JPH08502525A - Ｃｅｔｐ阻害剤ポリペプチド、合成ポリペプチドに対する抗体、および抗アテローム性動脈硬化症治療のための予防薬および治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ポリペプチドおよびその類似体はコレステロールエステル転送蛋白質（ＣＥＴＰ）を阻害する。抗アテローム性動脈硬化症組成物は、抗アテローム性動脈硬化症に有効な量のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む。抗アテローム性動脈硬化症キットは、ポリペプチドを含む少なくとも１ユニットの組成物、少なくとも１つのシリンジおよび少なくとも１つの針を別々の容器に含む。抗体は、本発明のポリペプチド、ヒヒＣＥＴＰ４ｋＤポリペプチド阻害剤、ａｐｏＣ−１の１−３６アミノ酸Ｎ末端フラグメント、修飾ａｐｏＡ−Ｉ（ＭＷ：３１ｋＤ）、または修飾ａｐｏＥ（ＭＷ：４１ｋＤ）に対する特異性を有する。アテローム性動脈硬化症の状態の素因を有する哺乳動物において抗アテローム性動脈硬化症を予防する方法は、哺乳動物に予防上有効量の本発明のポリペプチドを投与することを含み、アテローム性動脈硬化症に罹患した哺乳動物を治療する方法は、治療上有効量の本発明のポリペプチドを投与することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＥＴＰ阻害剤ポリペプチド、合成ポリペプチドに対する抗体、 および抗アテローム性動脈硬化症治療のための予防薬および治療薬 発明の背景 本出願は、１９９１年１２月１８日に出願された出願番号第０７／８１１，０ ４９号の一部継続出願である。 本発明に至る仕事は、国立心臓、肺および血液研究所の補助金番号ＨＬ２８９ ７２およびＨＬ４１２５６号、および契約番号ＨＶ５３０３０号により一部援助 された。政府は本願特許について権利を有する。 発明の分野 本発明は、内因性ヒヒ血漿コレステロールエステル転送蛋白質（ＣＥＴＰ）阻 害剤ポリペプチドに関する。より詳細には、本発明はこのポリペプチドの同定お よび特徴付け、ならびにＣＥＴＰの阻害活性を有する新規合成ぺプチドに関する 。内因性阻害ペプチドは、分子量４，０００を有し、それぞれ分子量３１ｋＤお よび４１ｋＤを有する修飾ａｐｏＡ−１およびａｐｏＥの形態で血漿中に存在し 、ａｐｏＣ−１のＮ末端フラグメントと共通のアミノ酸配列を有する。本発明は また、抗アテローム性動脈硬化症組成物、キット、および阻害蛋白質のＮ末端ア ミノ酸配列に対して生じさせた抗体に関する。本発明の阻害ペプチド、そのフラ グメントおよびその類似体は、アテローム性動脈硬化症治療の予防薬および治療 薬として有用である。 背景の記述 アテローム性動脈硬化症は、それに付随する合併症、特に冠状動脈心疾患のた め、今日米国において最も広範な健康上の問題の１つである。早期アテローム性 動脈硬化症（主として血漿コレステロールレベルの上昇）の発症には、多くの危 険因子が関与してきている。コレステロールは心疾患の発生に極めて重大な役割 を果たしていると思われるため、ヒトの身体におけるコレステロールの合成、輸 送および代謝の研究に対して多大な注意が向けられてきた。 特に興味深いことは、血漿リポ蛋白質または血清脂質のレベルと冠状動脈心疾 患の発症の危険との関係を確立することである。高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）お よび低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）は、コレステロールを主としてコレステロール エステル（ＣＥ）の形態で運搬する。しかし、ＬＤＬコレステロールが正の危険 因子であり、ＨＤＬコレステロールがむしろより重要な負の危険因子であるとい ういくつかの兆候がある。これらのリポ蛋白質の正確な機能は完全には確立され ていないが、ＨＤＬは末梢細胞からのコレステロールの除去および肝臓へ戻す輸 送を担うようである。肝臓では身体から排出されたコレステロールの大部分が除 去される。 ＬＤＬおよびＨＤＬは、ＣＥおよびトリグリセリド等の一般にゆっくりと加水 分解される代謝産物で動脈細胞の壁のライソソームに負荷をかけることにより、 心血管疾患の発症における主要な役割を果たすと信じられている。これらの産物 は、血漿ＬＤＬにより肝臓および腸から排出される。輸送されるべき脂質の量が 、肝臓へ排出するＨＤＬの輸送能力を越える場合には、ＣＥは動脈壁等のある種 の重要な領域の細胞中に沈着するようになる。この過負荷は最後に細胞の機能を 損ない、このことが続くと細胞は死に至る。継続的な過負荷は、血管壁における 細胞破片の蓄積およびアテローム性動脈硬化症斑の形成をもたらす。一方このこ とは、影響される動脈および／または筋肉の痙攣の妨害を引き起こし、この事象 から冠状動脈心疾患または発作の兆候が現れるかもしれない。したがって、血漿 中のＨＤＬのレベルは、ヒトおよび実験動物においてアテローム性動脈硬化症を 発症する可能性と負に相関している。 ＨＤＬのレベルは個体により著しく異なることが示されているが、そのような 血漿中のレベルを制御する手段はまだ明らかになっていない。 ＣＥＴＰはＣＥをＨＤＬからＶＬＤＬおよびＬＤＬに転送し、これは血漿ＨＤ Ｌレベルの制御に重要な役割を果たしていることが示唆されている。高αリポ蛋 白血症患者には、ＬＤＬと明らかに区別される大きなＨＤＬ粒子を高レベルで有 する者があることが報告されている。これらの患者からの血漿試料は、ＣＥＴＰ 活性を欠失していることが示されている（Koizumi et al.，Atherosclerosis 58 ：175-186（1985））。家族性高αリポ蛋白血症のホモ接合患者は、ＨＤＬから ＬＤＬへのＣＥの転送が欠損していることが見いだされている（Yokoyama et al .，Artery 14: 43-51 （1986））。患者血漿からの密度ｄ＞１．２１ｇ／ｍｌの 分画は、正常ＨＤＬの実質的なＣＥＴＰ活性を立証した。しかし、ＨＤＬはＣＥ ＴＰの好ましくない（poor）基質であることが証明されている。 ある種の動物の雄親およびその子孫は、異常なリポ蛋白質パターン、例えばＬ ＤＬとＨＤＬとの中間の密度のリポ蛋白質または大きな高密度リポ蛋白質を有し ている。これらのリポ蛋白質はＨＤＬ₁、動物表現型は「高ＨＤＬ₁」と名付けら れている。例えば、高いまたは低いＨＤＬ₁のいずれかのパターンを有するヒヒ の種が知られている。ほとんどの場合、ＨＤＬ₁はＬＤＬとＨＤＬとの間の区別 されるピークとしてまたはＨＤＬピークの肩として分離され、高コレステロール 、高ラード（ＨＣＨＦ）食餌により誘導される。ＨＤＬ₁の比率は、ヒヒがコレ ステロールを含むかまたは含まない、ポリ不飽和脂質に富む食餌を与えられたと きに減少する。しかし、時には、チャウ（chow）食餌を与えられた高ＨＤＬ₁ヒ ヒに存在するＨＤＬ₁の量は低い。 いくつかの雌ヒヒにおいては、ＨＣＨＦ食餌を与えられたとき血漿ＨＤＬ₁の レベルが増加することが示されている。ＨＣＨＦ食餌を与えられたとき、ヒヒは より高い血漿ＨＤＬレベルも示す。より一般的には、ヒヒならびにヒトにおける ＨＤＬの蓄積は、ＨＤＬから超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）およびＬＤＬへの ＣＥのより遅い転送と関連する。したがって、高ＨＤＬ₁血漿レベルのヒヒは、 高αリポ蛋白血症の研究のための優れた動物モデルである。 先の研究においては、本発明の発明者の一部は、高ＨＤＬ₁ヒヒにおいてＨＤ ＬからＶＬＤＬおよびＬＤＬへのＣＥの遅い転送が観察されることを報告してい る。これは、ＨＤＬおよび中間密度リポ蛋白質（ＩＤＬ）粒子と会合しているＣ ＥＴＰ蛋白質阻害剤の存在のためであった（Kushwaha et al.，J．P．Lipid Res ．31: 965-974（1990））。ＨＣＨＦ食餌を与えられた高ＨＤＬ₁ヒヒにおけるＨ ＤＬ₁の蓄積ならびにＨＤＬからＬＤＬへのＣＥの遅い転送が報告されている。 ＳｏｎおよびＺｉｌｖｅｒｓｍｉｔにより、同様の蛋白質がヒト血漿においても 見いだされている（Son and Zilversmit，B．B．A.，795: 473-480（1984））。 ヒ ト蛋白質は分子量３１，０００を有し、トリアシルグリセロールおよびＣＥの転 送を抑制する。 ラット、豚および犬を含むいくつかの他の種が、血漿中に容易にＨＤＬ₁を蓄 積することが報告されている。クラサワら（Kurasawa et al.，（1985）上掲） は、家族性高αリポ蛋白血症を有するホモ接合患者が、ＨＤＬとＬＤＬとの間の ＣＥ転送を欠損していることを報告している（Kurasawa et al.，J．B．Biochem ．98: 1499-1408（1985））。これとは別に、ヨコヤマらは、同一の患者のｄ＞ １．２１ｇ／ｍｌの血漿分画は、正常ＨＤＬで試験したときに実質的なＣＥ転送 活性を立証したことを報告している（Yokoyama et al.，Artery 14（1）:43-51 （1986））。この患者において蓄積されるＨＤＬ粒子は、通常のＨＤＬ₂よりも 実質的に分子量が大きい。 ＨＤＬは一般に、その粒子サイズおよび密度によって副分画に分けられる。こ れらの分画には、ＨＤＬ₁、ＨＤＬ₂およびＨＤＬ₃が含まれる。ＨＤＬ₁は、最も 大きい粒子であり、通常は正常ヒトまたはヒト以外の霊長類の血漿には存在しな い。ＨＤＬ₂およびＨＤＬ₃は、ヒト血漿の正常成分である。ＨＤＬ₂は、ＨＤＬ₃ より大きく、男と女では異なる。 コレステロールの血漿レベルを変化させるために、哺乳動物においてコレステ ロールの輸送および転送を妨げる多くの試みがなされてきた。例えば次のような ものである。 米国特許第４，９８７，１５１号（Taboc）は、アシルコエンザイムＡ：コレ ステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）酵素を阻害するトリテルペン 誘導体を開示する。ＡＣＡＴは血漿中には存在しない細胞性酵素であり、細胞性 コレステロールをエステル化してＣＥを形成する。この酵素は、血漿中に存在す るＣＥ転送蛋白質（ＣＥＴＰ）とは異なる。ＣＥＴＰはＡＣＡＴとは異なりＣＥ を形成しない。そのかわりに、ＣＥＴＰは異なる血漿リポ蛋白質の間でＣＥを転 送する。 米国特許第４，６４３，９８８号（Segrest，et al）は、ＨＤＬ中のａｐｏＡ −Ｉを置換しうる両親媒性ペプチドを開示する。ａｐｏＡ−Ｉは、ＨＤＬにおい てＣＥを形成する血漿酵素であるレシチンコレステロール：アシルトランスフェ ラーゼ（ＬＣＡＴ）酵素を刺激することが知られている。血漿ＣＥＴＰは、これ と対比的に、ＨＤＬからＶＬＤＬおよびＬＤＬにＣＥを転送する。したがって、 ＣＥＴＰ酵素の機能はＬＣＡＴ酵素の機能ともまた異なる。さらに、Ｓｅｇｒｅ ｓｔらのペプチドのアミノ酸配列は本発明のＣＥＴＰ阻害剤の配列と異なる。 本発明の概要 本発明は、ＣＥ転送蛋白質（ＣＥＴＰ）の阻害活性を有する実質的に純粋なポ リペプチドに関する。 本発明はまた、 抗アテローム性動脈硬化症に有効な量の上述のポリペプチド；および 薬学的に許容しうる担体 を含む、抗アテローム性動脈硬化症組成物に関する。 さらに本発明は、 少なくとも１ユニットの上述の組成物； 少なくとも１つのシリンジ；および 少なくとも１つの針 を別々の容器に含む、抗アテローム性動脈硬化症キットに関する。 本発明はまた、 上述のポリペプチド； ヒヒＣＥＴＰポリペプチド阻害剤； ａｐｏＣ−１の１−３６アミノ酸のＮ末端フラグメント； 修飾ａｐｏＡ−Ｉ（ＭＷ：３１ｋＤ）；および 修飾ａｐｏＥ（ＭＷ：４１ｋＤ） からなる群より選択されるポリペプチドに対する特異性を有する抗体に関する。 別の態様においては、本発明はそのような状態の素因を有する哺乳動物におけ る抗アテローム性動脈硬化症を予防する方法に関し、この方法は、哺乳動物に予 防上有効量の上述のポリペプチドを投与することを含む。 本発明はまた、アテローム性動脈硬化症に罹患した哺乳動物を治療する方法に 関し、この方法は、哺乳動物に治療上有効量の上述のポリペプチドを投与するこ とを含む。 本発明の他の目的、利点および特徴は、以下の記述から当業者に明らかとなる であろう。 好ましい態様の記述 本発明は、ヒトにおけるアテローム性動脈硬化症の予防および治療に対する新 規かつ自明でない研究法を提供しようとする発明者らによる希望から発生したも のである。 コレステロールと血漿中および肝臓中のリポ蛋白質の異なる分画との会合に関 して知られていることの図式を以下に示す。 ＨＤＬ₁、ＶＬＤＬおよびＬＤＬの蓄積（↑）をもたらす代謝段階については 上述した。ＨＤＬ₂₊₃は、肝外細胞からコレステロールを集め、次にこれをＬＣ ＡＴによりエステル化してコレステロールエステル（ＣＥ）を形成し、粒子の核 に保存する。ＨＤＬは大きくなり（ＨＤＬ₁）、ａｐｏＥを取り込み粒子に達し 、この粒子はＬＤＬレセプター（ＬＤＬ−Ｒ）から肝細胞へと除去される。ＣＥ に富むＨＤＬ₁はまた、ＣＥをＶＬＤＬおよびＬＤＬに与える。これはＣＥＴＰ により媒介される。本発明により提供されるもの等のＣＥＴＰ阻害剤が存在する ため、ＣＥ転送は遅く（棒）、トリグリセリド（ＴＧ）の相互転送は生じない（ Ｘ）。したがって、トリグリセリドに乏しいＨＤＬは、肝トリグリセリドリパー ゼ（ＨＴＧＬ）の適当な基質ではない。血漿中にＣＥＴＰ阻害剤が存在するため 、 ＶＬＤＬおよびＬＤＬは肝臓では得られない。このことの結果として、次に肝臓 はＬＤＬレセプターおよび３ヒドロキシ、メチル、グルタリルーコエンザイムＡ （ＨＭＧ−ＣｏＡ）シンセターゼの産生を増加させるためにメッセージの発現を 増加させる。 肝臓におけるＬＤＬレセプターの増加により、ａｐｏＥを含むＬＤＬまたはＨ ＤＬの取り込みが増加し、このため、肝臓により多くのコレステロールが運ばれ る。ＨＭＧ−ＣｏＡシンセターゼの合成の増加により、細胞の必要性をすべて満 たすために肝臓におけるコレステロールの合成が増加する。したがって、血漿中 におけるＣＥＴＰ阻害剤の存在は、組織によるＶＬＤＬおよび／またはＬＤＬの 取り込みならびにコレステロールエステルの沈着を防止するであろう。 一般に、高レベルのＨＤＬは抗アテローム性動脈硬化症効果を有するが、一方 、高レベルのＬＤＬはアテローム発生の効果を有する。コレステロール等の水に 不溶性の化合物の血液中における循環には、粒子の形成を必要とする。不溶性成 分、例えばコレステロールエステルおよびトリグリセリドは、粒子の核に詰め込 まれ、蛋白質、リン脂質等の極性成分により取り囲まれている。これらの粒子は リポ蛋白質と称され、したがって極性外殻および非極性核を有する。核にＣＥを 含むリポ蛋白質の会合は、その大きさおよび密度に依存して、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ 、ＬＤＬおよびＨＤＬと名付けられている。 ＶＬＤＬは肝臓から分泌される最大のリポ蛋白質であり、ＶＬＤＬに含まれる トリグリセリドが動脈壁の表面に存在するリポ蛋白質リパーゼ酵素により加水分 解された後、ＩＤＬに、続いてＬＤＬに変換される。ＬＤＬはコレステロールエ ステルを肝外および肝組織に与える主要リポ蛋白質である。ＨＤＬはまた肝臓に よって分泌され、大きさおよび密度に基づいてＨＤＬ₂およびＨＤＬ₃に分けられ る。ＨＤＬの機能は肝外細胞からコレステロールを取り出し、これをＶＬＤＬお よびＬＤＬを通して、またはａｐｏＥに富む大きいＨＤＬを通して肝臓に運ぶ。 これらの大きいＨＤＬ粒子はＨＤＬ₁と称され、血漿中に長時間留まらない。こ れらはコレステロールエステルをＶＬＤＬおよびＬＤＬに与えた後、肝臓により 速やかに除去されるかまたは変換してＨＤＬ₂に戻る。 ＨＤＬ₁は正常ヒトまたはヒト以外の霊長類には存在しない。上述したように 、 ＨＤＬ₁は、ＨＣＨＦ食餌を与えられているヒヒの血漿中では区別しうるバンド として現れる。知られていることからは、コレステロールエステルは、血流に入 るとＬＣＡＴ酵素の助力によりＣＥの形態でＨＤＬと会合するようになる。ＨＣ ＨＦ栄養ヒヒにおいては、これはＨＤＬ₁−ＣＥ画分として現れる。次にＣＥは ＨＤＬからＶＬＤＬおよびＬＤＬに転送され、ＣＥＴＰ酵素の助力によりＶＬＤ Ｌ−ＣＥおよびＬＤＬ−ＣＥを形成する。次にこれらの粒子はＬＤＬレセプター （ＬＤＬ−Ｒ）を通って肝細胞に入る。肝細胞において代謝された後、ＶＬＤＬ −ＣＥは血漿、したがって哺乳動物体の抹消に戻り、ここにおける沈着がアテロ ーム性動脈硬化症を引き起こす可能性がある。 本発明により提供されるもの等のＣＥＴＰ阻害剤は、ＨＤＬからＶＬＤＬおよ びＬＤＬへのＣＥの転送を遮断する。あるいは、ＣＥとａｐｏＥとの会合および ＬＤＬレセプター（ＬＤＬ−Ｒ）を通して肝臓細胞に入ることのできるＨＤＬ₁ −ＣＥ−ａｐｏＥ粒子の形成を生じる側路が好ましい。 ヒヒ以外の種々の種のアポリポ蛋白質Ｃ−Ｉは知られている。ａｐｏＣ−Ｉは ５７アミノ酸を含む分子量６６００の単一のポリペプチドである。これは主とし てＶＬＤＬおよびＨＤＬに存在する塩基性蛋白質であり、ＨＤＬはこの蛋白質の 貯蔵所として働く。一方、ＬＤＬはａｐｏＣ−Ｉをほとんど含まない。最近、ａ ｐｏＣ−ＩがａｐｏＥをＶＬＤＬから排出させ、そのＬＤＬレセプターへの結合 に影響を及ぼすことが示されている。 本明細書に記載されるＣＥＴＰ阻害剤ポリペプチドは、ａｐｏＣ−ＩのＮ末端 フラグメントと共通の配列を有する。以下に示すように、このフラグメントは少 なくとも３６アミノ酸を含む。 本発明により提供される内因性ポリペプチド（配列番号１）は、分子量約４０ ００であり、血漿中でａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＥと会合するかまたは結合する 。このＮ末端の３６アミノ酸を以下に示す。 次の配列（配列番号１）の１−３６アミノ酸に対応する配列を有するポリペプ チドが、本発明者により合成され、インビトロにおいてＣＥＴＰを阻害すること が示された。このペプチドは次の配列を有する。 このポリペプチド（配列番号１）の、アミノ酸２８−３６およびアミノ酸１６ −３６のＣ末端フラグメントを含むフラグメントは、５０μｇにおいて限定され たＣＥＴＰ阻害活性を示した。しかし、Ｃ末端アミノ酸２８−３６を含むフラグ メントは、２００μｇにおいて、３６アミノ酸ペプチドとほぼ同一のＣＥＴＰ阻 害活性を示した。合成ペプチドと対応するアミノ酸１−１５、アミノ酸１−２０ およびアミノ酸１−１０を含むＮ末端フラグメントおよびアミノ酸１５−３０等 を含む中間フラグメントは、ＣＥＴＰの阻害剤としての活性を有することを示し た。 配列番号２および配列番号３と名付けられる以下の２つの配列に対応する配列 を有するポリペプチドもまた本発明者によって合成され、インビトロにおいてＣ ＥＴＰの阻害剤であることが示された。 以下の２つの配列のうちの第１（配列番号２）は、ペプチドの最初に２つの追 加のアミノ酸を有することを除いては配列番号１と同様のヒヒの配列である。以 下の２つの配列のうちの第２（配列番号３）は、ヒトの配列であり、配列中の３ ８アミノ酸のうち７アミノ酸において配列番号２と異なる。 ＣＥＴＰの阻害活性を有する本発明のポリペプチドの類似体およびそのフラグ メントもまた本発明の一部である。この類似体は、配列中に１またはそれ以上の 置換を有するが、依然としてその阻害活性を保持している。ＣＥＴＰの阻害剤と して適当な類似体の例は、本発明のペプチドの類似体およびそのフラグメント、 例えば以下の指針にしたがって１またはそれ以上のアミノ酸が置換されているも のである。 置換アミノ酸は、次の群より選択することができる。 Ａspに対して、Ｇlu、Ｃ_α−メチルＡsp、およびβ−カルボキシＡsp； Ｖalに対して、isoＶaｌ、norＶal、Ｌeu）およびＣ_α−メチルＶal； Ａlaに対して、Ｇly、β−Ａla、Ｃ_α−メチルＡla、および２−アミノ酪酸； Ｌeuに対して、norＬeu、isoＬeu、およびＣ_α−メチルＬeu； Ｌysに対して、オルニチン、Ａrg、シトルリン、およびＣ_α−メチルＬys； Ｇlyに対して、Ａla、および２−アミノ酪酸； Ａsnに対して、Ｇln、シトルリン、およびＣ_α−メチルＡsn； Ｔrpに対して、Ｐ−ベンゾイルＰhe、Ａrg、およびＣ_α−メチルＴrp； Ｇluに対して、２−アミノアジピン酸、Ａsp、およびＣ_α−メチルＧlu； Ｉleに対して、Ｌeu、norＬeu、およびＣ_α−メチルＩle； Ａrgに対して、Ｌys、ホモＡrg、シトルリン、およびＣ_α−メチルＡrg； Ｇlnに対して、Ａsn、シトルリン、およびＣ_α−メチルＧln； Ｐheに対して、２−アミノ−４−フェニル酪酸、Ｌeu、およびＣ_α−メチルＰhe ； Ｔhrに対して、Ｓer、Ｍet、およびＣ_α−メチルＴhr； Ｓerに対して、Ｔhr、およびＣ_α−メチルＳer；および Ｐroに対して、３，４−デヒドロＰro、Ｓer、およびＣ_α−メチルＰro；ならび にこれらの組み合わせ。 しかし、当該技術分野において知られているように、置換アミノ酸と同等の性 質を有する他の置換を、単独でもしくは他の置換と組み合わせて用いることもで きる。 すなわち、本発明にしたがって、ＣＥＴＰの阻害活性を有する実質的に純粋な ポリペプチドが提供される。 本発明の１つの態様においては、このポリペプチドは、高ＨＤＬ₁ヒヒの血漿 中に存在する約３１ｋＤの修飾ａｐｏＡ−Ｉポリペプチドまたは次の配列： のペプチドの、このペプチドに対して生じさせた抗体への結合を阻害することが できる。 他の態様においては、本発明のポリペプチドは高ＨＤＬ₁ヒヒの血漿中に存在 する約４ｋＤのＣＥＴＰ阻害ポリペプチドの、次の式： のペプチドに対して生じさせた抗体への結合を阻害することができる。 さらに別の態様においては、本発明のポリペプチドは、高ＨＤＬ₁ヒヒの血漿 中に存在する約４１ｋＤの修飾ａｐｏＥポリペプチドの、ａｐｏＣ−Ｉの３６ア ミノ酸Ｎ末端フラグメントまたは次の式： のペプチドに対して生じさせた抗体への結合を阻害することができる。 さらにまた別の態様においては、このポリペプチドはａｐｏＣ−Ｉの３６アミ ノ酸Ｎ末端フラグメントまたは次の式： のペプチドの、修飾ａｐｏＡ−Ｉに対して生じさせた抗体への結合を阻害するこ とができる。 好ましいポリペプチドは、次の配列： （配列番号１）の抗４ｋＤペプチド抗体結合阻害フラグメント；および 次の群： Ａspに対して、Ｇlu、Ｃａ−メチルＡsp、およびβ−カルボキシＡsp； Ｖalに対して、isoＶal、norＶal、Ｌeu、およびＣａ−メチルＶal； Ａlaに対して、Ｇly、β−Ａla、Ｃａ−メチルＡla、および２−アミノ酪酸； Ｌeuに対して、norＬeu、isoＬeu、およびＣａ−メチルＬeu； Ｌysに対して、オルニチン、Ａrg、シトルリン、およびＣａ−メチルＬys； Ｇlyに対して、Ａla、および２−アミノ酪酸： Ａsnに対して、Ｇln、シトルリン、およびＣａ−メチルＡsn； Ｔrpに対して、Ｐ−ベンゾイルＰhe、Ａrg、およびＣａ−メチルＴrp； Ｇluに対して、２−アミノアジピン酸、Ａsp、およびＣａ−メチルＧlu； Ｔrpに対して、２−アミノアジピン酸、Ａsp、およびＣａ−メチルＴrp； Ｉleに対して、Ｌeu、norＬeu、およびＣａ−メチルＩle； Ａrgに対して、Ｌys、ホモＡrg、シトルリン、およびＣａ−メチルＡrg； Ｇlnに対して、Ａsn、シトルリン、およびＣａ−メチルＧln； Ｐheに対して、２−アミノ−４−フェニル酪酸、Ｌeu、およびＣａ−メチルＰhe ； Ｔhrに対して、Ｓer、Ｍet、およびＣａ−メチルＴhr； Ｓerに対して、Ｔhr、およびＣａ−メチルＳer；および Ｐroに対して、３，４−デヒドロＰro、Ｓer、およびＣａ−メチルＰro；ならび にこれらの組み合わせ、 より選択される少なくとも１つの置換アミノ酸を有する、（配列番号１）の抗４ ｋＤペプチド抗体結合阻害類似体； を有するポリペプチドである。 １つの特に好ましい態様においては、このポリペプチドは上述の配列（配列番 号１）の１から３６までのアミノ酸を含む。さらに別の特に好ましい態様におい ては、このペプチドは、アミノ酸１から１７、１から２０、および１から２５を 含むペプチドフラグメント（配列番号１）、および抗４ｋＤペプチド抗体／１− ３６アミノ酸ペプチド結合阻害活性を有するこれらのフラグメントからなる群よ り選択される。 さらに別の好ましい態様においては、ペプチドフラグメントは（配列番号１） のアミノ酸１から１８、および１から２８を含むペプチド、および抗４ｋＤペプ チド抗体／１−３６アミノ酸ペプチド結合阻害活性を有するこれらのフラグメン トからなる群より選択される。 また好ましいものは、Ｌys、Ａsp、およびＡsnアミノ酸によるＡrg、Ｇlu、お よびＧlnアミノ酸の置換；Ｓer、Ｌeu、Ａlaアミノ酸によるＴhr、Ｉle、Ｇlyア ミノ酸の置換；オルニチン、シトルリンおよびαアミノアジピン酸によるＬysお よびＧluアミノ酸の置換を有する、（配列番号１）の類似体である。 また好ましいものは、（配列番号１）の次の類似体である。アミノ酸１から１ ７、１から２０、１から２５、および１から３６、および抗４ｋＤペプチド抗体 ／１−３６アミノ酸ペプチド結合阻害活性を有するこれらのフラグメントの、任 意の対またはすべてのアミノ酸の対を連結する１つまたは複数のアミド結合（− Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）が、チオエーテル結合（−ＣＨ₂−Ｓ−）、エチル（−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−）等のアルキルおよび／またはアミノ（−ＣＨ₂−ＮＨ₂−）結合によ り置換されているアミノ酸配列を含むポリペプチドである。これらの類似体は、 ペプチド（類似体）の抗体１−３６アミノ酸ペプチドへの結合およびＣＥＴＰ阻 害活性がある程度保持されている限り、市販されているかまたは当業者に知られ る方法により製造することができる。 しかしながら、抗体／１−３６アミノ酸ペプチド結合の阻害活性を保持してい る限り、他の（配列番号１）の類似体もまた本発明の一部である。 本発明のＣＥＴＰ阻害ポリペプチドは、蛋白質分解を防止するため、粉体（好 ましくは凍結乾燥形態）、溶液（好ましくは−２０℃以下に凍結）等として提供 することができる。 本発明はまた、 抗アテローム性動脈硬化症に有効な量の本発明のポリペプチド；および 薬学的に許容される担体 を含む、抗アテローム性動脈硬化症組成物を提供する。 この組成物を予防手段として用いる場合には、組成物は１０から２００ｍｇ、 より好ましくは２０から１００ｍｇのポリペプチドを含む。しかし、他の量もま た適当である。この組成物を治療目的に用いる場合には、存在するポリペプチド の量は好ましくは約１０から４００ｍｇ、より好ましくは約２０から３００ｍｇ である。しかし、他の量を用いることもできる。 哺乳動物に、好ましくはヒトにペプチドを投与するための、当該技術分野にお いて知られている任意のおよびすべての薬学的に許容しうる担体は、本発明にお いて用いるのに適している。これらは当該技術分野において知られており、本明 細書においてさらに記載する必要はない。しかし、例としては、生理食塩水、ヒ ト血清アルブミンおよびスターチが挙げられる。しかし、他のものを用いること もできる。 本発明の組成物は、単位形態で、好ましくは無菌の閉鎖容器中で、より好まし くは密封容器中で提供される。 別々の容器に、 少なくとも１単位の本発明の抗アテローム性動脈硬化症組成物； 少なくとも１つのシリンジ；および 少なくとも１つの針 を含むキット。 典型的には、キットは約１から２０単位の本発明の組成物を含むが、５０単位 またはそれ以上を含んでいてもよい。さらにこのキットは、ディスポーザブルの ものである場合には、１から２０本、時には５０本またはそれ以上のシリンジ、 およびディスポーザブルのものである場合には、１から２０本、時には５０本ま たはそれ以上の針を含むことができる。キットの成分は無菌の形態で、すなわち 、密封し滅菌した包装またはその他の方法により包装して提供される。ディスポ ー ザブルでない場合には、シリンジおよび針は使用と使用との間にオートクレーブ することができる。 本発明の組成物は、好ましくは静脈内注射により投与されるが、腹膜内、皮下 または筋肉内注射として投与することもできる。ポリペプチドは胃の酸性ｐＨに おいて分解されるであろうことから、経口投与は許容されない。 この組成物は、好ましくは約７から９、より好ましくは約８から９のｐＨを有 し、ｐＨは当該技術分野において知られているように、塩基、酸または緩衝液を 添加することにより調節することができる。 本発明はまた、 本発明のポリペプチド； ヒヒＣＥＴＰポリペプチド阻害剤およびこれらのフラグメントおよびこれらの類 似体； ａｐｏＣ−Ｉの１−３６アミノ酸Ｎ末端フラグメント； 修飾ａｐｏＡ−Ｉ（分子量３１ｋＤ）；および 修飾ａｐｏＥ（分子量４１ｋＤ） からなる群より選択されるポリペプチドに対して特異性を有する抗体を提供する 。 本発明の抗体は、当該技術分野において知られているように、哺乳動物におい て生じさせることができる（Albers，J．J．Hazzard，W．R.，Immunochemical Q uantification of the Human Lp（a）Lipoprotein，Lipids 9：15-26（1974）） 。 典型的には、この抗体はウサギ、ヤギ、羊、豚および鶏において生じさせるこ とができる。しかし、他の哺乳動物を用いることもできる。好ましいものはウサ ギ抗体である。ポリクローナル抗体もまた好ましい。しかし、当該技術分野にお いて知られている方法によりモノクローナル抗体を製造することもできる（Kohl er，G.，and Milstein，D.，Continuous Cultures of Fused Cells Secreting A ntibody of Predefined Specificity，Natue（London）256：495-497（1975）） 。 １つの好ましい態様においては、本発明の抗体は修飾ａｐｏＡ−Ｉに特異的に 結合することができる。 別の好ましい態様においては、この抗体は、本発明のヒヒＣＥＴＰ阻害剤ポリ ペプチドに特異的に結合することができる。 他の好ましい態様においては、本発明の抗体は次の配列： および上述のこれらのフラグメントおよびこれらの類似体 のポリペプチドに特異的に結合することができる。 本発明のまた別の好ましい態様においては、この抗体は修飾ａｐｏＥに特異的 に結合することができる。 本発明の他の好ましい態様においては、この抗体はまた、ａｐｏＣ−Ｉに、よ り好ましくはその１−３６のＮ末端フラグメントに特異的に結合することができ る。 本発明の別の態様においては、アテローム性動脈硬化症の素因を有する哺乳動 物においてアテローム性動脈硬化症を予防する方法を提供する。この方法は、哺 乳動物に予防上有効量の本発明のポリペプチドまたは上述の抗アテローム性動脈 硬化症組成物を投与することを含む。 好ましい態様においては、予防の用途のためには、約２から１００ｍｇの量の ポリペプチドが投与される。しかし、他の量を投与することもできる。ポリペプ チドまたはその組成物は、当該技術分野において知られているように、小容量の 担体、例えば０．２から１．５ｍｌの生理食塩水または他の担体中において投与 することができる。 本発明のポリペプチドは、高血中コレステロールおよび高βリポ蛋白血症に罹 患していないが、他の手段により決定してアテローム性動脈硬化症に罹患する危 険性を有する集団、特にヒトの集団の一部に静脈内投与することができる。１つ のそのような例は決定されている家族性形質であろう。 本発明のポリペプチドは連日投与することができる。あるいは、アップジョン 社（UpJohn Co．Kalamazoo，MI）により提供されるデポエストラジオール等の、 当該技術分野において知られている緩効性組成物として与えられる場合には、よ り長い間隔で投与することができる。 他の態様においては、本発明はアテローム性動脈硬化症に罹患した哺乳動物を 治療する方法を提供する。この方法は、哺乳動物に治療上有効量の本発明のポリ ペプチドを投与することを含む。治療目的として投与される場合には、約１０か ら４００ｍｇ、より好ましくは２０から３００ｍｇのポリペプチドが注射される 。しかし、特定の症例における医師の評価により他の量を投与することもできる 。 治療的投与の場合には、予防的投与の場合と同様に、ポリペプチドを、他の経 路の中でも静脈内に投与することができる。 本発明を一般的に説明してきたが、本発明は特定の実施例を参照することによ って、より理解することができるであろう。これらの実施例は、例示の目的のた めのみに本明細書に記載されるものであり、特にことわらない限り、本発明およ びそのいかなる態様をも限定することを意図するものではない。 実施例 実施例１：動物および食餌 これらの研究の血液供与体としては、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉ ｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎ ｉｏ，Ｔｅｘａｓのヒヒ群落において保持されている成体雄または雌ヒヒ（ｐａ ｐｉｏ種）を用いた。これらのうち、２４頭は高ＨＤＬ₁表現型を有し、３２頭 は低ＨＤＬ₁表現型を有していた（Williams，M．C.，et al.，Detection of Abn ormal Lipoprotein In a Large Colony of Pedigreed Baboons Using High-Perf ormance Gel Exclusion Chromatography，J．Chromat．308：101-109（1984）） 。 高ＨＤＬ₁ヒヒ（ｎ＝１６）の半分をＨＣＨＦ食餌により維持した。この食餌 の組成は先に記載されている（Kushwaha，R．S.，et al.，Metabolism of Apoli poprotein B. In Baboons with Low and High Levels of Low Density Lipoprot ein．J．Lipid Res．27：497-507（1986））。 低ＨＤＬ₁表現型のヒヒの供与体のほとんどは、チャウ食餌（Purina Monkey C how，Ralston Purina Co.，St．Louis，Missouri）により維持した。このモンキ ーチャウは低脂肪（総カロリーの１０％）、高炭水化物（総カロリーの６２％） である。さらに、この食事はコレステロール含有量が非常に低い（０．０３ｍｇ ／Ｋｃａｌ）。 高ＨＤＬ₁ヒヒは、高ＨＤＬ₁表現型を有する２つの雄親（Ｘ１６７２およびＸ １０２）の子孫である。低ＨＤＬ₁ヒヒは、高ＨＤＬ₁表現型を有しなかった多数 の雄親の子孫である。ＨＤＬ₁の存在は、先に記載されているように高速液体ク ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検出した（Williams，et al.，Detectiono f Abnormal Lipoprotein In a Large Colony of Pedigreed Baboons Using High -Performance Gel Exclusion Chromatography，J．Chromatography．308：101-1 09（1984））。 実施例２：³ＨコレステロールエステルＨＤＬの調製 高および低ＨＤＬ₁ヒヒを１０ｍｇ／ｋｇのケタミンＨＣ１により固定し、採 血した。ＥＤＴＡ１ｍｇ／ｍｌを含む試験管に血液を集め、６℃における低速遠 心分離により血漿を分離した。血漿を、先に記載されているように、アジ化ナト リウム、クロラムフェニコール、硫酸ゲンタマイシン、フッ化フェニルメチル１ −スルホニルおよびＤＴＮＢにより処理した（Kushwaha，R．S.，et al.，Impai red Plasma CE Transfer with Accumulation of Larger High Density Lipoprot eins in Some Families of Baboons（papio sp.），J．Lipid Res．31：965-973 （1990））。 ２０から６０μＣｉのトリチル化リノレイン酸コレステロールをエタノールに 溶解し、次に血漿に加えた。血漿を窒素でフラッシュして４℃において２０時間 インキュベートした。 インキュベーションの後、密度勾配超遠心分離（McGill，H．C．et al.，Diet ary Effects on Serum Lipoprotein of Dsylipoproteinemic Baboons with High HDL₁，Atheriosclerosis 6：651-663（1986）；Redgrave，T．G.，et al.，Sepa ration of Plasma Lipoprotein by Density-Gradient Ultracentrifugation，An a．Biochem．65：42-49（1975））によりＨＤＬ₃を単離し、生理食塩水／ＥＤＴ Ａに対して透析し、ＣＥ転送反応の基質として使用した。 アッセイにおいて用いる前に、ＨＤＬ₃中の総コレステロールおよび遊離コレ ステロール含有量を測定した。 実施例３：受容体リポ蛋白質およびＣＥＴＰ源の調製 低ＨＤＬ₁ヒヒからのＶＬＤＬ＋ＬＤＬをＨＤＬ₃からのＣＥの受容体として使 用した。先に記載されているように（Kushwaha，et al.，（1986）上掲）、１０ ０−２００ｍｌの血液から、逐次的（sequential）超遠心分離によりｄ＜１．０ ４０ｇ／ｍｌのＶＬＤＬ＋ＬＤＬ分画を単離した。受容体リポ蛋白質中の総コレ ステロールおよび遊離コレステロール含有量は酵素的方法により測定した（Wako Pure Chemical Co.）（Allain，C．C.，et al.，Enzymatic Determination of T otal Serum Cholesterol，Clin．Chem．20：470-475（1974））。 ＶＬＤＬ＋ＬＤＬを分離した後、固体ＫＢｒを加えて底部分画をｄ＝１．２１ ｇ／ｍｌに調節し、総リポ蛋白質を超遠心分離により単離した（Kushwaha，et a l.，（1986）上掲）。ｄ＞１．２１ｇ／ｍｌの底部分画も集めた。 すべてのリポ蛋白質分画およびｄ＞１．２１ｇ／ｍｌ（ＬＰＤＳ）のリポ蛋白 質欠損分画を生理食塩水／ＥＤＴＡに対して透析した。ＬＰＤＳをＣＥＴＰの源 として用いた。 実施例４：コレステロールエステル転送アッセイ 試料のＣＥ転送活性は、先に記載された方法を変更してアッセイした（Kushwa ha，et al.，（1986）上掲）。 簡単には、５０−１００μｇの低ＨＤＬ₁ヒヒからのＣＥを含む³Ｈ ＣＥ標識 ＨＤＬ₃を、ＬＰＤＳの存在下で、１００−３００μｇのＣＥを含むＶＬＤＬ＋ ＬＤＬと共にインキュベートした。受容体リポ蛋白質およびＬＰＤＳは低ＨＤＬ₁ ヒヒ血漿（チャウ食餌）から得た。場合によっては、ＨＤＬ₃はＨＣＨＦ食餌で 維持された高ＨＤＬ₁ヒヒから得た。 インキュベーションは４℃（対照）および３７℃において４−６時間実施し、 試料を氷上に置くことにより終了させた。次にアッセイ混合物を超遠心分離して ｄ＞１．０４０ｇ／ｍｌを有するＶＬＤＬ＋ＬＤＬを分離し、先に記載されるよ うにリポ蛋白質中の放射活性を計数した（Kushwaha，et al.（1986）上掲）。 ４℃および３７℃においてＨＤＬからＶＬＤＬ＋ＬＤＬに転送された放射活性に ついて観察された相違を、ＬＰＤＳにおけるＣＥＴＰ活性とみなした。 時間経過実験により、７時間まで直線的な応答が得られた。同様に、ＣＥＴＰ 活性は、ＬＰＤＳ１４０μｌまでは、ＬＤＰＳの増加に対して直線的であり、こ れは等容量の血漿から得られた。 本発明のポリペプチドおよびその合成フラグメント、ならびに適当な合成対照 ペプチドを反応混合物に加えて、そのＣＥＴＰ阻害活性を決定した。 対照実験と阻害剤ペプチドを用いるアッセイとの差異のパーセンテージを阻害 活性として表した。 実施例５：阻害ポリペプチドの同定 ７２時間の超遠心分離により得られた底部非リポ蛋白質分画を、β−メルカプ トエタノールによる前処理をせずに１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動により蛋白質含有量について分析した（Laemmli，U．K.，Cleavage of Stru ctural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4，Nat ure 227：680-685（1970））。 低分子量アポリポ蛋白質における差異を決定するために、高および低ＨＤＬ₁ ヒヒからの破損させたｄ＜１．２１ｇ／ｍｌのリポ蛋白質を、試料をゲルに負荷 する前にβ−メルカプトエタノールによる前処理を行って１５−１９％ＳＤＳ− ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。 実施例６：阻害ポリペプチドの電気溶出 高ＨＤＬ₁ヒヒ血漿からのｄ＜１．２１ｇ／ｍｌのリポ蛋白質分画をエーテル −エタノールにより破損させ（Floren，C．H.，et al.，Estrogen-Induced Incr ease in Uptake of Cholesterol-Rich Very Low Density Lipoproteins in Perf used Rabbit Liver，Metabolism 30：367-374（1981））、β−メルカプトエタ ノールを加えた後に１５％ＳＤＳ−ゲル電気泳動により分離した（Laemmli，（1 970）上掲）。低分子量蛋白質のバンドを切り取り、チューブゲル（１５％）上 に移 した。 分子量カットオフ点が１０００である透析チューブをゲルチューブの底部に装 着し、電気溶出されるペプチドを受け取った。このようにして電気溶出されたペ プチドを透析し、その６６０ｎｍにおける吸収を、同時に電気溶出された既知量 の染色アルブミンと比較することにより定量した。 実施例７：抗体の製造 アポリポ蛋白質は１５％ＳＤＳ−ゲル電気泳動により分離し、染色した（Laem mli，（1970）上掲）。染色されたバンドをニトロセルロース膜上に移した。阻 害ポリペプチドに対応するバンドを切り出し（０．０５ｍｇ）、０．５ｍｌの濾 過ＤＭＳＯに溶解した。次に０．５ｍｌのフロインドアジュバントを加え、よく 混合し、この混合物を２匹のウサギに皮下注射した。３０日後、同様の量の電気 溶出された蛋白質バンドによりウサギをブーストした。抗体力価はウエスタンブ ロッティングにより測定した。ウサギは３回繰り返してブーストした。 合成ポリペプチドに対する抗体の製造のためには、５００μｇのポリペプチド を４００μｌのタイターマックス（Titer Max，CytRx Corporation，Atlanta，G A）に溶解し、ウサギに皮下注射した。第２８日に、２００ｐｌのタイターマッ クス中の合成ペプチド５００μｇによりウサギをブーストした。第４２日に血清 を試験した。必要に応じてウサギから血液を取り出して抗血清を得た。 実施例８：イムノアフィニティクロマトグラフィー イムノアフィニティカラムは、ＣｎＢｒ−活性化セファロースビーズ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ Ｃｏ．）を用いて製造した。結合させたリガンドは、抗体を有す るウサギの血清から沈殿させたＩｇＧであった。ＩｇＧを沈殿させるために用い た方法は、ＭｃＫｉｎｎｅｙおよびＰａｒｋｉｎｓｏｎにより記載される方法と 同様であった（McKinney，M．M．and Parkinson，A.，A Simple Non-Chromatogr aphic Procedure to Purify Immunogloblins From Serum and Ascites Fruid，J ．Immunological Methods 96：271-278（1987））。 簡単には、ウサギ血清５ｍｌを酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で４倍に希釈した。 カプリル酸６２５μｌを滴加してアルブミンおよび非ＩｇＧ蛋白質を沈殿させた 。不溶性物質を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離することにより除去した。 上清をリン酸緩衝生理食塩水と混合し、１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを７． ４に調節した。この溶液を４℃まで冷却し、硫酸アンモニウムを加えて最終濃度 ４５％として、ＩｇＧを沈殿させた。 遠心分離により沈殿物をペレットとして回収し、リン酸緩衝生理食塩水に再懸 濁した。ＩｇＧを１００容量のリン酸緩衝生理食塩水中で一夜透析し、次に酢酸 ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、ＣｎＢｒ−活性化セファロースビー ズ３ｇに結合させ、使用するまでトリス−生理食塩水（ｐＨ７．４）中で保存し た。 血漿８ｍｌをトリス−生理食塩水緩衝液中でＩｇＧ結合ビーズと共に、穏やか に回転させながら一夜インキュベートした。次に、ＣｈｅｕｎｇおよびＡｌｂｅ ｒｓにより記載されるように、カラムをトリス生理食塩水結合用緩衝液および酢 酸ナトリウム緩衝液で洗浄した（Cheung，M．C.，and Albers，Distribution of High Density Lipoprotein Particles with Different Apolipoprotein Composi tion：Particles with A-I and A-II and Particles with A-I But No A-II，J ．Lipid Res．23：747-753（1982））。 結合した蛋白質を０．１Ｍ酢酸（ｐＨ３．０）で溶出し、１ｍｌのアリコート を集め、２８０ｎｍの読みを測定してピークを可視化した。直ちに、蛋白質分画 をリン酸緩衝生理食塩水に対して透析し、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ルにおける電気泳動により分離した。 実施例９：イムノブロッティング ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより分離した蛋白質をイモビロンＰシート （Immobilon-P sheet，Millipore，Bedford，MA）上に移した。非特異的部位の ブロッキング後、このシートを阻害ペプチドに対する抗体と共にインキュベート した。シートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシドを含む第２抗体と共に再びイン キュベートした。３−アミノ−９−エチルカルボゾール、メタノールおよび過酸 化水素を含むホウ酸緩衝液を加えて発色させた。 実施例１０：アミノ酸分析および配列決定 蛋白質の染色バンドをイモビロンＰシート上に移した。選択されたバンドを切 り出し、５０％プロピオン酸、５０％１２Ｎ ＨＣｌにより１３５℃において２ 時間加水分解した。各々の試料のアミノ酸分析は、システムゴールド（System G old）ソフトウエアを備えたモデル６３００アミノ酸分析器（Beckman Co.，Palo Alto，CA）を用いて実施した。 同一のバンドを、モデル４７７Ａ蛋白質シークエンサー（Applied Biosystems ，Foster City，CA）を用いて配列決定した。 実施例１１：合成ペプチドの製造 ペプチドは、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより記載されている ようにして、固相ペプチド合成により合成した（Barany，G．and Merrifield，R ．B.，The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology；Gross，E．and Meinehof er，J.，eds．Vol．2，Academic Press，New York，pp．1-284（1980））。 １−３６アミノ酸合成ペプチドは、固体支持体に取り付けたアミノ酸のαカル ボキシル基を用いてＣ末端からＮ末端に向かって組み立て、次にＨＰＬＣで特徴 付けを行った。 実施例１２：データ分析 以下の実施例に示される値は平均値であり、平均値±標準偏差として与えられ る。これらの値は、分散分析を用いて比較し、有意な差異が検出された場合には これらの値をダンカン多範囲試験（Dancan's Multiple Range Test，Duncan，D ．B.，Multiple Range and Multiple F Tests，Biometrics 11：1-12（1955）） を用いて比較した。 実施例１３：下澄分画からの蛋白質の特徴付け リポ蛋白質を拡張的に、例えば７２時間または繰り返し超遠心分離した場合、 ＨＤＬからＣＥＴＰ阻害活性が消失した。超遠心分離後、阻害活性は下澄（infr anatant）分画に見いだされた。 蛋白質を特徴付けるため、下澄分画（ｄ＜１．２１ｇ／ｍｌ）を、β−メルカ プトエタノールの不在下で１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により 分離した。 高ＨＤＬ₁ヒヒからの下澄分画には、アルブミン、ａｐｏＡ−Ｉよりわずかに 大きい蛋白質およびａｐｏＥより大きい他の蛋白質が含まれていた。レーンＡお よびＢは、それぞれ高および低ＨＤＬ₁ヒヒからの非リポ蛋白質分画を示す。蛋 白質バンド１、３および５は、それぞれアルブミン、ａｐｏＥおよびａｐｏＡ− Ｉに対応する。それぞれ１と３、および３と５との間の分子量である蛋白質バン ド２および４は、それぞれ分子量４１，０００および３１，０００の蛋白質に対 応する。高ＨＤＬ₁ヒヒからの蛋白質試料は、アルブミン、分子量４１，０００ の蛋白質および分子量３１，０００の蛋白質に対応するバンドのみを示した。分 子量は同様のゲルで分離した標準蛋白質を用いて決定した（ゲルの写真は示され ていない）。 低ＨＤＬ₁ヒヒからの下澄分画もこれらの蛋白質を含んでいたが、それに加え て、ａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＥも含まれていた。ａｐｏＡ−Ｉ領域にある両方 の蛋白質をａｐｏＡ−Ｉに対する抗体を用いるイムノブロッティングにより同定 した。 同様に、ａｐｏＥ領域にある両方の蛋白質をａｐｏＥに対する抗体を用いるイ ムノブロッティングにより同定した。ａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＥを用いるイム ノブロッティングにより検出された蛋白質の分子量は、約４ｋＤの差異を示した （写真は示されていない）。ａｐｏＡ−Ｉの推定分子量は約２７，５００であり 、修飾ａｐｏＡ−Ｉの推定分子量は約３１，０００である。同様に、ａｐｏＥの 推定分子量は約３７，０００であり、修飾ａｐｏＥの推定分子量は約４１，００ ０である。ａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＥの両方とも分子量約４，０００の蛋白質 により修飾されていた。 実施例１４：高ＨＤＬ₁ヒヒの血漿中のＣＥＴＰ阻害剤ペプチドの検出 分子量４，０００の共通ポリペプチドがａｐｏＡ−ＩおよびａｐｏＥの両方を 修飾しているか否かを決定するために、β−メルカプトエタノールを用いる１８ ％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、高および低ＨＤＬ₁ヒヒか らｄ＜１．２１ｇ／ｍｌの血漿リポ蛋白質を分離した。 高ＨＤＬ₁ヒヒからのリポ蛋白質からは、低ＨＤＬ₁ヒヒからのリポ蛋白質より も多量の４ｋＤ蛋白質が検出された（ゲルの写真は示されていない）。 この４ｋＤポリペプチドがＣＥ転送を阻害するか否かを決定するために、ポリ ペプチドおよびアルブミンをゲルから電気溶出し、上述の実施例４において記載 したように、低ＨＤＬ₁ヒヒからのリポ蛋白質とともにＣＥ転送アッセイ混合物 中において増加濃度で用いた。アルブミンはＨＤＬからＶＬＤＬ＋ＬＤＬへのＣ Ｅの転送には影響を及ぼさなかった。一方、４ｋＤのポリペプチドは、ＣＥＴＰ 活性を有意に阻害した（結果は示されていない）。 実施例１５：アフィニティクロマトグラフィーによるポリペプチドの特徴付け 高ＨＤＬ₁ヒヒから得られたリポ蛋白質から単離された４ｋＤポリペプチドに 対するウサギ抗体を製造した。この抗体を用いてイムノアフィニティカラムを調 製した。ｄ＜１．２１ｇ／ｍｌのリポ蛋白質をイムノアフィニティカラムに通し た。結合したリポ蛋白質を０．１Ｍ酢酸により溶出し、１５％ＳＤＳ−ポリアク リルアミド還元ゲルで分離した。４ｋＤおよび３１ｋＤのポリペプチドおよび４ １ｋＤポリペプチドに対応する小バンドが検出された。 カラムに結合したペプチド（１００ｐｇ）は、低ＨＤＬ₁ヒヒからのＣＥＴＰ アッセイにおいて、ＣＥの転送を３１．３±１．４％（平均値士ＳＥ，ｎ＝３） で阻害した。 一方、高ＨＤＬ₁ヒヒからのアッセイにＩｇＧを添加すると、ＣＥ転送は４４ ．３±１．５％（ｎ＝３）増加したが、低ＨＤＬ₁ヒヒからのＣＥ転送には影響 を及ぼさなかった。 実施例１６：４ｋＤ阻害ポリペプチドの配列データバンクとの比較 配列データバンク（Sequence Data Bank，Reardon，W．R．and Lipman，D．J. ，PNAS（USA）85：2444-2448（1988））を用いて、このポリペプチドの配列を既 知 の蛋白質の配列と比較し、ヒトおよびカニクイザルのａｐｏＣ−Ｉと１００％の ホモロジーを有することを見いだした。 次にこの配列をヒヒからのａｐｏＣ−Ｉと比較し、１００％のホモロジーを有 することを見いだした（Dr．Hixon，Southwest Foundation for Biomedical Res earch からの私的情報）。 実施例１７：合成ペプチドを用いる阻害ポリペプチドの特徴付け 分子量に基づき、４ｋＤポリペプチドは約３６アミノ酸を含むことが決定され た。 ａｐｏＣ−Ｉ配列のＣ末端から始まる３つのペプチドを合成した。第１のペプ チドは９アミノ酸を含み、第２のペプチドは２１アミノ酸を含み、第３のペプチ ドは３６アミノ酸を含んでいた。３６アミノ酸ペプチドは分子量４，０００のポ リペプチドと同様のアミノ酸配列を有しており、他の２つは合成ペプチドのＣ末 端から始まるフラグメントであった。 これらのペプチド５０μｇを用いて、上述の実施例４に記載されるように、低 ＨＤＬ₁ヒヒのリポ蛋白質とともにＣＥＴＰアッセイを行った。分子量１，９０ ０の可溶性らせんペプチドを対照として用いた。３６アミノ酸ポリペプチドはＨ ＤＬからＶＬＤＬおよびＬＤＬへのＣＥ転送を有意に（ｐ＜０．０１）阻害した が、他のポリペプチドおよび対照ペプチドは阻害しなかった。 実施例１８：３６アミノ酸阻害ペプチドに対する抗体 実施例７に記載されるように、３６アミノ酸阻害ペプチドに対する抗体をウサ ギで製造し、イムノブロッティングに使用した。得られた抗体は、４ｋＤペプチ ドならびに高ＨＤＬ₁ヒヒのリポ蛋白質からの３１ｋＤポリペプチドを認識した 。 高および低ＨＤＬ₁ヒヒの血漿にａｐｏＣ−Ｉおよび４ｋＤポリペプチドの両 方が存在するか否かを決定するために、両方の表現型からのリポ蛋白質を１０％ ＳＤＳゲル電気泳動で分離してイムノブロッティングを行った。高ＨＤＬ₁ヒヒ からの試料のイムノブロッティングにより、２つの蛋白質のバンドが抗体で検出 された。低ＨＤＬ₁ヒヒからの試料においては、単一のバンドのみが検出された 。 さらに、合成ペプチドの等電点電気泳動パターンは、このペプチドがいくぶん 塩基性の蛋白質であることを示唆している。 実施例１９：種々のペプチドフラグメントによるＣＥＴＰ阻害 上述の実施例４に記載されるように、ＨＤＬ₁ヒヒ血漿、３Ｈ ＨＤＬおよび ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ担体を用いて、交換を媒介するＣＥＴＰ酵素の存在下にＣＥ転 送アッセイを行った。 反応は３７℃および４℃（対照）において２重に行った。以下の表１に結果を 示す。 実施例２０：合成ＣＥＴＰ阻害ペプチドによるヒトからのＣＥＴＰの阻害 本発明者らにより記載された方法により、ヒト血漿からのコレステロールエス テル転送活性をアッセイした（Kushwaha R．S.，Rainwater D．L.，Williams S. C.，Getz G．S.，and McGill H．C.，Jr.，Impaired Plasma Cholesteryl Este r Transfer with Accumulation of Large High Density Lipoproteins in Some Families of Baboons（Papio sp.），J．Lipid Res．31：965-973（1990））。 簡単には、低ＨＤＬ₁ヒヒからの［³Ｈ］コレステロールエステル標識ＨＤＬ（コ レステロールエステル１０μｇ，比活性３−４×１０⁶ｄｐｍ／ｍｇコレステロ ールエステル）を、ヒヒからの５０−１００μｇのＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロ ールエステルとインキュベートした。インキュベーションは、ヒトから得た１０ ０μｌのリポ蛋白質欠損血清（ＬＰＤＳ）および２ｍＭのＤＴＮＢの存在下にお いて実施した。アッセイの総容量は１ｍｌであった。インキュベーションは４℃ および３７℃において１−２時間行った。インキュベーションの終わりに、４０ μｌのヘパリン（５０００単位／ｍｌ）、０．５ｍｌの血漿および６０μｌの１ Ｍ ＭｎＣｌ₂をこの順序で加えた。混合物をボルテックスし、氷上で０．５時 間インキュベートし、１０分間遠心分離した。シンチレーション分光計により上 清分画の放射活性を測定した。４℃と３７℃との差異がＣＥＴＰ媒介性転送を表 すものと考えた。同時に、合成ＣＥＴＰ阻害ペプチド（３８アミノ酸のヒヒａｐ ｏＣ−Ｉ末端ペプチド，Ａla-Ｐro-Ａsp-Ｖal-Ｓer-Ｓer-Ａla-Ｌeu-Ａsp-Ｌys- Ｌeu-Ｌys-Ｇlu-Ｐhe-Ｇly-Ａsn-Ｔhr-Ｌeu-Ｇlu-Ａsp-Ｌys-Ａla-Ｔrp-Ｇlu-Ｖ al-Ｉle-Ａsn-Ａrg-Ｉle-Ｌys-Ｇln-Ｓer-Ｇlu-Ｐhe-Ｐro-Ａla-Ｌys-Ｔhr（配 列番号２））の存在下で、各々のセットのヒトＣＥＴＰインキュベーションを実 施し、ＣＥＴＰ阻害剤の存在下におけるＨＤＬからＶＬＤＬ＋ＬＤＬへのコレス テロールエステルの転送を測定した。場合によっては、合成ＣＥＴＰ阻害剤は３ ８アミノ酸のヒトａｐｏＣ−Ｉ末端ペプチド（Ｔhr-Ｐro-Ａsp-Ｖal-Ｓer-Ｓer- Ａla-Ｌeu-Ａsp-Ｌys-Ｌeu-Ｌys-Ｇlu-Ｐhe-Ｇly-Ａsn-Ｔhr-Ｌeu-Ｇlu-Ａsp-Ｌ ys-Ａla-Ａrg-Ｇlu-Ｌeu-Ｉle-Ｓer-Ａrg-Ｉle-Ｌys-Ｇln-Ｓer-Ｇlu-Ｌeu-Ｓer -Ａla-Ｌys-Ｍet（配列番号３））と同様であった。 これらの実験の結果を以下の表に示す。 実施例２１：［³Ｈ］ＨＤＬコレステロールエステル標識ＨＤＬ、ＶＬＤＬ＋Ｌ ＤＬ、ＬＰＤＳ（ヒト）の調製方法 ［³Ｈ］コレステロールエステル標識ＨＤＬおよび受容体リポ蛋白質（ｄ＜１ ．０４５ｇ／ｍｌ）は、発明者らにより記載されたようにして調製した（Kushwa haet al.，J．Lipid Res．31： 965-973（1990））。低ＨＤＬヒヒをケタミンＨ Ｃｌ（１０ｍｇ／ｋｇ）で固定した後に採血した。血液をＥＤＴＡ （ｌｍｇ／ ｍｌ）を含む試験管に集め、６℃における低速遠心分離により血漿を分離した。 血漿は ただちにアジ化ナトリウム（０．２ｇ／ｌ）、硫酸ゲンタマイシン（０．１ｇ／ ｌ）、クロラムフェニコール（０．０５ｇ／１）およびフッ化フェニルメチルス ルホニル（０．５ｍＭ）により処理した。エタノールに溶解したトリチル化オレ イン酸コレステロール（２０μＣｉ／ｍｌ）を血漿に加えた。血漿を窒素でフラ ッシュして、４℃において２０時間インキュベートした。インキュベーションの 後、密度勾配超遠心分離（Kushwaha，et al.,1990）によりＨＤＬを単離し、通 常の生理食塩水／ＥＤＴＡ（０．００１Ｍ）に対して透析し、コレステロールエ ステル転送反応の基質として使用した。ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ （ｄ＜１．０４５ｇ ／ｍｌ）およびＬＰＤＳは、発明者らによって記載されたように、２から４頭の ヒヒから得た１００−２００ｍｌの血液から逐次的超遠心分離により単離した（ Kushwaha，et al.，1990）。総コレステロールおよび遊離コレステロールおよび ＨＤＬおよびＶＬＤＬ＋ＬＤＬは酵素的アッセイを用いて測定した（Wako Pure Chemical Co.）。 実施例２２：ヒトＣＥＴＰの単離方法 ヒトＣＥＴＰを単離するために、ヒト対象から血液（５−１０ｍｌ）を得てＥ ＤＴＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を含む試験管に入れた。低速遠心分離により血漿を得た 。 血漿を氷上に保存し、血漿１ｍｌあたり４０μｌのヘパリン（５０００単位／ｍ １）および血漿１ｍｌあたり６０μｌの１Ｍ ＭｎＣｌ₂を加えることによりＬ ＤＬを沈殿させた。血漿をボルテックスして氷上で１５分間インキュベートした 。インキュベーションの後、遠心分離により上清を回収した。この工程を２回繰 り返し、血漿中のＶＬＤＬ＋ＬＤＬを完全に沈殿させた。次に、上清に１ｍｌあ たり８０μｌ／ｍｌの１０％硫酸デキストランを加え、１５分間インキュベート した。この混合物を遠心分離し、上清を集め、ＣＥＴＰの源として用いた。 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ぺプチド 配列 配列番号：２ 配列の長さ：３８アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ぺプチド 配列 配列番号：３ 配列の長さ：３８アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ぺプチド 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カンダ，パトリック アメリカ合衆国テキサス州78284，サン・ アントニオ，チャーチヒル・エステイツ 15051

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． コレステロールエステル転送蛋白質の阻害活性を有する実質的に純粋なポ リペプチドであって、次のペプチド： からなる群より選択されるペプチドの少なくとも一部分を含むポリペプチド。 ２． 凍結乾燥された形態である、請求項１記載のコレステロールエステル転送 蛋白質阻害ポリペプチド。 ３． 抗アテローム性動脈硬化症に有効な量の、次のポリペプチド： からなる群より選択されるポリペプチドの少なくとも一部分および薬学的に許容 される担体を含む、抗アテローム性動脈硬化症組成物。 ４． 別々の容器に、 少なくとも１０から４００ｍｇの請求項３記載の組成物； 少なくとも１つのシリンジ；および 少なくとも１つの針 を含む、抗アテローム性動脈硬化症キット。 ５． 次のポリペプチド： からなる群より選択されるポリペプチドの少なくとも一部分を含むポリペプチド に対して特異性を有する抗体。 ６． ポリクローナル抗体である、請求項５記載の抗体。 ７． 修飾ａｐｏＡ−Ｉに特異的に結合しうる請求項５記載の抗体。 ８． ヒヒＣＥＴＰ阻害蛋白質に特異的に結合しうる請求項５記載の抗体。 ９． 修飾ａｐｏＥに特異的に結合しうる請求項５記載の抗体。 １０． ａｐｏＣ−Ｉに特異的に結合しうる請求項５記載の抗体。 １１． アテローム性動脈硬化症の状態の素因を有する哺乳動物において抗アテ ローム性動脈硬化症を予防する方法であって、哺乳動物に予防上有効量の次のペ プチド： からなる群より選択されるペプチドの少なくとも一部分を含むポリペプチドを投 与することを含む方法。 １２． ポリペプチドが約１０から２００ｍｇの量で投与される、請求項１１記 載の方法。 １３． ポリペプチドが静脈内投与される、請求項１１記載の方法。 １４． 哺乳動物がヒトである、請求項１１記載の方法。 １５． アテローム性動脈硬化症に罹患した哺乳動物を治療する方法であって、 哺乳動物に治療上有効量の次のペプチド： からなる群より選択されるペプチドの少なくとも一部分を含むポリペプチドを投 与することを含む方法。 １６． ポリペプチドが約１０から４００ｍｇの量で投与される、請求項１５記 載の方法。 １７． ポリペプチドが静脈内投与される、請求項１５記載の方法。 １８． 哺乳動物がヒトである、請求項１５記載の方法。