JPH08504588A - Modified cutinase, dna, vectors and host - Google Patents

Modified cutinase, dna, vectors and host

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JPH08504588A JP51477094A JP51477094A JPH08504588A JP H08504588 A JPH08504588 A JP H08504588A JP 51477094 A JP51477094 A JP 51477094A JP 51477094 A JP51477094 A JP 51477094A JP H08504588 A JPH08504588 A JP H08504588A
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Abstract

(57)【要約】 酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した、改善された脂肪分解活性を示す真核生物クチナーゼ変異体を提供する。 (57) Abstract: was modified amino acid sequence such hydrophobic enzyme surface increases, providing a eukaryotic cutinase variants that exhibit improved lipolytic activity. 特に、 Fusarium sola ni pisiクチナーゼの変異体を提供する。 In particular, to provide a variant of Fusarium sola ni pisi cutinase.

Description

【発明の詳細な説明】 改変クチナーゼ、DNA、ベクター及び宿主技術分野 本発明は一般に、脂肪分解酵素の分野に関する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION modified cutinase, DNA, vectors and host TECHNICAL FIELD The present invention relates generally to the field of lipolytic enzymes. 本発明はとりわけ、組換えD NA技術により改変した脂肪分解酵素、その産生方法、及び特に酵素洗剤組成物でのその使用に関する。 The present invention, inter alia, lipolytic enzyme modified by recombinant D NA techniques, methods for their production, and in particular to its use in enzyme detergent composition. 背景及び従来技術脂肪分解酵素は、トリグリセリドを遊離脂肪酸やジグリセリド、モノグリセリド、場合によってはグリセロールに加水分解できる酵素である。 Background and prior art lipolytic enzymes, free fatty acids and diglycerides triglycerides, monoglycerides, optionally an enzyme capable of hydrolyzing glycerol. 前記酵素は更に、より複雑なエステル(例えば植物のクチン層又は皮脂)を分解し得る。 The enzyme may further degrade more complex esters (e.g. plant cutin layer or sebum). 脂肪分解酵素は、業界ではトリグリセリドのエステル交換やエステル合成のような種々の酵素法で使用されている。 Lipolytic enzyme, in the industry are used in various enzymatic methods, such as triglycerides of transesterification and ester synthesis. 前記酵素は更に、洗剤製品の脂肪除去性を改善するために洗剤組成物で使用されている。 The enzyme is further used in detergent compositions to improve fat removal of the detergent product. 最も広範に使用されている脂肪分解酵素は、リパーゼ(EC3.1.1.3) である。 Lipolytic enzymes are the most widely used is a lipase (EC 3.1.1.3). 例えば、ヨーロッパ特許出願公開第258 068号及びヨーロッパ特許出願公開第305 216号(共にNovo Nordisk)は共に、rD NA技術による異種宿主微生物を介した真菌リパーゼの産生、特にThermomyces lanuginosus/Hum icola lanuginosaに由来するリパーゼの産生を記載している。 For example, European Patent Application Publication No. 258 068 and EP 305 216 No. (both Novo Nordisk) both, the production of fungal lipases via heterologous host microorganism by rD NA technology, especially Thermomyces lanuginosus / Hum icola lanuginosa It describes the production of derived lipase. ヨーロッパ特許出願公開第331 376号(Amano)は、 Pseudom onas cepacia由来のリパーゼのアミノ酸配列を含め、リパーゼ、並びにそのrDNA技術による産生及び使用を記載している。 EP 331 376 (Amano), including the amino acid sequence of a lipase from Pseudom onas cepacia, lipase, and describes the production and use by the rDNA techniques. rDNA技術により産生されるリパーゼの別の例はWO−A−89/09263号やヨーロッパ特許出願公開第218 272号(共にGist−Brocades)に記載されている。 Is described in another example of the lipase produced is WO-A-89/09263 Patent and European Patent Application Publication No. 218 272 No. (both Gist-Brocades) by rDNA technique. リパーゼやその改変に関する刊行物が多数あるにもかかわらず、現在のところ、 Humicola lanuginosa由来のリパーゼだけが洗剤製品用添加剤としてLipolase(登録商標)の商品名で広く市販されている。 Despite the publications on lipase and its modification have many currently only lipase from Humicola lanuginosa are widely commercially available under the trade name Lipolase (TM) as an additive for detergent products. リパーゼの特徴は界面で活性を示すことである。 Feature of lipases is that they exhibit activity at the interface. これは、完全に溶解した基質よりも、界面又はミセルを形成した基質への酵素活性が遥かに高いことを意味している。 This than fully dissolved substrate, enzyme activity on substrates to form an interface or micelles means that much higher. 界面活性は、基質濃度が基質の臨界ミセル濃度(CMC)よりも高くなって、界面が形成されたときに脂肪分解活性の急増となって表れる。 Surfactants, the substrate concentration is higher than the critical micelle concentration of the substrate (CMC), it appears as a sudden increase in lipolytic activity when the interface is formed. 実験では、 この現象を酵素活性対基質濃度のグラフで非連続性として観察することができる。 In the experiment, this phenomenon can be observed as a discontinuity in the graph of enzyme activity versus substrate concentration. リパーゼの界面での活性化機構は、リパーゼ分子のタンパク質構造のコンホーメーション変化によって解明されてきた。 The activation mechanism at the interface of the lipase has been elucidated by conformational changes in the protein structure of the lipase molecule. 遊離した未結合の状態では、らせん状リッド(lid)が触媒結合部位を包囲している。 The liberated unbound state, the helical lid (lid) surrounds the catalyst binding sites. 脂質基質との結合時には、リッドが移動して、触媒部位が露出する。 When binding to the lipid substrate, the lid is moved, the catalytic site is exposed. らせん状リッドは、脂質界面と相互作用して、酵素を界面と結合した状態のままにするとも考えられている。 Helical lid, interacts with the lipid interface, is also believed to remain enzyme bound to the interface. WO−A−92/05249号(Novo Nordisk)は、脂質接触領域が改変された遺伝子工学的改変リパーゼ、特にHumicola lanug inosa由来のリパーゼを開示している。 WO-A-92 / No. 05249 (Novo Nordisk), the genetic engineering modification lipase lipid contact zone has been modified, in particular disclose the lipase derived from Humicola lanug inosa. 脂質接触領域は本明細書では、活性形のときにらせん状リッドにより覆われた表面と定義する。 Lipid contact zone is herein defined as the surface covered by the spiral lid when in active form. 改変は、脂質接触領域の1個以上のアミノ酸残基を欠失又は置換して、静電荷を増加させ、及び/又は脂質接触領域の疎水性を減少させ、又は脂質接触領域の表面コンホーメーションを変えることからなる。 Modifications, one or more amino acid residues of the lipid contact zone deleted or substituted, increase electrostatic charge, and / or decrease the hydrophobicity of the lipid contact zone, or surface conformation of the lipid contact zone It consists of changing the. これは、脂質接触領域の1個以上の陰電荷アミノ酸残基を欠失させ、又はこれらの残基を中性又はより陽性電荷のアミノ酸で置換し及び/又は脂質接触領域の1個以上の中性アミノ酸残基を陽電荷アミノ酸で置換し、及び/又は脂質接触領域の1個以上の親水性アミノ酸残基を欠失させ、又はこれらの残基を疎水性アミノ酸で置換することにより達成される。 This one or more negatively charged amino acid residues in the lipid contact zone deleted, or these residues were replaced by neutral amino acids or more positive charges and / or in one or more lipids contact area It is accomplished by sexual amino acid residue substituted with positively charged amino acid, and / or one or more hydrophilic amino acid residues in the lipid contact zone deleted, or in which these residues are replaced with hydrophobic amino acids . クチナーゼは、ろうエステル加水分解酵素の一種である(EC3.1.1.5 0)。 Cutinase is a type of wax ester hydrolases (EC3.1.1.5 0). これらの酵素は、植物で葉や茎の保護膜として生じるエステル化長鎖脂肪酸/脂肪アルコール網状体のクチンを分解し得る。 These enzymes can degrade cutin esterified long-chain fatty acids / fatty alcohols meshwork occurring as a protective film of leaves and stems in plants. 更には、前記酵素はある程度の脂肪分解活性を有し、即ちトリグリセリドを加水分解し得る。 Furthermore, the enzyme has a certain lipolytic activity, i.e. triglycerides can hydrolyze. 従って、前記酵素は、特殊なリパーゼとみなすことができる。 Thus, the enzyme can be regarded as special lipases. しかしながら、クチナーゼは、リパーゼとは異なり実質的な界面での活性を示さない。 However, cutinase does not show activity in a substantial interface unlike lipase. クチナーゼは、植物(例えば花粉)、細菌及び真菌のような多数の産生源から得ることができる。 Cutinase may be derived from plants (e.g. pollen), a number of production sources, such as bacteria and fungi. クチナーゼは、その脂肪分解性のために、酵素洗剤組成物の成分として提案されている。 Cutinase, due to its lipolytic, it has been proposed as components of enzyme detergent composition. 例えば、WO−A−88/09367号(Gene ncor)は、界面活性剤と実質的に純粋な細菌クチナーゼ酵素とを組み合わせた効果的な洗浄組成物の製造を提案している。 For example, WO-A-88 / No. 09367 (Gene ncor) proposes the preparation of effective cleaning compositions which combine a surfactant and a substantially pure bacterial cutinase enzyme. グラム陰性菌Pseudomon as putida ATCC 53552から得たクチナーゼを含む洗剤組成物が開示されている。 Detergent composition comprising a cutinase obtained from the Gram-negative bacteria Pseudomon as putida ATCC 53552 is disclosed. しかしながら、 より最近のヨーロッパ特許出願公開第476 915号(Clorox)では、 従来の方法を使用した場合、リパーゼと称する前記酵素は織物の油汚れ除去に対して他のリパーゼほどの効果はないと開示されている。 However, more recent EP 476 915 No. In (Clorox), when using the conventional method, disclosed not effective as other lipases relative to said enzyme called lipases grease removal of the fabric It is. 最近、 Fusarium solani pisi由来のクチナーゼの三次元構造が解明された(Martinez等(1992)Nature 356,6 15−618)。 Recently, the three-dimensional structure of the cutinase derived from Fusarium solani pisi has been elucidated (Martinez, etc. (1992) Nature 356,6 15-618). このクチナーゼが触媒結合部位を覆うらせん状リッドを持たないことが知見された。 That this cutinase does not have a helical lid covering the catalytic binding site has been found. その代わり、活性部位のセリン残基が溶媒とアクセスし得るように思える。 Instead, seems like the active site serine residue can be solvent access. これらの知見は、リパーゼの界面での活性化機構に関する現在の理論を確定するように思える。 These findings seem to confirm the current theories of the activation mechanism of the interface of the lipase. Fusarium solani pisi由来のクチナーゼ遺伝子はクローニングされ、配列決定されている(Ettinger等(1987)Bioch emistry 26,7883−7892)。 Cutinase gene from Fusarium solani pisi has been cloned and sequenced (Ettinger, etc. (1987) Bioch emistry 26,7883-7892). WO−A−90/09446号(Plant Genetics Systems)は、 E. WO-A-90 / No. 09446 (Plant Genetics Systems) is, E. coliでの前記遺伝子のクローニングや産生を記載している。 It describes cloning and production of the gene in coli. クチナーゼは、クチナーゼと基質との界面の存在下及び不在下で、水性及び非水性媒質中のエステルの合成や加水分解を効果的に触媒し得る。 Cutinase, in the presence and absence of the interface between the cutinase and the substrate, it can effectively catalyze the synthesis and hydrolysis of the ester in an aqueous and non-aqueous media. その一般的な安定性に基づき、 このクチナーゼを使用して、洗濯洗剤のような洗浄剤や、化粧品組成物やシャンプーのような他の特定の脂肪溶解製剤を製造することができる。 As based on the general stability, using this cutinase, detergents or as laundry detergent, it is possible to produce other specific lipolysis formulations such as cosmetic compositions and shampoos. 経済的に可能な酵素産生方法も、クチナーゼを含む特定の酵素洗剤組成物も開示されていない。 Economically feasible enzyme production process, does not disclose the specific enzyme detergent composition comprising a cutinase. この特徴のため、即ち界面での活性がないために、本明細書中ではクチナーゼを、実質的に界面で活性を示さない脂肪分解酵素と定義する。 Because of this feature, that is, because there is no activity on the interface, the cutinase herein, is defined as the lipolytic enzyme exhibits substantially no activity at the interface. 従って、クチナーゼは、触媒結合部位を覆うらせん状リッドを持たない点が従来のリパーゼと異なる。 Therefore, cutinase, that no helical lid covering the catalytic binding site is different from the conventional lipases. 前述したように、現在のところ、 Humicola lanuginosa由来のリパーゼだけが洗剤製品用添加剤としてLipolase(登録商標)の商品名で広く市販されている。 As described above, at present, only the lipase derived from Humicola lanuginosa are widely commercially available under the trade name Lipolase (TM) as an additive for detergent products. Henrik Malmosは、Chemistr y and Industry 1990,183−186ページに記載する論文で、洗濯プロセス中のリパーゼ活性は一般に低く、Lipolase(登録商標)も例外でないことは周知であると指摘している。 Henrik Malmos is a paper which described Chemistr y and Industry 1990,183-186 page, lipase activity in the wash process is generally low, Lipolase it ® nor exception is pointed out to be well known. 乾燥プロセス中に、織物の含水率が低下すると、酵素は活性を取り戻し、脂肪汚れは加水分解される。 During the drying process, the moisture content of the fabric is reduced, the enzyme regains activity, fat stains are hydrolysed. 次の洗濯サイクル中に、加水分解された物質が除去される。 During the next wash cycle, hydrolysed material is removed. これで、リパーゼ作用が1回目の洗濯サイクルの後は低いのに、 以後のサイクルで有意となる理由の説明もつく。 Now, though lipase action is unlikely after the first wash cycle, get an explanation of the reasons that will become significant in the subsequent cycle. 従って、洗濯プロセス中に有意な活性を示す脂肪分解酵素が更に必要である。 Thus, lipolytic enzyme exhibiting significant activity during the washing process is further required. クチナーゼ、特にFusarium solani pisi由来のクチナーゼが明らかな洗濯中(in-the-wash)作用を示すことが知見された。 Cutinase, it has been found that particularly shows the Fusarium solani pisi cutinase in a clear washing of origin (in-the-wash) action. しかしながら、洗濯中脂肪分解活性の改善されたクチナーゼやこのような酵素の産生方法が更に必要である。 However, improved cutinase and methods of producing such enzymes washing in lipolytic activity is necessary. 本発明の目的は、性能、特に洗濯中脂肪分解活性を改善するように改変されたクチナーゼを提供することである。 An object of the present invention is to provide a modified cutinase to improve performance, especially laundry in lipolytic activity. 驚くべきことに、真核生物クチナーゼ酵素、特にFusarium sola ni pisiColletotrichum capsiciColle totrichum gloeosporiodes 、及びMagnaport he grisea由来のクチナーゼの脂肪分解活性が、酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変することにより改善され得ることが知見された。 Surprisingly, the modified eukaryotic Cutinase enzymes, in particular Fusarium sola ni pisi, Colletotrichum capsici, Colle totrichum gloeosporiodes, and Magnaport he grisea lipolytic activity of cutinase derived is, the amino acid sequence so as to increase the hydrophobicity of the enzyme surface it has been found that can be improved by. 発明の定義酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した親クチナーゼのクチナーゼ変異体。 Cutinase variant of a parent cutinase hydrophobic definition enzyme surface with altered amino acid sequence to increase the invention. 好ましくは酵素表面の疎水性を増して、拡大された脂質接触領域を形成した。 Preferably increasing the hydrophobicity of the enzyme surface to form an enlarged lipid contact regions. 発明の説明本発明は、クチナーゼ酵素の変異体に関する。 Description of the Invention The present invention relates to variants of the cutinase enzyme. 前述したように、クチナーゼは、植物(例えば花粉)、細菌及び真菌のような多数の産生源から得ることができる。 As described above, cutinase may be derived from plants (e.g. pollen), a number of production sources, such as bacteria and fungi. 親クチナーゼとして、即ち組換えDNA技術による改変のための本発明の出発材料として使用すべきクチナーゼは、真核生物クチナーゼの群の中から選択する。 As a parent cutinase, i.e. cutinase to be used as starting materials of the present invention for the modification by recombinant DNA techniques is chosen from the group of eukaryotic cutinase. 真核生物クチナーゼは、植物(例えば花粉)又は真菌のような種々の産生源から得ることができる。 Eukaryotic Cutinases can be obtained from plants (e.g. pollen) or various production sources, such as fungi. (真核生物)真菌クチナーゼの群は、葉特異性及び茎特異性と特異性の異なる2つのファミリーからなるように思える。 (Eukaryotes) the group of fungal cutinase, seems to consist of two families with different leaf specificity and stem specificity and specificity. 葉特異性クチナーゼは、酸性又は中性pH最適値を有する傾向にあり、茎特異性クチナーゼはアルカリ性pH最適値を有する傾向にある。 Leaf specificity cutinase, tend to have an acidic or neutral pH optimum, stem-specific cutinases tend to have an alkaline pH optimum. アルカリ性pH最適値を有するクチナーゼは、ヘビィーデューティ織物粉末/液体洗剤のようなアルカリ性ビルダー入り洗剤組成物での使用により適し、酸性又は中性pH最適値を有するクチナーゼは、 ライトデューティ製品又はリンスコンディショナーだけでなく、工業洗浄製品により適している。 Cutinase having an alkaline pH optimum is suitable for use in alkaline builder-containing detergent compositions, such as F Byi duty fabric powder / liquid detergent, cutinase having an acidic or neutral pH optimum, only light duty products or rinse conditioners not, is more suitable for industrial cleaning products. 以下の表Iに、4種の異なる茎特異性クチナーゼとそのpH最適値を示す。 The following table I, show the four different stem specificities cutinase and its pH optimum. 表I 茎特異性クチナーゼの例 pH最適値 Fusarium solani pisi 9 Fusarium roseum culmorum 10 Rhizoctonia solani 8.5 Alternaria brassicicola(PNBase I) 9 野生型F usarium solani pisiから誘導され得るクチナーゼ(Ettinger等,1987)が本発明で特に好ましい。 Table I stalk specificity cutinase example pH optimum Fusarium solani pisi 9 Fusarium roseum culmorum 10 Rhizoctonia solani 8.5 Alternaria brassicicola (PNBase I) 9 may be derived from the wild-type F usarium solani pisi cutinase (Ettinger et al., 1987) by the present invention particularly preferred. このクチナーゼは、特定の洗剤組成物で使用すると明白な“洗濯中”作用を示す。 The cutinase may show a pronounced "during washing" action when used in certain detergent compositions. アミノ酸配列がFusarium solani pisi由来のクチナーゼと高度の相同性を示すクチナーゼも、親クチナーゼ、即ち組換えDNA技術による改変のための本発明の出発材料として適している。 Cutinase amino acid sequence exhibit a high degree of homology with the cutinase derived from Fusarium solani pisi also suitable parent cutinase, i.e. as starting material for the present invention for the modification by recombinant DNA techniques. Colletotr ichum capsiciColletotrichum gloeosp oriodes 、及びMagnaporthe grisea由来のクチナーゼがその例である。 Colletotr ichum capsici, Colletotrichum gloeosp oriodes, and cutinase derived from Magnaporthe grisea are examples. 図12にこれらのクチナーゼの部分アミノ酸配列を示す。 It shows the partial amino acid sequences of these cutinase in FIG. 高度の相同性を示すことが知見され得る。 To exhibit a high degree of homology may be finding. 遺伝子改変によるFusarium solani pisiクチナーゼの改良に代わる方法として、(プロ)クチナーゼをコードするFusarium s olanipisiColletotrichum capsiciCol letotrichum gloeosporiodes 、及びMagnapo rthe grisea cDNAに由来する5'及び3'DNAプローブや、他の脂肪分解酵素の保存配列を認識するプローブを用いて他の真核生物に由来するクチナーゼをコードする遺伝子情報を単離することができ、また必要とあればこれらのプローブを用い、ポリメラーゼ連鎖反応、即ちPCR技術を使用してクチナーゼを産生する真核細胞のメッセンジャーRNA(mRNA)由来のcDNAを増殖させることができる As an alternative to improving the Fusarium solani pisi cutinase by genetic modification, (pro) cutinase encoding Fusarium s olanipisi, and Colletotrichum capsici, Col letotrichum gloeosporiodes, and Magnapo rthe from grisea cDNA 5 'and 3'DNA probe, other using these probes using a probe that recognizes conserved sequences of lipolytic enzyme can be isolated genetic information encoding the cutinase derived from other eukaryotes, also if necessary, the polymerase chain reaction , i.e. the PCR technique cutinase can be grown messenger RNA (mRNA) from the cDNA of eukaryotic cells that produce using 例えばWO−A−92/05249号参照)。 See, for example Patent WO-A-92/05249). このようにして得られたクチナーゼコード化遺伝子を標準的な手順に従ってE. E. The cutinase encoding gene thus obtained according to standard procedures coliにクローニングして発現した後に、クチナーゼの(脂肪) 汚れ除去性能を適切な条件下で試験する。 After expressing cloned into coli, to test (fat) stain removal performance of cutinase under appropriate conditions. このようにして、洗濯中性能の改善された前記クチナーゼの天然変異体を多数得ることができる。 In this way, it is possible to obtain a large number of naturally occurring variants of improved the cutinase of washing in performance. 更には、これらの天然クチナーゼの配列は、 Fusarium solani pisiクチナーゼの別のタンパク質を製造するための優れた基礎となる。 Furthermore, the sequence of these naturally occurring cutinase, an excellent basis for the production of another protein of the Fusarium solani pisi cutinase. “洗濯中”脂肪分解酵素の活性を決定する因子に関する新たな考えや、 Fus arium solani pisiクチナーゼの3D構造の細心の検査に基づいて、このクチナーゼ、また一般にクチナーゼの性能を組換えDNA技術で改善するための幾つかの可能性を見出した。 And new ideas about the factors determining the activity of "in the wash" lipolytic enzymes, based on the meticulous inspection of the 3D structure of Fus Arium solani pisi cutinase, this cutinase and generally improve the performance of cutinase in recombinant DNA techniques We found some of the possibilities for that. クチナーゼは基本的にLipolase(登録商標)のようなリパーゼとは異なるので、クチナーゼ/基質(脂質界面)間の相互作用は基質と結合し得る疎水性領域のリッド開放や露出とは異なる原理に基づく(Brzozowski等( 1991)Nature 351,491−494)。 Since cutinase basically different from the lipases, such as Lipolase (TM), the interaction between Cutinase / substrate (lipid interface) is based on a principle different from the lid opening and exposure of the hydrophobic regions capable of binding to a substrate (Brzozowski, etc. (1991) Nature 351,491-494). 本発明は、クチナーゼ分子が凝集し始めるほど大きい疎水性領域を改変クチナーゼの表面上に形成せずに基質との相互作用を改善できるようにクチナーゼを改変できることを示している。 The present invention shows that can be modified cutinase so can improve the interaction with the substrate without forming a large hydrophobic region as cutinase molecule begins to aggregate on the surface of the modified Cutinase. 疎水面は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンのような疎水性アミノ酸やメチオニン、量は少なくなるがグルタミン酸、グルタミン及びヒスチジンを導入することにより拡大し得る。 Hydrophobic surface, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, can be extended by a hydrophobic amino acid and methionine, such as tryptophan and tyrosine, the amount is less but introducing glutamic acid, glutamine and histidine. 但し、これらのアミノ酸の疎水性側鎖はクチナーゼの疎水性コアに埋封しないものとする。 However, the hydrophobic side chains of these amino acids shall not be embedded in the hydrophobic core of the Cutinase. メチオニンは通常疎水性アミノ酸とみなさないが、特定位置で取り込まれると、クチナーゼ分子表面の疎水性増加に効果的に作用し得る。 Methionine is not normally considered a hydrophobic amino acid, when incorporated at a specific position, can act effectively to increased hydrophobicity of the Cutinase molecule surface. 場合によっては、疎水性アミノ酸の他に帯電アミノ酸を導入して酵素の凝集を回避することが有益であることが知見されている。 In some cases, it has been found that it is possible to avoid the addition to introducing charged amino acids aggregation of the enzyme of the hydrophobic amino acid is beneficial. 驚くべきことに、リシンやアルギニンのような陽電荷アミノ酸はクチナーゼ分子の特定位置に取り込まれると、疎水性表面積を拡大し得ることも判明した。 Surprisingly, positively charged amino acid such as lysine and arginine when incorporated into a specific position of the cutinase molecule, it has been found capable of expanding the hydrophobic surface area. これは、リシンやアルギニンに存在するメチレン基がクチナーゼ分子内に埋封されない位置に制限されるからである。 This is because the methylene groups present in lysine and arginine is limited to a position that is not embedded in the cutinase molecule. リシン又はアルギニンを使用する利点は、メチレン基が露出して、脂質層と相互作用し得る可能性がアミノ基又はイミド基により増大することである。 The advantage of using lysine or arginine is exposed methylene group, is that the possibility that may interact with the lipid layer is increased by an amino group or an imido group. リシンやアルギニンは通常、疎水性アミノ酸とはみなされない。 Lysine and arginine is usually not considered a hydrophobic amino acid. しかしながら、これらの残基の側鎖を形成する原子は、脂質層と相互作用し得る多数の疎水性原子を(メチレン部分中に)含んでいる。 However, the atoms forming the side chains of these residues contain a large number of hydrophobic atoms capable of interacting with the lipid layer (in methylene moiety). 実際、リシン残基の疎水性部分の寸法は、バリン残基の寸法に匹敵し得る。 In fact, the dimensions of the hydrophobic portion of the lysine residues may be comparable to the size of the valine residue. クチナーゼの他の固有特性は陽電荷の導入により悪影響を受けるが、これは、 脂質層と相互作用するクチナーゼ分子の部分の表面又はこの部分に近い表面に相殺(compensating)陰電荷を導入するか又は前記表面で陽電荷を欠失させることにより相殺され得る。 Another characteristic property of the cutinase adversely affected by the introduction of positive charge, which is or introducing offset (Compensating) negative charge to the surface close to the surface or a part of the portion of the cutinase molecule that interacts with the lipid layer It may be canceled by deleting a positive charge at the surface. 活性部位周辺のFusarium solani pisiクチナーゼ表面の疎水性を検査すると、疎水性が最適でないことが分かる。 Inspection of the hydrophobicity of the Fusarium solani pisi cutinase surface near the active site, it can be seen that the hydrophobic is not optimal. この領域内のこの特定アミノ酸を改良するために、残基をより嵩高い疎水性残基で置換すべきである。 To improve this particular amino acid in this region should be replaced by more bulky hydrophobic residues to residues. 脂質分解酵素の構造と機能との関係を更に理解するために、このような幾つかの酵素の三次元(3D)構造を入念に研究した。 To further understand the relationship between structure and function of lipolytic enzymes were carefully studied the three-dimensional (3D) structure of some such enzymes. これらの構造が文献に記載されていない場合は、構造を分子モデル化技術により誘導した。 If these structures are not described in the literature, and the structure derived by molecular modeling techniques. Rhizomucor mieheiリパーゼの3D構造は、X線結晶法により確定している(Brady等(1990)Nature 343,767−770,Brzozowski等(1991)Nature 351,491−494,Derewenda等(1992)Biochem istry 31,1532−1541)。 Rhizomucor miehei 3D structure of the lipase is determined by X-ray crystallography (Brady, etc. (1990) Nature 343,767-770, Brzozowski, etc. (1991) Nature 351,491-494, Derewenda, etc. (1992) Biochem istry 31 , 1532-1541). Ser−His−Aspプロテアーゼ様触媒トリアッド部位に属する活性部位Ser 144を短いらせん状リッド(残基85−91)下に埋封する。 Ser-His-Asp protease-like catalytic triad short helical lid to the active site Ser 144 belonging to the site (residues 85-91) is embedded in the bottom. 活性部位Serが埋封されている構造を以下では、酵素の“クローズド”コンホーメーションと称する。 Below the structure of the active site Ser has been embedded, it is referred to as a "closed" conformation of the enzyme. 油−水界面での吸着がらせん状リッドの移動と関係すると考えられている。 Oil - adsorption at water interface is thought to be associated with the movement of the helical lid. この移動によって、活性部位セリンは露出し、活性部位周辺の疎水性領域が増大する。 This movement, the active site serine is exposed hydrophobic region near the active site is increased. “オープン”コンホーメーションは、油−水界面で吸着される活性化酵素に相当すると考えられる。 "Open" conformation, the oil - is considered to correspond to the activating enzyme to be adsorbed by water interface. 真菌Rhizomucor mieheiリパーゼの“クローズド”形態のC α−配位は、BrookhavenのProtein Data Bankに寄託されている。 C alpha-coordinated "closed" form of the fungus Rhizomucor miehei lipase have been deposited in the Protein Data Bank of Brookhaven. 綿密な計算法を使用して、 Rhizomucor mieheiリパーゼの全タンパク質配位(主鎖及び側鎖)を生成した。 Use depth calculation method to generate total protein coordination of Rhizomucor miehei lipase (main chain and side chain). S. S. Wodak等( 1989)Protein Engineering 2,335−345に記載されている計算法を適用して、 Rhizomucor mieheiリパーゼのおおよその出発モデルを作成した。 Wodak, etc. (1989) by applying the calculation method described in Protein Engineering 2,335-345, creating the approximate starting model Rhizomucor miehei lipase. この方法は、SYBYL分子モデル化ソフトウエアパッケージ(TRI POS associates,Inc.St.Louis,Missouri )で実施される。 This method, SYBYL molecular modeling software package (TRI POS associates, Inc.St.Louis, Missouri) is carried out at. その後、BIOSYM分子モデル化ソフトウエアパッケージ( BIOSYM,San Diego,California)で実施されるようなエネルギー最小化(EM)や分子力学(MD)技術を適用してモデルを修正した。 Then modify the model by applying BIOSYM molecular modeling software package (BIOSYM, San Diego, California) energy minimization as implemented in the (EM) and molecular dynamics (MD) techniques. モデルのEM及びMD処理中に、知識をベースとするアプローチを適用した。 During EM and MD process model was applied an approach based on knowledge. 可能なエネルギー関数の詳細なエネルギー項(terms)や既知の構造基準について、モデルを同時に最適化した。 For detailed energy terms (terms) and known structural criteria of possible energy function was optimized model simultaneously. モデル品質を、水素結合の数や品質、二次構造要素での水素結合パターン、ペプチド単位の配向、主鎖二面角の値、芳香族基の相互作用角及びキャビティー寸法のような基準により評価した。 The model quality, the number and quality of hydrogen bonds, hydrogen bonding patterns in the secondary structure elements, the orientation of peptide units, the values ​​of the backbone dihedral angles, by criteria such as interaction angle and cavity dimensions of the aromatic group evaluated. 更には、不適切に埋封された電荷、極端に露出した疎水性残基、及びジスルフィド架橋のエネルギー的に好ましくない位置についてモデルを検査した。 Furthermore, we examined the model for improperly embedded charge, extremely exposed hydrophobic residues and energetically unfavorable positions of disulphide bridges. 関係する側鎖ロータマー(rotamers)は、Ponder & Richardsロータマーライブラリーから選択した(Ponder等( 1987)J.Mol.Biol.193,775−791)。 Related side chain rotamers (rotamers) was selected from the Ponder & Richards rotamer library (Ponder, etc. (1987) J.Mol.Biol.193,775-791). このライブラリーからの特定側鎖ロータマーの最終的な選択は、前述したような構造基準の評価を基準とした。 The final selection of a particular side-chain rotamer from this library was based on the evaluation of structural criteria described above. MDを使用して、側鎖原子を所定位置にアニーリングした。 Use MD, it was annealed side chain atoms into position. 既知の構造特性との一貫性についてモデル構造を入念に検査し、EM及びMD計算により構造特性を最適化すると、 Rhizomucor mieheiリパーゼの確実な全原子モデルを形成することができる。 The model structure carefully inspected for consistency with known structural properties and to optimize the structural properties by EM and MD calculations, it is possible to form a reliable full atom model of the Rhizomucor miehei lipase. Rhizomucor mieh eiリパーゼの“オープン”コンホーメーションは、C 10 −トリグリセリドがリパーゼの活性部位に結合するMDコンピューターシミュレーションを適用して得られた。 Rhizomucor Mieh ei "open" conformation of lipase, C 10 - triglycerides was obtained by applying the MD computer simulation that bind to the active site of the lipase. 文献に記載のオープン構造のコンホーメーション特性(Derewen da等,Biochemistry(1992)31,1532−1541)と入念に比較すると、このようにして得られた“オープン”コンホーメーションのコンピューターモデルが本質的に同一であることが判明した。 Conformation characteristic of open structure described in the literature (Derewen da like, Biochemistry (1992) 31,1532-1541) when a careful comparison of the computer model of the thus obtained "open" conformation is essentially it has been found to be the same. 真菌Rhizomucor mieheiリパーゼの既知の3D構造を出発点とし、SYBYL分子モデル化ソフトウエアパッケージ(TRIPOS associates,Inc.St.L ouis,Missouri)のCOMPOSERモジュールで実施されるようなルールベースの比較モデル化技術を適用して、 Humicola langi nosaリパーゼの“オープン”及び“クローズド”3D構造を得た。 The known 3D structure of fungal Rhizomucor miehei lipase as a starting point, SYBYL molecular modeling software package (TRIPOS associates, Inc.St.L ouis, Missouri ) rule-based comparative modeling techniques as implemented in the COMPOSER module It was applied to obtain the "open" and "closed" 3D structure of the Humicola langi nosa lipase. 得られたHumicola langinosaリパーゼモデルを、前述したのと同一の計算手順で修正した。 The resulting Humicola Langinosa lipase model was modified in the same calculation procedure as described above. 真菌Rhizomucor mieheiリパーゼ及びHumicola l anginosaリパーゼの三次元(3D)構造を比較して、基質の酵素上への吸着に関与するリパーゼ分子の部分を同定した。 By comparing the three-dimensional (3D) structure of the fungus Rhizomucor miehei lipase and the Humicola l anginosa lipase was identified moiety of the lipase molecule involved in adsorption onto the substrate for the enzyme. Fusarium solani pisiクチナーゼの既知の3D構造を出発点とし、SYBYL分子モデル化ソフトウエアパッケージ(TRIPOS a ssociates,Inc.St.Louis,Missouri)のCOM POSERモジュールで実施されるようなルールベースの比較モデル化技術を適用して、 Colletotrichum gloeosporiodes由来のクチナーゼの3D構造を得た。 Fusarium solani pisi the known 3D structure of the cutinase as a starting point, SYBYL molecular modeling software package (TRIPOS a ssociates, Inc.St.Louis, Missouri ) rule-based comparative modeling as implemented in COM POSER module by applying the technology to obtain the 3D structure of the cutinase from Colletotrichum gloeosporiodes. 得られたColletotri chum gloeosporiodesクチナーゼモデルを、前述したのと同一の計算手順で修正した。 The resulting Colletotri chum gloeosporiodes cutinase model was modified in the same calculation procedure as described above. 予期に反して、以下の表IIに示す脂肪分解酵素の三次元構造から、 Fusar ium solani pisiクチナーゼの残基116−120のCα−原子を介する最小自乗適合(least-square fit)である特定ベクトル(a particular vector which is the least-square fit through the Cα-atoms)を規定できることが観察された。 Unexpectedly, it is a three-dimensional structure of the lipolytic enzyme shown in the following table II, least squares fit through the Cα- atoms Fusar ium solani pisi residues cutinase 116-120 (least-square fit) specific vector (a particular vector which is the least-square fit through the Cα-atoms) that can be defined to have been observed. このベクトルは、基質との相互作用が生じる面と殆ど垂直である。 This vector is almost perpendicular to the surface where the interaction with the substrate occurs. 起源の異なる数種の脂肪分解酵素の一次配列を比較すると、例えばFusar ium solani pisiクチナーゼのアミノ酸残基116−120が機能相同性の程度が高い領域に位置するように思えることが以下の表IIから分かる。 Comparing the primary sequence of different several lipolytic enzymes origins, e.g. Fusar ium solani pisi cutinase Table II amino acid residues 116-120 that seems like the degree of functional homology is located in the high region of the following It can be seen from. 脂肪分解酵素のコンセンサス配列Gly−(His/Tyr)−Ser−X− Glyを使用して整列し比較することができる。 It can be compared and aligned using lipolytic enzyme consensus sequence Gly- (His / Tyr) -Ser-X- Gly. 従って、 Fusarium solani pisiクチナーゼ分子のアミノ酸残基116−120を介するベクトルを使用して、洗浄中活性の改善されたクチナーゼを得るためにアミノ酸改変すべきクチナーゼ分子の部分を限定した。 Therefore, using the vector through the amino acid residues 116-120 of Fusarium solani pisi cutinase molecule was limited portion of the cutinase molecule to be amino acid modifications in order to obtain improved cutinase washing in activity. 以下の表IIIは、表IIに示す脂肪分解酵素について隣接するアミノ酸の構造を示す。 Table III below shows the structure of an amino acid adjacent the lipolytic enzymes shown in Table II. 本発明の一態様により、酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した、洗浄中脂肪分解活性の改善された改変クチナーゼ酵素を提供する。 According to one aspect of the present invention modified the amino acid sequence so as to increase the hydrophobicity of the enzyme surface, to provide an improved modified cutinase enzyme cleaning in lipolytic activity. 好ましくは脂質接触領域に隣接する酵素の表面の疎水性を増して、広い脂質接触領域を形成した。 Preferably increasing the hydrophobicity of the surface of the enzyme adjacent to the lipid contact zone, to form a large lipid contact zone. 1個以上のアミノ酸残基を、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン及びヒスチジンからなる群の中から選択されるアミノ酸残基で置換することにより、クチナーゼの表面疎水性を増すことができる。 One or more amino acid residues, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, tryptophan, and tyrosine, methionine, glutamic acid, by replacing an amino acid residue selected from the group consisting of glutamine and histidine, it is possible to increase the surface hydrophobicity of the cutinase. バリン、 ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが好ましい。 Valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tryptophan and methionine are preferred. 表面疎水性を増すだけでなく、1個以上のリシン又はアルギニン残基を導入して1個以上の陽電荷を導入するようにアミノ酸配列を改変することが有利であることが知見された。 Not only increase the surface hydrophobicity, it has been found that altering the amino acid sequence to introduce one or more positive charges by introducing one or more lysine or arginine residues are preferred. 改変残基が、 Fusarium solani pisiクチナーゼの残基1 16−120のCα−原子又は異なるクチナーゼの対応するCα−原子を介する最小自乗適合であるベクトルと、該ベクトルに垂直で、残基117のCα−原子又は異なるクチナーゼの対応するCα−原子を含んでいる面によって規定される分子部分に位置することが好ましい。 Modified residues, and the vector is a least squares fit through the corresponding Cα- atoms Fusarium solani pisi cutinase residues 1 16-120 of Cα- atom or different cutinase, perpendicular to the vector, C alpha residues 117 - it is preferably located in the molecule portion defined by surfaces that include atoms or a different corresponding Cα- atoms cutinase. 前述したように、 Fusarium solani pisi由来のクチナーゼの三次元構造は文献に記載されている。 As described above, the three-dimensional structure of cutinase from Fusarium solani pisi have been described in the literature. この場合、どの改変が本発明の範囲内の改変となるかは明白である。 In this case, what modifications will become modifications within the scope of the invention will be apparent. 特定クチナーゼの三次元構造が判明していない場合には、脂肪分解酵素のコンセンサス配列Gly−(His/Tyr)−Ser −X−Glyによって誘導される既知配列のアミノ酸配列(図12参照)の整列比較によって、本発明の範囲内で適切な改変を行うことが可能である。 If the three dimensional structure of a particular Cutinase is not known, the alignment of the amino acid sequence of known sequence induced by lipolytic enzyme consensus sequence Gly- (His / Tyr) -Ser -X-Gly (see FIG. 12) by comparison, it is possible to perform appropriate modifications within the scope of the present invention. このプロセスでも分子モデル化技術を使用することが好ましい。 It is preferred to use molecular modeling techniques in this process. 本発明に従って産生したクチナーゼ変異体は、洗剤又は洗浄組成物の一部分として使用すると酵素活性で利点を示し得る。 Cutinase variants were produced in accordance with the present invention may exhibit advantages in enzymatic activity when used as part of a detergent or cleaning composition. 特に、前記クチナーゼ変異体は、洗濯プロセスの主サイクル中に改善された洗濯中性能を示すことが判明した。 In particular, the cutinase variant, exhibit improved wash in performance during the main cycle of a wash process was found. 洗濯プロセスの主サイクル中の洗濯中性能とは、酵素を含む洗剤組成物が、濃度、水の硬度、温度に関しては通常の洗濯条件を用い、ヨーロッパタイプの自動洗濯機により、1回の洗濯プロセスで汚れた織物からかなりの量の油汚れを除去できることを意味する。 The washing in performance during the main cycle of a laundering process, the detergent composition comprising an enzyme, concentration, water hardness, using a conventional washing conditions with respect to temperature, by an automatic washing machine European type, one laundering process It means that it is possible to remove a substantial amount of oil stains from soiled fabrics in. 市販されている従来の脂肪分解酵素Lipolase(登録商標)(Novo Nordisk製)は、同一の条件下で油汚れに対して有意な洗濯中作用を示すとは思えないことに留意すべきである。 Commercially available conventional lipolytic enzyme Lipolase (TM) (manufactured by Novo Nordisk) should be noted that not seem to exhibit the effect of significant washing the oil stains under the same conditions. 酵素の油汚れへの洗濯中作用は、以下のアッセイを用いて評価することができる。 Washing in the action of the oil stains of enzyme can be assessed using the following assay. 綿含量が10%未満の新しいポリエステル試験布を以下に示すような酵素非含有洗剤製品を用いて予洗し、その後十分に濯ぐ。 New polyester test cloth of cotton content of less than 10% with an enzyme-free detergent product such as the following prewashed, then thoroughly rinsed. 次いで、このような汚れていない布にオリーブ油又は他の適切な加水分解可能な油しみをつける。 Then, put the olive oil, or other suitable hydrolysable oil stains on fabric no such contamination. 各試験布( 重量約1g)を100mlのポリスチレンビン内の30mlの洗液でインキュベートする。 Each test cloth (weighing approximately 1g) and incubated at wash of 30ml in polystyrene bottles 100 ml. 洗液は以下に示す洗剤製品を1g/l含んでいる。 Washings contain detergent product shown below 1 g / l. 通常の30℃主洗濯プログラムを用い、水を一杯に入れたMiele TMT洗濯機でビンを30 分間撹拌する。 Using conventional 30 ° C. main wash program, stirred bottles 30 minutes Miele TMT washing machine placed in a glass of water. 予め3LU/mlのクチナーゼ変異体を洗液に添加する。 Adding previously 3LU / ml cutinase variant washings. 対照は酵素を含んでいない。 Contrast does not contain the enzyme. 粉末洗剤の組成を以下に示す(重量%): エトキシル化アルコール非イオン界面活性剤 9.5 硫酸ナトリウム 38.6 炭酸ナトリウム 40.4 ケイ酸ナトリウム(Na 2 O:Si 2 O=2.4) 7.3 水 4.2 非イオン界面活性剤としては、C 12 −C 15エトキシル化アルコール10.5− 13EOを使用したが、エトキシル化アルコール非イオン界面活性剤の種類は広範囲で変動し得る。 The composition of the powder detergent the following (wt%): Ethoxylated alcohol nonionic surfactant 9.5 Sodium 38.6 Sodium 40.4 Sodium silicate carbonate sulphate (Na 2 O: Si 2 O = 2.4) 7.3 Water 4.2 Nonionic surfactant as has been using C 12 -C 15 ethoxylated alcohols 10.5- 13eo, types of ethoxylated alcohol nonionic surfactant can vary over a wide range. 洗濯した後に、布を冷水で十分に濯ぎ、冷風式回転乾燥機で乾燥し、残留脂肪量を評価する。 After washing, thoroughly rinsing the cloth with cold water, dried cold air rotary dryer, to evaluate the residual fat mass. これは幾つかの方法で実施することができる。 This can be done in several ways. 通常の方法は、試験布をSoxhlet抽出装置中、石油エーテルで抽出し、溶媒を留去してから計量し、布の最初の脂肪量の分数としての残留脂肪分パーセンテージを決定することである。 Conventional methods, in test cloth Soxhlet extraction apparatus, and extracted with petroleum ether, the solvent and weighed. After distilling off is to determine the residual fat percentage as a fraction of the initial fat mass of the fabric. 更に高感度の第2の方法では、臭素化オリーブ油を用いて、試験布を汚す(R ichards,S.,Morris,M.A.及びArklay,T.H.( 1968),Textile Research Journal 38 ,10 5−107)。 Further in the second method of high sensitivity, using the brominated olive oil, soil the test cloths (R ichards, S., Morris, M.A. And Arklay, T.H. (1968), Textile Research Journal 38, 10 5-107). 次いで、各試験布を100mlのポリスチレンビン内の30ml の洗液でインキュベートする。 Then incubated each test cloth wash of 30ml in polystyrene bottles 100 ml. 次いで、通常の30℃主洗濯プログラムを用い、 水を一杯に入れた洗濯機で一連のビンを撹拌する。 Then, using a conventional 30 ° C. main wash program, it stirred a series of bins in a washing machine which takes into a glass of water. 主洗濯の後、 試験布を冷水中で5秒間入念に濯ぐ。 After the main wash, rinse the test cloth in cold water carefully for 5 seconds. 濯いだ直後に試験布を冷風式乾燥機で乾燥する。 The test cloth immediately after rinsing and drying with cold air dryer. 乾燥後、X線蛍光スペクトル分析で布の臭素含量を測定して脂肪残量を決定することができる。 After drying, it is possible to determine the fat remaining by measuring the bromine content of the cloth by X-ray fluorescence spectroscopy. 脂肪除去は、以下のように試験布に最初に存在していた量のパーセンテージとして決定することができる。 Fat removal can be determined as a first percentage of the amount that was present in the test cloth, as follows. 前記式中、臭素bwは洗濯前の布上の臭素パーセンテージを示し、臭素awは洗濯後の臭素パーセンテージを示す。 In the formula, bromine bw denotes bromine percentages in the cloth before washing, bromine aw denotes bromine percentage after washing. 酵素活性の別の評価方法は、標準的な技術に従って460nmで反射率を測定することからなる。 Another method for evaluating enzyme activity consists of measuring the reflectance at 460nm according to standard techniques. 本発明では、改変、突然変異もしくは突然変異体酵素、又は酵素変異体は、突然変異体遺伝子を発現している突然変異微生物によって産生された酵素を意味する。 In the present invention, modifications, mutation or mutant enzyme or enzyme variant is meant an enzyme produced by mutant microorganism expressing the mutant gene. (サイレント突然変異のみを含むもの以外の)突然変異体遺伝子は、直接的又は間接的に誘導され、1カ所以上の場所で対応する親酵素の配列と異なるアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子を意味する。 (Except for those containing only silent mutations) mutant genes is induced directly or indirectly, a gene encoding an enzyme having the amino acid sequence that differs from the sequence of the parent enzyme corresponding in one place or more locations means. 親酵素とは、対応する未変化遺伝子の遺伝子産物を意味する。 The parent enzyme means the gene product of the corresponding unaltered gene. 遺伝子のサイレント突然変異とは、遺伝子のポリヌクレオチド配列で生じる変化又は相違のうち、(コドン−アミノ酸関係での縮重(redundancy)のために)前記遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列が変化しない場合を意味する。 The silent mutation of genes, among the changes or differences occurring polynucleotide sequence of the gene, (codon - due to the degeneracy of the amino acid relationships (redundancy)) amino acid sequence of the enzyme encoded by the gene is not changed It refers to the case. 突然変異体又は突然変異微生物とは、酵素に対する遺伝子が突然変異を起こした親微生物又はその子孫である微生物を意味する。 The mutant or mutated microorganism means a microorganism that is the parent microorganism or progeny thereof gene for the enzyme is mutated. 微生物のこのような突然変異は、(a)既に親微生物に存在している対応遺伝子(親遺伝子)を突然変異させるか、又は(b)他の起源から直接又は間接的に得た対応遺伝子を突然変異微生物となるべき微生物に移入(導入)する(例えば遺伝子を突然変異させる)ことにより実施され得る。 Such mutations of microorganisms, the (a) Already mutate corresponding gene (parent gene) which is present in the parent microorganism, or (b) the corresponding genes directly or indirectly obtained from other sources populated microorganism to be mutated microorganism can be performed by (introduced) to (e.g. mutated genes). 宿主微生物は、その突然変異体遺伝子又は他の起源の移入遺伝子が一部分を構成している微生物である。 Host microorganism, the transgene of a mutant gene or other sources is a microorganism which form part. 一般に、宿主微生物は、株又は種源又は血統が親微生物と同一であっても異なってもよい。 In general, the host microorganism, strain or species source or breed may be the same or different and parental microorganism. 本発明は特に、WO−A−90/09446号(Plant Genetic s Systems)に開示されているFusarium solani pi siクチナーゼ、またColletotrichum capsiciCol letotrichum gloeosporiodes 、及びMagnapo rthe grisea由来のクチナーゼの突然変異体形態を提供する。 The present invention is particularly, WO-A-90/09446 No. (Plant Genetic s Systems) disclosed in Fusarium solani pi si cutinase and Colletotrichum capsici, Col letotrichum gloeosporiodes, and Magnapo rthe grisea from mutant forms of cutinase I will provide a. これらのクチナーゼ変異体は、rD NA技術で得た又は製造した遺伝子を含むrDNA改変微生物により産生され得る。 These Cutinase variants can be produced by rDNA modified microorganism containing or producing gene obtained in rD NA technology. Fusarium solani pisiクチナーゼの残基116−120 のCα−原子又は異なるクチナーゼの対応するCα−原子を介する最小自乗適合であるベクトルと、該ベクトルに垂直で、残基117のCα−原子又は異なるクチナーゼの対応するCα−原子を含んでいる面とによって規定される分子部分に位置するアミノ酸残基が同定されると、同定した1つ以上の位置に適切なアミノ酸を導入することにより、例えばFusarium solani pisiクチナーゼ又はその相同体の配列に関する突然変異N712Kのように、アミノ酸配列を改変することができる。 Fusarium solani and vector a least squares fit of pisi cutinase residues 116-120 of Ca-atoms or a different cutinase through the corresponding Ca-atoms, perpendicular to the vector, the residue 117 Ca-atoms or a different cutinase When amino acid residues located in the molecule portion defined by a plane containing the corresponding Cα- atom is identified by introducing the appropriate amino acid to the identified one or more positions, for example, Fusarium solani pisi as cutinase or mutant N712K related sequence of the homologue, it can alter the amino acid sequence. 当業者には自明の通り、このような改変はクチナーゼの構造に影響する。 As obvious to those skilled in the art, such modifications will affect the structure of the cutinase. 明らかに、活性部位周辺の静電荷にそれほど影響しない改変が好ましい。 Obviously, modifications that do not significantly affect the electrostatic charge near the active site are preferred. 本発明者らは酵素のコンホーメーションの不可避的な歪みと酵素活性増加の利点とのバランスの必要レベルの理解を深めた。 The present inventors have deepened the understanding of the required level of balance between the inevitable distortion and advantages of the enzymatic activity increases in conformation of the enzyme. これにより、高い成功率で有望なクチナーゼ変異体を予測して、製造することができる。 Thus, to predict the potential cutinase variants with high success rate can be produced. 以下の表IVや明細書の他の箇所では、ペプチド配列のアミノ酸やアミノ酸残基を以下に示す1文字及び3文字の略字で示す。 In elsewhere in the following table IV and specification, indicated by abbreviation single letter and three-letter indicating the amino acids and amino acid residues of the peptide sequence below. 表IV A=Ala=アラニン V=Val=バリンL=Leu=ロイシン I=Ile=イソロイシンP=Pro=プロリン F=Phe=フェニルアラニンW=Trp=トリプトファン M=Met=メチオニンG=Gly=グリシン S=Ser=セリンT=Thr=トレオニン C=Cys=システインY=Tyr=チロシン N=Asn=アスパラギンQ=Gln=グルタミン D=Asp=アスパラギン酸E=Glu=グルタミン酸 K=Lys=リシンR=Arg=アルギニン H=His=ヒスチジン 本明細書では、タンパク質のアミノ酸配列に存在する突然変異、従って突然変異体タンパク質自体は、突然変異の位置及び種類により以下の略記法で、即ち突然変異を受けた元のアミノ酸残基のアイデンティティー、突然変異の(配列番号に Table IV A = Ala = Alanine V = Val = Valine L = Leu = Leucine I = Ile = Isoleucine P = Pro = Proline F = Phe = Phenylalanine W = Trp = Tryptophan M = Met = Methionine G = Gly = Glycine S = Ser = serine T = Thr = threonine C = Cys = cysteine ​​Y = Tyr = tyrosine N = Asn = asparagine Q = Gln = glutamine D = Asp = aspartic acid E = Glu = glutamic acid K = Lys = lysine R = Arg = arginine H = His = histidine in this specification, a mutation present in the amino acid sequence of the protein, thus the mutant protein itself, the following abbreviations on the position and type of mutation, namely the original amino acid residues mutated of identity, (SEQ ID NO: of mutation る)部位、及び元のアミノ酸残基にとって代わるアミノ酸残基のアイデンティティーにより記載され得る。 That) site, and may be described by the identity of amino acid residues to replace for the original amino acid residue. 余分のアミノ酸が配列に挿入されると、その位置は、正規の配列又は基準配列の挿入直前の残基の番号に1個以上の下付き文字を付けて示す。 When extra amino acid is inserted into the sequence, its position is shown with one or more subscripts to the numbers immediately before insertion of residues in the regular sequence or reference sequence. 例えば、172位のアスパラギンがリシンで置換されたことを特徴とする突然変異体はAsn172Lys又はN172Kで表す。 For example, mutants, wherein a position 172 asparagine is substituted by lysine are expressed in Asn172Lys or N172K. (仮に)アスパラギンの後にプロリンのような別のアミノ酸残基を挿入すると、Asn172AsnPro 又はN172NPで表すか、172a位を示す挿入残基を用いて*172aPとして表す。 (If) Inserting another amino acid residue such as proline after asparagine, or represents in Asn172AsnPro or N172NP, expressed as * 172AP with inserted residues indicating the position 172a. (仮に)同じ位置でアスパラギンが欠失すると、Asn172*又はN172*で表す。 (If) when asparagine is deleted at the same position, expressed by Asn172 * or N172 *. *は、実際の欠失によって存在しないとみなされる場合は欠失を意味し、この位置に残基を有する他の配列又は基準配列との単なる比較又は相同性によって存在しないとみなされる場合はアミノ酸残基の不在を意味する。 *, If the if deemed not to exist by the actual deletions are considered to mean deletions, absent by simple comparison or homology with other sequences or the reference sequence having a residue in this position amino acid It refers to the absence of residues. 複数の突然変異は+記号で分けて表す。 Multiple mutations represented separately at + sign. 例えばN172K+S54I+A12 8Fは、アミノ酸配列の前記3つの位置の各々で前述したような置換による3つの突然変異を有する突然変異体タンパク質を表す。 For example N172K + S54I + A12 8F represents the mutant protein having three mutations by substitution, as described above with each of the three positions of the amino acid sequence. 所望とあれば、以下の表に示す突然変異を組み合わせてもよい。 If desired, it may be combined mutations in the following table. 以下の表Vは、 Fusarium solani pisi由来のクチナーゼの配列に基づく本発明のクチナーゼ変異体の特定の有用な例を示している。 Table V below shows the specific useful examples of Cutinase variants of the present invention based on the sequence of Cutinase from Fusarium solani pisi. 本発明の好ましい変異体は、 Fusarium solani pisiクチナーゼのA85F、N172K及びE201K、並びに他のクチナーゼの対応変異体である。 Preferred variants of the present invention, Fusarium solani pisi cutinase A85F, it is N172K and E201K, and the corresponding variants of other cutinase. このような対応クチナーゼ変異体の一例は、例えばColleto trichum gloeosporiodesクチナーゼに由来するAsp1 72Lys、即ちD172K変異体である。 An example of such a corresponding Cutinase variant is, for example Colleto trichum gloeosporiodes cutinase derived to Asp1 72Lys, that is, D172K mutant. 本発明の別の態様によれば、本発明のクチナーゼ変異体の産生方法を提供する。 According to another aspect of the present invention provides a method of producing a cutinase variant of the invention. 天然クチナーゼを産生する微生物は通常植物病原体であり、これらの微生物は改変クチナーゼ遺伝子用宿主細胞としての作用にはあまり適さない。 Microorganisms producing natural cutinase is usually plant pathogens, these organisms are not well suited to act as host cell for modified cutinase gene. 従って、rDNA法のために好ましい宿主微生物内に移入することのできるrDNAベクターに、改変(プロ)クチナーゼをコードする遺伝子を取り込んだ。 Therefore, rDNA vectors that can be transferred in a preferred host microorganism for the rDNA techniques, incorporating a gene encoding a modified (pro) cutinase. このため、WO−A−90/09446号に記載のrDNAベクターと本質的に同様のrDNAベクターを使用することができる。 Therefore, it is possible to use a rDNA vector essentially similar rDNA vector described in Patent WO-A-90/09446. 天然クチナーゼを産生する微生物は、発酵法にはあまり適さない。 Microorganism that produces a natural cutinase is not well suited to the fermentation process. 発酵法の収率を改善するため、改良されたクチナーゼをコードする遺伝子を、安い培地で急速増殖し得、また多量のクチナーゼの合成や分泌が可能な微生物に移入すべきである。 To improve the yield of the fermentation, a gene encoding an improved cutinase should populate rapidly proliferating obtained, also microorganisms capable synthesis and secretion of a large amount of cutinase at cheaper medium. 本発明のこのような適したrDNA改変(宿主微生物)は、細菌(とりわ けBacilliCorynebacteria ,Staphylococc 及びStreptomyces )又は下等な真核生物(例えばSacchar omyces cerevisiae及び関連種、 Kluyveromyces marxianus及び関連種、 Hansenula polymorpha及び関連種、並びにAspergillus属種)である。 Such suitable rDNA modified according to the invention (host microorganism) is bacterial (Toriwa only Bacilli, Corynebacteria, Staphylococc i and Streptomyces) or lower eukaryotic organisms (e.g. Sacchar omyces cerevisiae and related species, Kluyveromyces marxianus and related species, Hansenula polymorpha and related species, it is well Aspergillus species). 好ましい宿主微生物は下等な真核生物である。 Preferred host microorganism is a lower eukaryotes. 何故ならば、これらの微生物は、発酵法で非常によく酵素を産生分泌し、クチナーゼ分子を解糖し得るからである。 Because these microorganisms are very well enzyme to produce secrete by fermentation, because may glycolysis cutinase molecule. グリコシル化は、洗浄系でのクチナーゼの安定性に寄与し得る。 Glycosylation can contribute to the stability of the Cutinase in the cleaning system. 本発明は更に、改変真核生物クチナーゼ遺伝子(例えばFusarium s olani pisi由来の遺伝子)をクローニングrDNAベクターに導入して得られる遺伝子材料、及び新しい宿主細胞の形質転換やクチナーゼ変異体遺伝子の新しい宿主細胞での発現のための前記遺伝子材料の使用を提供する。 The present invention further provides modified eukaryotic Cutinase genes (e.g. Fusarium s olani pisi gene derived) genetic material obtained a by introducing into a cloning rDNA vectors, and new host cells transformed or cutinase variant gene new host cell It provides the use of the genetic material for expression in. 前記クチナーゼ変異体をコードするrDNA技術によって製造又は改変されるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むrDNAベクター、並びに前記ポリヌクレオチド及び/又は前記rDNAベクターを含むrDNA改変微生物も本発明で提供する。 Polynucleotides produced or modified by rDNA technique which encodes the Cutinase variant, rDNA vector comprising said polynucleotide, as well as by rDNA modified microorganisms present invention comprising said polynucleotide and / or the rDNA vector. 本発明は更に、改変真核生物クチナーゼをコードする対応ポリヌクレオチド(例えば成熟クチナーゼ変異体をコードする塩基配列を有し、最終翻訳コドンの次に終結コドンが来るポリヌクレオチドであるが、場合によっては成熟クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列のすぐ上流にこのクチナーゼ変異体のプレプロ又はプロ配列をコードするヌクレオチド配列を有する)を提供する。 The present invention further modification has a nucleotide sequence encoding the corresponding polynucleotides (e.g., mature cutinase variants encoding eukaryotic cutinase, but following the termination codon of the final translation codon is a polynucleotide which comes, in some cases providing a) a nucleotide sequence encoding a prepro or pro-sequence of this cutinase variant directly upstream of the nucleotide sequence encoding the mature cutinase variants. このようなポリヌクレオチドでは、産生源の微生物から誘導される、クチナーゼをコードするヌクレオチド配列を、少なくとも1個のコドン、好ましくはできるだけ多くのコドンが'サイレント'突然変異の対象に対し、新しい宿主に好まれるコドンである、同等のアミノ酸残基をコードするコドンを形成するように改変することにより、前記宿主の細胞内での使用時に、安定性の改善された導入遺伝子用mRNAを提供することができる。 In such a polynucleotide are derived from microorganisms producing source, a nucleotide sequence encoding a cutinase, at least one codon, to preferably as many codons 'silent' mutation target, the new host a codons favored by modifying to form codons encoding equivalent amino acid residues, in use in the cell of the host, to provide improved stability transgene for mRNA it can. プロ又は成熟クチナーゼをコードするヌクレオチド配列の上流には、特定宿主に適したシグナル又は分泌配列をコードするヌクレオチド配列が位置し得る。 Upstream of the nucleotide sequence encoding the pro-or mature cutinase, the nucleotide sequence encoding a signal or secretion sequence suitable for a particular host may be located. 従って、本発明の一実施態様は、クチナーゼ変異体又はその前駆体をコードするヌクレオチド配列が内部に挿入されたrDNAベクターに関する。 Thus, one embodiment of the present invention relates to a rDNA vector nucleotide sequence encoding a cutinase variant or a precursor thereof has been inserted therein. ヌクレオチド配列は例えば、以下の配列から誘導され得る: (a)(例えばFusarium solani pisiで産生したプロプレ又はプロクチナーゼの元のアミノ酸配列をコードする)天然ヌクレオチド配列; (b)新しい宿主に好まれるコドンと、新しい宿主で安定なメッセンジャーRN Aを生じさせるヌクレオチド配列とからなり、依然として元のアミノ酸配列をコードする化学合成ヌクレオチド配列; (c)アミノ酸配列は異なるが、洗剤系で優れた安定性及び/又は活性を示す、 Fusarium solanipisiクチナーゼをコードする前項a又はb に記載したヌクレオチド配列の一方に由来する遺伝子工学的に作成されたヌクレオチド配列。 The nucleotide sequence may, for example, may be derived from the following sequence: (a) (e.g., Fusarium solani encoding the original amino acid sequence of prepro or Purokuchinaze was produced in pisi) native nucleotide sequence; codons preferred in (b) the new host When a new host at consists of a resulting cause nucleotide sequences stable messenger RN a, still chemically synthesized nucleotide sequence encoding the original amino acid sequence; (c) the amino acid sequence is different, stability and excellent in detergent systems / or an activity, Fusarium solanipisi cutinase one nucleotide sequence created genetically engineered from nucleotide sequence described in the preceding paragraph a or b coding for. 要するに、好ましい宿主のひとつで前述したようなクチナーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を指令し得るrDNAベクターは好ましくは、以下の成分を含んでなる: (a)成熟クチナーゼ、又はプレクチナーゼ、又は(選択される宿主細胞にとって好ましい)分泌シグナルのすぐ下流でプレ配列の少なくとも一部分が除去された対応プレクチナーゼをコードする二本鎖(ds)DNA。 In short, the preferred rDNA vector capable of directing the expression of a nucleotide sequence encoding a cutinase gene as described above in single host preferably comprises the following components: (a) mature cutinase, or Purekuchinaze, or ( double-stranded (ds) DNA encoding at least corresponding Purekuchinaze a portion has been removed presequence immediately downstream of preferred) secretion signal to the host cell selected. 但し、翻訳されるべき遺伝子の部分がコドンATGで開始していない場合、ATGコドンを前に置くべきである。 However, if the portion of the gene to be translated has not started at codon ATG, it should be placed before the ATG codon. また、遺伝子の翻訳部分は常に適切な終結コドンで終了すべきである; (b)クチナーゼをコードするds DNA(成分(a))のプラス鎖の上流に位置する、(選択される宿主微生物に適した)発現レギュロン; (c)クチナーゼをコードするds DNA(成分(a))のプラス鎖の下流に位置する、(選択される宿主微生物に適した)ターミネーター配列; (d1)選択される宿主のゲノム内へのds DNAの組み込みを容易にするヌクレオチド配列、又は(d2)選択される宿主で適した複製起点; (e1)場合によっては(栄養要求性)選択マーカー。 Moreover, the translation portion of the gene is always should be terminated at the right termination codon; located upstream of the plus strand of (b) cutinase encoding ds DNA (component (a)), the host microorganism (selected suitable) expression regulon; located downstream of the plus strand of (c) cutinase ds DNA encoding the (component (a)), (suitable host microorganism selected) terminator sequence; (d1) hosts selected nucleotide sequence, or (d2) an origin of replication suitable in hosts selected to facilitate incorporation of the ds DNA into the genome of; (e1) optionally (auxotrophic) selection marker. 栄養要求性マーカーは、 栄養要求性マーカーのコード領域と欠陥プロモーターとからなり得る; (e2)場合によっては、選択される宿主での一前駆体形態のクチナーゼの成熟及び/又は分泌に関与するタンパク質をコードするds DNA配列。 Auxotrophic markers may consist with the coding region and the defect promoter auxotrophic marker; (e2) optionally, involved in the maturation and / or secretion of cutinase one precursor form of a host to be selected proteins ds DNA sequence encoding a. このようなrDNAベクターは更に、前述したようなポリヌクレオチドの上流及び/又は下流に、クチナーゼの機能発現を容易にする別の配列を有し得る。 Such rDNA vector further upstream and / or downstream of the polynucleotide as described above may have other sequences that facilitate expression of the function of cutinase. 栄養要求性マーカーは、栄養要求性マーカーのコード領域と、欠陥プロモーター領域とからなり得る。 Auxotrophic markers, and the coding region of the auxotrophic marker can consist of a defect promoter region. 本発明の他の実施態様は、前述の種々のクチナーゼ変異体の一種の発酵による産生である。 Another embodiment of the present invention is the production by fermentation of one of the various Cutinase variants described above. このような発酵は、通常のバッチ発酵であっても、フェドバッチ( fed-batch)発酵であっても、連続発酵であってもよい。 Such fermentation may be a conventional batch fermentation, even fed batch (fed-batch) fermentation, or may be a continuous fermentation. 使用すべき方法の選択は、宿主株や(公知の)好ましい下流処理(down stream processing)法に依存する。 The choice of method to be used depends upon the host strain and (known) preferably downstream processing (down, stream Processing) method. 従って、本発明は更に、本明細書に記載するようなクチナーゼ変異体の産生方法を提供し、本方法は、クチナーゼのアミノ酸配列に作用する少なくとも1 つの突然変異をもたらすrDNA技術により製造した遺伝子を含むrDNA改変微生物を発酵培養して、クチナーゼの活性を対応する親酵素と比べて改善し、微生物により産生されたクチナーゼを発酵ブロスと分離するか又は微生物細胞を発酵ブロスと分離することによりクチナーゼ変異体調製物を製造し、分離した細胞を破壊し、物理的又は化学的な濃縮又は精製法により前記ブロスから又は前記細胞からクチナーゼ変異体を濃縮又は部分精製する段階からなる。 Accordingly, the present invention further provides a method for producing the cutinase variants as described herein, the method, a gene produced by rDNA technique which provides at least one mutation affecting the amino acid sequence of cutinase by fermentation culture a rDNA modified microorganisms containing cutinase variant by improved compared to the parent corresponding enzyme activity of cutinase, separated from the or microbial cells fermentation broth separates the cutinase produced as fermentation broth by microorganisms manufactured preparations, to destroy the separated cells, comprising a physical or chemical concentration or cutinase variant from the broth or from said cells by purification methods the step of concentrating or partially purified. クチナーゼ変異体が微生物によって発酵ブロス内に分泌され、酵素が濾過又は遠心分離による細胞除去後にブロスから回収されるような条件を選択することが好ましい。 Cutinase variants are secreted into the fermentation broth by the microorganisms, it is preferable to select the conditions such that the enzyme is recovered from the broth after cell removal by filtration or centrifugation. 場合によっては、次いで、クチナーゼ変異体を所望の程度に濃縮、 精製することができる。 In some cases, then, it is possible to concentrate the cutinase variant to the extent desired, purified. これらの発酵法自体は微生物の特殊性を除けば、既知の発酵技術や、通常使用されている発酵/下流処理装置を基本とし得る。 In these fermentation processes themselves except particularity of microorganisms, known and fermentation techniques to the basic fermentation / downstream processing devices that are normally used. rDNA技術によりクチナーゼ変異体を産生し得る改変微生物の産生方法を更に本発明で提供する。 Further provided in the present invention the production method of the modified microorganism capable of producing cutinase variants by rDNA techniques. 本方法は、微生物内に導入されるクチナーゼ変異体をコードする遺伝子が5'末端で、宿主微生物のシグナル又は分泌配列として機能的な(改変)プレ配列をコードする遺伝子断片と融合することを特徴とする。 The method in gene 5 'end encoding a cutinase variant is introduced into the microorganism, wherein the fusing and functional (modified) gene fragment encoding the pre-sequence as a signal or secretion sequence of the host microorganism to. 本発明の別の態様では、クチナーゼ変異体遺伝子を含み、該遺伝子によってコードされるクチナーゼ変異体を産生し得るrDNA改変微生物を提供する。 In another aspect of the present invention, it comprises a cutinase variant gene, provides a rDNA modified microorganism capable of producing cutinase variants encoded by the gene. rDNA改変微生物では、天然クチナーゼをコードする遺伝子が元々存在するならば、これを除去(例えば他の構造遺伝子で置換)することが好ましい。 The rDNA modified microorganism, if the gene encoding the native cutinase originally present, it is preferred to remove this (e.g. substituted by other structural genes). 本発明の別の態様では、本発明のクチナーゼ変異体を含む酵素洗剤組成物を提供する。 In another aspect of the present invention, providing an enzyme detergent compositions comprising a cutinase variant of the invention. このような組成物は、クチナーゼ変異体及び通常洗剤系で使用されている他の成分(例えば洗剤組成物用添加剤、全配合洗剤及び例えばヨーロッパ特許出願公開第258 068号に記載されいている既知の種類の洗浄組成物の成分類)を組み合わせたものである。 Known Such compositions, other components (e.g., detergent compositions additives used in the cutinase variant and normal detergent systems, which have been described total formulation detergent and for example, in European Patent Application Publication No. 258 No. 068 is a combination of ingredients) of the type of cleaning composition. 特に、前記組成物は、5〜60重量%、好ましくは20〜50重量%の洗浄力ビルダーと、0 . In particular, the composition, 5 to 60 wt%, and preferably 20 to 50 wt% detergency builder, 0. 1〜50重量%の活性剤系とを含んでなり得る。 It may comprise from 1 to 50% by weight and a surfactant system. 活性剤系は、1種以上のアニオン界面活性剤を0〜95重量%、1種以上の非イオン界面活性剤を5〜100 重量%含んでなる。 Surfactant system is comprised of one or more of an anionic surfactant 0 to 95 wt%, it contains one or more nonionic surfactants from 5 to 100 wt%. このような洗剤組成物の他の成分は、例えば英国特許出願公開第1 372 034号(Unilever)、米国特許第3 950 277号、米国特許第4 011169号、ヨーロッパ特許出願公開第179 533号(Proct er & Gamble)、ヨーロッパ特許出願公開第205 208号及びヨーロッパ特許出願公開第206 390号(Unilever)、特開昭63− 078000号(1988)、1988年6月の調査レポート(Research Discl osure)29056号や、本明細書で引用した幾つかの明細書の各々に記載されているような多数の既知の種類のいずれであってもよい。 Other components of such detergent compositions, for example, British Patent Application Publication No. 1 372 No. 034 (Unilever), U.S. Pat. No. 3 950 277, U.S. Patent No. 4 011 169, EP 179 533 No. ( Proct er & Gamble), European Patent application Publication No. 205 208 and EP No. 206 390 (Unilever), JP-a-63- No. 078000 (1988), June survey report 1988 (research Discl osure) 29056 No. and may be any of a number of known types such as those described in each of several specification cited herein. 前記特許出願明細書は全て、参考として本明細書に組み入れる。 All the patent application is incorporated herein by reference. 本発明のクチナーゼ変異体は、任意の適切な形態で、即ち酵素の顆粒組成物、 溶液もしくはスラリーの形態で、又は担体材料(例えばヨーロッパ特許出願公開第258 068号に記載の材料や、Novo Nordisk製Savinase(登録商標)及びLipola se(登録商標))と共に洗剤組成物に有効に添加することができる。 Cutinase variant of the invention, in any suitable form, i.e. granular composition of the enzyme, in the form of a solution or slurry, or materials and according to the carrier material (e.g. European Patent Application Publication No. 258 No. 068, Novo Nordisk it can be effectively added to the detergent composition with manufacturing Savinase (TM) and Lipola se (TM)). クチナーゼ変異体の添加量は、洗剤組成物1g当たり例えば10〜20,00 0LU、好ましくは50〜2,000LUと広範囲で選択することができる。 Amount of cutinase variants detergent composition 1g per example 10~20,00 0lu, can preferably be selected in 50~2,000LU and extensive. 本明細書でのLU、即ちリパーゼ単位は、ヨーロッパ特許出願公開第258 06 8号(Novo Nordisk)で定義されている通りである。 LU, i.e., Lipase units in this specification are as defined in European Patent Application Publication No. 258 06 8 No. (Novo Nordisk). 更に存在し得る他の酵素の場合も同様の規定を準用する。 Furthermore it shall apply the same provisions in the case of other enzymes that may be present. ヨーロッパ特許出願公開第407 225号も参照されたい。 See also European Patent Application Publication No. 407 225. pIが10未満のプロテアーゼを選択し、このプロテアーゼをクチナーゼと共に前記洗剤組成物に存在させると有利であり得る。 pI selects less than 10 proteases, may be advantageous if the presence of the protease in the detergent composition with cutinase. ヨーロッパ特許出願公開第2 71 154号(Unilever)は、このようなプロテアーゼを多数記載している。 EP 2 71 154 No. (Unilever) describes a number of such proteases. クチナーゼ変異体と共に使用されるプロテアーゼは、場合によっては、 例えばBPN'型又は文献に開示されている多数の型のサブチリシンを包含し得る。 Protease used with cutinase variant may, in some cases, may include multiple types of subtilisin disclosed in example BPN 'type or literature. これらのうち数種は既に、例えばヨーロッパ特許出願公開第130 756号又はヨーロッパ特許出願公開第251 446号(共にGenentech);米国特許第4 760 025号(Genencor);ヨーロッパ特許出願公開第214 435号(Henkel);WO−A−87/04661号(Amg en);WO−A−87/05050(Genex);Thomas等(198 6/5)Nature 316,375−376及び(1987)J. The several of these already, for example, European Patent Application Publication No. 130 756) or (EP 251 446 No. (both Genentech); U.S. Pat. No. 4 760 025 (Genencor); European Patent Application Publication No. 214 435 No. (Henkel); WO-A-87/04661 No. (Amg en); WO-A-87/05050 (Genex); Thomas, etc. (198 6/5) Nature 316,375-376 and (1987) J. Mol. Mol. Biol. Biol. 193,803−813;Russel等(1987)Nature 328,496−500に記載の突然変異体プロテアーゼのように洗剤用途で提案されている。 193,803-813; Russel et al. (1987) suggested in detergent applications as mutant proteases according to Nature 328,496-500. 以下の実施例で本発明を更に詳しく説明する。 Further illustrate the present invention in the following examples. 核酸物質の遺伝子操作や分析で使用した全ての技術は、特に明記しない限り本質的にSambrook等(19 89)が記載した方法で実施した。 All of the techniques used in the genetic manipulation and analysis of nucleic acid materials were performed in a particularly methods stated non Unless essentially Sambrook et al. (19 89) is described. 添付図面の説明: 図1A: 合成Fusarium solani pisiクチナーゼ遺伝子のカセット1及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。 Description of the accompanying drawings: Figure 1A: Synthesis Fusarium solani pisi cutinase gene cassettes 1 and configuration nucleotide sequences of oligonucleotides. オリゴヌクレオチドトランジションをカセット配列に示す。 Oligonucleotide transitions are shown in the cassette sequence. 小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。 Lower case indicates the nucleotide position of the read outside the frame. 図1B: 合成Fusarium solani pisiクチナーゼ遺伝子のカセット2及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。 Figure 1B: Nucleotide sequence of the synthetic Fusarium solani pisi cutinase gene cassettes 2 and configured to oligonucleotides. オリゴヌクレオチドトランジションをカセット配列に示す。 Oligonucleotide transitions are shown in the cassette sequence. 図1C: 合成Fusarium solani pisiクチナーゼ遺伝子のカセット3及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。 Figure 1C: Synthesis Fusarium solani pisi cutinase gene cassettes 3 and nucleotide sequences of the oligonucleotides constituting. オリゴヌクレオチドトランジションをカセット配列に示す。 Oligonucleotide transitions are shown in the cassette sequence. 小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。 Lower case indicates the nucleotide position of the read outside the frame. 図1D: Fusarium solani pisiプレ−プロ−クチナーゼをコードする合成クチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。 Figure 1D: Fusarium solani pisi pre - pro - cutinase encoding synthetic cutinase gene nucleotide sequence. クチナーゼのプレ配列、プロ配列及び成熟配列を示す。 Presequence cutinase shows a prosequence and mature sequence. クローニングやオリゴヌクレオチドトランジションに使用する部位も示す。 Sites used for cloning and the oligonucleotide transitions are also shown. 小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。 Lower case indicates the nucleotide position of the read outside the frame. 図2: Fusarium solani pisiプロクチナーゼをコードする配列を、 E. Figure 2: the Fusarium solani pisi Purokuchinaze encoding sequence, E. coli phoAプレ配列の誘導体をコードする配列と連結するための合成DNA断片のヌクレオチド配列。 coli phoA nucleotide sequence of a synthetic DNA fragment for linking the derivative encoding sequence of the presequence. クローニングで使用する制限酵素部位やリボゾーム結合部位(RBS)を示す。 Restriction enzyme sites and ribosome binding site used in cloning showing a (RBS). コードされたphoAシグナル配列やクチナーゼ遺伝子の一部のアミノ酸配列も1文字コードで示す。 Part of the amino acid sequence of the encoded phoA signal sequence and the cutinase gene are also shown in single letter code. 図3: インベルターゼプレ配列及び成熟Fusarium solani p isiクチナーゼのコード配列の融合点をコードするカセット8、 Sac I− cl I断片のヌクレオチド配列。 Figure 3: Cassette 8 encoding a fusion point of invertase pre-sequence and mature Fusarium solani p isi cutinase coding sequence, the nucleotide sequence of the Sac I- B cl I fragment. 図4: pUR2740由来の0.2kb Sal I− Nru Iの欠失によって得られたプラスミドpUR2741は、pBR322の一部と、2μmプラスミドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母leu2D遺伝子と、酵母ga17プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領域と植物α−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合物とを含んでなるE. Figure 4: pUR2740 derived 0.2 kb Sal I- Nru plasmid pUR2741 obtained by deletion of the I is a portion of pBR322, and replication origin in yeast cells derived from the 2μm plasmid, the yeast leu2D gene, the yeast and a fusion with the yeast invertase signal sequence encoding region with a plant α- galactosidase gene under the control of ga17 promoter is comprised E. coli−S. coli-S. cerevisiaeシャトルベクターである。 is cerevisiae shuttle vector. 図5: プラスミドpUR7219は、pBR322の一部と、2μmプラスミドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母leu2D遺伝子と、酵母ga17プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領域と成熟Fusarium solani pisiクチナーゼをコードする領域との融合物とを含んでなるE. Figure 5: Plasmid pUR7219 is a part of pBR322, and replication origin in yeast cells derived from the 2μm plasmid, the yeast leu2D gene, mature yeast invertase signal sequence encoding region under the control of the yeast ga17 promoter Fusarium solani pisi comprising a fusion of a region encoding a cutinase E. coli−S. coli-S. cerevisiaeシャトルベクターである。 is cerevisiae shuttle vector. 図6: プラスミドpUR2740は、pBR322の一部と、2μmプラスミドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母leu2D遺伝子と、酵母ga17プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領域と植物α−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合物とを含んでなるE. Figure 6: Plasmid pUR2740 is a part of pBR322, and replication origin in yeast cells derived from the 2μm plasmid, the yeast leu2D gene, the yeast invertase signal sequence encoding region with a plant α- galactosidase under the control of the yeast ga17 promoter E. comprising a fusion with gene coli− S. coli- S. cerevisiaeシャトルベクターである。 is cerevisiae shuttle vector. 図7: exlAプレ配列及び成熟Fusarium solani pisiクチナーゼのコード配列の結合の型が異なるカセット5、6及び7のヌクレオチド配列。 Figure 7: ExlA presequence and mature Fusarium solani pisi cutinase type coupling different cassettes 5, 6 and 7 of the nucleotide sequence of the coding sequence of. 図8: Aspergillus niger変異株awamoriゲノムDN Aの5.3kb Sal I断片をpUC19のSal I部位に挿入して得られたプラスミドpAW14B。 Figure 8: Aspergillus niger mutant strains awamori genomic DN A of 5.3 kb Sal I fragment of plasmid pAW14B obtained by inserting a Sal I site of pUC19. 図9: pAW14BのexlA読み取り枠を含むBsp HI− Afl II断片を、 Fusarium solani pisiプレ−プロ−クチナーゼコード配列を含むBsp HI− Afl II断片で置換して得られたプラスミドpUR7 280。 Figure 9: a Bsp HI- Afl II fragment comprising the exlA open reading frame in pAW14B, Fusarium solani pisi pre - pro - cutinase coding comprises the sequence Bsp HI- Afl II fragment plasmid PUR7 280 obtained by substitution with. 従って、プラスミドpUR7280は、 A. Thus, plasmid pUR7280 is, A. niger変異株awam oriプロモータ及びターミネーターの制御下にあるFusarium sol ani pisiプレ−プロ−クチナーゼ遺伝子を含んでいる。 under the control of the niger variant Awam ori promoter and terminator Fusarium sol ani pisi pre - pro - contains cutinase gene. 図10: A. Figure 10: A. nidulans amdS及びA. nidulans amdS and A. niger変異株awam ori pyrGの両方の選択マーカーをpUR7280に導入して得られたプラスミドpUR7281 。 niger mutant awam ori pyrG both selection markers was obtained by introducing the pUR7280 plasmid PUR7281. 図11: Fusarium solani pisiクチナーゼ分子の概略図。 Figure 11: Fusarium solani pisi cutinase schematic diagram of the molecule. 図12: Fusarium solani pisiColletotri chum capsiciColletotrichum gloeospo riodes 、及びMagnaporthe grisea由来のクチナーゼの部分アミノ酸配列であって、残基の位置を3D構造で示す。 Figure 12: Fusarium solani pisi, Colletotri chum capsici, a partial amino acid sequence of the cutinase from Colletotrichum gloeospo riodes, and Magnaporthe grisea, showing the location of the residues in the 3D structure. 図13: Fusarium solani pisiクチナーゼ及びクチナーゼ変異体N172Kの洗濯中作用。 Figure 13: Fusarium solani pisi cutinase and Cutinase laundry during the action of the mutant N172K. 図14: Fusarium solani pisiクチナーゼ及びクチナーゼ変異体E201Kの洗濯中作用。 Figure 14: Fusarium solani pisi cutinase and Cutinase laundry during the action of the mutant E201K. 図15: Fusarium solani pisiクチナーゼ及びクチナーゼ変異体A85Fの洗濯中作用。 Figure 15: Fusarium solani pisi cutinase and Cutinase laundry during the action of the mutant A85F. 参考文献 Bibliography 実施例1 Fusarium solani pisiプレ−プロ−クチナーゼをコードする合成遺伝子の構築 本質的にヨーロッパ特許出願公開第407 225号(Unilever)に記載の方法に従って、 Fusarium solani pisiプレ−プロ− クチナーゼをコードする合成遺伝子を構築した。 According to the method described in the construction of a synthetic gene encoding cutinase essentially EP 407 225 No. (Unilever), Fusarium solani pisi pre - - Example 1 Fusarium solani pisi pre - pro pro - encoding cutinase synthesis It was constructed gene. 発表されているFusariu m solani pisi遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて(Solid ay等(1984)及びWO−A−90/09446号,Plant Gene tic Systems)、 Fusarium solani pisiプレ− プロ−クチナーゼポリペプチドをコードする領域を含む完全合成DNA断片を設計した。 Based on the nucleotide sequence of Fusariu m solani pisi gene has been published (Solid ay, etc. (1984) and WO-A-90/09446 JP, Plant Gene tic Systems), Fusarium solani pisi pre - pro - encoding cutinase polypeptide the fully synthetic DNA fragment containing a region designed. この合成クチナーゼ遺伝子は、元のFusarium solani pisi遺伝子のヌクレオチド配列に比べて幾つかのヌクレオチド変化を含み、 これにより制限酵素認識部位が、コードされたアミノ酸配列に影響することなく遺伝子内の好都合な位置に導入されている。 This synthetic cutinase gene comprises several nucleotide changes compared to the nucleotide sequence of the original Fusarium solani pisi gene, convenient location within the gene without thereby restriction enzyme recognition sites, affect the encoded amino acid sequence It has been introduced to. 全合成クチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図1Dに示す。 The nucleotide sequence of the entire synthetic cutinase gene is shown in Figure 1D. 合成DNAオリゴヌクレオチドから開始する3個の異なるカセットを集合させて合成クチナーゼ遺伝子を構築した。 Synthetic DNA is set to three different cassettes starting from oligonucleotides were constructed synthetic cutinase gene. 各合成DNAカセットは、最初にEco RI部位を、最後にHin dIII部位を備えている。 Each synthetic DNA cassette, the first Eco RI site, and a last Hin dIII site. Ap plied Biosystems 380A DNA合成機を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。 The oligonucleotides were synthesized using Ap plied Biosystems 380A DNA synthesizer and purified by polyacrylamide gel electrophoresis. 各カセットを構築するため、以下に示す手順を用いた。 To construct each cassette, with the following procedures. 所定のカセットを構成する等モル量(50pmol)のオリゴヌクレオチドを標準的な技術に従って混合し、5'末端でリン酸化し、アニールし、結合した。 Equimolar amounts constituting the predetermined cassette oligonucleotide (50 pmol) were mixed according to standard techniques, and phosphorylated at the 5 'end, were annealed and ligated. 得られた二本鎖DNA分子の混合物をEco RI及びHin dIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動でサイズ分画し、電気溶出でゲルから回収した。 The resulting mixture of double-stranded DNA molecules was cut with Eco RI and Hin dIII, size fractionated by agarose gel electrophoresis and recovered from the gel by electroelution. 得られた合成DNAカセットをpUC9の2 . 2 of the resulting synthetic DNA cassette pUC9. 7kb Eco RI− Hin dIII断片と結合し、 Escherichia coliに形質転換した。 Combined with 7 kb Eco RI-Hin dIII fragment, and transformed into Escherichia coli. 適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて幾つかのクローンのEco RI− Hin dIIIインサートを両方向で完全に配列決定し、合成カセットの配列を確定した。 Completely sequenced Eco RI-Hin dIII insert of several clones in both directions using suitable oligonucleotide primers to determine the sequence of the synthetic cassettes. この手順を用いて、pUR7207(カセット1を含む、図1A)、pUR7208(カセット2を含む、図1B)及びpUR7209(カセット3を含む、図1C)を構築した。 Using this procedure, PUR7207 (including cassette 1, Fig. 1A), (including cassette 2, Fig. 1B) pUR7208 (including cassette 3, Fig. 1C) and pUR7209 were constructed. 最後に、pUR7207の2.9kb Eco RI− Apa I断片をpUR7208の0.2kb Apa I− Nhe I断片及びpUR72 09の0.3kb Nhe I− Hin dIII断片と結合させて、合成クチナーゼ遺伝子を作成し、pUR7210を得た。 Finally, by combining the 2.9kb Eco RI- Apa I fragment of pUR7207 with the 0.2 kb Apa I- Nhe I fragment and PUR72 09 of 0.3 kb Nhe I- Hin dIII fragment of PUR7208, creating a synthetic cutinase gene to obtain a pUR7210. このプラスミドは、 Fusariu m solani pisiの完全プレ−プロ−クチナーゼをコードする読み取り枠を含んでいる(図1D)。 This plasmid, full Pres Fusariu m solani pisi - Pro - contains an open reading frame encoding a cutinase (Figure 1D). 実施例2 Escherichia coliでのFusarium solani pi si (プロ)クチナーゼの発現 合成クチナーゼ遺伝子を用いて、WO−A−90/09446号(Plant Genetic Systems)に記載のものと機能的に同様のE. Using expression synthetic cutinase gene for Fusarium solani pi si (pro) cutinase in Example 2 Escherichia coli, WO-A- 90/09446 No. (Plant Genetic Systems) as described in the functionally similar E. col 用発現ベクターを構築した。 It was constructed col i for expression vector. Fusarium solani pisiプロクチナーゼをコードする合成遺伝子の部分の前に、適切なE. Fusarium solani pisi Purokuchinaze the front part of the synthetic gene encoding an appropriate E. coli発現シグナル、即ち(i)誘導性プロモーター、(ii)リボソーム結合部位、及び(iii )翻訳開始コドンを提供し、またプロクチナーゼの細胞質膜からの送出に必要な情報を提供するシグナル配列が位置する構築物を設計した。 coli expression signals, i.e. (i) an inducible promoter, (ii) a ribosome binding site, and (iii) provides a translation initiation codon, also signal sequence position to provide the necessary information to delivery from the cell membrane Purokuchinaze constructs were designed to be. E. E. coli phoAシグナル配列の誘導体(Michaelis等、19 83)を合成クチナーゼ遺伝子のプロ配列と融合するための合成リンカーを設計した(図2参照)。 coli phoA derivative signal sequences (Michaelis like, 19 83) were designed synthetic cutinase gene synthesis linkers for fusing the pro sequence (see Figure 2). シグナルペプチドの開裂やプロクチナーゼの分泌を最適化するため、このリンカーのヌクレオチド配列は、phoAシグナル配列の3個のC 末端アミノ酸残基(Thr−Lys−Ala)をAla−Asn−Alaに変換し、クチナーゼプロ配列のN末端アミノ酸残基(Leu1、図1D参照)をAl aに変換するようなものであった。 To optimize secretion of cleavage and Purokuchinaze of the signal peptide, nucleotide sequence of this linker converts three C-terminal amino acid residue of the phoA signal sequence (Thr-Lys-Ala) to Ala-Asn-Ala , N-terminal amino acid residue of Kuchinazepuro sequence (leu1, see FIG. 1D) and were as converted into Al a. この構築により、クチナーゼのペリプラスム間隙内への分泌は確実である(WO−A−90/09446号参照、Plant Genetic Systems)。 This construction, secretion into the periplasmic space in cutinase is certain (see No. WO-A-90/09446, Plant Genetic Systems). このような構築物を得るため、クチナーゼプレ配列とプロ配列の一部を含む6 9bp Eco RI− Spe I断片をpUR7210から取り出し、 E. To obtain such a construct, removed 6 9bp Eco RI- Spe I fragment containing a portion of Kuchinazepure sequence and prosequence from PUR7210, E. col phoAプレ配列の誘導体及びクチナーゼプロ配列の改変N末端アミノ酸残基を提供する合成DNAリンカー配列( Eco RI− Spe I断片)で置換した(図2)。 It was replaced with col i phoA modified N-terminal amino acid residue to provide a synthetic DNA linker sequence derivatives and Kuchinazepuro sequence of the presequence (Eco RI-Spe I fragment) (FIG. 2). 得られたプラスミドをpUR7250と名付け、これを使用して、リボソーム結合部位及びphoAシグナル配列コード領域に融合したプロクチナーゼコード領域を含む0.7kb Bam HI− Hin dIII断片を単離した。 The resulting plasmid named the PUR7250, using this, the 0.7 kb Bam HI- Hin dIII fragment containing the pro-cutinase coding region fused to the ribosome binding site and phoA signal sequence encoding region was isolated. この断片をpMMB67EHの8.9kb Bam HI− Hin dIII断片(Fu rste等、1986)と結合して、pUR7220を得た。 This fragment 8.9 kb Bam HI- Hin dIII fragment of pMMB67EH (Fu RSTE etc., 1986) combine with, to give a PUR7220. このプラスミドでは、プロクチナーゼをコードする合成遺伝子をphoAシグナル配列の変種と融合して、誘導性tacプロモーターの制御下に置く。 In this plasmid, the synthetic gene encoding Purokuchinaze fused to variants of the phoA signal sequence and placed under the control of an inducible tac promoter. pUR7220を含むE. E. including pUR7220 coli株WK6を、 0.017M KH 2 PO 4 0.017M K 2 HPO 4 12g/l バクト−トリプトン24g/l バクト−酵母抽出物0.4%グリセロール(v/v) からなる0.5リットルのIXTB培地(Tartof及びHobbs,198 8)を含む2リットルの振盪フラスコで増殖させた。 E. coli strain WK6, 0.017M KH 2 PO 4 0.017M K 2 HPO 4 12g / l Bacto - 0.5 liter consisting yeast extract 0.4% glycerol (v / v) - tryptone 24 g / l Bacto IXTB medium (Tartof and Hobbs, 198 8) was grown in 2 liter shake flasks containing. 培養物を強く振盪しながら(150rpm)、100μg/mlのアンピシリンの存在下、25°C〜30℃で一晩増殖させた。 With shaking strongly culture (150 rpm), the presence of 100 [mu] g / ml ampicillin and grown overnight at 25 ° C~30 ℃. 610nmでのODは10〜 12であった。 OD at 610nm was 10-12. 次いで、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を添加して、最終濃度を10μMとし、更に12〜16時間インキュベーションを継続した。 Then added IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) to a final concentration of 10 [mu] M, was further continued for 12 to 16 hours incubation. 培養物から取り出した試料の分析判定で、生じた脂肪分解活性の量に更なる顕著な増加が観察できなかったときには、細胞を遠心分離で収集し、最初の培養容量の20%スクロース含有緩衝液に0℃で再度懸濁させた。 Analysis determined was taken out from the culture sample, when a further significant increase in the amount of the resulting lipolytic activity could be observed, the cells were collected by centrifugation, buffer containing 20% ​​sucrose of the original culture volume and resuspended at 0 ℃ to. 細胞を遠心分離で収集し、最初の培養容量の氷冷水に再度懸濁させると、浸透圧ショックで細胞が溶解した。 Cells were collected by centrifugation and is resuspended in ice-cold water first culture volume, cells were lysed in osmotic shock. 細胞破片を遠心分離で除去し、無細胞抽出物に酢酸を添加してpH4 . Cell debris was removed by centrifugation, pH 4 by adding acetic acid to the cell-free extract. 8に酸性化し、4℃で一晩放置し、得られた沈殿物を除去した。 8 acidified, and left to stand overnight at 4 ° C., to remove the resulting precipitate. この段階で、 無細胞抽出物の超濾過/凍結乾燥により、殆ど内在性リパーゼを含まない純度7 5%以上のクチナーゼ調製物が得られた。 At this stage, the ultrafiltration / lyophilization of cell-free extract, most endogenous lipase cutinase preparation with a purity 7 more than 5% free was obtained. あるいは、SP−sephadex上に酸性化無細胞抽出物を負荷し、酵素をpH8.0の緩衝液で溶出し、濃アルカリ性溶液を適量のDEAE−cellulose(Whatman DE−52 )に通し、DEAE通過液を直接Q−sepharose HP(Pharma cia)カラムに通すことによって、クチナーゼを均質になるまで精製(純度9 5%以上)することができる。 Alternatively, loaded with acidified cell free extract onto SP-sephadex, the enzyme was eluted with a buffer of pH 8.0, through a concentrated alkaline solution in an appropriate amount of DEAE-cellulose (Whatman DE-52), DEAE effluent directly by passing through a Q-sepharose HP (Pharma cia) column can be purified to homogeneity cutinase (purity 95% or higher). 塩勾配で溶出すると、典型的には75%以上の総収率で、均一なクチナーゼ調製物が得られた。 Elution with a salt gradient, typically at a total yield of 75% or more, homogeneous cutinase preparation was obtained. 実施例3 Fusarium solani pisiクチナーゼの変異体をコードする遺伝子の構築 実施例1に記載のFusarium solani pisiプレ−プロ−クチナーゼの合成遺伝子を使用して、コード化したアミノ酸配列に変化を含む変異体遺伝子を構築した。 Example 3 Fusarium solani pisi cutinase Fusarium solani pisi pre-described construction Example 1 of the gene encoding a variant of - pro - using the synthetic genes of the cutinase variant gene comprising a change in the encoded amino acid sequence It was constructed. この構築では、完全合成クチナーゼ遺伝子を構成する3個のカセットの構築について実施例1で説明したのと本質的に同じ方法を適用した。 In this construct, it was applied essentially the same method as described in Example 1 for the construction of the three cassettes constituting the complete synthetic cutinase gene. 例えば、突然変異を起こすべき位置、即ちAsn 172のコード化トリプレットをカバーする2個のオリゴを除いて、実施例1に記載したのと同じオリゴヌクレオチドを用いて新種のカセット3を作成して、 Fusarium sola ni pisiクチナーゼ変異体N172Kをコードする遺伝子を構築した。 For example, the position should mutate, i.e. with the exception of the two oligos which cover the coding triplet Asn 172, to create a new type of cassette 3 using the same oligonucleotides as described in Example 1, It was constructed a gene encoding a Fusarium sola ni pisi cutinase variant N172K. 代わりには、2個の新しい合成オリゴを使用した。 The place was used two new synthetic oligonucleotides. これらのオリゴは、変異体配列を含んでいるが、これ以外は置換前のオリゴと同一である。 These oligonucleotides, which contain variant sequences, other is identical to the oligo before replacement. 特に、CUTI3D MH及びCUTI3K MHの代わりにそれぞれCUTI3D M H変異体(AATの代わりにAAGを含む)及びCUTI3K MH変異体(A TTの代わりにCTTを含む)を取り込んで、変異N172Kを含む新しいカセット3を作成した(図1C参照)。 In particular, capture each CUTI3D M H variants instead of CUTI3D MH and CUTI3K MH (containing AAG instead of AAT) and CUTI3K MH mutant (containing CTT instead of A TT), a new cassette containing a mutation N172K 3 was created (see Figure 1C). 本質的に実施例1に記載した方法で新しいカセット3をクローニングして配列決定し、変異を含む0.3kb Nhe I− in dIII DNA断片をpUR7210の対応断片と置換してpUR725 7(N172K)を得た。 Essentially the new cassette 3 was then sequenced cloned by the method described in Example 1, 0.3kb Nhe I- H in dIII DNA fragment was replaced with the corresponding fragment of pUR7210 the PUR725 7 containing the mutation (N172K) It was obtained. このプラスミドに由来する0.6kb Spe I− in dIII断片を使用して、pUR7220の対応断片を置換し、 E. Use 0.6kb Spe I- H in dIII fragment derived from the plasmid, replacing the corresponding fragment of pUR7220, E. col 発現プラスミドpUR7224(N172K)を得た。 col i was obtained expression plasmid pUR7224 the (N172K). このE. The E. coli発現プラスミドをE. E. coli expression plasmid E. coli株WK6に形質転換した。 It was transformed into E. coli strain WK6. 形質転換細胞を実施例2に記載した方法で増殖させ、変異体プロクチナーゼ酵素を本質的に実施例2に記載した方法で回収し、精製した。 The transformed cells were grown in the manner described in Example 2, was recovered by the method essentially as described in Example 2 of mutant Purokuchinaze enzymes and purified. CUTI3F MH及びCUTI3M MH(図1C参照)の代わりにそれぞれCUTI3F MH変異体(GAGの代わりにAAGを含む)及びCUTI3 M MH変異体(CTCの代わりにCTTを含む)を取り込む新種のカセット3 を作成することにより、 Fusarium so lani pisiクチナーゼ変異体E201Kをコードする遺伝子を同様に構築した。 Create new cassette 3 incorporating respective CUTI3F MH variants (instead including AAG of GAG) and CUTI3 M MH variants (including CTT instead of CTC) instead of CUTI3F MH and CUTI3M MH (see Fig. 1C) by was constructed similarly a gene encoding a Fusarium so lani pisi cutinase variant E201K. CUTI2C MH及びCUTI2I MH(図1B参照)の代わりにそれぞれCUTI2C MH変異体(GCTの代わりにTTCを含む)及びCUTI2 I MH変異体(AGCの代わりにGAAを含む)を取り込む新種のカセット2 を作成することにより、 Fusarium solani pisiクチナーゼ変異体A85Fをコードする遺伝子を同様に構築した。 Create new cassette 2 incorporating each CUTI2C MH variants (including TTC instead of GCT) and CUTI2 I MH variants (including GAA instead of AGC) instead of CUTI2C MH and CUTI2I MH (see FIG. 1B) by was constructed similarly a gene encoding a Fusarium solani pisi cutinase variant A85F. 実施例4 Saccharomyces cerevisiaeでのFusarium s olani pisiクチナーゼの発現Saccharomyces cerevisiaeでのFusarium solani pisiクチナーゼ合成遺伝子の発現のために、成熟クチナーゼをコードする合成遺伝子の前に、 S. For expression of Fusarium solani pisi cutinase synthetic gene in Fusarium s olani pisi cutinase expression Saccharomyces cerevisiae in Example 4 Saccharomyces cerevisiae, before the synthetic gene encoding the mature cutinase, S. cerevisiaeインベルターゼのプレ配列(Taussig及びCarlsson,1983)及び強い誘導性ga l7プロモーター(Nogi及びFukasawa,1983)が存在する発現ベクターを構築した。 presequence cerevisiae invertase (Taussig and Carlsson, 1983) and strong inducible ga l7 promoter (Nogi and Fukasawa, 1983) is to construct an expression vector that exists. このような融合のための合成クチナーゼ遺伝子を産生するため、インベルターゼプレ配列のコード配列を、成熟クチナーゼのN末端のコード配列と融合するアダプター断片を合成した。 To produce the synthetic cutinase gene for such fusions, the coding sequence of the invertase pre-sequence were synthesized adapter fragment fused to the coding sequence of the N-terminus of the mature cutinases. この断片を、本質的に実施例1に記載したようなpUC9のEco RI− Hin dIIIカセットとして作成して(カセット8、図3参照)、pUR7217を得た。 This fragment was created as pUC9 of Eco RI-Hin dIII cassette such as essentially as described in Example 1 (cassette 8, see FIG. 3), to obtain a PUR7217. プラスミドpUR7210及びpUR7217をE. Plasmid pUR7210 and pUR7217 the E. coli JM110(damメチラーゼ活性の欠失した株)に形質転換し、pUR7217の2.8kb Bcl I− Hin dIII断片をpUR7210の0.6kb Bcl I− Hin dIII断片に連結することにより、成熟クチナーゼポリペプチドのコード化ヌクレオチド配列がS. coli JM110 was transformed into (strain lacking the dam methylase activity), by ligating the 2.8 kb Bcl I- Hin dIII fragment of pUR7217 to the 0.6 kb Bcl I- Hin dIII fragment of PUR7210, mature cutinase polypeptide S. coding nucleotide sequences ce revisiaeインベルターゼプレ配列コード領域の一部と融合したpUR7 218を得た。 was obtained ce Revisiae invertase pre-sequence coding PUR7 218 fused to part of the area. pUR2740の8.9kb Nru I− Sal I断片を単離し、 Sal I突出末端をクレノーポリメラーゼで充填し(fill in)、断片を再度円形にして(r ecircularization)、pUR2740(Verbakel,1991,図6参照)から発現ベクターpUR2741(図4参照) を誘導した。 The 8.9 kb Nru I- Sal I fragment PUR2740 isolated, Sal the I protruding ends were filled in with Klenow polymerase (fill in), fragments again in a circle a (r ecircularization), pUR2740 (Verbakel , 1991, 6 to induce expression vector PUR2741 (see FIG. 4) from the reference). pUR2741の7.3kb Sac I− Hin dIII断片をp UR7218の0.7kb Sac I− Hin dIII断片と連結し、pUR7 219を得た(図5参照)。 The 7.3 kb Sac I- Hin dIII fragment of pUR2741 was ligated with 0.7 kb Sac I- Hin dIII fragment of p UR7218, was obtained pUR7 219 (see FIG. 5). 場合によって、 S. In some cases, S. cerevisiae poI IIターミネーターをクチナーゼ遺伝子の後ろのHin dIII部位に置くことができるが、これはクチナーゼ遺伝子の効果的な発現には重要ではないことが判明した。 The cerevisiae POI II terminator can be placed in the Hin dIII site after the cutinase gene, which proved to be not critical to the efficient expression of cutinase gene. E. E. coli−S. coli-S. cerevisiaeシャトルプラスミドpUR7 219は、2μプラスミドを保有するS. cerevisiae shuttle plasmid PUR7 219 is, S. carrying 2μ plasmid cerevisiae株(cir +株)の複製起点と、 S. and the origin of replication cerevisiae strain (cir + strains), S. cerevisiae leu2 -株での高コピー数形質転換細胞の選択を可能とするプロモーター欠失種のS. cerevisiae leu2 - promoter deletion species to allow for the selection of high copy number transformants in strain S. cerevisiae Leu2遺伝子と、強い誘導性S. cerevisiae Leu2 gene and, strong-induced S. cerevisiae gal7プロモーターの制御下にあってS. There under the control of cerevisiae gal7 promoter S. cerevisiaeインベルターゼプレ配列に操作的に結合したFusarium solani pisiクチナーゼの成熟部分をコードする合成遺伝子とを含んでいる。 and a synthetic gene encoding the mature part of Fusarium solani pisi cutinase linked operatively to cerevisiae invertase pre-sequence. 酵母細胞の電気穿孔法の標準的なプロトコルを用いて、株YT6−2−lL( Erhart及びHollenbe rg,1981)と同一のS. Using standard protocols electroporation of yeast cells, strain YT6-2-lL (Erhart and Hollenbe rg, 1981) and the same S. cerevisiae株SU50(a,cir 0 ,leu2,his4,can1)を、2μのS. cerevisiae strain SU50 (a, cir 0, leu2 , his4, can1) a, 2μ of S. cerevisiaeプラスミドとpUR7219との等モル混合物で同時形質転換した。 It was co-transformed with an equimolar mixture of cerevisiae plasmid and pUR7219. ロイシン原栄養性について形質転換細胞を選択し、幾つかの形質転換細胞から全DNAを単離した。 For leucine prototrophic select transformed cells were isolated total DNA from several transformants. 全ての形質転換細胞は、2μプラスミド及びpUR7219の両方を含むように思え、このことは、pUR7219上に含まれるプロモーター欠失種のleu 2遺伝子が、2μ酵母プラスミドと共存するために高いコピー数で存在すると、 leu2欠失株を単に機能的に補い得ることを示している。 All transformed cells, seems to include both 2μ plasmid and PUR7219, this is, the promoter deletion species leu 2 gene contained on PUR7219 is at a high copy number in order to coexist with 2μ yeast plasmid When present, it indicates that may compensate only functionally the leu2 deficient strain. 完全培地で40世代以上培養し、次いで固形の選択及び完全培地でレプリカ平板培養して1個の形質転換細胞をpUR7219について処理(cure)し、 S. And cultured 40 generations or more in complete medium, then solid selection and one transformed cells by replica plating cultured in complete medium and treated (cure) for PUR7219, S. cerevisiae株SU51(a,cir + ,leu2,his4,can1)を得た。 cerevisiae strain SU51 (a, cir +, leu2 , his4, can1) was obtained. pUR7 219を保有するS. pUR7 219 held by the S. cerevisiae株SU51を、 −アミノ酸を含まない酵母窒素塩基(YNB) 6.7g/l -ヒスチジン 20mg/l -グルコース 20g/l からなる0.2リットルのMM培地を含む1リットルの振盪フラスコ内で増殖させた。 S. cerevisiae strain SU51, - grown in 1 liter shake flasks containing MM medium 0.2 liters consisting of glucose 20 g / l - yeast nitrogen base (YNB) 6.7g / l without amino acids - histidine 20 mg / l It was. 培養物を強く振盪(150rpm)しながら30℃で一晩増殖させた。 And grown overnight at 30 ° C. with culture strongly shaking (150 rpm). 6 10nmでのODは2〜4であった。 OD at 6 10nm was 2-4. 細胞を遠心分離により収集し、2リットルの振盪フラスコ内で、 −酵母抽出物 10g/1 −バクトペプトン 20g/1 −ガラクトース 50g/1 からなる1リットルのYPGAL培地に再度懸濁させ、更に12〜16時間インキュベーションを継続した。 Cells were collected by centrifugation, in shake flasks 2 liter, - yeast extract 10 g / 1 - bacto peptone 20 g / 1 - resuspended in YPGAL medium 1 liter made of galactose 50 g / 1, further 12 16 hours incubation was continued. 一定の間隔で、試料を培養物から取り出し、遠心分離にかけてバイオマスを除去した。 At regular intervals, samples were removed from the culture were removed biomass centrifuged. オリーブ油を基質として用い、上清のクチナーゼ活性を滴定法で分析した。 Using olive oil as substrate was analyzed cutinase activity of the supernatant titrimetrically. 各試料に対し、5.0mlのリパーゼ基質(Si gma、リパーゼの基質としてオリーブ油を含む)と25.0mlの緩衝液(5 mMトリス−HCl pH9.0,40mM NaCl,20mM CaCl 2 )の撹拌混合物に100〜200μlの濾液を添加した。 For each sample, 5.0 ml lipase substrate (Si gma, as substrate containing olive oil lipase) and 25.0ml of buffer (5 mM Tris -HCl pH9.0,40mM NaCl, 20mM CaCl 2) a stirred mixture of It was added to the filtrate of 100~200μl to. 30℃でアッセイを実施し、Mettler DL25滴定装置を用い、0.05M NaOHによるpH9.0までの自動滴定により脂肪酸の放出を測定した。 Assays were performed at 30 ° C., using a Mettler DL25 titrator, release was measured fatty Automatic titration to pH9.0 by 0.05 M NaOH. 滴定液量対時間の曲線が得られた。 Titrant volume versus time curve was obtained. 試料中に含まれるリパーゼ活性の量を、 この曲線の最大勾配から計算した。 The amount of lipase activity contained in the sample was calculated from the maximum slope of this curve. 1酵素活性単位は、前述の条件下で、1分間でオリーブ油から1μmolの脂肪酸を放出させる酵素の量として定義する。 1 enzymatic activity unit, under the conditions described above, is defined as the amount of enzyme which releases fatty acids 1μmol from olive oil in one minute. このような測定法は、当業者には公知である。 Such assays are well known to those skilled in the art. クチナーゼ活性の発生量が増加しなくなると、細胞を遠心分離にかけて除去し、無細胞抽出物に酢酸を加えてpH4.8に酸性化して、クチナーゼを実施例1 に記載した方法で回収した。 When the generation amount of cutinase activity no longer increases, the cells were removed by centrifugation, pH 4.8 and acidified to the addition of acetic acid to the cell-free extract, was recovered by the method described cutinase in Example 1. 実施例5 S. EXAMPLE 5 S. cerevisiaeでのFusarium solani pisiクチナーゼの変異体の発現Fusarium solani pisiクチナーゼの変異体N176Kを以下の方法でS. S. In Fusarium solani pisi expression of cutinase variants Fusarium solani pisi cutinase following method variant N176K of at cerevisiae cerevisiaeで発現させた。 It was expressed in cerevisiae. pUR7257(N17 2K)の0.5kb Apa I− Hin dIII断片を使用してpUR7218 の類似断片を置換し、変異を含む遺伝子がS. pUR7257 by replacing the similar fragment pUR7218 using 0.5kb Apa I- Hin dIII fragment (N17 2K), a gene containing a mutation is S. cerevisiaeシグナル配列をコードする配列に操作的に融合したpUR7228(N172K)を得た。 cerevisiae signal sequence to the sequence encoding obtain operatively fused pUR7228 the (N172K). pUR2741の7.0kb Sac I− Hin dIII断片を、pUR7228(N172K)の0.7kb Sac I− Hin dIII断片に連結して、pUR7234(N172K)を得た。 The 7.0 kb Sac I- Hin dIII fragment of pUR2741, linked to 0.7kb Sac I- Hin dIII fragment of pUR7228 (N172K), to obtain a pUR7234 (N172K). このプラスミドをS. This plasmid S. erevisiae株SU51に形質転換した。 It was transformed into c erevisiae strain SU51. 得られた形質転換細胞を実施例4に記載した方法でインキュベートし、産生した変異体酵素を実施例4及び1に記載した方法で培養ブロスから回収した。 Transformed cells obtained were incubated with the method described in Example 4, were recovered from the culture broth by the method described mutant enzyme produced in Examples 4 and 1. Fusarium solani pisiクチナーゼの変異体E201Kを、実施例3に記載したように、クチナーゼ変異体E201KをコードするFus arium solani pisiクチナーゼ遺伝子の変異体を用いてS. Fusarium solani mutant E201K of pisi cutinase, as described in Example 3, S. using variants of Fus Arium solani pisi cutinase gene coding for the cutinase variant E201K erevisiaeで同様に産生した。 It was produced similarly c cerevisiae. Fusarium solani pisiクチナーゼの変異体A85Fを、 実施例3に記載したように、クチナーゼ変異体A85FをコードするFusar ium solani pisiクチナーゼ遺伝子の変異体を用いてS. Fusarium solani variants A85F of pisi cutinase, as described in Example 3, S. using variants of Fusar ium solani pisi cutinase gene coding for the cutinase variant A85F cer evisiaeで同様に産生した。 It was produced in the same manner in cer evisiae. 実施例6 AspergilliでのFusarium solani pisiクチナーゼの発現Aspergillus niger変異株awamoriでの合成Fusa rium solani pisiクチナーゼ遺伝子の発現のために、 Fusa rium solani pisiプレ−プロ−クチナーゼをコードする合成遺伝子をA. For expression of the synthetic Fusa rium solani pisi cutinase gene in expression Aspergillus niger mutant strains awamori of Fusarium solani pisi cutinase in Example 6 Aspergilli, Fusa rium solani pisi pre - pro - cutinase A. The synthetic gene encoding the niger変異株awamoriの強い誘導性exlAプロモーター(Maat等,1992,de Graaff等1992)の制御下に置いた発現ベクターを構築した。 niger mutant strains strongly inducible with awamori ExlA promoter (Maat etc., etc. 1992 1992, de Graaff) to construct an expression vector and placed under control of. プラスミドpAW14Bからプレ−プロ−クチナーゼ発現プラスミド(pUR 7280)を構築した。 Pre from the plasmid PAW14B - Pro - it was constructed cutinase expression plasmid (pUR 7280). 前記pAW14Bは、1990年5月31日にCBS2 37.90の番号でCentraalbureau voor Schimme lcultures,Baarn,The NetherlandsにE. Said pAW14B is a CBS2 37.90 number of on May 31, 1990 Centraalbureau voor Schimme lcultures, Baarn, E. in The Netherlands co li株JM109で寄託されたものであり、0.7kbのエンドキシラナーゼII (exlA)遺伝子が2.5kbの5'フランキング配列及び2.0kbの3' フランキング配列と共に存在する約5.3kbのSal I断片を含んでいる(図8)。 has been deposited with co li strain JM109, about endoxylanase II (exlA) gene of 0.7kb is present with 5 'flanking sequence and 2.0kb of 3' flanking sequence of the 2.5 kb 5.3 kb It contains a Sal I fragment (Figure 8). pAW14Bで、exlAコード化領域をプレ−プロ−クチナーゼコード化領域で置換した。 In PAW14B, the exlA coding region pre - pro - was replaced by the cutinase coding region. exlA遺伝子の開始コドン(A TG)を含むBsp HI部位(5'−TCATGA−3')及びexlA遺伝子の終結コドン(TAA)を含むAfl II部位(5'−CTTAAG−3')は、pUR7280の構築を容易にした。 Bsp HI site comprising the exlA gene initiation codon (A TG) (5'-TCATGA -3 ') and exlA gene Afl II site including termination codon (TAA) of (5'-CTTAAG-3') is of pUR7280 It was to facilitate construction. 以下の方法で構築した:pAW14B(7.9kb)をBsp HIで部分的に切断し、線状化プラスミド(7.9kb)をアガロースゲルから単離した。 Was constructed in the following way: PAW14B a (7.9 kb) was partially digested with Bsp HI, isolated linearized plasmid (7.9 kb) from an agarose gel. その後、単離した7.9kb断片を、問題のBsp HI部位の数ヌクレオチド下流で切断するBsm Iで切断して、他のBsp HI部位で線状化したプラスミドを除去した。 Thereafter, a 7.9kb fragment isolated and cut with Bsm I which cuts a few nucleotides downstream of the Bsp HI site in question, to remove the linearized plasmid by other Bsp HI sites. 断片をアガロースゲルで分離し、7.9kb Bsp HI− Bsm I断片を単離した。 The fragments were separated on agarose gel to isolate the 7.9 kb Bsp HI- Bsm I fragment. これをAfl IIで部分的に切断し、得られた7.2kb Bs HI− Afl II断片を単離した。 This was partially cut with Afl II, a 7.2kb Bs p HI- Afl II fragment obtained was isolated. Fusarium solani pisiプレ−プロ−クチナーゼをコードする全読み取り枠を含むpUR7210の0.7kb Bsp HI− Afl II 断片を、pAW14Bの7.2kb Bsp HI− Afl II断片と連結して、 pUR7280を得た。 Fusarium solani pisi pre - pro - the 0.7 kb Bsp HI- Afl II fragment of pUR7210 comprising the entire open reading frame encoding a cutinase was ligated with the 7.2 kb Bsp HI- Afl II fragment of PAW14B, was obtained PUR7280. その後、構築したベクター(pUR7280)を従来の同時形質転換技術によりカビ(例えばAspergillus niger sp ergillus niger変異株awamori等)に移植することができ、次いでプレ−プロ−クチナーゼ遺伝子をエンドキシラナーゼIIプロモーターの誘導により発現させることができる。 Thereafter, molds (e.g. Aspergillus niger, A sp ergillus niger mutant awamori, etc.) The constructed vector (PUR7280) by conventional co-transformation techniques can be ported to, then the pre - pro - cutinase gene endoxylanase II promoter it can be expressed by the induction of. 構築したrDNAベクターは更に、従来の選択マーカー(例えばamdS又はpyrG、ヒグロマイシン等)を備えていてもよく、またカビを得られたrDNAベクターで形質転換して、所望のタンパク質を産生してもよい。 rDNA vectors constructed further conventional selection markers (e.g. amdS or pyrG, hygromycin etc.) may be provided with a, also was transformed with the rDNA vector obtained mold may produce the desired protein . 一例としては、amdS及びpyrG選択マーカーを発現ベクターに導入してpUR7281(図10)を産生した。 As an example, it produced PUR7281 (Figure 10) was introduced into an expression vector the amdS and pyrG selection markers. このため、合成オリゴヌクレオチド(5'−AATTGCGGCCGC−3')を用いて(プレ−プロ−クチナーゼ遺伝子のATGコドンの1.2kb上流に存在する) Eco RI 部位をNot I部位に変換してNot I部位を生成して、pUR7282を産生した。 Therefore, using a synthetic oligonucleotide (5'-AATTGCGGCCGC-3 ') ( pre - pro - present in the 1.2kb upstream of the ATG codon of the cutinase gene) the Eco RI site was converted to a Not I site Not I It generates a site to produce PUR7282. 全A. All A. nidulans amdS遺伝子及びA. nidulans amdS gene and the A. niger変異株aw amori pyrG遺伝子をそれら自体のプロモーターやターミネーターと共に含んでいる適切なDNA断片は、フランキングNot I部位を備えており、これをpUR7282のNot I部位に導入してpUR7281(図10)を産生した。 Suitable DNA fragment comprising the niger variant aw Amori pyrG gene together with their own promoters and terminators are introduced it includes flanking Not I site, this to Not I site of pUR7282 pUR7281 (Fig. 10) It was produced. Aspergillus niger変異株awamoriでの合成Fusa rium solani pisiクチナーゼ遺伝子の代替の発現方法として、 成熟クチナーゼをコードする合成遺伝子の前にそれ自体のプレ−プロ配列ではなく、 A. As an alternative to expression of the synthetic Fusa rium solani pisi cutinase gene in Aspergillus niger mutant awamori, itself pre before the synthetic gene encoding the mature cutinase - not a pro sequence, A. niger変異株awamori exlAのプレ配列が存在する発現ベクターを構築した。 to construct an expression vector presequence niger mutants awamori ExlA exists. このような融合のための合成クチナーゼ遺伝子を産生するために、exlAプレ配列のコード化配列が種々の方法で成熟クチナーゼのN末端のコード化配列に結合した数個のアダプター断片を合成した。 Synthetic cutinase gene for such fusions in order to produce, were synthesized several adapter fragments coding sequence of exlA pre sequence is bound to the coding sequence of the N-terminus of mature cutinase in different ways. カセット5では、この結合は、ex lAプレ配列をクチナーゼのプロ配列と融合して行う。 In the cassette 5, this coupling is carried out by fusing the prosequence of cutinase the ex lA presequence. カセット6では、exl Aプレ配列を成熟クチナーゼのN末端残基と融合する。 In the cassette 6, it is fused to the N-terminal residue of mature cutinase the exl A presequence. カセット7はカセット6 と同一であるが、コード化成熟クチナーゼポリペプチドのN末端残基を元のグリシンからセリン残基に変えて、シグナルペプチドの開裂要件により適合するようにした。 Cassette 7 is identical to the cassette 6, but by changing the N-terminal residue of the encoded mature cutinase polypeptide from the original glycine to serine residues, and to be compatible with an open 裂要 matter of the signal peptide. 本質的に実施例1に記載したように、カセット5、6及び7を合成オリゴヌクレオチドから作成した(図7参照)。 As essentially as described in Example 1 to prepare a cassette 5, 6 and 7 from synthetic oligonucleotides (see FIG. 7). カセット5を使用して、pUR72 10の0.1kb Eco RI− Spe I断片を置換してpUR7287を産生した。 Use cassette 5, and produced pUR7287 by replacing the 0.1 kb Eco RI-Spe I fragment pUR72 10. カセット6、7を使用して、pUR7210の0.1kb Eco RI− Bcl I 断片を置換し、それぞれpUR7288及びpUR7289を産生した。 Use cassette 6, to replace the 0.1 kb Eco RI-Bcl I fragment PUR7210, produced respectively pUR7288 and pUR7289. プラスミドpUR7287、pUR7288及びpUR7289の各々について、0. For each plasmid pUR7287, pUR7288 and pUR7289, 0. 7kb Bsp HI− Afl II断片をpAW14Bの7.2kb Bsp HI − Afl II断片と連結して、それぞれpUR7290、pUR7291及びp UR7292を得た。 7 kb Bsp HI- Afl II fragment of pAW14B 7.2kb Bsp HI - Afl II fragment was ligated with to give each pUR7290, pUR7291 and p UR7292. その後、従来の同時形質転換技術により、構築したrDNAベクターをカビ( Aspergillus nigerAspergillus niger変異株awamori )に移植し、エンドキシラナーゼIIプロモーターの誘導によりプレ−(プロ)−クチナーゼ遺伝子を発現した。 Then, by a conventional co-transformation techniques, a rDNA vector constructed transplanted into molds (Aspergillus niger, Aspergillus niger mutant strain awamori), pre-induction of endoxylanase II promoter - expressed the cutinase gene - (Pro). 本実施例でpUR7280について説明したように(上記参照)、構築したrDNAベクターは更に、従来の選択マーカー(例えばamdS又はpyrG、ヒグロマイシン)を備えていてもよく、またカビを得られたrDNAベクターで形質転換して、所望のタンパク質を産生してもよい。 pUR7280 as described in this Example (see above), rDNA vectors constructed further conventional selection markers (e.g. amdS or pyrG, hygromycin) may be provided with a, also in rDNA vectors obtained mildew transformed, it may produce the desired protein. (対応するプロ配列を備えた又は備えていないFusarium solan i pisi成熟クチナーゼコード領域と、 A.niger変異株awamori exlAプロモーター及びターミネーターの制御下のクチナーゼシグナル配列又はexlAシグナル配列とを含む)発現ベクターpUR7280、pUR7281、pUR7290、pUR7 291、pUR7292の各々で形質転換したAspergillus株を、以下の条件下で増殖させた:400mlの合成培地(pH6.5)を含む多数の1 リットル振盪フラスコに、胞子(最終濃度:10E6/ml)を接種した。 (Corresponding with Fusarium Solan i pisi mature cutinase encoding region that does not have or having a prosequence, and a cutinase signal sequence or ExlA signal sequence under the control of the A.niger mutants awamori ExlA promoter and terminator) expression vector pUR7280 , pUR7281, pUR7290, pUR7 291, the Aspergillus strains transformed with each PUR7292, were grown under the following conditions: the number 1 liter shake flask containing synthetic medium (pH 6.5) in 400 ml, spores (final concentration: 10E6 / ml) were inoculated with. 培地組成を以下に示す(AW培地): スクロース 10g/l NaNO 3 6.0g/l KCl 0.52g/l KH 2 PO 4 1.52g/l MgSO 4・7H 2 O 0.49g/l 酵母抽出物 1.0g/l ZnSO 4・7H 2 O 22mg/l H 3 BO 3 11mg/l MnCl 2・4H 2 O 5mg/l FeSO 4・7H 2 O 5mg/l CaCl 2・6H 2 O 1.7mg/l CuSO 4・5H 2 O 1.6mg/l NaH 2 MoO 4・2H 2 O 1.5mg/l Na 2 EDTA 50mg/l Mk Xインキュベーターシェーカーで、200rpm、30℃で24時間インキュベートした。 It shows a medium composition below (AW Medium): sucrose 10g / l NaNO 3 6.0g / l KCl 0.52g / l KH 2 PO 4 1.52g / l MgSO 4 · 7H 2 O 0.49g / l yeast extract things 1.0g / l ZnSO 4 · 7H 2 O 22mg / l H 3 BO 3 11mg / l MnCl 2 · 4H 2 O 5mg / l FeSO 4 · 7H 2 O 5mg / l CaCl 2 · 6H 2 O 1.7mg / l CuSO at 4 · 5H 2 O 1.6mg / l NaH 2 MoO 4 · 2H 2 O 1.5mg / l Na 2 EDTA 50mg / l Mk X incubator shaker and incubated for 24 hours at 200 rpm, 30 ° C..増殖後、細胞を濾過(0.45μmフィルター)して収集し、スクロース及び酵母抽出物を含まないAW培地(塩溶液)で2度洗浄し、50 mlの塩溶液に再度懸濁させ、キシロースを添加して10g/lの最終濃度にした50mlの塩溶液(誘導培地)を含む300mlの振盪フラスコに移した。上記と同一条件下でのインキュベーションを一晩継続した。得られた培養物をミラクロス(miracloth)で濾過してバイオマスを除去し、クチナーゼを本質的に実施例2に記載した方法で回収した。 実施例7 AspergilliでのFusarium solani pisiクチナーゼの変異体の発現 本質的に実施例6に記載した方法により、但し真菌発現ベクターの構築のためにpUR7210に代わりにプラスミドpUR7257(N172K)を用いて、変異N172Kを含むFusar ium solani pisiクチナーゼの変異体をAspergillus niger変異株awamoriで産生した。 実施例8 Fusarium solani pisiクチナーゼ遺伝子に関連する遺伝子の同定及び単離Fusarium solani pisiクチナーゼとの相同性の程度が異なるクチナーゼのコード化遺伝子を種々の真菌から単離した。 Hankin及びKolattukudy(1968)が記載する培地200mlに0.25%グルコースを補充したものを含む500mlの振盪フラスコで真菌培養物を増殖させ、Mk Xインキュベーターシェーカー(100rpm)で、28℃で4日間インキュベートした。この時点で、グルコースが消費され、本質的にEttin ger等(1987)が記載したようにクチン水解物を添加してクチナーゼの産生を誘導した。一定の間隔で試料を培養物から取り出し、標準的な技術に従って(実施例4参照)脂肪分解活性の存在を分析した。通常、誘導から約2日後に、 脂肪分解活性を実証することができ、 この時点で、標準的な技術を用いて細胞を濾過して収集した。標準的な技術に従って、菌糸を洗浄し、液体窒素中で凍結し、凍結乾燥した。グアニジニウムチオシアネート法を用いて全細胞RNA調製物を単離し、本質的にSambrook 等(1989)が記載したように、塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製した。 polyAT管(tract)mRNA単離キット(Promga)を用いてp olyA(+)mRNA画分を単離した。標準的な技術に従い、 Fusariu m solani pisiクチナーゼ遺伝子に由来するcDNA断片をプローブとして用いて、polyA(+)mRNA画分をノーザンハイブリダイゼーション分析で使用して、クチナーゼ関連遺伝子の発現を検証した。 ZAP cDN A合成キット(Stratagene,La Jolla)を供給業者の指示に従って用いて、プローブとハイブリダイズし得る物質を含むmRNA調製物でc DNAを合成して、poly−A領域に隣接しているXhoI付着端と、他端にEcoRIアダプターを有するcDNA断片を得た。得られたcDNA断片を用い、λZAPIIベクター(Stratagene,La Jolla)でのセンス方向のダイレクショナルクローニングにより発現ライブラリーを構築すると、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質(Huse等、1988)を発現することができた。 Fusarium sol ani pisiクチナーゼに対する抗血清を用いて、これらのライブラリーをスクリーニングした。あるいは、クチナーゼ特異的プライマー(表2参照)を用いて、合成cDNA 画分をPCRスクリーニングにかけた。これらのプライマーは、数種の真菌クチナーゼ遺伝子のアミノ酸配列(Ettinger等、1987)の比較により得られたものである。 Fusarium solani pisiクチナーゼのc DNAを対照として用いてPCR反応の条件を、各組のプライマーについて最適化した。同一条件下で、長さがFusarium solani pisiクチナーゼ由来のcDNAで産生されるPCR断片と同様である(又はそれ以上の) 特異的PCR断片の産生に使用され得るcDNA調製物について、PCR断片をゲル電気泳動で精製して、ゲルから単離した。代替の方法としては、クチナーゼ特異的プライマーを用いるPCRスクリーニング技術は更に、 Fusarium solani pisiのゲノムDNAを陽性対照として用いることにより、幾つかの真菌株のゲノムDNAに直接適用される。同一条件下で、長さがFusarium solani pisiクチナーゼ由来のc DNAで産生されるPCR断片と同様である(又はそれ以上の)特異的PCR断片の産生に使用され得る真菌ゲノムDNA調製物について、PCR断片をゲル電気泳動で精製して、ゲルから単離した。発現ライブラリー法又は(cDNAもしくはゲノムDNAを用いる)PCRスクリーニング法で陽性と評価された株や、他の幾つかの株について、高分子量ゲノムDNAを単離した。株を本質的にEttinger等(1987)の記載した方法で増殖させ、ゲノムDNAをGraaff等(1988)が記載した方法で単離した。ゲノムDNAを種々の制限酵素で消化し、類似cDNAインサート(発現ライブラリー法)又はPCR断片(PCRスクリーニング法)又はFus arium solani pisiクチナーゼ遺伝子(他の株)をプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションで分析し、クチナーゼ遺伝子の物理マップを構築した。ゲノムDNAの適切な消化物をゲル電気泳動でサイズ分画し、適切サイズの断片をゲルから単離し、pUC19にサブクローニングした。これらのゲノムライブラリーを対応するcDNAインサート(発現ライブラリー法)又はPCR断片(PCRスクリーニング法)でスクリーニングして、クチナーゼ遺伝子のゲノムコピーを含むクローンを産生した。これらの遺伝子を両方向に配列決定した。対応cDNAを配列決定するか又は他のクチナーゼ配列(Ettinger等、1987)と比較してイントロンを同定した。成熟クチナーゼポリペプチドのN末端を更にこのような比較から推定した。標準的なPCR技術を用いて、イントロンを除去し、 Hin dIII部位を読み取り枠のすぐ下流で作成し、 Saccharomyc es cerevisiaeインベルターゼ遺伝子(前にSac I部位が存在する、カセット8を比較、図3)のプレ配列のコード化配列を、成熟クチナーゼのN末端のコード化配列に融合した。 S. cerevisiaeインベルターゼプレ配列をコードする配列に操作的に連結したクチナーゼ遺伝子を含む産生Sac I− Hin dIII断片を、pUR7241(図4参照)の7.3kb Sac I− Hin dIII断片と連結し、 S. cerevisiae株SU51に形質転換した。真菌クチナーゼを発現し、 本質的に実施例4に記載したように培養ブロスから回収した。 実施例9 Fusarium solani pisiクチナーゼ変異体N172Kの洗濯中活性 クチナーゼ変異体N172Kの脂肪除去への作用を、野生型Fusarium solani pisiクチナーゼの場合と比較した。試験では、臭素化オリーブ油で汚したポリエステル試験布をモニターとして使用した。 (前述したように)X線蛍光スペクトル分析で試験布上の臭素の量を測定して、試験布上の脂肪量を決定した。野生型Fusarium solani pisiクチナーゼ(WT)及びN 172K変異体を3LU/ml用い、酵素による汚れ除去量を幾つかの実験条件下で測定した: 洗剤製品A〜Cの組成(重量%)を以下に示す: 製品A The composition of the detergent products A~C (weight%) shown below: Product A 製品B Products B 製品C Product C 様々な洗濯条件下で、洗濯中性能(油汚れ除去)が野生型Fusarium solani pisiクチナーゼに比べて改善されることは明白である。 In various washing conditions, it is evident that the laundry in performance (oily soil removal) is improved relative to wild-type Fusarium solani pisi cutinase. 図1 3は、30℃、27゜FHで、30分間の洗濯で2g/lの洗剤製品Cを用いた場合の種々の酵素濃度での洗濯中性能を示している。 1 3, 30 ° C., with 27 ° FH, shows the washing during the performance at various enzyme concentrations in the case of using the detergent product C of 2 g / l in the washing of 30 minutes. 比較として、更に同じ実験をLipolase(登録商標)を用いて実施した。 As a comparison was carried out using further Lipolase (TM) The same experiment. 全ての条件下で、クチナーゼ変異体N172Kの方が優れていた。 Under all conditions, it was superior to the cutinase variant N172K. 実施例12 Fusarium solani pisiクチナーゼ変異体E201Kの洗濯中活性 種々の酵素濃度のクチナーゼ変異体E201Kが脂肪除去に及ぼす作用を、3 0℃、27゜FHで、30分間の洗濯で2g/lの洗剤製品C(実施例11を参照)を用いて野生型Fusarium solani pisiクチナーゼの場合と比較した。 The effect on cutinase variant E201K fat removal of Example 12 Fusarium solani pisi cutinase washing in activity various enzyme concentrations mutant E201K, 3 0 ℃, at 27 ° FH, 2 g / l of detergent in the washing of 30 minutes It was compared to that of wild-type Fusarium solani pisi cutinase using the product C (see example 11). 試験では、臭素化オリーブ油で汚したポリエステル試験布をモニターとして使用した。 In the test, using a polyester test cloths soiled with brominated olive oil as a monitor. (前述したように)X線蛍光スペクトル分析で試験布上の臭素の量を測定して、試験布上の脂肪量を決定した。 By measuring the amount of bromine on the test cloth (as mentioned above) X-ray fluorescence spectroscopy to determine the amount of fat on the test cloth. 結果を図14に示す。 The results are shown in Figure 14. 洗濯中性能(油汚れ除去)が野生型Fusarium solani pisiクチナーゼに比べて改善されることは明白である。 It is apparent that washing in performance (oily soil removal) is improved relative to wild-type Fusarium solani pisi cutinase. 比較として、更に同じ実験をLipolase(登録商標)を用いて実施した。 As a comparison was carried out using further Lipolase (TM) The same experiment. E201Kクチナーゼ変異体の性能の方が明らかに優れていることが知見された。 It has been found that better performance E201K cutinase variant is clearly superior. 実施例13 Fusarium solani pisiクチナーゼ変異体A85Fの洗濯中活性 種々の酵素濃度のクチナーゼ変異体A85Fが脂肪除去に及ぼす作用を、30 ℃、27゜FHで、30分間の洗濯で2g/lの洗剤製品C(実施例11を参照)を用いて野生型Fusarium solani pisiクチナーゼの場合と比較した。 EXAMPLE 13 Fusarium solani pisi cutinase the effect of cutinase variant A85F is on fat removal of the washing in the active various concentration of enzyme variant A85F, 30 ℃, 27 ° FH, detergent products of 2 g / l in the washing of 30 minutes It was compared to that of wild-type Fusarium solani pisi cutinase using C (see example 11). 試験では、臭素化オリーブ油で汚したポリエステル試験布をモニターとして使用した。 In the test, using a polyester test cloths soiled with brominated olive oil as a monitor. (前述したように)X線蛍光スペクトル分析で試験布上の臭素の量を測定して、試験布上の脂肪量を決定した。 By measuring the amount of bromine on the test cloth (as mentioned above) X-ray fluorescence spectroscopy to determine the amount of fat on the test cloth. 結果を図15に示す。 The results are shown in Figure 15. 洗濯中性能(油汚れ除去)が野生型Fusarium solani pisiクチナーゼに比べて改善されることは明白である。 It is apparent that washing in performance (oily soil removal) is improved relative to wild-type Fusarium solani pisi cutinase. 比較として、更に同じ実験をLipolase(登録商標)を用いて実施した。 As a comparison was carried out using further Lipolase (TM) The same experiment. A85Fクチナーゼ変異体の性能の方が明らかに優れていることが知見された。 It has been found that better performance A85F cutinase variant is clearly superior.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 6識別記号 庁内整理番号 FI C12N 15/09 ZNA // C12S 11/00 8931−4B D06L 1/00 7199−3B (C12N 9/18 C12R 1:865) (C12N 9/18 C12R 1:77) (C12N 1/15 C12R 1:66) (C12N 1/19 C12R 1:85) (C12N 1/19 C12R 1:78) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:77) C12R 1:77) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AT,AU,BB,BG,BR,BY, CA,CH,CZ,D ────────────────────────────────────────────────── ─── front page continued (51) Int.Cl. 6 in identification symbol Agency Docket No. FI C12N 15/09 ZNA // C12S 11/00 8931-4B D06L 1/00 7199-3B (C12N 9/18 C12R 1 : 865) (C12N 9/18 C12R 1:77) (C12N 1/15 C12R 1:66) (C12N 1/19 C12R 1:85) (C12N 1/19 C12R 1:78) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:77) C12R 1:77) (81) designated States EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CZ, D ,DK,ES,FI,GB,H U,JP,KP,KR,KZ,LK,LU,MG,MN ,MW,NL,NO,NZ,PL,PT,RO,RU, SD,SE,SK,UA,VN (72)発明者 フアン・デル・ヒーデン,ヘンドリクス・ テオドルス・ウエー・エム オランダ国、エヌ・エル―2907・カー・ベ ー・カペレ・アー/デー・イユツセル、ア イダ・64 (72)発明者 ムステルズ,ウオーテル オランダ国、エヌ・エル―3141・エル・デ ー・マースルイス、ウイツペルスパルク・ 138 (72)発明者 ペテルス,ハンス オランダ国、エヌ・エル―3051・イツク ス・ベー・ロツテルダム、サフイエルスト ラート・12 (72)発明者 フエリプス,コルネリス・テオドルス オランダ国、エヌ・エル―3142・カー・ベ ー・マースルイス、ハゲドールン・18 (72)発明者 デ・ , DK, ES, FI, GB, H U, JP, KP, KR, KZ, LK, LU, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SK, UA, VN (72) inventor Juan del Hiden, Hendrix-Teodorusu, Parkway M. Netherlands, N. El -2907 car Baie over-Capelle-ah / Day Iyutsuseru, A Ida 64 (72) inventor Musuteruzu, Uoteru Netherlands, N. El -3141 el de over Maas Lewis, Huy Tsu per scan Parc 138 (72) inventor Peterusu, Hans Netherlands, N. El -3051-worship vinegar Bae Rotsuterudamu, Safuierusuto alert, 12 (72) inventor Fueripusu, Cornelis Teodorusu Netherlands, N. El -3142 car base over Maas Lewis, Hagedorun, 18 (72) inventor de リーグ,ヤコブ オランダ国、エヌ・エル―3142・アー・ペ ー・マースルイス、カスタニエーダル・32 League, Jacob Netherlands, N. El -3142 ARE Bae over Maas Lewis, castagniers over Dar 32

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. [Claims] 1. 酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した親クチナーゼのクチナーゼ変異体。 Cutinase variant of a parent cutinase was altering the amino acid sequence so as to increase the hydrophobicity of the surface of the enzyme. 2. 2. 脂質接触領域に隣接する酵素表面の疎水性を増加して、拡大された脂質接触領域を形成した請求項1に記載のクチナーゼ変異体。 By increasing the hydrophobicity of the enzyme surface adjacent to the lipid contact zone, cutinase variant of claim 1 which is formed an enlarged lipid contact regions. 3.1個以上のアミノ酸残基を、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンからなる群の中から選択されるアミノ酸残基で置換して疎水性を増した請求項1又は2に記載のクチナーゼ変異体。 3.1 or more amino acid residues, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, according to claim 1 or 2 was increased hydrophobicity by replacing an amino acid residue selected from the group consisting of tryptophan and methionine cutinase variant of. 4. 4. 表面疎水性を増すだけでなく、1個以上の陽電荷を導入するようにアミノ酸配列を改変した請求項1から3のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 Surface hydrophobicity well increase, cutinase variant according to claims 1 obtained by modifying the amino acid sequence to introduce one or more positive charges to any one of 3. 5.1個以上のリシン又はアルギニン残基を導入して陽電荷を導入した請求項4 に記載のクチナーゼ変異体。 Cutinase variant of Claim 4 introduced a positive charge by introducing 5.1 or more lysine or arginine residues. 6. 6. 置換されるアミノ酸残基が小さな側鎖を有し、好ましくはアラニン、セリン又はグリシンからなる群の中から選択される請求項1から5のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 Amino acid residue to be substituted has a small side chain, preferably alanine, cutinase variant according to any one of claims 1 to 5 selected from the group consisting of serine or glycine. 7. 7. 親クチナーゼが真核生物クチナーゼである請求項1から6のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 Cutinase variant according to any one of claims 1 6 parent cutinase is a eukaryotic cutinase. 8. 8. 親酵素が、 Fusarium solani pisi由来のクチナーゼに対する抗体と免疫学的に交差反応するクチナーゼである請求項1から7のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 Parent enzyme, cutinase variant according to any one of claims 1 7 is a Fusarium solani pisi cutinase derived from cross-reactive antibodies immunologically against cutinase. 9. 9. 親酵素がFusarium solani pisi由来のクチナーゼである請求項1から8のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 Cutinase variant according to any one of claims 1 to 8 parent enzyme is cutinase derived from Fusarium solani pisi. 10. 10. 改変残基が、 Fusarium solani pisiクチナーゼの残基116〜120のCα−原子又は異なるクチナーゼの対応するCα−原子を介する最小自乗適合であるベクトルと、該ベクトルに垂直で、残基117のCα− 原子又は異なるクチナーゼの対応するCα−原子を含んでいる面とによって規定される分子部分に位置する請求項1から9のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 Modified residues, and the vector is a least squares fit through the corresponding Ca-atoms of Fusarium solani pisi cutinase residues 116-120 of Ca-atoms or a different cutinase, perpendicular to the vector, residues 117 Ca- atom or different corresponding Cα- cutinase variant according atoms from claim 1 positioned molecule portion defined by a plane containing any one of 9 cutinase. 11 改変残基が、残基117のCα−原子から15A離れたFusarium solani pisiクチナーゼの残基116〜120のCα−原子を介する最小自乗適合であるベクトルに垂直な第1の面と、該第1の面に平行で、残基117のCα−原子を含んでいる第2の面との間に位置する分子部分中に位置する請求項1から10のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 11 modified residues, a first surface perpendicular to the vector is a least squares fit through the Cα- atoms residues 116-120 of Fusarium solani pisi cutinase away 15A from Cα- atoms residues 117, said parallel to the first surface, cutinase variant according to any one of claims 1 to 10 located in the molecule portion located between the second face containing the Cα- atoms residues 117 . 12. 12. 改変残基が、 Fusarium solani pisiクチナーゼのアミノ酸配列の以下の位置又は異なるクチナーゼの対応する位置: 17,18,19,40,42−46,50,53,54,58,74,75, 76,78,80−88,91,92,93,95,96,97,99,100 ,119,150−156,158,160,168,169,170,172 ,173,174,176,179,180−190,192,193,194 ,196,197,198,201 の1つ以上に位置する請求項1から11のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 Modified residues, Fusarium solani pisi following positions in the amino acid sequence of a cutinase or a different cutinase corresponding position: 17,18,19,40,42-46,50,53,54,58,74,75, 76, 78,80-88,91,92,93,95,96,97,99,100, 119,150-156,158,160,168,169,170,172, 173,174,176,179,180- 190,192,193,194, cutinase variant according to any one of claims 1 to 11 located on one or more 196,197,198,201. 13. 13. 改変残基が、 Fusarium solani pisiクチナーゼのアミノ酸配列の以下の位置又は異なるクチナーゼの対応する位置: 19,41,45,49,54,58,75,76,82,85,92,93, 99,100,127,128,17 2,173,179,183,184,185,189,190,194,19 7,201 の1つ以上に位置する請求項1から12のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 Modified residues, Fusarium solani pisi following positions in the amino acid sequence of a cutinase or a different cutinase corresponding positions: 19,41,45,49,54,58,75,76,82,85,92,93, 99, 100,127,128,17 2,173,179,183,184,185,189,190,194,19 cutinase according to claims 1 located in one or more of 7,201 to any one of the 12 Mutant. 14. 14. 以下の改変: T19V,G41A,T45K,T45P,*I49a,S54I,N58R, G75R,A76P,G82A,D83S,A85F,A85V,S92R,A 93V,L99K,G100R,A127L,A128F,N172K,T17 3I,T179F,I183F,V184I,A185L,L189F,A19 0L,D194R,G197V,E201K の1つ以上が、 Fusarium solani pisiクチナーゼのアミノ酸配列で又は異なるクチナーゼの対応する位置で実施された請求項1から13のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 Following modifications: T19V, G41A, T45K, T45P, * I49a, S54I, N58R, G75R, A76P, G82A, D83S, A85F, A85V, S92R, A 93V, L99K, G100R, A127L, A128F, N172K, T17 3I, T179F , I183F, V184I, A185L, L189F , A19 0L, D194R, G197V, one or more of E201K is, any of Fusarium solani pisi cutinase amino acid sequence or different cutinase corresponding performed at a position claims 1 to 13 cutinase variant according to one paragraph. 15. 15. 以下の改変:A85F、N172K、E201Kが、 Fusarium solani pisiクチナーゼのアミノ酸配列で、又は異なるクチナーゼの対応する位置で実施された請求項1から14のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体。 Following modifications: A85F, N172K, E201K is, Fusarium solani pisi the amino acid sequence of cutinase, or a different cutinase variant cutinase corresponding according to any one of claims 1, which is carried out 14 at a position. 16. 16. クチナーゼ変異体をコードするrDNA技術により製造した遺伝子を含むrDNA改変微生物を発酵培養し、微生物で産生されたクチナーゼ変異体を発酵ブロスと分離するか又は微生物細胞を発酵ブロスと分離することによりクチナーゼ変異体調製物を製造し、分離した細胞を破壊し、物理的又は化学的な濃縮又は精製法により前記ブロスから又は前記細胞からクチナーゼを濃縮又は部分精製する段階を包含する請求項1から15のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体の産生方法。 Fermented cultured rDNA modified microorganisms containing a gene produced by rDNA technique which encodes the Cutinase variant, cutinase variant by separating or microbial cells separated cutinase variant produced by microbial fermentation broth and fermentation broth manufactured preparations, to destroy the separated cells, either physical or chemical concentration or purification methods claims 1 to 15 including the step of concentrating or part purifying the cutinase from or the cells from the broth by methods for producing cutinase variant according to one paragraph or. 17. 17. 請求項1から15のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体をコードする遺伝子を保有するrDNAベクターによって形質転換されて、前記クチナーゼ変異体を発現し得るrDNA改変微生物。 By rDNA vector carrying a gene encoding a cutinase variant of any one of claims 1 to 15 is transformed, rDNA modified microorganism capable of expressing the cutinase variant. 18.5'末端で、宿主微生物のシグナル又は分泌配列として機能的な(改変) プレ配列をコードする遺伝子断片と融合することによって微生物内に導入されるクチナーゼ変異体をコードする遺伝子を保有する請求項17に記載のrDNA改変微生物。 18.5 'end, wherein carrying the gene encoding the cutinase variant is introduced into the microorganism by fusing a functional (modified) gene fragment encoding the pre-sequence as a signal or secretion sequence of the host microorganism rDNA modified microorganism according to item 17. 19. 19. 宿主微生物が真核生物、例えばSaccharom yces属、 Kluyveromyces属もしくはHansenula属の酵母菌、又はAspergillus属の真菌である請求項17又は18に記載のrDNA改変微生物。 Host microorganism eukaryote, such Saccharom yces sp, rDNA modified microorganism according to claim 17 or 18 which is a fungal yeast or Aspergillus genus Kluyveromyces genus or Hansenula spp. 20. 20. 請求項1から15のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体をコードする組換えDNAベクターを保有し、かつ先祖細胞のひとつで栄養要求性マーカーをコードする遺伝子を置換して栄養要求性突然変異体となったことを特徴とする、 請求項17から19のいずれか一項に記載のrDNA改変微生物。 And harboring recombinant DNA vector encoding a cutinase variant according to any one of claims 1 to 15, and to replace the gene coding for the auxotrophic marker auxotrophic mutations in a single progenitor cells characterized in that a body, rDNA modified microorganism according to any one of claims 17 19. 21. 21. 最終翻訳コドンの次に終結コドンが存在し、場合によっては、成熟酵素をコードするヌクレオチド配列のすぐ上流にこのクチナーゼのプレ配列をコードするヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項1から15のいずれか一項に記載の成熟クチナーゼ変異体又はその機能等価物又はその突然変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。 There is next termination codon of the final translation codons, in some cases, characterized by having a nucleotide sequence encoding the pre-sequence of this Cutinase directly upstream of the nucleotide sequence encoding the mature enzyme, 15 from claim 1 polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the mature cutinase variant or a functional equivalent or a mutant thereof according to any one of. 22. 22. 最終翻訳コドンの次に終結コドンが存在し、場合によっては、成熟酵素をコードするヌクレオチド配列のすぐ上流に対応プレ配列の少なくとも一部分、及び/又は選択される宿主微生物に適したシグナル配列もしくは分泌配列をコードするヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項1から15のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。 There is next termination codon of the final translation codons, in some cases, at least a portion, and / or signal sequences or secretion sequence suitable for a host microorganism selected corresponding presequence immediately upstream of the nucleotide sequence encoding the mature enzyme characterized in that it has a nucleotide sequence encoding a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding a cutinase variant of any one of claims 1 to 15. 23. 23. 請求項1から15のいずれか一項に記載の成熟クチナーゼ変異体又はその機能等価物又はその突然変異体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであって、産生源の微生物から誘導される、クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を、少なくとも1個のコドン、好ましくはできるだけ多くのコドンが'サイレント'突然変異の対象に対し、請求項17から20のいずれか一項に記載の新しい宿主に好まれるコドンである、同等のアミノ酸残基をコードするコドンを形成するように改変することにより、前記宿主の細胞内での使用時に、安定性の改善された導入遺伝子用mRNAを提供する前記ポリヌクレオチド。 A polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the mature cutinase variant or a functional equivalent or a mutant thereof according to any one of claims 1 to 15, derived from a microorganism of the production source, cutinase the nucleotide sequence encoding the variant, at least one codon, are preferred preferably to as many target codon 'silent' mutations, the new host according to any one of claims 17 to 20 a codon, by modifying to form codons encoding equivalent amino acid residues, in use in a cell of said host, said polynucleotide to provide stability improved transgene for mRNA. 24. 24. プロ又は成熟クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列の上流に、 請求項17から20のいずれか一項に記載の宿主に適したシグナル配列又は分泌配列をコードするヌクレオチド配列が位置する請求項21から23のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 Upstream of the nucleotide sequence encoding the pro-or mature Cutinase variant, it claims 21 to nucleotide sequences located encoding a signal or secretory sequence suitable for a host of any one of claims 17 to 20 23 polynucleotide according to any one of. 25. 25. (a)成熟クチナーゼ変異体、又はプレクチナーゼ、又は(選択された宿主細胞にとって好ましい)分泌シグナルのすぐ下流でプレ配列の少なくとも一部分が除去された対応プレクチナーゼをコードする二本鎖(ds)DNAであるが、但し、翻訳されるべき遺伝子の部分がコドンATGで開始していない場合はA TGコドンを前に置くべきとし、更に翻訳されるべき遺伝子部分は適切な終結コドンで終了する即ち前記コドンを付加するものとする、前記DNA; (b)クチナーゼ変異体をコードするds DNA(成分(a))のプラス鎖の上流に位置する、(選択される宿主微生物に適した)発現レギュロン; (c)クチナーゼ変異体をコードするds DNA(成分(a))のプラス鎖の下流に位置する、(選択される宿主微生物に適 (A) the mature cutinase variant, or Purekuchinaze, or (selected preferably to the host cell) duplexes soon encoding at least a portion has been removed corresponding Purekuchinaze presequence downstream of secretion signal (ds) DNA although, however, if the portion of the gene to be translated is not started at codon ATG is a should precede the a TG codon, further gene portion to be translated ends with an appropriate termination codon that is, the shall adding codon, the DNA; (b) cutinase located upstream of the plus strand of the ds DNA encoding the variant (component (a)), (suitable host microorganism selected) expression regulon; located downstream of the plus strand of (c) ds DNA encoding the cutinase variant (component (a)), suitable for the host microorganism (selected た)ターミネーター配列; (d1)選択される宿主のゲノム内へのds DNAの取り込みを容易にするヌクレオチド配列、又は(d2)選択される宿主に適した複製起点; (e1)場合によっては(栄養要求性)選択マーカー; (e2)場合によっては、選択される宿主でのクチナーゼ変異体の一前駆体形態の成熟及び/又は分泌に関与するタンパク質をコードするds DNA配列を含むことを特徴とする、クチナーゼ変異体遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を指令し得る組換えDNAベクター。 Was) terminator sequence; (d1) a nucleotide sequence which facilitates ds DNA incorporation into the genome of a host to be selected, or (d2) an origin of replication suitable for the host to be selected; (e1) optionally (Nutrition auxotrophic) selection marker; (e2) optionally, characterized in that it comprises a ds DNA sequence encoding proteins involved in the maturation and / or secretion of one precursor form of a cutinase variant in a host to be selected , recombinant DNA vectors capable of directing the expression of a nucleotide sequence encoding a cutinase variant gene. 26. 26. 前記定義のポリヌクレオチドの上流及び/又は下流に、クチナーゼの機能発現を容易にする別の配列を更に保有する請求項25に記載の組換えDNAベクター。 The recombinant DNA vector of claim 25, upstream and / or downstream of the defined polynucleotides, further possess different sequences that facilitate expression of the function of cutinase. 27. 27. 栄養要求性マーカーのコード領域と、欠陥プロモーター領域とからなる栄養要求性マーカーを保有する請求項25又は26に記載の組換えDNAベクター。 The recombinant DNA vector of claim 25 or 26 carrying the coding region of the auxotrophic marker, an auxotrophic marker consisting of a defect promoter region. 28. 28. 請求項1から15のいずれか一項に記載のクチナーゼ変異体を含む酵素洗剤組成物。 Enzyme detergent composition comprising a cutinase variant according to any one of claims 1 to 15.
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