JPH08502084A

JPH08502084A - Enzyme detergent composition

Info

Publication number: JPH08502084A
Application number: JP6504941A
Authority: JP
Inventors: フアン・デル・ヒイデン，ヘンドリクス・テオドルス・ウエー・エム; マルツグ，ジヨン・ダビド; ワール，ジヨナサン・フランク; クリユギスト，ジヤン; マステルス，ウオウテル; ホンドマン，デイルク・ヘルマン・アー
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-07-20
Publication date: 1996-03-05
Also published as: AU4700793A; PL307269A1; EP0652939A1; HU9500273D0; IN179842B; WO1994003578A1; CN1088256A; MX9304616A; BR9306828A; CA2141559A1; CZ24295A3; GB9216387D0; HUT74267A; ZA935530B

Abstract

(57)【要約】（ａ）（ａ１）０-９５重量％の１種以上の陰イオン性界面活性剤および（ａ２）５-１００重量％の１種以上の非イオン性界面活性剤から成る界面活性剤系０．１-５０重量％；ならびに（ｂ）洗浄過程のメインサイクル中に実質的に脂質分解活性を示すことのできる酵素１０-２０，０００ＬＵ／１ｇ洗剤組成物を含む酵素洗剤組成物が提供される。 (57) [Summary] (A) A surfactant system comprising (a1) 0-95% by weight of one or more anionic surfactants and (a2) 5-100% by weight of one or more nonionic surfactants. An enzyme detergent composition is provided which comprises: 1-50 wt%; and (b) 10-20,000 LU / 1 g detergent composition of an enzyme capable of exhibiting substantially lipolytic activity during the main cycle of the washing process.

Description

【発明の詳細な説明】酵素洗剤組成物技術的分野本発明は、一般には、酵素洗剤および洗浄組成物の分野に関する。特に、本発明は、脂肪分解活性を有する酵素を含む酵素洗剤組成物に関する。背景および従来技術洗剤組成物の添加物として種々の酵素が知られている。例えば、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびそれらの種々の組み合わせを含む洗剤組成物が文献に記載されており、そのような製品のいくつかは市販されている。本発明は、脂肪分解酵素すなわちリパーゼを含む洗剤組成物に関する。そのような酵素は、トリグリセリドの１個以上のエステル結合を加水分解することにより、繊維製品から油汚れを取り除くのに寄与する。ＥＰ−Ａ−２１４７６１（Novo Nordisk）は、Pseudomonascepacia種の微生物から得られるリパーゼを開示しており、ＥＰ−Ａ−２５８０６８（Novo Nordisk ）は、Thermomyces（以前の名称はHumicola）属の微生物から得られるリパーゼを開示している。また、二つの特許出願明細書は共に、これらのリパーゼの洗剤添加物としての用途も記載している。さらに、リパーゼ含有洗剤組成物の例は、ＥＰ−Ａ−２０５２０８およびＥＰ −Ａ−２０６３９０（ともに Unilever）に記載されており、それらは、免疫学的関係に基づいて規定した一群のリパーゼを開示し、洗剤組成物および繊維織物の洗濯におけるそれらの使用を記載している。好ましいリパーゼは、Pseudomona s fluorescens 、Pseudomonas gladioliおよびChromobacter種由来のものである。ＥＰ−Ａ−３３１３７６（Amano）は、リパーゼ、それらの用途および組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術による生産を記載しており、Pseudomonas cepacia由来のリパーゼのアミノ酸配列を記載している。さらに、ｒＤＮＡ技術により生産されるリパーゼ酵素の例は、ＷＯ−Ａ−８９／０９２６３およびＥＰ−Ａ−２１８２７２（ともに Gist-Brocades）にも記載されている。リパーゼ酵素およびそれらの改良に関する文献が多数あるにもかかわらず、今までのところ、Humicola lanuginosaに由来し、Aspergillus oryzaeを宿主として生産されるリパーゼのみが、繊維洗濯製品の添加物としての広汎な用途が見出されている。その酵素は、Lipolase（登録商標）の商標でNovo-Nordiskから入手できる。 Henrik Malmosは、Chemistry and Industry 1990，pages183-186の文献で、一般に洗濯工程中のリパーゼの活性は低いことが知られており、Lipolase（登録商標）も例外ではないことを記している。脱水工程中に繊維の水分が少なくなると、酵素はその活性を取り戻し、油汚れが加水分解される。続く洗濯サイクル中に、加水分解された物質が取り除かれる。また、リパーゼの効果が最初の洗濯サイクル後は低く、次のサイクルで効果を発揮する理由もこれにより説明される。これらの知見は、Aaslyng et al.，J．Chem．Tech．Biotechnol．50，321-330(199 1)，「洗剤工業におけるプロテアーゼおよびリパーゼのメカニズム的研究」にも記載されている。本発明者らは、脂肪分解酵素を含む既存の洗剤製品をまだその洗剤製品に触れていない繊維製品の洗濯に使用する場合には、脂肪分解酵素の有用な利点が期待できないことをその洗剤製品の欠点とみなしている。さらに、欧州および米国では、自動洗濯機の使用者の間で回転乾燥機を使用して洗濯物を乾燥させる傾向が高まっている。これらの機械では、湿った布を熱風に触れさせることにより急速に乾燥させる。通常ならば室温で６〜４８時間かかる乾燥工程を、回転乾燥機を使用することにより１時間未満に短縮することができる。上述したように、リパーゼ酵素はその活性を脱水工程中で繊維製品の水分が少なくなったときに取り戻す。リパーゼにとって最適な水分を有する時間は、回転乾燥機を使用する場合はかなり短い。その結果、洗剤製品中に通常のリパーゼ酵素が存在しても、回転乾燥機での乾燥工程を含む洗濯工程でその製品を使用する場合は、あまり利点がない。従って、本発明の目的は、自動洗濯機での洗濯工程のメインサイクル中に脂肪分解活性を有意に示し、その結果、まだ洗剤製品に触れていない繊維製品の洗濯に使用する場合に脂肪分解活性を示す酵素洗剤組成物を提供することである。また、本発明の目的は、回転乾燥機と組み合わせて使用するのに特に適した酵素洗剤組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、自動洗濯機での洗濯工程のメインサイクル中に脂肪分解活性を有意に示す酵素の製造方法を提供することである。本発明者らは、驚いたことに、洗濯工程のメインサイクル中に脂肪分解活性を有意に示す洗剤組成物を処方するために使用できる脂肪分解酵素が存在することを見出した。さらに、洗濯工程のメインサイクル中にそのような脂肪分解活性を示す能力とフルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ）による不活性化挙動との間には良好な相関関係があることを見出した。すなわち、適切な脂肪分解酵素は、通常は、それらのＤＦＰによる不活性化挙動に基づいて選択することができる。特に、真核生物起源のクチナーゼ酵素は、洗濯工程のメインサイクル中にそのような脂肪分解効果を示す適切な酵素であることが見出された。ＷＯ−Ａ−８８／０９３６７（Genencor）は、効果的な洗浄組成物を処方するための、界面活性剤とかなり純粋な微生物由来のクチナーゼ酵素との組み合わせを示唆している。（原核生物の）Pseudomonas putida ＡＴＣＣ５３５５２から得たクチナーゼを含む洗剤組成物が開示されている。しかし、より最近の欧州特許出願ＥＰ−Ａ−４７６９１５（Clorox）には、同じ酵素（以下、リパーゼと言う。）を通常の方法で使用する場合、繊維製品の油汚れの除去において他のリパーゼより効果的であるわけではないことが開示されている。言い換えると、この酵素は、洗濯中に効果を示すとは考えられない。ＷＯ−Ａ−９−／０９４４６（Plant Genetics Systems）は、Fusarium solan i pisi 由来の真核生物のクチナーゼの大腸菌でのクローン化および産生を記載しており、特に、このクチナーゼを使用すると、洗濯洗剤などの洗浄剤ならびに化粧品組成物およびシャンプーなどの他の特定の脂肪溶解剤を処方することができると言及している。しかし、特定の酵素洗剤組成物は開示も示唆もないので、繊維洗濯用の洗剤組成物を処方するためにこの特定の酵素を選択するための動機は、当業者であっても見出せない。発明の定義本発明の第一の発明によれば、（ａ）（ａ１）０〜９５重量％の１種以上の陰イオン性界面活性剤および（ａ２）５〜１００重量％の１種以上の非イオン性界面活性剤を含む活性剤系０．１〜５０重量％ならびに（ｂ）洗剤組成物１ｇにつき１０〜２０，０００ＬＵの、洗濯工程のメインサイクル中に実質的な脂肪分解活性を示すことができる酵素を含む酵素洗剤組成物を提供する。本発明の第二の発明によれば、自動洗濯機での洗濯工程のメインサイクル中に実質的な脂肪分解活性を示す酵素を、フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＥＰ）によるその不活性化挙動に基づいて確認および選択する方法を提供する。本発明のさらに別の発明によれば、そのような酵素の製造法を提供する。発明の説明（ａ）界面活性剤系本発明の一つは、０〜９５重量％の１種以上の陰イオン性界面活性剤および５〜１００重量％の１種以上の非イオン性界面活性剤を含む活性剤系を０．１〜５０重量％含む酵素洗剤組成物を提供する。界面活性剤系は、さらに両性または双性イオン性洗剤化合物を含んでもよいが、それらは比較的高価であるため、通常は好ましくない。一般に、非イオン性および陰イオン性の界面活性系は、“Surface Active Age nts”Vol．1，Schwartz & Perry著，Interscience 1949，Vol．2，Schwartz，Pe rry & Berch著，Interscience 1958，“McCutcheon′s Emulsifiers andDeterge nts”Manufacturing Confectioners Company発行または“Tenside-Taschenbuch ”，H．Stache著，2nd Edn.，CarlHauser Verlag，1981に記載された界面活性剤から選択することができる。使用できる適切な非イオン性洗剤化合物としては、特に、疎水基を有する化合物と反応性水素原子を有する化合物との反応生成物、例えば、脂肪族アルコール、酸、アミドまたはアルキルフェノールとアルキレンオキシド（特にエチレンオキシド単独またはプロピレンオキシドと併用）との反応生成物が挙げられる。特定の非イオン性洗剤化合物は、Ｃ₆〜Ｃ₂₂アルキルフェノール−エチレンオキシド縮合体（一般には５〜２５ＥＯ、すなわち１分子につき５〜２５単位のエチレンオキシドを有する）および直鎖または分岐した第一級または第二級脂肪族Ｃ₈〜Ｃ₁₈アルコールとエチレンオキシドとの縮合生成物（一般には５〜４０ＥＯ）である。使用できる適する陰イオン性洗剤化合物は、通常、約８〜約２２個の炭素原子を含むアルキルラジカルを有する有機硫酸エステルおよびスルホン酸エステルの水溶性アルカリ金属塩であり、アルキルは高級アシルラジカルのアルキル部分を含むものとする。適する合成の陰イオン性洗剤化合物の例は、アルキル硫酸ナトリウムおよびカリウム、特に、例えば獣油またはココナツ油から作られる高級Ｃ₈ 〜Ｃ₁₈アルコールを硫酸エステルにすることにより得られるもの、アルキルＣ₉ 〜Ｃ₂₀ベンゼンスルホン酸ナトリウムおよびカリウム、特に直鎖第二アルキルＣ₁₀ 〜Ｃ₁₅ベンゼンスルホン酸ナトリウム；およびアルキルグリセリルエーテル硫酸ナトリウム、特に獣油またはココナツ油から得られる高級アルコールおよび石油から得られる合成アルコールのエーテルである。好ましい陰イオン性洗剤化合物は、Ｃ₁₁〜Ｃ₁₅アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムおよびＣ₁₂〜Ｃ₁₈アルキル硫酸ナトリウムである。また、ＥＰ−Ａ−３２８１７７（Unilever）に記載された、塩析に対して耐性を示す界面活性剤、ＥＰ−Ａ−０７００７４に記載のアルキルポリグリコシド界面活性剤およびアルキルモノグリコシドも適用可能である。好ましい界面活性剤系は、陰イオン性と非イオン性の洗剤活性物質の混合物であり、特にＥＰ−Ａ−３４６９９５（Unilever）に示されている陰イオン性および非イオン性の界面活性剤の群および例が挙げられる。特に好ましいのは、Ｃ₁₆ 〜Ｃ₁₈第一アルコールの硫酸エステルのアルカリ金属塩とＣ₁₂〜Ｃ₁₅第一アルコールの３〜７ＥＯエトキシレートとの混合物である界面活性剤系である。非イオン性洗剤は、好ましくは、界面活性剤系の１０重量％より多い量、例えば２５〜９０重量％の量で存在させる。陰イオン性界面活性剤は、例えば、界面活性剤系の約５〜約４０重量％の量で存在させることかできる。（ｂ）酵素本発明の酵素洗剤組成物は、さらに、洗剤組成物１ｇにつき１０〜２０，０００ＬＵ、好ましくは５０〜２，０００ＬＵの、洗濯工程のメインサイクル中に実質的な脂肪分解活性を示すことができる酵素を含む。本明細書では、ＬＵ、すなわちリパーゼ単位をＥＰ−Ａ−２５８０６８（ Novo Nordisk）にあるように定義する。洗濯工程のメインサイクル中の実質的な脂肪分解活性、すなわち洗濯中の効果とは、酵素を含む洗剤組成物が、欧州型の自動洗濯機で、濃度、水の硬度、温度に関しては通常の洗濯条件を使用して、１回の洗濯工程中に汚れた繊維製品からかなりの量の油汚れを取り除くことができることを意味する。同じ条件下では、通常の市販されている脂肪分解酵素Lipolase（登録商標）（Novo Nordisk製）は、油汚れに関して有意な洗濯中の効果を有すると思われないことを留意すべきである。油汚れに関する酵素の洗濯中の効果は、次の測定法を使用して評価することができる。綿を３３％含む真新しいポリエステル／綿のテスト布を下記に挙げる酵素を含まない洗剤製品を使用して予備洗濯し、次いで完全に洗い流す。次いで、汚れのないテスト布に、オリーブ油または他の適切な加水分解可能な油のしみを付ける。各テスト布（約１ｇ）を１００ｍｌ容のポリスチレンのびんに入れた３０ｍｌの洗濯液中でインキュベートする。洗濯液は、１ｌにつき１ｇの量で下記に示す洗剤製品を含む。びんを、水を満たしたＭｉｅｌｅＴＭＴ洗濯機中で、通常の３０℃メイン洗濯プログラムを使用して３０分間揺り動かす。脂肪分解活性を有する酵素を３ＬＵ／ｍｌで洗濯液に前添加する。コントロールは酵素を含まない。洗濯粉末は下記組成（重量％）を有する。エトキシ化アルコール非イオン製界面活性剤９．５硫酸ナトリウム３８．６炭酸ナトリウム４０．４ケイ酸ナトリウム（Ｎａ₂Ｏ：Ｓｉ₂Ｏ＝２．４）７．３水４．２非イオン性界面活性剤としてＣ₁₂〜Ｃ₁₅エトキシル化アルコール１０．５〜１３ＥＯを使用したが、エトキシル化アルコール非イオン性界面活性剤の種類は広い範囲で変わりうることが見出された。洗濯後、布を冷水で完全にすすぎ、回転乾燥機で冷風により乾燥して、残留脂肪の量を評価する。これは、いくつかの方法で行うことができる。一般的な方法は、テスト布をソクスレー抽出器で石油エーテルにより抽出し、溶媒を留去して、テスト布の最初の脂肪量に対する残留脂肪物質の割合（％）を秤量により求めることである。二番目のより感度の高い方法によれば、臭素化オリーブ油を使用してテスト布に汚れを付す（Richards，S.，Morris，M．A．and Arklay，T．H．(1968)，Text ile Research Journal，38，105-107）。次いで、各テスト布を１００ｍｌ容のポリスチレンのびんに入れた３０ｍｌの洗濯液中でインキュベートする。次いで、一連のびんを、水を満たした洗濯機で、通常の３０℃メイン洗濯プログラムを使用して揺り動かす。メインの洗濯後、テスト布を冷水中で５秒間、注意してすすぐ。すすぎ後直ちに、テスト布を乾燥機で冷風により乾燥する。乾燥後、残留脂肪の量は、Ｘ線蛍光分光法により布の臭素含量を測定することにより求めることができる。脂肪除去率は、テスト布に最初に存在した量に対する割合（％）として次のように求めることができる。［式中、臭素_bwは洗濯前の布上の臭素の割合を示し、臭素_awは洗濯後の臭素の割合を示す。］酵素活性のさらに別の評価法は、標準法に従って４６０ｎｍでの反射率を測定することにより行う。本発明による洗剤組成物は、本明細書に記載した測定法で、酵素を含まない同一の洗剤組成物よりも、最初の油汚れの量に基づいて、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％多く油汚れを除去することができる酵素を含む。酵素活性を定義する別の方法は、市販のLipolase（登録商標）（Novo／Nordis k製のリパーゼ）の活性と関連させるものである。本発明によれば、本明細書に記載した測定法で、該酵素による油汚れ除去とLipolase（登録商標）による油汚れ除去との比が少なくとも３、好ましくは少なくとも５である。酵素による汚れ除去は、酵素の存在に起因する汚れ除去、すなわち、酵素が存在しない場合に認められる汚れの除去をバックグランドとして差し引いたものを意味する。開示したように、本発明によれば、実質的に洗濯中の効果を有する洗剤組成物を処方することが可能であり、本発明での使用に適する酵素の選択は当業者であれば明らかである。しかし、本発明者らは、本発明の組成物に適切な脂肪分解酵素を選択するための非常に便利な方法を見出した。その方法は、脂肪分解酵素の洗濯中の効果がフルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ）によるそれらの酵素の不活性化挙動と密接に関連するという本発明者らの知見に基づくものである。一般に、この化合物は脂肪分解酵素の活性部位であるセリン残基と容易に反応し、その結果、該酵素の酵素活性を奪うことが知られている。本発明者らは、ＤＦＰにより容易に不活性化される脂肪分解酵素、すなわち接近可能な活性部位のセリン残基を有する酵素は、一般的に良好な洗濯中の効果を示すことを見出した。他方、ＤＦＰによる不活性化がゆっくりである脂肪分解酵素、すなわち接近困難な活性部位のセリン残基を有する酵素は、一般的に洗濯中の効果を示さないか、その効果が非常に乏しい。室温、ｐＨ１０でＤＦＰと１０分インキュベートした後の残留活性が５０％未満、好ましくは４０％未満である脂肪分解酵素は、良好な洗濯中の効果を有することが見出された。残留活性が２５％未満である脂肪分解酵素は洗濯中の効果がさらに良好であり、残留活性が１５％未満である脂肪分解酵素は最も良好であることが見出された。ＤＰＦ−不活性化の測定の詳細は実施例に記載する。本発明組成物に適切な酵素は、エステラーゼおよびリパーゼの酵素群（ＥＣ３．１．１．＊；＊は何らかの数字を示す。）に見出すことができる。本発明に係る洗濯中の効果を示す非常に好ましい酵素の種類は、真核生物由来のクチナーゼである。クチナーゼは、酵素（ＥＣ３．１．１．５０）のサブクラスであるワックスエステル加水分解酵素である。これらの酵素は、葉および幹の保護膜として植物に存在するエステル化長鎖脂肪酸および脂肪アルコールの層であるクチンを分解することができる。さらに、それらの酵素は、いくらかの脂肪分解活性を有し、トリグリセリドを加水分解することもできる。すなわち、特殊なリパーゼとみなすことができる。リパーゼの特徴は、それらが界面活性化を示すことである。これは、酵素活性が、完全に溶解した基質よりも界面またはミセルを形成した基質に対してより高いことを意味する。界面活性化は、基質濃度が基質の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）以上に上昇して界面が形成されると、脂肪分解活性が突然増加することで示される。この現象は、実験的には、酵素活性対基質濃度のグラフの不連続性として認めることができる。しかし、クチナーゼは、リパーゼとは反対に、実質的な界面活性化を示さない。この特徴、すなわち界面活性化を示さないため、本発明では、クチナーゼを、実質的に界面活性化を示さない脂肪分解酵素として定義する。従って、クチナーゼは、触媒結合部位を覆う螺旋の蓋（ｌｉｄ）を有しない点で伝統的なリパーゼとは異なる。クチナーゼは、その脂肪分解特性のため、一般に酵素洗剤組成物の成分として提案されている。例えば、ＷＯ−Ａ−８８／０９３６７（Genencor）は、効果的な洗浄組成物を処方するために、界面活性剤と実質的に純粋な微生物由来のクチナーゼとを組み合わせることを示唆している。開示されているのは、グラム陰性菌Pseudomonas putlida ＡＴＣＣ５３５５２から得られる（原核生物の）クチナーゼを含む洗剤組成物である。しかし、上述したように、より最近の欧州特許出願ＥＰ−Ａ−４７６９１５（Clorox）には、同じ酵素（以下、リパーゼと言う。）を通常の方法で使用すると、繊維製品の油汚れの除去において他のリパーゼより効果的でないことが開示されている。 Fusarium solani pisiから得たクチナーゼ遺伝子がクローン化され、配列決定が行われている（Ettinger et al.，（1987）Biochemistry，26，7883-7892）。ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６（Plant Genetics Systems）は、この遺伝子の大腸菌でのクローン化および産生を記載している。クチナーゼは、水性および非水性媒体中、クチナーゼと基質との間の界面の非存在下および存在下で、エステルの加水分解および合成を効率的に触媒することができる。このクチナーゼは、その全体的な安定性に基づいて、洗濯洗剤などの洗浄剤ならびに化粧品組成物およびシャンプーなどの他の特定の脂肪溶解剤の製造に使用することができると考えられる。しかし、その酵素の実行可能な経済的方法での製造法は開示されていないし、そのクチナーゼを含む特定の酵素洗剤組成物も開示されていない。クチナーゼは、植物（例えば、花粉）、細菌および真菌類など多数の源から得ることができる。本発明で使用できるクチナーゼは、真核生物由来のクチナーゼ群から選択される。そのような真核生物由来のクチナーゼは、植物（例えば、花粉）または真菌類などの種々の源から得ることができる。（真核生物の）真菌類由来のクチナーゼ群は、異なる特異性、すなわち葉特異性および幹特異性を有する二種類の群を含むと考えられる。葉特異性を有するクチナーゼは酸性または中性に最適ｐＨを有する傾向があるが、幹特異性を有するクチナーゼはアルカリ性に最適ｐＨを有する傾向がある。アルカリ性に最適ｐＨを有するクチナーゼは、重質繊維製品用洗濯粉末および液体などのアルカリ性ビルダー入り洗剤組成物での使用により適する。酸性〜中性に最適ｐＨを有するクチナーゼは、軽質製品またはリンスコンディショナーにより適するが、工業用洗浄製品にも適する。下記表Ｉに４種類の幹特異性クチナーゼを、それらの最適ｐＨとともに掲げる。表Ｉ幹特異性を有するクチナーゼの例最適ｐＨ Fusarium solani pisi ９ Fusarium roseum culmorum １０ Rhizoctonia solani ８．５ Alternaria brassicicola（PNBase I）９本発明で特に好ましいのは、野生型Fusarium solani pisi（Ettinger et al. ，1987）から得られるクチナーゼである。このクチナーゼを適する洗剤組成物に使用すると、明らかに「洗濯中の（in-the-wash）」効果を示す。また、本発明では、Fusarium solani pisi由来のクチナーゼとアミノ酸配列の相同性が高いクチナーゼも好ましい。例としては、Colletotrichum capsici，Co lletotrichum gloeosporiodes およびMagnaporthe grisea由来のクチナーゼが挙げられる。本発明に適さないのは、ＥＰ−Ａ−３０５２１６（Novo Nordisk）に記載のHu micola lanuginosa リパーゼである。これは、Lipolase（登録商標）として市販されている。しかし、この酵素は洗濯工程のメインサイクル中に実質的な脂肪分解活性を示すようにｒＤＮＡ技術で修飾することができると考えられる。そのような修飾はリパーゼ酵素の構造に影響を及ぼす。従って、酵素の立体配座の避けられないゆがみと酵素活性の利点との間のバランスを見出すためにいくつかの実験が必要である。一般に、活性部位の周りの電荷にあまり影響を及ぼさない修飾が好ましい。本発明の脂肪分解酵素は、適するどんな形状でも洗剤組成物に有用に添加することができる。すなわち、顆粒状組成物の形状、スラリー状の酵素または担体物質（ＥＰ−Ａ−２５８０６８に記載したものならびにNovo Nordisk製品のSavina se（登録商標）およびLipolase（登録商標））とともに添加することができる。液体洗剤製品に酵素を添加する良好な方法は、ＥＰ−Ａ−４５０７０２（Unilev er）に記載したように、エトキシル化アルコール非イオン性界面活性剤中に０．５〜５０重量％の酵素を含むスラリーの形態で行う。本発明の洗剤組成物で使用する酵素は、酵素の遺伝子を、適当な産生生物（例えばBacilliまたはPseudomonaceae）、酵母（例えば、Saccharomyces，Kluyvero myces ，HansenulaまたはPichia）または真菌類（Aspargillusなど）でクローン化することにより産生することができる。天然のクチナーゼを生産する微生物は通常は植物の病原体であり、これらの微生物は、クチナーゼ遺伝子の宿主細胞としての作用にはあまり適さない。従って、（プロ）クチナーゼをコードする遺伝子を、ｒＤＮＡ技術に好ましい宿主微生物に移すことができるｒＤＮＡベクターに組み込んだ。この目的に対しては、ＷＯ−Ａ−９０／０９４４６に記載のｒＤＮＡベクターと本質的に同様のｒＤＮＡベクターを使用することができる。醗酵工程の収量を改善するために、クチナーゼをコードする遺伝子を、安価な培地で速く増殖でき且つ大量の酵素を合成・分泌することができる微生物に移すべきである。本発明に従って修飾された適するｒＤＮＡ（宿主微生物）は、細菌、中でもBacilli、Corynebacteria、StaphylococciおよびStreptomyces、またはSaccharomyces cerevisiae および関連種、Kluvveromyces marxianusおよび関連種、Hansenula polymorphaおよび関連種、ならびにAspergillus属などの下等真核生物である。好ましい宿主微生物は下等真核生物である。なぜならば、これらの微生物は、醗酵工程で非常に良好に酵素を生産・分泌し、クチナーゼ分子を解糖することができるからである。グリコシル化は、洗剤系でのクチナーゼの安定性に寄与する。本発明はまた、真核生物由来のクチナーゼ遺伝子、例えばFusarium solani pi si 由来の遺伝子をクローニングｒＤＮＡベクターに導入して得られる遺伝物質、ならびに、新しい宿主細胞の形質転換、およびその新しい宿主細胞でのクチナーゼ遺伝子の発現を行うためのこれらの遺伝物質の使用を提供する。また、本発明は、ｒＤＮＡ技術で作ったまたは修飾した、該クチナーゼをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むｒＤＮＡベクターおよび該ポリヌクレオチドおよび／または該ｒＤＮＡベクターを含むｒＤＮＡ修飾微生物も開示する。本発明はまた、真核生物由来のクチナーゼをコードする対応のポリヌクレオチド、例えば成熟クチナーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供する。そのポリヌクレオチドでは、最後に翻訳されるコドンの後に停止コドンが続き、所望により成熟クチナーゼをコードするヌクレオチド配列のすぐ上流にこのクチナーゼのプレプロ−またはプロ−配列をコードするヌクレオチド配列を有する。そのようなポリヌクレオチドでは、クチナーゼをコードする生物起源のヌクレオチド配列を修飾して少なくとも１個のコドン、好ましくはできるだけ多くのコドンの「サイレント」突然変異を誘発して同等のアミノ酸残基をコードするコドンを形成することができ、新しい宿主の好むコドンにすることにより、安定性が改善された導入遺伝子に対するメッセンジャーＲＮＡを該宿主の細胞内で使用することができる。プロ−または成熟クチナーゼをコードするヌクレオチド配列の上流には、選択した宿主に適するシグナルまたは分泌配列をコードするヌクレオチド配列を位置させることができる。すなわち、本発明の一態様は、クチナーゼまたはその前駆体をコードするヌクレオチド配列が挿入されたｒＤＮＡベクターに関する。ヌクレオチド配列は、例えば下記から誘導することができる。（ａ）天然のヌクレオチド配列（例えば、Fusarium solanipisiにより産生されるプロプレ−またはプロ−クチナーゼの初のアミノ酸配列をコードする配列）；（ｂ）新しい宿主が好むコドンおよびその新しい宿主において安定したメッセンジャーＲＮＡとなるヌクレオチド配列から成り、やはり最初のアミノ酸配列をコードする化学的に合成したヌクレオチド配列；（ｃ）Fusarium solani pisiクチナーゼをコードする前記ａおよびｂで述べたヌクレオチド配列の一つから誘導され、アミノ酸配列は異なるが、洗剤系での安定性および／または活性は優れている、遺伝子工学的に処理されたヌクレオチド配列。要約すると、上述したクチナーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を好ましい宿主の一つで発現することができるｒＤＮＡベクターは、下記要素を含む。（ａ）成熟したクチナーゼまたはプレクチナーゼまたは（選択した宿主細胞にとって好ましい）分泌シグナルのすぐ下流でプレ配列の少なくとも一部が除去された対応するプレクチナーゼをコードする二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ。翻訳すべき遺伝子部分がＡＴＧコドンで始まっていない場合は、ＡＴＧコドンを前に置くべきである。遺伝子の翻訳部分はいつも適切な停止コドンで終わるべきである；（ｂ）クチナーゼをコードするｄｓＤＮＡの＋鎖の上流に位置する（選択した宿主微生物に適する）発現レギュロン（要素（ａ））；（ｃ）クチナーゼをコードするｄｓＤＮＡの＋鎖の下流に位置する（選択した宿主微生物に適する）ターミネーター配列（要素（ａ））；（ｄ１）ｄｓＤＮＡの選択した宿主のゲノムへの組入れを容易にするヌクレオチド配列または；（ｄ２）選択した宿主に適する複製起点；（ｅ１）所望により、（栄養要求性）選択マーカー。栄養要求性マーカーは、栄養要求性マーカーのコード領域および欠陥プロモータから成りうる；（ｅ２）所望により、クチナーゼの前駆体形の一つの選択した宿主での成熟および／または分泌に関与する蛋白質をコードするｄｓＤＮＡ配列。そのようなｒＤＮＡベクターはまた、先に定義したポリヌクレオチドの上流および／または下流に、クチナーゼの機能発現を容易にする別の配列を有することができる。栄養要求性マーカーは、栄養要求性マーカーのコード領域および欠陥プロモーター領域で構成することができる。本発明はまた、洗濯中の効果を示すことができる脂肪分解酵素の製造法を提供する。その方法は、洗濯中の効果を有する脂肪分解酵素をコードする、ｒＤＮＡ技術により作製した遺伝子を含む人工的に修飾した微生物を醗酵培養する工程、微生物により生産した酵素を醗酵培養基から分離するか、微生物細胞を醗酵培養基から分離することにより酵素を調製する工程、分離した細胞を崩壊する工程および酵素を該培養基または該細胞から物理的または化学的濃縮または精製法により濃縮または部分精製する工程を含む。該醗酵は、通常のバッチ式醗酵、供給− バッチ式醗酵または連続醗酵のいずれでもよい。使用すべき方法の選択は、宿主菌株および好ましい下流処理法（自体公知）に依存する。好ましい条件は、酵素が微生物によって醗酵培養基中に分泌され、その酵素が細胞の除去後に濾過または遠心のいずれかにより培養基から回収されるように選択する。酵素は次いで、所望により、望ましい程度に濃縮および精製することができる。微生物の特定の性質とは別に醗酵法自体は、公知の醗酵法ならびに通常使用される醗酵および下流処理装置に基づくことができる。本発明の別の発明では、本明細書で定義した脂肪分解活性を有する酵素の遺伝子を含み、該遺伝子によってコードされる酵素を産生することができる人工的に修飾された微生物を提供する。本発明はさらに、本明細書で記載した洗濯中の活性を有する脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列を有する組換えＤＮＡベクターを提供する。（ｃ）他の成分本発明の酵素洗剤組成物は、さらに５〜６０重量％、好ましくは２０〜５０重量％の洗剤ビルダーを含むことができる。この洗剤ビルダーは、洗濯液中の遊離カルシウムイオンレベルを低下することができる物質を含んでいてもよく、好ましくは、アルカリ性ｐＨの発生、繊維製品から除去した汚れの懸濁および繊維柔軟化粘土物質の懸濁などの他の利点を有する組成物を提供する。洗剤ビルダーの例としては、アルカリ金属の炭酸塩、重炭酸塩、オルトリン酸塩などの沈降ビルター、アルカリ金属のトリポリリン酸塩もしくはニトリロトリ酢酸塩などの金属イオン封鎖ビルター、またはアルカリ金属の無定形アルミノケイ酸塩またはゼオライトなどのイオン交換ビルダーが挙げられる。本発明の洗剤組成物は、遊離カルシウム濃度を１ｍＭ以下に減少させるようなビルダー物質を含む場合、その脂肪分解活性に対して特に好ましいことが見出された。本発明の酵素洗剤組成物はまた、別の態様では、酵素および洗剤系で通常使用される他の構成物（例えば、洗剤組成物用添加物）の組み合わせを含むことができる。そのような他の成分は、多くの公知種類のいずれでもよく、例えば、ＧＢ −Ａ−１３７２０３４（Unilever）、ＵＳ−Ａ−３９５０２７７、ＵＳ−Ａ−４０１１１６９、ＥＰ−Ａ−１７９５３３（Procter& Gamble）、ＥＰ−Ａ−２０５２０８およびＥＰ−Ａ−２０６３９０（Unilever）、ＪＰ−Ａ−６３−０７８０００（１９８８）およびResearch Disclosure 29056 of June 1988ならびに本明細書で言及したいくつかの明細書の各々に記載したものが挙げられる。本発明に係る洗剤組成物の組成は、ＥＰ−Ａ−４０７２２５（Unilever）の実施例Ｄ１〜Ｄ１４を参照して説明することもできる。蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）も存在するような洗剤組成物では、特別の利点が得られる。ＥＰ−Ａ−２７１１５４（Unilever）は、ｐＩが１０以下である多数の適するプロテアーゼを記載している。リパーゼとともに使用するためのプロテアーゼとしては、ある環境下では、例えばＢＰＮ型のズブチリシンまたは文献に開示された多くの型のズブチリシンが挙げられ、そのいくつかは、洗剤用の用途としてすでに提案されており、例えば、ＥＰ−Ａ−１３０７５６またはＥＰ −Ａ−５１４４６（ともに Genentech）、ＵＳ−Ａ−４７６００２５（Genenco r）、ＥＰ−Ａ−２１４４３５（Henkel）、ＷＯ−Ａ−８７／０４６６１（Amgen ）、ＷＯ−Ａ−８７／０５０５０（Genex）、Thomas et al．(1986)，Nature 5 ，316および 5，375-37、並びに J．Mol．Biol．（1987）193，803-813，Russe l et al(1987) in Nature 328，496-500などに記載の突然変異体プロテアーゼが挙げられる。以下の実施例で本発明を更に具体的に説明する。添付の図面は：図１Ａ合成フザリウムソラニピシ（Fusarium solani pisi）クチナーゼ遺伝子および構成オリゴヌクレオチドのカセット１のヌクレオチド配列。オリゴヌクレオチドトランジションを、カセット配列内で示す。小文字は、転写解読枠の外側の位置のヌクレオチドを示す。図１Ｂ合成Fusarium solani pisiクチナーゼ遺伝子および構成オリゴヌクレオチドのカセット２のヌクレオチド配列。オリゴヌクレオチドトランジションを、カセット配列内で示す。図１Ｃ合成Fusarium solani pisiクチナーゼ遺伝子および構成オリゴヌクレオチドのカセット３のヌクレオチド配列。オリゴヌクレオチドトランジションを、カセット配列内で示す。小文字は、転写解読枠の外側の位置のヌクレオチドを示す。図１Ｄ Fusarium solani pisi プレ−プロ−クチナーゼをコードする合成クチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。クチナーゼプレ-配列、プロ-配列および成熟配列を示す。また、クローニングに用いた部位およびオリゴヌクレオチドトランジションも示す。小文字は、転写解読枠の外側の位置のヌクレオチドを示す。図２ Fusarium solani pisi プロ-クチナーゼをコードする配列を、大腸菌（E. coli）ｐｈｏＡプレ-配列の誘導体をコードする配列に連結するための合成ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）およびクローニングに用いる制限酵素部位を示す。また、コードされたｐｈｏＡシグナル配列およびクチナーゼ遺伝子の一部のアミノ酸配列を、一文字記号を用いて示す。図３カセット８のヌクレオチド配列、即ちインベルターゼプレ-配列および成熟Fusar ium solani pisi クチナーゼをコードする配列の融合点をコードするＳａｃｌ-Ｂｃｌｌ断片。図４０．２ｋｂＳａｌＩ-ＮｒｕＩのｐＵＲ２７４０からの欠失により得たプラスミドｐＵＲ２７４１は、ｐＢＲ３２２の一部、２μｍプラスミドから誘導される、酵母細胞内の複製起点、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子および、酵母ｇａｌ７プロモーターの制御下、植物のα-ガラクトシダーゼ遺伝子と酵母インベルターゼシグナル配列をコードする領域との融合体から成るE．coli-S．cerevisiaeシャトルベクターである。図５プラスミドｐＵＲ７２１９は、ｐＢＲ３２２の一部、２μｍプラスミドから誘導される、酵母細胞内の複製起点、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子および、酵母ｇａｌ７プロモーターの制御下、成熟Fusarium solani pisiクチナーゼをコードする領域と酵母インベルターゼシグナル配列をコードする領域との融合体から成るE．coli-S．cerevisiae シャトルベクターである。図６プラスミドｐＵＲ２７４０は、ｐＢＲ３２２の一部、２μｍプラスミドから誘導される、酵母細胞内の複製起点、酵母ｌｅｕ２Ｄ遺伝子および、酵母ｇａｌ７プロモーターの制御下、植物のα-ガラクトシダーゼ遺伝子と酵母インベルターゼシグナル配列をコードする領域との融合体から成るE，coli-S．cerevisiaeシャトルベクターである。図７ｅｘ１Ａプレ-配列および成熟Fusarium solani pisiクチナーゼのコード配列の異なる型の連結を含む、カセット５、６および７のヌクレオチド配列。図８ｐＵＣ１９のＳａｌＩ部位内のアスペルギルスニガー亜種アワモリ（Aspergillu s niger var．awamori）ゲノミックＤＮＡの５．３ｋｂＳａ１Ｉ断片の挿入により得たプラスミドｐＡＷ１４Ｂ。図９ｐＡＷ１４Ｂ内のｅｘｌＡ転写解読枠から成るＢｓｐＨＩ-ＡｆｌＩＩ断片を、F usarium solani pisi プレ-プロ-クチナーゼをコードする配列から成るＢｓｐＨＩ-ＡｆｌＩＩ断片で置き換えることにより得たプラスミドｐＵＲ７２８０。従って、プラスミドｐＵＲ７２８０は、A．niger var．awamoriプロモーターおよびターミネーターの制御下、Fusarium solanipisiプレ-プロ-クチナーゼ遺伝子を含む。図１０ A．nidulans amdSおよびA．niger var．awamori pyrG選択マーカーの両方をｐＵＲ７２８０内に導入することにより得たプラスミドｐＵＲ７２８１。図１１ＤＦＰ-不活性化後の残存活性と種々の脂質分解酵素のよごれ除去パーセンテージ間の相関関係。以下の省略記号を用いる：リポラーゼ（TM，Novo Nordisk社） lip Fusarium solani pisiクチナーゼ（実施例２） CT Candida cylindraceaリパーゼ（Sigma社） Candida Chromobacterium viscosumリパーゼ（Sigma社） Chrom ブタ膵臓リパーゼ（Sigma社） Panor ジェネンコアリパーゼ（Pseudomonas putida ATCC 53552の亜種） Gen ＡＫＧリパーゼ３０Ｂ（Amano社） AKG ＳＤＬ１９５リパーゼ（Showa Denko社） SDL Ps．pseudoalcaligines CBS 473.85リパーゼ Ps．Alk図１２ Fusarium solani pisi から得たクチナーゼとリポラーゼ（ＴＭ）の脂質分解活性の比較。図１３種々の種類のよごれに対するFusarium solani pisiクチナーゼとリポラーゼ（ＴＭ）の１回洗浄の影響。図１４Ａは、多数回洗浄を繰り返した後に測定して１ＬＵ／ｍｌの酵素水準における、図１４Ｂは、同様にして３ＬＵ／ｍｌの酵素水準における、図１４Ｃは、同様にして５ＬＵ／ｍｌの酵素水準における、図１４Ｄは、同様にして１０ＬＵ／ｍｌの酵素水準における、Fusarium solani pisi 由来のクチナーゼとリポラーゼ（ＴＭ）の効果。図１５ＰＡＳ／非イオン処方におけるリポラーゼ（ＴＭ）、Pseudomonas gladioliリパーゼおよびFusarium solani pisiクチナーゼを用いた複数回洗浄試験。図１６別のＰＡＳ／非イオン形成におけるリポラーゼ（ＴＭ）、Pseudomonas gladioli リパーゼおよびFusarium solani pisiクチナーゼを用いた複数回洗浄試験。図１７各洗浄サイクル後に再度よごれをつけたことを除いては図１６と同様。参考文献実施例１ Fusarium solani pisi プレ-プロ-クチナーゼをコードする合成遺伝子の構築 Fusarium solani pisiプレ-プロ-クチナーゼをコードする合成遺伝子を、実質的にＥＰ-Ａ-４０７２２５（Unilever社）に記載された方法により構築した。公開されたFusarium solani pisi遺伝子のヌクレオチド配列（Soliday等（1984年）およびWO-A-90/09446，Plant Genetic Systems社）に基づき、Fusarium solan i pisi プレ-プロ-クチナーゼポリペプチドをコードする領域から成る完全合成ＤＮＡ断片を設計した。元のFusarium solani pisi遺伝子のヌクレオチド配列と比較して、この合成クチナーゼ遺伝子は、コードされたアミノ酸配列に影響することなく、遺伝子内の都合のいい位置に制限酵素認識部位を導入したいくつかのヌクレオチドの変化を有する。全合成クチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図１Ｄに示す。合成クチナーゼ遺伝子の構築は、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドから出発する３種の別個のカセットの組み立てにより行った。各合成ＤＮＡカセットは、起点にＥｃｏＲＩ部位、終点にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えている。オリゴヌクレオチドを、アプライドバイオシステムズ３８０ＡＤＮＡシンセサイザーを用いて合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。各カセットの構築は、以下に概説した手法に従った。所定のカセットを構成する等モル量（５０ｐモル）のオリゴヌクレオチドを混合し、５′-末端で燐酸化し、アニーリングをし、標準技法によりライゲートした。その結果できた２重鎖ＤＮＡ分子の混合物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分別し、電気溶出によりゲルから回収した。その結果できた合成ＤＮＡカセットをｐＵＣ９の２．７ｋｂＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片と共にライゲートし、Escherichia coliに導入した。合成カセットの配列を確認するのに好適なオリゴヌクレオチドプライマーを用い、多数のクローンのＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ挿入物を両方向に完全に配列決定した。この手法を用い、ｐＵＲ７２０７（カセット１を含む、図１Ａ）、ｐＵＲ７２０８（カセット２を含む、図１Ｂ）およびｐＵＲ７２０９（カセット３を含む、図１Ｃ）を構築した。最後に、ｐＵＲ７２０７の２．９ｋｂＥｃｏＲＩ-ＡｐａＩ断片とｐＵＲ７２０８の０．２ｋｂＡｐａＩ-ＮｈｅＩ断片およびｐＵＲ７２０９の０．３ｋｂＮｈｅＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片とを合わせることにより組み立て、ｐＵＲ７２１０を得た。このプラスミドは、Fusarium solani pisiの完全なプレ-プロ-クチナーゼをコードする転写解読枠を含む（図１Ｄ）。実施例２ Fusarium solani pisi（プロ）クチナーゼのEscherichia coli中での発現ＷＯ-Ａ-９０／０９／４４６（プラントゲネティックシステムズ社）に記載されたものと機能的に類似している、合成クチナーゼ遺伝子でE. coli中での発現のためのベクターを構築した。Fusarium solani pisiプロ-クチナーゼをコードする合成遺伝子の一部が、適当なE. coli発現シグナル、即ち、（ｉ）誘導プロモーター、（ｉｉ）リボソーム結合部位および、（ｉｉｉ）翻訳開始コドンを提供し、細胞膜の外側へのプロ-クチナーゼの送りだしに要求される情報を提供するシグナル配列により先導される構築物を設計した。合成クチナーゼ遺伝子のプロ-配列へのE. coli phoAシグナル配列の誘導体（M ichaelis等，1983）の融合のための合成リンカーを設計した（図２参照）。シグナルペプチドの切断およびプロ-クチナーゼの分泌を最適化するために、このリンカーのヌクレオチド配列は、ｐｈｏＡシグナル配列の３個のＣ-末端アミノ酸残基（Ｔｈｒ-Ｌｙｓ-Ａｌａ）がＡｌａ-Ａｓｎ -Ａｌａに変化し、クチナーゼプロ-配列のＮ-末端アミノ酸残基（Ｌｅｕ１、図１Ｄ参照）がＡｌａに変化したものであった。この構築物は、細胞周辺腔内へのクチナーゼの分泌を保証する（ＷＯ-Ａ-９０／０９４４６、プラントゲネティックシステムズ社参照）。このような構築物を得るために、クチナーゼプレ-配列およびプロ-配列の一部から成る６９ｂｐＥｃｏＲＩ-ＳｐｅＩ断片をｐＵＲ７２１０から取り除き、E. coli phoAプレ-配列の誘導体およびクチナーゼプロ-配列の変化したＮ-末端アミノ酸残基を提供する合成ＤＮＡリンカー配列（ＥｃｏＲＩ-ＳｐｅＩ断片）（図２）で置換した。その結果できたプラスミドをｐＵＲ７２５０と命名し、リボソーム結合部位および、ｐｈｏＡシグナル配列をコードする領域に融合したプロ- クチナーゼをコードする領域から成る０．７ｋｂＢａｍＨＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片の単離に用いた。この断片をｐＭＭＢ６７ＥＨ（Fursle等，1986）の８．９ｋｂＢａｍＨＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片とライゲートしてｐＵＲ７２２０を得た。このプラスミド内でプロ-クチナーゼをコードする合成遺伝子をｐｈｏＡシグナル配列の変形バージョンに融合させ、誘導ｔａｃ-プロモーターの制御下においた。ｐＵＲ７２２０を有するE. coli菌株ＷＫ６を、０．０１７ＭのＫＨ₂ＰＯ０．０１７ＭのＫ₂ＨＰＯ１２ｇ／ｌのバクト-トリプトン２４ｇ／１のバクト-イーストエキス０．４％グリセロール（ｖ／ｖ）から成る０．５ＬのＩＸＴＢ培地（Tartol and Hobbs，1988）が入った２Ｌの振蕩フラスコ内で生育させた。培養物を、１００ｐｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下、２５℃-３０℃で一晩激しく振蕩（１５０ｒｐｍ）してＯＤが６１０ｎｍで１０-１２になるまで生育させた。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド）を、１０μＭの最終濃度になるように加え、更に１２-１６時間インキュベーションを続けた。培養物から採取した試料の分析により判断することであるが、生産される脂質分解活性の量における更なる顕著な増加が観察されなくなった時点で、細胞を遠心分離により集め、２０％庶糖を含有する緩衝液の元の培養容量に０ ℃で再懸濁させた。細胞を遠心分離により集め、浸透ショックを介した細胞溶解を引き起こす氷冷水の元の培養容量に再懸濁させた。細胞の破片を遠心分離により除去し、無細胞抽出液を酢酸でｐＨ４．８に酸性化し、４℃で一晩放置し、その結果生じた沈澱を取り出した。細胞内リパーゼを実質的に含まない７５％以上純粋なクチナーゼ調製物を、この段階で、無細胞抽出液の限外濾過および凍結乾燥の手段により得た。あるいは、クチナーゼは、酸性化した無細胞抽出液をＳＰ-セファデックスにかけ、ｐＨ８．０の緩衝液で酵素を溶出し、適切な容量のＤＥＡＥ-セルロース（ワットマンＤＥ-５２）を介して濃アルカリ溶液を通過させ、ＤＥＡＥ通過物をＱ- セファロースＨＰ（ファルマシア社）カラムに直接供することにより均質（即ち、９５％以上純粋）になるまで精製することができる。塩勾配を用いた溶出により、均質クチナーゼ調製物を代表的な全収率の７５％以上で得た。実施例３ Fusarium solani pisi クチナーゼのSaccharomyces cerevisiaeにおける発現合成Fusarium solani pisiクチナーゼ遺伝子のSaccharomyces cerevisiaeにおける発現のために、成熟クチナーゼをコードする合成遺伝子がS.cerevisiaeインベルターゼのプレ-配列（Taussig and Carlsson，1983）および、強力な誘導ｇａｌ７プロモーター（Nogi and Fukasawa，1983）により先導される発現ベクターを構築した。このような融合体用の合成クチナーゼ遺伝子を調製するために、インベルターゼプレ-配列をコードする配列を、成熟クチナーゼのＮ-末端をコードする配列に融合させるアダプター断片を合成した。この断片を、実質的に実施例１（カセット８、図３参照）で述べた通りに、ｐＵＣ９中にＥｃｏＲＩ -ＨｉｎｄＩＩＩカセットとして組み入れ、ｐＵＲ７２１７を得た。プラスミドｐＵＲ７２１０およびｐＵＲ７２１７をE.coli JM110（damメチラーゼ活性が欠乏した菌株）に導入し、ｐＵＲ７２１７の２．８ｋｂＢｃｌＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＲ７２１０の０．６ｋｂＢｃｌＩ-ＨｉｎｄＩ１１断片とライゲ−トして、成熟クチナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がS,cerevisi ae インベルターゼプレ-配列をコードする領域の一部と融合するｐＵＲ７２１８を得た。ｐＵＲ２７４０の８．９ｋｂＮｒｕＩ-ＳａｌＩ断片の単離、ＳａｌＩの突出末端内のクレナウポリメラーゼによる充填および、断片の再環化により、発現ベクターｐＵＲ２７４１（図４参照）をｐＵＲ２７４０（Verbakel，1991，図６参照）から誘導した。ｐＵＲ２７４１の７．３ｋｂＳａｃＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＲ７２１８の０．７ｋｂＳａｃＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片とライゲートしてｐＵＲ７２１９を得た（図５参照）。任意に、S．cer evisiae ｐｏｌＩＩターミネーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位中のクチナーゼ遺伝子の後ろに置くことができ、これはクチナーゼ遺伝子の効率的な発現に必須ではないことがわかった。E．coli-S，cerevisiaeシャトルプラスミドｐＵＲ７２１９は、２μプラスミド（ｃｉｒ⁺菌株）を含むS．cerevisiae菌株における複製起点、S．cerevisiae Ｌｅｕ２-菌株における高コピー数の形質転換体の選択を可能にするS．cerevisiae Ｌｅｕ２遺伝子のプロモーター欠失バージョンおよび、強力な誘導S．cerevisiae ｇａｌ７プロモーターの調節下、S．cerevisiae インベルターゼプレ-配列に機能的に結合したFusarium solani pisiクチナーゼの成熟部分をコードする合成遺伝子を含有する。菌株ＹＴ６-２-１Ｌ（Erhart and Hollenberg，1981）と同一であるS．cerevi siae 菌株ＳＵ５０（ａ、ｃｉｒ０、Ｌｅｕ２、ｈｉｓ４、ｃａｎ１）を、酵母細胞のエレクトロポレーション用標準プロトコールを用い、２μS．cerevisiae プラスミドとｐＵＲ７２１９との等モル混合物で同時形質転換した。形質転換体は、ロイシン原栄養株を選択し、全ＤＮＡを多数の形質転換体から単離した。全形質転換体は、２μプラスミドとｐＵＲ７２１９の両方を含有すると考えられ、ｐＵＲ７２１９上に含有されるＬｅｕ２遺伝子のプロモーター-欠失バージョンは、２μ酵母プラスミドが同時に存在するため高コピー数で存在する場合、ｌｅｕ２欠失菌株を単に機能的に補完することができることを示す。形質転換体の１つは、４０世代以上完全培地上で培養し、続いて選択および完全固体培地上で複製プレーティングすることによりｐＵＲ７２１９プラスミドを除去してS．cerevisiae 菌株ＳＵ５１（ａ、ｃｉｒ⁺ 、Ｌｅｕ２、ｈｉｓ４、ｃａｎ１）を得た。ｐＵＲ７２１９プラスミドを有するS．cerevisiae 菌株ＳＵ５１を、 - アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（ＹＮＢ） 6.7g/l - ヒスチジン 20mg/l - ブドウ糖 20g/l から成る０．２ＬのＭＭ培地が入った１Ｌの振蕩フラスコ中で生育させた。培養物を、３０℃で一晩激しく振蕩（１５０ｒｐｍ）してＯＤが６１０ｎｍで２-４になるまで生育させた。細胞を遠心分離により集め、２Ｌの振蕩フラスコに入った - 酵母エキス１０ｇ／ｌ - バクトペプトン２０ｇ／ｌ - ガラクトース５０ｇ／ｌから成る１ＬのＹＰＧＡＬ培地に再懸濁し、更に１２-１６時間インキュベーションを続けた。規則的な間隔で試料を培養液から採取し、遠心分離してバイオマスを取り除いた。基質としてオリーブ油を用いた滴定アッセイにより、上澄のクチナーゼ活性を分析した。各試料について、１００から２００μｌの濾液を、５．０ｍｌのリパーゼ基質（シグマ社、リパーゼの基質としてオリーブ油を含有）と２５．０ｍｌの緩衝液（５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ９．０、４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＣａＣｌ₂）との撹拌混合液に加えた。アッセイは、３０℃ で行い、脂肪酸の放出を、メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ）ＤＬ２５タイトレーターを用い０．０５ＭのＮａＯＨでｐＨ９．０にする自動滴定により測定した。時間に対する滴定剤の量のカーブを得た。このカーブの最大スロープから試料中に含まれるリパーゼ活性の量を算定した。酵素活性の１単位を、上記の特定の条件下、１分間にオリーブ油から１μＭの脂肪酸を放出する酵素の量と定義する。このような測定法は、当業者等に公知である。クチナーゼ活性の生産がもはや増加しなくなった時点で、遠心分離により細胞を除去し、無細胞抽出液を酢酸でｐＨ４．８に酸性化し、実施例１に記載の通りにクチナーゼを回収した。実施例４ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉにおけるFusarium solani pisiクチナーゼの発現 Aspergillus niger 亜種awamori における合成Fusariumsolani pisiクチナーゼ遺伝子の発現のために、Fusariumsolani pisiプレ-プロ-クチナーゼをコードする合成遺伝子を、A．niger亜種awamori の強力な誘導ｅｘｌＡプロモーター（ Maat等，1992年，de Graaff等，1992年）の制御下においた発現ベクターを構築した。プラスミドｐＡＷ１４Ｂから出発してプレ-プロ-クチナーゼ発現プラスミド（ｐＵＲ７２８０）を構築して、これをE．coli 菌株ＪＭ１０９に導入し、これを１９９０年５月３１日にＮ゜ＣＢＳ２３７．９０としてCentraalbureau voorSch immelcultures，Baarn，オランダに寄託したが、これは、２．５ｋｂの５′-フランキング配列および２．０ｋｂの３′-フランキング配列と共に０．７ｋｂエンドキシラナーゼＩＩ（ｅｘｌＡ）遺伝子が位置する約５．３ｋｂＳａｌＩ断片（図８）を含んでいる。ｐＡＷ１４Ｂ内のｅｘｌＡコード領域を、プレ-プロ-クチナーゼコード領域により置換した。ｅｘｌＡ遺伝子の第一コドン（ＡＴＧ）から成るＢｓｐＨＩ部位（５′ -ＴＣＡＴＧＡ-３′）およびｅｘｌＡ遺伝子の終止コドン（ＴＡＡ）から成るＡｆｌＩＩ部位（５′-ＣＴＴＡＡＧ-３′）は、ｐＵＲ７２８０の構築を容易にした。構築は、以下の通りに行った：ｐＡＷ１４Ｂ（７．９ｋｂ）をＢｓｐＨＩで部分的に切断し、直線化したプラスミド（７．９ｋｂ）をアガロースゲルから単離した。次いで、単離した７．９ｋｂ断片を、これのＢｓｐＨＩ部位の数個のヌクレオチド下流を切断するＢａｍＩで切断して、別のＢｓｐＨＩ部位で直線化したプラスミドを取り出した。断片をアガロースゲル上で分離し、７．９ｋｂＢｓｐＨＩ-ＢａｍＩ断片を単離した。これを、ＡｆｌＩＩで部分的に切断し、その結果生じた７．２ｋｂＢｓｐＨＩ-ＡｆｌＩＩ断片を単離した。 Fusarium solani pisiプレ-プロ-クチナーゼをコードする全転写解読枠から成る、ｐＵＲ７２１０の０．７ｋｂＢｓｐＨＩ-ＡｆｌＩＩ断片をｐＡＷ１４Ｂの７．２ｋｂＢｓｐＨＩ-ＡｆｌＩＩ断片と共にライゲートし、ｐＵＲ７２８０を得た。構築したベクター（ｐＵＲ７２８０）は、次いで、従来の同時形質転換技法の手段によりカビ（例えば、Aspergillus niger 、Aspergillus niger 亜種aw amori 等）に導入することができ、次いで、プレ-プロ-クチナーゼ遺伝子は、エンドキシラナーゼＩＩプロモーターの誘導を介して発現させることができる。また、構築したｒＤＮＡベクターは、従来の選択マーカー（例えば、ａｍｄｓまたはｐｙｒＧ、ハイグロマイシン等）と共に提供することもでき、その結果できたｒＤＮＡベクターでカビを形質転換して所望の蛋白を生産することができる。例として、ａｍｄｓおよびｐｙｒＧ選択マーカーを発現ベクター内に導入してｐＵＲ７２８１を得た（図１０）。この目的のために、合成オリゴヌクレオチド（５′-ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ-３′）を用い、ＥｃｏＲＩ部位（プレ-プロ-クチナーゼ遺伝子のＡＴＧコドンの１．２ｋｂ上流に存在）をＮｏｔＩ部位に変換することによりＮｏｔＩ部位を創出し、ｐＵＲ７２８２を得た。全A．nidulans amdS遺伝子およびA．niger亜種awamoriｐｙｒＧ遺伝子ならびにそれら自身のプロモーターおよびターミネーターから成る適切なＤＮＡ断片に、フランキングＮｏｔＩ部位を備えさせ、ｐＵＲ７２８２のＮｏｔＩ部位に導入してｐＵＲ７２８１を得た（図１０）。 Aspergillus niger亜種awamori中で合成Fusarium solanipisiクチナーゼ遺伝子を発現させる別のアプローチとして、成熟クチナーゼをコードする合成遺伝子がそれ自身のプレ-プロ-配列ではなくA．niger亜種awamoriｅｘｌＡのプレ−配列によって先導される発現ベクターを構築した。このような融合体用の合成クチナーゼ遺伝子を調製するために、ｅｘｌＡプレ -配列をコードする配列を、成熟クチナーゼのＮ-末端をコードする配列に異なる方法で連結するいくつかのアダプター断片を合成した。カセット５内で、この連結を、ｅｘｌＡプレ-配列をクチナーゼのプロ-配列に融合させることにより行った。カッセト６内で、ｅｘｌＡプレ-配列を成熟クチナーゼのＮ-末端残基と融合させた。カッセト７は、カッセト６と同様であるが、こちらは、シグナルペプチドの切断に対する要求をより満たすために、コードされた成熟クチナーゼポリペプチドのＮ-末端残基が元のグリシンからセリン残基に変化している。カセット５、６および７を、実質的に実施例１に述べた通りに合成オリゴヌクレオチドから組み立てた（図７参照）。カセット５を用いてｐＵＲ７２１０の０．１ｋｂＥｃｏＲＩ-ＳｐｅＩ断片を置き換え、ｐＵＲ７２８７を得た。カセット６および７を用いてｐＵＲ７２１０の０．１ｋｂＥｃｏＲＩ-ＢｃｌＩ断片を置き換え、各々ｐＵＲ７２８８およびｐＵＲ７２８９を得た。ｐＵＲ７２８７、ｐＵＲ７２８８およびｐＵＲ７２８９の各プラスミドのために、０．７ｋｂＢｓｐＨＩ-ＡＦｌＩＩ断片をｐＡＷ１４Ｂの７．２ｋｂＢｓｐＨＩ-ＡｆｌＩＩ断片とライゲートして、各々、ｐＵＲ７２９０、ｐＵＲ７２９１およびｐＵＲ７２９２を得た。構築したｒＤＮＡベクターを、次いで、従来の同時形質転換技法の手段によりカビ（Aspergillus niger、Aspergillusniger 亜種awamori）に導入し、プレ-（プロ）-クチナーゼ遺伝子を、エンドキシラナーゼＩＩプロモーターの誘導を介して発現させた。また、構築したｒＤＮＡベクターは、本実施例でｐＵＲ７２８０を用いて具体的に説明した（上記参照）ように、従来の選択マーカー（例えば、ａｍｄｓまたはｐｙｒＧ、ハイグロマイシン）と共に提供することもでき、その結果できたｒＤＮＡベクターでカビを形質転換して所望の蛋白を生産することができる。発現ベクターｐＵＲ７２８０、ｐＵＲ７２８１、ｐＵＲ７２９０、ｐＵＲ７２９１、ｐＵＲ７２９２（A．niger亜種awamori ｅｘｌＡプロモーターおよびターミネーターの制御下、相当するプロ-配列を有するまたは有せずにFusariumsolan i pisi 成熟クチナーゼをコードする領域ならびにクチナーゼシグナル配列もしくはｅｘｌＡシグナル配列のいずれかを含有）のいずれかで形質転換されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ菌株を以下の条件で生育させた：４００ｍｌの合成培地（ｐＨ６．５）を含む複数個の１Ｌの振蕩フラスコに胞子を接種した（最終濃度：１０Ｅ６／ｍｌ）。培地は、以下の組成（ＡＷ培地）を有した：庶糖１０ｇ／ｌＮａＮＯ₃ ６．０ｇ／ｌＫＣｌ０．５２ｇ／ｌＫＨ₂ＰＯ₄ １．５２ｇ／ｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．４９ｇ／ｌ酵母エキス１．０ｇ／ｌＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ２２ｍｇ／ｌＨ₃ＢＯ₃ １１ｍｇ／ｌＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ５ｍｇ／ｌＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ５ｍｇ／ｌＣａＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ１．７ｍｇ／ｌＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ１．６ｍｇ／ｌＮａＨ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ１．５ｍｇ／ｌＮａ₂ＥＤＴＡ５０ｍｇ／ｌ。ＭＫＸインキュベーターシェーカー内で３０℃、２００ｒｐｍで２４時間インキュベーションを行った。生育後、細胞を濾別（０．４５μｍフィルター）し、庶糖および酵母エキスを含まないＡＷ培地（塩溶液）で２回洗浄し、５０ｍｌの塩溶液に再懸濁し、５０ｍｌの塩溶液が入った３００ｍｌの振蕩フラスコに移し、これに、最終濃度が１０ｇ／ｌになるようにキシロースを加えた（誘導培地）。上記と同じ条件下でインキュベーションを一晩続けた。その結果できた培養物をミラクロス上で濾過してバイオマスを取り除き、実質的に実施例２に記載の通りにクチナーゼを回収した。実施例５ Fusarium solani pisi クチナーゼ遺伝子に関する遺伝子の単離および同定 Fusarium solani pisiクチナーゼとの相同性の程度が異なるクチナーゼをコードする遺伝子を異なるカビから単離した。カビの培養物を、０．２５％ブドウ糖を追加したHankin andKolattukudy（1968）によって述べられた培地２００ｍｌを含む５００ｍｌの振蕩フラスコ内に加え、ＭＫＸインキュベーターシェーカー（１００ｒｐｍ）内で２８℃で４日間インキュベートした。この時点で、ブドウ糖が消費され、実質的にEttinger等（1987年）により述べられた通りにクチン加水分解物を加えることによりクチナーゼ生産が誘導された。規則的間隔で試料を培養物から採取し、標準技法（実施例４参照）により脂質分解活性の存在を分析した。通常、誘導の約２日後に脂質分解活性を示し、その時点で標準技法を用いて細胞を濾過により回収した。菌糸を洗浄し、液体窒素中で冷凍し、標準技法により凍結乾燥した。全細胞ＲＮＡ調製物を、実質的にSambrook等（1989年）により述べられた通りに、グアニジンチオシアネート法を用いて単離し、塩化セシウム濃度勾配遠心分離により精製した。ｐｏｌｙＡ（＋）ｍＲＮＡ画分を、ｐｏｌｙＡＴｔｒａｃｔｍＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｇａ社）を用いて単離した。ｐｏｌｙＡ（＋）ｍＲＮＡ画分を、標準技法によりプローブとしてFusarium solani pisiクチナーゼ遺伝子から得たｃＤＮＡ断片を用いたノーザンハイブリダイゼーション分析に使用して、クチナーゼが関連した遺伝子の発現を確認した。プローブとハイブリダイズすることのできる材料から成るｍＲＮＡの調製物を、製造元の指示書によりＺＡＰｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社、La jolla）を用いてｃＤＮＡの合成に使用して、ｐｏｌｙ- Ａ部位をフランクするＸｈｏＩ付着末端と他方の末端のＥｃｏＲＩアダプターを有するｃＤＮＡ断片を得た。β-ガラクトシダーゼ融合蛋白（Huse等，1988年）を発現させるために、得られたｃＤＮＡ断片を、λＺＡＰＩＩベクター（ストラタジーン社、La Jolla）内でセンス方向のクローニングによる発現ライブラリーの構築に用いた。これらのライブラリーを、Fusarium solani pisi クチナーゼに対して生成させた抗血清を用いてスクリーニングした。或は、合成したｃＤＮＡ画分をクチナーゼ特異プライマーを用いたＰＣＲ-スクリーニングに供した（表２参照）。これらのプライマーは、いくつかのカビクチナーゼ遺伝子（Ettinger等，1987年）のアミノ酸配列の比較により誘導した。対照としてFusarium solani pisiクチナーゼから得たｃＤＮＡを用い、ＰＣＲ反応の条件をプライマーの各セットに最適化した。それによって、同様の条件下でFusarium solani pisi クチナーゼから得たｃＤＮＡにより生成したＰＣＲ断片の長さと同じ（又はそれよりも長い）長さの特異的ＰＣＲ断片を生成することのできるｃＤＮＡの調製のために、ＰＣＲ断片をゲル電気泳動により精製し、ゲルから分離した。また、別のアプローチとして、クチナーゼ特異プライマーを用いたＰＣＲスクリーニング技法を、陽性の対照としてFusarium solani pisiのゲノミックＤＮＡを用いた、カビ菌株のゲノミックＤＮＡに直接供した。それによって、同様の条件下でFusarium solani pisiクチナーゼから得たｃＤＮＡにより生成したＰＣＲ断片の長さと同じ（又はそれよりも長い）長さの特異的ＰＣＲ断片を生成することのできるカビゲノミックＤＮＡの調製のために、ＰＣＲ断片をゲル電気泳動により精製し、ゲルから分離した。発現ライブラリーアプローチまたはＰＣＲスクリーニングアプローチのいずれかで陽性反応を示した菌株（ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡのいずれかを有する）および他の多数の菌株のために、高分子量ゲノミックＤＮＡを単離した。菌株を実質的にEttinger等（1987年）により記載された通りに生育させ、ゲノミックＤＮＡをGraaff等（1988年）により記載された通りに単離した。ゲノミックＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、プローブとして類似のｃＤＮＡインサート（発現ライブラリーアプローチ）またはＰＣＲ断片（ＰＣＲスクリーニングアプローチ）またはFusarium solani pisiクチナーゼ遺伝子（他の菌株）を用いたサウザンハイブリダイゼーションにより分析し、クチナーゼ遺伝子の制限酵素地図を構築した。ゲノミックＤＮＡの適切な消化物をゲル電気泳動によりサイズ分別し、適切なサイズの断片をゲルから分離し、ｐＵＣ１９にサブクローンした。これらのゲノミックライブラリーを、相当するｃＤＮＡインサート（発現ライブラリーアプローチ）またはＰＣＲ断片（ＰＣＲスクリーニングアプローチ）でスクリーニングしてクチナーゼ遺伝子のゲノミックコピーから成るクローンを得た。これらの遺伝子は、両方向に配列決定した。イントロンを、相当するｃＤＮＡを配列決定することにより又は他のクチナーゼ配列（Ettinger等，1987年）との比較により同定した。また、成熟クチナーゼポリペプチドのＮ-末端もこのような比較から演繹した。標準ＰＣＲ技法を用いて、イントロンを除去し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を転写解読枠のすぐ下流に設計し、Saccharomyces cerevisiaeインベルターゼ遺伝子（ＳａｃＩ部位により先導された、カセット８と比較せよ、図３）のプレ-配列をコードする配列を、成熟クチナーゼのＮ-末端をコードする配列に融合した。得られた、S ．cerevisiae インベルターゼプレ-配列をコードする配列に機能的に結合したクチナーゼ遺伝子から成るＳａｃＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＲ７２４１の７．３ｋｂＳａｃＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ断片（図４参照）とライゲートし、S．cerevi siae 菌株ＳＵ５１に導入した。カビクチナーゼを発現させ、実質的に実施例４に記載の通りに培養液から回収した。実施例６ジ-イソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）を用いた不活性化実験この実験で、種々の起源の脂質分解酵素を、種々の濃度のＤＦＰによる一定期間の不活性化に供した。不活性化期間後の残存活性のパーセンテージを、ｐＨ- スタット実験で測定した。実験条件は：試験しようとする脂質分解酵素を、２０ｍＭのＣａＣｌ_２・２Ｈ₂Ｏを含有する１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ１０．０（メルク社）中でｍｌ当り０．５ｍｇの蛋白濃度で用いた。２０μｌのＤＦＰ-阻害剤溶液を、この酵素溶液（試料）０．５ｍｌに加え、２０μｌのエーテルを別の０．５ｍｌの酵素溶液に加えた（ブランク）。ＤＦＰ-阻害剤溶液は、エーテル（Baker社）に溶解した０．５ＭのＤＦＰ（ジ-イソプロピルフルオロホスフェート、Fluka社）である。両方の試料を室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、溶液を、エッペンドルフ遠心分離機で全速力（１４，０００ｒｐｍ）で２分間遠心分離した。上澄を用いた。試料とブランクの両方のリパーゼ活性を、リパーゼ基質（シグマ社、カタログＮｏ．８００-１）を用いｐＨ１０．０でのｐＨ-スタット実験で測定した。次いで、残存活性（ＲＡ）を以下の通りに算定した：ＲＡ＝試料のリパーゼ活性／ブランクのリパーゼ活性 *１００％残存活性のパーセンテージを下記に示す：脂質分解酵素残存活性（％）リポラーゼ（TM、Novo Nordisk社）８６Fusarium solani pisi クチナーゼ（実施例２）５Candida cylindracea リパーゼ（Sigma社）８３Chromobacteriumu viscosum リパーゼ（Sigma ６５ブタ膵臓リパーゼ（Sigma社）６０ Genencorリパーゼ（Pseudomonas putida ATCC 53552 の亜種，“Lumafast”）６５ AKGリパーゼ30B（Amano社）５２ SDL 195リパーゼ（Showa Denko社）２０Ps．pseudoalcaligines CBS 473.85リパーゼ６０実施例７前記実施例で試験した酵素の脂質分解活性を、上記Ｂｒ-オリーブ油法を用いて測定した。洗浄温度は３０℃であり、水の硬度は２７゜ＦＨであった。洗浄実験で除去されたＢｒ-オリーブ油のパーセンテージは、以下の通りであった：脂質分解酵素よごれ除去（％）リポラーゼ（TM、Novo Nordisk社）０Fusarium solani pisi クチナーゼ（実施例２）１９Candida cylindracea リパーゼ（Sigma社）０Chromobacleriumu viscosum リパーゼ（Sigma）１．６ブタ膵臓リパーゼ（Sigma社）１０ Genencorリパーゼ（Pseudomonas putida ATCC 53552の亜種）１１ AKGリパーゼ30B（Amano社）１０ SDL 195リパーゼ（Showa Denko社）２０Ps．pseudoalcaligines CBS 473.85リパーゼ１５実施例６で得られたデータ（ＤＦＰと共にインキュベーションした後の残存活性）とこの実施例で得られたデータとを、線形回帰分析の方法により互いに関係づけた。図１１に、この相関関係のグラフ図を示す。この図で、所定の脂質分解酵素の残存活性パーセンテージと洗浄性能との間に良好な相関関係があることがわかる。従って、実施例６によるＤＦＰとのインキュベーション後の残存活性パーセンテージを、いずれの起源の脂質分解酵素の洗浄中の性能の簡単な予測試験として用いることができると結論する。実施例８ Fusarium solani pisi クチナーゼとリポラーゼ（ＴＭ）との脂質分解活性の比較実施例２により単離したFusarium solani pisi由来のクチナーゼの脂質分解活性を、Novo Nordisk社A/Sから市販されているリポラーゼ（ＴＭ）、即ちHumicol a lanuginosa リパーゼの脂質分解活性と比較した。綿織物および綿編み物でできた試験クロスに純粋なオリーブ油でよごれをつけた。各試験クロスを、次いで、１００ｍｌのポリスチレン瓶に入った３０ｍｌの洗浄液中でインキュベートした。瓶を、水をはったMiele TMT洗濯機内で通常の３０℃の主洗浄プログラムを用いて撹拌した。洗濯液は、以下の組成（重量％）：非イオン性界面活性剤C₁₂−C₁₅ アルコール10.5-13EO 9.5 硫酸ナトリウム 38.6 炭酸ナトリウム 40.4 ケイ酸ナトリウム（Na₂O:Si₂O＝2.4） 7.3 水 4.2 を有する洗剤粉末２ｇに対し水（６゜ＦＨ）１Ｌから成る。第１回の洗浄後、室温でタンブルドライヤー内で試験クロスを乾燥した後、残存脂肪を直ちに定量した。試験クロスは、ソックスレーの装置内で石油エーテルで抽出した。次に、脂肪物質の量を、重量を計ることにより決定し、クロス上の脂肪パーセンテージとして表した。結果を図１２に示す。この図から、リポラーゼ（ＴＭ）は、オリーブ油の除去において対照に対しなんら改良が見られないことがわかるが、一方、寄与を示す実験においては僅かに負であったが、これは顕著なものではないと考えられる。他方、クチナーゼは、明瞭な洗浄中の効果を示す。実施例９異なる型の汚れに対するFusarium solani pisiクチナーゼとリポラーゼ（ＴＭ）の１回洗浄の効果綿製の試験クロスに落花生油、オレイン酸オレイルおよびこれら２種の脂肪の５０／５０の混合物で汚れをつけた。洗剤粉末および洗濯条件は、実施例８と同じであった。１回洗浄後の洗浄効果を、４６０ｎｍにおける反射率を測定することにより評価した。結果を図１３に示す。この図から、クチナーゼを含有する洗剤組成物のいくつかの型の油汚れに対する洗浄効果が、リポラーゼ（ＴＭ）を含有する組成物のそれに比し一貫して良好であることが分かる。その効果は、純粋な落花生油について最もはっきりしている。実施例１０各洗浄サイクル後に測定した、多数の酵素レベルにおけるFusarium solani pisi クチナーゼとリポラーゼ（ＴＭ）の効果試験クロスにＬＳ-３で汚れをつけ、実施例９を実質的に繰り返した。これは、７５ｇの落花生油、４０ｇの乳化剤、１２５ｇのＡＳ-８および１２５ｇのミルク粉末のエマルジョンである。第１回洗浄後、試験クロスに再度よごれをつけ、再度洗浄した。これを計４回繰り返した。クチナーゼおよびリポラーゼ（ＴＭ）の効果を洗浄液１ｍｌ当り１、３、５および１０ＬＵの酵素水準で、各洗浄サイクル後に測定した。結果を図１４Ａ-Ｄに示す。これらの実験からいくつかの結論を引き出すことができる。クチナーゼは、全ての酵素水準で顕著な１回洗浄の効果を示すのに対し、リポラーゼ（ＴＭ）は、最も高い水準の１０ＬＵ／ｍｌで１回洗浄の小さい効果のみを示すことが明瞭である。第１回洗浄後のリポラーゼ（ＴＭ）に対するクチナーゼの有利性は、全４回の洗浄サイクルに対して維持されている。実施例１１ Fusarium solani pisi クチナーゼ、Pseudomonas gladioli由来のリパーゼおよびリポラーゼ（ＴＭ）の効果６７％ポリエステルおよび３３％綿の試験クロスを、下記に示した洗剤製品を５ｇ／Ｌで用いてのり抜きし、充分すすいだ。７．５ｃｍ×７．５ｃｍ片に切断し、固定した。このような汚れていないクロス１０枚（全量約６．５ｇ）を、下記に示した洗剤製品を１Ｌ当り５ｇの量で含む７５ｍｌの洗浄液６゜ＦＨ中で洗浄した。Pseudomonas gladioli由来のリパーゼ、リポラーゼまたはFusarium sol ani pisi クチナーゼを、１ＬＵ／ｍｌで洗浄液に予備添加した。Pseudomonas gl adioli 由来のリパーゼは、ＥＰ-Ａ-２０５２０８およびＥＰ-Ａ-２０６３９０（両方ともユニリバー社）に記載の通りにして得た。洗浄液とクロスを小瓶に入れ、これを、Lavamat AEG洗濯機内で３０℃で３０分間撹拌した。洗剤粉末は、以下の組成（重量％）を有した：ココ-一級アルキル硫酸塩 5.2 非イオン性界面活性剤C₁₃-C₁₅アルコール7EO 5.2 非イオン性界面活性剤C₁₃-C₁₅アルコール3EO 6.6 ゼオライト４Ａ 32.00 炭酸ナトリウム 11.52 ケイ酸ナトリウム 0.45 硬化牛脂石鹸 2.00 初めのｐＨは、いずれの場合も約１０であった。洗浄の最後に、クロスをかたく絞り３００ｍｌの水道水で約３０秒すすいだ。これを３回繰り返した。次いで、クロスをもう１回かたく絞り、周囲条件下でライン干しした。乾燥クロスの半分にオリーブ油でよごれをつけ、３日間放置した。初めにクロスの約５重量％であった油よごれの量を、重量を計ることにより定量した。結果を図１５に示す。リポラーゼ（ＴＭ）が１回洗浄後の油よごれの除去に寄与していないことは明瞭である。リポラーゼ（ＴＭ）の効果は、繰り返し洗浄後にのみ現れる。P．gla dioli リパーゼは、第１回洗浄後小さいが明らかな洗浄効果を、その後の洗浄サイクルで明らかな違いを示す。クチナーゼは、既に第１回洗浄サイクルから既に油よごれ除去に寄与しており、この恩恵は、その後のサイクルを通じて維持される。実施例１２ Fusarium solani pisi クチナーゼ、Pseudomonas gladioli由来のリパーゼおよびリポラーゼ（ＴＭ）の効果以下の洗剤製品を５ｇ／Ｌの濃度で用い実施例１１を繰り返した：ココ-一級アルキル硫酸塩 1.7 非イオン性界面活性剤C₁₂-C₁₅アルコール7EO 6.8 非イオン性界面活性剤C₁₂-C₁₅アルコール3EO 8.5 ゼオライトMAP1） 32.00 炭酸ナトリウム 11.52 ケイ酸ナトリウム 0.45 硬化牛脂石鹸 2.00 1）ゼオライトMAPは、“最大アルミニウムゼオライトＰ”を表し、これは、ゼオライトの型であり、ＥＰ-Ａ-３８４０７０（ユニリバー社）に詳細に記載されている。結果を図１６に示す。両方のリパーゼとも、第１回洗浄後またはその後のサイクル後のいずれの油よごれ除去に寄与しないということになる。しかしながら、クチナーゼは、既に第１回洗浄サイクル後洗浄における大きな効果を示している。実施例１３ Fusarium solani pisi クチナーゼ、Pseudomonas gladioli由来のリパーゼおよびリポラーゼ（ＴＭ）の効果。各洗浄サイクルの間に再度汚れをつけたことを除いては、実施例１２を繰り返した。結果を図１７に示す。第２回洗浄サイクル後、リポラーゼ（ＴＭ）およびP．gladioli のリパーゼに僅かな有益性が観察された。クチナーゼは、既に１回洗浄において油よごれの量を最小限に減らしている。その後の洗浄サイクルは、再度よごれをつけた後でさえ油よごれの更なる減少に帰する。Detailed Description of the InventionEnzyme detergent composition Technical field The present invention relates generally to the field of enzymatic detergents and cleaning compositions. Especially Ming relates to an enzymatic detergent composition comprising an enzyme having lipolytic activity.Background and prior art Various enzymes are known as additives for detergent compositions. For example, protease Washing, containing cellulase, amylase, lipase and various combinations thereof. Agent compositions are described in the literature, some such products are commercially available . The present invention relates to detergent compositions containing lipolytic enzymes or lipases. That's it Such enzymes are based on the hydrolysis of one or more ester bonds in triglycerides. Contributes to removing oil stains from textiles. EP-A-214761 (Novo Nordisk)PseudomonascepaciaSeed microorganisms Discloses a lipase obtained from EP-A-258068 (Novo Nordisk ) IsThermomyces(Below The previous name isHumicola) Disclosed are lipases obtained from microorganisms of the genus. Also, Both of the two patent applications also describe the use of these lipases as detergent additives. It is listed. Further examples of lipase-containing detergent compositions are EP-A-205208 and EP. -A-206390 (both Unilever), which describes immunology Disclosed is a group of lipases defined on the basis of physical relationships, detergent compositions and textile fabrics , Their use in laundry. The preferred lipase isPseudomona s fluorescens ,Pseudomonas gladioliandChromobacterIs of seed origin . EP-A-331376 (Amano) is a lipase, their use and recombination Describes production by DNA (rDNA) technology,Pseudomonas cepaciaOrigin The amino acid sequence of the lipase is described. In addition, produced by rDNA technology Examples of lipase enzymes that can be used are WO-A-89 / 09263 and EP-A-218. 272 (both Gist-Brocades). Despite the extensive literature on lipase enzymes and their improvements, Up toHumicola lanuginosaDerived fromAspergillus oryzaeAs a host Only Lipase Produced From It Has Widespread Use as an Additive for Textile Laundry Products Has been It The enzyme is available from Novo-Nordisk under the trademark Lipolase®. Henrik Malmos is a reference in Chemistry and Industry 1990, pages 183-186. It is generally known that the activity of lipase during the washing process is low. (Mark) is not an exception. When the water content of the fiber becomes low during the dehydration process , The enzyme regains its activity and the oil stains are hydrolyzed. During the subsequent wash cycle , The hydrolyzed material is removed. In addition, the effect of lipase is the first washing size. This also explains why it is low after the clew and is effective in the next cycle. This These findings are summarized in Aaslyng et al., J. Chem. Tech. Biotechnol.50, 321-330 (199 1), "Mechanistic study of protease and lipase in detergent industry" Has been described. We have touched existing detergent products that contain lipolytic enzymes yet Expected useful benefits of lipolytic enzymes when used to wash untextured textiles What he cannot do is regarded as a drawback of the detergent product. In addition, in Europe and the United States, tumble dryers are used by users of automatic washing machines. There is an increasing tendency to dry laundry. These machines use a damp cloth with hot air. Suddenly by touching Dry quickly. Normally, a drying process that takes 6 to 48 hours at room temperature is performed by a rotary dryer. Can be shortened to less than 1 hour. As mentioned above, Pase enzyme takes its activity when the water content of the textile product becomes low during the dehydration process. return. The time to have the optimum moisture for lipase when using a tumble dryer Is quite short. As a result, even if the normal lipase enzyme is present in detergent products, spin If the product is used in a washing process, including a dryer drying process, there are not many advantages. Absent. Therefore, an object of the present invention is to reduce fat during the main cycle of the washing process in an automatic washing machine. Washing textiles that show significant degrading activity, so that they have not yet been exposed to detergent products It is intended to provide an enzyme detergent composition which exhibits lipolytic activity when used for. Well Also, an object of the present invention is to provide an enzyme wash that is particularly suitable for use in combination with a rotary dryer. To provide an agent composition. Furthermore, the object of the present invention is to reduce the fat during the main cycle of the washing process in an automatic washing machine. An object of the present invention is to provide a method for producing an enzyme that exhibits significant degrading activity. The present inventors have surprisingly found that the lipolytic activity is increased during the main cycle of the washing process. The existence of lipolytic enzymes that can be used to formulate meaningful detergent compositions Found. In addition, washing The ability to exhibit such lipolytic activity and fluorophosphoric acid during the main cycle of the process Good correlation with inactivation behavior by diisopropyl (DFP) I found that. That is, the appropriate lipolytic enzyme normally binds to their DFP. Can be selected based on the deactivation behavior by In particular, eukaryotic origin Enzymes are suitable for exhibiting such lipolytic effects during the main cycle of the washing process. It was found to be a painful enzyme. WO-A-88 / 09367 (Genencor) formulates effective cleaning compositions. For the combination of a detergent with a fairly pure microbial cutinase enzyme It suggests. (Of prokaryotes)Pseudomonas putida ATCC 53552? A detergent composition containing cutinase obtained from the above is disclosed. But more recent Europe Patent application EP-A-476915 (Clorox) describes the same enzyme (hereinafter lipase To tell. ) Is used in the usual way, it is not It is disclosed that it is not as effective as pase. In other words, this Enzymes are not expected to be effective during washing. WO-A-9- / 09446 (Plant Genetics Systems)Fusarium solan i pisi Describing the cloning and production in E. coli of the eukaryotic cutinase from which it was derived. And especially this cutiner When used, cleaning agents such as laundry detergents as well as cosmetic compositions and shampoos It is mentioned that other particular lipolytic agents such as can be formulated. But, No specific enzyme detergent composition is disclosed or suggested, so a detergent composition for textile laundry is formulated. The motivation for choosing this particular enzyme to Yes.Definition of invention According to the first aspect of the present invention, (a) (a1) 0 to 95% by weight of one or more shades. Ionic surfactant and (a2) 5-100% by weight of one or more nonionic fields. 0.1 to 50% by weight of an active agent system containing a surface active agent and (b) 1 g of a detergent composition 10-20,000 LU, substantial lipolysis during the main cycle of the washing process Provided is an enzymatic detergent composition comprising an enzyme capable of exhibiting activity. According to the second aspect of the present invention, during the main cycle of the washing process in the automatic washing machine, Diisopropyl fluorophosphate (DEP) was used as an enzyme showing substantial lipolytic activity. To provide confirmation and selection based on its inactivation behavior by According to yet another invention of the present invention, a method for producing such an enzyme is provided.Description of the invention (A) Surfactant system One of the present inventions is 0-95% by weight of one or more anionic surfactants and 5 0.1 to 5% by weight of an activator system containing one or more nonionic surfactants. An enzyme detergent composition containing 0% by weight is provided. Surfactant systems can also be amphoteric or bifunctional. Although it may include zwitterionic detergent compounds, they are usually Is not preferable. Generally, nonionic and anionic surface active systems are referred to as “Surface Active Age”. nts ”Vol. 1, Schwartz & Perry, Interscience 1949, Vol. 2, Schwartz, Pe rry & Berch, Interscience 1958, “McCutcheon's Emulsifiers and Deterge Published by nts ”Manufacturing Confectioners Company or“ Tenside-Taschenbuch , H. Stache, 2nd Edn., Carl Hauser Verlag, 1981 You can choose from. Suitable nonionic detergent compounds which can be used include, in particular, compounds having a hydrophobic group. Reaction product of a compound with a compound having a reactive hydrogen atom, for example, an aliphatic alcohol , Acids, amides or alkylphenols and alkylene oxides (especially ethylene oxide). Kide alone A reaction product with itself or in combination with propylene oxide). Specific non-a On-type detergent compounds are C₆~ C_{twenty two}Alkylphenol-ethylene oxide condensate (Generally 5-25 EO, ie 5-25 units of ethyleneoxy per molecule. And linear or branched primary or secondary aliphatic C₈~ C₁₈A It is a condensation product of rucor and ethylene oxide (generally 5 to 40 EO). Suitable anionic detergent compounds that can be used typically have from about 8 to about 22 carbon atoms. Of organic sulfates and sulfonates containing alkyl radicals containing It is a water-soluble alkali metal salt, and alkyl is the alkyl part of the higher acyl radical. Shall be included. An example of a suitable synthetic anionic detergent compound is the sodium alkylsulfate. Higher C made from, for example, thallium and potassium, especially animal oil or coconut oil₈ ~ C₁₈Alkyl C, obtained by converting alcohol to sulfuric ester₉ ~ C₂₀Sodium and potassium benzene sulfonate, especially linear secondary alkyl C_Ten ~ C_FifteenSodium benzene sulfonate; and alkyl glyceryl ether sulfur Sodium acid, especially higher alcohols and stones derived from tallow or coconut oil It is an ether of a synthetic alcohol obtained from oil. Preferred anionic detergent compound Thing C₁₁~ C_FifteenSodium alkylbenzene sulfonate and C₁₂~ C₁₈Alkyl sulfur Sodium acid. In addition, it has resistance to salting out described in EP-A-328177 (Unilever). , A surfactant having the formula: alkyl polyglycoside boundaries described in EP-A-070074. Surfactants and alkyl monoglycosides are also applicable. A preferred surfactant system is a mixture of anionic and nonionic detergent actives. And especially the anionic and ionic properties shown in EP-A-346995 (Unilever). And groups of nonionic surfactants and examples. Particularly preferred is C₁₆ ~ C₁₈Alkali metal salts of sulfuric acid esters of primary alcohols and C₁₂~ C_FifteenFirst Arco Is a surfactant system which is a mixture of 3 to 7 EO ethoxylates. The nonionic detergent is preferably in an amount greater than 10% by weight of the surfactant system, eg For example, it is present in an amount of 25 to 90% by weight. Anionic surfactants include, for example, interfacial It can be present in an amount of about 5 to about 40% by weight of the activator system. (B) enzyme The enzyme detergent composition of the present invention further comprises 10 to 20,000 per gram of detergent composition. 0 LU, preferably 50-2,000 LU, Enzymes capable of exhibiting substantial lipolytic activity during the main cycle of the washing process Including. As used herein, LU, or lipase unit, is referred to as EP-A-258068 ( Novo Nordisk). Substantial lipolytic activity during the main cycle of the washing process, ie the effect during washing Is a detergent composition containing an enzyme in a European-type automatic washing machine. Using normal washing conditions, from soiled textiles in one washing step This means that a significant amount of greasy dirt can be removed. Under the same conditions, The usual commercially available lipolytic enzyme Lipolase (registered trademark) (Novo Nordisk) It should be noted that it does not seem to have a significant washing effect on oil stains is there. The effect of enzymes on oil stains during laundering can be evaluated using the following measurement method: it can. A new polyester / cotton test cloth containing 33% cotton Pre-wash with a base-free detergent product, then rinse thoroughly. Then Clean the test cloth with a stain of olive oil or other suitable hydrolyzable oil. wear. Each test cloth (about 1 g) was placed in a 100 ml polystyrene bottle 3 Incubate in 0 ml of wash liquor. Washing liquid is 1g per liter Detergent products shown in Including. Place the bottle in a Miele TMT washing machine filled with water in a standard 30 ° C wash. Shake for 30 minutes using the laundry program. An enzyme with lipolytic activity Pre-add to wash liquor at 3 LU / ml. Controls contain no enzyme. Washing powder Has the following composition (% by weight). Ethoxylated alcohol nonionic surfactant 9.5 Sodium sulfate 38.6 Sodium carbonate 40.4 Sodium silicate (Na₂O: Si₂O = 2.4) 7.3 Water 4.2 C as a nonionic surfactant₁₂~ C_FifteenEthoxylated alcohol 10.5-1 3EO was used, but there are a wide variety of ethoxylated alcohol nonionic surfactants. It has been found that it can change within a certain range. After washing, rinse the cloth thoroughly with cold water and dry it with cold air in a rotary dryer to remove residual oil. Evaluate the amount of fat. This can be done in several ways. General method Extract the test cloth with a Soxhlet extractor with petroleum ether and remove the solvent , The ratio (%) of the residual fat substance to the initial fat amount of the test cloth was determined by weighing. Is Rukoto. According to the second and more sensitive method, test cloth using brominated olive oil Stains (Richards, S., Morris, MA and Arklay, TH (1968), Text ile Research Journal,38, 105-107). Then add 100 ml of each test cloth Incubate in 30 ml of wash liquor in a polystyrene bottle. Then , A series of bottles, in a washing machine filled with water, the usual 30 ° C main washing program Use to rock. After the main wash, carefully test the test cloth in cold water for 5 seconds. soon. Immediately after rinsing, the test cloth is dried in a dryer with cold air. Residue after drying The amount of fat can be determined by measuring the bromine content of the cloth by X-ray fluorescence spectroscopy. You can The fat removal rate is the ratio (%) to the amount originally present in the test cloth. Then, it can be calculated as follows. [In the formula, bromine_bwIndicates the percentage of bromine on the cloth before washing,_awIs the proportion of bromine after washing Indicates the result. ] Yet another method for evaluating enzyme activity is to measure reflectance at 460 nm according to a standard method. By doing. The detergent composition according to the present invention has the measurement method described herein, Less than the same detergent composition without enzymes, based on the amount of initial oil stain Enzymes capable of removing oil stains by as much as 5%, preferably at least 10% including. Another way to define enzyme activity is with the commercially available Lipolase® (Novo / Nordis lipase produced by k). According to the present invention, Removal of oil stains by the enzyme and oil stains by Lipolase (registered trademark) according to the described measurement method. The removal to removal ratio is at least 3, preferably at least 5. Enzyme stain Removal is due to soil removal due to the presence of the enzyme, i.e. in the absence of the enzyme. It means the background of which the removal of dirt that has been removed is subtracted as a background. As disclosed, according to the present invention, a detergent composition having a substantially laundering effect Can be formulated and the selection of an enzyme suitable for use in the present invention is within the skill of the art. It will be obvious. However, we have found that a suitable lipolytic fermentation for the composition of the invention. We have found a very convenient way to select a prime. The method of lipolytic enzyme The effect during washing of those enzymes by diisopropyl fluorophosphate (DFP) This is based on the findings of the present inventors that it is closely related to inactivation behavior. one Generally, this compound easily reacts with the serine residue which is the active site of lipolytic enzyme, That As a result, it is known to deprive the enzyme activity of the enzyme. We use DFP Lipolytic enzymes that are more easily inactivated, that is, serine residues in the accessible active site It has been found that enzymes with groups have generally shown good laundering effects. On the other hand, Lipolytic enzymes that are slowly inactivated by DFP, ie, inaccessible activities Enzymes with a serine residue at the site generally show no or no effect during laundering. Very few fruits. Remains after 10 minutes incubation with DFP at room temperature, pH 10 Lipolytic enzymes with a retention activity of less than 50%, preferably less than 40%, are suitable for good washing. It has been found to have a medium effect. Lipolytic enzyme with residual activity less than 25% Is a lipolytic enzyme with a better effect during washing and a residual activity of less than 15% Was found to be the best. Details of the measurement of DPF-inactivation are given in the examples. Enter. The enzyme suitable for the composition of the present invention is an enzyme group of esterase and lipase (EC3 ． 1.1. *; * Indicates some number. ) Can be found in. A highly preferred type of enzyme that exhibits an effect during laundering according to the present invention is from a eukaryote. Cutinase. Cutinase is a subclass of the enzyme (EC 3.1.1.50). Wax ester hydrolase. These enzymes are in leaves and stems Protective film Is a layer of esterified long-chain fatty acids and fatty alcohols present in plants as It can break down chin. In addition, those enzymes have some lipolytic activity. It has properties and can also hydrolyze triglycerides. That is, the special lip Can be regarded as A characteristic of lipases is that they exhibit surface activation. This is the enzymatic activity Is higher than that of the interface or micelle-formed substrate than the completely dissolved substrate. Means no. The interfacial activation depends on the critical micelle concentration (CMC) of the substrate concentration. This is shown by a sudden increase in lipolytic activity when the interface is raised above the above. It This phenomenon was experimentally recognized as a discontinuity in the graph of enzyme activity versus substrate concentration. Can be However, cutinases, as opposed to lipases, have a substantial interface. Does not show activation. In the present invention, cutinase is It is defined as a lipolytic enzyme showing substantially no surface activation. Therefore, cutiner Ze is a traditional lipase in that it has no helical lid covering the catalytic binding site. Is different from. Due to its lipolytic properties, cutinase is generally a component of enzyme detergent compositions. Proposed. For example, WO-A-88 / 09367 (Genencor) is effective. To prescribe a cleansing composition To this end, a combination of a surfactant and a substantially pure microbial cutinase was used. Suggests that. Disclosed is a Gram-negative bacteriumPseudomonas putlida Detergent composition containing (prokaryotic) cutinase obtained from ATCC 53552 Is. However, as mentioned above, the more recent European patent application EP-A-4769. The same enzyme (hereinafter referred to as lipase) was used for 15 (Clorox) by the usual method. It is then less effective than other lipases in removing greasy stains on textiles. It has been disclosed. Fusarium solani pisiThe cutinase gene obtained from (Ettinger et al., (1987) Biochemistry,26, 7883-7892). WO-A-90 / 09446 (Plant Genetics Systems) is the colon of this gene. Cloning and production in fungi are described. Cutinases are aqueous and non-aqueous In the medium, in the absence and presence of the interface between cutinase and substrate, the ester Hydrolysis and synthesis can be efficiently catalyzed. This cutinase Based on overall stability, detergents such as laundry detergents and cosmetic compositions and Thought to be used in the manufacture of certain other lipolytic agents such as shampoos Be done. However, no viable and economical method for producing the enzyme is disclosed. And its special cutinase No specific enzyme detergent composition is disclosed. Cutinases are derived from many sources including plants (eg pollen), bacteria and fungi. Can be The cutinase which can be used in the present invention is a cutinase derived from eukaryote. Selected from the group. Cutinase from such eukaryotes is used in plants (eg, flowers Flour) or fungi. Cutinases from fungi (of eukaryotes) have different specificities, namely leaf-specific It is thought to include two groups with sex and stem specificity. Leaf specificity Tinases tend to have optimal pH in acid or neutral but have stem specificity Cutinases tend to have an optimum pH for alkaline. Optimum pH for alkaline With cutinase is an alkaline binder such as laundry powders and liquids for heavy textiles. More suitable for use in ruder detergent compositions. Acidic to neutral pH optimum Tinase is more suitable for light products or rinse conditioners, but is suitable for industrial cleaning. Also suitable for purified products. Table I below lists the four stem-specific cutinases, along with their optimum pH. . Table I Examples of cutinase with stem specificity Optimum pH Fusarium solani pisi 9 Fusarium roseum culmorum 10 Rhizoctonia solani 8.5 Alternaria brassicicola (PNBase I) 9 Wild type is particularly preferred in the present invention.Fusarium solani pisi(Ettinger et al. , 1987). This cutinase is suitable for detergent composition When used, it clearly exhibits an "in-the-wash" effect. Further, in the present invention,Fusarium solani pisiOf cutinase and amino acid sequence Cutinase having high homology is also preferable. For example,Colletotrichum capsici,Co lletotrichum gloeosporiodes andMagnaporthe griseaThe cutinase derived from You can Not suitable for the present invention is described in EP-A-305216 (Novo Nordisk).Hu micola lanuginosa It is a lipase. This is marketed as Lipolase® Has been done. However, this enzyme does not absorb substantial fat during the main cycle of the washing process. It is believed that it can be modified with rDNA technology to exhibit deactivation. Such modifications affect the structure of lipase enzymes. Therefore, the conformation of the enzyme To find the balance between the inevitable distortion of That experiment is necessary. In general, it does not significantly affect the charge around the active site. Modification is preferred. The lipolytic enzyme of the present invention is usefully added to detergent compositions in any suitable form. be able to. That is, the enzyme or carrier material in the form of granular composition, slurry Quality (as described in EP-A-258068 and Savina of Novo Nordisk products) se (registered trademark) and Lipolase (registered trademark)) can be added together. A good method of adding enzymes to liquid detergent products is EP-A-450702 (Unilev er) and ethoxylated alcohol nonionic surfactants as described above. It is carried out in the form of a slurry containing 5 to 50% by weight of enzyme. The enzyme used in the detergent composition of the present invention is a gene produced by converting the enzyme gene into an appropriate producing organism (eg, For exampleBacilliOrPseudomonaceae), Yeast (eg,Saccharomyces,Kluyvero myces ,HansenulaOrPichia) Or fungi (AspargillusEtc.) It can be produced by Microorganisms that produce natural cutinase are usually plant pathogens. Yes, these microorganisms are less likely to act as a host cell for the cutinase gene. Not suitable. Therefore, the gene encoding the (pro) cutinase was transferred to rDNA technology. It was incorporated into an rDNA vector that can be transferred to a preferred host microorganism. This eye For the purpose, it is essentially the same as the rDNA vector described in WO-A-90 / 09446. The same rDNA vector can be used for. In order to improve the yield of the fermentation process, the gene encoding cutinase was Transfer to microorganisms that can grow rapidly in the medium and synthesize and secrete large amounts of enzymes Should be. Suitable rDNAs (host microorganisms) modified according to the invention are bacteria Among other thingsBacilli,Corynebacteria,StaphylococciandStreptomyces, OrSaccharomyces cerevisiae And related species,Kluvveromyces marxianusAnd related seed,Hansenula polymorphaAnd related species, andAspergillusGenuine lower truth It is a nuclear organism. The preferred host microorganism is a lower eukaryote. Because these Microorganisms produce and secrete the enzyme very well in the fermentation process and dissolve the cutinase molecule. This is because it can be sugar. Glycosylation stabilizes cutinase in detergent systems Contribute to sex. The present invention also relates to cutinase genes from eukaryotes, such asFusarium solani pi si Genes derived from cloning rDNA The genetic material obtained by introducing it into the vector, transformation of new host cells, And their inheritance for directing expression of the cutinase gene in its new host cell Provide use of the substance. The present invention also provides a coding for the cutinase produced or modified by rDNA technology. And a rDNA vector containing the polynucleotide and the polynucleotide RDNA modified microorganism containing polynucleotide and / or said rDNA vector Also disclosed. The present invention also provides a corresponding polynucleotide encoding a cutinase of eukaryotic origin. A nucleotide having a nucleotide sequence encoding a mature cutinase, for example Offer ochido. In that polynucleotide, after the last translated codon Followed by a stop codon and optionally a nucleotide sequence encoding the mature cutinase Immediately upstream is a nucleoside encoding the prepro- or pro-sequence of this cutinase. It has a tide sequence. Such polynucleotides include a biologically-derived nucleotide encoding a cutinase. The otide sequence has been modified to include at least one codon, and preferably as many codons as possible. A code encoding the equivalent amino acid residue by inducing a "silent" mutation of Don. Stability and by making it the preferred host codon Messenger RNA for improved transgenes Can be used in the cells of the host. Upstream of the nucleotide sequence encoding the pro- or mature cutinase is a selection The nucleotide sequence encoding the signal or secretory sequence appropriate for the host Can be made. That is, one aspect of the present invention is a cutinase or a precursor thereof. It relates to an rDNA vector into which a nucleotide sequence coding for the body has been inserted. The nucleotide sequence can be derived, for example, from: (A) a natural nucleotide sequence (eg,Fusarium solanipisiProduced by Sequence encoding the first amino acid sequence of a propre- or pro-cutinase); (B) Codon preferred by new host and stable messenger in the new host It consists of a nucleotide sequence that forms a jar RNA, and the first amino acid sequence is Chemically synthesized nucleotide sequence (C)Fusarium solani pisiThe coding described in a and b above, which encodes cutinase. Derived from one of the cleotide sequences and differing in amino acid sequence, but stable in detergent systems A nucleotide sequence that has been genetically engineered to have excellent activity and / or activity. Row. In summary, the nucleotide encoding the cutinase gene described above A rDNA vector capable of expressing the otide sequence in one of the preferred hosts is Contains the following elements: (A) mature cutinase or precutinase or (depending on the selected host cell Immediately downstream of the secretion signal, at least part of the presequence is removed Double-stranded (ds) DNA encoding the corresponding plectinase. Genetics to translate If the offspring does not start with an ATG codon, it should be preceded by an ATG codon. is there. The translated part of the gene should always end with an appropriate stop codon; (B) Located upstream of the + strand of dsDNA encoding cutinase (selected accommodation An expression regulon (suitable for the main microorganism) (element (a)); (C) is located downstream of the + strand of dsDNA encoding cutinase (selected accommodation A terminator sequence (suitable for the main microorganism) (element (a)); (D1) Nucleotides that facilitate integration of dsDNA into the genome of a selected host Array or; (D2) an origin of replication suitable for the selected host; (E1) A (auxotrophy) selectable marker, if desired. Auxotrophy marker Requirement marker coding region and defect marker Can consist of a romota; (E2) If desired, maturation of one of the precursor forms of cutinase in one selected host and And / or dsDNA sequences encoding proteins involved in secretion. Such a rDNA vector also contains an upstream of the polynucleotide defined above. And / or downstream with another sequence that facilitates functional expression of cutinase Can be. An auxotrophic marker includes coding regions and defects in the auxotrophic marker. It can consist of a promoter region. The present invention also provides a method for producing a lipolytic enzyme capable of exhibiting effects during washing. To do. The method involves rDNA encoding a lipolytic enzyme that has a laundering effect. Fermentation culture of an artificially modified microorganism containing a gene produced by the technique, Separate the enzyme produced by the microorganism from the fermentation medium or ferment the microbial cells. The steps of preparing the enzyme by separating it from the base, and the step of disrupting the separated cells. And enzymes from the culture medium or the cells by physical or chemical concentration or purification methods. It includes a step of concentration or partial purification. The fermentation is a normal batch-type fermentation, supply- Either batch-type fermentation or continuous fermentation may be used. The choice of method to use depends on the host Strain and preferred downstream treatment method (known per se) Depends on. Preferred conditions are that the enzyme is secreted by the microorganism into the fermentation medium, After removal of cells, select to recover from the culture medium either by filtration or centrifugation. Choose. The enzyme can then be optionally concentrated and purified to the desired degree. it can. Apart from the specific properties of the microorganisms, the fermentation method itself is a known fermentation method as well as a conventional fermentation method. Fermentation and downstream processing equipment. In another invention of the present invention, the inheritance of an enzyme having lipolytic activity as defined herein. Artificially, including offspring, capable of producing the enzyme encoded by the gene Provide a modified microorganism. The present invention further comprises a lipolytic enzyme having the active in laundry as described herein. Provided is a recombinant DNA vector having an encoding nucleotide sequence. (C) Other ingredients The enzyme detergent composition of the present invention further comprises 5 to 60% by weight, preferably 20 to 50% by weight. Amounts of detergent builder may be included. This detergent builder is a free It may contain substances capable of lowering calcium ion levels and is preferred. By the way, Generation of alkaline pH, suspension of dirt removed from textiles and textile softening clay Compositions having other advantages such as suspension of substances are provided. Examples of detergent builders include alkali metal carbonates, bicarbonates, orthophosphoric acid. Sedimentation builder such as salt, alkali metal tripolyphosphate or nitrilotri Metal ion sequestration builder such as acetate, or amorphous metal aluminium Included are ion exchange builders such as formates or zeolites. The detergent composition of the present invention reduces the free calcium concentration to 1 mM or less. The inclusion of builder substances has been found to be particularly preferred for their lipolytic activity. It was The enzyme detergent compositions of the present invention, in another aspect, are also commonly used in enzyme and detergent systems. Can be combined with other components (eg, additives for detergent compositions) that are Wear. Such other ingredients may be of any of the many known types, such as GB -A-1372034 (Unilever), US-A-3950277, US-A-4 011169, EP-A-179533 (Procter & Gamble), EP-A-20 5208 and EP-A-206390 (Unilever), JP-A-63-078. 000 (1988) and Research Disclosure 29056 of June 1988 To each of the several specifications mentioned herein. Book The composition of the detergent composition according to the invention is described in Example of EP-A-407225 (Unilever). It can also be described with reference to D1 to D14. Detergent compositions in which proteolytic enzymes (proteases) are also present have special benefits. You get points. EP-A-271154 (Unilever) has a pI of 10 or less. A number of suitable proteases have been described. For use with lipase As a Rotease, under certain circumstances, for example, BPN-type subtilisin or sentence There are many types of subtilisin disclosed in the Tribunal, some of which are It has already been proposed as a use, for example, EP-A-130756 or EP. -A-51446 (both Genentech), US-A-4760025 (Genenco r), EP-A-214435 (Henkel), WO-A-87 / 04661 (Amgen). ), WO-A-87 / 05050 (Genex), Thomas et al. (1986), NatureFive 316 andFive, 375-37, and J. Mol. Biol. (1987) 193, 803-813, Russe The mutant protease described in l et al (1987) in Nature 328, 496-500, etc. Can be mentioned. The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. Attached drawings Is:Figure 1A Synthetic Fusarium solanipisi (Fusarium solani pisi) Cutinase gene and structure Nucleotide sequence of cassette 1 of the synthetic oligonucleotide. Oligonucleotide Rangitions are indicated within the cassette sequence. Lowercase letters are placed outside the transcription frame Indicates a nucleotide.Figure 1B SynthesisFusarium solani pisiThe cutinase gene and constituent oligonucleotides Nucleotide sequence of set 2. Oligonucleotide transition, cassette Shown in the array.Figure 1C SynthesisFusarium solani pisiThe cutinase gene and constituent oligonucleotides Nucleotide sequence of set 3. Oligonucleotide transition, cassette Shown in the array. Lower case letters indicate nucleotides outside the open reading frame.Figure 1D Fusarium solani pisi Synthetic cutinase inheritance encoding pre-pro-cutinase Nucleotide sequence of the offspring. Shows cutinase pre-, pro- and mature sequences . Also, for cloning The sites used and the oligonucleotide transitions are also shown. Lowercase letters are transcription solutions The nucleotides at positions outside the open reading frame are indicated.Figure 2 Fusarium solani pisi The sequence encoding the pro-cutinase was transformed into E. coli (E. coli) Synthetic DNA fragment for ligating to a sequence encoding a derivative of the phoA pre-sequence Nucleotide sequence of. Used for ribosome binding site (RBS) and cloning Indicates the restriction enzyme site. Also encoded phoA signal sequence and cutina The amino acid sequence of a part of the enzyme gene is shown using a single letter code.Figure 3 Nucleotide sequence of cassette 8, namely invertase pre-sequence and maturationFusar ium solani pisi Encodes the fusion point of the sequence encoding cutinaseSacl-B cll fragment.Figure 4 0.2 kbSalI-NruPlasmids obtained by deletion of I from pUR2740 PUR2741 is derived from a part of pBR322, 2 μm plasmid, Origin of replication in yeast cells, yeast leu2D gene, and yeast gal7 promoter Α-galactosidase gene and yeast invertase under the control of Consists of a fusion with the region encoding the signal sequenceE. coli-S. cerevisiaeSha It is a toll vector.FIG. Plasmid pUR7219 is derived from a 2 μm plasmid, part of pBR322. Origin of replication in yeast cells, yeast leu2D gene and yeast gal7 gene Under the control of Romano, matureFusarium solani pisiThe region encoding the cutinase Consists of a fusion with the region encoding the yeast invertase signal sequenceE. coli-S. cerevisiae It is a shuttle vector.Figure 6 Plasmid pUR2740 is derived from a 2 μm plasmid, part of pBR322. Origin of replication in yeast cells, yeast leu2D gene and yeast gal7 gene Plant α-galactosidase gene and yeast invertase under the control of lomotor Consists of a fusion with the region encoding the signal sequenceE, coli-S. cerevisiaeSha It is a toll vector.Figure 7 ex1A pre-sequence and maturationFusarium solani pisiOf the cutinase coding sequence Nucleotide sequences of cassettes 5, 6 and 7, including different types of ligation.Figure 8 of pUC19SalAspergillus niger subspecies awamori in I site (Aspergillu s niger var.awamori) 5.3 kb of genomic DNASa1By inserting the I fragment The resulting plasmid pAW14B.FIG. Consists of the exlA open reading frame within pAW14BBspHI-AflII fragment,F usarium solani pisi Consists of a sequence encoding pre-pro-cutinaseBspH I-AflPlasmid pUR7280 obtained by replacing with the II fragment. Obedience Therefore, the plasmid pUR7280 isA. niger var.awamoriPromoter and And the control of the terminator,Fusarium solanipisiPre-pro-cutinase gene including.FIG. A. nidulans amd S andA. niger var.awamori pU for both pyrG selection markers Plasmid pUR7281 obtained by introducing into R7280.FIG. Residual activity after DFP-inactivation and dirt removal percentage of various lipolytic enzymes The correlation between the two. Use the following abbreviations: Lipolase (TM, Novo Nordisk) lip Fusarium solani pisi cutinase(Example 2) CT Candida cylindraceaLipase (Sigma) Candida Chromobacterium viscosumLipase (Sigma) Chrom Porcine pancreatic lipase (Sigma) Panor Genenco lipase (Pseudomonas putida ATCC 53552 variant) Gen AKG Lipase 30B (Amano) AKG SDL 195 Lipase (Showa Denko) SDL Ps. pseudoalcaligines CBS 473.85 Lipase Ps. Alk12 Fusarium solani pisi Activity of cutinase and lipolase (TM) obtained from comparison.FIG. Against various types of dirtFusarium solani pisiCutinase and lipolase (T Effect of single wash of M).FIG. 14A Was measured after repeated washing a number of times and the enzyme level was measured at 1 LU / ml. KickFIG. 14B In the same manner at an enzyme level of 3 LU / ml,FIG. 14C In the same manner at an enzyme level of 5 LU / ml,Figure 14D In the same manner at an enzyme level of 10 LU / ml,Fusarium solani pisi Effect of cutinase and lipolase (TM) of origin.Figure 15 Lipolase (TM) in PAS / non-ion formulation,Pseudomonas gladioliLipa AndFusarium solani pisiMultiple wash tests with cutinase.FIG. Lipolase (TM) in alternative PAS / nonion formation,Pseudomonas gladioli Lipase andFusarium solani pisiMultiple wash tests with cutinase.FIG. 17 Same as FIG. 16 except that it was recontaminated after each wash cycle. References Example 1 Fusarium solani pisi Construction of synthetic gene encoding pre-pro-cutinase Fusarium solani pisiA synthetic gene encoding pre-pro-cutinase Was constructed by the method described in EP-A-407225 (Unilever). public OpenedFusarium solani pisiNucleotide sequence of gene (Soliday et al. (1984 ) And WO-A-90 / 09446, Plant Genetic Systems Inc.),Fusarium solan i pisi Fully synthetic D consisting of the region encoding the pre-pro-cutinase polypeptide The NA fragment was designed. OriginalFusarium solani pisiRatio of nucleotide sequence of gene In comparison, this synthetic cutinase gene can affect the encoded amino acid sequence. First, some nucleotides with restriction enzyme recognition sites introduced at convenient positions in the gene. Have changes in cleotide. Figure 1 shows the nucleotide sequence of the total synthetic cutinase gene. Shown in D. Construction of synthetic cutinase genes starts with synthetic DNA oligonucleotides This was done by assembling three separate cassettes. Origin of each synthetic DNA cassette ToEcoRI site, at the end pointHindIt has a III site. Oligonucleoti The Applied Biosystems 380A DNA Synthesizer Used to synthesize and purify by polyacrylamide gel electrophoresis. Of each cassette The construction followed the procedure outlined below. Equimolar amount (5 (0 pmol) of the oligonucleotide was mixed, phosphorylated at the 5'-end and And ligated by standard techniques. The resulting mixture of double-stranded DNA molecules CompoundEcoCleaved with RI and HindIII and electrophoresed on agarose gel. The gel was separated by size and recovered from the gel by electroelution. The resulting synthetic DNA The cassette is 2.7 kb of pUC9EcoRI-HinLigue with dIII fragment TheEscherichia coliIntroduced. Suitable for confirming the sequence of synthetic cassette Of multiple clones using various oligonucleotide primersEcoRI-Hin The dIII insert was fully sequenced in both directions. Using this technique, pUR720 7 (including cassette 1, FIG. 1A), pUR7208 (including cassette 2, FIG. 1B) ) And pUR7209 (including cassette 3, FIG. 1C) were constructed. Finally, p UR7207 2.9 kbEcoRI-ApaI fragment and 0.2 of pUR7208 kbApaI-NheI fragment and 0.3 kb of pUR7209NheI-Hin Assembled by combining with the dIII fragment to give pUR7210. This program RasmidFusarium solani pisiof It contains an open reading frame encoding the complete pre-pro-cutinase (FIG. 1D).Example 2 Fusarium solani pisiOf (pro) cutinaseEscherichia coliExpression in Described in WO-A-90 / 09/446 (Plant Genetic Systems) With a synthetic cutinase gene that is functionally similar toE. coliExpression in Constructed a vector for.Fusarium solani pisiCode for pro-cutinase A part of the synthetic geneE. coliExpression signal, ie (i) inducible pro Provide a motor, (ii) ribosome binding site, and (iii) translation initiation codon To provide the information required for the delivery of pro-cutinase to the outside of the cell membrane. A construct was designed that was guided by the signal sequence. Synthetic cutinase gene to pro-sequenceE. coliDerivative of phoA signal sequence (M A synthetic linker for the fusion of ichaelis et al., 1983) was designed (see Figure 2). Sig In order to optimize the cleavage of the null peptide and the secretion of pro-cutinase, this The nucleotide sequence of the linker is the three C-terminal amino acids of the phoA signal sequence. Residue (Thr-Lys-Ala) is Ala-Asn -Ala, the N-terminal amino acid residue of the cutinase pro-sequence (Leu1, Figure 1D) was changed to Ala. This construct is Guarantees the secretion of cutinase (WO-A-90 / 09446, Plant Genetics) See Systems Inc.). In order to obtain such a construct, cutinase pre-sequences and part of the pro-sequences Consisting of 69bp EcoRI-SpeRemove the I fragment from pUR7210,E. coli Derivatives of the phoA pre-sequence and altered N-terminal amino acid of cutinase pro-sequence A synthetic DNA linker sequence (EcoRI-SpeI fragment) (Fig. It was replaced with 2). The resulting plasmid was named pUR7250 and was labeled with Of the prome fused to the coding region of the phoA signal sequence and the chromosomal binding site. 0.7 kb consisting of the region encoding cutinaseBamHI-HindIII disconnection Used to isolate a piece. This fragment was cloned into pMMB67EH (Fursle et al., 1986) at 8.9 k. bBamHI-HinLigation with the dIII fragment gave pUR7220. This Of the synthetic gene encoding pro-cutinase in the plasmid of phoA Fused to a modified version of the sequence and placed under the control of the inducible tac-promoter . has pUR7220E. coliThe strain WK6 was treated with 0.017M KH₂PO K of 0.017M₂HPO 12 g / l Bacto-tryptone 24g / 1 Bacto-Yeast Extract 0.5 L IXTB medium consisting of 0.4% glycerol (v / v) (Tartol and Hobbs, 1988) and grown in a 2 L shaker flask. Cultures were incubated at 25 ° C-30 ° C overnight in the presence of 100 pg / ml ampicillin. Grow violently (150 rpm) until OD reaches 10-12 at 610 nm. Let Then, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) Add 10 μM final concentration and incubate for an additional 12-16 hours. Continued. It is judged by the analysis of the sample collected from the culture, but the production When no further significant increase in the amount of lipolytic activity observed is observed , Cells were harvested by centrifugation and the original culture volume of buffer containing 20% sucrose was reduced to 0. Resuspend at 0 ° C. Collect cells by centrifugation and lyse through osmotic shock It was resuspended in the original culture volume of ice cold water causing Centrifuge the cell debris Cell-free extract Was acidified to pH 4.8 with acetic acid and left overnight at 4 ° C. and the resulting precipitate was removed. I put it out. Cutinase preparation of 75% or more pure substantially free of intracellular lipase Were obtained at this stage by means of ultrafiltration and lyophilization of the cell-free extract. Ah Rutin, cutinase, acidified cell-free extract was applied to SP-Sephadex Elute the enzyme with a pH 8.0 buffer and add an appropriate volume of DEAE-cellulose (wa The concentrated alkaline solution is passed through the Qtman DE-52) to pass the DEAE-passed product through Q- Homogeneous (ie, by applying directly to Sepharose HP (Pharmacia) column) , 95% or more pure). By elution with a salt gradient Homogeneous cutinase preparations were obtained in> 75% of the typical overall yield.Example 3 Fusarium solani pisi CutinaseSaccharomyces cerevisiaeExpression in SynthesisFusarium solani pisiOf the cutinase geneSaccharomyces cerevisiaeTo A synthetic gene encoding mature cutinaseS. cerevisiaeInn Pre-sequences of vertase (Taussig and Carlsson, 1983) and strong induction g Expression led by the al7 promoter (Nogi and Fukasawa, 1983) The vector was constructed. We have prepared synthetic cutinase genes for such fusions. For this purpose, the sequence encoding the invertase pre-sequence was added to the N-terminus of the mature cutinase. An adapter fragment was synthesized that was fused to the coding sequence. This fragment is Into pUC9 as described in Example 1 (cassette 8, see FIG. 3).EcoRI -HinIncorporation as a dIII cassette gave pUR7217. Plasmid pUR7210 and pUR7217E.coli JM110 (dam lacks methylase activity 2.8 kb of pUR7217BclI-HindIII Fragment of pUR7210 0.6 kbBclI-HindI11 fragment and ligate The nucleotide sequence encoding the mature cutinase polypeptideS, cerevisi ae PUR7218 fused to part of the region encoding the invertase pre-sequence Got 8.9 kb of pUR2740NruI-SalIsolation of the I fragment,SalProtrusion of I The expression vector is filled by filling with Klenow polymerase in the ends and recircularizing the fragment. PUR2741 (see FIG. 4) to pUR2740 (Verbakel, 1991, see FIG. 6). Derived from. 7.3 kb of pUR2741SacI-HindIII fragment To 0.7 kb of pUR7218SacI-HindI Ligation with the II fragment gave pUR7219 (see Figure 5). Optionally,S. cer evisiae The polII terminator isHinCutinase residues in the dIII site It can be placed after the gene, which is essential for efficient expression of the cutinase gene. I found that there is no.E. coli-S, cerevisiaeShuttle plasmid pUR72 19 is a 2μ plasmid (cir⁺Strain)S. cerevisiaeReplication in strains Starting point,S. cerevisiaeSelection of high copy number transformants in Leu2-strains enableS. cerevisiae A promoter deleted version of the Leu2 gene and And strong inductionS. cerevisiaeunder the control of the gal7 promoter,S. cerevisiae Functionally linked to the invertase pre-sequenceFusarium solani pisiCutinase Contains a synthetic gene encoding the mature part of Identical to strain YT6-2-1L (Erhart and Hollenberg, 1981)S. cerevi siae Strain SU50 (a, cir0, Leu2, his4, can1) 2μ using standard protocol for cell electroporationS. cerevisiae Cotransformation with an equimolar mixture of plasmid and pUR7219. Transformant Selected a leucine prototrophic strain and isolated total DNA from numerous transformants. all Transformants were 2μ plasmid and p Le contained on pUR7219, believed to contain both UR7219 The promoter-deleted version of the u2 gene co-exists with the 2μ yeast plasmid. If present at a high copy number, it will simply functionally complement the leu2 deletion strain. Indicates that you can One of the transformants was grown on complete medium for over 40 generations. By feeding, followed by selection and replication plating on complete solid medium. Remove the UR7219 plasmidS. cerevisiaeStrain SU51 (a, cir⁺ , Leu2, his4, can1) were obtained. carrying the pUR7219 plasmidS. cerevisiaeStrain SU51 -Yeast nitrogen base (YNB) without amino acid 6.7g / l -Histidine 20 mg / l -Glucose 20g / l Was grown in a 1 L shake flask containing 0.2 L of MM medium. culture The product was vigorously shaken (150 rpm) at 30 ° C. overnight, and the OD was 2-4 at 610 nm. Was grown until. Cells were collected by centrifugation and placed in a 2 L shaker flask. Was -Yeast extract 10g / l -Bactopeptone 20g / l -Galactose 50g / l Resuspend in 1 L of YPGAL medium and incubate for an additional 12-16 hours. Continued. Samples are taken from the culture at regular intervals and centrifuged to remove bioma I removed the spur. The supernatant supernatant was analyzed by a titration assay using olive oil as the substrate. Tinase activity was analyzed. For each sample, add 100-200 μl of filtrate to 5 ． 0 ml of lipase substrate (Sigma, containing olive oil as a substrate for lipase) And 25.0 ml of buffer (5 mM Tris-HCl, pH 9.0, 40 mM N 2 aCl, 20 mM CaCl₂) And stirred mixture. Assay is 30 ℃ And release of fatty acids by Mettler DL25 titrator Was measured by automatic titration with 0.05 M NaOH to pH 9.0. time A curve of the amount of titrant for was obtained. The maximum slope of this curve is included in the sample. The amount of lipase activity involved was calculated. 1 unit of enzyme activity is It is defined as the amount of enzyme that releases 1 μM fatty acid from olive oil per minute. this Such measurement methods are known to those skilled in the art. When production of cutinase activity no longer increases, the cells are centrifuged to Was removed and the cell-free extract was acidified to pH 4.8 with acetic acid, as described in Example 1. The cutinase was recovered.Example 4 At AspergilliFusarium solani pisiExpression of cutinase Aspergillus nigerSubspeciesawamoriSynthesis inFusariumsolani pisiCutiner For the expression of the ze gene,Fusariumsolani pisiCode for pre-pro-cutinase The synthetic geneA. nigerSubspeciesawamoriStrong inducible exla promoter ( Construction of expression vector under the control of Maat et al., 1992, de Graaff et al., 1992) did. Starting from the plasmid pAW14B a pre-pro-cutinase expression plasmid ( pUR7280) and constructed thisE. coliIntroduced into strain JM109, Centraalbureau voorSch as N ° CBS237.90 on May 31, 1990 It was deposited at immelcultures, Baarn, The Netherlands, which is a 2.5 kb 5'-foot. 0.7 kb with ranking sequence and 2.0 kb of 3'-flanking sequence Approximately 5.3 kb in which the endoxylanase II (ex1A) gene is locatedSalI fragment (FIG. 8) is included. The exla coding region in pAW14B was pre-procedure It was replaced by the tinase coding region. Is it the first codon (ATG) of the exlA gene? Consists ofBspHI site (5 ' -TCATGA-3 ') and the stop codon (TAA) of the exla geneA fl The II site (5'-CTTAAG-3 ') facilitates the construction of pUR7280. It was Construction was performed as follows: pAW14B (7.9 kb)BspIn HI The partially cut and linearized plasmid (7.9 kb) was isolated from an agarose gel. Released. The isolated 7.9 kb fragment was thenBspA few HI sites Cut downstream of cleotideBamCut with I, anotherBspLinearize at HI site The removed plasmid was removed. Fragments were separated on an agarose gel, 7.9 kbBs p HI-BamThe I fragment was isolated. this,AflPartially cut at II, The resulting 7.2 kbBspHI-AflThe II fragment was isolated. Fusarium solani pisiConsists of the entire open reading frame encoding pre-pro-cutinase 0.7 kb of pUR7210BspHI-AflII fragment of pAW14B 7.2 kbBspLigated with the HI-AflII fragment to give pUR7280 Obtained. The constructed vector (pUR7280) was then transformed with conventional co-transformation techniques. Mold by means of law (eg,Aspergillus niger,Aspergillus nigerSubspeciesaw amori Etc.) and then the pre-pro-cutinase gene is And xylaner It can be expressed via induction of the zeII promoter. Also, the constructed r DNA vectors may be labeled with conventional selectable markers (eg, amds or pyrG, h). And the resulting rDNA vector. Can be used to transform the mold to produce the desired protein. As an example, amd The s and pyrG selectable markers were introduced into an expression vector to give pUR7281. (Fig. 10). To this end, synthetic oligonucleotides (5'-AATTG CGGCCGC-3 ') and EcoRI site (pre-pro-cutinase gene Existing 1.2 kb upstream of the ATG codon ofNotBy converting to I site A NotI site was created resulting in pUR7282. allA. nidulans amdSGenes and AndA. nigerSubspeciesawamoripyrG gene and its own promoter and Flanking to a suitable DNA fragment consisting ofNotEquipped with I part Of pUR7282NotIntroduced at the I site to obtain pUR7281 (Fig. 1 0). Aspergillus nigerSubspeciesawamoriSynthesized inFusarium solanipisiCutinase inheritance Another approach to expression in offspring is a synthetic gene encoding mature cutinase. Is not its own pre-pro-sequenceA. nigerSubspeciesawamoripre-distribution of exla In a row Therefore, a leading expression vector was constructed. To prepare a synthetic cutinase gene for such a fusion, the exlA -The sequence coding sequence differs from the sequence coding for the N-terminus of the mature cutinase Several adapter fragments were ligated by the method. In cassette 5, this series The ligation was performed by fusing the exla pre-sequence to the cutinase pro-sequence. It was Fusion of the exlA pre-sequence with the N-terminal residue of the mature cutinase in cassette 6. Let Casset 7 is the same as Casset 6, but this is a signal pepti Coded mature cutinase polypep The N-terminal residue of the peptide is changed from the original glycine to a serine residue. cassette 5, 6, and 7 were synthetic oligonucleotides substantially as described in Example 1. Assembled (see FIG. 7). 0.1 kb of pUR7210 using cassette 5E co RI-SpeThe I fragment was replaced resulting in pUR7287. Cassette 6 and 0.1 kb of pUR7210 using 7EcoRI-BclReplace the I fragment, We obtained pUR7288 and pUR7289, respectively. pUR7287, pUR72 For each of the 88 and pUR7289 plasmids, 0.7 kb BspHI-A The FlII fragment was added to the 7.2 kb Bsp of pAW14B. Ligated with the HI-AflII fragment to generate pUR7290 and pUR729, respectively. 1 and pUR7292 were obtained. The constructed rDNA vector is then transformed by conventional co-transformation techniques. Mold(Aspergillus niger,AspergillusnigerSubspeciesawamori) Introduced in the pre- ( Pro) -cutinase gene through the induction of the endoxylanase II promoter And expressed. The constructed rDNA vector is pUR728 in this example. As described specifically using 0 (see above), conventional selectable markers (eg, , Amds or pyrG, hygromycin). To produce a desired protein by transforming a mold with the resulting rDNA vector Can be. Expression vectors pUR7280, pUR7281, pUR7290, pUR72 91, pUR7292 (A. nigerSubspeciesawamoriexla promoter and tar Under the control of a minator, with or without the corresponding pro-sequenceFusariumsolan i pisi The region encoding the mature cutinase as well as the cutinase signal sequence Or any of the ex1A signal sequences). pergillus strain was grown under the following conditions: 400 ml of synthetic medium (p H 6.5) containing 1 L shaker flasks were inoculated with spores (final concentration: 10 E6 / ml). The medium had the following composition (AW medium): Sucrose 10g / l NaNO₃ 6.0 g / l KCl 0.52g / l KH₂PO_Four 1.52 g / l MgSO_Four・ 7H₂O 0.49g / l Yeast extract 1.0g / l ZnSO_Four・ 7H₂O 22mg / l H₃BO₃ 11 mg / l MnCl₂・ 4H₂O 5mg / l FeSO_Four・ 7H₂O 5mg / l CaCl₂・ 6H₂O 1.7 mg / l CuSO_Four・ 5H₂O 1.6mg / l NaH₂MoO_Four・ 2H₂O 1.5mg / l Na₂EDTA 50 mg / l. MK X incubator shaker at 30 ℃, 200 rpm for 24 hours Incubation was done. After growth, cells are filtered (0.45 μm filter) , Sucrose and yeast extract Wash twice with AW medium without salt (salt solution), resuspend in 50 ml salt solution, Transfer to a 300 ml shaker flask containing ml of salt solution, to which the final concentration is 1 Xylose was added to 0 g / l (induction medium). Under the same conditions as above Incubation continued overnight. The resulting culture was filtered on Miracloth To remove the biomass and recover the cutinase substantially as described in Example 2. It wasExample 5 Fusarium solani pisi Isolation and identification of genes for cutinase gene Fusarium solani pisiCoat a cutinase with a different degree of homology to cutinase. The isolated gene was isolated from different molds. Mold culture is 0.25% glucose 200 ml medium as described by Hankin and Kolattukudy (1968) with the addition of In a 500 ml shake flask containing MK X incubator shaker -(100 rpm) at 28 ° C for 4 days. At this point, Bud Sugars are consumed and cutin substantially as described by Ettinger et al. (1987). Cutinase production was induced by the addition of hydrolysates. Samples at regular intervals Were harvested from the culture and subjected to standard techniques (see Example 4). The presence of lipolytic activity was analyzed. Usually shows lipolytic activity about 2 days after induction , At which point cells were harvested by filtration using standard techniques. Wash mycelium and liquid Frozen in nitrogen and lyophilized by standard techniques. Substitute a total cell RNA preparation with Guanidine thiocyanate method as described by Sambrook et al. (1989). And purified by cesium chloride gradient centrifugation. polyA ( +) MRNA fraction was analyzed using the polyATtract mRNA isolation kit (Prom Ga). The polyA (+) mRNA fraction was analyzed by standard techniques. As a probeFusarium solani pisiCDNA fragment obtained from cutinase gene Related to cutinase used in the Northern hybridization analysis used The expression of the gene was confirmed. From a material that can hybridize to the probe The mRNA preparation consisting of ZAP cDNA synthesis kit ( Stratagene, La jolla) was used for cDNA synthesis and poly- The XhoI sticky end flanks the A site and the EcoRI adapter at the other end A cDNA fragment was obtained. β-galactosidase fusion protein (Huse et al., 1988) The resulting cDNA fragment was cloned into a λZAPII vector (stra Sense direction within La Jolla) It was used to construct an expression library by rolling. These librariesFusarium solani pisi Screening with antiserum raised against cutinase I did. Alternatively, the synthesized cDNA fraction was subjected to PCR-screening using a cutinase-specific primer. It was subjected to cleaning (see Table 2). These primers are It was derived by comparing the amino acid sequences of the tinase gene (Ettinger et al., 1987). As a control, cDNA obtained from Fusarium solani pisi cutinase was used and PCR reaction was performed. The reaction conditions were optimized for each set of primers. Thereby under similar conditionsFusarium solani pisi Of the PCR fragment generated by the cDNA obtained from cutinase Since it produces a specific PCR fragment of the same length (or longer) as the length, PCR fragment was purified by gel electrophoresis for Separated. Another approach is to use a PCR screen with cutinase-specific primers. Leaning technique as a positive controlFusarium solani pisiGenomic DNA Was directly used for the genomic DNA of the fungal strain. Thereby, similar articles Under the circumstancesFusarium solani pisiPCR generated from cDNA obtained from cutinase Length equal to (or longer than) fragment For the preparation of cavigenomic DNA capable of producing a specific PCR fragment of Second, the PCR fragment was purified by gel electrophoresis and separated from the gel. Either an expression library approach or a PCR screening approach Strains that showed a positive reaction in (having either cDNA or genomic DNA High molecular weight genomic DNA was isolated for many other strains. Fungus The strain was grown substantially as described by Ettinger et al. DNA was isolated as described by Graaff et al. (1988). Genomic D NA was digested with various restriction enzymes and a similar cDNA insert (expressed Current library approach) or PCR fragment (PCR screening approach H) orFusarium solani pisiSoutha using cutinase gene (other strains) Analysis by hybridization and construct a restriction map of the cutinase gene. Built Appropriate digests of genomic DNA are size-sorted by gel electrophoresis, Fragments of the appropriate size were separated from the gel and subcloned into pUC19. these Genomic library of the corresponding cDNA insert (expression library Screen) or PCR fragment (PCR screening approach) Learning and gardener A clone consisting of a genomic copy of the ze gene was obtained. Both of these genes Sequentially sequenced. By sequencing the intron, the corresponding cDNA is sequenced Or it was identified by comparison with other cutinase sequences (Ettinger et al., 1987). Also The N-terminus of the mature cutinase polypeptide was also deduced from such a comparison. standard Using the PCR technique to remove the intron,HindIII site of the open reading frame Designed just downstream,Saccharomyces cerevisiaeInvertase gene (SacI Comparing with cassette 8, site-guided, encodes the pre-sequence of Figure 3) Was fused to the sequence encoding the N-terminus of the mature cutinase. Got,S . cerevisiae A clone operably linked to the sequence encoding the invertase pre-sequence. Consists of a tinase geneSacI-HinThe dIII fragment was added to pUR7241 7 ． 3 kbSacI-Hinligated with the dIII fragment (see Figure 4),S. cerevi siae Introduced into strain SU51. A cavactinase was expressed and substantially the same as in Example 4 Recovered from culture as described in.Example 6 Inactivation experiment using di-isopropyl fluorophosphate (DFP) In this experiment, lipolytic enzymes of various origins were routinely treated with various concentrations of DFP. It was subjected to inactivation between. The percentage of residual activity after the inactivation period was calculated as pH- It was measured by a stat experiment. The experimental conditions are: 20 mM CaCl for the lipolytic enzyme to be tested₂・ 2H₂Contains O 0.5 mg protein per ml in 10 mM Tris buffer pH 10.0 (Merck) Used at a concentration. 20 μl of DFP-inhibitor solution was added to this enzyme solution (sample) 0.5 In addition to ml, 20 μl of ether was added to another 0.5 ml of enzyme solution (Blank H). DFP-inhibitor solution is 0.5M DFP dissolved in ether (Baker) (Di-isopropyl fluorophosphate, Fluka). Both samples at room temperature And incubated for 10 minutes. After incubation, add the solution to the Eppendorf Centrifuge for 2 minutes at full speed (14,000 rpm) with a centrifuge. Use the supernatant I was there. The lipase activity of both the sample and the blank was measured using a lipase substrate (Sigma, Catalysis). Log No. 800-1) and the pH-stat experiment at pH 10.0. Residual activity (RA) was then calculated as follows: RA = sample lipase activity / blank lipase activity * 100% The percentage of residual activity is shown below:Lipid-degrading enzyme residual activity (%) Lipolase (TM, Novo Nordisk) 86Fusarium solani pisi Cutinase (Example 2) 5Candida cylindracea Lipase (Sigma) 83Chromobacteriumu viscosum Lipase (Sigma 65 Porcine pancreatic lipase (Sigma) 60 Genencor lipase (Pseudomonas putida ATCC 53552 "Lumafast") 65 AKG Lipase 30B (Amano) 52 SDL 195 Lipase (Showa Denko) 20Ps. pseudoalcaligines CBS 473.85 Lipase 60Example 7 The lipolytic activity of the enzymes tested in the above examples was determined using the Br-olive oil method described above. Measured. The washing temperature was 30 ° C. and the water hardness was 27 ° FH. Cleaning The percentage of Br-olive oil removed in the trial was as follows:Lipolytic enzyme Dirt removal (%) Lipolase (TM, Novo Nordisk) 0Fusarium solani pisi Cutinase (Example 2) 19Candida cylindracea Lipase (Sigma) 0Chromobacleriumu viscosum Lipase (Sigma) 1.6 Porcine pancreatic lipase (Sigma) 10 Genencor lipase (Pseudomonas putida ATCC 53552 variant) 11 AKG Lipase 30B (Amano) 10 SDL 195 Lipase (Showa Denko) 20Ps. pseudoalcaligines CBS 473.85 Lipase 15 The data obtained in Example 6 (remaining activity after incubation with DFP Sex) and the data obtained in this example are related to each other by the method of linear regression analysis. I attached it. FIG. 11 shows a graph of this correlation. In this figure, the desired lipolysis There is a good correlation between the residual activity percentage of the enzyme and the cleaning performance. Recognize. Therefore, the residual activity levels after incubation with DFP according to Example 6 -A simple predictive test of performance during washing of lipolytic enzymes of any origin Can be used as.Example 8 Fusarium solani pisi Comparison of lipolytic activity between cutinase and lipolase (TM) Isolated according to Example 2Fusarium solani pisiActivity of cutinase derived from The sex is Lipolase (TM) commercially available from Novo Nordisk A / S, ieHumicol a lanuginosa It was compared with the lipolytic activity of lipase. Contamination test cloth made of cotton fabric and cotton knit with pure olive oil It was Each test cloth was then placed in 30 ml of a 100 ml polystyrene bottle. Incubated in wash. Keep the bottle in a watered Miele TMT washing machine as normal. Stir using the main wash program at 30 ° C. Washing liquid has the following composition (% by weight) : Nonionic surfactant C₁₂-C_Fifteen Alcohol 10.5-13EO 9.5 Sodium sulfate 38.6 Sodium carbonate 40.4 Sodium silicate (Na₂O: Si₂O = 2.4) 7.3 Water 4.2 1 g of water (6 ° FH) for 2 g of detergent powder having After the first wash, dry the test cloth in a tumble dryer at room temperature and then leave Fat content was quantified immediately. The test cloth is petroleum ether in Soxhlet equipment It was extracted with. Next, the amount of fatty matter is determined by weighing and on the cloth Expressed as fat percentage. The result is shown in FIG. From this figure, Lipolase (TM) was comparable to the control in the removal of olive oil. It can be seen that no improvement is seen, but in the experiment showing contribution, it is slightly Although it was negative, this is not considered significant. On the other hand, cutinase Shows a clear effect during washing.Example 9 Against different types of stainsFusarium solani pisiCutinase and Lipolase (TM) Effect of one-time cleaning On a cotton test cloth, add peanut oil, oleyl oleate and these two fats. Soiled with a 50/50 mixture. The detergent powder and the washing conditions were the same as in Example 8. It was the same. To measure the cleaning effect after cleaning once, measure the reflectance at 460 nm. It was evaluated by and. The results are shown in Fig. 13. From this figure, it is shown that some types of oil stains of detergent compositions containing cutinase The cleaning effect includes lipolase (TM) It can be seen that the composition is consistently better than that of the composition. The effect is pure The most obvious about flower oil.Example 10 At multiple enzyme levels, measured after each wash cycleFusarium solani pisi Effects of cutinase and lipolase (TM) The test cloth was soiled with LS-3 and Example 9 was substantially repeated. this is , 75 g peanut oil, 40 g emulsifier, 125 g AS-8 and 125 g mi It is an emulsion of Luk powder. After the first cleaning, stain the test cloth again. , Washed again. This was repeated 4 times in total. Cutinase and lipolase (TM ) Effect at each enzyme level of 1, 3, 5 and 10 LU per 1 ml of washing solution. It was measured after the icicle. The results are shown in Figures 14A-D. Several conclusions can be drawn from these experiments. Cutinase is whole In contrast to all the enzyme levels showing a remarkable effect of one wash, Lipolase (TM) It is clear that the highest level of 10 LU / ml shows only a small effect of one wash. is there. The advantage of cutinase over Lipolase (TM) after the first wash was 4 Maintained for one wash cycle.Example 11 Fusarium solani pisi Cutinase,Pseudomonas gladioliDerived lipase and Effect of Lipolase (TM) A 67% polyester and 33% cotton test cloth was used with the detergent product shown below. It was used at 5 g / L for de-sizing and rinsing thoroughly. Cut into 7.5 cm x 7.5 cm pieces Then fixed. 10 pieces of such unclean cloth (total amount about 6.5g) Wash in 75 ml of washing liquid 6 ° FH containing 5 g of the detergent product shown in the above. CleanPseudomonas gladioliDerived lipase, lipolase orFusarium sol ani pisi Cutinase was pre-added to the wash solution at 1 LU / ml.Pseudomonas gl adioli The derived lipases are EP-A-205 208 and EP-A-206390. (Both were Unilever). Put the cleaning solution and cloth in a small bottle. This was stirred in a Lavamat AEG washing machine for 30 minutes at 30 ° C. Detergent powder It had the following composition (% by weight): Coco-primary alkyl sulfate 5.2 Nonionic surfactant C₁₃-C_FifteenAlcohol 7 EO 5.2 Nonionic surfactant C₁₃-C_FifteenAlcohol 3 EO 6.6 Zeolite 4A 32.00 Sodium carbonate 11.52 Sodium silicate 0.45 Hardened tallow soap 2.00 The initial pH was about 10 in each case. At the end of washing, cross Rinse with 300 ml of tap water for about 30 seconds. This was repeated 3 times. Then The cloth was squeezed once more and line dried under ambient conditions. Half of dry cloth The portion was soiled with olive oil and left for 3 days. First about 5% by weight of the cloth The amount of oil stain that was present was quantified by weighing. The results are shown in Fig. 15. It is clear that Lipolase (TM) does not contribute to the removal of oil stains after one wash. It's obvious. The effect of Lipolase (TM) appears only after repeated washing.P. gla dioli The lipase has a small but clear cleaning effect after the first wash, The ukule shows a clear difference. Cutinase has already been used since the first wash cycle. Contributes to the removal of oil stains and this benefit is maintained throughout subsequent cycles. ItExample 12 Fusarium solani pisi Cutinase,Pseudomonas gladioliDerived lipase and Effect of Lipolase (TM) Example 11 was repeated using the following detergent products at a concentration of 5 g / L: Coco-primary alkyl sulfate 1.7 Nonionic surfactant C₁₂-C_FifteenAlcohol 7 EO 6.8 Nonionic surfactant C₁₂-C_FifteenAlcohol 3EO 8.5 Zeolite MAP1) 32.00 Sodium carbonate 11.52 Sodium silicate 0.45 Hardened tallow soap 2.00 1) Zeolite MAP stands for "Maximum Aluminum Zeolite P", which is Zeo A type of light, described in detail in EP-A-384070 (Uniriver) There is. The results are shown in Fig. 16. Both lipases were sized after or after the first wash. This means that it does not contribute to the removal of any oil stains after the clou. However, Cutinase has already shown great efficacy in washing after the first wash cycle .Example 13 Fusarium solani pisi Cutinase,Pseudomonas gladioliDerived lipase and Effect of Lipolase (TM). Except that it was recontaminated between each wash cycle. Example 12 was repeated. The results are shown in FIG. After the second wash cycle, the repoler Ze (TM) andP. gladioliA slight benefit was observed with this lipase. Cutina Has already reduced the amount of oil stains in a single wash. After that The wash cycle results in a further reduction of oil stain even after recontamination.

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年９月６日【補正内容】請求の範囲１．酵素洗剤組成物であって、（ａ）０．１-５０重量％の、（ａ１）０-９５重量％の１種以上の陰イオン性界面活性剤および（ａ２）５-１００重量％の１種以上の非イオン性界面活性剤から成る界面活性剤系；ならびに（ｂ）真核生物クチナーゼ１０-２０，０００ＬＵ（ＥＰ-Ａ-２５８０６８で定義された通りのリパーゼ単位）／ｇ洗剤組成物を含むことを特徴とする前記組成物。２．酵素が、本明細書で述べた通りのアッセイで、酵素を含まない同じ洗剤組成物と比較して当初の油よごれ量に基づき少なくとも５％以上、好ましくは少なくとも１０％以上の油よごれを除去することのできる、請求項１に記載の洗剤組成物。３．本明細書で述べた通りのアッセイで、リポラーゼ（ＴＭ）による酵素的油よごれ除去に対する本酵素による酵素的油よごれ除去の比率が、少なくとも３、好ましくは少なくとも５である、請求項１に記載の洗剤組成物。４．脂質分解活性を示す酵素が、本明細書で述べたように、ｐＨ１０でジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）と共に室温で１０分間インキュベーション後、５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは２５％未満の残存活性を有する脂質分解酵素である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の洗剤組成物。５．真菌クチナーゼを含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の洗剤組成物。６．幹特異性を有する真菌クチナーゼを含む、請求項５に記載の洗剤組成物。７．クチナーゼが、Fusarium solani pisi、Fusarium roseum culmorum、Rhizoc tonia solani およびAlternaria brassicicola （PNBase I）から成る群から選ばれる、請求項５に記載の洗剤組成物。８．酵素がFusarium微生物から得ることのできるクチナーゼである、請求項５に記載の洗剤組成物。９．酵素がFusarium solani pisiから誘導されるクチナーゼである、請求項５に記載の洗剤組成物。１０．酵素が、Fusarium solani pisiから誘導されるクチナーゼに対する抗体と免疫学的に交差反応性である、請求項５に記載の洗剤組成物。１１．陰イオン性界面活性剤を含まない、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の洗剤組成物。１２．陰イオン界面活性剤が一級アルコールサルフェートである、請求項１〜１０に記載の洗剤組成物。１３．陰イオン界面活性剤がＣ₁₂〜Ｃ₁₅一級アルコールサルフェートである、請求項１２に記載の洗剤組成物。１６．汚れた繊維製品を洗濯する方法であって、（ａ）請求項１〜１５のいずれか１つに記載の洗剤組成物の水溶液と共に汚れた繊維製品を洗濯し、（ｂ）温風により繊維製品を乾かす工程から成ることを特徴とする前記方法。[Procedure Amendment] Patent Law Article 184-8 [Submission Date] September 6, 1994 [Amendment Content] Claims 1. An enzyme detergent composition comprising: (a) 0.1-50% by weight, (a1) 0-95% by weight of one or more anionic surfactants, and (a2) 5-100% by weight of 1 A surfactant system consisting of one or more nonionic surfactants; and (b) a eukaryotic cutinase 10-20,000 LU (lipase units as defined in EP-A-258068) / g detergent composition. A composition as defined above. 2. The enzyme removes at least 5% and preferably at least 10% or more of oil stains based on the original amount of oil stains in the assay as described herein, as compared to the same detergent composition without the enzyme. The detergent composition according to claim 1, which can be used. 3. 2. The assay as described herein, wherein the ratio of enzymatic degreasing by the enzyme to enzymatic decontamination by Lipolase (TM) is at least 3, preferably at least 5. Detergent composition. 4. The enzyme exhibiting lipolytic activity is less than 50%, preferably less than 40%, more preferably less than 25% after 10 minutes incubation at room temperature with diisopropylfluorophosphate (DFP) at pH 10 as described herein. The detergent composition according to any one of claims 1 to 3, which is a lipolytic enzyme having residual activity. 5. The detergent composition according to any one of claims 1 to 4, comprising a fungal cutinase. 6. The detergent composition according to claim 5, comprising a fungal cutinase having stem specificity. 7. The detergent composition according to claim 5, wherein the cutinase is selected from the group consisting of Fusarium solani pisi , Fusarium roseum culmorum , Rhizoctonia solani and Alternaria brassicicola (PNBase I). 8. The detergent composition according to claim 5, wherein the enzyme is a cutinase obtainable from Fusarium microorganisms. 9. The detergent composition according to claim 5, wherein the enzyme is a cutinase derived from Fusarium solani pisi . 10. The detergent composition according to claim 5, wherein the enzyme is immunologically cross-reactive with an antibody to a cutinase derived from Fusarium solani pisi . 11. The detergent composition according to any one of claims 1 to 10, which does not contain an anionic surfactant. 12. The detergent composition according to claims 1 to 10, wherein the anionic surfactant is a primary alcohol sulfate. 13. The detergent composition according to claim 12, wherein the anionic surfactant is a C _{12 to} C ₁₅ primary alcohol sulfate. 16. A method of washing a soiled textile product, comprising: (a) washing the soiled textile product with an aqueous solution of the detergent composition according to any one of claims 1 to 15; Said method comprising the step of drying.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:77）Ｃ１２Ｒ 1:77） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者ワール，ジヨナサン・フランクイギリス国、ウイラル・エル・62・４・ユー・エル、ポート・サンライト、バス・ストリート・15 (72)発明者クリユギスト，ジヤンイギリス国、スピタル・エル・63・９・エフ・エヌ、ヘロンパーク・ウエイ・25 (72)発明者マステルス，ウオウテルオランダ国、エヌ・エル―3141・エル・デー・マースルイス、ウイペルスパーク・ 138 (72)発明者ホンドマン，デイルク・ヘルマン・アーオランダ国、エヌ・エル―2712・エー・カー・ツオエテルメール、ペルクストラート・49─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:77) C12R 1:77) (81) Designated country EP (AT, BE , CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML) , MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, HU, JP, KP, KR, KZ. , LK, LU, MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SK, UA, VN (72) Inventor Wahl, Gionathan Franc KU England, Wilal El 62.4 You L, Port Sunlight, Bass Street 15 (72) Inventor Kryugist, Jiyan England, Spital El 63.9 EF N, Heron Park Way 25 (72) Inventor Mastells, Walter Netherlands, N El-3141 El de Mars Luis, Wipers Park 138 (72) Inventor Hondomann, Derik Hermann Ahr Netherlands, N.L.-2712, A.K., Zoetermeer, Perkstraat, 49

Claims

[Claims] 1. An enzyme detergent composition comprising: (a) 0.1-50% by weight, (a1) 0-95% by weight of one or more anionic surfactants, and (a2) 5-100% by weight of 1. A surfactant system comprising one or more non-ionic surfactants; and (b) an enzyme 10-20,000 LU / g detergent composition capable of exhibiting substantially lipolytic activity during the main cycle of the washing process. A composition as defined above. 2. The enzyme removes at least 5% and preferably at least 10% or more of oil stains based on the original amount of oil stains in the assay as described herein, as compared to the same detergent composition without the enzyme. The detergent composition according to claim 1, which can be used. 3. 2. The assay as described herein, wherein the ratio of enzymatic degreasing by the enzyme to enzymatic decontamination by Lipolase (TM) is at least 3, preferably at least 5. Detergent composition. 4. The enzyme exhibiting lipolytic activity is less than 50%, preferably less than 40%, more preferably less than 25% after 10 minutes incubation at room temperature with diisopropylfluorophosphate (DFP) at pH 10 as described herein. The detergent composition according to any one of claims 1 to 3, which is a lipolytic enzyme having residual activity. 5. The detergent composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the enzyme is esterase or lipase. 6. The detergent composition according to any one of claims 1 to 5, wherein the enzyme is a eukaryotic cutinase. 7. The detergent composition according to claim 6, wherein the enzyme is a fungal cutinase. 8. The detergent composition according to claim 7, wherein the enzyme is a fungal cutinase having stem specificity. 9. The detergent composition according to claim 8, wherein the enzyme is a cutinase selected from the group consisting of Fusarium solani pisi , Fusarium roseum culmorum , Rhizoctoni a solani and Alternaria brassicicola (PNBase I). 10. The detergent composition according to claim 7, wherein the enzyme is a cutinase obtainable from a Fusarium microorganism. 11. The detergent composition according to claim 7, wherein the enzyme is a cutinase derived from Fusarium solani pisi . 12. The detergent composition according to claim 7, wherein the enzyme is immunologically cross-reactive with an antibody to a cutinase derived from Fusarium solani pisi . 13. The detergent composition according to any one of claims 1 to 12, which does not contain an anionic surfactant. 14. The detergent composition according to claim 1, wherein the anionic surfactant is a primary alcohol sulfate. 15. The detergent composition according to claim 14, wherein the anionic surfactant is a C ₁₂ -C ₁₅ primary alcohol sulfate. 16. A method for washing a soiled textile product, comprising: (a) washing the contaminated textile product with an aqueous solution of the detergent composition according to any one of claims 1 to 15; and (b) heating the textile product with warm air. Said method comprising the step of drying.