JPH08509364A

JPH08509364A - Lipase mutant

Info

Publication number: JPH08509364A
Application number: JP6523626A
Authority: JP
Inventors: スベンセン，アラン; アナンパトカー，シャムカン; ゴームセン，エリク; グロスクローセン，イーベー
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-04-23
Filing date: 1994-04-22
Publication date: 1996-10-08
Also published as: EP0695348A1; DK46693D0; FI955018A; WO1994025577A1; BR9406384A; CN1124039A; FI955018A0; AU6535894A

Abstract

(57)【要約】リパーゼ分子の主として疎水性である長い結合ポケットの中に位置している活性セリンを含むトリプシン様触媒性トリアドを含んで成るリパーゼは、そのリパーゼ構造の活性リパーゼ残基を含んでいる部分において位置している、加水分解時に基質との相互作用を司りうる残基を含んで成る脂質接触ゾーンの非芳香族アミノ酸を芳香族アミノ酸により置換するよう、突然変異されている。 (57) [Summary] A lipase comprising a trypsin-like catalytic triad containing an active serine located in a predominantly hydrophobic long binding pocket of the lipase molecule is located in the portion of the lipase structure containing the active lipase residue. Has been mutated to replace the non-aromatic amino acids in the lipid contact zone comprising aromatic residues with residues that are capable of interacting with the substrate during hydrolysis.

Description

【発明の詳細な説明】リパーゼ変異体発明の分野本発明は改善された性質を有する新規のリパーゼ酵素変異体、前記変異体の実現についてコードするDNA構築体、このDNA構築体からこの変異休を発現せしめることのできる宿主細胞、及び前記宿主細胞を培養することによるこの変異体の製造方法に関する。発明の背景組換DNA技術の到来及び発展はタンパク質化学の分野において深遠な影響を及ぼした。これらの技術は特定の基準に従ってペプチド及びタンパク質、例えば酵素のデザインを可能なものとすると考えられ、それ故所望の特性を有する化合物の製造を可能とする。かかる技術の有用性に基づき、所望のアミノ酸配列を有する酵素を構築することが可能となり、そしてかなりの数の研究がこの目的に向けられている。多数のリパーゼの一次構造が決定され、そして論文に記載されている（Boelら、Lipids 23，701-706(1988)，de Caroら、Biochim．Biophys．Acta 671，129-1 38(1981)，Winklerら、Nature 343，771-774(1900)）。真に、より限定された数のリパーゼの三次構造も推定されている（Winklerら、Nature 343，771-774(199 0)，Bradyら、Nature 343，767-770(1990)，J．D．SchragらNature 351，1991、真761-764）。これらの研究から、リパーゼは共通して一定の構造的特徴を有するが、しかしその一方、主要の構造的変異もリパーゼ間で存在することが明らかとなった。 WO 92/05249は向上したリパーゼ特性を有するリパーゼであって、野生型リパーゼ酵素の一定の特徴がそのアミノ酸配列の特異的な改変により変更されているリパーゼを開示する。例えば、主に天然リパーゼ分子の中に存在しているアミノ酸残基を置換又は欠失させることにより、野生型リパーゼ酵素のいわゆる脂質接触ゾーンの静電荷及び／又は疎水性が変化されており、更にはその活性部位に対する脂質基質の接近性が向上されている。発明の概要本発明者は驚くべきことに、向上した特性を有する新規のリパーゼ変異体の構築を招く更なるアミノ酸改変をこの度同定した。従って、一の観点において、本発明は主として疎水性であるリパーゼ分子の長い結合性ポケットの中に位置している活性セリンを含むトリプシン様触媒性トリアドを含んで成る親リパーゼ変異体であって、リパーゼ構造のこの活性セリン残基を含む部において位置している、加水分解時に基質との相互作用を司りうる残基を含んで成る脂質接触ゾーンの非芳香族アミノ酸残基が芳香族アミノ酸残基により置換されている変異体に関する。以下の開示において、このタイプのリパーゼ変異体をリパーゼ変異体Ｉと呼ぶ。本明細書において、「トリプシン様」なる語は、親リパーゼが触媒性トリアド、即ち、Ser，His及びAsp，Glu，Asn又はGlnのいづれかのアミノ酸を、トリプシンのそれに対応する活性部位において含んで成ることを意味するつもりである。一部のリパーゼは、リパーゼが不活性形態にあるときにその活性セリンを覆っている表層ループ構造も含んで成りうる（かかるリパーゼの例はBradyら、Nature 343 ，1990、頁767-770に記載されている）。リパーゼが活性化されているとき、そのループ構造はシフトして活性部位残基が露出し、加水分解の際に脂質基質と相互作用する疎水性の高められた表層が生み出される。本目的にとって、この表層は「脂質接触ゾーン」と呼び、この表層（又はかかるループ構造を含まないリパーゼの対応の表層）部に位置する又はそれを構成するアミノ酸残基を含むことを意図する。任意的にループ構造の形態におけるアミノ酸残基は、リパーゼが脂質表層との接触により活性化されたときにその脂質相からトリグリセリドを加水分解するとき、その加水分解時の基質とのリパーゼ相互作用を司りうる。トリグリセリドの加水分解の際、脂肪酸並びにモノー及びジーグリセリドが様々な量で形成される。本願で説明するヒュミコラ・ラヌギノーザ（Humicola lanuginosa）リパーゼの脂質接触ゾーンはアミノ酸残基21-25，36-38，56-62，81-98，110-116，144-1 47，172-174，199-213及び248-269と定義される。これらの残基はリパーゼと脂質基質との相互作用のコンピューターモデルシミュレーションを基礎に同定した。本明細書において、「芳香族アミノ酸残基」とはチロシン、トリプトファン又はフェニルアラニンの残基を意味し、そして「非芳香族アミノ酸残基」なる語は、チロシン、トリプトファン又はフェニルアラニン以外のアミノ酸残基を含むつもりである。更なる観点において、本発明は特異的なリパーゼ変異体であって、WO 92/0524 9に開示されているヒュミコラ・ラヌギノーザリパーゼ（そのcDNA及びアミノ酸配列はSEQ ID No.１及び２に示す）の特定の位置の、又は他の起源のリパーゼの類似の位置の１又は複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基により置換されている変異体に関する。これらの変異体を更に詳細する。本発明は更に上記のリパーゼ変異体をエンコードするDNA配列を含んで成るDNA 構築体、前記DNA構築体を担持している組換発現ベクター、このDNA構築体又は発現ベクターで形質転換された細胞、及び本発明のリパーゼ変異体を製造する方法であって、前記細胞をこのリパーゼ変異体の生産を誘発する条件下で培養し、その後そのリパーゼ変異体をその培養物から回収することによる方法に関する。更に本発明は、任意的に無塵顆粒、安定化液体又は保護酵素の形態の本発明のリパーゼ変異体を含んで成る洗浄添加組成物、及び本発明のリパーゼ変異体を含んで成る洗浄組成物に関する。発明の詳細な開示本発明に係るリパーゼ変異体を説明するうえで、参照のし易さのために以下の命名法を利用した：もとの（複数の）アミノ酸：（複数の）位置：（複数の）置換化アミノ酸この命名法に従うと、例えば位置96でのアスパラギン酸のトリプトファンによる置換は以下の通りである： Asp 96 Trp又はD96W 多重突然変異はプラスにより分けられる、即ち： Asp 96 Leu＋Leu 206 Val又はD96L＋L206V これは、位置96及び206における、アスパラギン酸及びロイシンの、ロイシン及びバリンによるそれぞれの置換を表している。このリパーゼ変異体はほとんど慣用の１文字アミノ酸の利用により特定している。本発明に従うと、リパーゼ変異体Ｉは好ましくは、置換されるべき非芳香族アミノ酸残基がグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、そして好適にはSEQ ID N o.２に示している成熟Ｈ．ラヌギノーザリパーゼのアミノ酸配列の位置96に、又は更に以下に詳細する通り別の起源の親リパーゼの類似の位置に存在しているものである。前記Ｈ．ラヌギノーザリパーゼから調製ざれた本発明の特異的なリパーゼ変異体は以下の通りに置換された１又は複数のアミノ酸残基を含んで成る： E56H，Ｐ，Ｍ，Ｗ，Ｙ，Ｆ，Ｉ．Ｇ，Ｃ，Ｖ； D96H，Ｅ，Ｐ，Ｍ，Ｗ，Ｙ，Ｆ，Ｉ，Ｇ，Ｃ，Ｖ； L259N，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ； L206K，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｈ，Ｉ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ特に興味深い効果は本発明のリパーゼ変異体が１個より多くの置換、好ましくは２個の置換を含んで成るときにも得られうる。例えば、Ｈ．ラヌギノーザリパーゼの以下の変異体が興味深いことが見い出された： D96W＋E210N； D254K＋L259I； D96L＋L206V； D96L＋L206S； D96W＋D102N； D96L＋L259I＋L206V； E56Q＋L259I＋L206V．Ｈ．ラヌギノーザリパーゼについて前記したものと類似の置換により他の起源のリパーゼから調製したリパーゼ変異体も本発明の範囲に属すると考えられる。本明細書において、「類似の置換」なる語は、Ｈ．ラヌギノーザリパーゼについて上記に特定したものと類似の位置において施した、他のリパーゼのアミノ酸置換を意味するつもりである。類似の位置はＨ．ラヌギノーザの三次元構造と課題のリパーゼのそれどの対比を基礎に特定されうる。Ｈ．ラヌギノーザの三次構造はWO 92/05 249のFig．1A及び1Bに示され、そして改変すべき親リパーゼの三次元構造は、公知であるか、又は例えばＸ線分析を含む慣用の方法により推定されうる。置換すべきアミノ酸残基及び挿入すべきものは同タイプのアミノ酸に属するもの（例えば疎水性、親水性等）であることが好ましいが、Ｈ．ラヌギノーザリパーゼの実際のアミノ酸残基と同一である必要はない。親リパーゼは様々な起源、例えば膵臓、胃、肝臓又はリポタンパク質リパーゼに由来しうるが、一般に微生物リパーゼが好ましい。従って、親リパーゼは酵母、例えばカンジダ（Candida）リパーゼ、細菌、例えばシュードモナス（Psendom onas）リパーゼ、又は菌類、例えばヒュミコラもしくはリゾムコール（Rhizomuc or）リパーゼから選ばれうる。構造的に同族のリパーゼの群から親リパーゼを選ぶことが特に好ましい。例えば、親リパーゼはリゾムコール・ミーヘイ（Rhizom ucor miehei）リパーゼ、特にEP 238,023に記載のリパーゼ、又は上記のＨ．ラヌギノーザリパーゼであってよい。Ｈ．ラヌギノーザのリパーゼ及びリゾムコール・ミーヘイのリパーゼは同一のリパーゼ群に属することに注目すべきである。これは、２つのリバーゼの全体的な三次元構造が非常に似ていることを意味し、そしてＸ線結晶グラフにより非常に相同性であることが示されている（Ｈ．ラヌギノーザ及びRh．ミーヘイのリパーゼのコンピューターモデルは、WO 92/05249のFig．1AとＢ、及び2AとＢにそれぞれ示されており、それよりこれら２つのリパーゼの脂質接触ゾーン間の類似性が明確にされている）。従って、Ｈ．ラヌギノーザリパーゼについて指定する改変のタイプはRh．ミーヘイのリパーゼにとっても機能的であろう。本発明に従うと、上記のアミノ酸配列のいづれかの改変を、本明細書に記載の別のいづれかの改変又はWO 92/05249に記載のいづれかの改変と組合せてよい。本発明のリパーゼ変異体は、親リパーゼをエンコードするDNA配列を単離し、その配列を例えば部位特異的突然変異誘発によって課題の変異体をエンコードするように適当に改変し、次いでその改変DNA配列を課題の変異体を発現できる適当な宿主生物に導入することによって調製されうる。本発明のDNA構築体のDNA配列はcDNA、ゲノムDNAもしくは合成DNA配列、又は慣用の技術に従って得られるかかる配列の任意の組合せであってよい。DNA配列をクローン及び突然変異するための適当な技術は、その開示内容を引用することに本明細書に組入れるWO 92/05 249に詳細に開示されている。以下の実施例にその技術を更に例示する。本発明のリパーゼ変異体の発現は以下のようにして得られうる。例えばWO 92/ 04249に記載の通りにして、又は当業界に公知の任意のそれに代わる方法により作った突然変異リパーゼをコードする配列は、一般にプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び任意的にレプレッサー遺伝子又は様々な活性化遺伝子をエンコードするコントロール配列を含む発現ベクターを用い、酵素形態で発現されうる。発現タンパク質の分泌を可能とするため、「シグナル配列」をエンコードするヌクレオチドをリパーゼコード配列の前に挿入してよい。コントロール配列の誘導下での発現のため、本発明に従って処理すべき標的遺伝子は適当なリーディングフレームの中でコントロール配列と作動的に連結されている。プラスミドベクターの中に一体化でき、且つ突然変異リパーゼ遺伝子の転写を補助できるプロモーター配列には、限定することなく、原核系β− ラクタマーゼプロモーター（Villa-Kamaroffら、1978，Proc．Natl．Acad．Sci ．U．S．A．75：3727-3731）及びtacプロモーター（DeBoerら、1983，Proc．Nat l．Acad．Sci．U．S．A．80 ：21-25）が含まれる。更なる参考はScientific American，1980，242：74-94 の「Useful proteins from recombinant bacteria」においても見い出せうる。一の態様に従うと、バチルス（Bacillus）属の細胞、例えばＢ．リシェニホルミス（B．licheniformis）、Ｂ．レンタス（B．lentus）又はＢ．スブチリス（B ．subtilis）を、突然変異DNAを担持する発現ベクターにより形質転換してよい。発現を分泌性微生物、例えばＢ．スブチリスの中で行うとき、シグナル配列が、翻訳開始シグナルに後続し、且つ課題のDNA配列に先行していてよい。シグナル配列は発現生成物を細胞壁まで運搬するのを司り、そこでそれは分泌後にその生成物から解裂する。上記の「コントロール配列」な語は、存在しているなら、シグナル配列を含むことを意図する。本発明のリパーゼ変異体を製造する現状好適な方法において、糸状菌を宿主生物として用いる。糸状菌宿主生物は組換タンパク質を製造するための宿主として従来利用されているものであることが好都合であり、例えばアスペルギルス（As pergillus）種の株、例えばＡ．ニガー（A．niger）、Ａ．ニドゥランス（A．ni dulans）又はＡ．オリザ（A．oryzae）である。組換タンパク質の製造におけるＡ．オリザの利用は例えばEP 238,023に詳しく記載されている。アスペルギルスの中でのリパーゼ変異体の発現のためには、このリパーゼ変異体をコードするDNA配列にプロモーターが先行している。このプロモーターはアスペルギルスの中で強力な転写活性を発揮する任意のDNA配列であってよく、そしてアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又は解糖酵素の如くの細胞外又は細胞内タンパク質をエンコードする遺伝子に由来しうる。適当なプロモーターの例は、Ａ．オリザTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイアスパラギン酸プロティナーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイリパーゼ、Ａ．オリザアルカリ性プロテアーゼ、又はＡ．オリザトリオースリン酸イソメラーゼをエンコードする遺伝子に由来するものである。特に宿主生物がＡ．オリザであるとき、本発明の方法における利用にとって好適なプロモーターはＡ．オリザTAKAアミラーゼプロモーターであり、なぜならそれはＡ．オリザの中で強力な転写活性を発揮するからである。TAKAアミラーゼプロモーターの配列はEP 238,023より明らかとされている。終止及びポリアデニル化配列はプロモーターと同じ起源に由来するのが適当でありうる。菌類の宿主細胞を形質転換するのに用いる技術はEP 238,023に記載の通りであるのが適当でありうる。宿主細胞からのリパーゼ変異体の分泌を確実なものとするため、リパーゼ変異体をエンコードするDNA配列にはシグナル配列が先行していてよく、それは細胞からのタンパク質の分泌を司る天然シグナル配列であるかもしくはその機能部分、又は合成配列であってよい。詳しくは、このシグナル配列はアスペルギルス種のアミラーゼもしくはグルコアミラーゼをエンコードする遺伝子、リゾムコール・ミーヘイリパーゼもしくはプロテアーゼをエンコードする遺伝子、又はヒュミコラ・セルラーゼ、キシラナーゼもしくはリパーゼをエンコードする遺伝子に由来しうる。このシグナル配列は好ましくは、Ａ．オリザTAKAアミラーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラーゼ又はＡ．ニガーグルコアミラーゼをエンコードする遺伝子に由来する。形質転換宿主細胞を培養するのに用いる培地はアスペルギルス細胞を増殖するのに適当な任意の慣用の培地であってよい。その形質転換体は通常安定なものであり、そして淘汰圧抜きで培養できうる。しかしながら、もし形質転換体が不安定であることが見い出されたなら、細胞の中に導入する選択マーカーを選択のために利用してよい。宿主細胞から分泌した成熟リパーゼタンパク質は、その培養培地から、遠心又は濾過によって細胞を培地から分ける、そして硫酸アンモニウムの如くの塩によりその培地のタンパク質性成分を沈殿させる、それに続くイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーの如くのクロマトグラフィー手順を含む公知の手順によって、慣用的に回収できうる。洗浄組成物本発明に従い、リパーゼ変異体は一般に洗浄組成物の成分でありうる。従って、それは無塵顆粒、安定化液体又は保護酵素の形態で洗浄組成物の中に含まれていてよい。無塵顆粒は例えばUS 4,106,991及び4,661,452（共にNovo Industri A /Sに属する）に開示の通りに製造でき、そして任意的に当業界公知の方法によりコートされていてよい。ワキシーコーティング材料の例は、1000〜20000の平均モル重量を有するポリ（エチレンオキシド）生成物（ポリエチレングリコール、 PEG）、16〜50個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を有しており、そして15〜80個のエチレンオキシド単位が存在しているエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。流動層技術による塗布にとって適当なフィルム形成コーティング材料の例は特許GB 1483591に示されている。液体酵素調製品は、例えば、プロピレングルコールの如くのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸又は硼酸を、確立された方法に従って加えることにより安定化する。その他の酵素安定化剤も当業界に公知である。保護酵素はEP 238,216に開示の方法に従って調製されうる。本発明の洗浄組成物は、粉末、顆粒、ペースト又は液体の如くの任意の好都合な形態であってよい。液体洗剤は水性であってく、一般に70％までの水及び０〜 30％の有機溶媒を含むか、又は非水性である。洗浄組成物は１又は複数の界面活性剤を含んで成り、それぞれはアニオン、非イオン、カチオン又は双イオン性であってよい。洗剤は通常０〜50％のアニオン性界面活性剤、例えば線形アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、アルファーオレフィンスルホネート（AOS）、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）（AS）、アルコールエトキシスルフェート（AEOS又はAES）、第二アルカンスルホネート（SAS）、アルファースルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル−コハク酸又は石けんを含むであろう。それはまた０〜40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート（AEO又はAE）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミン、脂肪酸モノエタノールアミド又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（WO 92/06154に記載）も含みうる。この洗浄組成物は更に１又は複数のその他の酵素、例えばアミラーゼ、リパーゼ、キュティナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ又はオキシダーゼを含んで成りうる。洗剤は１〜65％の洗浄ビルダー又は錯形成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸（NTA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTMPA）、アルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層状シリケート（例えばHoechst由来のSKS-６）を含みうる。洗剤はビルダー無し、即ち洗浄ビルダーを本質的に含まなくてもよい。洗剤は一又は複数のポリマーを含んで成りうる。その例は、カルボキシメチルセルロース（CMC）、ポリ（ビニルピロリドン）（PVP）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ（ビニルアルコール）（PVA）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸・アクリル酸コポリマー及びメタクリル酸ラウリル・アクリル酸コポリマーである。洗剤は漂白系であって、H₂O₂起源、例えばテトラアセチルエチレンジアミン（ TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）の如くの過酸一形成漂白活性化剤と組合せられうる過ホウ酸塩又は過炭酸塩を含んで成りうる系を含みうる。他方、この漂白系はアミド、イミド又はスルホンタイプの如くの過オキシ酸を含んで成りうる。本発明の洗浄組成物の酵素は慣用の安定化剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコールもしくはグリセロール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステルを利用して安定化することができ、そしてこの組成物は例えばWO 92/19707及びWO 92/19708に記載の通りにして配合してよい。洗剤はその他の洗浄成分、例えば布帛コンディショナー、例えば粘土、発泡促進剤、泡抑制剤、耐触剤、土壌懸濁剤、土壌再付着防止剤、色素、殺菌剤、光学漂白剤、又は香料も含みうる。 pH（使用濃度での水性溶液において測定）は通常中性又はアルカリ性、例えば７〜11であろう。本発明の範囲に属する洗浄組成物の特定の形態には以下のものが含まれる：１）以下のものを含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌのバルク密度を有する顆粒として配合された洗浄組成物。２）以下のものを含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌのバルク密度を有する顆粒として配合された洗浄組成物。３）以下のものを含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌのバルク密度を有する顆粒として配合された洗浄組成物。４）以下のものを含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌのバルク密度を有する顆粒として配合された洗浄組成物。５）以下のものを含んで成る、水性液体洗浄組成物。６）以下のものを含んで成る、水性構築化液体洗浄組成物。７）以下のものを含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌのバルク密度を有する顆粒として配合された洗浄組成物。８）以下のものを含んで成る、顆粒として配合された洗浄組成物。９）以下のものを含んで成る、顆粒として配合された洗浄組成物。 10）以下のものを含んで成る、水性液体洗浄組成物。 11）以下のものを含んで成る、水性液体洗浄組成物。 12）以下のものを含んで成る、少なくとも600ｇ／ｌのバルク密度を有する顆粒として配合された洗浄組成物。 13）線形アルキルベンゼンスルホネート又はその一部がアルキルスルフェート（Ｃ₁₂−Ｃ₁₈）により置換された、１）〜12）に記載の洗浄組成物。 14）追加の成分として、又は特定した漂白系の代替品として安定化又は封入化過酸を含む１）〜13）に記載の洗浄組成物。 15）過ホウ酸塩が過炭酸塩により置換された、３），７），９）及び12）に記載の洗浄組成物。 16）液体非イオン性界面活性剤、例えば線形アルコキシル化第一アルコール、ビルダー系（例えばホスホネート）、酵素及びアルカリを含んで成る非水性洗浄液体として配合された洗浄組成物。本発明のリパーゼ変異体は、洗剤の中で通常利用されている濃度に含まれうる。本発明の洗浄組成物において、リパーゼ変異体は洗浄液１リットル当り0.001 〜100mgの酵素に対応する量で加えてよいと現状考えられている。皿洗い用の洗浄組成物更に、このリパーゼ変異体は皿洗い用洗浄組成物の中の成分として利用されうる。皿洗い用の洗浄組成物は、アニオン、非イオン、カチオン、双イオン又はこれらのタイプの混合物でありうる界面活性剤を含んで成る。この洗剤は０〜90％の非イオン性界面活性剤、例えば低一〜非一発泡性エトキシル化プロポキシル化直鎖アルコールを含むであろう。この洗浄組成物は無機及び／又は有機系の洗浄ビルダー塩を含みうる。この洗浄ビルダーは、燐含有及び無燐タイプに分けられる。洗浄組成物は通常１〜90％の洗剤ビルダーを含む。存在しているとき、燐含有無機アルカリ洗浄ビルダーの例には、水溶性塩、特にアルカリ金属ピロホスフェート、オルトホスフェート、ポリホスフェート及びホスホネートが含まれる。存在しているとき、無燐無機ビルダーの例には、水溶性アルカリ金属カルボネート、ボレート及びシリケート、並びに様々なタイプの水不溶性結晶又はアモルファスアルミノシリケートが含まれ、そのうちゼオライドが最も良く知られている代表である。適当な有機ビルダーの例にはアルカリ金属、アンモニウム及び置換化アンモニウム、クエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、脂肪酸スルホン酸塩、カルボキシメトキシコハク酸塩、アンモニウムポリアセテート、カルボキシレート、ポリカルボキシレート、アミノポリカルボキシノート、ポリアセチルカルボキシレート及びポリヒドロキシスルホン酸塩が含まれる。その他の適当な有機ビルダーには、ビルダー特性を有することで知られている高分子量ポリマー及びコポリマー、例えば適当なポリアクリル酸、ポリマレイン酸、及びポリアクリル酸、ポリマレイン酸コポリマー、並びにそれらの塩が含まれる。皿洗い用洗浄組成物は塩素／臭素系又は酸素系の漂白剤を含みうる。無機塩素／臭素系漂白剤の例は、リチウム、ナトリウム又はカルシウム次亜塩素酸塩及び次亜臭素酸塩、並びに塩素化リン酸三ナトリウムである。有機塩素／臭素系漂白剤の例は、複素環Ｎ−ブロモ及びＮ−クロロイミド、例えばトリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸及びジクロロイソシアヌル酸、並びに水溶性カチオン、例えばカリウム及びナトリウムとのその塩である。酸素系漂白剤は、好ましくは漂白プレカーサーを伴う無機過塩の形態において、又はペルオキシ酸化合物として好ましい。適当なペルオキシ漂白化合物の典型例は、アルカリ金属過ホウ酸塩の四水和物及び一水和物、アルカリ金属過炭酸塩、過珪酸塩及び過リン酸塩である。好適な活性化材料はTAED及びグリセロール三酢酸塩である。本発明の皿洗い用洗浄組成物は酵素にとっての慣用の安定化剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステルを用いて安定化されうる。この皿洗い用洗浄組成物はまたその他の酵素、特にアミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はセルラーゼを含みうる。本発明の皿洗い用洗浄組成物はまたその他の慣用の洗剤成分、例えば解膠剤、充填剤、発泡抑制剤、耐触剤、土壌懸濁剤、封鎖剤、土壌再付着防止剤、脱水剤、色素、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤及び香料を含みうる。最後に、本発明の変異体は慣用の皿洗い用洗剤、例えば下記の特許公開公報のいづれかに記載のいづれかの洗剤において利用してよい： EP 551670，EP 533239，WO 9303129，EP 507404，US 5141664，GB 2247025，E P 414285，GB 2234980，EP 408278，GB 2228945，GB2228944，EP 387063，EP 38 5521，EP 373851，EP 364260，EP 349314，EP 331370，EP 318279，EP 318204， GB 2204319，EP 266904，US 5213706，EP 530870，CA 2006687，EP 481547，EP 337760，WO 93/14183，US 5223179，WO 93/06202，WO 93/05132，WO 92/19707， WO 92/09680，WO 92/08777，WO 92/06161，WO 92/06157，WO 92/06156，WO 91/1 3959，EP 399752，US 4941988，US 4908148。柔軟組成物更に、本発明のリパーゼ変異体は柔軟組成物の中に使用してよい：このリパーゼ変異体は布帛柔軟剤、例えばSurfactant and Consumer Products ，Ed.，J．Falbe，1987，pp 295-296；Tenside Surfactants Detergents，30（1 993），6，pp 394-399；JAOCS，Vol.61（1984），2，pp 367-376；EP 517 762； EP 123 400；WO 92/19714；WO 93/19147；US5,082,578；EP 494 769；EP 544 49 3；EP 543 562；US 5,235,082；EP 568 297；EP 570 237に記載の柔軟剤に使用できうる。図面の簡単な説明本発明を添付図面を参考に以降説明するが、ここで図１はポリメラーゼ連鎮反応（PCR）によるリパーゼ変異体をエンコードするプラスミドの調製の模式図であり；そして図２はPCRによる三段突然変異誘発の模式図である。本発明を以下の実施例において更に説明し、それらは本発明の範囲を限定するものではない。一般方法アスペルギルス・オリザの中でのＨ．ラヌギノーザリパーゼの発現Ｈ．ラヌギノーザリパーゼのクローニングはEP 305,216に記載されている。この特許文献はアスペルギルス・オリザにおけるリパーゼの発現及び特性化も述べている。使用している発現プラスミドをp960と呼ばれている。本願において使用している発現プラスミドはp960と同じであるが、ただしリパーゼコード領域のすぐ３’側にわずかな改変がある。この改変は以下のようにして施した：p960をNruＩ及びBamHＩ制限酵素で消化した。これら２つの部位の間に、プラスミドpBR322由来のBamHＩ/Nhe Ｉフラグメント（そのNheＩフラグメントはクレノウポリメラーゼで補完してある）をクローンし、これにより固有BamHＩ及びNheＩ部位を含むプラスミドpA01 （WO 92/05249のFig.５に示してある）を作り上げた。これらの固有部位の間に、p960由来のBamHＩ/XbaＩフラグメントをクローンし、pAHLを得た（WO 92/0524 ９のFig.６に示してある）。リパーゼ遺伝子の部位特異的インビトロ突然変異誘発リパーゼ遺伝子の中に突然変異を導入するために用いる手法はNelson & Long ，Analytical Biochemistry，180，147-151（1989）に記載されている。これはP CR（ポリメラーゼ連鎮反応）反応においてプライマーの１つとして化学合成DNA 鎖を利用することによって導入した所望の突然変異を含むPCRの３段作製を包括する。PCR作製フラグメントから、その突然変異を担持しているDNAフラグメントを制限酵素による消化によって単離でき、そして発現プラスミドの中に再挿入できる。この方法は実施例３の中に詳しく説明する。図１及び２において、この方法を更に概略する。実施例実施例１Ｈ．ラヌギノーザリパーゼのD96W変異体を発現するプラスミドの構築ブラスミドpAHLの線状化円形のプラスミドpAHLを制限酵素SphＩにより、以下の50μｌの反応混合物：5 0mMのNaCl，10mMのトリス−HCl，pH7.9，10mMのMgCl₂，１mMのジチオスレイトール、１μｇのプラスミド及び２ユニットのSphＩの中で線状化した。消化は37℃ で２時間行った。この反応混合物をフェノール（トリス−HCl，pH7.5で平衡化）で抽出し、そして２容量の氷冷96％エタノールを加えることにより沈殿させた。遠心及びペレットの乾燥後、線状化したDNAを50μｌのH₂Oの中に溶かし、そしてその濃度をアガロースゲル上で推定した。３段PCR突然変異誘発図２に示す通り、３段突然変異誘発は４種のプライマーの使用を包括する：３工程は全て以下のものを含むバッファーの中で行った：10mMのTris-HCl，pH 8.3，50mMのKCl，1.5mMのMgCl₂，0.001％のゼラチン、0.2mMのdATP，0.2mMのdCT P，0.2mMのdGTP，0.2mMのTTP，2.5ユニットのTaqポリメラーゼ。工程１において、100pmolのプライマーＡ，100pmolのプライマーＢ及び１fmol の線状化プラスミドを全部で100μｌの反応混合物に加え、そして95℃で２分、3 7℃で２分及び72℃で３分より成る15サイクルを行った。 PCR生成物の濃度はアガロースゲル上で評価した。次に、工程２を実施した。0 .6pmolの工程１生成物及び１fmolの線状化プラスミドを全部で100μｌの前記バッファーの中に含ませ、そして95℃で５分、37℃で２分及び72℃で10分より成る１サイクルを実施した。この工程２の反応混合物に、100pmolのプライマーＣ及び100pmolのプライマーＤを加え（１μｌづつ）、そして95℃で２分、37℃で２分及び72℃で３分より成る20サイクルを実施した。この操作は突然変異手順の工程３を構成する。突然変異制限フラグメントの単離工程３由来の生成物をアガロースゲルから単離し、そして20μｌのH₂Oに再溶解した。次いで、それを制限酵素BamHＩ及びBstxＩにより、総容量50μｌの以下の組成において消化した：100mMのNaCl，50mMのトリス−HCl，pH7.9，10mMのMgC l₂，１mMのDTT及び10ユニットづつの酵素。インキュベーションは37℃で２時間とした。アガロースゲルから733bpのBamHＩ／BstxＩフラグメントが単離された。発現ベクターpAHLへのリゲーション発現プラスミドpAHLをBamHＩ及びBstxＩにより上記の条件下で解裂させ、そして大型フラグメントをアガロースゲルから単離した。このベクターに、上記で単離した突然変異フラグメントをリゲートし、そしてそのリゲーション混合物をＥ．コリ（E．coli）を形質転換するのに用いた。フラグメントの存在及び配向は制限酵素による形質転換体由来のプラスミド調製品の解裂により確認した。配列分析はSangerにより開発されたジーデオキシ連鎖停止手順を利用し、二本鎖プラスミドで行った。このプラスミドをpAHLD96Wと命名し、それは改変コドンを除き、pAHLと同一である。実施例２Ｈ．ラヌギノーザリパーゼの他の変異体を発現するプラスミドの構築以下の変異体を実施例１と同じ方法を利用して構築したが、ただし制限酵素Xh oＩ及びBstxＩを、PCR-生成物、並びにD254K/L259I及びL259Iについての突然変異フラグメントの再クローニングのために用いるベクターを消化するために用いた。改変のために用いたプラスミドの名称及びプライマーを以下に記す。実施例３アスペルギルス・オリザの形質転換（一般手順） 100mlのYPD（Shermanら、Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor L aboratory，1981）にＡ．オリザの胞子を接種し、そして振盪しながら24時間インキュベートした。その菌系体をミラクロスでの濾過により回収し、そして200m lの0.6ＭのMgSO₄で洗った。その菌系体を15mlの1.2ＭのMgSO₄，10mMのNaH₂PO₄， pH＝5.8の中に懸濁した。この懸濁物を氷上で冷やし、そして120mgのNovozym234 バッチ1687を含むバッファー１mlを加えた。５分後、１mlの12mg／mlのBSA（Sig ma Type H25）を加え、そしてゆっくりとした撹拌を伴う37℃でのインキュベーションを1.5〜2.5時間、サンプル中に大量のプロトプラストが顕微鏡で見えるようになるまで行った。この懸濁物をミラクロスで濾過し、その濾液を滅菌チューブに移し、そして５ mlの0.6Ｍのソルビトール、100mMのトリス−HCl，pH＝7.0をかぶせた。遠心を10 00ｇで15分行い、そしてそのプロトプラストをMgSO₄クッションの上部から回収した。２容量のSTC（1.2Ｍのソルビトール、10mMのトリス−HCl，pH7.5，10mM C aCl₂）をそのプロトプラスト懸濁物に加え、そしてその混合物を1000ｇで５min 遠心した。そのプロトプラストペレットを３mlのSTCに再懸濁し、そして再ペレット化した。これを繰り返した。最後に、このプロトプラストを0.2−１mlのSTCの中に再懸濁した。100μｌのプロトプラスト懸濁物を10μｌのSTC中の５〜25μｇのp3SR₂（Hynesら、Mol．and Cel．Biol．、第３巻、第８号、1430-1439，1983年８月に記載のＡ．ニドゥランスamdS遺伝子担持プラスミド）と混合した。その混合物を室温で25分放置した。0.2mlの60％のP EG 4000（BDH 29576），10mMのCaCl₂及び10mMのトリス−HCl，pH＝7.5を加え、そして慎重に混合し（２回）、そして最後に0.85mlの同一の溶液を加え、そして慎重に混合した。その混合物を室温で25分放置し、2,500ｇで15分遠心した。もう一回の沈殿化の後、そのプロトプラストを1.0Ｍのスクロース、pH−7.0、窒素源としての10mMのアセトアミド及びバックグランド増殖を阻止するための20mMの CsClを含む最小プレート（Cove，Biochem．Biophys．Acta 113(1966)51-56）の上にまいた。37℃で４〜７日のインキュベーション後、胞子をひろい、滅菌水の中に懸濁し、そして単独コロニーのために散布した。この手順を繰り返し、そして第二再単離を経た単独コロニーを規定の形質転換体として保存した。実施例４Ａ．オリザの中でのリパーゼ変異体D96Wの発現 pAHLD96WをＡ．オリザIFO 4177の中に、実施例３記載のＡ．ニドゥランス由来のamds遺伝子を含むp3SR₂との同時形質転換により形質転換した。上記の通りに調製したプロトプラストを約５μｇづつのpAHLD96Wとp3SR₂との同量混合物とインキュベートした。唯一の窒素源としてアセトアミドを利用できる９つの形質転換体を２回再単離した。YPD上で３日間増殖後、培養上清物を実施例５（本発明のリパーゼ変異体の精製）に記載してあるリパーゼ活性アッセイを利用して分析した。最良の形質転換体を更なる試験のために選定し、そして200mlのFG4培地（３％の大豆肉、３％のマルトデキストリン、１％のペプトン、４ＭのNaOHでpHを7.0に調整）の中で１１の振盪フラスコ中で30℃で４日間インキュベートした。これらの条件下で、形質転換体は培養物１ml当り約500リパーゼユニットを示した。その他のリパーゼ変異体も実施例３に記載の一般手順を利用して、本質的に上記の通りに製造した。実施例５本発明のリパーゼ変異体の精製リパーゼ活性についてのアッセイ：リパーゼにとっての基質を、乳化剤としてアラビアゴムを用い、グリセリントリブチラット（MERCK）を乳化することによって調製した。リパーゼ活性はpHスタット法を利用し、pH７でアッセイした。１ユニットのリパーゼ（LU／mg）は１分当り１μmolの脂肪酸を遊離させるのに必要な量と定義する。工程１：発酵上清液を遠心し、沈渣を捨てる。上清液のpHを７に調整し、そして等容量の冷96％エタノールを徐々に加える。その混合物を氷浴の中で30分放置する。遠心し、沈渣を捨てる。工程２：イオン交換クロマトグラフィー。上清液を濾過し、そして50mMのトリス −酢酸バッファーpH７で平衡にしたDEAE−ファストフロー（Pharmacia商標）カラムに載せる。そのカラムを同じバッファーで280nmでの吸収が0.050Dより低くなるまで洗う。結合酵素活性を同一のバッファー中の線形塩勾配（０〜0.5ＭのN aCl）により、５倍のカラム容量を利用して溶離させる。酵素活性を含む画分をプールする。工程３：疎水性クロマトグラフィー。酵素活性含有プールのモル濃度を、固形酢酸アンモニウムを加えることにより0.8Ｍに調整する。酵素を、0.8Ｍの酢酸アンモニウムで予備平衡化しておいたTSK ゲルブチル−トヨパール650Cカラム（東ソー（株）、日本より入手可能）の上に載せる。未結合酵素を0.8Ｍの酢酸アンモニウムで洗い、そして結合物質を蒸留水で溶離させる。工程４：リパーゼ活性含有プールを水で希釈し、導電率を２mS、そしてpHを７に調整する。このプールを50mMのトリス−酢酸pH７で予備平衡化しておいた高性能 Q Sepharose（Pharmacia）カラムに載せる。結合酵素を線形塩勾配で溶離させる。実施例６本発明のリパーゼ変異体の洗浄性能本発明のＨ．ラヌギノーザリパーゼ変異体の洗浄性能は、野生型Ｈ．ラヌギノーザリパーゼと対比させて、OD₂₈₀に従い、リットル当りのmgタンパク質における酵素投与量に基づいて評価した。洗浄試験はサーモスタット式水浴の中に入れた150mlのビーカーの中で実施した。このビーカーを三角形マグネチックロッドで撹拌した。実験条件は以下の通りである：方法：オーバナイトで３サイクル；各サイクル間で乾燥洗浄液：ビーカー当り100ml 見本：ビーカー当り６枚の見本（3.5×3.5cm）布帛：線100％，Test Fabric Style#400 汚れ：Sudanレッドで着色したラード（0.75mgの色素／ラード１ｇ）。70℃に加熱したラード６μｌを各見本の中央に付けた。汚れを付けた後、その見本を75℃のオーブンの中で30分加熱した。その見本を一第回目の洗浄前に室温で一夜保管した。リパーゼ濃度：0.075，0.188，0.375，0.75及び2.5mgのリパーゼタンパク質／１時間：20分温度：30℃ すすぎ：流水道水で15分乾燥：室温で一夜（〜20℃，30〜50％のRH）評価：３回目の洗浄後、460nmでの反射率を測定。結果投与量−応答曲線を、リパーゼ変異体及び天然Ｈ．ラヌギノーザリパーゼについて比較した。投与一応答曲線は測定データーを以下の式に入れることにより計算した：ここで、ΔＲは反射単位で表わす効果Ｃは酵素濃度（mg／ｌ） ΔＲ_maxは最大効果を表わす定数Ｋは定数；Ｋ²は最大効果の半分が得られる酵素濃度を表わす。各リパーゼ変異体及び野生型リパーゼについて見い出せた特徴的な定数ΔＲ_ma _x 及びＫに基づき、改善係数を計算した。以下で定義する改善係数ｆ_improve＝Ｃ_wt／Ｃ（II）は、0.25mg／ｌの対照野生型タンパク質（Ｃ_WT）で得られるのと同じ効果を得るのに必要とされるリパーゼ変異体タンパク質の量を表わす。即ち、改善係数を計算するための手順は以下の通りである：１）0.25mg／ｌでの野生型タンパク質の効果（ΔＲ）野生型を式（Ｉ）により計算する；２）0.25mg／ｌの野生型と同じ効果をもたらすリパーゼ変異体の濃度を次式より計算する；３）改善係数を式（II）より計算する。その結果を以下の表１に示す。表１から、リパーゼ変異体D96K，D96W，D96W＋E210N、更にはある程度リパーゼ変異体D96F及びD254K＋L259Iが野生型リパーゼよりもかなり優れた洗浄性能を有することが明らかである。この改善効果について考えられる一の解釈は、変異体の脂質接触ゾーンの帯電特性が変化したことでありうる。 Detailed Description of the Invention Lipase mutant Field of the invention The present invention provides a novel lipase enzyme mutant with improved properties, A DNA construct that encodes the present, and expresses this mutational rest from this DNA construct. A host cell capable of producing this variant, and the production of this variant by culturing said host cell Regarding the manufacturing method. BACKGROUND OF THE INVENTION The advent and development of recombinant DNA technology has profound implications in the field of protein chemistry. I dropped it. These techniques are based on specific criteria for peptides and proteins such as fermentation. Compounds that are believed to enable the design of prime and therefore have the desired properties It is possible to manufacture Based on the usefulness of such a technique, an enzyme having a desired amino acid sequence can be constructed. Has become possible, and a considerable amount of research has been devoted to this purpose. The primary structure of numerous lipases has been determined and described in the paper (Boel et al. Lipids 23, 701-706 (1988), de Caro et al., Biochim. Biophys. Acta 671, 129-1 38 (1981), Winkler et al., Nature 343, 771-774 (1900)). A truly more limited number The tertiary structure of the lipase has also been deduced (Winkler et al., Nature 343, 771-774 (199). 0), Brady et al., Nature 343, 767-770 (1990), J. Am. D. Schrag et al.Nature 351,1991, True 761-764). From these studies, lipases share certain structural features in common However, on the other hand, major structural mutations were also found to exist between the lipases. Became. WO 92/05249 is a lipase with improved lipase properties, Certain features of the enzyme are altered by specific modifications of their amino acid sequences Disclosed is a lipase. For example, the amino acids that are mainly present in the natural lipase molecule. By substituting or deleting an acid residue, the so-called lipid contact of the wild-type lipase enzyme is The electrostatic charge and / or hydrophobicity of the tactile zone has been altered, and in addition to its active site The accessibility of lipid substrates is improved. Summary of the invention The present inventors have surprisingly found that novel lipase mutants with improved properties have been constructed. Further amino acid alterations that lead to construction have now been identified. Therefore, in one aspect, the present invention relates to the length of lipase molecules that are predominantly hydrophobic. A trypsin-like catalytic bird containing an active serine located in a binding pocket. A parent lipase variant comprising an ad, wherein this active serine residue of lipase structure A residue that is located in the group containing the group and can control the interaction with the substrate during hydrolysis. A non-aromatic amino acid residue in the lipid contact zone comprising a group becomes an aromatic amino acid residue More substituted variants. In the disclosure below, this type of lip The ze variant is called lipase variant I. As used herein, the term "trypsin-like" means that the parent lipase is a catalytic triad. That is, any amino acid of Ser, His and Asp, Glu, Asn or Gln is trypsinized. It is meant to comprise at the corresponding active site of the protein. Some lipases cover their active serine when the lipase is in its inactive form. Can also include a surface loop structure (see Brady et al.Nature 343 , 1990, pp. 767-770). When lipase is activated, The loop structure shifts to expose active site residues However, during hydrolysis, a surface layer with increased hydrophobicity that interacts with the lipid substrate is created. Be done. For this purpose, this surface is referred to as the “lipid contact zone” and this surface (or It is located at or corresponds to the corresponding surface layer portion of the lipase that does not contain such a loop structure. It is intended to include amino acid residues that make up Optionally in the form of a loop structure Amino acid residues are the lipids of a lipase when it is activated by contact with the lipid surface. When hydrolyzing triglyceride from the substance phase, lipase with the substrate during the hydrolysis It can control the interaction. When hydrolyzing triglycerides, And diglycerides are formed in varying amounts. Humicola lanuginosa lipase described in this application The lipid-contacting zone of the is amino acid residues 21-25, 36-38, 56-62, 81-98, 110-116, 144-1 Defined as 47, 172-174, 199-213 and 248-269. These residues are lipase and Identification based on computer model simulations of interactions with quality substrates . In the present specification, the term “aromatic amino acid residue” means tyrosine, tryptophan or Means a residue of phenylalanine, and the term "non-aromatic amino acid residue" means , Amino acids other than tyrosine, tryptophan or phenylalanine It is Mori. In a further aspect, the present invention is directed to specific lipase mutants, comprising WO 92/0524 Humicola lanuginosa lipase disclosed in 9 (its cDNA and amino acid Sequences are shown at specific positions in SEQ ID Nos. 1 and 2) or of lipases of other origin. One or more amino acid residues at similar positions are replaced by another amino acid residue Related mutants. These variants are further detailed. The invention further comprises a DNA comprising a DNA sequence encoding the above lipase variant. Construct, a recombinant expression vector carrying the DNA construct. Of the present invention, cells transformed with this DNA construct or expression vector, and A method for producing a lipase variant, the method comprising the step of producing the lipase variant with the cells. Cultivated under conditions that induce A. lipase, and then recover the lipase variant from the culture. Regarding the method by doing. Furthermore, the present invention optionally comprises the form of dust-free granules, a stabilizing liquid or a protective enzyme. A wash additive composition comprising a lipase variant, and a lipase variant of the invention. And a cleaning composition comprising: Detailed disclosure of the invention In describing the lipase mutant according to the present invention, for ease of reference, the following Used nomenclature: Original amino acid (s): Position (s): Substituted amino acid (s) According to this nomenclature, for example tryptophan of aspartic acid at position 96 The substitutions are as follows: Asp 96 Trp or D96W Multiple mutations are separated by plus, ie: Asp 96 Leu ＋ Leu 206 Val or D96L ＋ L206V This is the leucine of aspartic acid and leucine at positions 96 and 206. And each substitution with valine. Most of this lipase mutant It is specified by using a conventional one-letter amino acid. According to the invention, the lipase variant I is preferably a non-aromatic acid to be replaced. The mino acid residue is glutamic acid or aspartic acid, and preferably SEQ ID N The mature H. At position 96 in the amino acid sequence of lanuginosa lipase, As further detailed below It is in a similar position to the parent lipase of another origin. H. Specific lipase mutations of the invention prepared from lanuginosa lipase The body comprises one or more amino acid residues substituted as follows: E56H, P, M, W, Y, F, I. G, C, V; D96H, E, P, M, W, Y, F, I, G, C, V; L259N, D, C, Q, E, H, I, M, F, P, W, Y; L206K, R, N, D, C, Q, E, H, I, M, F, P, W, Y A particularly interesting effect is that the lipase variants of the invention are more than one substitution, preferably Can also be obtained when it comprises two substitutions. For example, H.264. Lanuginosa lipa The following variants of the enzyme have been found to be interesting: D96W + E210N; D254K + L259I; D96L ＋ L206V; D96L + L206S; D96W ＋ D102N; D96L ＋ L259I ＋ L206V; E56Q + L259I + L206V. H. Other sources by substitution similar to those described above for lanuginosa lipase Lipase variants prepared from the lipases of E. coli are also considered to be within the scope of the present invention. As used herein, the term "similar substitution" refers to H.264. Lanuginoza lipase And the amino acids of other lipases at positions similar to those specified above. I intend to mean replacement. Similar positions are described in H. Three-dimensional structure and section of Lanuginosa It can be specified on the basis of each contrast of the subject lipase. H. The third structure of Lanuginoza Structure is WO 92/05 Fig. 249. The three-dimensional structure of the parent lipase shown in 1A and 1B and to be modified is Known or can be estimated by conventional methods including, for example, X-ray analysis. Replace The amino acid residue to be inserted and the one to be inserted belong to the same type of amino acid (for example, For example, hydrophobicity, hydrophilicity, etc.) are preferred. Lanuginosa Lipase Fruit It does not have to be the same as the amino acid residue. Parental lipases have various origins, such as pancreas, stomach, liver or lipoprotein lipase. However, microbial lipases are generally preferred. Therefore, the parent lipase is yeast , Eg Candida lipase, bacteria, eg Pseudomonas (Psendom) onas) lipase, or fungi such as Humicola or Rhizomuc or) lipase. Select a parent lipase from a group of structurally related lipases Especially preferred is For example, the parent lipase is Rhizom ucor miehei) lipase, in particular the lipase described in EP 238,023, or the H. La It may be Nuginosa lipase. H. Lanuginosa lipase and Rhizomucor mihei lipase are identical It should be noted that it belongs to the lipase group. This is the overall of the two ribases Mean that the three-dimensional structure is very similar, and the X-ray crystalgraph Has been shown to be homologous to H. lanuginosa and Rh. The computer model of the enzyme is shown in Fig. 2 of WO 92/05249. 1A and B, and 2A and B Shown respectively, and the similarity between the lipid contact zones of these two lipases. Has been clarified). Therefore, H. Specified for lanuginosa lipase The strange type is Rh. It would also be functional for Mihei's lipase. In accordance with the present invention, any of the above amino acid sequence modifications are described herein. Any other modification or any of those described in WO 92/05249 May be combined with the modification. The lipase variant of the present invention isolates a DNA sequence encoding a parent lipase, Encode the variant of interest in its sequence, for example by site-directed mutagenesis Appropriate modification so that the modified DNA sequence is suitable for expressing the mutant of interest. It can be prepared by introducing it into the relevant host organism. DNA arrangement of the DNA construct of the present invention Is the sequence obtained by cDNA, genomic or synthetic DNA sequence, or according to conventional techniques? It may be any combination of such sequences. Clone and mutate DNA sequences A suitable technique for this is WO 92/05, which is incorporated herein by reference in its disclosure. Further details are disclosed in 249. The technique is further illustrated in the following examples. Expression of the lipase mutant of the present invention can be obtained as follows. For example WO 92 / 04249 or by any alternative method known in the art. The sequence encoding the mutated lipase produced is generally a promoter or operator. , A ribosome binding site, a translation initiation signal and optionally a repressor gene or Is an expression vector containing control sequences encoding various activating genes. Can be used and expressed in enzymatic form. In order to allow secretion of the expressed protein, The nucleotide encoding the "Gunal sequence" is inserted before the lipase coding sequence. You may To be treated according to the invention for expression under the control of a control sequence The target gene is operably linked to the control sequence in the proper reading frame. Is tied. Can be integrated into a plasmid vector and can be used as a mutant lipase The promoter sequence capable of assisting transcription of the gene is not limited to, but is not limited to prokaryotic β- Lactamase promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. ． U. S. A.75: 3727-3731) and tac promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Nat. l. Acad. Sci. U. S. A.80 : 21-25) are included. For further reference, Scientific American, 1980,242: 74-94 It can be found in "Useful proteins from recombinant bacteria". According to one embodiment, cells of the genus Bacillus, eg B. Lischenhor B. licheniformis, B. B. lentus or B. lentus Subtilis (B ． subtilis) may be transformed with an expression vector carrying a mutant DNA . Expression is secreted by microorganisms such as B. When performing in Subtilis, the signal sequence , May follow the translation initiation signal and may precede the subject DNA sequence. Signa Sequence directs the delivery of the expressed product to the cell wall where it is secreted Cleave from the product. The word "control array" above, if present, It is intended to include a signal sequence. In the presently preferred method for producing the lipase variant of the present invention, filamentous fungi are used as host cells. Used as a thing. Filamentous fungal host organisms serve as hosts for producing recombinant proteins It is convenient that it is one that is conventionally used, such as Aspergillus (As pergillus) strains such as A. A. niger, A. Nidulans (A. ni dulans) or A. It is A. oryzae. In the production of recombinant proteins A. The use of Oryza is described in detail, for example, in EP 238,023. For expression of the lipase mutant in Aspergillus, this lipase mutation A promoter precedes the DNA sequence encoding the body. This promoter is It can be any DNA sequence that exerts a strong transcriptional activity in Spergillus. Amylase, glucoamylase, protease, lipase, cellulase or Derived from genes that encode extracellular or intracellular proteins such as glycolytic enzymes sell. Examples of suitable promoters are: Oriza TAKA Amylase, Rhizomu Cole Meehy Aspartate Proteinase, A. Niger Neutral α-Amilar Ze, A. Niger acid stable α-amylase, A. Niger glucoamylase, Rhizomu Cole Meihei Lipase, A. Oryza alkaline protease, or A. Orient It is derived from the gene encoding zatriose phosphate isomerase. . In particular, the host organism is A. When being Oriza, it is suitable for use in the method of the present invention. A suitable promoter is A. Oryza TAKA amylase promoter, because This is A. This is because it exerts a strong transcription activity in Oryza. TAKA Amylase The lomomotor sequence has been clarified from EP 238,023. The termination and polyadenylation sequences are suitably derived from the same source as the promoter. It is possible. The techniques used to transform fungal host cells are as described in EP 238,023. May be appropriate. To ensure secretion of the lipase variant from the host cell, lipase mutation The DNA sequence encoding the body may be preceded by a signal sequence, which is the cell Is a natural signal sequence that controls the secretion of proteins from Escherichia coli or a functional part thereof , Or a synthetic sequence. In detail, this signal sequence is Aspergillus species , A gene encoding the amylase or glucoamylase ・ Genes encoding mihay lipase or protease, or Humi Due to the gene encoding Kola cellulase, xylanase or lipase Can come. This signal sequence is preferably A. Oryza TAKA amylase, A. D Garr neutral α-amylase, A. Niger acid stable α-amylase or A. Nigarg It is derived from the gene encoding lucoamylases. The medium used to culture the transformed host cells is Aspergillus spp. It may be any conventional medium suitable for growing cells. The transformant is usually It is stable and can be cultivated without selection pressure. However, if the trait Selectable marker to be introduced into cells if the transformant is found to be unstable May be used for selection. The mature lipase protein secreted from the host cell is centrifuged or centrifuged from its culture medium. Separate the cells from the medium by filtration, and with a salt such as ammonium sulfate. Subsequent ion exchange chromatography to precipitate the proteinaceous components of the culture medium Chromatographic procedures such as Raffy and affinity chromatography Can be routinely recovered by known procedures including. Cleaning composition In accordance with the present invention, the lipase variant will generally be a component of a cleaning composition. Therefore , It is included in the cleaning composition in the form of dust-free granules, stabilizing liquid or protective enzyme You can stay. Dust-free granules can be obtained, for example, from US 4,106,991 and 4,661,452 (both Novo Industri A / S)) and optionally by methods known in the art. It may be coated. An example of a waxy coating material is an average of 1000 to 20000 Poly (ethylene oxide) product having a molar weight (polyethylene glycol, PEG), an ethoxylated noniphenol having 16 to 50 ethylene oxide units; The alcohol has 12 to 20 carbon atoms, and 15 to 80 ethylene Ethoxylated fatty alcohols in which side units are present; fatty alcohols; fatty acids And fatty acid mono- and di- and triglycerides. By fluidized bed technology An example of a film-forming coating material suitable for application is given in patent GB 1483591. Have been. Liquid enzyme preparations can be prepared using, for example, a polyol such as propylene glycol. , Sugar or sugar alcohol, lactic acid or boric acid Stabilized by adding according to established methods. Other enzyme stabilizers Are also known in the art. The protected enzyme is prepared according to the method disclosed in EP 238,216. It The cleaning composition of the invention may be of any convenient form, such as a powder, granules, paste or liquid. It may be in any form. Liquid detergents are aqueous, generally up to 70% water and 0- Contains 30% organic solvent or is non-aqueous. The cleaning composition comprises one or more surfactants, each of which is anionic or non-ionic. It may be ionic, cationic or zwitterionic. Detergents are usually 0-50% anions Surfactants such as linear alkylbenzene sulfonate (LAS), alpha Olefin sulfonate (AOS), alkyl sulphate (fatty alcohol sulphate) Fate) (AS), alcohol ethoxysulfate (AEOS or AES), secondary acid Lucan sulfonate (SAS), alpha-sulfo fatty acid methyl ester, alk It may include ru- or alkenyl-succinic acid or soap. It is also 0-40% Nonionic surfactants such as alcohol ethoxylates (AEO or AE), Ruboxylated alcohol ethoxylates, nonylphenol ethoxylates, Rukyru polyglycoside, alkyl dimethyl amine oxide, ethoxylated fatty acid Monoethanolamine, fatty acid monoethanolamide or polyhydroxyalky The fatty acid amides (described in WO 92/06154) may also be included. The cleaning composition may further comprise one or more other enzymes such as amylase, lipase. Ze, cutinase, protease, cellulase, peroxidase or oxy It may comprise dase. Detergents include 1-65% of cleaning builders or complexing agents such as zeolites, diphosphite , Triphosphate, phosphonate, citrate, nitrilotriacetic acid (NTA) , Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), die Tylene triamine pentaacetic acid (DTMPA), alkyl- or alkenyl succinic acid, soluble It may include a sex silicate or a layered silicate (eg SKS-6 from Hoechst). The detergent may be builder-free, ie, essentially free of wash builder. The detergent may comprise one or more polymers. An example is carboxymethyl Cellulose (CMC), poly (vinylpyrrolidone) (PVP), polyethylene glycol (PEG), poly (vinyl alcohol) (PVA), polycarboxylates, for example Polyacrylate, maleic acid-acrylic acid copolymer and lauric methacrylate It is a copolymer of acrylic acid and acrylic acid. Detergent is a bleach system, H₂O₂Origin, eg tetraacetylethylenediamine ( TAED) or nonanoyloxybenzene sulfonate (NOBS) -like peracid formation Includes a system which may comprise a perborate or a percarbonate which may be combined with a bleach activator. Miru This bleaching system, on the other hand, is a peroxy compound such as amide, imide or sulfone type It may comprise silicic acid. The enzymes of the cleaning compositions of the present invention may be formulated with conventional stabilizers such as polyols such as propylene. Pyrene glycol or glycerol, sugar or sugar alcohol, lactic acid, boric acid , Or boric acid derivatives such as aromatic boric acid esters can be utilized for stabilization. , And the composition is distributed as described, for example, in WO 92/19707 and WO 92/19708. You may combine. Detergents include other cleaning ingredients, such as fabric conditioners, such as clay, foam promoters. Progressive agent, foam control agent, anti-corrosion agent, soil suspension agent, soil anti-redeposition agent, pigment, fungicide, optical Bleach or fragrance may also be included. pH (measured in aqueous solution at working concentration) is usually neutral or alkaline, eg It will be 7-11. Specific forms of cleaning compositions within the scope of the invention include the following: 1) Granules having a bulk density of at least 600 g / l, comprising: As a cleaning composition. 2) Granules having a bulk density of at least 600 g / l, comprising: As a cleaning composition. 3) Granules having a bulk density of at least 600 g / l, comprising: As a cleaning composition. 4) Granules having a bulk density of at least 600 g / l, comprising: As a cleaning composition. 5) An aqueous liquid cleaning composition comprising: 6) An aqueous structured liquid cleaning composition comprising: 7) Granules having a bulk density of at least 600 g / l, comprising: As a cleaning composition. 8) A cleaning composition formulated as granules, comprising: 9) A cleaning composition formulated as granules, which comprises: 10) An aqueous liquid cleaning composition comprising: 11) An aqueous liquid cleaning composition comprising: 12) Granules having a bulk density of at least 600 g / l, comprising: As a cleaning composition. 13) Linear alkyl benzene sulfonate or part of it is alkyl sulphate ( C₁₂-C₁₈The cleaning composition according to 1) to 12), which is replaced by 14) Stabilized or encapsulated as an additional ingredient or as a replacement for the specified bleaching system. The cleaning composition according to 1) to 13), which comprises an acid. 15) Described in 3), 7), 9) and 12) in which the perborate is replaced by percarbonate. Cleaning composition. 16) Liquid nonionic surfactants such as linear alkoxylated primary alcohols, vinyl A non-aqueous cleaning solution comprising a rudder system (eg phosphonate), an enzyme and an alkali A cleaning composition formulated as a body. The lipase variants of the present invention may be included at concentrations normally used in detergents . In the cleaning composition of the present invention, the lipase mutant is 0.001 per 1 liter of cleaning liquid. It is currently believed that an amount corresponding to ~ 100 mg of enzyme may be added. Cleaning composition for washing dishes Furthermore, this lipase variant is utilized as an ingredient in dishwashing cleaning compositions. It Cleaning compositions for washing dishes include anionic, nonionic, cationic, zwitterionic or It comprises a surfactant which can be a mixture of these types. This detergent is 0-90% Nonionic surfactants, such as low mono- to non-foaming ethoxylated propoxylated Will include straight chain alcohols. The cleaning composition comprises an inorganic and / or organic cleaning builder salt sell. This cleaning builder is classified into a phosphorus-containing type and a phosphorus-free type. Cleaning composition Usually contains 1-90% detergent builder. Examples of phosphorus-containing inorganic alkaline cleaning builders, when present, include water-soluble salts, special Alkali metal pyrophosphate, orthophosphate, polyphosphate and Phosphonates are included. Examples of phosphorus-free inorganic builders, when present, are water-soluble. Alkali metal carbonates, borates and silicates, and various types of Contains water-insoluble crystals or amorphous aluminosilicates, of which De is the best known representative. Examples of suitable organic builders include alkali metals, ammonium and substituted ammonium. Um, citrate, succinate, malonate, fatty acid sulfonate, carboxy Methoxysuccinate, ammonium polyacetate, carboxylate, polycarbonate Ruboxylate, aminopolycarboxynote, polyacetylcarboxylate And polyhydroxy sulfonate. Other suitable organic builders are known to have builder properties High molecular weight polymers and copolymers such as suitable polyacrylic acid, polymalein Includes acids and polyacrylic acid, polymaleic acid copolymers, and their salts Be done. The dishwashing cleaning composition may include chlorine / bromine based or oxygen based bleach. Inorganic chlorine Examples of / bromine bleach include lithium, sodium or calcium hypochlorite and Hypobromite, and trisodium chlorinated phosphate. Organic chlorine / bromine bleaching Examples of agents are heterocyclic N-bromo and N-chloroimides such as trichloroisocyanate. Nuric acid, tribromoisocyanuric acid, dibromoisocyanuric acid and dichloroisoic acid Cyanuric acid and its salts with water-soluble cations such as potassium and sodium Is. The oxygen-based bleach is preferably in the form of an inorganic persalt with a bleach precursor. , Or as a peroxy acid compound. Typical of suitable peroxy bleaching compounds Examples are tetrahydrates and monohydrates of alkali metal perborates, alkali metal percarbonates. , Persilicates and superphosphates. Preferred activated materials are TAED and glycerol It is an acetate salt. The dishwashing cleaning composition of the present invention contains conventional stabilizers for enzymes such as polio. Such as propylene glycol, sugars or sugar alcohols, lactic acid, boric acid, or boron It can be stabilized with acid derivatives, for example aromatic borate esters. This dishwashing cleaning composition also comprises other enzymes, especially amylase, protease. And / or cellulase. The dishwashing cleaning composition of the present invention also comprises other conventional detergent ingredients such as peptizers, Filler, foam suppressor, anti-corrosion agent, soil suspension agent, sequestering agent, soil redeposition preventive agent, dehydrating agent , Pigments, bactericides, fluorescent agents, thickeners and fragrances. Finally, the variants of the present invention may be used in conventional dishwashing detergents such as those disclosed in the following patent publications. May be used in any of the detergents listed: EP 551670, EP 533239, WO 9303129, EP 507404, US 5141664, GB 2247025, E P 414285, GB 2234980, EP 408278, GB 2228945, GB2228944, EP 387063, EP 38 5521, EP 373851, EP 364260, EP 349314, EP 331370, EP 318279, EP 318204, GB 2204319, EP 266904, US 5213706, EP 530870, CA 2006687, EP 481547, EP 337760, WO 93/14183, US 5223179, WO 93/06202, WO 93/05132, WO 92/19707, WO 92/09680, WO 92/08777, WO 92/06161, WO 92/06157, WO 92/06156, WO 91/1 3959, EP 399752, US 4941988, US 4908148. Flexible composition Furthermore, the lipase variants of the invention may be used in softening compositions: This lipase variant is a fabric softener such as Surfactant and Consumer Products. , Ed., J. Falbe, 1987, pp 295-296; Tenside Surfactants Detergents,30(1 993), 6, pp 394-399; JAOCS, Vol.61(1984), 2, pp 367-376; EP 517 762; EP 123 400; WO 92/19714; WO 93/19147; US5,082,578; EP 494 769; EP 544 49 3; used in softeners described in EP 543 562; US 5,235,082; EP 568 297; EP 570 237 You can do it. Brief description of the drawings The present invention will now be described with reference to the accompanying drawings, in which Figure 1 encodes lipase variants by polymerase chain reaction (PCR) 1 is a schematic representation of plasmid preparation; and FIG. 2 is a schematic diagram of three-step mutagenesis by PCR. The invention is further described in the following examples, which limit the scope of the invention Not a thing. General method H. in Aspergillus Oriza Expression of lanuginosa lipase H. Cloning of lanuginosa lipase is described in EP 305,216. This Patent document also describes the expression and characterization of lipases in Aspergillus oryzae ing. The expression plasmid used is called p960. The expression plasmid used in this application is the same as p960 except that There is a slight modification immediately 3'to the enzyme coding region. This modification is as follows Applied: p960 restricted to NruI and BamHI Digested with enzyme. Between these two sites is the BamHI / Nhe from the plasmid pBR322. I fragment (the NheI fragment was complemented by Klenow polymerase Plasmid pA01 containing the unique BamHI and NheI sites. (Shown in Fig. 5 of WO 92/05249) has been created. Between these unique parts , A BamHI / XbaI fragment derived from p960 was cloned to obtain pAHL (WO 92/0524 (Shown in Fig. 6 of 9). Site-directed in vitro mutagenesis of the lipase gene The technique used to introduce mutations into the lipase gene is Nelson & Long , Analytical Biochemistry, 180, 147-151 (1989). This is P Chemically synthesized DNA as one of the primers in CR (polymerase chain reaction) reaction Includes three-step PCR generation containing the desired mutations introduced by utilizing the strands To do. From a PCR-generated fragment, a DNA fragment carrying the mutation Can be isolated by restriction enzyme digestion and reinserted into the expression plasmid. Wear. This method is described in detail in Example 3. 1 and 2 The method is further outlined. Example Example 1 H. Construction of a plasmid expressing the D96W mutant of lanuginosa lipase Linearization of brasmid pAHL The circular plasmid pAHL was digested with the restriction enzyme SphI to give the following 50 μl reaction mixture: 5 0 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.9, 10 mM MgCl₂, 1 mM dithio thrito Linearized in 1 μg of plasmid and 2 units of SphI. Digestion is 37 ℃ I went there for 2 hours. The reaction mixture is phenol (tris-HCl, equilibrated with pH 7.5) Extracted with And precipitated by adding 2 volumes of ice cold 96% ethanol. Centrifuge and pellet After drying the pellet, add 50 μl of linearized DNA to₂Dissolve in O and adjust its concentration. Estimated on a galose gel. 3-step PCR mutagenesis As shown in Figure 2, three-step mutagenesis involves the use of four primers: All three steps were performed in a buffer containing: 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.001% gelatin, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dCT P, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM TTP, 2.5 units Taq polymerase. In step 1, 100 pmol of primer A, 100 pmol of primer B and 1 fmol Of linearized plasmid was added to a total of 100 μl of reaction mixture and 2 min at 95 ° C for 3 min. Fifteen cycles consisting of 2 minutes at 7 ° C and 3 minutes at 72 ° C were performed. The concentration of PCR product was evaluated on an agarose gel. Next, step 2 was performed. 0 .6 pmol of Step 1 product and 1 fmol of linearized plasmid in a total of 100 μl of the above plasmid. Consists in a stuffer and consists of 5 minutes at 95 ° C, 2 minutes at 37 ° C and 10 minutes at 72 ° C One cycle was carried out. To this step 2 reaction mixture, add 100 pmol of primer C and 100 pmol of primer Add D (1 μl at a time) and mix for 2 minutes at 95 ° C, 2 minutes at 37 ° C and 3 minutes at 72 ° C. 20 cycles were performed. This operation Configure step 3 of the mutation procedure. Isolation of mutation restriction fragments The product from step 3 was isolated from an agarose gel and 20 μl H 2₂Redissolved in O I understand. Then, it was digested with restriction enzymes BamHI and BstxI in a total volume of 50 μl or less. Digested in the following composition: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.9, 10 mM MgC. l₂, 1 mM DTT and 10 units of enzyme. Incubation at 37 ℃ for 2 hours And A 733 bp BamHI / BstxI fragment was isolated from an agarose gel . Ligation into expression vector pAHL The expression plasmid pAHL was cleaved with BamHI and BstxI under the above conditions and The large fragment was isolated from an agarose gel. This vector is The isolated mutant fragment is ligated and the ligation mixture is digested with E ． It was used to transform E. coli. The existence and orientation of the fragments It was confirmed by cleavage of the plasmid preparation derived from the transformant with a restriction enzyme. Array The analysis utilizes the dideoxy chain termination procedure developed by Sanger, and I went with Smid. This plasmid was named pAHLD96W and it contains the modified codons. , PAHL. Example 2 H. Construction of plasmids expressing other variants of lanuginosa lipase The following mutants were constructed using the same method as in Example 1, except that the restriction enzyme Xh oI and BstxI for PCR-products and sudden changes for D254K / L259I and L259I Used to digest the vector used for recloning of foreign fragments It was The names of the plasmids used for the modification and the primers are listed below. Example 3 Transformation of Aspergillus oryzae (general procedure) 100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor L aboratory, 1981). Inoculate Oryza spores and shake for 24 hours. Incubated. The strain was harvested by filtration through miracloth and 200m l of 0.6M MgSO_FourWashed in. The bacterial strain was treated with 15 ml of 1.2M MgSO 4._Four， 10mM NaH₂PO_Four, Suspended in pH = 5.8. The suspension was chilled on ice and 120 mg Novozym 234 1 ml of buffer containing batch 1687 was added. After 5 minutes, 1 ml of 12 mg / ml BSA (Sig ma Type H25) and incubate at 37 ° C with slow stirring. For 1.5 to 2.5 hours, a large amount of protoplasts can be seen under the microscope in the sample. I went until it grew. The suspension is filtered through miracloth, the filtrate is transferred to a sterile tube and 5 It was overlaid with ml 0.6 M sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH = 7.0. Centrifuge 10 Perform for 15 minutes at 00g, and add the protoplasts to MgSO 4._FourCollect from the top of the cushion did. 2 volumes of STC (1.2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM C aCl₂) To the protoplast suspension and the mixture at 1000 g for 5 min It was centrifuged. The protoplast pellet was resuspended in 3 ml STC and repelled. It became This was repeated. Finally, this professional Toplasts were resuspended in 0.2-1 ml STC. 100 μl protoplast suspension 5 to 25 μg p3SR in 10 μl STC₂(Hynes et al., Mol. And Cel. Biol. Volume 3, Issue 8, 1430-1439, August 1983A. NidulansamdS gene Plasmids). The mixture was left at room temperature for 25 minutes. 0.2 ml 60% P EG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl₂And 10 mM Tris-HCl, pH = 7.5, Then mix carefully (twice) and finally add 0.85 ml of the same solution, and Mix carefully. The mixture was left at room temperature for 25 minutes and centrifuged at 2,500g for 15 minutes. Also After a single precipitation, the protoplasts were washed with 1.0 M sucrose, pH-7.0, nitrogen. 10 mM acetamide as a source and 20 mM to prevent background growth Of the smallest plate containing CsCl (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51-56) Sprinkled on. After incubation at 37 ° C for 4-7 days, spores are picked and sterile water is added. Suspended in and sprayed for single colonies. Repeat this step The single colony that underwent the second re-isolation was stored as a defined transformant. Example 4 A. Expression of the lipase variant D96W in Oryza pAHLD96WA. OrizaIn IFO 4177, described in Example 3A. NidulansOrigin P3SR containing the amds gene₂It was transformed by co-transformation with. As above Prepared protoplasts containing about 5 μg each of pAHLD96W and p3SR₂An equal amount of Incubated. 9 transformations that can use acetamide as the sole nitrogen source The recombinant was reisolated twice. After being grown on YPD for 3 days, the culture supernatant was treated with Example 5 (the present invention). Purification of lipase mutants) and analysis using the lipase activity assay described in did. The best transformants were selected for further testing and 200 ml FG4 medium ( 3% soy meat, 3% maltodext 11 shaking frass in phosphorus, 1% peptone, pH adjusted to 7.0 with 4M NaOH) Incubated at 30 ° C. for 4 days in co. Under these conditions, transformants were cultured About 500 lipase units were shown per 1 ml of the product. The other lipase variants were essentially as above using the general procedure described in Example 3. Produced as described. Example 5 Purification of lipase variants of the invention Assay for lipase activity: Glycerin is used as a substrate for lipase and gum arabic as an emulsifier. Prepared by emulsifying Libbut Rats (MERCK). The lipase activity is Assays were performed at pH 7 using the Tat method. One unit of lipase (LU / mg) releases 1 μmol of fatty acid per minute Define as the required amount. Step 1: Centrifuge the fermentation supernatant and discard the sediment. Adjust the pH of the supernatant to 7 and Gradually add an equal volume of cold 96% ethanol. Leave the mixture in the ice bath for 30 minutes It Centrifuge and discard the sediment. Step 2: Ion exchange chromatography. The supernatant is filtered and 50 mM Tris DEAE-Fastflow (Pharmacia trademark) equilibrated with acetate buffer pH 7 Put it on the rum. The column has the same buffer with less than 0.050D absorption at 280 nm Wash until The bound enzyme activity was measured by a linear salt gradient (0-0.5M N 2 in the same buffer). aCl), utilizing 5 column volumes to elute. Fraction containing enzyme activity To pool. Step 3: Hydrophobic chromatography. Change the molar concentration of the enzyme activity-containing pool to solid vinegar. Adjust to 0.8 M by adding ammonium acid. The enzyme was added to 0.8M ammonium acetate. TSK pre-equilibrated with monium On GelButyl-Toyopearl 650C column (available from Tosoh Corporation, Japan) Put. Unbound enzyme was washed with 0.8 M ammonium acetate, and bound material was distilled. Elute with water. Step 4: Dilute the pool containing lipase activity with water to a conductivity of 2 mS and a pH of 7. adjust. High performance of this pool pre-equilibrated with 50 mM Tris-acetate pH7 Place on Q Sepharose (Pharmacia) column. Elute the bound enzyme with a linear salt gradient . Example 6 Cleaning performance of the lipase mutant of the present invention Of the present inventionH. LanuginozaCleaning performance of lipase mutant is wild typeH. Lanugino User OD in contrast to lipase₂₈₀In mg protein per liter according to It was evaluated based on the enzyme dose. The cleaning test is carried out in a 150 ml beaker placed in a thermostatic water bath. It was The beaker was agitated with a triangular magnetic rod. The experimental conditions are as follows: Method: 3 cycles overnight; dry between each cycle Cleaning solution: 100 ml per beaker Samples: 6 samples per beaker (3.5 x 3.5 cm) Fabric: 100% line, Test Fabric Style # 400 Dirt: Sudan red colored lard (0.75 mg pigment / lard 1 g) ). 6 μl of lard heated to 70 ° C. was placed in the center of each swatch. After cleaning, heat the sample in an oven at 75 ° C for 30 minutes. did. The swatch was stored overnight at room temperature before the first wash. Lipase concentration: 0.075, 0.188, 0.375, 0.75 and 2.5 mg lipase Protein / 1 Time: 20 minutes Temperature: 30 ℃ Rinse: 15 minutes with running tap water Drying: overnight at room temperature (~ 20 ℃, 30 ~ 50% RH) Evaluation: After the third washing, the reflectance at 460 nm was measured. result Dose-response curves were calculated using lipase variants and naturalH. LanuginozaTo lipase And compared. The dose-response curve is calculated by inputting the measured data into the following formula. Calculated: Where ΔR is the effect expressed in reflection units C is the enzyme concentration (mg / l) ΔR_maxIs a constant representing the maximum effect K is a constant; K²Is the enzyme concentration that gives half the maximum effect Represent. Characteristic constant ΔR found for each lipase variant and wild-type lipase_ma _x And the improvement factor was calculated based on K. Improvement factor defined below f_improve= C_wt/ C (II) Is 0.25 mg / l of control wild-type protein (C_WT) Same as It represents the amount of lipase variant protein required to obtain the same effect. That is, the procedure for calculating the improvement factor is as follows: 1) Effect of wild type protein at 0.25 mg / l (ΔR) The wild type was calculated by formula (I). Calculate; 2) The concentration of the lipase mutant that produces the same effect as 0.25 mg / l wild type is calculated from the following formula. calculate; 3) Calculate the improvement coefficient from equation (II). The results are shown in Table 1 below. From Table 1, lipase mutants D96K, D96W, D96W + E210N, and even lipase to some extent ZE mutants D96F and D254K + L259I give significantly better cleaning performance than wild-type lipase It is clear to have. One possible explanation for this improving effect is mutation It may be due to a change in the charging properties of the lipid contact zone of the body.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:685） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ゴームセン，エリクデンマーク国，デーコー―2830 ビルム, スネッケトフテン 15 (72)発明者クローセン，イーベーグロスデンマーク国，デーコー―3400 ヒレレズ，フィレスティーン６─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI (C12N 9/20 C12R 1: 125) (C12N 9/20 C12R 1: 645) (C12N 9/20 C12R 1: 78) (C12N 9/20 C12R 1: 865) (C12N 9/20 C12R 1:66) (C12N 9/20 C12R 1:69) (C12N 9/20 C12R 1: 685) (81) Designated country EP (AT , BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN) , ML, MR, NE, SN, TD, TG), AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, FI, HU, JP, KG, KP, KR, KZ, LK, LV, MD. , M , MN, MW, NO, NZ, PL, RO, RU, SD, SK, TJ, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Gormsen, Erik Denmark, Deko-2830 Birm, Snecketoften 15 (72) Invention Person Krosen, Eve Gross, Denmark, Dekoh-3400 Hillérez, Philesteen 6

Claims

[Claims] 1. A lipase variant of the parent lipase, comprising a trypsin-like catalytic triad containing an active serine located in a predominantly hydrophobic long binding pocket of the lipase molecule, where this active serine of lipase structure A non-aromatic amino acid in the lipid contact zone, which is located in the residue-containing part and comprises a residue capable of controlling the interaction with the substrate during hydrolysis, is replaced by an aromatic amino acid residue. , The lipase mutant. 2. The lipase mutant according to claim 1, wherein the substituted non-aromatic amino acid residue is glutamic acid or aspartic acid. 3. The lipase variant according to claim 1 or 2, wherein the aromatic amino acid residue is selected from the group consisting of tryptophan, phenylalanine and tyrosine residues. 4. A variant of the parent lipase, which comprises the mature H. elegans comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID No.1. Lipase variants in which one or more amino acid residues of lanuginosa lipase are replaced as follows: E56H, P, M, W, Y, F, I, G, C, V; D96H, E , P, M, W, Y, F, I, G, C, V; L259N, D, C, Q, E, H, I, M, F, P, W, Y; L206K, R, N, D , C, Q, E, H, I, M, F, P, W, Y. 5. A lipase variant according to any one of the preceding claims, comprising more than 5.1 substitutions, preferably 2 substitutions. 6. A variant of the parent lipase, which comprises the mature H. elegans comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID No.2. Lipase variants in which one or more amino acid residues of lanuginosa lipase have been replaced as follows: D96W + E210N; D254K + L259I; D96L + L206V; D96L + L206S; D96W + D102N; D96L + L2591 + L206V; E56Q + L2591 + L206V. 7. The lipase variant according to any one of the preceding claims, wherein the parent lipase is a microbial lipase. 8. The lipase mutant according to claim 7, wherein the parent lipase is a fungal lipase. 9. The lipase variant according to claim 9 , wherein the parent lipase is derived from a strain of Humicola or Rhizomucor . Ten. The lipase mutant according to claim 9, wherein the parent lipase is Rhizomucor miehei lipase. 11. The parent lipase is H. The lipase mutant according to claim 9, which is lanuginosa lipase . 12. The lipase mutant according to claim 8, wherein the parent lipase is yeast lipase. 13. 13. The lipase variant according to claim 12, wherein the parent lipase is derived from a strain of Candida . 14. 8. The lipase variant according to claim 7, wherein the parent lipase is a bacterial lipase. 15. 15. The lipase variant according to claim 14, wherein the parent lipase is derived from a strain of Pseudomonas . 16． A DNA construct comprising a DNA sequence encoding a lipase variant according to any one of claims 1-15. 17. A recombinant expression vector carrying the DNA construct according to claim 16. 18. A cell transformed with the DNA construct according to claim 16 or the vector according to claim 17. 19. The cells belonging to the fungal cell, for example Aspergillus, for example A. Niger , A. Oriza or A. Nidulans; a yeast cell, eg belonging to Sakkaroma Isis (Saccharomyces), for example, S. Cerevisiae (S. cerevisiae), or Hansenula (Hansenula) spp from methylotrophic yeasts such as H. Po Rimorufa (H.polymorpha) or Fichia (Phichia) from the genus methylotrophic yeast, e.g., P. Pastoris (P. pastoris); or bacterial cells, for example, those belonging to the strain of Pachirusu genus, for example, B. Subtilis or B. 19. The cell of claim 18, which is Lentus . 20. The lipase mutation according to any one of claims 1 to 15, wherein the cell according to claim 18 or 19 is cultured under a condition that induces the production of the lipase mutant, and then the lipase mutant is recovered from the culture. How to make a body. twenty one. A cleaning additive comprising a lipase variant according to any one of claims 1 to 15, optionally in the form of dust-free granules, a stabilizing liquid or a protective enzyme. 22. The cleaning additive of claim 21, comprising 22.0.02-200 mg enzyme protein / g additive. twenty three. 23. The cleaning additive according to claim 21 or 22, further comprising other enzymes such as proteases, amylases, oxidases, peroxidases, cellulases and / or lipases other than said lipase variants. twenty four. A cleaning composition comprising a lipase variant according to any one of claims 1-15. twenty five. 25. The cleaning composition according to claim 24, further comprising other enzymes, such as proteases, amylases, oxidases, peroxidases, cellulases and / or lipases other than said lipase variants. 26. A dishwashing composition comprising a lipase variant according to any one of claims 1-15. 27. A softening composition comprising a lipase variant according to any one of claims 1-15.