、ストリップ４０を支持するため のローラーは垂直であってもよい。この場合、容器の中の電極は同様に垂直にし て、電極の面の間にストリップを配置することが過度に複雑になるのを避けるこ とが望ましい。 電極の面の間に膜を形成する連続的ストリップ４０は、機械的に十分強ければ 、長い膜で形成することもできる。しかし、膜の薄さ若しくは膜の材質が原因で 膜の機械的強度が弱い場合には、支持ストリップ上にあらかじめ切り抜 かれた窓に膜を所定の長さ分固定することが望ましい。該支持ストリップは、膜 と同じ材質のものであってもよいがより厚くされ、或いは異なる材質のものとす る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 7363−2Ｊ ３１５ Ｄ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．複数の平行に延びる細長い電極を有し、巨大分子泳動のための第１電界、次 いで薄膜（２２）に前記巨大分子を移動させるための第１電界に垂直な第２電界 を、電極間に連続的に発生させるように電極に電位を付与する手段（１６）を備 える容器（１０）内で、巨大分子の泳動及び薄膜への移動を制御下に行うための 多重電気泳動法において、容器（１０）内に互いに平行であって、前記電極（１ ４）に対しても平行である薄膜（２２）を該電極間に配置し、容器内に液相状態 の電気泳動ゲルを充填し、該充填は、前記容器（１０）内に前記薄膜（２２）が 配置される前又は後で行われ、次いで前記ゲルは固化し、次いで前記薄膜の一端 縁に沿って前記ゲル内に形成された窪みに巨大分子の試料を載置し、最初に前記 ゲル内で巨大分子を泳動させ、次いで前記巨大分子を薄膜に移動させるために電 極（１４）に電位を与え、しかる後、前記ゲルを液化、溶解又は分解し、前記容 器から前記薄膜を取り出すことを特徴とする多重電気泳動方法。 ２．次の電気泳動操作の前に、容器（１０）を空にして清浄する工程を含むこと を特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．前記容器（１０）内に配置されるべき薄膜（２２）が、支持兼操作用フレー ム（３２）上に予め取付けられ、必要に応じて該フレームに張られることを特徴 とする請求項１又は２に記載の方法。 ４．容器内に配置されるべき前記薄膜は、平行に並んだ複数のローラ（４２、４ ４）を通るジグザグ経路に沿って案内される連続した帯状体（４０）を形成する ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。 ５．前記電極（１４）によって容器（１０）内のゲルを加熱又は冷却する工程を 有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。 ６．前記電極（１４）が微小多孔性管（１８）内に収納され、前記電気泳動ゲル を加熱又は冷却するための高温の又は低温の液体の電解液を前記管に沿って循環 させる工程を有することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。 ７．前記電気泳動ゲルを加熱又は冷却するために、熱伝達液を循環させるための ジャケット（１２）で前記容器（１０）を包囲することを特徴とする請求項１か ら６のいずれかに記載の方法。 ８．前記容器内（１０）に、酵素溶液を注入することによ ってゲルを分解する工程、又は吸引の適用によって、圧力下で液体を注入するこ とによって、若しくは機械的振動或いは超音波振動によって、前記ゲルを分解す る工程を有することを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の方法。 ９．巨大分子の制御された泳動及び薄膜への移動のための多重電気泳動装置であ って、複数の平行に延びる細長い電極（１４）を有し、巨大分子泳動及び分離の ための第１電界、次いで前記巨大分子を薄膜（２２）に移動するための前記第１ 電界に垂直な第２電界を前記電極間に連続して発生させるように前記電極に電位 を与えるための手段（１６）を有した容器（１０）を備える装置において、 前記容器（１０）内で互いに平行であり、且つ前記電極（１４）に平行とされ た前記薄膜（２２）を案内又は支持する手段（３２、４２、４４）と、 前記容器を液相状態の電気泳動ゲルで満たす手段（２０）と、 容器内で前記ゲルを固化するための手段（１２）と、 前記容器内で前記ゲルを液化、溶解又は分解するための手段（１２）と、 を有することを特徴とする装置 １０．巨大分子の試料を受け入れるためのゲル内の窪みの列を形成するための手 段（３４、３６）を有することを特徴とする請求項９に記載の装置。 １１．前記容器（１０）内のゲルを液化させるための手段が、容器を加熱するこ とによって、及び／又は電極を加熱することによって、及び／又は熱い液体を前 記電極を収容する微小多孔性管（１８）に沿って且つ／又は前記容器（１０）を 囲むジャケット（１２）内に循環させることによって、なされる形式であること を特徴とする請求項９又は１０に記載の装置。 １２．前記ゲルを溶解又は分解する手段が、圧力下で液体を注入し、又は吸引を 適用し、又は機械的振動又は超音波振動を発生する形式であることを特徴とする 請求項９又は１０に記載の装置。 １３．前記薄膜が、必要に応じて該薄膜（２２）に張りを与えるための手段を有 する支持フレーム（３２）上にその両端縁によって固定されることを特徴とする 請求項９から１２のいずれかに記載の装置。 １４．前記薄膜が、前記電極に平行なローラ群（４２、４４）を通るジグザグ経 路に沿って案内される連続した帯状体（４０）であることを特徴とする請求項９ から１２のい ずれかに記載の装置。 １５．前記帯状体（４０）を案内するためのローラ群（４２、４４）が、前記容 器（１０）に挿脱自在の移動式単一組立体を形成する共通の支持部材（４６）に よって搬送されることを特徴とする請求項１４に記載の装置。