JPH08503410A

JPH08503410A - 金属蓄積法

Info

Publication number: JPH08503410A
Application number: JP51186194A
Authority: JP
Inventors: ディック，ローズマリィ，エレーン; マカスキー，リン，エレーン
Original assignee: ブリティッシュニュークリアフューエルズピーエルシー
Priority date: 1992-11-14
Filing date: 1993-11-12
Publication date: 1996-04-16
Also published as: DE69316029D1; EP0673350A1; WO1994011315A1; DK0673350T3; RU2135421C1; US5520811A; RU95112454A; AU5430094A; GB9223932D0; EP0673350B1; AU682671B2; ES2111777T3; ZA938469B; DE69316029T2

Abstract

(57)【要約】リン酸塩が低水溶性である金属、例えばＣｄ、Ｐｂ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｓｒ、Ｕ、Ｌａ、Ｐｕ、ＡｍおよびＮｐは、１種またはそれ以上のポリリン酸−蓄積微生物により蓄積される酵素的に開裂されたポリリン酸により生成されるリン酸との反応によって、水から除去される。

Description

【発明の詳細な説明】金属蓄積法本発明は、金属蓄積法に関しおよび特には、例えば以下の目的：（ａ）水の精製；（ｂ）洗浄またはその他の工程に使用される水、例えば貴金属鉱石の処理に使用された水からの金属の回収；（ｃ）土壌から重金属を除去する目的のため該土壌を処理するために使用された水からの重金属の蓄積；の１またはそれ以上のために、金属を含む水からの該金属の除去に関する。 ”An immobilised cell bioprocess for the removal of heavy metals from aqueous flows（水流からの重金属の除去のための固定化細胞バイオプロセス） ”，L.E.Macaskie，J．Chem．Technol．Biotechnol．49 357-379 （1990），において、サイトバクター種（Citobacter sp.）を使用する重金属除去を行うことが従来提案されており、その中で金属除去に対してそれにかなった生理学的状態のバイオマス細胞を製造するためにグリセロール−２−ホスフェートを使用して上記バイオマスを培養する。金属除去は金属と、固定化細胞による金属蓄積に対するリン酸受容体として５ｍＭまでの量でのグリセロール−２−ホスフェート（Ｇ２Ｐ）とを共に呈示すること（co-presentation）による。上記Ｇ２Ｐは酵素的にグリセロールおよび無機リン酸（inorganic phosphate）に開裂し（上記細胞のポテンシャルエネルギー源）、そのリン酸（phosphate）の流出が入ってくる金属を遮り、結晶性重金属リン酸塩の沈澱を生じる。このような方法は溶液から重金属の除去に有効であると同時に、その使用は高価なグリセロール−２−リン酸を使用するという不都合を有する。本発明の目的はグリセロール−２−リン酸のような高価な媒体の使用に依らない技術を提供することである。その見地の一つでは、本発明は、１種またはそれ以上の金属を含む上記水の存在下で酵素的に開裂して金属リン酸塩を沈澱させるために水中の上記金属（類）と反応するリン酸イオンを製造するポリリン酸（poly-phosphate）を蓄積する、ポリリン酸−蓄積微生物の１種またはそれ以上を使用することにある。このような金属ポリリン酸塩は結晶化できまたは水酸基のような他の沈澱種と混合できる。本発明の見地の他のものでは、金属リン酸塩類として沈澱により金属類を溶液から除去するためのポリリン酸の開裂で製造されるリン酸イオンの使用法である。本発明の技術を許容する金属は低水溶性のリン酸塩になるものであり、例えばカドミウム、鉛、銅、マンガン、コバルト、ニッケル、カルシウム、イットリウム、ストロンチウム、ウラン、ランタン、ランタニド類、プルトニウム、アメリシウムおよびネプツニウムである。好ましい方法では、ポリリン酸−蓄積微生物がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を合成しおよび利用できる条件下の培養培地において該微生物は培養され、次にＡＴＰ合成／利用を変更し、それにより該微生物が代用エネルギー源としてポリリン酸を利用して、金属イオンと反応して金属リン酸塩の沈澱を生じることのできる上記リン酸イオンの製造が生ずることとなる。微生物は好ましくはポリリン酸−蓄積細菌であり、例えばポリリン酸−蓄積アシネトバクター（Acinetobacter）の細菌である。それはａ）その中のある微生物が好気的条件下でポリリン酸の保蔵量を蓄積できおよび嫌気的条件下でそのようなポリリン酸を使用してリン酸（phosphate）を生じること；ならびに（ｂ）標準的な好気的方法の下流に嫌気的処理ゾーンをもうけることによりこれは活性汚泥処理の生物学的リンの除去を誘導するのに使用できることはそれ自体公知である（Y．Comeau et al，Wat．Res．Vol.20，No.12，pp 1511-1521参照）。しかし、われわれが気付く限り、溶液から重金属を除去するためのリン酸源（ a source of phosphate）としてこのような微生物によって蓄積されるポリリン酸（polyphosphate）を利用することは以前には提案がない。このように、本発明は酵素的に仲介される金属生体蓄積化または生体鉱物化による金属蓄積のためのリン酸の主な原料としてのポリリン酸の使用によるものである。公知のポリリン酸−蓄積アシネトバクター細菌の特別な例はアシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）ＡＴＣＣ２３０５５（ＮＣＩＭＢ１０６９４）である。公知のポリリン酸−蓄積微生物の他の例はクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsi ella pneumoniae ）ＡＴＣＣ１２６５８である（＝ＮＣＩＭＢ８８０６）。アシネトバクターの場合では、ＡＴＰの合成／利用は好気的条件下で可能であり、および嫌気的条件に対するスイッチによりＡＴＰからのエネルギー利用をスイッチオフすることができる。通常（好気的）条件下で起こると一般的に理解されると同様に、嫌気条件下では、ＡＴＰ合成を抑制することによりＡＴＰ利用は抑制される。しかし、それはＡＴＰ合成を妨害しない脱共役剤、例えば２，４− ジニトロフェノールまたはＤＣＣＤ（ジシクロヘキシルカーボジイミド）の添加によりＡＴＰ利用をスイッチオフすることは本発明の範囲内にある。好ましい細菌は、以降に記載するようにわれわれが活性汚泥から単離しそして１９９３年１１月５日にブダペスト条約の条項に基づいて、23 St．Machar Driv e，Aberdeen AB 2 1RY，Scotlandのザナショナルコレクションオブインダストリアルアンドマリンバクテリアリミテッド〔The National Colle ction of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)〕にそれぞれの受託番号（Accetion Nomber）ＮＣＩＭＢ 40594およびＮＣＩＭＢ 40595として寄託したアシネトバクターＷ６種およびアシネトバクターＷ９種である。これらの寄託された細菌の現在利用可能な表示〔ＬａｂＭ栄養寒天培地（La b M nutrient agar）における生育から認められ、２５℃でインキュベートされる〕は以下に示すものである。われわれはまた、ポリリン酸−蓄積微生物がそれらが生じる環境から単離されることを本発明が必要としないということを見出した。特にわれわれはポリリン酸−蓄積微生物を含む活性汚泥がそれ自体本発明において使用できることを見出した。活性汚泥の適当なタイプは自然環境へ排出する前に〔例えば所謂ホストリップ（Phostrip）またはホレドックス（Phoredox）法により〕流出液からリンイオンを除去するためのプラントで使用されるものである。本発明の技術はリンの供給に依存することが評価されるであろう。そのような供給は少なくとも部分的にリンの同化可能な原料の計画的な添加により提供することができる。しかし、本発明は、不純物としてリンの同化可能源を既に含む水であって、しかしそれはその水にまた存在する金属（類）と直接反応する形態でないか、金属不純物がリンと反応できる形態ではない上記水から金属（類）を除去するのに適切であることが評価されるであろう。上記方法の好気的または嫌気的段階における操作条件は微生物の使用を含めて、好気的および嫌気的処理に対して使用される通常の条件である。しかし、亜硝酸塩への硝酸塩の還元は、酸素と置き換えが可能でありおよびそのため要求されるポリリン酸のリン酸への変換を抑制するため、嫌気的段階では低い硝酸塩濃度を使用するのが好ましい。典型的には温度は０ないし３６℃、最も好ましくは１５ないし３０℃の範囲である。微生物の好気培養に使用される培地は、最適な生育のため同化し得る炭素、窒素、リンおよび他の必要な微量元素を含む適当な生育培地である。そのような培地は他の方法からの廃棄物であってもよい。Ｇ２Ｐのような高価な炭素およびリン源を使用する必要はない。嫌気的条件下では、そのような栄養源を用意する必要はなく、単に、溶解された酸素および酸化された窒素（亜硝酸塩および硝酸塩）が不在であることを確保することによる適当な嫌気的条件を準備する要件のみでよい。本発明に従った廃水からの重金属の除去のための典型的方法を今ここに記載する。ポリリン酸−蓄積アシネトバクター種の代表的な菌株を好気的に培養し、そして水性栄養培地（aqueous nutrient medium）を使用するバイオリアクター中の固体支持体〔例えば開孔（open-pore）ポリウレタンフォーム，ガラスビーズ、砂または砂利タイプの物質〕に固定する（その培地は該バイオリアクター中を循環する）。気体酸素は圧縮空気給送機および気泡破壊装置を介して導入される。栄養培地（nutrient medium）は、同化可能な炭素、窒素およびリン源としてのリン酸濃度の高い廃水からの、廃液醗酵生成物および廃液リン酸を含む。ポリリン酸を蓄積するために好気的処理は約２０℃の温度でおよびｐＨ７．０で２４− ４８時間行われる。これに続いてバイオアリアクターの条件を栄養分ないし同化可能な酸素を供給しない嫌気的条件に切り換える。除去されるべき重金属を含む廃水を蓄積されたポリリン酸を含む固定化細菌を接触するようにバイオリアクター中に通す。嫌気性条件下では、細菌はそれらのＡＴＰの供給が不足し、そのためエネルギー源として蓄積されたポリリン酸を利用し始める。この結果ポリリン酸は酵素的に開裂し、重金属と反応して重金属リン酸塩を沈澱させるリン酸を生じ、従って上記水において重金属が除去されるかまたは少なくともその重金属の濃度は減少することになる。これに続いて、生育できなくなった場合に微生物を交換する定期的停止を含めて、バイオリアクターは好気的な操作に切替え戻して上記方法を周期的に行うことができる。各々の嫌気段階中では、微生物は適当な炭素供給によりまた炭素貯蔵ポリマーであるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を製造でき、それは生育のための貯蔵炭素として利用でき、および続いて起こる好気的周期の間のさらなるポリリン酸の蓄積を剌激するＡＴＰを発生するのに利用できる。さて本発明は以下の実施例でより詳細に記載する。添付する図面において：図１ａは細胞のない溶液中において、溶液中のリン酸イオンおよびランタンイオン濃度を、無機のリン酸ランタンを沈澱させる間の時間に対してプロットしたグラフであり；図１ｂは細胞のない溶液中において、溶液中のリン酸イオンおよびウラニルイオン濃度を、インキュベートする間の時間に対してプロットしたグラフであり；図２ａおよび図２ｂは以下に示す表１および表２にそれぞれ示された結果を表わす図表であり；図３ａはアシネトバクター・カルコアセチカスＮＣＩＭＢ１０６９４により放出されたリン酸（released phosphate）を示す、リン酸濃度を時間に対してプロットするグラフであり；図３ｂはアシネトバクター・カルコアセチカスＮＣＩＭＢ１０６９４によるランタン除去を示す、ランタン濃度を時間に対してプロットするグラフであり；図４はＬａ³⁺の存在または不在下での嫌気的条件下のＷ９菌株によるリン酸放出（phosphate release）ならびにランタン除去を示す、リン酸およびランタン濃度を時間に対してプロットするグラフであり；図５は嫌気的条件下でインキュベートされたＷ９菌株の細胞懸濁液によるランタンの除去およびリン酸放出を示す、リン酸およびランタン濃度を時間に対してプロットするグラフであり；図６ないし９は以下に示す表３ないし５にそれぞれ示す結果を表わす図表であり；図１０および１１は以下に示す実験例８においてそれぞれ連続２日間１回の好気的および１回の嫌気的期間を通した第一および第二リアクター中のリン酸および金属レベルを示し；ならびに図１２は純粋なＨ₂（ＵＯ₂）₂（ＰＯ₄）₂８Ｈ₂Ｏのスペクトルと比較した実験例８で使用した第二リアクターから得られた試料のＸ線回折スペクトルである。以下の実験例において、次の生育培地が使用された：培地１ −生育培地１ｌ当たりトリス６．０ｇ酢酸ナトリウム５．０ｇ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １．５ｇＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．１６ｇＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ０．０８ｇＫＣｌ０．６ｇ微量元素溶液^a) １．０ｍｌ鉄ＥＤＴＡ溶液^b) ０．２４ｍｌｐＨをＨＣｌで７．１に調節しおよび培地をオートクレーブすることにより殺菌する。以下ものは別に殺菌しおよび冷却後添加する。１０％酵母エキス１ｍｌＫ₂ＨＰＯ₄・３Ｈ₂Ｏ０．１６ｇ〔 ^a 微量元素溶液は（１リットル当たり）ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１０ｍｇＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ３ｍｇＨ₃ＢＯ₃ ３０ｍｇＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ２０ｍｇＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ１μｇＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ２ｍｇＮａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ３ｍｇを含む ^b 第一鉄ＥＤＴＡ溶液は（市販されている混合物）硫酸第一鉄（８水塩）エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩１．０ｇ／ｌを含む〕培地２ −窒素制限生育培地培地１と同様であるが、酢酸ナトリウム１０ｇおよびＫ₂ＨＰＯ₄・３Ｈ₂Ｏ０．２３ｇ（１リットルにつき）を含む。培地３ −好気的段階培地１リットル当たりトリス６．０ｇ酢酸ナトリウム０．３６ｇ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ０．０２ｇＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．０３ｇＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ０．０２ｇＫＣｌ０．０１２ｇ微量元素溶液^a) １．０ｍｌＫ₂ＨＰＯ₄・３Ｈ₂Ｏ０．１３６ｇ（別にオートクレーブされる）ｐＨをＨＣｌで７．１に調節しおよび培地をオートクレーブすることにより殺菌する。培地４ −嫌気的段階の培地（最終濃度）ＭＯＰＳ〔３-(Ｎ-モルホリノ)プロパンスルホン酸）/ NaOH緩衝液pH７．０〕４０ｍＭクエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝液pH７．０２ｍＭ酢酸ナトリウム（オ-トクレーブにより殺菌）１０ｍＭいくつかの実験例ではＭＯＰＳを同じｐＨおよび濃度のトリス／ＨＣｌ緩衝液と置き換える。ウラニルイオンを使用する実験例では、酢酸ナトリウムを１０ｍＭ酢酸アンモニウムと置き換える。他に言及しないかぎり全ての実験例は３０℃でインキュベートされた。微生物菌株Ｗ６およびＷ９の単離活性汚泥が混合された液体はセバーントレント下水処理場（Severn Trent s ewage treatment works）〔英国，ウインボーン（Wimborne）所在〕から入手された。それぞれの液体の均質な懸濁液を作りそして連続希釈液（殺菌塩水，０．８５％ｗ／ｖ）を栄養寒天培地〔ディフコラボラトリー（Difco labratories），アメリカ合衆国，デトロイト〕で平板培養する。室温（２０℃）で２週間インキュベーション後、明らかに異なる形態のコロニーを選択し、１０^-4ないし１０^-6 希釈液から取出しそして栄養寒天培地において純化のためストリークする。グラム染色およびオキシダーゼ試験に続いて、単離された微生物菌株（Ｗ６およびＷ９）は実験的に、アシネトバクター属であるのものとしてのＡＰＩ２０Ｅおよび２０ＮＥ同定ストリップ〔ＡＰＩシステム，バイオメリッる。このＷ６およびＷ９菌株はブダペスト条約の条項に基づいてナショナルコレクションオブインダストリアルアンドマリンバクテリアリミテッド（ＮＣＩＭＢ）にそれぞれ受託番号ＮＣＩＭＢ４０５９４およびＮＣＩＭＢ４０５９５号で１９９３年１１月５日に寄託されている。方法（ａ）遊離細胞による実験培地１からの５０ｍｌ出発培養培地を接種しそして１−２日間インキュベートする。この２０ｍｌｈａ地の２リットルを接種するのに使用し、培養培地を圧縮空気供給による強制曝気により２４ないし３６時間好気的にインキュベートする。細胞を遠心分離により収集する（４５００ｒｐｍ；４℃；３０分間）。上澄みを流し去りおよびその一部分を細胞を再懸濁するため使用する。おのおのの懸濁液を再度遠心分離する。細胞ペレットを再び上澄みの一部分で懸濁し、細胞懸濁液を集め、使用時まで氷で冷やす。集められた細胞懸濁液は個々の実験で記載された金属塩の添加とともにまたは添加なしに培地４を接種するのに使用される。好気的条件が要求されるにしろ嫌気的条件が要求されるにしろ各条件による培地中に空気または窒素ガス（無酸素の）が泡立たされる。所定の間隔で、キンキュベーション混合物１ｍｌが取り出され、その細胞は遠心分離（１２０００ｒｐｍ；５分間）で速やかに沈降される。この上澄みをリン酸および金属に対して定量する。（ｂ）固定化細胞による実験遊離細胞による実験に対して記載したと同様に、４リットルまでの培養を生育させおよび収集する。細胞ペレットの重さを図り、０．８５％のＮａＣｌに再懸濁し、アリコートに集める。この細胞を寒天またはアガロース（最終濃度３％ｗ／ｖ；最終細胞濃度約５％ｗ／ｖ）に様々に固定化するが、幾つかの実験では、大豆油が疏水相使用される、ニルソンら（Nilsson et al）の方法〔Eur．J．Appl ．Microbiol．Biotechnol．17:319-326〕によるビーズ（平均１ｍｍ径）の形成ともに固定する。別の方法では、ゲル化した細胞懸濁液を成形型に置き、凝固したゲルをステンレスメッシュを通すことにより寸断し、１ｍｍ角断面および長さ１０ｍｍまでの押し出された小片を得る。ゲル小片またはビーズを塩水で洗浄して固定されていない細胞および／または接着性油を取り除きそして予め殺菌された反応容器またはカラムに入れる。ここで、以下に記載するように嫌気的段階に金属と共にまたは金属なしで、それらを好気的および嫌気的段階（それぞれ培地４および培地３を使用して）に交互にインキュベートする。化学的分析カドミウムおよび鉛はＭｅｔｒｏｈｍ６９３ＶＡポーラログラフおよびポルタンメトリーアナライザーを使用して、吊り下げ水銀滴電極を備えたＡＳＶ（陽極ストリッピングポルタンメトリー）により測定する。ランタンおよびウラニルは、酸性溶液中のアルセナゾII Iによる比色測定法で測定される〔Ｍ．Ｒ．トレイ（M.R.Tolley），D.Phil．The sis Univ of Oxfrod，1993〕。リン酸はその酸性モリブデン塩との反応ににより比色的に測定される（Pierpont 1957 Biochem J．65： 67-76）。Ｘ線粉体回折データは入射束モノクロメーター〔ゲルマニウムIIIプレーンズ（Germanium III ,planes）〕、フイリップス（Phillips）ＰＮ１７１０ディフラクトメーター制御ユニットおよびシーメンス／ソカビン（Siemens/Socabin）ＤＩＦＦＲＡＣ／ＡＴプログラム一式を備えたピッカープレシシオンデフラクトメーター（Pi cker Precision diffractometer）により得られる。ＣｕＫα線（λ＝１．５４０６Å）への曝露時間は１６時間である。反応器の詳細説明１）自動操作反応器小片に対するフィルターの役割をする４ｍｍ径ガラスビーズ１５０ｇを含む最大５００ｍlの２つの反応器が使用される。ポンプおよび電気的に操作されるバルブが好気的および嫌気的期間を交替する装填および抜取りシステム（fill and draw system）の自動操作を可能し、ならびに反応器を１日に３回の８時間周期にかけるタイマーにより制御する。流入培地および反応器を使用の前にオートクレーブにかけ、同時に管およびバルブを７０％エタノールにより殺菌しおよび滅菌蒸留水で洗浄する。それぞれの８時間周期は以下に示す内容である：時間（分）０-１５０嫌気的段階でのインキュベーション（培地４；無酸素のヘッドスペースを保つようにゆっくりした割合で窒素ガスを培地内に泡立たせる）１５０-１６１抜取り段階−培地４を抜取る；窒素オン１６１-１６６装填段階−培地３（好気的培地）を装填する；窒素オフ／高い割合で培地に空気を泡立たせる１６６-４６４好気段階におけるインキュベーション；空気オン４６４-４７６抜取り段階−培地３を抜取る；空気オン４７６-４８０装填段階一培地４を装填する；空気オフ／窒素オン一日のうち３回の嫌気的期間は次の時間である：６：３０−９：００；１４：３０−１７：００および２２：３０−１：００。分析のため試料は一日のうち最初および第二の嫌気段階の終わりに採取され、および適当ならば、最初の好気的および第二の嫌気的段階（９：００−１７：００）を通して採取される。第三の嫌気性段階は試料採取はない。それぞれの反応器に加える適当な容量は嫌気的段階に対しては培地４の２００ｍｌおよび好気的段階に対しては培地３の２５０ｍｌである（流入流量＝５０ｍｌ／分；流出流量２０．８ｍｌ／分）。好気的段階および嫌気的段階を通してのリン酸および金属分析のために、試料２−４ｍｌが、サンプリング管によってシリンジを用いて抜取られる。培地は金属分析の前に沈降させておくが、しかしリン酸分析に対しては遠心分離されて細胞を取り除き、上澄みが分析される。嫌気的段階の間におけるリン酸の放出は嫌気的段階の開始時の試料と終わりの試料との違いとして測定される。金属除去の計算に対しては５分間沈降させておき、その金属濃度を流入培地の金属濃度と比較する。ｂ）カラム反応器手動逆転機能を備えた変速ポンプおよび手動で操作されるバルブにより好気的段階と嫌気的段階との間の無菌的な培地の交換可能である。カラム反応器は一日にそれぞれ２．５時間の２回の嫌気的段階（それぞれの日の大体同じ時間９：３０−１２：００および１６：００−１８：３０において）を受ける。ガラスビーズ（２ｍｍ径）がそれぞれのカラムの底にフィルターとして使用される。それぞれの段階の総容量は２５０ｍｌである。段階間の交換の間、５分未満で一方の培地は抜取られおよび他方の培地はカラムに装填される。金属分析に対しては沈降した流出液を流入培地と比較する。嫌気的段階の開始におけるカラム中の残りのリン酸を試料採取するため、培地の試料はサンプリング管に留まっている液体を洗浄するのを確実にするためサンプリング管を介して培地１０−１５ｍｌを最初に抜き取り、次にさらにサンプル５ｍｌを抜き取りそして遠心分離にかけそして上澄みの分析をして；これを流出液の上澄みのリン酸と比較する。実験例１（比較実験−細胞のない溶液中の金属リン酸塩の無機的沈澱）硝酸ランタン（１ｍＭ）および硝酸ウラニル（１ｍＭ）を無機リン酸（Ｋ₂ＨＰＯ₄として）の０．５ｍＭの存在下で嫌気的条件を確実にするため窒素を泡立たせながら培地４中でインキュベートする。所定の間隔で、試料を取り出し、遠心分離し（１２０００ｒｐｍ，５分間）および上澄みを残っているリン酸および金属イオンについて分析する。図１ａはリン酸ランタンの沈澱による、溶液からのランタンの迅速な損失を示す。しかしながら沈澱は微細でおよび遠心分離なしでは懸濁物中に残る。図１ｂはウラニルイオン（ＵＯ₂ ²⁺）は遠心分離により懸濁物から除去できる沈澱を容易に生成しないことを示す。実験例２（リン酸−除去活性汚泥によるリン酸の放出および金属除去）未加工の活性汚泥または所謂「混合液（Mixed liquor ）」を「ホストリップ（Phostrip）」法を操作する栄養プラントから入手する。混合液の懸濁された固体の総量（total suspened solids of mixed liquor）は６．４３ｇ／ｌである。２つの自動操作反応器のそれぞれに接種するために混合液３５０ｍｌを使用する。これを培地４の５０ｍｌでいっぱいに満たし（添加される金属なしに）、そして最初の嫌気的段階のインキュベーションを開始する。反応器は最初に金属のない流入培地４中で操作され、次に酢酸カドミウムまたは酢酸鉛（０．２ｍＭ）または硝酸ランタン（０．５ｍＭ）を以下の表１および表２に示すように添加する。上記の表１および表２に示された結果は添付された図２ａおよび図２ｂにそれぞれ図表化される。実験例３（カルチャーコレクション菌株アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus ）ＮＣＩＭＢ１０６９４との比較における活性汚泥から単離されたＷ６およびＷ９菌株のポリリン酸貯蔵能力の比較）上記で記載したように細胞を生育させそして収集する。約１．０ｇ（湿重量）の細胞を含む細胞懸濁物を予め作成したパーコール密度勾配に導入し９０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。公知の密度のマーカービーズに対して決定されるそれらの密度（特定の重力加速度）によって細胞はバンドを形成し（より多くのポリリン酸＝より高い細胞密度）；３０℃における続くインキュベーションの間にポリリン酸は分解しおよび細胞のバンドは細胞がより少ない密度になるように勾配を上に移動することが見られる。密度の減少分は嫌気的条件下で容易に分解できる短鎖ポリリン酸の測定値である。 48-74 hのインキュベーション菌株初期密度後の密度１０６９４ 1.050-1.075 1.033-1.035 Ｗ６ 1.098-1.110 1.065-1.069（２個体群）Ｗ９ 1.095 1.045実験例４（アシネトバクター・カルカオセテチカスNCI MB 10694の細胞懸濁液によるランタンの除去）２４時間生育後、０．３７０の光学細胞濃度（ＯＤ₆₀₀）であるアシネトバクター・カルカオセテチカスNCIMB 10694の培養を収集する。得られた細胞ペレットの湿重量は２．２４３ｇでありそしてこれを総容量６ｍｌ中に再度懸濁する。懸濁液１ｍｌを、以下の溶液をおのおの１０ｍｌ含む試験管に加える。試験管１１ｍＭ硝酸ランタンを含む培地４；好気的にインキュベートする試験管２および３１ｍＭ硝酸ランタンを含む培地４；嫌気的にインキュベートする試験管４金属を含まない培地４；嫌気的にインキュベートする試料は上に記載されたように分析する。図３ａは好気的条件下ではなく嫌気的条件下で放出されたリン酸を示す：ランタンを含む試験管では明確により少ないリン酸が放出される。図３ｂではまたリン酸放出に伴う試験管２および３のランタンの損失を示す。著しいランタンの除去は好気的条件下の試験管１では見出されず、金属の受動バイオソープシヨン（pa ssive biosorption）はほとんどない。実験例５（Ｗ９菌株の細胞懸濁液によるランタン除去）２４時間生育後、細胞密度（ＯＤ₆₀₀）１．０００であるＷ９菌株の培養を収集する。得られた細胞ペレットの湿重量は５．３２９ｇでありそしてこれを総容量６ｍｌ中に再度懸濁する。懸濁液１．５ｍｌを以下の溶液をおのおの２０ｍｌ含む試験管に加える。試験管１および２０．７ｍＭ硝酸ランタンを含む培地４；嫌気的にインキュベートする試験管３および４金属を含まない培地；嫌気的にインキュベートする試料は上に記載されたように分析する。図４は１２０分後放出されたリン酸の急な損失に付随するランタンの損失およびランタンの存在下でのリン酸放出の明らかな減少を伴う、嫌気的条件下で放出されたリン酸およびランタンの除去を示す。２１０分後に観察されるランタン濃度の減少（０．４ｍＭ−０．５ｍＭ）は対照試験管の０．４−０．５ｍＭリン酸の放出と一致する。実験例６（単離Ｗ６の細胞懸濁液によるランタン除去）２４時間生育後、細胞密度（ＯＤ₆₀₀）０．７９０であるＷ６菌株の培養を収集する。得られた細胞ペレットの湿重量は３．８ｇでありそしてこれを総容量６ｍｌ中に再度懸濁する。懸濁液１．５ｍｌを以下の溶液をおのおの２０ｍｌ含む試験管に加える。試験管１および２０．８ｍＭ硝酸ランタンを含む培地４；嫌気的にインキュベートする試験管３および４金属を含まない培地４；嫌気的にインキュベートする試料は上に記載されたように分析する。図５は６０分後に開始されたランタンの損失および放出されたリン酸の急な損失を伴う、嫌気的条件下で放出されたリン酸およびランタンの除去を示す。対照試験管の０．７−０．８ｍＭリン酸の放出が検出されたとき、０．７−０．８ｍＭランタンの完全除去が起こることは注目すべきである。実験例７（Ｗ９菌株の固定化細胞によるカラム中のカドミウムおよび鉛の除去）菌株Ｗ９の培養を生育させ上記に記載したように収集し平均１ｍｍ径のアガロースビーズに固定化する。ビーズをおおよそ１カラム当たり湿重量５ｇを加えるバイオマス（ゲル化材料１００ｇ）とともに予め殺菌した第一および第二カラムに入れるが、しかし拡散限度（diffusional limitations）によりビーズの全ての細胞が固定化された培養に見出される生理学に寄与するのではないと予想される；例えば表面における酸素に対する拡散限度値（diffusional limits）は５０ μｍが通常とられる。カラムは金属の導入前に金属の不在下で嫌気的／好気的周期を８日間受ける。連続７日間にわたり嫌気的段階につき第一のカラムは約０．２ｍＭの酢酸鉛を入れ、そして第二のカラムは０．２ｍＭの酢酸カドミウムを入れる。試料を上記に記載したように分析する。以下の表３および図６は第一カラムの流入および流出液中の放出されたリン酸および測定された鉛を示す。以下の表４および図７は第二カラムの流入および流出液中の放出されたリン酸および測定されたカドミウムを示す。実験例８（Ｗ６菌株の固定化細胞による自動操作反応器におけるランタンおよびウランの除去Ｗ６菌株の培養を成育させそして上述したように収集し、寒天中に固定化しそしてゲルを細かく刻んでおおよそ１ｍｍ×１ｍｍ×１０ｍｍの小片を得る。おおよそ１カラムに付５ｇ湿重量細胞を加えるバイオマス（ゲル化材料１００ｇ）とともにこの小片は予め殺菌された第一および第二のカラム反応器におかれる。カラムは金属が導入される前に７日間金属なしで嫌気的／好気的周期を受け；最初に両方の反応器に０．５ｍＭの硝酸ランタンを入れ、次に第一の反応器にはランタンを続けて入れ他方第二の反応器は０．５ｍＭの硝酸ウラニルを入れる。試料を上記に記載したように分析する。実験の終了において反応器が排出された場合、反応器の底のガラスビーズ上にバイオフィルム（biofilm）が生成されることが注目される。第二反応器中のゲル化した材料およびビーズ上のバイオフィルムの試料は淡黄色に着色し（リン酸ウラニルは黄色である）およびＵＶ線で蛍光に見える（リン酸ウラニルの純結晶が示すように）。ゲル化した材料およびビーズの一部をアセトン中で激しく浸透して表面のバクテリアおよび結晶性沈澱物を取り除く。試料をアセトンで脱水し、蒸発させ、およびＸ線回折により分析する。以下の表５および図８は第一反応器の流入および流出液中の放出されたリン酸および測定されたランタンを示す。表６および図９は第二反応器の流入および流出液中の放出されたリン酸および測定されたランタンを示す。図１０および図１１は好気的段階における沈澱された金属の可溶化が殆どないことを示す。図１２は第二反応器からの試料のＸ線回折パターンにより得られたスペクトルがＨ₂（ＵＯ₂）₂（Ｐ０₄）₂・８Ｈ₂Ｏに対して報告されたスペクトル（Ross(1955) ，Am．Mineral 40； 917-919）と一致することを示す。１０個の最強の回折ピークに対するｄ値はそれぞれＨ₂（ＵＯ₂）₂（ＰＯ₄）₂・８Ｈ₂Ｏのピークの０．０３Åの範囲内にある。このことは試料がＨ₂（ＵＯ₂）₂（ＰＯ₄）₂・８Ｈ₂Ｏの結晶物質を含むことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 3/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者マカスキー，リン，エレーンイギリス国，オーエックス３９イーダブリュー，オックスフォード，ヘディントン，ノースフィールドロード 40

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリリン酸−蓄積微生物がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を合成および利用できる条件下での培地で該微生物を培養する段階；ＡＴＰ合成／利用を変更し、それにより上記微生物が代替エネルギー源としてポリリン酸を利用してリン酸イオンの製造する段階；および上記リン酸イオンを金属イオンと反応させて金属リン酸塩を沈澱させる段階のからなる１種またはそれ以上の金属イオン水から除去する方法。２．上記培養段階が好気的に行われおよび上記ＡＴＰ合成／利用変更段階が好気的条件から嫌気的条件に変更することにより行われることを請求項１に記載の方法。３．上記反応段階が好気的培養段階後に上記１種またはそれ以上の金属イオンを含む水を導入することにより行われる請求項２に記載の方法。４．上記微生物がアシネトバクター（Acinetobacter）属の細菌である請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。５．上記微生物がアシネトバクター種Ｗ６（ＮＣＩＭＢ４０５９４）またはアシネトバクター種Ｗ９（ＮＣＩＭＢ４０５９５）のポリリン酸−蓄積特性を有する、請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。６．上記培養段階が上記微生物を含む活性汚泥の存在下で行われる請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。７．上記１種またはそれ以上の金属がカドミウム、鉛、銅、マンガン、コバルト、ニッケル、カルシウム、ストロンチウム、イットリウム、ウラン、ランタン、ランタニド類、プルトニウム、アメリシウムおよびネプツニウムである請求項１ないし６いずれかに記載の方法。８．１種またはそれ以上の金属を含む水の存在下で酵素的に開裂するポリリン酸を蓄積して、金属リン酸塩を沈澱させるように上記水中で上記金属（類）と反応させるリン酸イオンを製造するための、１種またはそれ以上のポリリン酸−蓄積微生物の使用法。９．金属リン酸塩（類）として沈澱により溶液から金属（類）を除去するための、ポリリン酸の開裂において製造されるリン酸イオンの使用法。１０．酵素的に仲介された金属生体蓄積化または生体鉱物化による金属蓄積のためのリン酸の主な原料としてのポリリン酸の使用法。