JPH08504588A

JPH08504588A - Modified cutinase, DNA, vector and host

Info

Publication number: JPH08504588A
Application number: JP6514770A
Authority: JP
Inventors: エグモンド，マールテン・ロベルト; フアン・デル・ヒーデン，ヘンドリクス・テオドルス・ウエー・エム; ムステルズ，ウオーテル; ペテルス，ハンス; フエリプス，コルネリス・テオドルス; デ・フリーグ，ヤコブ
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ
Priority date: 1992-12-18
Filing date: 1993-12-09
Publication date: 1996-05-21
Also published as: PL309388A1; BR9307678A; WO1994014963A1; CN1090328A; CA2150837A1; ZA939415B; CZ157895A3; EP0679188A1; AU5699994A; SK79595A3; HU9501771D0; HUT71325A

Abstract

(57)【要約】酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した、改善された脂肪分解活性を示す真核生物クチナーゼ変異体を提供する。特に、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体を提供する。 (57) [Summary] A eukaryotic cutinase mutant having improved lipolytic activity is provided, in which the amino acid sequence is modified to increase the hydrophobicity of the enzyme surface. In particular, a variant of Fusarium solani pisi cutinase is provided.

Description

【発明の詳細な説明】改変クチナーゼ、ＤＮＡ、ベクター及び宿主技術分野本発明は一般に、脂肪分解酵素の分野に関する。本発明はとりわけ、組換えＤＮＡ技術により改変した脂肪分解酵素、その産生方法、及び特に酵素洗剤組成物でのその使用に関する。背景及び従来技術脂肪分解酵素は、トリグリセリドを遊離脂肪酸やジグリセリド、モノグリセリド、場合によってはグリセロールに加水分解できる酵素である。前記酵素は更に、より複雑なエステル（例えば植物のクチン層又は皮脂）を分解し得る。脂肪分解酵素は、業界ではトリグリセリドのエステル交換やエステル合成のような種々の酵素法で使用されている。前記酵素は更に、洗剤製品の脂肪除去性を改善するために洗剤組成物で使用されている。最も広範に使用されている脂肪分解酵素は、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）である。例えば、ヨーロッパ特許出願公開第２５８０６８号及びヨーロッパ特許出願公開第３０５２１６号（共にＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）は共に、ｒＤＮＡ技術による異種宿主微生物を介した真菌リパーゼの産生、特にＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ／Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａに由来するリパーゼの産生を記載している。ヨーロッパ特許出願公開第３３１３７６号（Ａｍａｎｏ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ由来のリパーゼのアミノ酸配列を含め、リパーゼ、並びにそのｒＤＮＡ技術による産生及び使用を記載している。ｒＤＮＡ技術により産生されるリパーゼの別の例はＷＯ−Ａ−８９／０９２６３号やヨーロッパ特許出願公開第２１８２７２号（共にＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）に記載されている。リパーゼやその改変に関する刊行物が多数あるにもかかわらず、現在のところ、Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼだけが洗剤製品用添加剤としてＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）の商品名で広く市販されている。リパーゼの特徴は界面で活性を示すことである。これは、完全に溶解した基質よりも、界面又はミセルを形成した基質への酵素活性が遥かに高いことを意味している。界面活性は、基質濃度が基質の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも高くなって、界面が形成されたときに脂肪分解活性の急増となって表れる。実験では、この現象を酵素活性対基質濃度のグラフで非連続性として観察することができる。リパーゼの界面での活性化機構は、リパーゼ分子のタンパク質構造のコンホーメーション変化によって解明されてきた。遊離した未結合の状態では、らせん状リッド（lid）が触媒結合部位を包囲している。脂質基質との結合時には、リッドが移動して、触媒部位が露出する。らせん状リッドは、脂質界面と相互作用して、酵素を界面と結合した状態のままにするとも考えられている。ＷＯ−Ａ−９２／０５２４９号（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）は、脂質接触領域が改変された遺伝子工学的改変リパーゼ、特にＨｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼを開示している。脂質接触領域は本明細書では、活性形のときにらせん状リッドにより覆われた表面と定義する。改変は、脂質接触領域の１個以上のアミノ酸残基を欠失又は置換して、静電荷を増加させ、及び／又は脂質接触領域の疎水性を減少させ、又は脂質接触領域の表面コンホーメーションを変えることからなる。これは、脂質接触領域の１個以上の陰電荷アミノ酸残基を欠失させ、又はこれらの残基を中性又はより陽性電荷のアミノ酸で置換し及び／又は脂質接触領域の１個以上の中性アミノ酸残基を陽電荷アミノ酸で置換し、及び／又は脂質接触領域の１個以上の親水性アミノ酸残基を欠失させ、又はこれらの残基を疎水性アミノ酸で置換することにより達成される。クチナーゼは、ろうエステル加水分解酵素の一種である（ＥＣ３．１．１．５０）。これらの酵素は、植物で葉や茎の保護膜として生じるエステル化長鎖脂肪酸／脂肪アルコール網状体のクチンを分解し得る。更には、前記酵素はある程度の脂肪分解活性を有し、即ちトリグリセリドを加水分解し得る。従って、前記酵素は、特殊なリパーゼとみなすことができる。しかしながら、クチナーゼは、リパーゼとは異なり実質的な界面での活性を示さない。クチナーゼは、植物（例えば花粉）、細菌及び真菌のような多数の産生源から得ることができる。クチナーゼは、その脂肪分解性のために、酵素洗剤組成物の成分として提案されている。例えば、ＷＯ−Ａ−８８／０９３６７号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）は、界面活性剤と実質的に純粋な細菌クチナーゼ酵素とを組み合わせた効果的な洗浄組成物の製造を提案している。グラム陰性菌ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＡＴＣＣ５３５５２から得たクチナーゼを含む洗剤組成物が開示されている。しかしながら、より最近のヨーロッパ特許出願公開第４７６９１５号（Ｃｌｏｒｏｘ）では、従来の方法を使用した場合、リパーゼと称する前記酵素は織物の油汚れ除去に対して他のリパーゼほどの効果はないと開示されている。最近、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼの三次元構造が解明された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ等（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５６，６１５−６１８）。このクチナーゼが触媒結合部位を覆うらせん状リッドを持たないことが知見された。その代わり、活性部位のセリン残基が溶媒とアクセスし得るように思える。これらの知見は、リパーゼの界面での活性化機構に関する現在の理論を確定するように思える。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼ遺伝子はクローニングされ、配列決定されている（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６，７８８３−７８９２）。ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号（ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓＳｙｓｔｅｍｓ）は、Ｅ．ｃｏｌｉでの前記遺伝子のクローニングや産生を記載している。クチナーゼは、クチナーゼと基質との界面の存在下及び不在下で、水性及び非水性媒質中のエステルの合成や加水分解を効果的に触媒し得る。その一般的な安定性に基づき、このクチナーゼを使用して、洗濯洗剤のような洗浄剤や、化粧品組成物やシャンプーのような他の特定の脂肪溶解製剤を製造することができる。経済的に可能な酵素産生方法も、クチナーゼを含む特定の酵素洗剤組成物も開示されていない。この特徴のため、即ち界面での活性がないために、本明細書中ではクチナーゼを、実質的に界面で活性を示さない脂肪分解酵素と定義する。従って、クチナーゼは、触媒結合部位を覆うらせん状リッドを持たない点が従来のリパーゼと異なる。前述したように、現在のところ、Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼだけが洗剤製品用添加剤としてＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）の商品名で広く市販されている。ＨｅｎｒｉｋＭａｌｍｏｓは、ＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｙ１９９０，１８３−１８６ページに記載する論文で、洗濯プロセス中のリパーゼ活性は一般に低く、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）も例外でないことは周知であると指摘している。乾燥プロセス中に、織物の含水率が低下すると、酵素は活性を取り戻し、脂肪汚れは加水分解される。次の洗濯サイクル中に、加水分解された物質が除去される。これで、リパーゼ作用が１回目の洗濯サイクルの後は低いのに、以後のサイクルで有意となる理由の説明もつく。従って、洗濯プロセス中に有意な活性を示す脂肪分解酵素が更に必要である。クチナーゼ、特にＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼが明らかな洗濯中（in-the-wash）作用を示すことが知見された。しかしながら、洗濯中脂肪分解活性の改善されたクチナーゼやこのような酵素の産生方法が更に必要である。本発明の目的は、性能、特に洗濯中脂肪分解活性を改善するように改変されたクチナーゼを提供することである。驚くべきことに、真核生物クチナーゼ酵素、特にＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ由来のクチナーゼの脂肪分解活性が、酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変することにより改善され得ることが知見された。発明の定義酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した親クチナーゼのクチナーゼ変異体。好ましくは酵素表面の疎水性を増して、拡大された脂質接触領域を形成した。発明の説明本発明は、クチナーゼ酵素の変異体に関する。前述したように、クチナーゼは、植物（例えば花粉）、細菌及び真菌のような多数の産生源から得ることができる。親クチナーゼとして、即ち組換えＤＮＡ技術による改変のための本発明の出発材料として使用すべきクチナーゼは、真核生物クチナーゼの群の中から選択する。真核生物クチナーゼは、植物（例えば花粉）又は真菌のような種々の産生源から得ることができる。（真核生物）真菌クチナーゼの群は、葉特異性及び茎特異性と特異性の異なる２つのファミリーからなるように思える。葉特異性クチナーゼは、酸性又は中性ｐＨ最適値を有する傾向にあり、茎特異性クチナーゼはアルカリ性ｐＨ最適値を有する傾向にある。アルカリ性ｐＨ最適値を有するクチナーゼは、ヘビィーデューティ織物粉末／液体洗剤のようなアルカリ性ビルダー入り洗剤組成物での使用により適し、酸性又は中性ｐＨ最適値を有するクチナーゼは、ライトデューティ製品又はリンスコンディショナーだけでなく、工業洗浄製品により適している。以下の表Ｉに、４種の異なる茎特異性クチナーゼとそのｐＨ最適値を示す。表Ｉ茎特異性クチナーゼの例 pH最適値 Fusarium solani pisi 9 Fusarium roseum culmorum 10 Rhizoctonia solani 8.5 Alternaria brassicicola（PNBase I） 9 野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉから誘導され得るクチナーゼ（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等，１９８７）が本発明で特に好ましい。このクチナーゼは、特定の洗剤組成物で使用すると明白な“洗濯中”作用を示す。アミノ酸配列がＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼと高度の相同性を示すクチナーゼも、親クチナーゼ、即ち組換えＤＮＡ技術による改変のための本発明の出発材料として適している。Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ由来のクチナーゼがその例である。図１２にこれらのクチナーゼの部分アミノ酸配列を示す。高度の相同性を示すことが知見され得る。遺伝子改変によるＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの改良に代わる方法として、（プロ）クチナーゼをコードするＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａｃＤＮＡに由来する５’及び３’ＤＮＡプローブや、他の脂肪分解酵素の保存配列を認識するプローブを用いて他の真核生物に由来するクチナーゼをコードする遺伝子情報を単離することができ、また必要とあればこれらのプローブを用い、ポリメラーゼ連鎖反応、即ちＰＣＲ技術を使用してクチナーゼを産生する真核細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）由来のｃＤＮＡを増殖させることができる（例えばＷＯ−Ａ−９２／０５２４９号参照）。このようにして得られたクチナーゼコード化遺伝子を標準的な手順に従ってＥ．ｃｏｌｉにクローニングして発現した後に、クチナーゼの（脂肪）汚れ除去性能を適切な条件下で試験する。このようにして、洗濯中性能の改善された前記クチナーゼの天然変異体を多数得ることができる。更には、これらの天然クチナーゼの配列は、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの別のタンパク質を製造するための優れた基礎となる。 “洗濯中”脂肪分解酵素の活性を決定する因子に関する新たな考えや、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの３Ｄ構造の細心の検査に基づいて、このクチナーゼ、また一般にクチナーゼの性能を組換えＤＮＡ技術で改善するための幾つかの可能性を見出した。クチナーゼは基本的にＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）のようなリパーゼとは異なるので、クチナーゼ／基質（脂質界面）間の相互作用は基質と結合し得る疎水性領域のリッド開放や露出とは異なる原理に基づく（Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５１，４９１−４９４）。本発明は、クチナーゼ分子が凝集し始めるほど大きい疎水性領域を改変クチナーゼの表面上に形成せずに基質との相互作用を改善できるようにクチナーゼを改変できることを示している。疎水面は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンのような疎水性アミノ酸やメチオニン、量は少なくなるがグルタミン酸、グルタミン及びヒスチジンを導入することにより拡大し得る。但し、これらのアミノ酸の疎水性側鎖はクチナーゼの疎水性コアに埋封しないものとする。メチオニンは通常疎水性アミノ酸とみなさないが、特定位置で取り込まれると、クチナーゼ分子表面の疎水性増加に効果的に作用し得る。場合によっては、疎水性アミノ酸の他に帯電アミノ酸を導入して酵素の凝集を回避することが有益であることが知見されている。驚くべきことに、リシンやアルギニンのような陽電荷アミノ酸はクチナーゼ分子の特定位置に取り込まれると、疎水性表面積を拡大し得ることも判明した。これは、リシンやアルギニンに存在するメチレン基がクチナーゼ分子内に埋封されない位置に制限されるからである。リシン又はアルギニンを使用する利点は、メチレン基が露出して、脂質層と相互作用し得る可能性がアミノ基又はイミド基により増大することである。リシンやアルギニンは通常、疎水性アミノ酸とはみなされない。しかしながら、これらの残基の側鎖を形成する原子は、脂質層と相互作用し得る多数の疎水性原子を（メチレン部分中に）含んでいる。実際、リシン残基の疎水性部分の寸法は、バリン残基の寸法に匹敵し得る。クチナーゼの他の固有特性は陽電荷の導入により悪影響を受けるが、これは、脂質層と相互作用するクチナーゼ分子の部分の表面又はこの部分に近い表面に相殺（compensating）陰電荷を導入するか又は前記表面で陽電荷を欠失させることにより相殺され得る。活性部位周辺のＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ表面の疎水性を検査すると、疎水性が最適でないことが分かる。この領域内のこの特定アミノ酸を改良するために、残基をより嵩高い疎水性残基で置換すべきである。脂質分解酵素の構造と機能との関係を更に理解するために、このような幾つかの酵素の三次元（３Ｄ）構造を入念に研究した。これらの構造が文献に記載されていない場合は、構造を分子モデル化技術により誘導した。Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの３Ｄ構造は、Ｘ線結晶法により確定している（Ｂｒａｄｙ等（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４３，７６７−７７０，Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５１，４９１−４９４，Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ等（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１，１５３２−１５４１）。Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐプロテアーゼ様触媒トリアッド部位に属する活性部位Ｓｅｒ１４４を短いらせん状リッド（残基８５−９１）下に埋封する。活性部位Ｓｅｒが埋封されている構造を以下では、酵素の“クローズド”コンホーメーションと称する。油−水界面での吸着がらせん状リッドの移動と関係すると考えられている。この移動によって、活性部位セリンは露出し、活性部位周辺の疎水性領域が増大する。“オープン”コンホーメーションは、油−水界面で吸着される活性化酵素に相当すると考えられる。真菌Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの“クローズド”形態のＣ α−配位は、ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎのＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋに寄託されている。綿密な計算法を使用して、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの全タンパク質配位（主鎖及び側鎖）を生成した。Ｓ．Ｗｏｄａｋ等（１９８９）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ２，３３５−３４５に記載されている計算法を適用して、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼのおおよその出発モデルを作成した。この方法は、ＳＹＢＹＬ分子モデル化ソフトウエアパッケージ（ＴＲＩＰＯＳａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で実施される。その後、ＢＩＯＳＹＭ分子モデル化ソフトウエアパッケージ（ＢＩＯＳＹＭ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実施されるようなエネルギー最小化（ＥＭ）や分子力学（ＭＤ）技術を適用してモデルを修正した。モデルのＥＭ及びＭＤ処理中に、知識をベースとするアプローチを適用した。可能なエネルギー関数の詳細なエネルギー項（terms）や既知の構造基準について、モデルを同時に最適化した。モデル品質を、水素結合の数や品質、二次構造要素での水素結合パターン、ペプチド単位の配向、主鎖二面角の値、芳香族基の相互作用角及びキャビティー寸法のような基準により評価した。更には、不適切に埋封された電荷、極端に露出した疎水性残基、及びジスルフィド架橋のエネルギー的に好ましくない位置についてモデルを検査した。関係する側鎖ロータマー（rotamers）は、Ｐｏｎｄｅｒ＆Ｒｉｃｈａｒｄｓロータマーライブラリーから選択した（Ｐｏｎｄｅｒ等（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３，７７５−７９１）。このライブラリーからの特定側鎖ロータマーの最終的な選択は、前述したような構造基準の評価を基準とした。ＭＤを使用して、側鎖原子を所定位置にアニーリングした。既知の構造特性との一貫性についてモデル構造を入念に検査し、ＥＭ及びＭＤ計算により構造特性を最適化すると、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの確実な全原子モデルを形成することができる。Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの“オープン”コンホーメーションは、Ｃ₁₀−トリグリセリドがリパーゼの活性部位に結合するＭＤコンピューターシミュレーションを適用して得られた。文献に記載のオープン構造のコンホーメーション特性（Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）３１，１５３２−１５４１）と入念に比較すると、このようにして得られた“オープン”コンホーメーションのコンピューターモデルが本質的に同一であることが判明した。真菌Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼの既知の３Ｄ構造を出発点とし、ＳＹＢＹＬ分子モデル化ソフトウエアパッケージ（ＴＲＩＰＯＳａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のＣＯＭＰＯＳＥＲモジュールで実施されるようなルールベースの比較モデル化技術を適用して、Ｈｕｍｉｃｏｌａｌａｎｇｉｎｏｓａリパーゼの“オープン”及び“クローズド”３Ｄ構造を得た。得られたＨｕｍｉｃｏｌａｌａｎｇｉｎｏｓａリパーゼモデルを、前述したのと同一の計算手順で修正した。真菌Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉリパーゼ及びＨｕｍｉｃｏｌａｌａｎｇｉｎｏｓａリパーゼの三次元（３Ｄ）構造を比較して、基質の酵素上への吸着に関与するリパーゼ分子の部分を同定した。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの既知の３Ｄ構造を出発点とし、ＳＹＢＹＬ分子モデル化ソフトウエアパッケージ（ＴＲＩＰＯＳａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のＣＯＭＰＯＳＥＲモジュールで実施されるようなルールベースの比較モデル化技術を適用して、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ由来のクチナーゼの３Ｄ構造を得た。得られたＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓクチナーゼモデルを、前述したのと同一の計算手順で修正した。予期に反して、以下の表IIに示す脂肪分解酵素の三次元構造から、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの残基１１６−１２０のＣα−原子を介する最小自乗適合（least-square fit）である特定ベクトル（a particular vector which is the least-square fit through the Cα-atoms）を規定できることが観察された。このベクトルは、基質との相互作用が生じる面と殆ど垂直である。起源の異なる数種の脂肪分解酵素の一次配列を比較すると、例えばＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのアミノ酸残基１１６−１２０が機能相同性の程度が高い領域に位置するように思えることが以下の表IIから分かる。脂肪分解酵素のコンセンサス配列Ｇｌｙ−（Ｈｉｓ／Ｔｙｒ）−Ｓｅｒ−Ｘ− Ｇｌｙを使用して整列し比較することができる。従って、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ分子のアミノ酸残基１１６−１２０を介するベクトルを使用して、洗浄中活性の改善されたクチナーゼを得るためにアミノ酸改変すべきクチナーゼ分子の部分を限定した。以下の表IIIは、表IIに示す脂肪分解酵素について隣接するアミノ酸の構造を示す。本発明の一態様により、酵素表面の疎水性が増すようにアミノ酸配列を改変した、洗浄中脂肪分解活性の改善された改変クチナーゼ酵素を提供する。好ましくは脂質接触領域に隣接する酵素の表面の疎水性を増して、広い脂質接触領域を形成した。１個以上のアミノ酸残基を、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン及びヒスチジンからなる群の中から選択されるアミノ酸残基で置換することにより、クチナーゼの表面疎水性を増すことができる。バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが好ましい。表面疎水性を増すだけでなく、１個以上のリシン又はアルギニン残基を導入して１個以上の陽電荷を導入するようにアミノ酸配列を改変することが有利であることが知見された。改変残基が、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの残基１１６−１２０のＣα−原子又は異なるクチナーゼの対応するＣα−原子を介する最小自乗適合であるベクトルと、該ベクトルに垂直で、残基１１７のＣα−原子又は異なるクチナーゼの対応するＣα−原子を含んでいる面によって規定される分子部分に位置することが好ましい。前述したように、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼの三次元構造は文献に記載されている。この場合、どの改変が本発明の範囲内の改変となるかは明白である。特定クチナーゼの三次元構造が判明していない場合には、脂肪分解酵素のコンセンサス配列Ｇｌｙ−（Ｈｉｓ／Ｔｙｒ）−Ｓｅｒ −Ｘ−Ｇｌｙによって誘導される既知配列のアミノ酸配列（図１２参照）の整列比較によって、本発明の範囲内で適切な改変を行うことが可能である。このプロセスでも分子モデル化技術を使用することが好ましい。本発明に従って産生したクチナーゼ変異体は、洗剤又は洗浄組成物の一部分として使用すると酵素活性で利点を示し得る。特に、前記クチナーゼ変異体は、洗濯プロセスの主サイクル中に改善された洗濯中性能を示すことが判明した。洗濯プロセスの主サイクル中の洗濯中性能とは、酵素を含む洗剤組成物が、濃度、水の硬度、温度に関しては通常の洗濯条件を用い、ヨーロッパタイプの自動洗濯機により、１回の洗濯プロセスで汚れた織物からかなりの量の油汚れを除去できることを意味する。市販されている従来の脂肪分解酵素Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ製）は、同一の条件下で油汚れに対して有意な洗濯中作用を示すとは思えないことに留意すべきである。酵素の油汚れへの洗濯中作用は、以下のアッセイを用いて評価することができる。綿含量が１０％未満の新しいポリエステル試験布を以下に示すような酵素非含有洗剤製品を用いて予洗し、その後十分に濯ぐ。次いで、このような汚れていない布にオリーブ油又は他の適切な加水分解可能な油しみをつける。各試験布（重量約１ｇ）を１００ｍｌのポリスチレンビン内の３０ｍｌの洗液でインキュベートする。洗液は以下に示す洗剤製品を１ｇ／ｌ含んでいる。通常の３０℃主洗濯プログラムを用い、水を一杯に入れたＭｉｅｌｅＴＭＴ洗濯機でビンを３０分間撹拌する。予め３ＬＵ／ｍｌのクチナーゼ変異体を洗液に添加する。対照は酵素を含んでいない。粉末洗剤の組成を以下に示す（重量％）：エトキシル化アルコール非イオン界面活性剤 9.5 硫酸ナトリウム 38.6 炭酸ナトリウム 40.4 ケイ酸ナトリウム（Na₂O：Si₂O=2.4） 7.3 水 4.2 非イオン界面活性剤としては、Ｃ₁₂−Ｃ₁₅エトキシル化アルコール１０．５− １３ＥＯを使用したが、エトキシル化アルコール非イオン界面活性剤の種類は広範囲で変動し得る。洗濯した後に、布を冷水で十分に濯ぎ、冷風式回転乾燥機で乾燥し、残留脂肪量を評価する。これは幾つかの方法で実施することができる。通常の方法は、試験布をＳｏｘｈｌｅｔ抽出装置中、石油エーテルで抽出し、溶媒を留去してから計量し、布の最初の脂肪量の分数としての残留脂肪分パーセンテージを決定することである。更に高感度の第２の方法では、臭素化オリーブ油を用いて、試験布を汚す（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｓ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ａ．及びＡｒｋｌａｙ，Ｔ．Ｈ．（１９６８），ＴｅｘｔｉｌｅＲｅｓｅａｒｃｈＪｏｕｒｎａｌ３８，１０５−１０７）。次いで、各試験布を１００ｍｌのポリスチレンビン内の３０ｍｌの洗液でインキュベートする。次いで、通常の３０℃主洗濯プログラムを用い、水を一杯に入れた洗濯機で一連のビンを撹拌する。主洗濯の後、試験布を冷水中で５秒間入念に濯ぐ。濯いだ直後に試験布を冷風式乾燥機で乾燥する。乾燥後、Ｘ線蛍光スペクトル分析で布の臭素含量を測定して脂肪残量を決定することができる。脂肪除去は、以下のように試験布に最初に存在していた量のパーセンテージとして決定することができる。前記式中、臭素_bwは洗濯前の布上の臭素パーセンテージを示し、臭素_awは洗濯後の臭素パーセンテージを示す。酵素活性の別の評価方法は、標準的な技術に従って４６０ｎｍで反射率を測定することからなる。本発明では、改変、突然変異もしくは突然変異体酵素、又は酵素変異体は、突然変異体遺伝子を発現している突然変異微生物によって産生された酵素を意味する。（サイレント突然変異のみを含むもの以外の）突然変異体遺伝子は、直接的又は間接的に誘導され、１カ所以上の場所で対応する親酵素の配列と異なるアミノ酸配列を有する酵素をコードする遺伝子を意味する。親酵素とは、対応する未変化遺伝子の遺伝子産物を意味する。遺伝子のサイレント突然変異とは、遺伝子のポリヌクレオチド配列で生じる変化又は相違のうち、（コドン−アミノ酸関係での縮重（redundancy）のために）前記遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列が変化しない場合を意味する。突然変異体又は突然変異微生物とは、酵素に対する遺伝子が突然変異を起こした親微生物又はその子孫である微生物を意味する。微生物のこのような突然変異は、（ａ）既に親微生物に存在している対応遺伝子（親遺伝子）を突然変異させるか、又は（ｂ）他の起源から直接又は間接的に得た対応遺伝子を突然変異微生物となるべき微生物に移入（導入）する（例えば遺伝子を突然変異させる）ことにより実施され得る。宿主微生物は、その突然変異体遺伝子又は他の起源の移入遺伝子が一部分を構成している微生物である。一般に、宿主微生物は、株又は種源又は血統が親微生物と同一であっても異なってもよい。本発明は特に、ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号（ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓＳｙｓｔｅｍｓ）に開示されているＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ、またＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ由来のクチナーゼの突然変異体形態を提供する。これらのクチナーゼ変異体は、ｒＤＮＡ技術で得た又は製造した遺伝子を含むｒＤＮＡ改変微生物により産生され得る。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの残基１１６−１２０のＣα−原子又は異なるクチナーゼの対応するＣα−原子を介する最小自乗適合であるベクトルと、該ベクトルに垂直で、残基１１７のＣα−原子又は異なるクチナーゼの対応するＣα−原子を含んでいる面とによって規定される分子部分に位置するアミノ酸残基が同定されると、同定した１つ以上の位置に適切なアミノ酸を導入することにより、例えばＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ又はその相同体の配列に関する突然変異Ｎ７１２Ｋのように、アミノ酸配列を改変することができる。当業者には自明の通り、このような改変はクチナーゼの構造に影響する。明らかに、活性部位周辺の静電荷にそれほど影響しない改変が好ましい。本発明者らは酵素のコンホーメーションの不可避的な歪みと酵素活性増加の利点とのバランスの必要レベルの理解を深めた。これにより、高い成功率で有望なクチナーゼ変異体を予測して、製造することができる。以下の表IVや明細書の他の箇所では、ペプチド配列のアミノ酸やアミノ酸残基を以下に示す１文字及び３文字の略字で示す。表IV Ａ＝Ａｌａ＝アラニンＶ＝Ｖａｌ＝バリンＬ＝Ｌｅｕ＝ロイシンＩ＝Ｉｌｅ＝イソロイシンＰ＝Ｐｒｏ＝プロリンＦ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニンＷ＝Ｔｒｐ＝トリプトファンＭ＝Ｍｅｔ＝メチオニンＧ＝Ｇｌｙ＝グリシンＳ＝Ｓｅｒ＝セリンＴ＝Ｔｈｒ＝トレオニンＣ＝Ｃｙｓ＝システインＹ＝Ｔｙｒ＝チロシンＮ＝Ａｓｎ＝アスパラギンＱ＝Ｇｌｎ＝グルタミンＤ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシンＲ＝Ａｒｇ＝アルギニンＨ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン本明細書では、タンパク質のアミノ酸配列に存在する突然変異、従って突然変異体タンパク質自体は、突然変異の位置及び種類により以下の略記法で、即ち突然変異を受けた元のアミノ酸残基のアイデンティティー、突然変異の（配列番号による）部位、及び元のアミノ酸残基にとって代わるアミノ酸残基のアイデンティティーにより記載され得る。余分のアミノ酸が配列に挿入されると、その位置は、正規の配列又は基準配列の挿入直前の残基の番号に１個以上の下付き文字を付けて示す。例えば、１７２位のアスパラギンがリシンで置換されたことを特徴とする突然変異体はＡｓｎ１７２Ｌｙｓ又はＮ１７２Ｋで表す。（仮に）アスパラギンの後にプロリンのような別のアミノ酸残基を挿入すると、Ａｓｎ１７２ＡｓｎＰｒｏ又はＮ１７２ＮＰで表すか、１７２ａ位を示す挿入残基を用いて＊１７２ａＰとして表す。（仮に）同じ位置でアスパラギンが欠失すると、Ａｓｎ１７２＊又はＮ１７２＊で表す。＊は、実際の欠失によって存在しないとみなされる場合は欠失を意味し、この位置に残基を有する他の配列又は基準配列との単なる比較又は相同性によって存在しないとみなされる場合はアミノ酸残基の不在を意味する。複数の突然変異は＋記号で分けて表す。例えばＮ１７２Ｋ＋Ｓ５４Ｉ＋Ａ１２８Ｆは、アミノ酸配列の前記３つの位置の各々で前述したような置換による３つの突然変異を有する突然変異体タンパク質を表す。所望とあれば、以下の表に示す突然変異を組み合わせてもよい。以下の表Ｖは、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来のクチナーゼの配列に基づく本発明のクチナーゼ変異体の特定の有用な例を示している。本発明の好ましい変異体は、ＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのＡ８５Ｆ、Ｎ１７２Ｋ及びＥ２０１Ｋ、並びに他のクチナーゼの対応変異体である。このような対応クチナーゼ変異体の一例は、例えばＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓクチナーゼに由来するＡｓｐ１７２Ｌｙｓ、即ちＤ１７２Ｋ変異体である。本発明の別の態様によれば、本発明のクチナーゼ変異体の産生方法を提供する。天然クチナーゼを産生する微生物は通常植物病原体であり、これらの微生物は改変クチナーゼ遺伝子用宿主細胞としての作用にはあまり適さない。従って、ｒＤＮＡ法のために好ましい宿主微生物内に移入することのできるｒＤＮＡベクターに、改変（プロ）クチナーゼをコードする遺伝子を取り込んだ。このため、ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号に記載のｒＤＮＡベクターと本質的に同様のｒＤＮＡベクターを使用することができる。天然クチナーゼを産生する微生物は、発酵法にはあまり適さない。発酵法の収率を改善するため、改良されたクチナーゼをコードする遺伝子を、安い培地で急速増殖し得、また多量のクチナーゼの合成や分泌が可能な微生物に移入すべきである。本発明のこのような適したｒＤＮＡ改変（宿主微生物）は、細菌（とりわけＢａｃｉｌｌｉ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）又は下等な真核生物（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び関連種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ及び関連種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及び関連種、並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種）である。好ましい宿主微生物は下等な真核生物である。何故ならば、これらの微生物は、発酵法で非常によく酵素を産生分泌し、クチナーゼ分子を解糖し得るからである。グリコシル化は、洗浄系でのクチナーゼの安定性に寄与し得る。本発明は更に、改変真核生物クチナーゼ遺伝子（例えばＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ由来の遺伝子）をクローニングｒＤＮＡベクターに導入して得られる遺伝子材料、及び新しい宿主細胞の形質転換やクチナーゼ変異体遺伝子の新しい宿主細胞での発現のための前記遺伝子材料の使用を提供する。前記クチナーゼ変異体をコードするｒＤＮＡ技術によって製造又は改変されるポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むｒＤＮＡベクター、並びに前記ポリヌクレオチド及び／又は前記ｒＤＮＡベクターを含むｒＤＮＡ改変微生物も本発明で提供する。本発明は更に、改変真核生物クチナーゼをコードする対応ポリヌクレオチド（例えば成熟クチナーゼ変異体をコードする塩基配列を有し、最終翻訳コドンの次に終結コドンが来るポリヌクレオチドであるが、場合によっては成熟クチナーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列のすぐ上流にこのクチナーゼ変異体のプレプロ又はプロ配列をコードするヌクレオチド配列を有する）を提供する。このようなポリヌクレオチドでは、産生源の微生物から誘導される、クチナーゼをコードするヌクレオチド配列を、少なくとも１個のコドン、好ましくはできるだけ多くのコドンが‘サイレント’突然変異の対象に対し、新しい宿主に好まれるコドンである、同等のアミノ酸残基をコードするコドンを形成するように改変することにより、前記宿主の細胞内での使用時に、安定性の改善された導入遺伝子用ｍＲＮＡを提供することができる。プロ又は成熟クチナーゼをコードするヌクレオチド配列の上流には、特定宿主に適したシグナル又は分泌配列をコードするヌクレオチド配列が位置し得る。従って、本発明の一実施態様は、クチナーゼ変異体又はその前駆体をコードするヌクレオチド配列が内部に挿入されたｒＤＮＡベクターに関する。ヌクレオチド配列は例えば、以下の配列から誘導され得る：（ａ）（例えばＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉで産生したプロプレ又はプロクチナーゼの元のアミノ酸配列をコードする）天然ヌクレオチド配列；（ｂ）新しい宿主に好まれるコドンと、新しい宿主で安定なメッセンジャーＲＮＡを生じさせるヌクレオチド配列とからなり、依然として元のアミノ酸配列をコードする化学合成ヌクレオチド配列；（ｃ）アミノ酸配列は異なるが、洗剤系で優れた安定性及び／又は活性を示す、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼをコードする前項ａ又はｂに記載したヌクレオチド配列の一方に由来する遺伝子工学的に作成されたヌクレオチド配列。要するに、好ましい宿主のひとつで前述したようなクチナーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列の発現を指令し得るｒＤＮＡベクターは好ましくは、以下の成分を含んでなる：（ａ）成熟クチナーゼ、又はプレクチナーゼ、又は（選択される宿主細胞にとって好ましい）分泌シグナルのすぐ下流でプレ配列の少なくとも一部分が除去された対応プレクチナーゼをコードする二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ。但し、翻訳されるべき遺伝子の部分がコドンＡＴＧで開始していない場合、ＡＴＧコドンを前に置くべきである。また、遺伝子の翻訳部分は常に適切な終結コドンで終了すべきである；（ｂ）クチナーゼをコードするｄｓＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の上流に位置する、（選択される宿主微生物に適した）発現レギュロン；（ｃ）クチナーゼをコードするｄｓＤＮＡ（成分（ａ））のプラス鎖の下流に位置する、（選択される宿主微生物に適した）ターミネーター配列；（ｄ１）選択される宿主のゲノム内へのｄｓＤＮＡの組み込みを容易にするヌクレオチド配列、又は（ｄ２）選択される宿主で適した複製起点；（ｅ１）場合によっては（栄養要求性）選択マーカー。栄養要求性マーカーは、栄養要求性マーカーのコード領域と欠陥プロモーターとからなり得る；（ｅ２）場合によっては、選択される宿主での一前駆体形態のクチナーゼの成熟及び／又は分泌に関与するタンパク質をコードするｄｓＤＮＡ配列。このようなｒＤＮＡベクターは更に、前述したようなポリヌクレオチドの上流及び／又は下流に、クチナーゼの機能発現を容易にする別の配列を有し得る。栄養要求性マーカーは、栄養要求性マーカーのコード領域と、欠陥プロモーター領域とからなり得る。本発明の他の実施態様は、前述の種々のクチナーゼ変異体の一種の発酵による産生である。このような発酵は、通常のバッチ発酵であっても、フェドバッチ（ fed-batch）発酵であっても、連続発酵であってもよい。使用すべき方法の選択は、宿主株や（公知の）好ましい下流処理（down stream processing）法に依存する。従って、本発明は更に、本明細書に記載するようなクチナーゼ変異体の産生方法を提供し、本方法は、クチナーゼのアミノ酸配列に作用する少なくとも１つの突然変異をもたらすｒＤＮＡ技術により製造した遺伝子を含むｒＤＮＡ改変微生物を発酵培養して、クチナーゼの活性を対応する親酵素と比べて改善し、微生物により産生されたクチナーゼを発酵ブロスと分離するか又は微生物細胞を発酵ブロスと分離することによりクチナーゼ変異体調製物を製造し、分離した細胞を破壊し、物理的又は化学的な濃縮又は精製法により前記ブロスから又は前記細胞からクチナーゼ変異体を濃縮又は部分精製する段階からなる。クチナーゼ変異体が微生物によって発酵ブロス内に分泌され、酵素が濾過又は遠心分離による細胞除去後にブロスから回収されるような条件を選択することが好ましい。場合によっては、次いで、クチナーゼ変異体を所望の程度に濃縮、精製することができる。これらの発酵法自体は微生物の特殊性を除けば、既知の発酵技術や、通常使用されている発酵／下流処理装置を基本とし得る。ｒＤＮＡ技術によりクチナーゼ変異体を産生し得る改変微生物の産生方法を更に本発明で提供する。本方法は、微生物内に導入されるクチナーゼ変異体をコードする遺伝子が５’末端で、宿主微生物のシグナル又は分泌配列として機能的な（改変）プレ配列をコードする遺伝子断片と融合することを特徴とする。本発明の別の態様では、クチナーゼ変異体遺伝子を含み、該遺伝子によってコードされるクチナーゼ変異体を産生し得るｒＤＮＡ改変微生物を提供する。ｒＤＮＡ改変微生物では、天然クチナーゼをコードする遺伝子が元々存在するならば、これを除去（例えば他の構造遺伝子で置換）することが好ましい。本発明の別の態様では、本発明のクチナーゼ変異体を含む酵素洗剤組成物を提供する。このような組成物は、クチナーゼ変異体及び通常洗剤系で使用されている他の成分（例えば洗剤組成物用添加剤、全配合洗剤及び例えばヨーロッパ特許出願公開第２５８０６８号に記載されいている既知の種類の洗浄組成物の成分類）を組み合わせたものである。特に、前記組成物は、５〜６０重量％、好ましくは２０〜５０重量％の洗浄力ビルダーと、０．１〜５０重量％の活性剤系とを含んでなり得る。活性剤系は、１種以上のアニオン界面活性剤を０〜９５重量％、１種以上の非イオン界面活性剤を５〜１００重量％含んでなる。このような洗剤組成物の他の成分は、例えば英国特許出願公開第１３７２０３４号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、米国特許第３９５０２７７号、米国特許第４０１１１６９号、ヨーロッパ特許出願公開第１７９５３３号（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ）、ヨーロッパ特許出願公開第２０５２０８号及びヨーロッパ特許出願公開第２０６３９０号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、特開昭６３− ０７８０００号（１９８８）、１９８８年６月の調査レポート（Research Discl osure）２９０５６号や、本明細書で引用した幾つかの明細書の各々に記載されているような多数の既知の種類のいずれであってもよい。前記特許出願明細書は全て、参考として本明細書に組み入れる。本発明のクチナーゼ変異体は、任意の適切な形態で、即ち酵素の顆粒組成物、溶液もしくはスラリーの形態で、又は担体材料（例えばヨーロッパ特許出願公開第２５８０６８号に記載の材料や、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ製Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）及びＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標））と共に洗剤組成物に有効に添加することができる。クチナーゼ変異体の添加量は、洗剤組成物１ｇ当たり例えば１０〜２０，０００ＬＵ、好ましくは５０〜２，０００ＬＵと広範囲で選択することができる。本明細書でのＬＵ、即ちリパーゼ単位は、ヨーロッパ特許出願公開第２５８０６８号（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）で定義されている通りである。更に存在し得る他の酵素の場合も同様の規定を準用する。ヨーロッパ特許出願公開第４０７２２５号も参照されたい。ｐＩが１０未満のプロテアーゼを選択し、このプロテアーゼをクチナーゼと共に前記洗剤組成物に存在させると有利であり得る。ヨーロッパ特許出願公開第２７１１５４号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）は、このようなプロテアーゼを多数記載している。クチナーゼ変異体と共に使用されるプロテアーゼは、場合によっては、例えばＢＰＮ’型又は文献に開示されている多数の型のサブチリシンを包含し得る。これらのうち数種は既に、例えばヨーロッパ特許出願公開第１３０７５６号又はヨーロッパ特許出願公開第２５１４４６号（共にＧｅｎｅｎｔｅｃｈ）；米国特許第４７６００２５号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ヨーロッパ特許出願公開第２１４４３５号（Ｈｅｎｋｅｌ）；ＷＯ−Ａ−８７／０４６６１号（Ａｍｇｅｎ）；ＷＯ−Ａ−８７／０５０５０（Ｇｅｎｅｘ）；Ｔｈｏｍａｓ等（１９８６／５）Ｎａｔｕｒｅ３１６，３７５−３７６及び（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３，８０３−８１３；Ｒｕｓｓｅｌ等（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２８，４９６−５００に記載の突然変異体プロテアーゼのように洗剤用途で提案されている。以下の実施例で本発明を更に詳しく説明する。核酸物質の遺伝子操作や分析で使用した全ての技術は、特に明記しない限り本質的にＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）が記載した方法で実施した。添付図面の説明：図１Ａ：合成Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子のカセット１及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。オリゴヌクレオチドトランジションをカセット配列に示す。小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。図１Ｂ：合成Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子のカセット２及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。オリゴヌクレオチドトランジションをカセット配列に示す。図１Ｃ：合成Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子のカセット３及び構成するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列。オリゴヌクレオチドトランジションをカセット配列に示す。小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。図１Ｄ：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼをコードする合成クチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。クチナーゼのプレ配列、プロ配列及び成熟配列を示す。クローニングやオリゴヌクレオチドトランジションに使用する部位も示す。小文字は読み取り枠外のヌクレオチド位置を示す。図２：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプロクチナーゼをコードする配列を、Ｅ．ｃｏｌｉｐｈｏＡプレ配列の誘導体をコードする配列と連結するための合成ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。クローニングで使用する制限酵素部位やリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）を示す。コードされたｐｈｏＡシグナル配列やクチナーゼ遺伝子の一部のアミノ酸配列も１文字コードで示す。図３：インベルターゼプレ配列及び成熟Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのコード配列の融合点をコードするカセット８、ＳａｃＩ−ＢｃｌＩ断片のヌクレオチド配列。図４：ｐＵＲ２７４０由来の０．２ｋｂＳａｌＩ−ＮｒｕＩの欠失によって得られたプラスミドｐＵＲ２７４１は、ｐＢＲ３２２の一部と、２μｍプラスミドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子と、酵母ｇａ１７プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領域と植物α−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合物とを含んでなるＥ．ｃｏｌｉ−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクターである。図５：プラスミドｐＵＲ７２１９は、ｐＢＲ３２２の一部と、２μｍプラスミドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子と、酵母ｇａ１７プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領域と成熟Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼをコードする領域との融合物とを含んでなるＥ．ｃｏｌｉ−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクターである。図６：プラスミドｐＵＲ２７４０は、ｐＢＲ３２２の一部と、２μｍプラスミドから誘導される酵母細胞における複製起点と、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子と、酵母ｇａ１７プロモーターの制御下にある酵母インベルターゼシグナル配列コード領域と植物α−ガラクトシダーゼ遺伝子との融合物とを含んでなるＥ．ｃｏｌｉ− Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクターである。図７：ｅｘｌＡプレ配列及び成熟Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのコード配列の結合の型が異なるカセット５、６及び７のヌクレオチド配列。図８：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉゲノムＤＮＡの５．３ｋｂＳａｌＩ断片をｐＵＣ１９のＳａｌＩ部位に挿入して得られたプラスミドｐＡＷ１４Ｂ。図９：ｐＡＷ１４ＢのｅｘｌＡ読み取り枠を含むＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片を、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼコード配列を含むＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片で置換して得られたプラスミドｐＵＲ７２８０。従って、プラスミドｐＵＲ７２８０は、Ａ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉプロモータ及びターミネーターの制御下にあるＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼ遺伝子を含んでいる。図１０：Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓａｍｄＳ及びＡ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉｐｙｒＧの両方の選択マーカーをｐＵＲ７２８０に導入して得られたプラスミドｐＵＲ７２８１。図１１：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ分子の概略図。図１２：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｄｅｓ、及びＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ由来のクチナーゼの部分アミノ酸配列であって、残基の位置を３Ｄ構造で示す。図１３：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ及びクチナーゼ変異体Ｎ１７２Ｋの洗濯中作用。図１４：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ及びクチナーゼ変異体Ｅ２０１Ｋの洗濯中作用。図１５：Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ及びクチナーゼ変異体Ａ８５Ｆの洗濯中作用。参考文献実施例１Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼをコードする合成遺伝子の構築本質的にヨーロッパ特許出願公開第４０７２２５号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に記載の方法に従って、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ− クチナーゼをコードする合成遺伝子を構築した。発表されているＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて（Ｓｏｌｉｄａｙ等（１９８４）及びＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号，ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ− プロ−クチナーゼポリペプチドをコードする領域を含む完全合成ＤＮＡ断片を設計した。この合成クチナーゼ遺伝子は、元のＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ遺伝子のヌクレオチド配列に比べて幾つかのヌクレオチド変化を含み、これにより制限酵素認識部位が、コードされたアミノ酸配列に影響することなく遺伝子内の好都合な位置に導入されている。全合成クチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図１Ｄに示す。合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドから開始する３個の異なるカセットを集合させて合成クチナーゼ遺伝子を構築した。各合成ＤＮＡカセットは、最初にＥｃｏＲＩ部位を、最後にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えている。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０ＡＤＮＡ合成機を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。各カセットを構築するため、以下に示す手順を用いた。所定のカセットを構成する等モル量（５０ｐｍｏｌ）のオリゴヌクレオチドを標準的な技術に従って混合し、５’末端でリン酸化し、アニールし、結合した。得られた二本鎖ＤＮＡ分子の混合物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動でサイズ分画し、電気溶出でゲルから回収した。得られた合成ＤＮＡカセットをｐＵＣ９の２．７ｋｂＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と結合し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉに形質転換した。適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて幾つかのクローンのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩインサートを両方向で完全に配列決定し、合成カセットの配列を確定した。この手順を用いて、ｐＵＲ７２０７（カセット１を含む、図１Ａ）、ｐＵＲ７２０８（カセット２を含む、図１Ｂ）及びｐＵＲ７２０９（カセット３を含む、図１Ｃ）を構築した。最後に、ｐＵＲ７２０７の２．９ｋｂＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片をｐＵＲ７２０８の０．２ｋｂＡｐａＩ−ＮｈｅＩ断片及びｐＵＲ７２０９の０．３ｋｂＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と結合させて、合成クチナーゼ遺伝子を作成し、ｐＵＲ７２１０を得た。このプラスミドは、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉの完全プレ−プロ−クチナーゼをコードする読み取り枠を含んでいる（図１Ｄ）。実施例２ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ（プロ）クチナーゼの発現合成クチナーゼ遺伝子を用いて、ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号（ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）に記載のものと機能的に同様のＥ．ｃｏｌｉ用発現ベクターを構築した。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプロクチナーゼをコードする合成遺伝子の部分の前に、適切なＥ．ｃｏｌｉ発現シグナル、即ち（ｉ）誘導性プロモーター、（ii）リボソーム結合部位、及び（iii ）翻訳開始コドンを提供し、またプロクチナーゼの細胞質膜からの送出に必要な情報を提供するシグナル配列が位置する構築物を設計した。Ｅ．ｃｏｌｉｐｈｏＡシグナル配列の誘導体（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ等、１９８３）を合成クチナーゼ遺伝子のプロ配列と融合するための合成リンカーを設計した（図２参照）。シグナルペプチドの開裂やプロクチナーゼの分泌を最適化するため、このリンカーのヌクレオチド配列は、ｐｈｏＡシグナル配列の３個のＣ末端アミノ酸残基（Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ）をＡｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａに変換し、クチナーゼプロ配列のＮ末端アミノ酸残基（Ｌｅｕ１、図１Ｄ参照）をＡｌａに変換するようなものであった。この構築により、クチナーゼのペリプラスム間隙内への分泌は確実である（ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６号参照、ＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）。このような構築物を得るため、クチナーゼプレ配列とプロ配列の一部を含む６９ｂｐＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片をｐＵＲ７２１０から取り出し、Ｅ．ｃｏｌｉｐｈｏＡプレ配列の誘導体及びクチナーゼプロ配列の改変Ｎ末端アミノ酸残基を提供する合成ＤＮＡリンカー配列（ＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片）で置換した（図２）。得られたプラスミドをｐＵＲ７２５０と名付け、これを使用して、リボソーム結合部位及びｐｈｏＡシグナル配列コード領域に融合したプロクチナーゼコード領域を含む０．７ｋｂＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離した。この断片をｐＭＭＢ６７ＥＨの８．９ｋｂＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｆｕｒｓｔｅ等、１９８６）と結合して、ｐＵＲ７２２０を得た。このプラスミドでは、プロクチナーゼをコードする合成遺伝子をｐｈｏＡシグナル配列の変種と融合して、誘導性ｔａｃプロモーターの制御下に置く。ｐＵＲ７２２０を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６を、０．０１７ＭＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０１７ＭＫ₂ＨＰＯ₄ １２ｇ／ｌバクト−トリプトン２４ｇ／ｌバクト−酵母抽出物０．４％グリセロール（ｖ／ｖ）からなる０．５リットルのＩＸＴＢ培地（Ｔａｒｔｏｆ及びＨｏｂｂｓ，１９８８）を含む２リットルの振盪フラスコで増殖させた。培養物を強く振盪しながら（１５０ｒｐｍ）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下、２５°Ｃ〜３０℃で一晩増殖させた。６１０ｎｍでのＯＤは１０〜１２であった。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して、最終濃度を１０μＭとし、更に１２〜１６時間インキュベーションを継続した。培養物から取り出した試料の分析判定で、生じた脂肪分解活性の量に更なる顕著な増加が観察できなかったときには、細胞を遠心分離で収集し、最初の培養容量の２０％スクロース含有緩衝液に０℃で再度懸濁させた。細胞を遠心分離で収集し、最初の培養容量の氷冷水に再度懸濁させると、浸透圧ショックで細胞が溶解した。細胞破片を遠心分離で除去し、無細胞抽出物に酢酸を添加してｐＨ４．８に酸性化し、４℃で一晩放置し、得られた沈殿物を除去した。この段階で、無細胞抽出物の超濾過／凍結乾燥により、殆ど内在性リパーゼを含まない純度７５％以上のクチナーゼ調製物が得られた。あるいは、ＳＰ−ｓｅｐｈａｄｅｘ上に酸性化無細胞抽出物を負荷し、酵素をｐＨ８．０の緩衝液で溶出し、濃アルカリ性溶液を適量のＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＷｈａｔｍａｎＤＥ−５２）に通し、ＤＥＡＥ通過液を直接Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに通すことによって、クチナーゼを均質になるまで精製（純度９５％以上）することができる。塩勾配で溶出すると、典型的には７５％以上の総収率で、均一なクチナーゼ調製物が得られた。実施例３Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体をコードする遺伝子の構築実施例１に記載のＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼの合成遺伝子を使用して、コード化したアミノ酸配列に変化を含む変異体遺伝子を構築した。この構築では、完全合成クチナーゼ遺伝子を構成する３個のカセットの構築について実施例１で説明したのと本質的に同じ方法を適用した。例えば、突然変異を起こすべき位置、即ちＡｓｎ１７２のコード化トリプレットをカバーする２個のオリゴを除いて、実施例１に記載したのと同じオリゴヌクレオチドを用いて新種のカセット３を作成して、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ｎ１７２Ｋをコードする遺伝子を構築した。代わりには、２個の新しい合成オリゴを使用した。これらのオリゴは、変異体配列を含んでいるが、これ以外は置換前のオリゴと同一である。特に、ＣＵＴＩ３ＤＭＨ及びＣＵＴＩ３ＫＭＨの代わりにそれぞれＣＵＴＩ３ＤＭＨ変異体（ＡＡＴの代わりにＡＡＧを含む）及びＣＵＴＩ３ＫＭＨ変異体（ＡＴＴの代わりにＣＴＴを含む）を取り込んで、変異Ｎ１７２Ｋを含む新しいカセット３を作成した（図１Ｃ参照）。本質的に実施例１に記載した方法で新しいカセット３をクローニングして配列決定し、変異を含む０．３ｋｂＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片をｐＵＲ７２１０の対応断片と置換してｐＵＲ７２５７（Ｎ１７２Ｋ）を得た。このプラスミドに由来する０．６ｋｂＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用して、ｐＵＲ７２２０の対応断片を置換し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＵＲ７２２４（Ｎ１７２Ｋ）を得た。このＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＷＫ６に形質転換した。形質転換細胞を実施例２に記載した方法で増殖させ、変異体プロクチナーゼ酵素を本質的に実施例２に記載した方法で回収し、精製した。ＣＵＴＩ３ＦＭＨ及びＣＵＴＩ３ＭＭＨ（図１Ｃ参照）の代わりにそれぞれＣＵＴＩ３ＦＭＨ変異体（ＧＡＧの代わりにＡＡＧを含む）及びＣＵＴＩ３ＭＭＨ変異体（ＣＴＣの代わりにＣＴＴを含む）を取り込む新種のカセット３を作成することにより、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ｅ２０１Ｋをコードする遺伝子を同様に構築した。ＣＵＴＩ２ＣＭＨ及びＣＵＴＩ２ＩＭＨ（図１Ｂ参照）の代わりにそれぞれＣＵＴＩ２ＣＭＨ変異体（ＧＣＴの代わりにＴＴＣを含む）及びＣＵＴＩ２ＩＭＨ変異体（ＡＧＣの代わりにＧＡＡを含む）を取り込む新種のカセット２を作成することにより、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ａ８５Ｆをコードする遺伝子を同様に構築した。実施例４ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの発現ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ合成遺伝子の発現のために、成熟クチナーゼをコードする合成遺伝子の前に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼのプレ配列（Ｔａｕｓｓｉｇ及びＣａｒｌｓｓｏｎ，１９８３）及び強い誘導性ｇａｌ７プロモーター（Ｎｏｇｉ及びＦｕｋａｓａｗａ，１９８３）が存在する発現ベクターを構築した。このような融合のための合成クチナーゼ遺伝子を産生するため、インベルターゼプレ配列のコード配列を、成熟クチナーゼのＮ末端のコード配列と融合するアダプター断片を合成した。この断片を、本質的に実施例１に記載したようなｐＵＣ９のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩカセットとして作成して（カセット８、図３参照）、ｐＵＲ７２１７を得た。プラスミドｐＵＲ７２１０及びｐＵＲ７２１７をＥ．ｃｏｌｉＪＭ１１０（ｄａｍメチラーゼ活性の欠失した株）に形質転換し、ｐＵＲ７２１７の２．８ｋｂＢｃｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＲ７２１０の０．６ｋｂＢｃｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に連結することにより、成熟クチナーゼポリペプチドのコード化ヌクレオチド配列がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼプレ配列コード領域の一部と融合したｐＵＲ７２１８を得た。ｐＵＲ２７４０の８．９ｋｂＮｒｕＩ−ＳａｌＩ断片を単離し、ＳａｌＩ突出末端をクレノーポリメラーゼで充填し（fill in）、断片を再度円形にして（r ecircularization）、ｐＵＲ２７４０（Ｖｅｒｂａｋｅｌ，１９９１，図６参照）から発現ベクターｐＵＲ２７４１（図４参照）を誘導した。ｐＵＲ２７４１の７．３ｋｂＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＲ７２１８の０．７ｋｂＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、ｐＵＲ７２１９を得た（図５参照）。場合によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｐｏＩＩＩターミネーターをクチナーゼ遺伝子の後ろのＨｉｎｄＩＩＩ部位に置くことができるが、これはクチナーゼ遺伝子の効果的な発現には重要ではないことが判明した。Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルプラスミドｐＵＲ７２１９は、２μプラスミドを保有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ｃｉｒ⁺株）の複製起点と、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｌｅｕ２^-株での高コピー数形質転換細胞の選択を可能とするプロモーター欠失種のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＬｅｕ２遺伝子と、強い誘導性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｇａｌ７プロモーターの制御下にあってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼプレ配列に操作的に結合したＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの成熟部分をコードする合成遺伝子とを含んでいる。酵母細胞の電気穿孔法の標準的なプロトコルを用いて、株ＹＴ６−２−ｌＬ（Ｅｒｈａｒｔ及びＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，１９８１）と同一のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５０（ａ，ｃｉｒ⁰ ，ｌｅｕ２，ｈｉｓ４，ｃａｎ１）を、２μのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプラスミドとｐＵＲ７２１９との等モル混合物で同時形質転換した。ロイシン原栄養性について形質転換細胞を選択し、幾つかの形質転換細胞から全ＤＮＡを単離した。全ての形質転換細胞は、２μプラスミド及びｐＵＲ７２１９の両方を含むように思え、このことは、ｐＵＲ７２１９上に含まれるプロモーター欠失種のｌｅｕ２遺伝子が、２μ酵母プラスミドと共存するために高いコピー数で存在すると、ｌｅｕ２欠失株を単に機能的に補い得ることを示している。完全培地で４０世代以上培養し、次いで固形の選択及び完全培地でレプリカ平板培養して１個の形質転換細胞をｐＵＲ７２１９について処理（cure）し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５１（ａ，ｃｉｒ⁺，ｌｅｕ２，ｈｉｓ４，ｃａｎ１）を得た。ｐＵＲ７２１９を保有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５１を、 −アミノ酸を含まない酵母窒素塩基（YNB） 6.7g/l -ヒスチジン 20mg/l -グルコース 20g/l からなる０．２リットルのＭＭ培地を含む１リットルの振盪フラスコ内で増殖させた。培養物を強く振盪（１５０ｒｐｍ）しながら３０℃で一晩増殖させた。６１０ｎｍでのＯＤは２〜４であった。細胞を遠心分離により収集し、２リットルの振盪フラスコ内で、 −酵母抽出物 10g/1 −バクトペプトン 20g/1 −ガラクトース 50g/1 からなる１リットルのＹＰＧＡＬ培地に再度懸濁させ、更に１２〜１６時間インキュベーションを継続した。一定の間隔で、試料を培養物から取り出し、遠心分離にかけてバイオマスを除去した。オリーブ油を基質として用い、上清のクチナーゼ活性を滴定法で分析した。各試料に対し、５．０ｍｌのリパーゼ基質（Ｓｉｇｍａ、リパーゼの基質としてオリーブ油を含む）と２５．０ｍｌの緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ９．０，４０ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭＣａＣｌ₂ ）の撹拌混合物に１００〜２００μｌの濾液を添加した。３０℃でアッセイを実施し、ＭｅｔｔｌｅｒＤＬ２５滴定装置を用い、０．０５ＭＮａＯＨによるｐＨ９．０までの自動滴定により脂肪酸の放出を測定した。滴定液量対時間の曲線が得られた。試料中に含まれるリパーゼ活性の量を、この曲線の最大勾配から計算した。１酵素活性単位は、前述の条件下で、１分間でオリーブ油から１μｍｏｌの脂肪酸を放出させる酵素の量として定義する。このような測定法は、当業者には公知である。クチナーゼ活性の発生量が増加しなくなると、細胞を遠心分離にかけて除去し、無細胞抽出物に酢酸を加えてｐＨ４．８に酸性化して、クチナーゼを実施例１に記載した方法で回収した。実施例５Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体の発現Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体Ｎ１７６Ｋを以下の方法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現させた。ｐＵＲ７２５７（Ｎ１７２Ｋ）の０．５ｋｂＡｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を使用してｐＵＲ７２１８の類似断片を置換し、変異を含む遺伝子がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシグナル配列をコードする配列に操作的に融合したｐＵＲ７２２８（Ｎ１７２Ｋ）を得た。ｐＵＲ２７４１の７．０ｋｂＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＲ７２２８（Ｎ１７２Ｋ）の０．７ｋｂＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に連結して、ｐＵＲ７２３４（Ｎ１７２Ｋ）を得た。このプラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５１に形質転換した。得られた形質転換細胞を実施例４に記載した方法でインキュベートし、産生した変異体酵素を実施例４及び１に記載した方法で培養ブロスから回収した。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体Ｅ２０１Ｋを、実施例３に記載したように、クチナーゼ変異体Ｅ２０１ＫをコードするＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の変異体を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで同様に産生した。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体Ａ８５Ｆを、実施例３に記載したように、クチナーゼ変異体Ａ８５ＦをコードするＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の変異体を用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで同様に産生した。実施例６ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの発現Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉでの合成Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の発現のために、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼをコードする合成遺伝子をＡ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉの強い誘導性ｅｘｌＡプロモーター（Ｍａａｔ等，１９９２，ｄｅＧｒａａｆｆ等１９９２）の制御下に置いた発現ベクターを構築した。プラスミドｐＡＷ１４Ｂからプレ−プロ−クチナーゼ発現プラスミド（ｐＵＲ７２８０）を構築した。前記ｐＡＷ１４Ｂは、１９９０年５月３１日にＣＢＳ２３７．９０の番号でＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂａａｒｎ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９で寄託されたものであり、０．７ｋｂのエンドキシラナーゼII （ｅｘｌＡ）遺伝子が２．５ｋｂの５’フランキング配列及び２．０ｋｂの３’ フランキング配列と共に存在する約５．３ｋｂのＳａｌＩ断片を含んでいる（図８）。ｐＡＷ１４Ｂで、ｅｘｌＡコード化領域をプレ−プロ−クチナーゼコード化領域で置換した。ｅｘｌＡ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）を含むＢｓｐＨＩ部位（５’−ＴＣＡＴＧＡ−３’）及びｅｘｌＡ遺伝子の終結コドン（ＴＡＡ）を含むＡｆｌＩＩ部位（５’−ＣＴＴＡＡＧ−３’）は、ｐＵＲ７２８０の構築を容易にした。以下の方法で構築した：ｐＡＷ１４Ｂ（７．９ｋｂ）をＢｓｐＨＩで部分的に切断し、線状化プラスミド（７．９ｋｂ）をアガロースゲルから単離した。その後、単離した７．９ｋｂ断片を、問題のＢｓｐＨＩ部位の数ヌクレオチド下流で切断するＢｓｍＩで切断して、他のＢｓｐＨＩ部位で線状化したプラスミドを除去した。断片をアガロースゲルで分離し、７．９ｋｂＢｓｐＨＩ−ＢｓｍＩ断片を単離した。これをＡｆｌＩＩで部分的に切断し、得られた７．２ｋｂＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片を単離した。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉプレ−プロ−クチナーゼをコードする全読み取り枠を含むｐＵＲ７２１０の０．７ｋｂＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片を、ｐＡＷ１４Ｂの７．２ｋｂＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片と連結して、ｐＵＲ７２８０を得た。その後、構築したベクター（ｐＵＲ７２８０）を従来の同時形質転換技術によりカビ（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉ等）に移植することができ、次いでプレ−プロ−クチナーゼ遺伝子をエンドキシラナーゼIIプロモーターの誘導により発現させることができる。構築したｒＤＮＡベクターは更に、従来の選択マーカー（例えばａｍｄＳ又はｐｙｒＧ、ヒグロマイシン等）を備えていてもよく、またカビを得られたｒＤＮＡベクターで形質転換して、所望のタンパク質を産生してもよい。一例としては、ａｍｄＳ及びｐｙｒＧ選択マーカーを発現ベクターに導入してｐＵＲ７２８１（図１０）を産生した。このため、合成オリゴヌクレオチド（５’−ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）を用いて（プレ−プロ−クチナーゼ遺伝子のＡＴＧコドンの１．２ｋｂ上流に存在する）ＥｃｏＲＩ部位をＮｏｔＩ部位に変換してＮｏｔＩ部位を生成して、ｐＵＲ７２８２を産生した。全Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓａｍｄＳ遺伝子及びＡ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉｐｙｒＧ遺伝子をそれら自体のプロモーターやターミネーターと共に含んでいる適切なＤＮＡ断片は、フランキングＮｏｔＩ部位を備えており、これをｐＵＲ７２８２のＮｏｔＩ部位に導入してｐＵＲ７２８１（図１０）を産生した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉでの合成Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子の代替の発現方法として、成熟クチナーゼをコードする合成遺伝子の前にそれ自体のプレ−プロ配列ではなく、Ａ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉｅｘｌＡのプレ配列が存在する発現ベクターを構築した。このような融合のための合成クチナーゼ遺伝子を産生するために、ｅｘｌＡプレ配列のコード化配列が種々の方法で成熟クチナーゼのＮ末端のコード化配列に結合した数個のアダプター断片を合成した。カセット５では、この結合は、ｅｘｌＡプレ配列をクチナーゼのプロ配列と融合して行う。カセット６では、ｅｘｌＡプレ配列を成熟クチナーゼのＮ末端残基と融合する。カセット７はカセット６と同一であるが、コード化成熟クチナーゼポリペプチドのＮ末端残基を元のグリシンからセリン残基に変えて、シグナルペプチドの開裂要件により適合するようにした。本質的に実施例１に記載したように、カセット５、６及び７を合成オリゴヌクレオチドから作成した（図７参照）。カセット５を使用して、ｐＵＲ７２１０の０．１ｋｂＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片を置換してｐＵＲ７２８７を産生した。カセット６、７を使用して、ｐＵＲ７２１０の０．１ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢｃｌＩ断片を置換し、それぞれｐＵＲ７２８８及びｐＵＲ７２８９を産生した。プラスミドｐＵＲ７２８７、ｐＵＲ７２８８及びｐＵＲ７２８９の各々について、０．７ｋｂＢｓｐＨＩ−ＡｆｌＩＩ断片をｐＡＷ１４Ｂの７．２ｋｂＢｓｐＨＩ −ＡｆｌＩＩ断片と連結して、それぞれｐＵＲ７２９０、ｐＵＲ７２９１及びｐＵＲ７２９２を得た。その後、従来の同時形質転換技術により、構築したｒＤＮＡベクターをカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉ）に移植し、エンドキシラナーゼIIプロモーターの誘導によりプレ−（プロ）−クチナーゼ遺伝子を発現した。本実施例でｐＵＲ７２８０について説明したように（上記参照）、構築したｒＤＮＡベクターは更に、従来の選択マーカー（例えばａｍｄＳ又はｐｙｒＧ、ヒグロマイシン）を備えていてもよく、またカビを得られたｒＤＮＡベクターで形質転換して、所望のタンパク質を産生してもよい。（対応するプロ配列を備えた又は備えていないＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ成熟クチナーゼコード領域と、Ａ．ｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉｅｘｌＡプロモーター及びターミネーターの制御下のクチナーゼシグナル配列又はｅｘｌＡシグナル配列とを含む）発現ベクターｐＵＲ７２８０、ｐＵＲ７２８１、ｐＵＲ７２９０、ｐＵＲ７２９１、ｐＵＲ７２９２の各々で形質転換したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ株を、以下の条件下で増殖させた：４００ｍｌの合成培地（ｐＨ６．５）を含む多数の１リットル振盪フラスコに、胞子（最終濃度：１０Ｅ６／ｍｌ）を接種した。培地組成を以下に示す（ＡＷ培地）：スクロース１０ｇ／ｌＮａＮＯ₃ ６．０ｇ／ｌＫＣｌ０．５２ｇ／ｌＫＨ₂ＰＯ₄ １．５２ｇ／ｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．４９ｇ／ｌ酵母抽出物１．０ｇ／ｌＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２２ｍｇ／ｌＨ₃ＢＯ₃ １１ｍｇ／ｌＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ５ｍｇ／ｌＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ５ｍｇ／ｌＣａＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ１．７ｍｇ／ｌＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ１．６ｍｇ／ｌＮａＨ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ１．５ｍｇ／ｌＮａ₂ＥＤＴＡ５０ｍｇ／ｌＭｋＸインキュベーターシェーカーで、２００ｒｐｍ、３０℃で２４時間インキュベートした。増殖後、細胞を濾過（０．４５μｍフィルター）して収集し、スクロース及び酵母抽出物を含まないＡＷ培地（塩溶液）で２度洗浄し、５０ｍｌの塩溶液に再度懸濁させ、キシロースを添加して１０ｇ／ｌの最終濃度にした５０ｍｌの塩溶液（誘導培地）を含む３００ｍｌの振盪フラスコに移した。上記と同一条件下でのインキュベーションを一晩継続した。得られた培養物をミラクロス（miracloth）で濾過してバイオマスを除去し、クチナーゼを本質的に実施例２に記載した方法で回収した。実施例７ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉでのＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体の発現本質的に実施例６に記載した方法により、但し真菌発現ベクターの構築のためにｐＵＲ７２１０に代わりにプラスミドｐＵＲ７２５７（Ｎ１７２Ｋ）を用いて、変異Ｎ１７２Ｋを含むＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの変異体をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ変異株ａｗａｍｏｒｉで産生した。実施例８Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子に関連する遺伝子の同定及び単離Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼとの相同性の程度が異なるクチナーゼのコード化遺伝子を種々の真菌から単離した。Ｈａｎｋｉｎ及びＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ（１９６８）が記載する培地２００ｍｌに０．２５％グルコースを補充したものを含む５００ｍｌの振盪フラスコで真菌培養物を増殖させ、ＭｋＸインキュベーターシェーカー（１００ｒｐｍ）で、２８℃で４日間インキュベートした。この時点で、グルコースが消費され、本質的にＥｔｔｉｎｇｅｒ等（１９８７）が記載したようにクチン水解物を添加してクチナーゼの産生を誘導した。一定の間隔で試料を培養物から取り出し、標準的な技術に従って（実施例４参照）脂肪分解活性の存在を分析した。通常、誘導から約２日後に、脂肪分解活性を実証することができ、この時点で、標準的な技術を用いて細胞を濾過して収集した。標準的な技術に従って、菌糸を洗浄し、液体窒素中で凍結し、凍結乾燥した。グアニジニウムチオシアネート法を用いて全細胞ＲＮＡ調製物を単離し、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）が記載したように、塩化セシウム密度勾配遠心分離により精製した。ｐｏｌｙＡＴ管（tract）ｍＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｇａ）を用いてｐｏｌｙＡ（＋）ｍＲＮＡ画分を単離した。標準的な技術に従い、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子に由来するｃＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ｐｏｌｙＡ（＋）ｍＲＮＡ画分をノーザンハイブリダイゼーション分析で使用して、クチナーゼ関連遺伝子の発現を検証した。ＺＡＰｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ）を供給業者の指示に従って用いて、プローブとハイブリダイズし得る物質を含むｍＲＮＡ調製物でｃＤＮＡを合成して、ｐｏｌｙ−Ａ領域に隣接しているＸｈｏＩ付着端と、他端にＥｃｏＲＩアダプターを有するｃＤＮＡ断片を得た。得られたｃＤＮＡ断片を用い、λＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ）でのセンス方向のダイレクショナルクローニングにより発現ライブラリーを構築すると、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（Ｈｕｓｅ等、１９８８）を発現することができた。Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼに対する抗血清を用いて、これらのライブラリーをスクリーニングした。あるいは、クチナーゼ特異的プライマー（表２参照）を用いて、合成ｃＤＮＡ画分をＰＣＲスクリーニングにかけた。これらのプライマーは、数種の真菌クチナーゼ遺伝子のアミノ酸配列（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等、１９８７）の比較により得られたものである。ＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼのｃＤＮＡを対照として用いてＰＣＲ反応の条件を、各組のプライマーについて最適化した。同一条件下で、長さがＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ由来のｃＤＮＡで産生されるＰＣＲ断片と同様である（又はそれ以上の）特異的ＰＣＲ断片の産生に使用され得るｃＤＮＡ調製物について、ＰＣＲ断片をゲル電気泳動で精製して、ゲルから単離した。代替の方法としては、クチナーゼ特異的プライマーを用いるＰＣＲスクリーニング技術は更に、ＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉのゲノムＤＮＡを陽性対照として用いることにより、幾つかの真菌株のゲノムＤＮＡに直接適用される。同一条件下で、長さがＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ由来のｃＤＮＡで産生されるＰＣＲ断片と同様である（又はそれ以上の）特異的ＰＣＲ断片の産生に使用され得る真菌ゲノムＤＮＡ調製物について、ＰＣＲ断片をゲル電気泳動で精製して、ゲルから単離した。発現ライブラリー法又は（ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡを用いる）ＰＣＲスクリーニング法で陽性と評価された株や、他の幾つかの株について、高分子量ゲノムＤＮＡを単離した。株を本質的にＥｔｔｉｎｇｅｒ等（１９８７）の記載した方法で増殖させ、ゲノムＤＮＡをＧｒａａｆｆ等（１９８８）が記載した方法で単離した。ゲノムＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、類似ｃＤＮＡインサート（発現ライブラリー法）又はＰＣＲ断片（ＰＣＲスクリーニング法）又はＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ遺伝子（他の株）をプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションで分析し、クチナーゼ遺伝子の物理マップを構築した。ゲノムＤＮＡの適切な消化物をゲル電気泳動でサイズ分画し、適切サイズの断片をゲルから単離し、ｐＵＣ１９にサブクローニングした。これらのゲノムライブラリーを対応するｃＤＮＡインサート（発現ライブラリー法）又はＰＣＲ断片（ＰＣＲスクリーニング法）でスクリーニングして、クチナーゼ遺伝子のゲノムコピーを含むクローンを産生した。これらの遺伝子を両方向に配列決定した。対応ｃＤＮＡを配列決定するか又は他のクチナーゼ配列（Ｅｔｔｉｎｇｅｒ等、１９８７）と比較してイントロンを同定した。成熟クチナーゼポリペプチドのＮ末端を更にこのような比較から推定した。標準的なＰＣＲ技術を用いて、イントロンを除去し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を読み取り枠のすぐ下流で作成し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子（前にＳａｃＩ部位が存在する、カセット８を比較、図３）のプレ配列のコード化配列を、成熟クチナーゼのＮ末端のコード化配列に融合した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼプレ配列をコードする配列に操作的に連結したクチナーゼ遺伝子を含む産生ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＲ７２４１（図４参照）の７．３ｋｂＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＵ５１に形質転換した。真菌クチナーゼを発現し、本質的に実施例４に記載したように培養ブロスから回収した。実施例９Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ｎ１７２Ｋの洗濯中活性クチナーゼ変異体Ｎ１７２Ｋの脂肪除去への作用を、野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの場合と比較した。試験では、臭素化オリーブ油で汚したポリエステル試験布をモニターとして使用した。（前述したように）Ｘ線蛍光スペクトル分析で試験布上の臭素の量を測定して、試験布上の脂肪量を決定した。野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ（ＷＴ）及びＮ１７２Ｋ変異体を３ＬＵ／ｍｌ用い、酵素による汚れ除去量を幾つかの実験条件下で測定した：洗剤製品Ａ〜Ｃの組成（重量％）を以下に示す：製品Ａ製品Ｂ製品Ｃ様々な洗濯条件下で、洗濯中性能（油汚れ除去）が野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼに比べて改善されることは明白である。図１３は、３０℃、２７゜ＦＨで、３０分間の洗濯で２ｇ／ｌの洗剤製品Ｃを用いた場合の種々の酵素濃度での洗濯中性能を示している。比較として、更に同じ実験をＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）を用いて実施した。全ての条件下で、クチナーゼ変異体Ｎ１７２Ｋの方が優れていた。実施例１２Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ｅ２０１Ｋの洗濯中活性種々の酵素濃度のクチナーゼ変異体Ｅ２０１Ｋが脂肪除去に及ぼす作用を、３０℃、２７゜ＦＨで、３０分間の洗濯で２ｇ／ｌの洗剤製品Ｃ（実施例１１を参照）を用いて野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの場合と比較した。試験では、臭素化オリーブ油で汚したポリエステル試験布をモニターとして使用した。（前述したように）Ｘ線蛍光スペクトル分析で試験布上の臭素の量を測定して、試験布上の脂肪量を決定した。結果を図１４に示す。洗濯中性能（油汚れ除去）が野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼに比べて改善されることは明白である。比較として、更に同じ実験をＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）を用いて実施した。Ｅ２０１Ｋクチナーゼ変異体の性能の方が明らかに優れていることが知見された。実施例１３Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼ変異体Ａ８５Ｆの洗濯中活性種々の酵素濃度のクチナーゼ変異体Ａ８５Ｆが脂肪除去に及ぼす作用を、３０ ℃、２７゜ＦＨで、３０分間の洗濯で２ｇ／ｌの洗剤製品Ｃ（実施例１１を参照）を用いて野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼの場合と比較した。試験では、臭素化オリーブ油で汚したポリエステル試験布をモニターとして使用した。（前述したように）Ｘ線蛍光スペクトル分析で試験布上の臭素の量を測定して、試験布上の脂肪量を決定した。結果を図１５に示す。洗濯中性能（油汚れ除去）が野生型Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｐｉｓｉクチナーゼに比べて改善されることは明白である。比較として、更に同じ実験をＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）を用いて実施した。Ａ８５Ｆクチナーゼ変異体の性能の方が明らかに優れていることが知見された。Detailed Description of the Invention Modified cutinase, DNA, vector and hostTechnical field The present invention relates generally to the field of lipolytic enzymes. The present invention is particularly directed to recombinant D Lipolytic enzyme modified by NA technology, method for producing the same, and especially enzyme detergent composition Regarding its use in.Background and prior art Lipolytic enzymes convert triglycerides into free fatty acids, diglycerides, and monoglycerides. And an enzyme that can be hydrolyzed to glycerol in some cases. The enzyme is , Can break down more complex esters such as the cutin layer or sebum of plants. Fat percentage De-enzymes are used in the industry in various ways such as transesterification of triglycerides and ester synthesis. Is used in the enzymatic method. The enzyme further improves the fat removal of detergent products. For use in detergent compositions. The most widely used lipolytic enzyme is lipase (EC 3.1.1.3) Is. For example, European Patent Application Publication No. 258 068 and European Patent Application No. Hyo Application Publication No. 305 216 (both Novo Nordisk) are both rD Fungal cells mediated by heterologous host microorganisms by NA technology Production of pase, especiallyThermomyces lanuginosus / Hum icola lanuginosa The production of a lipase derived from European Patent Application Publication No. 331 376 (Amano)Pseudom onas cepacia Including the amino acid sequence of lipase derived from And its production and use by rDNA technology. by rDNA technology Other examples of lipases produced are WO-A-89 / 09263 and European patents. Application Publication No. 218 272 (both Gist-Brocades) There is. Despite the large number of publications on lipases and their modifications, AroundHumicola lanuginosaOnly lipase derived from detergent products It is widely marketed under the trade name of Lipolase (registered trademark) as an additive for use. A characteristic of lipase is that it exhibits activity at the interface. This is a completely dissolved substrate Means that the enzyme activity on the interface or on the micelle-forming substrate is much higher than ing. The surface activity is higher when the substrate concentration is higher than the critical micelle concentration (CMC) of the substrate. Thus, when the interface is formed, it appears as a rapid increase in lipolytic activity. In the experiment, This phenomenon is referred to as enzyme activity vs. substrate concentration. It can be observed as a discontinuity in the degree graph. The mechanism of lipase activation at the interface depends on the conformation of the protein structure of the lipase molecule. It has been elucidated by the changes in the formation. In the free, unbound state, it is helical A lid surrounds the catalytic binding site. When binding to a lipid substrate, The catalyst moves and the catalyst site is exposed. The spiral lid interacts with the lipid interface It is also believed that the enzyme remains bound to the interface. WO-A-92 / 05249 (Novo Nordisk) describes lipid contact areas. Modified genetically engineered lipase, especiallyHumicola lanug inosa Disclosed are lipases of origin. The lipid contact region is active herein It is defined as the surface covered by the spiral lid when shaped. Modification is due to lipid contact One or more amino acid residues in the region to increase or increase electrostatic charge and / or Reduce the hydrophobicity of the lipid-contacting region or increase the surface conformation of the lipid-contacting region. It consists of changing This is the residue of one or more negatively charged amino acids in the lipid contact region. Groups may be deleted or these residues may be replaced with neutral or more positively charged amino acids. And / or one or more neutral amino acid residues in the lipid contact region With a positively charged amino acid and / or one or more hydrophilic amino acids in the lipid contact region. Achieved by deleting acid residues or replacing these residues with hydrophobic amino acids. Is made. Cutinase is a wax ester hydrolase (EC 3.1.1.5). 0). These enzymes are esterified long-chain fats that occur in plants as a protective film of leaves and stems. It is capable of degrading the cutin of acid / fatty alcohol networks. Furthermore, the enzyme is to some extent It has the lipolytic activity of, ie is able to hydrolyze triglycerides. Therefore, the fermentation The element can be regarded as a special lipase. However, cutinase Unlike pase, it does not exhibit substantial interfacial activity. Cutinases are derived from numerous sources such as plants (eg pollen), bacteria and fungi. Obtainable. Due to its lipolytic properties, cutinase is an enzyme detergent composition. Proposed as an ingredient. For example, WO-A-88 / 09367 (Gene ncor) combines a surfactant with a substantially pure bacterial cutinase enzyme. It proposes the production of effective cleaning compositions. Gram-negative bacteriaPseudomon as putida Detergent composition containing cutinase obtained from ATCC 53552 The thing is disclosed. However, In a more recent European Patent Application Publication No. 476 915 (Clorox), When using conventional methods, the enzyme called lipase is used to remove oil stains on textiles. It is disclosed that it is not as effective as other lipases. Recently,Fusarium solani pisiThree-dimensional cutinase from Structure elucidated (Martinez et al. (1992) Nature 356, 6) 15-618). This cutinase has no helical lid covering the catalytic binding site. It was discovered that Instead, the active site serine residue may be accessible to the solvent. It seems like These findings are currently related to the activation mechanism of lipase at the interface. Seems to confirm the theory of. Fusarium solani pisiThe cutinase gene derived from And sequenced (Ettinger et al. (1987) Bioch. chemistry 26, 7883-7892). WO-A-90 / 09446 (Plant Genetics Systems)E. FIG. coliAt the It describes the cloning and production of genes. Cutinase is a cutinase and a substrate In the presence and absence of an interface with and in aqueous and non-aqueous media. It can effectively catalyze the synthesis and hydrolysis of stells. Based on its general stability, This cutinase can be used for cleaning agents such as laundry detergents, cosmetic compositions and shampoos. Other specific fat-dissolving formulations such as Pooh can be produced. Economically possible Neither enzyme production methods nor specific enzyme detergent compositions containing cutinase are disclosed. Due to this feature, ie lack of activity at the interface, cutinase is used herein. Is defined as a lipolytic enzyme that is substantially inactive at the interface. Therefore, cutiner Zease differs from conventional lipases in that it has no helical lid covering the catalytic binding site. It As mentioned above, currentlyHumicola lanuginosaReason Only conventional lipase is a commercial product of Lipolase® as an additive for detergent products. It is widely marketed under the product name. Henrik Malmos is Chemistr y and Industry 1990, pp. 183-186. According to the statement, the lipase activity during the washing process is generally low and Lipolase It is well known that the standard) is no exception. During the drying process When the water content decreases, the enzyme becomes active. Upon return, the greasy soil is hydrolyzed. Material hydrolyzed during the next wash cycle Are removed. Now, the lipase action is low after the first wash cycle, It will also explain why it is significant in the subsequent cycles. Therefore, significant during the washing process There is a further need for lipolytic enzymes that exhibit different activities. Cutinase, especiallyFusarium solani pisiOriginating cutiner It was found that ze had a clear in-the-wash effect. But Naga Et al., A cutinase with improved lipolytic activity during washing and a method for producing such an enzyme More needed. The object of the present invention was modified to improve performance, especially lipolytic activity during washing. To provide a cutinase. Surprisingly, eukaryotic cutinase enzymes, especiallyFusarium sola ni pisi ,Colletotrichum capsici,Colle totrichum gloeosporiodes ,as well asMagnapport he grisea The lipolytic activity of the derived cutinase increases the hydrophobicity of the enzyme surface. It has been found that this can be improved by modifying the amino acid sequence as described above.Definition of invention Cutina, a parent cutinase with an amino acid sequence modified to increase the hydrophobicity of the enzyme surface Mutant. Preferably, the hydrophobicity of the enzyme surface is increased to increase the expanded lipid contact area. Formed.Description of the invention The present invention relates to mutants of cutinase enzymes. As mentioned above, cutinase Can be obtained from numerous sources, such as, plants (eg pollen), bacteria and fungi It The present invention as a parent cutinase, ie for modification by recombinant DNA technology The cutinase to be used as the starting material is selected from the group of eukaryotic cutinases. It Eukaryotic cutinases are derived from various sources such as plants (eg pollen) or fungi. Can be obtained from The (eukaryotic) fungal cutinase group differs in leaf-specific and stem-specific and specific Seems to consist of two families. Leaf-specific cutinase is acidic or neutral The stem-specific cutinase tends to have a pH optimum value, and the stem-specific cutinase has an alkaline pH optimum value. Tend to have. Cutinases with optimal alkaline pH are -Use in alkaline builder detergent compositions such as textile powder / liquid detergents More suitable, cutinase having an acidic or neutral pH optimum is Not only for light duty products or rinse conditioners, but also for industrial cleaning products More suitable. Table I below shows four different stem-specific cutinases and their pH optimum. Table I Examples of stem-specific cutinase pH optimum Fusarium solani pisi 9 Fusarium roseum culmorum 10 Rhizoctonia solani 8.5 Alternaria brassicicola (PNBase I) 9 Wild type Fusarium solani pisiCan be derived from cutiner Zetz (Ettinger et al., 1987) is particularly preferred in the present invention. This cutinase Exhibits a pronounced "during washing" effect when used in certain detergent compositions. Amino acid sequenceFusarium solani pisiOrigin cutinase A cutinase that exhibits a high degree of homology with the parent cutinase, or recombinant DNA technology Suitable as a starting material for the present invention for modification.Colletotr ichum capsici ,Colletotrichum gloeosp oriodes ,as well asMagnaporthe griseaOrigin cutinase Is an example. FIG. 12 shows partial amino acid sequences of these cutinases. Altitude It can be found to exhibit homology. By genetic modificationFusarium solani pisiCutinase breaks Encode (pro) cutinase as an alternative to goodFusarium s olanipisi ,Colletotrichum capsici,Col lettotrichum gloeosporiodes ,as well asMagnapo rthe grisea Preservation of 5'and 3'DNA probes derived from cDNA and other lipolytic enzymes Uses a sequence-recognizing probe to encode a cutinase from another eukaryote. Gene information can be isolated, and these probes can be used if necessary. , Eukaryotes producing cutinase using the polymerase chain reaction, or PCR technique It is possible to grow cDNA derived from messenger RNA (mRNA) of cells. (See, for example, WO-A-92 / 05249). Ku obtained in this way Standard procedure for tinase-encoding genes According toE. FIG. coliOf the cutinase (fat) after cloning and expression in Test soil removal performance under appropriate conditions. In this way, improved performance during washing It is possible to obtain a large number of natural variants of the cutinase described above. Furthermore, these heavens But the sequence of cutinase isFusarium solani pisiCutinase It is an excellent basis for producing another protein of. New thoughts on the factors that determine the activity of "during" lipolytic enzymes,Fus arium solani pisi Based on close examination of the 3D structure of cutinase The performance of this cutinase, and in general cutinase, is improved by recombinant DNA technology. We have found some possibilities to do this. Cutinases are basically different from lipases such as Lipolase®. Since, the interaction between cutinase / substrate (lipid interface) is hydrophobic that can bind to the substrate Based on a principle different from lid opening and exposure of the sexual area (Brzozowski et al. 1991) Nature 351, 491-494). The present invention modifies cutinas that are hydrophobic regions that are large enough that the cutinase molecules begin to aggregate. With the substrate without forming on the surface of the enzyme It shows that the cutinase can be modified to improve the interaction. Hydrophobic surface Is alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine , Hydrophobic amino acids such as tryptophan and tyrosine, and methionine in small amounts However, it can be expanded by introducing glutamic acid, glutamine and histidine. obtain. However, the hydrophobic side chains of these amino acids were embedded in the hydrophobic core of cutinase. Make it not exist. Methionine is not usually considered a hydrophobic amino acid, but at certain positions When incorporated, it can effectively act to increase the hydrophobicity of the cutinase molecule surface. In some cases, introducing a charged amino acid in addition to the hydrophobic amino acid causes the aggregation of the enzyme. It has been found beneficial to avoid. Surprisingly, ricin and When a positively charged amino acid such as arginine is incorporated at a specific position in the cutinase molecule It was also found that the hydrophobic surface area can be expanded. It exists in lysine and arginine Because the existing methylene group is restricted to the position where it is not embedded in the cutinase molecule. It The advantage of using lysine or arginine is that the methylene group is exposed and The possibility of interaction is increased by the amino or imido groups. Lysine and arginine are not usually considered hydrophobic amino acids. However , The atoms forming the side chains of these residues have a large number of hydrophobic moieties that can interact with the lipid layer. Contains atoms (in the methylene moiety). In fact, the size of the hydrophobic part of the lysine residue Can be comparable to the size of valine residues. Other intrinsic properties of cutinase are adversely affected by the introduction of positive charges, which The surface of the part of the cutinase molecule that interacts with the lipid layer or close to this part Introducing a compensating negative charge or depleting a positive charge on the surface Can be offset by. Around the active siteFusarium solani pisiCutinase surface Inspection of the hydrophobicity shows that the hydrophobicity is not optimal. This particular in this area In order to improve the amino acids, the residues should be replaced with more bulky hydrophobic residues. To further understand the relationship between the structure and function of lipolytic enzymes, some of these The three-dimensional (3D) structure of the enzyme was carefully studied. These structures are described in the literature If not, the structure was derived by molecular modeling techniques. Rhizomucor miehei3D structure of lipase The structure is determined by the X-ray crystal method (Brady et al. (1990) Nature). 343, 767-770, Brzozowski et al. (1991) Nature. 351, 491-494, Derewenda et al. (1992) Biochem. (Istry 31,1532-1541). Ser-His-Asp protector ZE-like catalytic triad site with active site Ser 144 as a short helical lid Embed below (residues 85-91). Below is the structure in which the active site Ser is embedded. Is referred to as the "closed" conformation of the enzyme. Adsorption at the oil-water interface It is believed to be associated with the movement of the spiral lid. By this movement, activity The site serine is exposed, increasing the hydrophobic region around the active site. "Open" con The conformation is thought to correspond to the activated enzyme adsorbed at the oil-water interface. . fungusRhizomucor miehei"Closed" form of lipase C The α-coordinate is assigned to the Protein Data Bank in Brookhaven. It is entrusted. Using a careful calculation methodRhizomucor miehei The entire protein coordination of the lipase (backbone and side chain) was generated. S. Woodak et al. 1989) Protein Apply the calculation method described in Engineering 2, 335-345. hand,Rhizomucor mieheiCreate an approximate starting model for lipase I made it. This method is based on the SYBYL molecular modeling software package (TRI POS associates, Inc. St. Louis, Missouri ). After that, the BIOSYM molecular modeling software package ( BIOSYM, San Diego, California) The model by applying various energy minimization (EM) and molecular mechanics (MD) techniques. It was Applied a knowledge-based approach during EM and MD processing of models . For detailed energy terms of possible energy functions and known structural criteria. And optimized the model at the same time. The model quality is defined by the number and quality of hydrogen bonds and the secondary structure. Hydrogen bond pattern in building element, orientation of peptide unit, value of main chain dihedral angle, aromatic group Were evaluated by such criteria as interaction angle and cavity size. Furthermore, unsuitable Truncated charges, extremely exposed hydrophobic residues, and disulfide bridge energy The model was inspected for ruggedly unfavorable positions. Side chain rotamers involved -(Rotamers) is Ponder & Richards rotamer library (Ponder et al. 1987) J. Mol. Biol. 193, 775-791). This library The final selection of specific side chain rotamers from the It was based on. Side chain atoms were annealed into place using MD. Known Carefully inspect the model structure for consistency with the structural properties of By optimizing the structural characteristics,Rhizomucor mieheiLipase A reliable all-atom model can be formed.Rhizomucor mieh ei The "open" conformation of lipase is C_Ten-Triglyceride Obtained by applying MD computer simulation that binds to the active site of pase Was done. Conformation properties of open structures described in the literature (Derewen da et al., Biochemistry (1992) 31, 1532-1541). A careful comparison of the “open” conformations thus obtained The computer model turned out to be essentially identical. fungusRhizomucor mieheiStarting from the known 3D structure of lipase SYBYL molecular modeling software Software package (TRIPOS associates, Inc. St. L) ouis, Missouri) to be implemented in COMPOSER module Applying a new rule-based comparative modeling technology,Humicola langi nosa "Open" and "closed" 3D structures of lipase were obtained. GotHumicola langinosa The lipase model is identical to the one described above. Corrected in the calculation procedure. fungusRhizomucor mieheiLipase andHumicola l anginosa Comparing the three-dimensional (3D) structures of lipases, the substrate on the enzyme The part of the lipase molecule involved in adsorption was identified. Fusarium solani pisiRelease known 3D structure of cutinase As a starting point, SYBYL molecular modeling software package (TRIPOS a associates, Inc. St. Louis, Missouri) COM Suitable for rule-based comparative modeling techniques such as those implemented in the POSER module. UseColletotrichum gloeosporiodesOf origin The 3D structure of cutinase was obtained. GotColletotri chum gloeosporiodes The cutinase model is the same as described above. Corrected with one calculation procedure. Unexpectedly, from the three-dimensional structure of the lipolytic enzyme shown in Table II below,Fusar ium solani pisi Cα-atoms of residues 116-120 of cutinase Is a least-square fit through a particular vector (a particular vector which is the least-square fit through the C α-atoms). Was observed. This vector is almost perpendicular to the plane where the interaction with the substrate occurs. Is. Comparing the primary sequences of several lipolytic enzymes of different origin, for example,Fusar ium solani pisi Amino acid residues 116-120 of cutinase It can be seen from Table II below that it appears to be located in a region with a high degree of homology. . Consensus sequence of lipolytic enzyme Gly- (His / Tyr) -Ser-X- Gly can be used to align and compare. Therefore,Fusarium solani pisiAmino of cutinase molecule Vectors via acid residues 116-120 were used to improve the activity of the wash during washing. The portion of the cutinase molecule to be amino acid modified to obtain a tinase was limited. Since Table III below shows the structures of adjacent amino acids for the lipolytic enzymes shown in Table II. . According to one aspect of the invention, the amino acid sequence is modified to increase the hydrophobicity of the enzyme surface. Also provided is a modified cutinase enzyme with improved lipolytic activity during washing. Preferably Is the lipid contact area The surface of the enzyme adjacent to the zone was increased in hydrophobicity to form a large lipid contact area. Replace one or more amino acid residues with alanine, valine, leucine, isoleucine, Lorin, phenylalanine, tryptophan and tyrosine, methionine, gluta Amino acid residue selected from the group consisting of mynic acid, glutamine and histidine Substitution with can increase the surface hydrophobicity of cutinase. Valine, Leucine, isoleucine, phenylalanine, tryptophan and methionine preferable. Not only increases surface hydrophobicity, but also introduces one or more lysine or arginine residues It is advantageous to modify the amino acid sequence to introduce one or more positive charges It was discovered. The modified residue isFusarium solani pisiResidue 1 of cutinase Via the Cα-atoms of 16-120 or the corresponding Cα-atoms of different cutinases The vector that is the least squares fit and the Cα-atom at residue 117 perpendicular to the vector Or defined by the plane containing the corresponding Cα-atoms of different cutinases Can be located in the molecular part preferable. As previously mentioned,Fusarium solani pisiOriginating cutiner The three-dimensional structure of ze is described in the literature. In this case, which modification is within the scope of the present invention It will be obvious that this will be a modification of. If the three-dimensional structure of the specific cutinase is not known In this case, the lipolytic enzyme consensus sequence Gly- (His / Tyr) -Ser -Alignment of amino acid sequences of known sequence induced by X-Gly (see Figure 12) Appropriate modifications can be made within the scope of the invention by comparison. This pro The use of molecular modeling techniques is also preferred. The cutinase variants produced according to the present invention can be used as part of a detergent or cleaning composition. When used as such, the enzyme activity may show an advantage. In particular, the cutinase mutant is washed It has been found to exhibit improved in-wash performance during the main cycle of the rinsing process. Washing The performance during washing in the main cycle of the process means that the detergent composition containing the enzyme is European standard automatic washing machine using normal washing conditions for hardness and temperature Allows a single washing process to remove a significant amount of oil stains from soiled fabrics Means that. Conventional on the market The lipolytic enzyme Lipolase (registered trademark) (manufactured by Novo Nordisk) is However, under the same conditions, it does not seem to have a significant effect during washing on oil stains. It should be understood. The effects of enzymes on oil stains during laundering can be evaluated using the following assay. It A new polyester test cloth with a cotton content of less than 10% was treated with an enzyme Pre-wash with detergent product containing, then rinse thoroughly. Then there is such dirt Stain no cloth with olive oil or other suitable hydrolyzable oil stain. Each test cloth ( Incubate about 1 g) with 30 ml of washing solution in a 100 ml polystyrene bottle. To start. The washing liquid contains 1 g / l of the detergent product shown below. Normal 30 ℃ main wash Using the rinse program, 30 bottles in a Miele TMT washing machine full of water Stir for minutes. Preliminarily add 3 LU / ml of cutinase mutant to the washing solution. Contrast Contains no enzymes. The composition of the powder detergent is shown below (% by weight): Ethoxylated alcohol Nonionic surfactant 9.5 Sodium sulfate 38.6 Sodium carbonate 40.4 Sodium silicate (Na₂O: Si₂O = 2.4) 7.3 Water 4.2 As the nonionic surfactant, C₁₂-C_FifteenEthoxylated alcohol 10.5- 13EO was used, but there are a wide variety of ethoxylated alcohol nonionic surfactants. It can vary in range. After washing, rinse the cloth thoroughly with cold water and dry in a cold air rotary dryer to remove residual fat. Evaluate the amount. This can be done in several ways. The usual method is The test cloth was extracted with petroleum ether in a Soxhlet extractor and the solvent was distilled off. Weigh and determine the percentage of residual fat as a fraction of the initial fat content of the fabric That is. The second, more sensitive method, uses brominated olive oil to stain the test cloth (R ichards, S.M. Morris, M .; A. And Arklay, T .; H. ( 1968), Textile Research Journal38, 10 5-107). Then, place each test cloth in 30 ml in a 100 ml polystyrene bottle. Incubate with wash solution. Then use the regular 30 ° C main wash program, Stir a series of bottles in a washing machine full of water. After the main wash, Rinse the test cloth thoroughly in cold water for 5 seconds. Immediately after rinsing, dry the test cloth with a cool air dryer To do. After drying, measure the bromine content of the cloth by X-ray fluorescence spectrum analysis to determine the residual amount of fat. Can be specified. Fat removal is the amount originally present in the test cloth as follows: Can be determined as a percentage of In the above formula, bromine_bwIndicates the percentage of bromine on the cloth before washing,_awAfter washing The bromine percentage of is shown. Another method for assessing enzyme activity is to measure reflectance at 460 nm according to standard techniques. Consists of doing. In the present invention, a modified, mutated or mutant enzyme, or enzyme variant is Means an enzyme produced by a mutant microorganism expressing a naturally mutant gene It Mutant genes (other than those containing only silent mutations) are direct Or indirectly derived from an amino acid sequence that differs from the corresponding parent enzyme sequence at one or more locations. It means a gene encoding an enzyme having a no acid sequence. The parent enzyme is the corresponding Refers to the gene product of a mutated gene. A silent mutation of a gene is a gene Changes in the polynucleotide sequence of Of the differences, the above (due to the redundancy in the codon-amino acid relationship) It means that the amino acid sequence of the enzyme encoded by the gene is unchanged. Mutant or mutant microorganism is a gene for an enzyme that is mutated. Parent microorganism or a microorganism that is a progeny thereof. Such mutations of microorganisms (A) mutates the corresponding gene (parent gene) already present in the parental microorganism Or (b) mutating the corresponding gene directly or indirectly obtained from another source. Transferring (introducing) into a microorganism to be a product (for example, mutating a gene) Can be implemented by: The host microbial organism is the transfer of its mutant gene or other origin. It is a microorganism whose genes form a part. Generally, the host microorganism is a strain or species The source or lineage may be the same or different than the parental microorganism. The present invention is particularly directed to WO-A-90 / 09446 (Plant Genetic). s Systems)Fusarium solani pi si Cutinase againColletotrichum capsici,Col lettotrichum gloeosporiodes ,as well asMagnapo rthe grisea Origin A mutant form of the cutinase of These cutinase mutants have rD May be produced by rDNA-modified microorganisms containing genes obtained or produced by NA technology It Fusarium solani pisiResidues 116-120 of cutinase Least-squares fit via the Cα-atoms of the And a vector that is perpendicular to the vector and is Cα-atom at residue 117 or a different atom. To the portion of the molecule defined by the surface containing the corresponding Cα-atom of the tinase. Once the amino acid residue located is identified, the appropriate amino acid (s) are identified at the identified position (s). By introducing an acid, for exampleFusarium solani pisiKu Amino acids such as the mutation N712K relating to the sequence of tinase or its homologues. The sequence can be modified. As will be appreciated by those in the art, such modifications affect the structure of cutinase. joy In addition, a modification that does not significantly affect the electrostatic charge around the active site is preferable. The inventors Is a balun with the unavoidable distortion of enzyme conformation and the advantage of increased enzyme activity. I deepened my understanding of the required level. This makes the cutinase mutation promising with a high success rate. Predict and manufacture foreign substances be able to. In Table IV below and elsewhere in the specification, amino acids and amino acid residues in peptide sequences Is indicated by the one-letter and three-letter abbreviations shown below. Table IV A = Ala = alanine V = Val = valine L = Leu = leucine I = Ile = isoleucine P = Pro = proline F = Phe = phenylalanine W = Trp = tryptophan M = Met = methionine G = Gly = glycine S = Ser = serine T = Thr = Threonine C = Cys = Cysteine Y = Tyr = tyrosine N = Asn = asparagine Q = Gln = glutamine D = Asp = aspartic acid E = Glu = glutamic acid K = Lys = lysine R = Arg = Arginine H = His = Histidine As used herein, mutations present in the amino acid sequence of proteins, and thus sudden changes The heterologous protein itself is abbreviated as follows depending on the position and type of mutation: The identity of the originally mutated amino acid residue, The position (according to the SEQ ID NO) and the amino acid residue that replaces the original amino acid residue Can be described by identity. When extra amino acids are inserted into the sequence , Its position is one or more below the residue number immediately before the insertion of the canonical or reference sequence. Indicated with a subscript. For example, suddenly characterized by substitution of asparagine at position 172 with lysine Mutants are designated Asn172Lys or N172K. (If) after asparagine Inserting another amino acid residue such as proline into Asn172AsnPro Alternatively, it is represented by N172NP, or by using an insertion residue at the 172a position as * 172aP. To represent. Deletion of asparagine at the same position (assuming Asn172 * or It is represented by N172 *. * Is missing if it is considered not present due to the actual deletion. Meaning a loss, simply comparing to another sequence or a reference sequence having a residue at this position or The absence of amino acid residues is considered to be absent by homology. Multiple mutations are represented separately with a + sign. For example, N172K + S54I + A12 8F is a trio of 3 by substitution as described above at each of the three positions of the amino acid sequence. Mutation of Represents a mutant protein having. If desired, make the mutations shown in the table below. You may combine. Table V belowFusarium solani pisiOrigin cutinase 3 shows a particular useful example of a cutinase variant of the invention based on the sequence Preferred variants of the invention areFusarium solani pisiCutie Nucleases A85F, N172K and E201K, and the corresponding variants of other cutinases. It is a different body. An example of such a corresponding cutinase variant is, for example,Colleto trichum gloeospores Asp1 derived from cutinase 72Lys, a D172K mutant. According to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a cutinase mutant of the present invention. . Microorganisms that produce natural cutinase Are usually plant pathogens, and these microorganisms are known as host cells for the modified cutinase gene. Is not very suitable for the action. Therefore, preferred host microbiota for the rDNA method. The modified (pro) cutinase was added to the rDNA vector that can be transferred into the product. Incorporated the gene to be used. Therefore, it is described in WO-A-90 / 09446. A rDNA vector essentially similar to the rDNA vector of . Microorganisms that produce natural cutinase are less suitable for fermentation processes. Fermentation yield To improve the rate, the gene encoding the improved cutinase was expressed rapidly in cheap medium. Should be transferred to microorganisms that can grow rapidly and that are capable of synthesizing and secreting large amounts of cutinase. is there. Such suitable rDNA modifications (host microorganisms) of the present invention are bacteria (host organisms). KeBacilli,Corynebacterium, Staphylococci as well asStreptomyces) Or lower eukaryotes (egSacchar omyces cerevisiae And related species,Kluyveromyces marxianus And related species,Hansenula polymorpha And related species, andAspergillusGenus species). Preferred host microorganism Is a lower eukaryote. what Because these microorganisms produce and secrete enzymes very well in the fermentation process, cutiner This is because the ZE molecule can be glycosylated. Glycosylation stabilizes cutinase in wash systems Can contribute to sex. The invention further provides modified eukaryotic cutinase genes (eg,Fusarium s olani pisi (Derived gene) into a cloning rDNA vector Genetic material obtained, transformation of new host cells and inheritance of cutinase mutants Provided is the use of said genetic material for expression of a new offspring host cell. Manufactured or modified by rDNA technology encoding the cutinase variant A polynucleotide, an rDNA vector containing the polynucleotide, and the polynucleotide A rDNA-modified microorganism containing a polynucleotide and / or the rDNA vector is also provided. Provided by the invention. The invention further provides corresponding polynuclears encoding modified eukaryotic cutinases. A nucleotide (eg, having a nucleotide sequence encoding a mature cutinase variant, A polynucleotide in which a stop codon follows the translation codon, but in some cases Immediately upstream of the nucleotide sequence encoding the mature cutinase variant is this cutiner. Ze mutant prepro Or having a nucleotide sequence encoding a prosequence). In such a polynucleotide, the cutiner derived from the source microorganism is used. A nucleotide sequence encoding at least one codon, preferably As many codons as possible are preferred for new hosts against'silent 'mutations Modified to form a codon that encodes an equivalent amino acid residue Due to the modification, the stability of the transfer agent is improved when it is used in the cells of the host. Gene mRNA can be provided. A specific host is provided upstream of the nucleotide sequence encoding the pro- or mature cutinase. There may be located a nucleotide sequence encoding a suitable signal or secretory sequence. Obedience Therefore, one embodiment of the present invention provides a nucleotide encoding a cutinase variant or a precursor thereof. It relates to an rDNA vector having a cleotide sequence inserted therein. The nucleotide sequence can be derived, for example, from the following sequences: (A) (for exampleFusarium solani pisiPropure produced in Or the original amino acid of the cutinase A natural nucleotide sequence encoding a sequence); (B) Codon preferred by new host and stable messenger RN in new host The nucleotide sequence that gives rise to A. Chemically synthesized nucleotide sequence (C) Amino acid sequences are different, but exhibit excellent stability and / or activity in detergent systems,Fusarium solanipisi The above item a or b encoding a cutinase A genetically engineered nucleotide derived from one of the nucleotide sequences described in Ochid arrangement. In short, one of the preferred hosts encodes the cutinase gene as described above. The rDNA vector capable of directing the expression of the nucleotide sequence Comprising the components of: (A) mature cutinase or precutinase, or (depending on the host cell selected At least a portion of the presequence is removed immediately downstream of the secretion signal. Double-stranded (ds) DNA encoding the corresponding plectinase. However, it should be translated. If the part of the gene does not start with the codon ATG, prepend the ATG codon Should be. Also the gene The translated portion of should always terminate with an appropriate stop codon; (B) upstream of the plus strand of ds DNA (component (a)) encoding cutinase Located, an expression regulon (suitable for the selected host microorganism); (C) Downstream of the plus strand of ds DNA (component (a)) encoding cutinase A terminator sequence (suitable for the selected host microorganism) located; (D1) a gene that facilitates integration of ds DNA into the genome of the selected host. Cletide sequence, or (D2) an origin of replication suitable for the selected host; (E1) optionally (auxotrophic) selectable marker. The auxotrophy marker is It may consist of an auxotrophic marker coding region and a defective promoter; (E2) optionally maturation of one precursor form of cutinase in the selected host And / or ds DNA sequences encoding proteins involved in secretion. Such an rDNA vector may further include an upstream of the polynucleotide as described above. And / or downstream it may have another sequence which facilitates functional expression of the cutinase. Sakae The auxotrophic marker includes the coding region of the auxotrophy marker and the defective promoter. Data area. Another embodiment of the invention is by fermentation of one of the various cutinase variants described above. Production. Fed batch (such as fermentation) It may be fed-batch) fermentation or continuous fermentation. Choosing the method to use Depends on the host strain and the preferred (known) down stream processing method To do. Accordingly, the present invention further provides for the production of cutinase variants as described herein. There is provided a live method, wherein the method acts on at least one amino acid sequence of cutinase. Modification containing a gene produced by rDNA technology that results in one mutation Microorganisms are fermented and cultured to improve the activity of cutinase compared to the corresponding parent enzyme and The cutinase produced by the organism is separated from the fermentation broth or the microbial cells are released. The cutinase mutant preparation was produced by separating it from the fermentation broth, and the separated cells From the broth or from the broth by a physical or chemical concentration or purification method. Concentrating or partially purifying the cutinase variant from the cell. Cutinase mutation The body is secreted by the microorganisms into the fermentation broth and the enzyme is filtered or centrifuged. Select conditions that allow recovery from the broth after cell removal Is preferred. In some cases, the cutinase variant is then concentrated to the desired degree, It can be purified. These fermentation methods themselves are well known except for the peculiarities of microorganisms. Fermentation techniques and commonly used fermentation / downstream processing equipment can be the basis. A method for producing a modified microorganism capable of producing a cutinase mutant by rDNA technology is further added. The present invention provides. This method encodes a cutinase mutant introduced into a microorganism. Gene at the 5'end is functional as a signal or secretory sequence of the host microorganism. It is characterized in that it is fused with a gene fragment encoding a (modified) pre-sequence. The present invention Another aspect of the present invention comprises a cutinase mutant gene and is encoded by the gene. A rDNA-modified microorganism capable of producing a cutinase mutant is provided. rDNA modification In microorganisms, if the gene encoding the natural cutinase originally exists, It is preferable to remove (eg, replace with another structural gene). In another aspect of the invention, an enzyme detergent composition comprising a cutinase variant of the invention is provided. To serve. Such compositions have been used in cutinase variants and commonly in detergent systems. Other ingredients such as additives for detergent compositions, fully formulated detergents and for example European patents Described in Application Publication No. 258 068 Of the known types of cleaning compositions). Especially, the group The composition comprises 5 to 60% by weight, preferably 20 to 50% by weight of a detergency builder and 0 ． 1 to 50% by weight of the activator system. The activator system is one or more 0 to 95% by weight of on-surfactant, 5 to 100% of one or more nonionic surfactants. It comprises by weight. Other components of such detergent compositions are described, for example, in British Patent Application Publication No. 1 372. 034 (Unilever), U.S. Pat. No. 3,950,277, U.S. Pat. No. 4,011169, European Patent Application Publication No. 179,533 (Proct) er & Gamble), European Patent Application Publication No. 205 208 and Yo -Roppa Patent Application Publication No. 206390 (Unilever), JP-A-63- No. 078000 (1988), June 1988 research report (Research Discl No. 29056 and each of the several specifications cited herein. Can be any of the numerous known types. The patent application specification is All are incorporated herein by reference. The cutinase variants of the present invention may be in any suitable form, namely a granular composition of the enzyme, In the form of a solution or slurry, Is a carrier material (such as those described in European Patent Application Publication No. 258 068). , Novo Nordisk's Savinase® and Lipola se (registered trademark)) can be effectively added to the detergent composition. The amount of the cutinase mutant added is, for example, 10 to 20,000 per 1 g of the detergent composition. A wide range of 0 LU, preferably 50 to 2,000 LU can be selected. Book The LU, or lipase unit, in the description refers to European Patent Application Publication No. 258 06. As defined in No. 8 (Novo Nordisk). Similar rules apply mutatis mutandis for other enzymes that may be present. European patent application See also Publication No. 407 225. Choose a protease with a pI of less than 10 and share this protease with cutinase. It may be advantageous to present it in the detergent composition. European Patent Application Publication No. 2 71 154 (Univer) describes a number of such proteases. ing. The protease used with the cutinase variant may, in some cases, It may include, for example, the BPN 'type or a number of types of subtilisins disclosed in the literature. It Some of these have already been described, for example in European Patent Application Publication No. 130 756 or European Patent Application Publication No. 251 446 (both Genentech); US National Patent No. 4 760 025 (Genencor); European Patent Application Publication No. 214 435 (Henkel); WO-A-87 / 04661 (Amg en); WO-A-87 / 05050 (Genex); Thomas et al. (198). 6/5) Nature 316, 375-376 and (1987) J. Am. Mol. Biol. 193, 803-813; Russell et al. (1987) Nature. For detergent applications, such as the mutant proteases described in 328, 496-500. Proposed. The invention is described in more detail in the following examples. For genetic manipulation and analysis of nucleic acid substances All techniques used were essentially Sambrook et al. (19) unless otherwise stated. 89). Description of the attached drawings: Figure 1A: SynthesisFusarium solani pisiOf the cutinase gene Nucleotide sequences of cassette 1 and the constituent oligonucleotides. Orient Gonucleotide transitions are shown in the cassette sequence. Lowercase letters are outside the reading frame The nucleotide position is indicated. Figure 1B: SynthesisFusarium solani pisiOf the cutinase gene Nucleotide sequences of cassette 2 and the constituent oligonucleotides. Oligonucle The ochtide transition is shown in the cassette sequence. Figure 1C: SynthesisFusarium solani pisiOf the cutinase gene Nucleotide sequences of cassette 3 and the constituent oligonucleotides. Oligonucle The ochtide transition is shown in the cassette sequence. Small letters are outside the reading frame Indicates the tide position. Figure 1D:Fusarium solani pisiPre-pro-cutinase The nucleotide sequence of the synthetic cutinase gene encoding Cutinase pre-sequence , The pro and mature sequences are shown. Cloning and oligonucleotide transitions It also shows the parts to be used. Lowercase letters are outside the reading frame The nucleotide position of Figure 2:Fusarium solani pisiEncodes a Protinase ArrayE. FIG. coliligates with a sequence encoding a derivative of the phoA presequence Sequence of synthetic DNA fragments for Restriction enzyme part used for cloning Position and ribosome binding site (RBS). Encoded phoA signal sequence The partial amino acid sequence of the cutinase gene is also shown by the one-letter code. Figure 3: Invertase presequence and maturationFusarium solani p isi Cassette 8 encoding the fusion point of the cutinase coding sequence,SacI-B cl Nucleotide sequence of the I fragment. Figure 4: 0.2 kb from pUR2740SalI-NruBy the deletion of I The resulting plasmid pUR2741 contains a portion of pBR322 and 2 μm plasmid. Origin of Replication in Yeast Cells Derived from Escherichia coli, Yeast leu2D Gene, and Yeast Yeast invertase signal sequence coding region under the control of the ga17 promoter Area and plant α-galactosidase Comprising a fusion with a geneE. FIG. coli-S. cerevisiaeSha It is a toll vector. Figure 5: Plasmid pUR7219 contains a portion of pBR322 and 2 μm plasmid. Origin of Replication in Yeast Cells Derived from Escherichia coli, Yeast leu2D Gene, and Yeast Yeast invertase signal sequence coding region under the control of the ga17 promoter Area and maturityFusarium solani pisiCode that encodes cutinase Comprising a fusion with an areaE. FIG. coli-S. cerevisiaeshuttle It is a vector. Figure 6: Plasmid pUR2740 contains a portion of pBR322 and 2 μm plasmid. Origin of Replication in Yeast Cells Derived from Escherichia coli, Yeast leu2D Gene, and Yeast Yeast invertase signal sequence coding region under the control of the ga17 promoter Region and a fusion of the plant α-galactosidase gene.E. FIG. coli- S. cerevisiae It is a shuttle vector. Figure 7: exlA pre-sequence and maturationFusarium solani pisi Nucleotides of cassettes 5, 6 and 7 with different types of binding of the cutinase coding sequence Array. Figure 8:Aspergillus nigerMutant strainawamoriGenome DN 5.3 kb of ASalThe I fragment of pUC19SalObtained by inserting at the I site Plasmid pAW14B. Figure 9: Includes the exA reading frame of pAW14BBspHI-AflII fragment ToFusarium solani pisiPre-pro-cutinase code Contains an arrayBspHI-AflPlasmid pUR7 obtained by replacing with the II fragment 280. Therefore, the plasmid pUR7280A. nigerMutant strainawam ori Under the control of a promoter and terminatorFusarium sol ani pisi It contains the pre-pro-cutinase gene. Figure 10: A. nidulans amdS andA. nigerMutant strainawam ori Both pyrG Plasmid pUR7281 obtained by introducing the selective marker of pUR7280 into . Figure 11:Fusarium solani pisiSchematic diagram of cutinase molecule . Figure 12:Fusarium solani pisi,Colletotri chum capsici ,Colletotrichum gloeospo riodes ,as well asMagnaporthe griseaOf cutinase from It is a partial amino acid sequence, and the position of the residue is shown by a 3D structure. Figure 13:Fusarium solani pisiCutinase and cutiner Action during washing of ze mutant N172K. Figure 14:Fusarium solani pisiCutinase and cutiner The action of ze mutant E201K during washing. Figure 15:Fusarium solani pisiCutinase and cutiner Action of ze mutant A85F during washing.References Example 1 Fusarium solani pisi Encodes pre-pro-cutinase Construction of synthetic gene Essentially to European Patent Application Publication No. 407 225 (Unilever) According to the method describedFusarium solani pisiPre-Pro- A synthetic gene encoding cutinase was constructed. Has been announcedFusariu m solani pisi Based on the nucleotide sequence of the gene (Solid ay et al. (1984) and WO-A-90 / 09446, Plant Gene. tic Systems),Fusarium solani pisiPre- Construction of a fully synthetic DNA fragment containing the region encoding the pro-cutinase polypeptide I planned. This synthetic cutinase geneFusarium solani pisi Contains some nucleotide changes compared to the nucleotide sequence of the gene, This ensures that the restriction enzyme recognition site does not affect the encoded amino acid sequence. It has been introduced at a convenient location within the gene. Nucleo of the total synthetic cutinase gene The tide sequence is shown in Figure 1D. Three different starting from synthetic DNA oligonucleotides A synthetic cutinase gene was constructed by assembling the cassettes. Synthetic DNA cassette The firstEcoRI site at the endHinIt has a dIII site. Ap Oligonucleotides using a Plated Biosystems 380A DNA synthesizer Cleotide was synthesized and purified by polyacrylamide gel electrophoresis. Each cassette The following procedure was used to construct Equimolar amount to make up a given cassette (50 pmol) of oligonucleotides were mixed according to standard techniques, Edge phosphorylated, annealed and bonded. The resulting mixture of double-stranded DNA moleculesEco RI andHinCut with dIII and size fraction by agarose gel electrophoresis And recovered from the gel by electroelution. The obtained synthetic DNA cassette was designated as pUC9-2. ． 7 kbEcoRI-Hinligates with the dIII fragment,Escherichia coli Transformed into. How many with the appropriate oligonucleotide primer Of the cloneEcoRI-HinComplete sequencing of dIII inserts in both directions And the sequence of the synthesis cassette was confirmed. Using this procedure, pUR7207 ( 1A), including set 1, pUR7208 (including cassette 2, FIG. 1B) and pUR7209 (including cassette 3, figure 1C) was constructed. Finally, 2.9 kb of pUR7207EcoRI-Apa 0.2 kb of I fragment of pUR7208ApaI-NheI fragment and pUR72 0.3 kb of 09NheI-HinSynthetic cutiner ligated with dIII fragment Ze gene was created to obtain pUR7210. This plasmidFusariu m solani pisi Of a complete pre-pro-cutinase encoding It contains a frame (Fig. 1D).Example 2 Escherichia coli InFusarium solani pi si Expression of (pro) cutinase Using the synthetic cutinase gene, WO-A-90 / 09446 (Plant Functionally similar to that described in Genetic Systems)E. FIG. col i The expression vector was constructed.Fusarium solani pisiProfessional Before the part of the synthetic gene encoding the cutinase,E. FIG. coliExpression sig Null, ie (i) an inducible promoter, (ii) a ribosome binding site, and (iii ) Provides a translation initiation codon and is required for the delivery of processinase from the plasma membrane The structure in which the signal sequence that provides information is located I designed a structure. E. FIG. coli A derivative of the phoA signal sequence (Michaelis et al., 19 83) Design a synthetic linker for fusing 83) with the prosequence of the synthetic cutinase gene (See FIG. 2). Optimize signal peptide cleavage and processinase secretion Therefore, the nucleotide sequence of this linker is 3 C of the phoA signal sequence. Convert terminal amino acid residue (Thr-Lys-Ala) to Ala-Asn-Ala The N-terminal amino acid residue of the cutinase prosequence (Leu1, see FIG. 1D) It was like converting to a. With this construction, the cutinase periplasm Secretion into the interstitial space is certain (see WO-A-90 / 09446, Plant). (Genetic Systems). In order to obtain such a construct, the cutinase pre-sequence and a part of the pro-sequence are included. 9 bpEcoRI-SpeRemove the I fragment from pUR7210,E. FIG. col i Derivatives of phoA presequence and modified N-terminal amino acid residues of cutinase prosequence A synthetic DNA linker sequence that provides a group (EcoRI-SpeI fragment) (Figure 2). The resulting plasmid was named pUR7250 and used to Boso Chain fusion site and a procA signal sequence coding region fused to a cutinase 0.7kb including the code areaBamHI-HinThe dIII fragment was isolated. this The fragment was 8.9 kb of pMMB67EH.BamHI-HindIII fragment (Fu rste et al., 1986) to give pUR7220. With this plasmid Fusions a synthetic gene encoding a cutinase with a variant of the phoA signal sequence. Put together under the control of the inducible tac promoter. Includes pUR7220E. FIG. coliShare WK6, 0.017M KH₂PO_Four 0.017M K₂HPO_Four 12 g / l Bacto-tryptone 24 g / l Bacto-yeast extract 0.4% glycerol (v / v) 0.5 liters of IXTB medium (Tartof and Hobbs, 198 Grow in 2 liter shake flasks containing 8). Shake the culture vigorously (150 rpm) with 100 μg / ml ampicillin Overnight at 25 ° C to 30 ° C. OD at 610 nm is 10 It was 12. Then IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added To a final concentration of 10 μM and continue incubation for an additional 12-16 hours. It was Analytical judgment of samples taken from the culture further indicates the amount of lipolytic activity produced. When no significant increase was observed, cells were harvested by centrifugation and the first culture It was resuspended in a volume of 20% sucrose-containing buffer at 0 ° C. Centrifuge cells The cells were harvested and resuspended in the original culture volume of ice-cold water and the cells were exposed to osmotic shock. Dissolved. Cell debris was removed by centrifugation and acetic acid was added to the cell-free extract to pH 4 ． It was acidified to 8 and left overnight at 4 ° C. to remove the resulting precipitate. At this stage, Ultra-filtration / freeze-drying of cell-free extract for purity of almost no endogenous lipase 7 Greater than 5% cutinase preparation was obtained. Or on SP-sephadex The sample was loaded with acidified cell-free extract, and the enzyme was eluted with a buffer solution of pH 8.0. Solution containing a suitable amount of DEAE-cellulose (Whatman DE-52 ), The DEAE passage solution is directly passed through the Q-sepharose HP (Pharma). Cia) the cutinase was purified to homogeneity (purity 9 5% or more). With a salt gradient Elution yielded a uniform cutinase preparation, typically with a total yield of 75% or higher. It wasExample 3 Fusarium solani pisi Remains encoding a variant of cutinase Building a gene Described in Example 1Fusarium solani pisiPre-procure Mutations involving changes in the encoded amino acid sequence using the synthetic gene for tinase Somatic genes were constructed. In this construction, the three genes that make up the fully synthetic cutinase gene Essentially the same method as described in Example 1 was applied for the construction of the cassette . For example, the position to be mutated, ie the encoded triplet of Asn 172. The same oligonucleotides as described in Example 1, except for the two oligos covering the Create a new type of cassette 3 using cleotide,Fusarium sola ni pisi The gene encoding the cutinase mutant N172K was constructed. Generation Instead, two new synthetic oligos were used. These oligos are mutant sequences Except that it is the same as the oligo before substitution. In particular, CUTI3D CUTI3D M instead of MH and CUTI3K MH respectively H variant (including AAG instead of AAT) and CUTI3K MH variant (A A new cassette containing the mutation N172K, which contains CTT instead of TT). 3 was prepared (see FIG. 1C). Essentially the new method is as described in Example 1. Set 3 cloned, sequenced, mutation containing 0.3 kbNheI-H in Replacing the dIII DNA fragment with the corresponding fragment of pUR7210 to generate pUR725 7 (N172K) was obtained. 0.6 kb derived from this plasmidSpeI-H in The dIII fragment was used to replace the corresponding fragment of pUR7220,E. FIG. col i The expression plasmid pUR7224 (N172K) was obtained. thisE. FIG. coliManifestation PlasmidE. FIG. coliTransformed into strain WK6. Transformed cells in Example 2 The mutant processinase enzyme was grown essentially as described in Example 2 and grown as described. It was recovered and purified by the method described above. Instead of CUTI3F MH and CUTI3M MH (see Figure 1C) respectively CUTI3F MH mutant (containing AAG instead of GAG) and CUTI3 A novel cassette 3 that incorporates MMH variants (including CTT instead of CTC) By creatingFusarium so lani pisi Similarly, the gene encoding the cutinase mutant E201K was constructed. Built Instead of CUTI2C MH and CUTI2I MH (see FIG. 1B) respectively CUTI2C MH mutant (including TTC instead of GCT) and CUTI2 A new cassette 2 that incorporates I MH mutants (including GAA instead of AGC) By creatingFusarium solani pisiCutinase The gene encoding mutant A85F was similarly constructed.Example 4 Saccharomyces cerevisiae InFusarium s olani pisi Expression of cutinase Saccharomyces cerevisiaeInFusarium solani pisi Due to the expression of cutinase synthesis gene, mature cutinase Before the synthetic gene encodingS. cerevisiaeInvertase Sequence (Taussig and Carlsson, 1983) and strong inducible ga Expression in the presence of the 17 promoter (Nogi and Fukasawa, 1983) Vek Built the tar. To produce a synthetic cutinase gene for such fusion , The coding sequence of the invertase pre-sequence to the N-terminal coding sequence of the mature cutinase. An adapter fragment was synthesized that fused to the row. This fragment is essentially described in Example 1. Like pUC9EcoRI-HinCreated as a dIII cassette ( Set 8, see FIG. 3), pUR7217 was obtained. Plasmid pUR7210 and pUR7217E. FIG. coli JM110 (dam methylase activity was deleted Strain), and 2.8 kb of pUR7217BclI-HindIII disconnection 0.6 kb of pUR7210BclI-Hinligated to the dIII fragment Gives the encoded nucleotide sequence of the mature cutinase polypeptideS. ce revisiae PUR7 fused to part of the invertase presequence coding region 218 was obtained. 8.9 kb of pUR2740NruI-SalThe I fragment is isolated,SalI rush The outgoing end is filled with Klenow polymerase (fill in) and the fragment is recircularized (r ecircularization), pUR2740 (Verbakel, 1991, see FIG. 6) ) To the expression vector pUR2741 (see FIG. 4) Was induced. 7.3 kb of pUR2741SacI-Hinp the dIII fragment 0.7kb of UR7218SacI-Hinligated with dIII fragment, pUR7 219 was obtained (see FIG. 5). In some casesS. cerevisiae poI II terminator behind the cutinase geneHinPlace on dIII site However, this was not important for the effective expression of the cutinase gene. RevealedE. FIG. coli-S. cerevisiaeShuttle plasmid pUR7 219 carries a 2μ plasmidS. cerevisiaeStock (cir)⁺stock ) Replication origin,S. cerevisiae leu2^-High copy number trait in strain Promoter-deficient species that allow selection of transformed cellsS. cerevisiae Leu2 gene and strong inducibilityS. cerevisiae gal7 promoter Under control ofS. cerevisiaeOperational to invertase presequence Bound toFusarium solani pisiThe mature part of cutinase It contains the encoding synthetic gene. Using the standard protocol for electroporation of yeast cells, strain YT6-2-IL ( Erhart and Hollenbe rg, 1981)S. cerevisiaeStock SU50 (a, cir⁰ , Leu2, his4, can1) of 2μS. cerevisiaeplus Cotransformation with an equimolar mixture of Mido and pUR7219. Leucine prototrophy Transformants were selected for and total DNA was isolated from several transformants . All transformants should contain both 2μ plasmid and pUR7219 This seems to be due to the fact that the promoter-deficient leu contained on pUR7219 is leu. When two genes are present at high copy numbers due to coexistence with the 2μ yeast plasmid, It shows that the leu2 deletion strain can only be functionally supplemented. 40 generations in complete medium After culturing as above, solid plating and replica plating on complete medium were performed to obtain one trait. The transformed cells were cured for pUR7219,S. cerevisiae Stock SU51 (a, cir⁺, Leu2, his4, can1) were obtained. pUR7 Own 219S. cerevisiaeStock SU51, -Amino acid-free yeast nitrogen base (YNB) 6.7g / l -Histidine 20mg / l -Glucose 20g / l Grown in a 1 liter shake flask containing 0.2 liters of MM medium. I let you. The culture was grown overnight at 30 ° C. with vigorous shaking (150 rpm). 6 The OD at 10 nm was 2-4. Collect cells by centrifugation, 2 liters In a shake flask of − Yeast extract 10g / 1 − Bactopeptone 20g / 1 -Galactose 50g / 1 Resuspend in 1 liter of YPGAL medium consisting of The cubation was continued. At regular intervals, samples are removed from the culture and centrifuged. The biomass was removed over time. Using olive oil as a substrate, the supernatant cutina The enzyme activity was analyzed by titration method. For each sample, 5.0 ml of lipase substrate (Si gma, containing olive oil as a substrate for lipase) and 25.0 ml of buffer solution (5 mM Tris-HCl pH 9.0, 40 mM NaCl, 20 mM CaCl₂ 100-200 μl of the filtrate was added to the stirred mixture of). Perform the assay at 30 ° C Dosing and using a Mettler DL25 titrator with 0.05M NaOH Measure the release of fatty acids by automatic titration up to pH 9.0 It was A titration volume vs. time curve was obtained. The amount of lipase activity contained in the sample is Calculated from the maximum slope of this curve. 1 enzyme activity unit is 1 minute under the above conditions Is defined as the amount of enzyme that releases 1 μmol of fatty acid from olive oil. This Such measurement methods are known to those skilled in the art. When the amount of cutinase activity no longer increases, the cells are removed by centrifugation. Acetate was added to the cell-free extract to acidify it to pH 4.8 and cutinase was added to Example 1. It was recovered by the method described in.Example 5 S. cerevisiae InFusarium solani pisiCutie Expression of mutants of Nase Fusarium solani pisiCutinase mutant N176K In the following wayS. cerevisiaeWas expressed in. pUR7257 (N17 2K) 0.5kbApaI-HinpUR7218 using the dIII fragment Of the gene containing the mutationS. cerevisiaeSignal distribution We obtained pUR7228 (N172K) operatively fused to the sequence encoding the row. 7.0 kb of pUR2741SacI-HindIII fragment To 0.7 kb of pUR7228 (N172K)SacI-HindIII disconnection Ligation in one piece gave pUR7234 (N172K). This plasmidS. c erevisiae Transformed into strain SU51. The transformed cells obtained are used in the examples. The mutant enzyme produced by incubation in the method described in Example 4 was used in Examples 4 and 1. Harvested from the culture broth as described. Fusarium solani pisiCutinase mutant E201K Encodes the cutinase mutant E201K as described in Example 3.Fus arium solani pisi Using a mutant of cutinase geneS. c erevisiae Produced in the same way. Fusarium solani pisiThe cutinase mutant A85F Encodes the cutinase variant A85F as described in Example 3.Fusar ium solani pisi Using a mutant of cutinase geneS. cer evisiae Produced in the same way.Example 6 In AspergilliFusarium solani pisiCutiner Expression Aspergillus nigerMutant strainawamoriSynthesisFusa ium solani pisi For the expression of the cutinase gene,Fusa ium solani pisi Synthetic residue encoding pre-pro-cutinase A geneA. nigerMutant strainawamoriStrong inducible exla promoter (Maat et al., 1992, de Graaff et al., 1992). The current vector was constructed. From plasmid pAW14B to pre-pro-cutinase expression plasmid (pUR 7280) was constructed. The pAW14B was added to CBS2 on May 31, 1990. Centralbureau voor Simmee at 37.90 lcultures, Baarn, The NetherlandsE. FIG. co li It was deposited in strain JM109 and has a 0.7 kb endoxylanase II The (exIA) gene is 2.5 kb of 5'flanking sequence and 2.0 kb of 3 '. About 5.3 kb present with flanking sequencesSalContains the I fragment (Figure 8). In pAW14B, the exla coding region was pre-pro-cutinase coding It was replaced with The start codon of the exla gene (A Including TG)BspHI site (5'-TCATGA-3 ') and exla gene Including the termination codon (TAA) ofAflII site (5'-CTTAAG-3 ') , PUR7280 was facilitated. It was constructed by the following method: pAW14B (7.9 kb)BspHI partially Cleaved and the linearized plasmid (7.9 kb) was isolated from an agarose gel. That Afterwards, the isolated 7.9 kb fragment wasBspA few nucleotides downstream of the HI site DisconnectBsmCut with I, otherBspRemove the plasmid linearized at the HI site I left. The fragments were separated on an agarose gel, 7.9 kbBspHI-BsmI A piece was isolated. thisAfl7.2 kb obtained by partial cleavage with IIBs p HI-AflThe II fragment was isolated. Fusarium solani pisiCode for pre-pro-cutinase 0.7 kb of pUR7210 including all open reading framesBspHI-AflII The fragment was converted to 7.2 kb of pAW14B.BspHI-AflLigated with the II fragment, pUR7280 was obtained. Then, the constructed vector (pUR7280) Molds (eg,Aspergillus niger,A sp ergillus niger Mutant strainawamoriCan be transplanted to , Then the pre-pro-cutinase gene of the endoxylanase II promoter It can be expressed by induction. The constructed rDNA vector is With a selectable marker (eg amdS or pyrG, hygromycin, etc.) Alternatively, the desired protein can be obtained by transforming the mold with the obtained rDNA vector. Quality may be produced. As an example, expressing amdS and pyrG selectable markers Introduced into the vector to generate pUR7281 (Figure 10). Therefore, the synthetic orientation Using gonucleotide (5'-AATTGCGGCCGC-3 ') (prepared It exists 1.2 kb upstream of the ATG codon of the locutinase gene)EcoRI PartNotConvert to I siteNotGenerate an I site to produce pUR7282 did. All A. nidulans amdS gene andA. nigerMutant strainaw amori The pyrG gene is linked to its own promoter and terminator. The appropriate DNA fragment contained inNotIt has an I part Of pUR7282NotIntroduction into the I site to produce pUR7281 (Fig. 10) did. Aspergillus nigerMutant strainawamoriSynthesisFusa ium solani pisi As an alternative expression method of cutinase gene, There is no pre-pro sequence of its own before the synthetic gene encoding the mature cutinase. TheA. nigerMutant strainawamori Expression in the presence of the pre-sequence of exla The vector was constructed. In order to produce a synthetic cutinase gene for such fusions The coding sequence for the sequence of the coding sequence can be converted into Several ligated adapter fragments were synthesized. In cassette 5, this binding is ex The IA pre-sequence is fused to the cutinase pro-sequence. In cassette 6, exl The A presequence is fused to the N-terminal residue of the mature cutinase. Cassette 7 is cassette 6 Identical to, but with the N-terminal residue of the encoded mature cutinase polypeptide replaced by the original Change from syn to serine residues to better suit the cleavage requirements of the signal peptide I chose Cassettes 5, 6 and 7 were synthesized synthetically essentially as described in Example 1. It was prepared from gonucleotide (see FIG. 7). PUR72 using cassette 5 0.1 kb for 10EcoRI-SpeReplace the I fragment to produce pUR7287 did. Mosquito 0.1 kb of pUR7210 using sets 6 and 7EcoRI-BclI The fragments were replaced, yielding pUR7288 and pUR7289, respectively. plus For each of the mid pUR7287, pUR7288 and pUR7289, 0. 7 kbBspHI-AflThe II fragment was 7.2 kb of pAW14B.BspHI −AflLigated to the II fragment to give pUR7290, pUR7291 and pUR7291, respectively. UR7292 was obtained. Then, the rDNA vector constructed by the conventional co-transformation technique is mold (Aspergillus niger ,Aspergillus nigerStrange Foreign strainawamori) By induction of the endoxylanase II promoter. The pre- (pro) -cutinase gene was expressed. In this example, pUR7280 As described above (see above), the constructed rDNA vector is Even with a selectable marker (eg amdS or pyrG, hygromycin) Well and transformed with the obtained rDNA vector to obtain the desired protein May be produced. (With or without corresponding prosequenceFusarium solan i pisi Mature cutinase code Area andA. nigerMutant strainawamori exla promoter and tar A cutinase signal sequence or exla signal sequence under the control of a minator. Mu) Expression vectors pUR7280, pUR7281, pUR7290, pUR7 The Aspergillus strain transformed with each of 291 and pUR7292 was prepared as follows. Grow under the following conditions: Multiple 1 containing 400 ml synthetic medium (pH 6.5) A liter shake flask was inoculated with spores (final concentration: 10E6 / ml). Culture medium The composition is shown below (AW medium): Sucrose 10g / l NaNO₃ 6.0 g / l KCl 0.52g / l KH₂PO_Four 1.52 g / l MgSO_Four・ 7H₂O 0.49g / l Yeast extract 1.0g / l ZnSO_Four・ 7H₂O 22mg / l H₃BO₃ 11 mg / l MnCl₂・ 4H₂O 5mg / l FeSO_Four・ 7H₂O 5mg / l CaCl₂・ 6H₂O 1.7 mg / l CuSO_Four・ 5H₂O 1.6mg / l NaH₂MoO_Four・ 2H₂O 1.5mg / l Na₂EDTA 50mg / l Use an Mk X incubator shaker at 200 rpm and 30 ° C for 24 hours. Incubated. After growth, cells were collected by filtration (0.45 μm filter) , Washed twice with AW medium (salt solution) without sucrose and yeast extract, 50 Resuspend in ml salt solution and add xylose to a final concentration of 10 g / l. Transferred to a 300 ml shake flask containing 50 ml of salt solution (induction medium). Up Incubation under the same conditions as above was continued overnight. The resulting culture is It is filtered through a cloth (miracloth) to remove the biomass and essentially remove the cutinase. Recovered by the method described in Example 2.Example 7 In AspergilliFusarium solani pisiCutiner Expression of a mutant of ze Essentially by the method described in Example 6, but for the construction of a fungal expression vector. Plus instead of pUR7210 Includes mutation N172K using mid pUR7257 (N172K)Fusar ium solani pisi A variant of cutinaseAspergillus niger Mutant strainawamoriProduced in.Example 8 Fusarium solani pisi Genes related to cutinase gene Identification and isolation Fusarium solani pisiDifferent degree of homology with cutinase The cutinase-encoding gene was isolated from various fungi. Hankin and 0.25% gut was added to 200 ml of the medium described by Kolattukudy (1968). The fungal culture was grown in a 500 ml shake flask containing the supplemented Lucose. Let the Mk X incubator shaker (100 rpm) for 4 days at 28 ° C. Incubated. At this point glucose is consumed and essentially Ettin Gertin et al. (1987) added cutin hydrolyzate to produce cutinase. Induced raw. Samples are removed from the culture at regular intervals and according to standard techniques (See Example 4) The presence of lipolytic activity was analyzed. Usually about 2 days after induction, Can demonstrate lipolytic activity, At this point, cells were filtered and collected using standard techniques. According to standard technology The hyphae were washed, frozen in liquid nitrogen and freeze-dried. Guanidinium thio Total cell RNA preparations were isolated using the cyanate method and essentially Sambrook Et al. (1989) and purified by cesium chloride density gradient centrifugation. It was p using the polyAT tube (tract) mRNA isolation kit (Promga) The olya (+) mRNA fraction was isolated. Following standard techniques,Fusariu m solani pisi CDNA fragment derived from cutinase gene The polyA (+) mRNA fraction was used as a probe for Northern hybridization. Expression analysis of cutinase-related genes. ZAP cDN A synthesis kit (Stratagene, La Jolla) according to supplier's instructions Therefore, it can be used in an mRNA preparation containing a substance capable of hybridizing with the probe c By synthesizing DNA, the XhoI cohesive end adjacent to the poly-A region and the other end A cDNA fragment containing the EcoRI adapter was obtained. Use the obtained cDNA fragment The λZAPII vector (Stratagene, La Jolla). Directional Cronin When the expression library was constructed by using a β-galactosidase fusion protein, (Huse et al., 1988).Fusarium sol ani pisi Using antisera against cutinase, these libraries were Screened. Alternatively, using a cutinase-specific primer (see Table 2), synthetic cDNA Fractions were subjected to PCR screening. These primers are useful for several fungal cuticles. Obtained by comparison of the amino acid sequences of the Nase gene (Ettinger et al., 1987) It has been done.Fusarium solani pisiCutinase c Optimal PCR reaction conditions using DNA as a control for each set of primers Turned into Length under the same conditionsFusarium solani pisiCutie Similar (or more) to the PCR fragment produced by the cDNA derived from Nase For cDNA preparations that can be used to generate specific PCR fragments, Purified by gel electrophoresis and isolated from gel. An alternative method is to use PCR screeners with cutinase-specific primers. Ng technologyFusarium solani pisiGenomic DNA As a positive control It is applied directly to the genomic DNA of several fungal strains. Same article Under the circumstances, the lengthFusarium solani pisiC derived from cutinase Specific PCR fragment similar (or more) to the PCR fragment produced in DNA The PCR fragment was gel-charged for a fungal genomic DNA preparation that could be used to produce the pieces. Purified by electrophoresis and isolated from gel. Expression library method or PCR (using cDNA or genomic DNA) For the strains that tested positive by the cleaning method and some other strains, Nome DNA was isolated. The strain was essentially described by Ettinger et al. (1987). And the genomic DNA described in Graaff et al. (1988). Isolated in. Genomic DNA digested with various restriction enzymes to give a similar cDNA insert (Expression library method) or PCR fragment (PCR screening method) orFus arium solani pisi Using the cutinase gene (other strains) as a probe Used to analyze the physical properties of the cutinase gene analyzed by Southern hybridization. Built a map. An appropriate digest of genomic DNA was size-fractionated by gel electrophoresis. , An appropriately sized fragment from the gel It was isolated and subcloned into pUC19. Pair these genomic libraries Corresponding cDNA insert (expression library method) or PCR fragment (PCR Screened by the learning method) and contains a genomic copy of the cutinase gene A clone was produced. These genes were sequenced in both directions. Corresponding cDNA Sequenced or compared to other cutinase sequences (Ettinger et al., 1987) In comparison, the intron was identified. The N-terminus of the mature cutinase polypeptide is Estimated from such comparison. Remove introns using standard PCR techniques,Hin Create a dIII site just downstream of the reading frame,Saccharomyc es cerevisiae Invertase gene (beforeSacI site exists Comparing cassette 8, the coding sequence of the pre-sequence of Figure 3) Fused to the N-terminal coding sequence.S. cerevisiaeInvertase Sp Production containing a cutinase gene operably linked to the sequence encoding the sequenceSac I-HinThe dIII fragment was added to 7.3 kb of pUR7241 (see FIG. 4).Sac I-Hinligated with the dIII fragment,S. cerevisiaeTraits of strain SU51 Converted. Expresses a fungal cutinase, Recovered from the culture broth essentially as described in Example 4.Example 9 Fusarium solani pisi Washing of cutinase mutant N172K Medium activity Effect of cutinase mutant N172K on fat removalFusarium solani pisi Compared with the case of cutinase. In the test, brominated ori A polyester test cloth soiled with a heating oil was used as a monitor. (As mentioned above The amount of bromine on the test cloth was measured by X-ray fluorescence spectrum analysis to determine the fat on the test cloth. The amount was determined. Wild typeFusarium solani pisiCutinase (WT) and N The 172K mutant was used at 3 LU / ml, and the amount of stain removal by the enzyme was adjusted to some experimental conditions. Measured below: The composition (wt%) of detergent products A to C is shown below: Product A Product B Product C Under various washing conditions, the performance during washing (oil stain removal) is wild typeFusarium solani pisi It is clear that there is an improvement over cutinase. FIG. 3 was used at 30 ° C., 27 ° FH and 30 minutes of washing with 2 g / l of detergent product C The performance during washing with various enzyme concentrations in the case is shown. For comparison, the same experiment was also performed with Lipolase®. . The cutinase mutant N172K was superior under all conditions.Example 12 Fusarium solani pisi Washing of cutinase mutant E201K Medium activity The effects of various enzyme concentrations of the cutinase mutant E201K on fat removal were 3 2g / l of detergent product C (see Example 11) after 30 minutes of washing at 0 ° C, 27 ° FH. Wild type usingFusarium solani pisiField of cutinase Compared with the case. In the test, a polyester test cloth stained with brominated olive oil was Used as a target. X-ray fluorescence spectrum analysis (as described above) on the test cloth The amount of bromine was measured to determine the amount of fat on the test cloth. The results are shown in Fig. 14. Performance during washing (removal of oil stains) is wild TypeFusarium solani pisiImproved compared to cutinase Is obvious. For comparison, the same experiment was performed with Lipolase (registered trademark). It carried out using. The performance of the E201K cutinase mutant is clearly superior It was discovered.Example 13 Fusarium solani pisi Washing the cutinase mutant A85F Activity The effect of various enzyme concentrations of the cutinase mutant A85F on fat removal was determined by 30 2 g / l of detergent product C after 30 minutes of washing at 27 ° F., 27 ° C. (see Example 11) ) With wild typeFusarium solani pisiFor cutinase Compared with. The test monitored a polyester test cloth stained with brominated olive oil. Used as X-ray fluorescence spectrum analysis (as previously described) The amount of fat was measured to determine the amount of fat on the test cloth. The results are shown in Fig. 15. Wild type for performance during washing (removal of oil stains)Fusarium solani pisi It is clear that there is an improvement over cutinase. Comparison As a further experiment, the same experiment was performed using Lipolase (registered trademark). It was It was found that the performance of the A85F cutinase mutant was clearly superior. It was

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ // Ｃ１２Ｓ 11/00 8931−4ＢＤ０６Ｌ 1/00 7199−3Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:77）Ｃ１２Ｒ 1:77） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者フアン・デル・ヒーデン，ヘンドリクス・テオドルス・ウエー・エムオランダ国、エヌ・エル―2907・カー・ベー・カペレ・アー／デー・イユツセル、アイダ・64 (72)発明者ムステルズ，ウオーテルオランダ国、エヌ・エル―3141・エル・デー・マースルイス、ウイツペルスパルク・ 138 (72)発明者ペテルス，ハンスオランダ国、エヌ・エル―3051・イツクス・ベー・ロツテルダム、サフイエルストラート・12 (72)発明者フエリプス，コルネリス・テオドルスオランダ国、エヌ・エル―3142・カー・ベー・マースルイス、ハゲドールン・18 (72)発明者デ・フリーグ，ヤコブオランダ国、エヌ・エル―3142・アー・ペー・マースルイス、カスタニエーダル・32─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI C12N 15/09 ZNA // C12S 11/00 8931-4B D06L 1/00 7199-3B (C12N 9/18 C12R 1 : 865) (C12N 9/18 C12R 1:77) (C12N 1/15 C12R 1:66) (C12N 1/19 C12R 1:85) (C12N 1/19 C12R 1:78) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:77) C12R 1:77) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CZ, D , DK, ES, FI, GB, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, LU, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SK, UA, VN (72) Inventor Juan der Headen, Hendrix Theodorus Way M. Netherlands, N.L. 2907 Kerbae Kapere A./D. Yeutsell, Aida 64 (72) Inventor Mustels, Water Netherlands, N. El-3141 El de Mars Lewis, Witzpelspark 138 (72) Inventor Peters, Hans N.L. 3051, Itx B., Netherlands Rotterdam, Safielstraat 12 (72) Inventor Phelips, Cornelis Theodorus N. El-3142, Kerber Maasluis, Haguedorn 18 (72) Inventor De League, Jacob Netherlands, N. El -3142 ARE Bae over Maas Lewis, castagniers over Dar 32

Claims

[Claims] 1. A cutinase mutant of a parent cutinase having an amino acid sequence modified to increase the hydrophobicity of the enzyme surface. 2. The cutinase mutant according to claim 1, wherein the hydrophobicity of the enzyme surface adjacent to the lipid contact region is increased to form an enlarged lipid contact region. 3. The hydrophobicity is increased by substituting one or more amino acid residues with an amino acid residue selected from the group consisting of valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tryptophan and methionine. Cutinase mutant of. 4. The cutinase mutant according to any one of claims 1 to 3, wherein the amino acid sequence is modified so as to not only increase surface hydrophobicity but also to introduce one or more positive charges. 5. The cutinase mutant according to claim 6, wherein a positive charge is introduced by introducing one or more lysine or arginine residues. 6. The cutinase variant according to any one of claims 1 to 5, wherein the amino acid residue to be replaced has a small side chain and is preferably selected from the group consisting of alanine, serine or glycine. 7. The cutinase mutant according to any one of claims 1 to 6, wherein the parent cutinase is a eukaryotic cutinase. 8. The cutinase mutant according to any one of claims 1 to 7, wherein the parent enzyme is a cutinase that immunologically cross-reacts with an antibody against the cutinase derived from Fusarium solani pisi . 9. The cutinase mutant according to any one of claims 1 to 8, wherein the parent enzyme is a cutinase derived from Fusarium solani pisi . 10. The vector whose modified residue is the least squares fit via the Cα-atoms of residues 116-120 of the Fusarium solani pisi cutinase or the corresponding Cα-atoms of different cutinases, and perpendicular to the vector, the Cα-of residue 117 10. A cutinase variant according to any one of claims 1 to 9 located in a molecular part defined by an atom or a plane containing the corresponding Cα-atoms of different cutinases. 11 the first plane perpendicular to the vector in which the modified residue is the least-squares fit through the Cα-atoms of residues 116-120 of the Fusarium solani pisi cutinase 15A away from the Cα-atom of residue 117; 11. A cutinase variant according to any one of claims 1 to 10 which is located in a portion of the molecule which is parallel to the first plane and which is located between the second plane containing the Cα-atom of residue 117. . 12. The modified residues are the following positions of the amino acid sequence of Fusarium solani pisi cutinase or the corresponding positions of different cutinases: 17, 18, 19, 40, 42-46, 50, 53, 54, 58 , 74, 75, 76, 78,80-88,91,92,93,95,96,97,99,100,119,150-156,158,160,168,169,170,172,173,174,176,179,180- 190, 192, 193, 194, 196, 197, 198, 201. The cutinase mutant according to any one of claims 1 to 11, which is located at one or more positions. 13. The modified residues are the following positions of the amino acid sequence of Fusarium solani pisi cutinase or the corresponding positions of different cutinases: 19,41,45,49,54,58,75,76,82,85,92,93,99, The cutinase according to any one of claims 1 to 12, which is located in one or more of 100, 127, 128, 172, 173, 179, 183, 184, 185, 189, 190, 194, 197, 201. Mutant. 14. The following modifications: T19V, G41A, T45K, T45P, * I49a, S54I, N58R, G75R, A76P, G82A, D83S, A85F, A85V, S92R, A93V, L99K, G100R, A127L, A128F, N172K, T173I, T173T. , I183F, V184I, A185L, L189F, A190L, D194R, G197V, E201K were carried out with the amino acid sequence of Fusarium solani pisi cutinase or at the corresponding positions of different cutinases. A cutinase mutant according to item 1. 15. 15. The cutinase variant according to any one of claims 1 to 14, wherein the following modifications: A85F, N172K, E201K were carried out with the amino acid sequence of Fusarium solani pisi cutinase or at the corresponding positions of different cutinase. 16. A cutinase mutation by fermenting an rDNA-modified microorganism containing a gene produced by the rDNA technique encoding a cutinase mutant and separating the cutinase mutant produced by the microorganism from the fermentation broth or by separating the microbial cell from the fermentation broth. 16. Any of claims 1 to 15 comprising the step of producing a body preparation, disrupting the separated cells and concentrating or partially purifying cutinase from or from said broth by physical or chemical concentration or purification methods. A method for producing the cutinase mutant according to the above 1. 17． An rDNA-modified microorganism capable of expressing the cutinase mutant by being transformed with the rDNA vector carrying the gene encoding the cutinase mutant according to any one of claims 1 to 15. Carrying at the 18.5'-end the gene encoding a cutinase mutant introduced into a microorganism by fusion with a gene fragment encoding a (modified) presequence functional as a signal or secretory sequence of the host microorganism. Item 17. The rDNA-modified microorganism according to Item 17. 19. Host microorganism eukaryote, such Saccharom yces sp, rDNA modified microorganism according to claim 17 or 18 which is a fungal yeast or Aspergillus genus Kluyveromyces genus or Hansenula spp. 20. An auxotrophic mutation carrying a recombinant DNA vector encoding the cutinase mutant according to any one of claims 1 to 15 and substituting a gene encoding an auxotrophy marker in one of the progenitor cells. 20. The rDNA-modified microorganism according to any one of claims 17 to 19, which has become a body. 21. A termination codon is present next to the final translation codon, and optionally has a nucleotide sequence encoding the presequence of this cutinase immediately upstream of the nucleotide sequence encoding the mature enzyme. 9. A polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the mature cutinase mutant or the functional equivalent thereof or the mutant thereof according to any one of 1. 22. There is a stop codon next to the final translation codon, optionally at least a portion of the corresponding presequence immediately upstream of the nucleotide sequence encoding the mature enzyme, and / or a signal or secretory sequence suitable for the host microorganism selected. A polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the cutinase mutant according to any one of claims 1 to 15, which has a nucleotide sequence encoding 23. A polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the mature cutinase mutant according to any one of claims 1 to 15, a functional equivalent thereof or a mutant thereof, which is derived from a microorganism of a production source. A nucleotide sequence encoding a variant is preferred by the new host according to any one of claims 17 to 20 to the subject of a'silent 'mutation of at least one codon, preferably as many codons as possible. The polynucleotide, which is modified to form a codon that encodes an equivalent amino acid residue that is a codon, thereby providing a transgene mRNA with improved stability when used in the cell of the host. 24. A nucleotide sequence encoding a signal sequence or secretory sequence suitable for a host according to any one of claims 17 to 20 is located upstream of a nucleotide sequence encoding a pro or mature cutinase variant. The polynucleotide according to any one of 1. 25. (A) a double-stranded (ds) DNA encoding a mature cutinase variant, or a plectinase, or a corresponding plectinase with at least a portion of the presequence removed immediately downstream of the secretion signal (preferred for the selected host cell). However, provided that the part of the gene to be translated does not start with the codon ATG, it should be preceded by the ATG codon, and the part of the gene to be translated ends with the appropriate stop codon, ie (B) an expression regulon (suitable for the host microorganism of choice) located upstream of the plus strand of the ds DNA encoding the cutinase variant (component (a)), to which codons are to be added; (C) located downstream of the plus strand of the ds DNA encoding the cutinase variant (component (a)) (suitable for the host microorganism of choice) A) a terminator sequence; (d1) a nucleotide sequence facilitating the incorporation of ds DNA into the genome of the selected host, or (d2) an origin of replication suitable for the selected host; (Required) selectable marker; (e2) optionally comprising a ds DNA sequence encoding a protein involved in maturation and / or secretion of one precursor form of the cutinase variant in the selected host A recombinant DNA vector capable of directing the expression of a nucleotide sequence encoding a cutinase mutant gene. 26. 26. The recombinant DNA vector according to claim 25, which further carries another sequence that facilitates functional expression of cutinase upstream and / or downstream of the polynucleotide defined above. 27. The recombinant DNA vector according to claim 25 or 26, which carries an auxotrophic marker comprising an auxotrophic marker coding region and a defective promoter region. 28. An enzyme detergent composition comprising the cutinase mutant according to any one of claims 1 to 15.