JPH05508577A - 調製的電気泳動のための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は調製的電気泳動のための装置に関し、より具体的には、該装置のための 寸法に依存しない冷却システムに関する。

電気泳動は、蛋白質を分離するための現在量も効率的な分析方法である。調製的 電気泳動の技術も非常に多くが存在するが、これらは殆どが、ミリグラム量の規 模での蛋白質の分離のために使用されている。規模の拡大のための主たる問題点 は、電流を通ずる際に発生するジュール熱の除去である。特に成功している技術 は、顆粒化させたゲルの層中における調製的等電点電気泳動法であり、それによ り、ダラム量の蛋白質が高い分離度を以て分離されることができる（Ｒａｄｏｌ ａ、　Ｂ、Ｊ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１９８４．１０４． ２５６−２７５）。

分離のこのシステムにおいては、層の厚さは約１ｃｍに制限され、更に、分離距 離は拡大することができないが、このことは、層の幅を変更することによっての み分離体積を増大させうることを意味する。しかしながら、そのような規模の拡 大は厳しい実際上の制限を受ける。文献より知られている円筒状の幾何形状を有 する他の調製規模を拡大させることもできない（Ｒｉｌｂｅ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｐ ｅｔｔｅｒｓｏｎ、　Ｓ。

、於：　Ａｒｂｕｔｈｎｏｔｔ、　Ｊ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｂｅｅｌｅｙ、　Ｊ、Ａ 、　ｌ５ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｆｏｃｕｓｉｎｇ、　Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、 　Ｌｏｎｄｏｎ　１９７５．　ｐｐ、　４４−５７）。本発明の目的は、大量の 物質の分離に使用することができる調製的電気泳動のための装置を提供すること である。

本発明によれば、調製的電気泳動のための装置であって、複数の個々のコンパー トメントよりなるものである電解質チャンバーのモジュール構造によって特徴づ けられ、該コンパートメントが膜様の性質を有する仕切り要素によって連結され ており、各コンパートメントが平行な毛細管よりなる冷却要素を含むものである 装置が提案される。

電解質を含むものである各コンパートメントの本質的部分は、毛細管より構成さ れた冷却要素であり、これにおいては、細い毛細管が相互に平行に、それら相互 の及びコンパートメントの境界面からの間隔がいかなる点においても数ｍｍを超 えないように、配列されている。コンパートメントの境界面は、膜様の性質を有 する隣接要素（仕切り要素ともいう）によって形成されている。一般的に、毛細 管相互の間隔は３乃至１０ｍｍであり、好ましくは５乃至７ｍｍである。最も近 い隣接表面（即ち２つのコンパートメント間の仕切り要素）からの間隔は、毛細 管の外表面から測って５ｍｍを超えず、好ましくは１乃至３ｍｍを超えないもの でなければならない。毛細管の直径は、材料の性質及び冷却液の効果的な流れを 維持するに必要な内径のために課せられる技術上の限界はあるが、可能な限り小 さいものでなければならない。一般的には、毛細管の外径は１乃至３ｍｍである 。

毛細管の重要な要件の一つは、それらが電導性であってはならず、そして使用さ れる化学物質（電解質、蛋白質等）に対して中性且つ耐性でなければならないと いうことである。

毛細管を構成するに適した材料としては、例えば、金Ｉ！（但し例えばプラスチ ック（ポリエチレン、テフロン等）等の絶縁性物質で外側を被覆されていること を条件とする。）、プラスチック及びガラスが含まれる。

毛細管の冷却は、長さ、壁の厚み及び材料の熱伝導性、並びに、冷却ユニットの 貫流速度及び効率の関数である。本発明の冷却原理は、少なくとも総量１００ｊ ！又はそれ以上まで使用することができ、必要とされる分離距離及び分離時間の 長さによって主に決定される。２４時間を超える分離時間は、特別に問題のある 状況においてのみ妥当であるように思われる。冷却能率は、種々の配列の毛細管 （間隔、長さ、直径、材料、冷却液の貫流速度、層の厚さ）を有するコンパート メントにおいて試験された。システムの種々の負荷においての温度測定は、０． ３乃至０．４Ｗ／ａｍまでは、全システムを通じて、例えば電極付近等の極端な 点においてすら、温度が一定であることを示した。この電力負荷は、電気泳動の 間に予期されつる熱の発生より何倍も大きいであろう。

本発明による毛細管冷却システムはまた、それが、チャンバーのモジュール構造 のため電解質チャンバーの容積に自動的に適合することから、寸法に依存しない 冷却システムともいう。

本発明の具体例の一つにおいては、毛細管より構成された冷却要素を存するーの コンパートメントは、構造ユニットを形成し、該コンパートメントは次の構造的 特徴を有する二　対向する側面部分が基礎部分と一緒になって、一般的に最上部 において開いた平たい枠を形成する。側面部分の高さ及び基礎部分の長さは、広 い範囲内のいかなる所望の寸法でもよく、それによって電気泳動チャンバーの内 部寸法の高さ及び幅が規定される。例えば、高さは３０ｃｍで幅が４０ｃｍであ ってよく、外寸は使用された材料に応じてこれより大きい。好ましい材料は、ブ レクシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）及びポリエチレンのような、力学的に作業 の容易な化学的に耐性のプラスチックである。対向する側面部分の各縁は、基礎 部分の各縁と一緒になって、仕切り要素が接する各面を形成する。これらの２つ の面の相互の間隔、即ち側面部分及び基礎部分の厚みは、毛細管冷却システムの 能率によって設定される。原則として、該間隔は２乃至１０ｍｍ、好ましくは２ 乃至５ｍｍであろう。コンパートメントの数は電気泳動チャンバーの分離効率を 規定する。与えられた一定の容積に対しては、コンパートメントの厚みの一層の 小ささは、コンパートメント数の一層の多さ及び、同時に、システムの改善され た分離効率を意味する。こうして、減少された厚みを有するコンパートメントを 得ることが望ましいが、毛細管冷却システムによって構造的限界がこれに課され る。

特定の具体例の一つにおいては、基礎部分は、電解質溶液を（所望により分離さ れた蛋白質と共に）その最下点に備えられた出口開口を通して完全に抜き取るこ とができるように、コンパートメント内部に勾配を作り出すよう増大する厚みを 有する。

コンパートメントと毛細管より形成される冷却要素とが構造ユニット（図２）を 形成するならば、各側面部分はｌ又はより多くの空洞（開口）を含む。複数のコ ンパートメントよりなるモジュール構造の結果として、これらの空洞は、一端よ り冷却液が流入し、毛細管を通って反対側の冷却水チャンネルから流出するもの である、冷却水チャンネルを形成する。個々のコンパートメントよりなる本発明 の電解質チャンバーが、冷却水チャンネルが冷却液の供給を受けられるよう連結 器を含んでいることは言うまでもない。

冷却効率を高めることが望まれ又は必要であるならば、各コンパートメントの毛 細管は、それら独自に又はブロック毎にまとめて、別々に冷却液を供給されても よい。冷却液の温度は、例えば低温保持装置を用いる、例えば１乃至３０°Ｃの 温度範囲における、又は−１Ｏ乃至−３０°Ｃの低温電気泳動のための等、生じ る分離の特別の問題に適合させることができる。高濃度のポリオールの存在下に おける分離のためには、好ましい温度範囲は２０°Ｃ付近である。

毛細管は、冷却水チャンネルと連通ずるかしかし電気泳動チャンバー内部にはい かなる冷却液も侵入できないよう、側面部分に連結される。

２つの隣接するコンパートメントの境界面は、仕切り要素によって互いからシー ルされる。従って、各コンパートメントの側面部分の縁及び基礎部分の縁は、シ ール機能を達成し且ついかなる電解質溶液の漏出をも防止するよう形状が与えら れる。それらは、例えば、ゴム又はテフロン若しくはシリコンのような他の適当 な材料で作られた、シール性の輪郭を含む。

仕切り要素は、分離されるべき蛋白質は拡散できる一方、隣接するコンパートメ ント間での液体の交換を防止するのに役立つ。即ち、仕切り要素は膜として働く 。この膜機能を有し且つ力学的に十分に安定でもあるいかなる物質も使用するこ とができる。適当な材料としては、例えば多孔性ポリマーフィルム、セラミック 膜、又は非常に薄いゲルで被覆した工業用布が含まれる。そのような布は、例え ば、ドイツ出願公開公報３７３６０８７に記述されており、その内容はここに言 及される。

特に好ましい材料は、約５０μｍ乃至２ｍｍ、好ましくは５０乃至１００μｍの 厚さを有する、超薄布支持のポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲルである 。この種の薄布支持ゲルは、２つのコンパートメントの間に直接に入れることが でき、仕切り要素を受けるための他のいかなる構造的特徴も必要としない。ゲル は、外部固定装置によってかけられた圧力によって２つのコンパートメントの間 に固定される。ゲルの表面積は、冷却水チャンネルが覆われないような寸法のも のである。

本発明の具体例の一つにお、いては、仕切り要素は、その表面にゲルを重合する ことのできるものである布を固く連結させて有する、薄い枠よりなるものである ことが提示される。この具体例は、電気泳動チャンバーの迅速な組立と仕切り要 素の一層容易な取り替えとを可能にする。この場合、枠は、連合したコンパート メントとしての冷却水チャンネルのための、同じサイズの空洞を有しなければな らないことは言うまでもない。

ゲルは、電気泳動に通常使用されるような添加物を含むことができる。この方法 により、課された種々の分離問題に本発明の電気泳動法チャンバーを適合させる ことができる。こうして、例えば、ポリアクリルアミドゲルを使用する場合には 、既に知られている固定されたｐＨ勾配における等電点電気泳動の技術における ように、ゲル中に追加の官能基を含めることができる。

本発明による寸法に依存しない毛細管冷却システムは、種々の形態をとりうる。

好ましい具体例は、毛細管がコンパートメントの側面部分に固定的に連結されて おり冷却水チャンネルを通じて冷却液か供給されるものであり、既に上述した。

他の具体例の一つにおいては、各コンパートメントの毛細管は、共に結合されて 「エンドルス」の毛細管を形成し、冷却液システムに連結されている。

他の具体例の一つにおいては、毛細管冷却システムは、コンパートメントに固定 的には連結されていない。毛細管は、冷却液を供給し且つ除去するための装置を も含むものである平たい枠内に配列される。該枠の寸法は、コンパートメントに 備えられた溝に挿入することができるようなものである。毛細管を有する枠がコ ンパートメントの境界面に対して平行に配列されることが必要である。

最初の及び最後のコンパートメントには、電気泳動チャンバーの電極（陽極及び 陰極）か存する。電極の構造は慣用の形態の範囲内で変更できるが、網様の構造 の電極を使用するのが有利であることが判明した。不活性な材料（例えばプラス チック）で作られた「粗いメツシュ」の網（メツシュサイズｌ乃至３ｍｍ）は、 それを縫う電導性材料、好ましくは白金線を有する。専ら白金又は白金／イリジ ウム線により織られたネットを使用することも適している。

グラファイトの電極又はチタン／白金電極もまた適している。電極の表面積は、 コンパートメントの内表面積に実質的に対応している。５０ｍ１乃至２００Ｖ／ ｃｍの高い電場強度及びその結果としての電極スペースにおける気体発生のため 、２つの電極を含んだこれら２つのコンパートメントについては、他のコンパー トメントに比して実質的に大きい容積を有することが有利である。これは過剰な 発泡を回避する。本発明の電気泳動チャンバーの区分された構造は、電極を有す るコンパートメントの電解質溶液が他のコンパートメントとは異なる組成を有す ることを許容する。こうして、例えば、より高含量のポリオールで電極領域にお ける発泡を減少させることがてきる。

本発明の電気泳動チャンバーは、コンパートメントと仕切り要素とか交替する多 （の区画より構成される。外側の２つのコンパ−トメントは、２つの電極を有す る。この電気泳動チャンノく−は、電解質溶液が外部へと漏出しないよう及び隣 接するコンパートメント間において液体の交換か起こらないよう、その層状の構 造とともに、個々の構成要素（コンパートメント及び仕切り要素）をシールする ために固定装置で一緒に保持される。

本発明の電気泳動チャンバーについては、分離された物質の抗対流的安定性のた めには、チャンバーを４０乃至８０％のポリオール、例えばグリセロール、ショ 糖、ソルビトール又はこれらポリオールの混合物の溶液で満たすのが有利である ことが判明している。個々のコンパートメントは、互い同士、布支持ポリアクリ ルアミドゲルによって分離されている。この抗対流安定性により、分離過程にお いて区分の全てからサンプルを採取することができ、そして、分離後、何らの破 壊的な混合を伴うことなく蛋白質を容易に溶出することができる。ポリオールの 濃度勾配によって安定化されたｐＨ勾配における等電点電気泳動法の導入に際し て、高ポリオール濃度が電気泳動過程と適合性であることが見出された。

特に、チャンバーが高い物質負荷を有しているときには、電気デカンテーション を防止するために、個々のコンパートメントの内容物をマルチチャンネルポンプ によって持続的に循環させることが必要であろう。電気デカンテーションは、コ ンパートメントのより低い部分への分離された物質の集積を引き起こすであろう が、これは分離を妨害し、従って、望ましくないであろう。至適の分離のために は、分離された物質及び電解質かコンバートメン）・の全断面にわたって一様に 分布しでいることか望ましい。くまれた液体は、個々のコンパートメントの流出 チャンネルによって除夕１され、そして、循環さねだ液体は、個々のコンパート メントの上側部分・＼とチコーブを通って再循環される。

布支持ポリアクリルアミドゲルによるコンパートメント化は、多くの利点を有す る。ポリアクリルアミドゲルは、分析実験より、等電点電気泳動法及び他の電気 泳動的分離過程を妨害しないことが最もよく知られているマトリクスである。こ のアクリルアミドゲルにより支持された布の層厚は、およそ０．０５乃至２ｍｍ の範囲で選択することかできる。この方法により、分離チャンバー内のゲル相に 対する液相の比率を変化させることが可能であり、それは分離において極めて重 要な効果を有する。この布支持ゲルは、力学的に安定であり、良好なコンパート メント化を許容する。二〇布支持ゲルは、洗浄し、乾燥しそして脱水することが できる。この布支持ゲルの組成は、特定の架橋度内において所望の通りでよい。

ポリアクリルアミドゲルの使用はまた、固定されたｐＨ勾配中における等電点電 気泳動法の技術より知られているように（Ｇｏｒｇ、　Ａ。

、　Ｆａｗｃｅｔｔ、　Ｊ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｃｈｒａｍｂａｃｈ、　Ａ、　Ａｄ ｖ、　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、■９８８、２．１−４３）、ゲル中へ 追加の官能基を導入することをも可能にするコンパートメントは、ｐＨ１温度、 ＵＶ、ＩＲ，放射性標識サンプルの活性測定、電導度等の重要なパラメーターを 測定するためのセンサーを含むことかできる。本発明の電気泳動チャンバーは、 もし追加的に自動サンプル記録装置及びサンプリング装置が装備されわは、断続 的な操作のために完全に自動化することができる。

通常、本発明の電気泳動チャンバーは、水平位置において操作される。しかしな がら、もしコンパートメントの枠が、コンパートメントを膚だし及び空にするだ めの開口を除き全ての側において閉じられているならば、該電気泳動チャンバー はまた、垂直にして操作することもてきる。

蛋白質を分離するためには、例えば、次の手順が用いられる・電解質溶液で満た されたコンパートメントのうち、１つ又はより多くのコンパートメントが空にさ れ、分離されるべきサンプルと電解質溶液との混合物で満たされる。分離の進行 は、個々のコンパートメントからの直接サンプリングによっても、又は、もしコ ンパートメントが適当なセンサーを含んでいれば、測定により得られたデータに よって、モニターすることができる。分離されたサンプルは、単に関係コンパー トメントを空にすることにより単離される。

等電点電気泳動の間、全てのコンパートメントは、サンプル溶液で満たすために 空にすることができる。電場中において、サンプルは次いで個々のコンパートメ ントの等電点に従って分離される。

担体両性電解質の分画は、等電点電気泳動のための担体両性電解質の製造におけ る重要な段階である。高分離能分離チャンバーによれば、これまで使用されてき た工程で可能であったよりも一層よく規定された性質を有する狭いｐＨ範囲の担 体両性電解質を調製することができる。担体両性電解質のｐＨ範囲が狭いことは 、例えば、ゲノムマーカーを研究する場合のように、高い分離能が必要とされる 分離のためには重要である。

多くの実験において、担体両性電解質を合成するための混合物が分画され、単離 された画分は、分析的等電点電気泳動試験において試験された。本新規の分離チ ャンバーの卓越した冷却効率のおかげで、濃縮された合成混合物（３５％）か直 接、即ち希釈することなく分画でき、それにより、これまで必要であった、希薄 な、分画された担体両性電解質の費用のかかる濃縮操作が省かれた。４４時間の 分離時間の後、ｐＨ勾配は、中性のｐＨにおいてこのｐＨ範囲に特徴的である最 低の電導度を有する、実質的に直線的な推移を示した。分析的等電点電気泳動試 験０ｍ１ ｐＨ勾配は、いくつかの例においては狭いｐＨｉ！［（例えば、ｐＨ範囲３乃至 ４）にわたる卓越した直線性を育して、調製的実験において単離されたｐＨ範囲 と一致していた。担体両性電解質の分画は、サンプル又は緩衝剤電解質が高い電 導度を有している場合であってさえ該新規の分離チャンバー中において分離を実 施することが可能であることを示している。そのような分離はまた、他の低分子 量物質の場合にも興味あるものであろう。

種々の蛋白質を分離するために、ｐＨ勾配及び電圧Ｘ時間（ｖｈ）産物は至適化 されなければならない。これは、電場中におけるｐＨ勾配の安定性を前提とする 。ｐＨ４乃至９の５ｅｒｖａｌｙｔ担体両性電解質中における実験において、ｐ Ｈ勾配は６０００乃至１３０００　Ｖｈのｖｈ産物について一定であった。狭い ｐＨ範囲の調製的等電点電気泳動法において、ｐＨ範囲は最初に単離された範囲 と一致した。この実験は、２又はより多くの段階におけるカスケードフォーカシ ング（ｃａｓｃａｄｅ　ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）が可能であることを示しており、 それは分離することが困難な成分の分離を有意に改善しつるであろう。

図１に示したように、本発明の電気泳動チャンバーは、そのモジュール構造によ って特徴づけられる。コンパートメント（２）は、基盤（１）上に順次配列され ている。この図面は２つのコンパートメントの間に位置する仕切り要素は示して いない。電極（３）を含むコンパートメントに隣接して、２つの案内レール（６ ）を受けるための手段（５）を有する２つの安定な末端ブロック（４）がある。

盤、案内レール及び末端部分（８）は、液密的な電気泳動チャンバーを形成する よう個々のコンパートメントが固定されることを可能にする。もし案内レールが 丸棒又は管の形態であれば、それらはネジ山を含んでよい。

末端部分（８）は、取り付けられそしてナツトによって締めつけられ、それによ り、必要な圧力が、案内レール上に可動的に取り付けられた末端部分を介して電 気泳動チャンバーに加えられる。末端ブロック（４）は同時に、冷却液が漏出で きないように、２つの冷媒チャンネルの空洞（７）をシールする働きをする。同 様に、末端ブロックは、毛細管冷却システム（１１）を低温保持装置又は他の冷 却液の供給源（図には示さず）に連結するための手段（９）を含む。コンパート メント（２）間のシール（１２）は、液体の漏出を防止する。空洞（７）は、２ つの対向する冷媒チャンネルを形成する。各電極への電気的結合はいずれも図示 していない。熱論、相当する技術的に均等な手段によって、各コンパートメント が一緒に保持されるものであってもよい。

一つの例外について、コンパートメントは、該電気泳動チャンバーの構造を一層 明瞭にするために、正両立面図においてのみ示されている。

一般に、チャンバーは少なくとも５個のコンパートメントよりなる。よＱ少ない 数でも可能であろうか、分離能のため、例外的な場合においてのみ実用的であろ う。５個又はより少ないコンパートメントを有する短縮された分離ルートは、も し、それらかいわゆるカスケードにおいて使用されるならば、妥当である。サン プルの予備的分離か第１の電気泳動チャンバーにおいてなされ、次いでコンパー トメントの内容物は、他のチャンバー中で更なる画分へと分離される。

この手順は数回繰り返すことができる。

カスケードを形成する少数のコンパートメントを有する数個の電気泳動チャンバ ーの組合せは、例えば蛋白質混合物等の迅速な分離を可能にする。

図２は、毛細管冷却システムの固定された、コンパートメント（２）を通る断面 図である。２つの側面部分（１４）及び基礎部分（１５）は結合して枠（１６） を形成している。基礎部分は変化する厚みのものであり、最下点に閉止可能な排 液チャンネル（１７）があり、その上に、電気デカンテーションを防止するため に個々のコンパートメントの内容物を循環させるため、マルチチャンネルポンプ を取り付けることができる。開口（７）は側面部分に備えられている。冷媒チャ ンネルは、こうして数個の枠部分を組み合わせることによって形成される。毛細 管（１８）は、側面部分（１４）に固定的に連結されている。

図３は、分離した冷媒チャンネルを形成するために再分割された開口（７ａ）及 び（７ｂ）を有するコンパートメント（２）を通る断面図である。一層効果的な 冷却のために、冷却液は、例えば向流式の流れとしてそれらに沿って通過させて もよい。図４は、組み込まれた布支持ゲル（２０）を有する仕切り要素（１９） を示す。側面部分（２１）は冷媒チャンネルを形成するだめの空洞（２２）を含 む。側面部分（２１）　、基礎部分（２５）及び上側部分（２３）は、ゲルをそ の上に重台させてある布を支持する固い枠（２４）を形成する。

工　＝ 要約書 チャンバーサイズに依存しない毛細管冷却システムを有するモジュール設計の電 気泳動チャンバー。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年１月７日−

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．調製的電気泳動のための装置であって、複数のコンパートメントよりなる電 解質チャンバーのモジュール構造によって特徴付けられ、該個々のコンパートメ ントが膜様の性質を有する要素（仕切り要素）によって相互に分離されており、 そして各コンパートメントが平行な毛細管よりなる冷却要素を含むものである、 装置。
2. ２．該仕切り要素が膜様の性質を有するポリマーフィルムよりなるものであるこ とを特徴とする、請求項１に記載の装置。
3. ３．該仕切り要素が布支持ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲルよりなる ものであることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
4. ４．調製的電気泳動のための寸法に依存しない冷却システムであって、相互に小 さい間隔で配列された小さい外径の平行な冷却用毛細管を含むものであることを 特徴とするシステム。
5. ５．該毛細管がスチールで作られており且つ絶縁性材料で被覆されているもので あることを特徴とする、請求項４に記載の寸法に依存しない冷却システム。
6. ６．該毛細管がプラスチックよりなるものであることを特徴とする、請求項４に 記載の寸法に依存しない冷却システム。
7. ７．電気泳動チャンバーであって、 ａ）小さい相互間隔の平行な冷却用毛細管を備えた、少なくとも５個のコンパー トメントと、 ｂ）電極を受けるための２個のコンパートメントと、ｃ）該毛細管に冷却液を供 給するための手段と、そしてｄ）該コンパートメントを一緒に保持するための手 段よりなるものであることを特徴とするチャンバー。
8. ８．電気デカンテーションを防止するために個々のコンパートメント内の電解質 を混合するための手段を含むものであることを特徴とする、請求項１、２、３又 は７に記載の電気泳動チャンバー。
9. ９．個々のコンパートメント内における電気デカンテーションを防止するために 個々のコンパートメント内の電解質を混合するためのマルチチャンネルポンプを 含むものであることを特徴とする、請求項８に記載の電気泳動チャンバー。