JPH08503129A

JPH08503129A - オピオイド受容体活性を有する新規ポリペプチド、それらポリペプチドをコードする核酸ならびに使用

Info

Publication number: JPH08503129A
Application number: JP6511503A
Authority: JP
Inventors: ブリジツトキーフアー，
Original assignee: ユニベルシテ・ルイ・パストウール
Priority date: 1992-11-10
Filing date: 1993-11-08
Publication date: 1996-04-09
Anticipated expiration: 2019-12-15
Also published as: US7297771B2; CA2149056A1; WO1994011500A1; FR2697850A1; JP3601604B2; US20040096940A1; US6562587B1; FR2697850B1; DE69333803T2; EP0672139B1; ATE294861T1; EP0672139A1; DE69333803D1

Abstract

(57)【要約】オピオイド受容体活性を有する新規ポリペプチド、それを発現する遺伝物質、該ポリペプチドを発現する任意の組換え細胞およびそれらの使用。

Description

【発明の詳細な説明】オピオイド受容体活性を有する新規ポリペプチド、それらポリペプチドをコードする核酸ならびに使用本発明は新規ポリペプチド、およびそれを発現させることができる遺伝物質に関する。より詳細にはオピオイド受容体活性を有する新規ポリペプチドに関する。オピオイド受容体は長い間、アヘンのアルカロイド誘導体の鎮痛作用を媒介する神経系の膜受容体として知られて来た。これら受容体およびその前駆体の内因性リガンドは特性が決定され、そしてその疼痛およびストレスに対する役割は広く研究されてきた（Akilら、（1984）Annu.Rev.Neurosci.7,223-255）。さらに薬理学的研究によりオピオイド受容体の３つのサブタイプ、ミュー（モルフィン）、デルタ（エンケファリン）およびカッパ（ダイノルフィン）の存在が明らかになった。同研究で、これら受容体の細胞活性に対する阻害作用はＧタンパク質の活性化に関連していることが実証された（Simonds,W.F.（1988）Endocrine Re v.9,200-212）。これらの理由から現在ではこれら受容体はＧタンパク質と相互作用する受容体の一族に分類され、その一族は受容体が７つのトランスメンブランドメインを保有し、そして既知の受容体の約８０％を包含するクラスである。様々な研究室でオピオイド受容体をコードする遺伝子をクローン化する試みがなされて来た。特にミュー型の選択性でオピオイドに結合するタンパク質が雄ウシの脳から精製され、そして部分的に配列決定された。次にこの部分配列由来のヌクレオチドプローブを使用してｃＤＮＡを単離した。しかしこの配列から推定されるタンパク質はトランスメンブランドメインを保有せず、そしてＮＣＡＭ（接着分子）と高度な相同性を表す（Sc hofieldら、（1989）EMBO J.8,489-495）。さらに最近では別のｃＤＮＡの単離について記載され（Xieら、（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89.4124-4128）、これはクローニングの発現により得られた。このｃＤＮＡライブラリーはカッパサブタイプのみを発現するヒト胎盤から構築され、そして主にアフィニティー法によるダイノルフィンのペプチド誘導体を使用してスクリーニングされた。しかしこのタンパク質はオピオイドリガンドに対して比較的弱い親和性を有し、いかなるサブタイプ特異性も表さず、そして最終的にニューロメジンＫに関する受容体に極めて似ているように思われる。結局、Ｇタンパク質にカップルする受容体との相同性に基づいたＰＣＲ法によりオピオイド受容体をクローン化するすべての試みは無になっている。本発明は初めてオピオイド受容体をコードする遺伝子のクローニングを開示する。また本発明は初めてオピオイド受容体の配列およびその組換え細胞によるそれらの発現を開示する。こうして、本発明によりオピオイド受容体の構造に関してより正確な理解を得ることができ、そしてより詳細にその作用機構を研究することができるようになる。本発明では極めて高純度のオピオイド受容体を多量に得ることができるので、これにより機能的および薬理学的研究の実施、抗生物質の製造等が可能となる。本発明により特定な大きさのオピオイド受容体断片、ならびにすべての種類のオピオイド受容体誘導体を調製することも可能になる。本発明はこれらリガンドをスクリーニングするために使用できるオピオイド受容体およびオピオイド受容体断片（作用薬、拮抗薬、モジュレーター等）を発現する組換え細胞も供給する。本発明のＤＮＡ配列は生物的試料中からオピオイド受容体の発現の不規則性（非−発現、突然変異、多型性など）を検出できるプローブを作成することを可能にする。これらのプローブは、種々の起源の組織、および特に以下に記載するヒト起源の組織を使用する、オピオイド受容体をコードする任意の他のｃＤＮＡのハイブリダイゼーションクローニングについても使用できる。したがって本発明の第一の主題はオピオイド受容体活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。本発明にいう、オピオイド受容体には、特にデルタ、ミューおよびカッパサブタイプが含まれる。好ましくは本発明はデルタオピオイド受容体活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。さらに好ましくは本発明によるヌクレオチド配列は次の中から選択される：（ａ）配列番号１の全部または部分のヌクレオチド配列、あるいはその相補鎖、（ｂ）（ａ）にハイブリダイズし、かつオピオイド受容体活性を有するポリペプチドをコードするいずれかの配列、ならびに（ｃ）遺伝暗号の縮重に起因する配列（ａ）および配列（ｂ）に由来する配列。本発明の特に特別な態様は、配列番号１の全部または部分を含んで成るヌクレオチド配列により、あるいはその相補鎖により代表される。本発明の種々のヌクレオチド配列は、人工的であってもなくてもよい。それらはゲノム性、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ配列、ハイブリッド配列あるいは合成または半合成の配列であることができる。これらの配列は例えばＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー）を、配列番号１の配列を基に開発されたプローブでスクリーニングすることにより得ることができる。そのようなライブラリーは種々の起源の細胞から、当業者に周知の標準的な分子生物学的技法を使用して調製することができる。本発明のヌクレオチド配列は特にホスホルアミダイド法を使用する化学合成により調製することもでき、あるいはライブラリーをスクリーニングすることにより得た配列を化学的または酵素的に修飾する混合法を使用しても調製できる。本発明のヌクレオチド配列はオピオイドポリペプチドを生成するために使用できる。オピオイドポリペプチドという用語は、オピオイド受容体活性を有するすべてのポリペプチドおよびそのようなポリペプチドのすべての断片または誘導体を表す。オピオイドポリペプチドを生成するために、該ポリペプチドをコードするその部分は一般的にそれを宿主細胞で発現可能とするシグナルの制御下に置かれる。これらのシグナル（プロモーター、ターミネーター、等）の選択は使用する宿主細胞により変化する。このために、本発明のヌクレオチド配列は自律的に複製または組込むことができるベクターの一部であることができる。さらに具体的には、自律的に複製するベクターは選択した宿主中で確実に自律的に複製する配列を使用して調製できる。組込みベクターに関しては、例えば宿主の特定領域と相同的な配列を使用して調製でき、これによりベクターの相同的組換えによる組込みが起こることを可能にする。組換え経路を介して本発明のオピオイドポリペプチドを生産するために使用できる宿主細胞は、真核宿主ならびに原核宿主である。挙げることができる適当な真核宿主は動物細胞、酵母細胞または真菌である。特に酵母に関してはサッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、シュワンニオミセス（Schwanniomyces）またはハンゼヌラ（Hansenula ）属を挙げることができる。動物細胞に関して挙げることができるのは、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞などである。より特別に挙げることができる真菌はアスペルギルス（Aspergillus）ssp.またはトリコデルマ（Trichoderma）ssp.である。原核宿主として以下のイー．コリー（E.Col i ）、バチルス（Bacillus）またはストレプトミセス（Streptomyces）の使用も好ましいことが明らかにされている。本発明のヌクレオチド配列は薬理学的領域においても使用でき、遺伝子治療を目的とした範囲内で使用しうるアンチセンス配列の調製、あるいはさらに、ハイブリダイゼーション実験による生物学的試料中のオピオイド受容体の発現を検出、あるいは遺伝的異形（多型性または突然変異）または異常発現の実証のいずれかを可能にするプローブの調製に使用することもできる。アンチセンス配列による一定の遺伝子の発現阻害は、遺伝子活性を制御するにめに有望な戦略であると判明した。アンチセンス配列はその転写産物が所定の遺伝子のコーティング鎖に相補的であり、そしてこの理由のためその転写産物は転写されたｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができ、これによってそのタンパク質への翻訳を阻害する配列である。したがって、本発明はすでに記載したようにオピオイドポリペプチドの生産を少なくとも部分的に阻害することができるアンチセンス配列に関する。そのような配列は上記定義のヌクレオチド配列の全部または部分から構成することができる。一般的にそれらは本発明のペプチドをコードする配列に相補的な配列、または配列の断片である。そのような配列は配列番号１の配列から例えば断片化等、または化学合成により得ることができる。上記に示したように、本発明は上記定義の本発明のオピオイドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または対応するｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる合成または非−合成ヌクレオチドプローブを調製することを可能にする。そのようなプローブはインビトロでオピオイド受容体の発現を検出するための、または遺伝的異形（誤ったスプライシング、多形性、点突然変異等）を検出するための診断用の道具として使用できる。オピオイド受容体の内因性リガンドの多様な活性を考慮すると、本発明のプローブは神経的、心血管的、または精神的影響を同定することを可能にする。これらのプローブはまた、上記定義のオピオイドポリペプチドをコードする相補的な核酸配列を検出するために使用でき、そして他の細胞源から、好ましくはヒト起源の細胞からそれら核酸配列を単離するために使用できる。本明細書はデルタ型の受容体にてより具体的に説明されているが、文献に記載された生化学的および免疫学的研究は明らかにオピオイド受容体が有意な程度の相同性（同じ分子量、同じ抗体に対する交差反応性など）を有することを示している。本発明のプローブは一般的に少なくとも１０塩基を含んで成り、そしてそれらは最高で配列番号１の全部、あるいはその相補鎖を含んで成ることができる。好ましくはこれらのプローブは使用前に標識される。この目的のために、当業者に周知の様々な技法（放射線標識、酵素的標識など）を使用できる。これらのプローブを使用できるハイブリダイゼーション条件は以下の、ならびに実施例の一般的なクローニング法に示されている。本発明はまた前記定義のヌクレオチド配列の発現により生じたすべてのポリペプチドに関する。好ましくはポリペプチドは配列番号２のペプチド配列の全部または一部、あるいはそれらの誘導体を含んで成る。本発明の意味において、誘導体という用語は配列番号２のペプチド配列の遺伝的および／または化学的修飾により得られる任意の分子を表す。遺伝的および／または化学的修飾とは、１つ以上の残基の任意の突然変異、置換、欠失、付加および／または修飾を意味すると理解されている。そのような誘導体は、例えば特にペプチドのそのリガンド（１つまたは複数）に対する親和性の増大、その生産レベルの上昇、そのプロテアーゼに対する耐性の増強、および／またはその活性の修飾、あるいはペプチドに新規薬理学的動態および／または生物的特性の付加、のような様々な目的のために作成できる。付加から生じた誘導体で挙げることができる例は、一方の末端にさらに連結した異種部分を含んで成るキメラポリペプチドである。誘導体という用語は、他の細胞起源から派生した、特にヒト起源の細胞から派生した、または他の生物から派生しており、かつ同じ種類の活性を保有する配列番号２のポリペプチドに相同ポリペプチドも包含する。そのような相同ポリペプチドは実施例に記載されるようなハイブリダイゼーション実験により得ることができる。好ましくは本発明のポリペプチドはモルホリン（ミュー型受容体）、エンケファリン（デルタ型受容体）またはダイノルフィン（カッパ型受容体）に結合する能力を有するポリペプチドである。さらにいっそう好ましくは、ポリペプチドはエンケファリン（デルタ型受容体）に結合する能力を有するポリペプチドである。さらに好適な態様によれば、本発明のポリペプチドは完全な配列番号２のペプチド配列を認識する抗体により認識されることができるものである。このような性質の抗体は、当業者に周知である任意の方法により、本発明で抗原として記載されたポリペプチドを使用して生成できる。実施例に示すように、これらのポリペプチドは機能的オピオイド受容体を形成するために種々の細胞型中で発現させることができる。本発明のポリペプチドは当業者に周知である任意の方法を使用して上記ヌクレオチド配列を宿主細胞中で発現させることにより、配列番号２の配列に基づき化学合成することにより、あるいはこれらの技術の組み合わせにより得ることができる。本発明は細胞表面上でオピオイド受容体活性を有するポリペプチドを発現できる組換え細胞に関するものでもある。これらの細胞は上記ヌクレオチド配列を導入し、そして該細胞を該配列が発現する条件下で培養することにより得ることができる。本発明による組換え細胞は真核細胞または原核細胞のいずれかであることができる。挙げることができる適当な真核細胞は動物細胞、酵母細胞または真菌である。酵母について特に挙げることができるのはサッカロミセス（Saccharomyces ）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、シュワンニオミセス（Schwanniomyces）またはハンゼヌラ（Hansenula）属である。動物細胞に関して挙げることができるのはＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞などである。特に挙げることができる真菌はアスペルギルス（Aspergillus ）ssp.またはトリコデルマ（Trichoderma）ssp.である。原核宿主として以下のイー．コリー（E.Coli）、バチルス（Bacillus）またはストレプトミセス（Stre ptom yces ）の使用も好ましいとされる。このようにして得た細胞はオピオイド受容体のリガンドとして、または活性のモジュレーターとして挙動する種々の分子の能力を測定するために使用できる。より具体的には、それらはオピオイド受容体活性のリガンドまたはモジュレーター（そしてより好ましくは作用薬および拮抗薬）を検出または単離するための方法において使用できる。したがって、本発明はオピオイド受容体のリガンドを検出および／または単離するための方法にも関し、それによれば以下の工程が行われる： −未だ同定されていなくてもよい１つの分子または種々の分子の混合物を、細胞表面上でオピオイド受容体活性を有するポリペプチドを発現する細胞である上記組換え細胞と、もし該分子が該ポリペプチドに対する親和性を有するならば、該ポリペプチドと該分子との間の相互作用が可能な条件下で接触させ、そして −該ポリペプチドに結合した分子を検出および／または単離する。特別な態様では、本発明の方法はデルタオピオイド受容体に関するエンケファリンの作用薬および拮抗薬を検出および／または単離するために応用される。本発明はまたオピオイド受容体のモジュレーターを検出および／または単離するための方法に関するものであり、それによれば以下の工程が行われる： −未だ同定されていなくてもよい１つの分子または種々の分子の混合物を、細胞表面上でオピオイド受容体活性を有するポリペプチドを発現する細胞である上記組換え細胞と、該受容体の内因性リガンドの存在下で該ポリペプチドとそのリガンドとの間の相互作用が可能な条件下で接触させ、そして −該ポリペプチドに対するリガンドの活性をモジュレートできる分子を検出および／または単離する。特別な態様では、本発明の方法はデルタオピオイド受容体に関するエンケファリンの活性のモジュレーターを検出および／または単離するために応用される。本発明はまた上記記載の方法により同定および／または得られるリガンドまたはモジュレーターの医薬品としての使用に関する。なぜならばそのようなリガンドまたはモジュレーターはオピオイド受容体と関連した特定の疾患の治療を可能にするからである。特に、オピオイド受容体は鎮痛効果を媒介するので、これら受容体の作用薬は疼痛感を減少するために使用できる。さらににれらの受容体はアヘン誘導体の効果の媒介体であるので、それらの拮抗薬は中毒症状を回復させる治療目的で使用できる。本発明はまた本発明の受容体に作用する少なくとも１つの分子を有効成分として含むすべての医薬品に関する。好ましくはこの分子はすでに記載した方法により同定および／または単離されたリガンドまたはモジュレーターである。本発明の他の利点は、制限することを意図していない説明的な以下の実施例を読むことにより明らかになるだろう。図表第１図：Ｋ５６受容体を発現しているＣｏｓ−１細胞の膜に対する³Ｈ−ＤＴＬＥＴの結合曲線。膜を１μＭのナロキソン（−）の有無にて、図のようにリガンド濃度を増加させてインキュベーションした。特異的結合が表される。挿入図は結果のスキャッチャード（Scatchard）分析である。第２図：濃度を増加させた競合剤の存在下で、Ｋ５６受容体を発現しているＣｏｓ−１細胞膜に対する³Ｈ−ＤＴＬＥＴの結合曲線。第３図：濃度を増加させた競合剤の存在下で、Ｋ５６受容体を発現しているＣｏｓ−１細胞膜に対する³Ｈ−ＤＴＬＥＴ（１ｎＭ）の結合曲線。表１：Ｋ５６受容体の薬学的プロフィール。結果はＫ５６受容体を一時的に発現しているＣｏｓ−１細胞膜に対する³Ｈ−ＤＴＬＥＴの結合についての競合実験に関する。ＩＣ５０値（５０％の結合した³Ｈ−ＤＴＬＥＴが置き換わるために必要なリガンド濃度に対応する）は実験的に定め、そして以下の式に従いＫｉに転換した：Ｋｉ＝ＩＣ（５０）／（１＋Ｌ／Ｋｄ）、式中Ｌは³Ｈ−ＤＴＬＥＴの濃度であり、そしてＫｄは³Ｈ−ＤＴＬＥＴの解離定数である。各値は３回の独立した実験の平均を表す。一般的クローニング法分子生物学の標準的技法（プラスミドＤＮＡの調製的抽出、塩化セシウム勾配中でのプラスミドＤＮＡの遠心、アガロースまたはアクリルアミドゲル中での電気泳動、電気的溶出によるＤＮＡ断片の精製、フェノールまたはフェノール／クロロホルムでのタンパク質の抽出、エタノールまたはイソプロパノールを使用する生理食塩媒質中でのＤＮＡ沈殿、大腸菌中への形質転換等のような）は当業者には周知であり、そして文献に豊富に記載されている［Maniatis T.ら、“モレキュラークローニング、アラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning,a Laborat ory Manual）”、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harb or Laboratory）、コールドスプリングハーバー、N,Y.,1982;Ausubel F.M.ら、（編集）、“分子生物学の現在の方法（Current Protocols in Molecular Biolo gy）”、ジョンウイリーアンドサンズ（John Wiley ＆ Sons）、ニューヨーク、1987］。ライゲーションに関してはＤＮＡ断片をアガロースまたはアクリルアミドゲルによりそれらの大きさに従い分離し、フェノールまたはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿し、そして次にファージＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で供給元の推薦条件に従いインキュベーションする。突出している５’末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で供給元の推薦条件に従い満たす。突出している３’末端をファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼの存在下で製造元の推薦条件に従い使用して破壊する。突出している５’末端をＳ１ヌクレアーゼで注意深く処理することにより破壊する。合成オリゴデオキシヌクレオチドを使用するインビトロの部位−特異的突然変異誘発法は、Taylorら［Nucleic Acids Res.13（1985）8749-8764］により開発された方法により従い行う。ＤＮＡ断片の酵素的増幅はＰＣＲ［ポリメラーゼ−触媒連鎖反応（Polymerase -catalysed chain reaction）、Saiki R.K.ら、Science 230（1985）1350-1354; Mullis K.B.およびFaloona F.A.,Meth.Enzym.155（1987）335-350］と呼ばれる方法を使用して行う。ヌクレオチド配列はSangrら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,（1977）5463-5467 ］により開発された方法を使用して確認する。ハイブリダイゼーション実験に関するストリンジェンシー条件は上記のManiat is T.ら、に基づく。１．マウスデルタオピオイド受容体の単離この実験ではクローニングの発現でｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりマウスデルタオピオイド受容体をコードするクローンＫ５６の単離を記載する。１．１．ライブラリーの構築ｃＤＮＡライブラリーはハイブリドーマＮＧ１０８−１５（Klee,W.A.およびN irenberg,M.（1974）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71,3474-3477）から、哺乳類の一過性発現ベクターｐＣＤＭ８（Aruffo,A.およびSeed,B.（1987）Proc.Natl.Acad .Sci.USA 84,8573-8577）を使用して構築した。このために、ＮＧ１０８−１５細胞［B.Foucaud（URA 1836、ファカルテデファマシー（Faculte de Pharma cie）、ストラスボーグ、仏国）から供給された］を５０％コンフルエンスで回収し、ＲＮＡをこれらの細胞から塩化リチウムおよび尿素の存在下で沈殿させて抽出し（Auffrayら、（1980）Eur.J.Biochem.107,303-314）、そしてｐｏｌｙＡＲＮＡをoligo（dT）カラム（ファルマシア：Pharmacia）で精製した。次にｃＤＮＡライブラリーは大腸菌を宿主として使用して、Kieffer（1991,Gene109,11 5-119）に記載された技術を使用してベクターｐＣＤＭ８（米国、マサチューセッツ総合病院のB.Seedから得た）中に構築した。約３００，０００個の形質転換体をペトリ皿（１６ｃｍ）に、皿あたり３０００コロニーの密度で一晩培養した。次にコロニーを選択ＬＢ培地に移した。得られたうちの半分の懸濁液を３０％グリセロールの存在下で凍結保存し、そして残りをアルカリ溶解法によるプラスミドＤＮＡの調製のために使用した（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,＆ Maniatis,T.（1989）、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル（コールドスプリングハーバーラボ、コールドスプリングハーバー、ＮＹ）第二版）。各バッチから１／１０のプラスミドＤＮＡを別個にＣｏｓ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ／１６５０）に、ＤＥＡＥデキストラン法を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの最高の結果（最高２０％のトランスフェクトされた細胞）は、以下の手法を使用して得た：単層のＣｏｓ−１細胞を６ｃｍの皿に、皿あたり２．１０⁵細胞の密度でＤＭＥＭ（ダルベッコの改良イーグル培地）中で、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下かつ５％ＣＯ₂下で培養した。３７℃で１６時間後、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、pH7.4）で２回洗浄し、そして３７℃で１時間、1-10μｇ（７）ＤＮＡ、0.25mg/mlのＤＥＡＥデキストラン（ファルマシア）、10mM Tris-HCl、pH7.4から成る2ml DMEM中の溶液と一緒にインキュベーションした。細胞を次に１０％グリセロール（２ｍｌ（１）ＤＭＥＭ中）で３分間処理し、素早く５ｍｌのＰＢＳで希釈し、そしてＰＢＳで２回洗浄した。最後に細胞を３７℃にて５時間、１０％ＦＣＳおよび0.1mMのクロロキンを含有するＤＭＥＭ培地中でインキュべーションし、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で一旦洗浄し、そしてこの培地中で７２時間培養した。１．２．発現によるスクリーニング上記１．１．に記載したトランスフェクトしたＣｏｓ−１細胞を、以下のペプチドに対するそれらの結合能力について試験した：トリチウム標識（61 Ci/mmol 、ＣＥＡ、サクレ、仏国）したＴｒｙ−Ｄ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ− Ｔｈｒ（ＤＴＬＥＴ）。そのようなスクリーニング試験で弱い特異性を有するリガンドの使用はこれまでに記載されなかった。単層の細胞を０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＰＢＳの存在下で２回洗浄し、そして0.5％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充し、そして１ｎＭの³Ｈ−ＤＴＬＥＴ（２ｍＬ）を含有するＰＢＳの存在下で３７℃で３５分間、インキュベーションし、これは天然受容体のＫｄに対応する。皿を氷上で５分間冷却し、そして細胞を0.5％の冷却ＢＳＡを補充したＰＢＳで４回洗浄した。細胞を1.5mlの1.5％ＳＤＳで溶解し、そして７ｍｌのシンチレーション液体に加え、そして計数した（LS6000SC、ベックマン（Beckman））。陽性のバッチを選択培地中のグリセロール中で凍結した保存アリコートで希釈することにより分画し、そして懸濁液を寒天プレート上に上層したニトロセルロース膜に散布した。一晩培養した後に、独立したコロニーのバッチを単離するために膜断片を切り出した。これらの種々のコロニーを１０ｍｌの選択ＬＢ培地に移し、そしてＯＤ_600nmが０．５になるまで培養した。アリコートをグリセロール中で凍結し、そして残りはプラスミドＤＮＡを調製し、そしてＣｏｓ−１細胞を上記のようにトランスフェクトするために使用した。バックグラウンドが１０％を越えるシグナルを生成した最初の陽性バッチを検出した。このバッチを２５０クローンの４０バッチに分割した。これらのバッチを再度³Ｈ−ＤＴＬＥＴに結合する能力について試験した。結合³Ｈ−ＤＴＬＥＴの特異性を評価するために、このようにして分画したクローンを、オピオイド拮抗薬である冷却ナロキソン存在下でインキュベーションした。数個のクローンが２０％を越えるバックグラウンドを生成し、そしてナロキソンの存在下で消失した。これらの１つを２度分割し（３０クローンの４０バッチ、そして次に９０個の別個のクローン）、単一のクローンを導き、これをＫ５６と命名し、これはＣｏｓ−１細胞に強力な³Ｈ−ＤＴＬＥＴ結合能力を与える。特に、得られたシグナルはバックグラウンドよりも６倍大きく、ナロキソンに感受性であり、そして³Ｈ−ＤＴＬＥＴ濃度に依存している。２．クローンＫ５６が持つデルタオピオイド受容体の構造の研究クローンＫ５６は両鎖の配列がジデオキシヌクレオチド法（シークエナーゼキット（sequenase kit）、ＵＳバイオケミカルズ（Biochemicals））を使用して決定された約２．２ｋｂの挿入物を含む。このようにして得た配列は配列番号１の配列に対応する。これは単離ｃＤＮＡが３７１アミノ酸（配列番号２）から成るタンパク質をコードする１１７４ｂｐの読み取り枠を持ち、そして計算された４０８１０ダルトン（翻訳開始部位はＯＲＦの５９位のＡＴＧコドンと指定された）の分子量を有することを実証する。さらに疎水性分析によれば、このタンパク質はＧタンパク質にカップルする一族の員が持つ特徴に見られる７つのトランスメンブラン（Ｔｍ）疎水性ドメインを持つことが示される。さらにこれらタンパク質中の保存残基もＫ５６中に存在する、すなわち −ＴｍドメインIV、Ｖ、VIおよびVII中のプロリン、 −ＴｍドメインIVおよびVI中のトリプトファン、ならびに第一細胞外ループ、 −コンセンサス配列ＧＮｘｘＶ（ＴｍＩ）；ＬＡｘＡＤ（ＴｍII）；ＤＲＹ（第二細胞内ループ；およびＰＮｘｘＹ（ＴｍVII）。さらにＫ５６タンパク質は、β−アドレナリン受容体のＡｓｐ１１３残基に等しいＡｓｐ残基を１２８位に保有し、したがってこれはリガンド−結合部位を意味しているにちがいない。最後にＫ５６タンパク質の配列をＧタンパク質にカップルする受容体一族由来の他のタンパク質の配列と比較する、すなわち： −β２アドレナリン受容体、 −ニューロメジンＫに対する受容体 −ロドプシンに対する受容体、および −Ｎ−ホルミルペプチドに対する受容体。得られた最大の相同性は１０ギャップを含み３０％であった。これはスイスポートデータバンク（Swissport Deta bank）のタンパク質で得られた最も強い相同性である。３．Ｋ５６受容体の薬理学的研究実施例１で単離したＫ５６プラスミドをＣｏｓ−１細胞をトランスフェクトするために使用した。次に得られたトランスフェクトした細胞膜を調製し、そして特定の標識オピオイドリガンドに対する結合能力について試験した。塩化セシウム−精製プラスミドＫ５６（オピオイド受容体をコードする約2.2k bのインサートを含むプラスミドｐＣＤＭ８）をＤＥＡＥデキストラン法を使用してＣｏｓ−１細胞（１０ｃｍのプレート上）をトランスフェクトするために使用した。対照はｐＣＤＭ８プラスミドでトランスフェクトした細胞から成る。トランスフェクションの７２時間後、組換え細胞を回収し、そして膜を以下のように調製する：細胞ペレットを４℃で６０ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中に溶解し、次に均一化し、そして１１００ｇで１０分間遠心する。引き続きペレットを３０ｍｌの同じ緩衝液に２度目の溶解を行い、そして均一化および遠心する。第二上清を混合し、そして１１０，０００ｇで１５分間遠心する。膜状ペレットを次に５ｍｌの同一緩衝液に溶解し、アリコートに分け、そして−８０℃に保存する。飽和結合実験および競合実験をこれらの膜について種々のリガンドの存在下で行った。このために、膜試料を（１５−３０μｐｇのタンパク質）を３７ ℃で３０分間、³Ｈ−ＤＴＬＥＴの存在下で、競合物の有無にて、最終容量が１ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH 7.4）；１０ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中にてインキュベーションした。反応を続いてワットマン（Whatman）ＧＦ／Ｇフィルターを通過させる真空濾過により停止し、続いて３回３ｍｌの冷却緩衝液で洗浄した。Ｋｉ値はChengおよびPrussofの式を使用して得た：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｌ／Ｋｄ）。放射線活性はβ−カウンターを使用して測定した。３．１．トランスフェクトしたＣｏｓ−１細胞に関するＤＴＬＥＴの親和性トランスフェクトしたＣｏｓ−１細胞に関するＤＴＬＥＴの親和性を上記操作の一般的条件を使用して測定した。膜を³Ｈ−ＤＴＬＥＴの濃度を増加させ、ならびに１０^-6Ｍ（−）ナロキソンの不在（全結合）または存在下（非−特異的結合）でインキュベーションした。特異的結合は全結合と非−特異的結合間の差に対応する。得られた結果はプラスミドＫ５６でトランスフェクトしたＣｏｓ−１細胞の場合には高い特異的結合が観察され、一方対照細胞（プラスミドｐＣＤＭ８でトランスフェクトしたＣｏｓ−１細胞）由来の膜の場合には特異的結合はごくわずかである（第１図を参照にされたい）。デルタオピオイド受容体を天然に発現するＮＧ１０８−１５細胞膜に対する結合を比較として与える。特異的結合のスキャッチャード分析では、外見上の解離定数がＫｄ＝１．４ｎＭ；およびＢｍａｘが膜調製物に依存してタンパク質１ｍｇあたり３．９から６．４ｐｍｏｌの間である単一種類の受容体の存在が示される（第１図）。トランスフェクション効率（約１０％）を考慮すると、本発明のオピオイドポリペプチドがトランスフェクトしたＣｏｓ−１細胞中で発現するレベルは、５．１０⁶分子／細胞と推定できる。３．２競合実験競合実験のために非標識競合物の濃度を増加して存在させ、１ｎＭ濃度の³Ｈ −ＤＴＬＥＴを使用した。使用した非標識競合物は以下のとおり： −ＤＡＤＬＥ：［Ｄ−Ａｌａ²、Ｄ−Ｌｅｕ⁵］−エンケファリン、シグマ（ Sigma） −ＤＰＤＰＥ：サイクリック［Ｄ−ペニシラミン２、Ｄ−ペニシラミン⁵］ −エンケファリン、シグマ −ＤＡＧＯ：［Ｄ−Ａｌａ²、ＭｅＰｈｅ⁴、Ｇｌｙ−ｏｌ⁵］−エンケファリン、シグマ −Ｕ５０４８８：トランス−（±）−３，４−ジクロロ−Ｎ−メチル−Ｎ− （２−［１−ピロリジニル］シクロヘキシル）ベンゼンアセトアミド、シグマ −（＋）−および（−）−ナロキソン −レボルファノールおよびデキストロールファン −ブレマゾシン、ならびに −エトニタゼン。オピオイド受容体は極めて立体選択的である。レボルファノールおよび（−） −ナロキソンは高い親和性でオピオイド受容体と結合すると知られており、一方デキストロールファンの鏡像異性体および（＋）−ナロキソンはそれぞれ実験した受容体のサブタイプに関係なく全く結合しない。２対のリガンドの存在下でＤＴＬＥＴにて行った競合実験では（ｉ）（＋）−ナロキソンは競合物ではない、（ii）１μＭのデキストロールファンは緩和な阻害を誘導し、これはこの生成物がオピオイド受容体に結合できるが、その結合親和性はレボルファノールの１０００倍低いことを示すという知見と一致する、（iii）２（−）鏡像異性体は、 δオピオイド受容体について文献に記載されたものに対応する阻害定数Ｋｉを有する（（−）−ナロキソンについては２９．５ｎＭ）そしてレボルファノールについては２０．９ｎＭ）（第２図および表１を参照にされたい）。さらに上述した他のリガンドで施した実験では、以下のことが実証された（第３図および表１を参照にされたい）： −δ作用薬、ＤＡＤＬＥおよびＤＰＤＰＥ、ならびに非−選択的作用薬ブレマゾシンは、最も効果的な競合物であり、そのＫｉ値はそれぞれ6.2、10.9および5.7ｎＭである。 −μ作用薬、エトニタゼンおよびＤＡＧＯは弱いリガンドであり、そのＫｉはそれぞれ１８００および５０５０ｎＭである、そして −κ作用薬Ｕ５０４８８は最も効果が低い競合物であり、そのＫｉは３９，１００ｎＭである。これら種々のリガンドの効力の次元は、Ｋ５６受容体がデルタオピオイド受容体に分類されることを確証するものである。そこれらの結果はまた本発明のＣｏｓ−１細胞が天然の受容体に匹敵する結合特性を有するオピオイドポリペプチドをよく発現できることも実証する。４．他の組織中の相同配列の調査配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれらの断片を別の組織中の相同配列を検出するために使用できる。ＰＣＲ、in situハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティングなどの様々な技術をこの目的に使用できる。さらに具体的にはＰＣＲによる調査のために、全ＲＮΛを調査中の種々の組織からCathalaら（DNA 2（4）（1983））に記載された方法を使用して調製する。このＲＮＡを次に逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼおよび配列番号１の配列由来の適当なプローブの存在下で逆転写および増幅に供する。このようにして得た生成物をニトロセルロースフィルターに写し取り、そしてストリンジェンシー条件を変化させてハイブリダイズさせる。これらの実験で検出した相同配列は、もちろん標準的な分子生物学的技術を使用して単離および／または増幅することができる。５．ヒト受容体のクローニング実施例１に記載した受容体に相同的なヒト受容体を、配列番号１の配列のコーディング部分に対応するプローブを使用して、ヒト胎盤ゲノムライブラリーをスクリーニングすることによりクローン化した。スクリーニングは高ストリンジェンシー条件下（５ＸＳＳＣ）５Ｘデンハーツ溶液、４０％ホルムアルデヒド，０．１％ＳＤＳ，０．０５％ＮａＰＰＩ、１００μｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ、４２℃）でハイブリダイズすることにより行った。スクリーニングの結果、ヒト相同物をコードする配列を含む２つのクローンが単離された。第１はタンパク質の始めの７７アミノ酸をコードするエキソンを、そして第２は１つが７８−１９４アミノ酸をコードし、そしてもう１つが１９５−３７２アミノ酸をコードする２つのエキソンを含んでいた。このようにして得た配列には確認されなければならない位置があるが、配列番号３に示される。配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：（Ａ）氏名：ルイパスツール大学（Ｂ）通り：１１ルーヒューマン（Ｃ）町：ストラスボーグ（Ｄ）国：仏国（Ｆ）郵便番号：６７０８５（ii）発明の名称：オピオイド受容体活性を有する新規ポリペプチド、それらポリペプチドをコードする核酸ならびに使用。（iii）配列の数：３（iv）コンピューター読み取り先：（Ａ）媒体：テープ（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃１．０、＃１．２５（ＥＰＯ）バージョン（２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：２２１９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖の数：２本鎖（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子の型：ｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル：無し（iv）アンチーセンス：無し（iv）起源：（Ａ）生物：マウス（ix）特徴（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ（Ｂ）位置５９．．．１１７７（Ｃ）他の情報：／生成物＝“デルタオピオイド受容体遺伝子” （xi）配列の記載：配列番号１：（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：３７２アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子の型：タンパク質（xi）配列の記載：配列番号２：（２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：９９９塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖の数：２本鎖（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子の型：ｃＤＮＡ（iii）ハイポセティカル：無し（iv）アンチーセンス：無し（iv）起源：（Ａ）生物：ホモサピエンス（ix）特徴（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ（Ｂ）位置１．．９９９（Ｃ）他の情報：／生成物＝“ヒトデルタオピオイド受容体の部分” （xi）配列の記載：配列番号３：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年９月２９日【補正内容】請求の範囲１．（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列の全部または部分、あるいはその相補鎖、（ｂ）配列（ａ）とハイブリダイズし、かつオピオイド受容体活性を有するすべての配列、ならびに（ｃ）遺伝暗号の縮重により配列（ａ）および（ｂ）から推定される配列、の中から選択されることを特徴とするオピオイド受容体活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。２．デルタオピオイド受容体をコードすることを特徴とする請求の範囲第１項記載のヌクレオチド配列。３．配列番号１または３のヌクレオチド配列の全部または部分、あるいはその相補鎖を含んで成ることを特徴するヌクレオチド配列。４．ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ配列、ハイブリッド配列あるいは合成または半合成配列の中から選択されることを特徴とする、請求の範囲第１ないし第３項のいずれか１項記載のヌクレオチド配列。５．上記ポリペプチドをコードする部分が宿主細胞中でそのポリペプチドを発現できるシグナルの制御下に位置していることを特徴とする、請求の範囲第１ないし第４項のいずれか１項記載の配列。６．上記請求の範囲のいずれか１項記載のヌクレオチド配列の発現の結果生成するポリペプチド。７．配列番号２または３のペプチド配列の全部または部分、あるいはそれらの誘導体を含んで成るポリペプチド。８．請求の範囲第６および７のいずれか１項記載のポリペプチドの生産を少なくとも部分的に阻害することができるアンチセンス配列。９．請求の範囲第１項または対応するｍＲＮＡの配列にハイブリダイズできるヌクレオチドプローブ。１０．オピオイド受容体の発現を検出するための、または遺伝子異形（誤ったスプライシング、多型性、点突然変異など）を検出するための、またはオピオイド受容体と関連する神経的、心血管的または精神的影響を同定するための、あるいはオピオイドポリペプチドをコードする相同核酸配列を検出および単離するための、請求の範囲第９項記載のプローブの使用。１１．オピオイド受容体活性を保有することを特徴とする請求の範囲第６または第７項記載のポリペプチド。１２．細胞表面で請求の範囲第６、７および１１項のいずれか１項記載のポリペプチドを発現することができる組換え細胞。１３．真核または原核細胞の中から選択されることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の細胞。１４．−未だ同定されていなくてもよい１つの分子または種々の分子の混合物を、細胞表面上でオピオイドポリペプチドを発現する請求の範囲第１２項記載の組換え細胞と、もし該分子が該ポリペプチドに対する親和性を有するならば該ポリペプチドと該分子との間の相互作用が可能な条件下で接触させ、そして −該ポリペプチドに結合した分子を検出および／または単離する、工程を行うことを特徴とするオピオイド受容体のリガンドを検出および／または単離する方法。１５．デルタオピオイド受容体のリガンドを検出および／または単離するための請求の範囲第１４項記載の方法。１６．−未だ同定されていなくてもよい１つの分子または種々の分子の混合物を、上記の細胞表面上でオピオイド受容体活性を有するポリペプチドを発現する請求の範囲第１２項記載の組換え細胞と、該受容体のリガンドの存在下で、該ポリペプチドとそのリガンドとの間の相互作用が可能な条件下で接触させ、そして −該ポリペプチドに対するリガンドの活性をモジュレートできる分子を検出および／または単離する、工程を行うことを特徴とするオピオイド受容体のモジュレーターを検出および／または単離する方法。１７．請求の範囲第１４ないし第１６項の方法で得ることができる、請求の範囲第６、７および第１１項に定義されたポリペプチドのリガンドまたはモジュレーター。１８．請求の範囲第１４ないし第１６項の方法により同定および／または得られたリガンドまたはモジュレーターの医薬品としての使用。１９．有効成分として請求の範囲第１１項記載のポリペプチドに作用する少なくとも１つの分子を含む医薬品。２０．上記分子が請求の範囲第１４ないし第１６項記載の方法により同定および／または単離されるリガンドまたはモジュレーターであることを特徴とする、請求の範囲第１９項記載の医薬品。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/72 8318−4ＨＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2ＪＧ 8310−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】１．オピオイド受容体活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。２．デルタオピオイド受容体をコードすることを特徴とする請求の範囲第１項記載のヌクレオチド配列。３．（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列の全部または部分、あるいはその相補鎖、（ｂ）配列（ａ）とハイブリダイズし、かつオピオイド受容体活性を有するポリペプチドをコードするすべての配列、ならびに（ｃ）遺伝暗号の縮重により配列（ａ）および（ｂ）から推定される配列、の中から選択されることを特徴とする請求の範囲第１または第２項に記載のヌクレオチド配列。４．配列番号１または３のヌクレオチド配列の全部または部分、あるいはその相補鎖を含んで成ることを特徴とするヌクレオチド配列。５．ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ配列、ハイブリッド配列あるいは合成または半合成配列の中から選択されることを特徴とする、請求の範囲第１ないし第４項のいずれか１項記載のヌクレオチド配列。６．上記ポリペプチドをコードする部分が宿主細胞中でそのポリペプチドを発現できるシグナルの制御下に位置していることを特徴とする、請求の範囲第１ないし第５項のいずれか１項記載の配列。７．上記請求の範囲のいずれか１項記載のヌクレオチド配列の発現の結果生成するポリペプチド。８．配列番号２または３のペプチド配列の全部または部分、あるいはそれらの誘導体を含んで成るポリペプチド。９．請求の範囲第７および８のいずれか１項記載のポリペプチドの生産を少なくとも部分的に阻害することができるアンチセンス配列。１０．請求の範囲第３項または対応するｍＲＮＡの配列にハイブリダイズできるヌクレオチドプローブ。１１．オピオイド受容体の発現を検出するための、または遺伝子異形（誤ったスプライシング、多型性、点突然変異など）を検出するための、またはオピオイド受容体と関連する神経的、心血管的または精神的影響を同定するための、あるいはオピオイドポリペプチドをコードする相同核酸配列を検出および単離するための、請求の範囲第１０項記載のプローブの使用。１２．オピオイド受容体活性を保有することを特徴とする請求の範囲第７または第８項記載のポリペプチド。１３．細胞表面で請求の範囲第７、８および１２項のいずれか１項記載のポリペプチドを発現することができる組換え細胞。１４．真核または原核細胞の中から選択されることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の細胞。１５．−未だ同定されていなくてもよい１つの分子または種々の分子の混合物を、細胞表面上でオピオイドポリペプチドを発現する請求の範囲第１３項記載の組換え細胞と、もし該分子が該ポリペプチドに対する親和性を有するならば該ポリペプチドと該分子との間の相互作用が可能な条件下で接触させ、そして −該ポリペプチドに結合した分子を検出および／または単離する、工程を行うことを特徴とするオピオイド受容体のリガンドを検出および／または単離する方法。１６．デルタオピオイド受容体のリガンドを検出および／または単離するための請求の範囲第１５項記載の方法。１７．−未だ同定されていなくてもよい１つの分子または種々の分子の混合物を、上記の細胞表面上でオピオイド受容体活性を有するポリペプチドを発現する請求の範囲第１３項記載の組換え細胞と、該受容体のリガンドの存在下で、該ポリペプチドとそのリガンドとの間の相互作用が可能な条件下で接触させ、そして −該ポリペプチドに対するリガンドの活性をモジュレートできる分子を検出および／または単離する、工程を行うことを特徴とするオピオイド受容体のモジュレーターを検出および／または単離する方法。１８．請求の範囲第１５ないし第１７項の方法で得ることができる、請求の範囲第７、８および第１２項に定義されたポリペプチドのリガンドまたはモジュレーター。１９．請求の範囲第１５ないし第１７項の方法により同定および／または得られたリガンドまたはモジュレーターの医薬品としての使用。２０．有効成分として請求の範囲第１２項記載のポリペプチドに作用する少なくとも１つの分子を含む医薬品。２１．上記分子が請求の範囲第１５ないし第１７項記載の方法により同定および／または単離されるリガンドまたはモジュレーターであることを特徴とする、請求の範囲第２０項記載の医薬品。