【発明の詳細な説明】
HIV感染された患者におけるＴヘルパー細胞の免疫担当能力の回復
発明の背景
本発明は、免疫不全ウィルスにより感染された患者への医薬投与のためのIL−
10に対するアンタゴニストの使用に関する。それらのアンタゴニストの投与は、
Ｔヘルパー細胞のIL−２生成能力を回復せしめる。
発明の要約
本発明は、ヒト免疫不全ウィルスにより感染された患者におけるＴヘルパー細
胞により生成されるIL−２のレベルを高める方法を提供する。その方法は、イン
ターロイキン10の多量のアンタゴニストを投与することを含んで成り、ここで前
記量は患者のＴへルパー細胞のIL−２生成を高めるために効果的である。前記ア
ンタゴニストは好ましくは静脈内投与される。好ましいアンタゴニストは、IL−
10への結合のために特異的な抗体である。その抗体は、キメラ性、組換え、ポリ
クローナル又はモノクローナル抗体であり得る。同源抗体、ヒト又はヒト化され
た抗体が、ヒト患者が処理される場合、安全性のために好ましい。抗体の好まし
い１回の投与量はkg体重当たり１〜10mgである。他方、１回の用量に投与される
抗体の量は、患者の血清1ml当たり約10〜約100μｇである。
詳細な記載
本発明はＴヘルパー細胞においてIL−２の生成を高めるための効果的手段を提
供し、この場合、前記レベルはヒト免疫不全ウィルス
〔HIV〕として知られているレンチウィルスの感染に付随するIL−10の過剰レベ
ルにより阻害されるレベルである。
この慢性及びしばしば致至性ウィルス感染は、Ｔヘルパー細胞応答における不
均衡により特徴化される。このIL−10はＴヘルパー細胞のサブセットを包含する
多くの異なった細胞により生成される。IL−２生成の維持はHIV感染された患者
に有益である。IL−２はＴ細胞増殖を担当し、そして免疫システムの状態のキー
インジケーターである。
IL−２生成の低下は、IL−10に対して特異的な適切な量のアンタゴニストの投
与により停止される。IL−10のアンタゴニストは、標準の変異誘発法を用いてIL
−10のアミノ酸配列を変異誘発することによって製造され得る。そのような方法
は、単一部位変異誘発を導入し、IL−10からのランダムアミノ酸を欠失し又はア
ミノ酸を付加するためにＭ13ベクターの使用を包含する。次に、その得られるム
テインは、変異誘発されていないIL−10と競争する能力について標準アッセイに
より試験される。適切なアッセイは下記に記載されており、そしてインビトロ細
胞アッセイを包含し、ここでIL−２依存性増殖が外因性IL−10の存在により開始
される。この方法は、多くのタンパク質、たとえばトロンボモデュリン、ヒト増
殖因子及び組織プラスミノーゲン活性化因子の機能的ドメインを特徴づけるため
に使用されて来た。
他方、アンタゴニストは、IL−10〔αIL−10〕への場合に対して特異的である
抗体であり、そしてそれはＴ−ヘルパーレセプターへのその結合を妨害する。ａ
IL−10は種々の従来の手段で生成される。抗体生成の一般的な復習は、Harlow a
nd Lane，Antibodies: A Laboratorg Manual,Cold Spring Harbor Pubs.,N.Y.(1
988)又はColligan et al.Eds.,1991及びSuppl.Current Protocols in
Immunology，Green Wiley，NY，NYに見出され得る。抗体はポリクローナル混合
物又はモノクローナルであり得る。抗体は天然源又は組換え源に由来する損なわ
れていない免疫グロブリンであり得る。抗体はまた、損なわれていない免疫グロ
ブリンの免疫反応性タンパク質も包含する。
簡単に言えば、αIL−10抗体を得るための方法は、哺乳類における体液性応答
を誘発するのに十分な量の抗原を投与することを包含する。抗体は哺乳類の血清
又は除去されたリンパ球から集められ、不滅化され、そして所望する抗体を分泌
する細胞が単離され、そして所望する抗体の収穫のために培養される。IL−10に
対する抗体は、Mosmann et al.，1990.J.Immund.145: 2938により記載されてい
る。
それらの方法は抗原としてIL−10の適切な源を必要とする。抗原は損なわれて
いないIL−10又は免疫反応性ペプチドであり得る。IL−10の組換え発現は、抗原
としての使用のためにIL−10を得るための便利な手段である。適用できる組換え
技法の一般的な復習のためには、Sambrook，et al.，Molecular Cloning-A Labo
ratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New Yo
rk 1989を参照のこと。IL−10を発現し、そして精製するための特定の技法は知
られている。IL−10の発現は、PCT/US/03554(WO/91/00349)及びMalefyt，et al.
，1992，Curr.Opin.Immunology，4:314-320に記載される。他方、ペプチド合成
は、IL−10の損なわれていない又は免疫反応性部分を得るために使用され得る。
本発明に使用するための抗体は好ましくは患者のために同源性であり、それに
よって、追加の免疫学的問題を最少にする。免疫不全の個人は非自己抗体に対し
て低い反応性である傾向があり、そして従って、同じ種の細胞に由来する非自己
抗体もまた有用である。異なった種の抗体は有用であるが、しかし可能な反対の
免疫反応を制御するた
めの手段が取られるべきである。たとえば、ヒト化されたラット抗体がヒト患者
における免疫応答を最少にすることができる。
本発明に使用するための抗体は典型的には、中和化抗体であり、そして好まし
くは、その天然のレセプターに対してのIL−10の親和性よりも高いか又はそれに
ほぼ近い結合定数を有するであろう。それらの対応するレセプターに対してそれ
らのシトキンよりも100倍低い結合定数を有する抗体は好ましいものではない。
結合の比較を、標準の平衡法を用いて実施する。基本的な技法は、Chapter 25 o
f Vol.1:Immunochemistry，Ed.D.M.Weir，4th Ed.1986，Blackwell Socientific
Pub1.25.1-25.30に記載される。他方、標準のインビトロバイオアッセイにおい
て一定量のIL−10を中和するそして過剰の抗体を決定するためのアッセイを使用
することができる。そのようなアッセイの例は、Mosmann and Fong，1989，J.Im
munol.Methods，116:151(IL-4) and Fiorentino et al.，1989，J.Exp.Med.170:
2081に見出される。10〜1,000倍過剰で一定量のIL−10を中和するそれらの抗体
が理想的な範囲である。
アンタゴニスト、たとえばαIL−10の投与の手段は典型的には、非経口、好ま
しくは静脈内投与である。アンタゴニストは標準の静脈内技法を用いて患者に注
入される。アンタゴニストは最初に、殺菌した生理学的に相溶性の媒体、たとえ
ばリン酸緩衝液に懸濁される。医薬的に許容できる賦形剤、たとえばレシチン、
グルコース、デオストロース、抗生物質がまた、そのアンタゴニストと共に含ま
れ得る。
アンタゴニストが抗体である場合、それらは個々の抗体のために血清１ml当た
り約１〜150μｇ及び好ましくは10〜100μｇでαIL−10の循環レベルを提供する
量で投与される。抗体は２〜７日の半減期を有し、そして反復された投与が、α
IL−10のレベルがそれら
のレベル以下である場合に必要である。投与当たりに適用されるαIL−10の合計
量は、個々の抗体に対して体重１kg当たり１〜10mgである。
本発明の方法はIL−２生成を高め、そして前記レベルが100％正常値に近づき
又はそれを越えることが好ましい。処理の前、IL−２生成の50％以上の上昇が良
好であると思われる。処理は、Ｔヘルパー細胞が、いづれかの従来のアッセイに
より測定される場合、正常値の10〜100％レベルでIL−２を生成する場合に停止
される。
それらの従来のアッセイは２つのカテゴリーに分けられる。第１のカテゴリー
はIL−２の存在下で増殖するいくつかの不滅細胞系のIL−２依存性増殖を測定す
るバイオアッセイである。そのような細胞系の例はCILLである。細胞分裂は、放
射性ラベルされたチミジン摂取により測定される。第２のカテゴリーは機能的ア
ッセイであり、そしてIL−２を直接的に測定するイムノアッセイ、たとえばELIS
Aの使用を包含する。この技術の一般的な概観は、Mosmann and Fong，1989，Spe
cific Assay for Cytokine Production by T-Cell,，J.Immunol.Meth.116:151-1
58に見出され得る。
従来の抗ウィルス治療剤、たとえばAZTはまた、本発明と一緒に使用され得る
。
本発明はより明確に理解するために例示的にいくらか詳細に記載されて来たが
、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で実施され得る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Restoring the immunocompetent capacity of T helper cells in HIV-infected patients
Background of the Invention
The present invention relates to IL-IL for administering a drug to a patient infected by the immunodeficiency virus.
For the use of antagonists against 10. Administration of those antagonists
Restores the ability of T helper cells to produce IL-2.
Summary of the Invention
The present invention relates to T helper cells in patients infected by the human immunodeficiency virus.
Methods for increasing the level of IL-2 produced by the vesicle are provided. The method is
Comprising administering a large amount of an antagonist of Tarleukin 10, wherein
The dosage is effective to increase IL-2 production of T helper cells in the patient. Said a
The antagonist is preferably administered intravenously. Preferred antagonists are IL-
Antibody specific for binding to 10. The antibodies are chimeric, recombinant, poly
It can be a clonal or monoclonal antibody. Allogeneic antibodies, human or humanized
Antibodies are preferred for safety when human patients are treated. Antibody preferences
The single dose is 1 to 10 mg per kg body weight. On the other hand, administered in one dose
The amount of antibody is about 10 to about 100 μg / ml of patient serum.
Detailed description
The present invention provides an effective means to enhance IL-2 production in T helper cells.
Wherein the level is human immunodeficiency virus
Excessive levels of IL-10 associated with lentivirus infection known as [HIV]
Level that is inhibited by
This chronic and often lethal virus infection results in an impairment in the T helper cell response.
Characterized by equilibrium. This IL-10 comprises a subset of T helper cells
Produced by many different cells. Maintain IL-2 production in HIV-infected patients
It is beneficial. IL-2 is responsible for T cell proliferation and is key to the state of the immune system
It is an indicator.
Decreased IL-2 production is indicated by administration of an appropriate amount of antagonist specific for IL-10.
It is stopped by giving. An antagonist of IL-10 can be expressed using standard mutagenesis methods.
It can be produced by mutagenizing the -10 amino acid sequence. Such a way
Introduces single-site mutagenesis and deletes or deletes random amino acids from IL-10.
Includes the use of M13 vectors to add amino acids. Next, the resulting mu
Thein is tested in standard assays for its ability to compete with non-mutagenized IL-10.
To be tested. Suitable assays are described below, and in vitro assays
The IL-2-dependent growth initiated by the presence of exogenous IL-10
Is done. This method is useful for many proteins, such as thrombomodulin, human
To characterize functional domains of growth factors and tissue plasminogen activator
Used to be.
On the other hand, antagonists are specific for the case to IL-10 [αIL-10]
An antibody, which interferes with its binding to the T-helper receptor. a
IL-10 is produced by various conventional means. A general review of antibody generation is Harlow a
nd Lane, Antibodies: A Laboratorg Manual, Cold Spring Harbor Pubs., N.Y. (1
988) or Colligan et al. Eds., 1991 and Suppl.Current Protocols in
Immunology, Green Wiley, NY, NY. Antibodies are polyclonal mixed
Or monoclonal. Antibodies are compromised from natural or recombinant sources
Immunoglobulin may not be present. Antibodies can also be used in immunocompromised immunoglobulins.
Also encompasses the immunoreactive protein of Brin.
Briefly, methods for obtaining αIL-10 antibodies are based on humoral responses in mammals.
Administering an antigen in an amount sufficient to elicit the following. Antibody is mammalian serum
Or collected from depleted lymphocytes, immortalized, and secretes desired antibodies
The desired cells are isolated and cultured for harvest of the desired antibody. To IL-10
Antibodies to this are described by Mosmann et al., 1990. J. Immund. 145: 2938.
You.
Those methods require a suitable source of IL-10 as antigen. Antigen is damaged
Not IL-10 or immunoreactive peptide. Recombinant expression of IL-10 is an antigen
A convenient means to obtain IL-10 for use as a. Applicable recombination
For a general review of techniques, see Sambrook, et al., Molecular Cloning-A Labo.
ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yo
See rk 1989. Specific techniques for expressing and purifying IL-10 are known.
Have been. Expression of IL-10 was determined by PCT / US / 03554 (WO / 91/00349) and Malefyt, et al.
Opin. Immunology, 4: 314-320. On the other hand, peptide synthesis
Can be used to obtain an intact or immunoreactive portion of IL-10.
Antibodies for use in the present invention are preferably cognate for the patient,
Thus, additional immunological problems are minimized. Immunocompromised individuals respond to non-autoantibodies
And low reactivity, and therefore non-self derived from cells of the same species
Antibodies are also useful. Different species of antibodies are useful, but possible opposite
To control the immune response
Measures should be taken. For example, if a humanized rat antibody is
Immune response can be minimized.
Antibodies for use in the present invention are typically neutralizing antibodies, and are preferably
Or higher than or greater than the affinity of IL-10 for its natural receptor
It will have near-close coupling constants. It against their corresponding receptors
Antibodies with binding constants that are 100-fold lower than these cytokins are not preferred.
Binding comparisons are performed using standard equilibrium methods. The basic technique is Chapter 25 o
f Vol.1: Immunochemistry, Ed.D.M.Weir, 4th Ed.1986, Blackwell Socientific
Pub1.25.1-25.30. On the other hand, in standard in vitro bioassays
Neutralize fixed amounts of IL-10 and use assays to determine excess antibody
can do. Examples of such assays are described in Mosmann and Fong, 1989, J. Im.
munol. Methods, 116: 151 (IL-4) and Fiorentino et al., 1989, J. Exp. Med. 170:
Found in 2081. Those antibodies that neutralize a certain amount of IL-10 with a 10-1,000 fold excess
Is the ideal range.
The means of administration of the antagonist, for example αIL-10, is typically parenteral, preferably
Or intravenous administration. Antagonists are injected into patients using standard intravenous techniques.
Is entered. Antagonists are initially sterile, physiologically compatible media, e.g.
For example, it is suspended in a phosphate buffer. Pharmaceutically acceptable excipients such as lecithin,
Glucose, deostrose, antibiotics are also included along with their antagonists
Can be
If the antagonists are antibodies, they will hit 1 ml of serum for each antibody.
Provides about 1 to 150 μg and preferably 10 to 100 μg of circulating levels of αIL-10
Administered in amounts. The antibody has a half-life of 2-7 days, and repeated administrations
IL-10 levels
Required if the level is less than or equal to Total αIL-10 applied per dose
The amount is between 1 and 10 mg / kg of body weight for the individual antibody.
The method of the invention enhances IL-2 production, and the level approaches 100% normal.
Or more. 50% increase in IL-2 production prior to treatment
Seems to be good. The treatment is performed using T-helper cells in any conventional assay.
Stops when producing IL-2 at 10-100% level of normal value if measured
Is done.
Those conventional assays fall into two categories. First category
Measures IL-2-dependent growth of several immortal cell lines growing in the presence of IL-2
Bioassay. An example of such a cell line is CILL. Cell division
It is measured by radiolabeled thymidine ingestion. The second category is functional
Immunoassays that measure IL-2 directly, such as ELIS
Including the use of A. A general overview of this technology can be found in Mosmann and Fong, 1989, Spe.
cific Assay for Cytokine Production by T-Cell ,, J. Immunol. Meth. 116: 151-1
58 can be found.
Conventional antiviral therapeutics, such as AZT, can also be used with the present invention
.
Although the present invention has been described by way of example in some detail for a clearer understanding,
, Certain changes and modifications may be made within the scope of the present invention.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，
ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，Ｍ
Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ
，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ
(72)発明者 クレリッチ，マリオ
アメリカ合衆国，メリーランド 20852,
ロックビル，グロスベノア プレイス
10201，アパートメント 108
(72)発明者 コフマン，ロバート エル.
アメリカ合衆国，カリフォルニア 94028,
ポートラ バレー，エコー レーン 239
(72)発明者 シャーラー，ジーン エム.
アメリカ合衆国，メリーランド 20817,
ベセスダ，グレンウッド ロード 5512────────────────────────────────────────────────── ───
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(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
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C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG
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CZ, FI, HU, JP, KR, KZ, LK, LV, M
G, MN, MW, NO, NZ, PL, RO, RU, SD
, SK, UA, VN
(72) Inventor Clerich, Mario
United States of America, Maryland 20852,
Rockville, Grosvenor Place
10201, apartment 108
(72) Inventor Coffman, Robert El.
United States of America, California 94028,
Portra Valley, Echo Lane 239
(72) Inventor Sharar, Gene M.
United States of America, Maryland 20817,
Bethesda, Glenwood Road 5512